KR20230174589A - 비타민 관련 바이오 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents
비타민 관련 바이오 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 비타민 관련 바이오 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 비타민 D 바이오 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 비타민 D 바이오 복합체와 선택적인 결합력을 보이므로, 비타민 D 측정을 위한 바이오마커로써 비타민 D와 결합된 형태의 단백질을 검출하여 단순 단백질 형태의 비타민 D 결합단백질과의 구분을 통해 보다 정확한 비타민 D 혈중 농도를 측정할 수 있어 체내 비타민 D 농도를 파악하는데 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 비타민 관련 바이오 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 상기 펩타이드를 포함하는 비타민 D 검출용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.
비타민 D는 뼈의 성장과 유지, 무기질 항상성을 유지하는 데 중요한 호르몬의 전구체로 알려져 있으나, 최근 인체 내 다양한 조직과 세포에서 비타민 D 수용체(vitamin D receptor, VDR)뿐 아니라 비타민 D를 활성형으로 전환하는데 필요한 1알파-수산화효소(1-hydroxylase)가 발현되는 것이 알려지면서 비타민 D 작용에 대한 새로운 조명이 이루어지고 있다. 이러한 발견은 비타민 D가 뼈나 신장, 소장 외에 다른 조직이나 기관에서 작용하거나 뼈나 무기질 항상성과 무관한 생물학적 과정에 관여하고 있을 가능성을 시사하며, 실험실연구나 역학연구 결과도 이를 뒷받침하고 있다.
한편, National Health and Nutrition Examination Survey 자료를 분석한 결과에 따르면, 1988-1994년도에 비해 2001-2004년도 미국 성인의 평균 비타민 D 농도는 6 ng/mL가 떨어진 24 ng/mL로, 23%만이 적정수준인 30 ng/mL 이상을 유지하는 것으로 나타났고, 이전에 시행되었던 다양한 코호트 연구에서도 대상자의 52-77%가 비타민 D 부족이나 결핍에 해당하는 것으로 나타났다. 우리나라의 경우에도 골다공증을 동반한 폐경여성을 대상으로 조사한 결과에 따르면 92%가 30 ng/mL 미만에 해당하였고, 12 ng/mL 미만인 경우도 57%나 되어 이제 비타민 D 부족은 우리나라를 포함하여 전 세계적으로 심각한 건강문제가 되었음을 알 수 있다.
한편, 일반적으로 비타민 D 관련 치료에 있어 적절한 양의 비타민 D 투여가 필요하다. 이에 앞서 체내 비타민 D 농도를 확인하는 것이 필수적이며, 비타민 D 농도 측정은 상대적으로 반감기가 긴 25-hydroxyvitamin D3(25(OH)D3)의 농도를 측정함으로써 이뤄진다. 혈중 25(OH)D3 농도 20ng/mL(50nmol/L) 미만을 ‘비타민 D 결핍’으로 진단하며, 21-29ng/mL를 ‘비타민 D 부족’, 30ng/mL(75nmol/L) 이상이면 ‘비타민 D 충분’ 상태로 진단한다.
약 80%의 비타민 D는 햇빛 (UVB)을 쬠으로써 합성되고 간을 통해 혈중에서 흔히 발견되는 25(OH)D3로 변환된다. 비타민 D 검진을 받을 때도 상대적으로 반감기가 긴 25(OH)D3 농도를 측정함으로써 비타민 D의 수준을 파악하는데, 기존의 검출법의 경우 25(OH)D3은 단독으로 돌아다니지 않고, 비타민 D 결합단백질과 결합하여 복합체 형태로 존재하는 경향이 크고, 25(OH)D3을 검출하기 위해 150kDa 크기의 항체를 사용하여 크기가 상대적으로 크기가 작은 비타민 D 결합단백질(약 58kDa)과 그 복합체를 구분하지 못한다는 단점이 있으며, 대량 생산이 쉽지 않고, 시간에 따른 안정성 등의 문제가 존재한다.
혈중 비타민 D는 대부분 비타민 D 결합단백질(vitamin D binding protein, VDBP)과 결합하여 바이오 복합체 형태(VDBP-Complex)로 순환하는 것으로 알려져 있다. 따라서 체내 비타민 D 수치를 파악하기 위해서는 단순한 단백질인 비타민 D 결합단백질과 이에 결합된 비타민 관련 바이오 복합체를 구별하는 것이 중요하다.
본 발명자들은 phage display library를 이용하여 비타민 관련 바이오 복합체에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 펩타이드를 스크리닝하였으며, 상기 펩타이드가 비타민 D 바이오 복합체를 인식하여 비타민 D 농도 검출 지표로써 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 비타민 D 바이오 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 비타민 D 바이오 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 비타민 D 바이오 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 비타민 D 검출용 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 비타민 D 검출용 조성물을 포함하는, 비타민 D 검출 키트를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비타민 D 부족 또는 결핍 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 비타민 D 혈중 농도 측정 방법을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 표시되는 비타민 D 바이오 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
이어서, 본 발명은 상기 비타민 D 바이오 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 비타민 D 검출용 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 비타민 D 검출용 조성물을 포함하는 비타민 D 검출 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 비타민 D 검출용 조성물을 포함하는 비타민 D 부족 또는 결핍 진단용 조성물을 제공한다.
마지막으로, 본 발명은 검사 대상으로부터 혈액검체를 채취하는 단계; 상기 혈액검체에 상기 비타민 D 검출용 조성물을 처리하여 비타민 D 바이오 복합체를 검출하는 단계; 및 비타민 D 바이오 복합체 검출량을 분석하여 비타민 D 혈중 농도를 측정하는 단계;를 포함하는 비타민 D 혈중 농도 측정 방법을 제공한다.
본 발명의 비타민 D 바이오 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 비타민 D 바이오 복합체와 선택적인 결합력을 보이므로, 비타민 D 측정을 위한 바이오마커로써 비타민 D와 결합된 형태의 단백질을 검출하여 단순 단백질 형태의 비타민 D 결합단백질과의 구분을 통해 보다 정확한 비타민 D 혈중 농도를 측정할 수 있어 체내 비타민 D 농도를 파악하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 있어서, phage display library를 이용한 펩타이드 선별 과정을 간단히 도식화하여 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 있어서, 비타민 관련 바이오 복합체 (VDBP-Complex)에 대해 특이적으로 결합하는 펩타이드의 서열 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 있어서, 비타민 D 바이오 복합체 (VDBP-Complex)에 대해 특이적으로 결합하는 펩타이드의 친화도 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 있어서, 비타민 관련 바이오 복합체 (VDBP-Complex)에 대해 특이적으로 결합하는 펩타이드의 서열 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 있어서, 비타민 D 바이오 복합체 (VDBP-Complex)에 대해 특이적으로 결합하는 펩타이드의 친화도 분석 결과를 나타낸 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(Terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명하도록 한다.
본 발명은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 표시되는 비타민 D 바이오 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공한다.
본 발명에서 용어, “비타민 D 바이오 복합체”란 25-하이드록시 비타민 D3(25-hydroxyvitamin D3, 25(OH)D3) 및 비타민 D 결합단백질(vitamin D binding protein)이 결합된 형태를 의미한다.
본 발명에서 용어, "아미노산"이란 자연적으로 펩타이드로 통합되는 22개의 표준 아미노산들 뿐만 아니라 D-아이소머 및 변형된 아미노산들을 포함한다. 이에 따라, 상기 펩타이드는 D-아미노산을 포함하는 펩타이드일 수 있다. 한편, 본 명세서 내에서 사용된 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 약어로 기재하였다.
본 발명에서 용어, “펩타이드”란 아미드 결합 (또는 펩타이드 결합)으로 연결된 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미한다. 본 발명의 목적상, 비타민 D 바이오 복합체와 특이적으로 결합하는 펩타이드를 말한다.
또한, 상기 펩타이드는 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 등 번역 후 변형(post-translational modification)에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들, 또는 단편들일 수 있다. 번역 후 변형의 예는 인산화(phosphorylation), 당화(glycosylation), 아실화(acylation) (예컨대, 아세틸화(acetylation), 미리스토일화(myristoylation) 및 팔미토일화(palmitoylation)를 포함), 알킬화(alkylation), 카르복실화(carboxylation), 히드록실화(hydroxylation), 당화반응(glycation), 비오티닐화(biotinylation), 유비퀴티닐화(ubiquitinylation), 화학적 성질의 변화(예컨대, 베타-제거 탈이미드화, 탈아미드화) 및 구조적 변화(예컨대, 이황화물 브릿지의 형성) 를 포함한다. 또한, 펩타이드 컨쥬게이트를 형성하기 위한 가교제(crosslinker)들과의 결합과정에서 일어나는 화학 반응들에 의해 생기는 아미노산의 변화, 예컨대 아미노기, 카르복시기 또는 사이드 체인에서의 변화와 같은 아미노산의 변화를 포함한다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 실질적으로 동일한 펩타이드 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다.
상기 실질적으로 동일한 펩타이드란 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열과 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 예컨대, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 의미하나 이에 한정되지 않으며, 75% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 활성을 가진다면 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 펩타이드는 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 펩타이드의 N- 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 펩타이드의 N-말단은 아세틸기(acetyl group), 플루오레닐메톡시카르보닐기(fluoreonylmethoxycarbonyl group), 포르밀기(formyl group), 팔미토일기(palmitoyl group), 미리스틸기(myristyl group), 스테아릴기(stearyl group), 부톡시카르보닐기(butoxycarbonyl group), 아릴옥시카르보닐기(allyloxycarbonyl group) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합될 수 있고; 및/또는 상기 펩타이드의 C-말단은 아미노기(amino group, -NH2), 삼차 알킬기(tertiary alkyl group) 및 아자이드(azide, -NHNH2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합될 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 선택적으로, 표적화 서열, 태그 (tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열도 추가적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "안정성"은 생체 내 단백질 절단효소의 공격으로부터 상기 펩타이드를 보호하는 in vivo 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성 (예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미할 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 당업자에게 알려진 통상의 펩타이드 합성 방법 혹은 제조 방법을 통하여 각 펩타이드의 순도가 90% 이상이 되도록 제작할 수 있으며, 예컨대 직접 합성하거나 펩타이드 제조회사에 제조를 의뢰한 후 구입하여 사용할 수 있다. 상기 펩타이드는 당업자에게 알려진 통상의 펩타이드 합성 방법 혹은 제조 방법을 통하여 D-form이나 L-form, 서열 중 일부만 D-form이나 L-form으로 구성된 펩타이드, 또는 이들의 라세미체 형태로 모두 제작하여 사용될 수 있다. 또한, 펩타이드의 안정성을 높이기 위해 그 외의 당업계에 공지된 통상적인 변형이 가능하다. 본 발명에서는 바람직하게 고체상 펩타이드 합성(Solid state peptide synthesis) 방법을 이용하여 펩타이드를 합성하였으나, 전술한 바와 같이 펩타이드 합성 방법 및 조건이 이에 제한되는 것은 아니다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산서열로 표시되는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
일 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA의 형태일 수 있는데, 상기 DNA는 cDNA 및 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. 만약 단일 가닥이라면, 이는 코딩 가닥 또는 비-코딩(안티센스) 가닥일 수 있고, 상기 코딩 서열은, 유전적 코드의 축퇴성(degeneracy) 또는 중복성(redundancy)의 결과로서, 동일한 폴리펩타이드를 인코딩한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 또한 본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포함할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체는 폴리뉴클레오티드의 자연적으로 발생하는 대립(allelic) 변이체 또는 폴리뉴클레오티드의 비-자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 대립 변이체는, 인코딩(암호화)되는 폴리뉴클레오티드의 기능을 실질적으로 변경하지 않는, 하나 이상의 뉴클레오티드들의 치환, 결실, 또는 부가를 가질 수 있는 폴리염기 서열의 교대(alternate) 형태이다. 단일 아미노산이 하나 이상의 뉴클레오티드 코돈에 의해 인코딩될 수 있고 상기 폴리뉴클레오티드가 동일한 펩타이드를 암호화하는 교대 폴리뉴클레오티드를 제조하도록 용이하게 변형될 수 있음이 당업계에 잘 알려져 있다.
이어서, 본 발명은 상기 비타민 D 바이오 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 비타민 D 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 비타민 D 검출용 조성물은 상술한 펩타이드를 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 펩타이드와 중복된 내용은 중복된 내용의 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 상기 조성물은 비타민 D 및 비타민 D 결합단백질(vitamin D binding protein)이 결합된 형태의 비타민 D 바이오 복합체를 검출하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 비타민 D는 25-하이드록시 비타민 D3(25-hydroxyvitamin D3, 25(OH)D3)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 비타민 D 검출용 조성물은 혈액 내 비타민 D를 검출하기 위한 것으로, 비타민 D는 신체의 거의 모든 조직에서 그 수용체가 발견된다는 점으로 미루어 볼 때, 각종 질병과의 연관성 또한 높다. 따라서, 혈액 내 비타민 D의 검출을 위해 본 발명의 펩타이드를 이용하여 어떠한 형태로도 사용할 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 비타민 D 검출용 조성물을 포함하는 비타민 D 검출 키트를 제공한다.
본 발명의 비타민 D 검출용 키트는 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.
아울러, 본 발명은 상기 비타민 D 바이오 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비타민 D 부족 또는 결핍 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 진단용 조성물은 상술한 펩타이드를 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 펩타이드와 중복된 내용은 중복된 내용의 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명의 진단용 조성물은 상기 비타민 D 바이오 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하여 혈액검체 내 존재하는 비타민 D 농도를 측정할 수 있으며, 비타민 D 농도 측정 결과에 따라 비타민 D 부족 또는 결핍으로 진단할 수 있다. 예컨대, 비타민 D 혈중 농도가 20ng/mL(50nmol/L) 미만인 경우 비타민 D 결핍, 21 내지 29ng/mL인 경우 비타민 D 부족 상태로 진단할 수 있다.
마지막으로, 본 발명은 검사 대상으로부터 혈액검체를 채취하는 단계; 상기 혈액검체에 상기 비타민 D 검출용 조성물을 처리하여 비타민 D 바이오 복합체를 검출하는 단계; 및 비타민 D 바이오 복합체 검출량을 분석하여 혈중 비타민 D 함량을 정량화하는 단계;를 포함하는 비타민 D 혈중 농도 측정 방법을 제공한다.
또한, 상기 검사 대상은 혈액 내 비타민 D 농도를 측정하고자 하는 대상을 의미하고, 사람, 개, 원숭이, 고양이, 설치류 (예컨대, 마우스, 유전자 조작된 마우스 등) 제한 없이 사용될 수 있다. 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 소 등의 포유류를 의미한다.
또한, 상기 혈액검체는 전혈(Whole blood), 혈청(Serum) 및 혈장(Plasma)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 따른 하나의 구현예에서 비타민 D의 농도는 면역어세이 절차에서 확인/측정/탐지 된다. 상기 면역어세이는 당업자에게 잘 알려져 있다. 그러한 어세이의 수행 방법 뿐만 아니라 실질적 응용 및 절차가 관련 교과서에 요약되어 있다. 관련 교과서의 예는 Tijssen, P., Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates, In: Practice and theory of enzyme immunoassays, pp. 221-278, Burdon, R.H. 및 v. Knippenberg, P.H. (eds.), Elsevier, Amsterdam (1990), 및 면역학적 탐지 방법을 다루는 다양한 권의 Methods in Enzymology, Colowick, S.P., and Caplan, N.O. (eds.), Academic Press, 특히 권 70, 73, 74, 84, 92 및 121 이다.
하나의 구현예에서 혈중 비타민 D 의 농도를 확인하기 위한 방법은 효소 결합 면역어세이 (ELISA), 전기화학발광 면역어세이 (ECLIA), 방사면역어세이 (RIA) 및 화학발광 면역어세이 (CLIA) 로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 비타민 D는 효소 결합 면역어세이 (ELISA) 에서 탐지된다. 비타민 D는 추가의 바람직한 구현예에서 (전기-) 화학발광 면역어세이 (ECLIA) 에서 탐지된다. 비타민 D는 추가의 구현예에서 방사면역어세이 (RIA) 에서 탐지된다. 또한 바람직한 구현예는 비타민 D 를 확인하기 위한 화학발광 면역어세이 (CLIA) 이다. 추가로 바람직하게는 어세이는 샌드위치 형광 면역어세이 (FIA), 마이크로입자 포획 효소 면역어세이 (MEIA), 고체-상 형광 면역어세이(SPFIA), 입자 농도 형광 면역어세이 (PCFIA), 라텍스 입자 증강 (enhancement) (LPIA) 이 있는 및 없는 혼탁 분석 및 비탁분석 어세이이다. 또한, 하나의 구현예에서 어세이는 테스트 스트립의 형태일 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.
<실시예 1> 비타민 관련 바이오 물질들의 페트리 디쉬에의 고정
비타민 D 결합단백질 (VDBP)과 비타민 D와 비타민 D 결합단백질이 결합된 형태의 비타민 D 관련 바이오 복합체 (VDBP-Complex)를 페트리 디쉬에 코팅하였으며, 코팅 방법은 다음과 같다. 상기 2종의 비타민 관련 바이오 물질을 페트리 디쉬에 코팅하기 위하여 petri dish (SPL, Korea, Cat#10060)를 이용하였다. 비타민 관련 바이오 물질을 0.1 M NaHCO3 (pH 8.6)를 이용하여 20 ㎍/ml의 농도로 희석하고, 페트리 디쉬의 표면을 덮도록 희석된 용액을 4 ml 넣어주었다. 교반기 (agitate machine)를 사용하여 가습 용기에서 4 ℃에서 8 시간 이상 배양했다. 배양 후 코팅 용액을 부어 각 페트리 디쉬에서 제거하고 깨끗한 종이 타월에 코팅 부위가 아래로 가도록 두드려 잔류 용액을 제거하였다. TBST (TBS+0.1%[v/v] Tween-20) 1 ml를 첨가하여 세척해준 뒤 상층액을 다시 제거해주며 이 세척과정을 총 5회 반복하였다.
상기와 같은 방법으로 페트리 디쉬 표면에 비타민 관련 바이오 물질을 고정시켰으며, 이를 이용하여 phage display 실험을 수행하였다.
<실시예 2> Phage display를 이용한 비타민 관련 바이오 복합체에 특이적으
로 결합하는 펩타이드 선별
비타민 D 바이오 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 선별하기위해 phagy display 기술을 이용하였다 (도 1 참조). 구체적으로, Phage library를 최종 농도 10^9 PFU/ml (Plaque forming units/ml)로 전체 반응 부피를 1.5 ml 제작하였다. 대조군 (페트리 디쉬) 및 음성 대조군 (BSA가 고정된 페트리 디쉬)에 먼저 phage library를 처리하였다. 페트리 디쉬 (poly styrene)에 1.1 ml의 phage library를 상온에서 45분간 반응시켰다. 이후 상층액만을 거둬 BSA가 고정된 페트리 디쉬에 상층액을 상온에서 45분간 반응시켰다. 이러한 일련의 과정, 대조군으로 사용될 물질에 먼저 처리하는 단계를 pre-binding이라 명명하였다. Pre-binding을 실시한 상층액 phage library를 수득하여 비타민 관련 바이오 물질이 고정된 페트리디쉬에 처리하고 상온에서 45분간 반응시켰다. 각각의 비타민 관련 바이오 물질과 특이적으로 결합하는 펩타이드를 선별하고자, 결합이 약하거나 결합하지 않은 펩타이드를 제거하기 위하여 TBST 1 ml로 총 5회 세척하여 제거하였다. Elution buffer (0.2 M Glycine-HCl, pH2.2) 1 ml씩 각 plate에 넣어 15 분간 상온에서 반응시켰다. 분리된 특이적 펩타이드를 포함한 phage library를 포함하는 반응액을 회수하여 1 M Tris-HCl (pH 9.1) buffer를 150 ㎕를 넣어 중화시켜주었다. 중화된 반응액을 페트리 디쉬에 처리하여 상온에서 30분간 반응시켰다. 이러한 과정, 표적 물질에 결합된 phage를 용출하여 대조군으로 사용될 물질에 처리하여 상층액만을 거둬 새로운 phage library를 구성하는 단계를 after-binding이라 명명하였다. 분리된 after-binding library phage 500 ㎕를 Kit의 phage 감염을 위한 재조합 및 구성되어 있는 E. coli ER2738에 접종시켜 20 ml의 LB배양액에 혼합하여 37 ℃에서 4.5 시간동안 배양하여 증폭시켜주었다. 반응액을 4 ℃에서 12,000 g로 원심분리하여 상층액의 80%를 회수하여 20% PEG/2.5 M NaCl을 혼합하여 4 ℃에서 15 시간 동안 반응시켜 특이적 펩타이드를 포함하는 library phage를 침전시킨 뒤, 4 ℃에서 12,000 g로 원심분리하여 특이적 펩타이드를 포함하는 library phage만을 침전시켜 회수하였다. 이후, 일련의 phage display library 결합 과정은 총 7회까지 진행하였으며, phage display library 라운드가 진행될수록 반응 조건을 엄격하게 하여 표적 물질인 비타민 관련 바이오 물질들의 단백질과 더욱 특이적으로 결합하는 펩타이드를 얻고자 하였다.
<실시예 3> 선별된 library phage 내의 전체 DNA 추출
비타민 D 바이오 복합체에 특이적인 펩타이드 선별을 위하여 4, 5, 6, 7 라운드 각각에 해당되는 library phage를 40개 회수하였으며, 회수한 특이적 펩타이드를 포함하는 library phage 내에서 phage DNA를 추출하기 위한 방법은 다음과 같다.
E. coli ER2738을 하룻밤 동안 배양 한 후, 1 ml의 LB 배양액에 1:100의 비율로 접종한 뒤 37 ℃에서 5 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 14,000 rpm으로 1 분간 원심분리하여 숙주인 E. coli를 제거해준 뒤 phage가 포함된 상층액 500 ㎕와 20% PEG/2.5 M NaCl buffer 200 ㎕와 혼합하여 실온에서 20분간 반응시켰다. 반응액을 14,000 rpm으로 4 ℃에서 10 분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 phage만을 분리하였다. 원심분리를 통해 얻은 phage는 ethanol을 이용하여 외막 단백질을 제거하고 순수한 phage DNA만을 획득하는 세척 과정을 수행하였다. 획득한 DNA에 Iodide buffer 100 ㎕를 첨가하여 혼합해주고 200 ㎕ ethanol을 첨가해 15분 동안 실온에서 반응시켰다. 반응액을 14,000 rpm으로 4 ℃에서 10 분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 500 ㎕ 70% ethanol로 펩타이드를 세척해준 다음, 한 번 더 원심분리하여 상층액을 완전히 제거해 준 뒤, 37 ℃에서 5 분간 건조시켜 ethanol을 완전히 휘발시켰다. 이후 정제된 DNA에 30㎕ TE buffer를 혼합해주었다.
<실시예 4> 선별된 library phage의 펩타이드를 구성하는 유전자 DNA 증폭 및 비타민 관련 바이오 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드 확인
실시예 3에서 얻어진 비타민 D 바이오 복합체에 특이적으로 결합하는 library phage의 DNA를 증폭하여 phage 말단을 구성하는 펩타이드 부분을 분석하기 위하여, 프라이머 (primer) 한 쌍을 바이오니아 (Bioneer, Korea)로부터 합성하였다 (표 1), 역방향 프라이머 5‘-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’ (서열번호 5)]. 상기의 프라이머를 이용한 PCR 반응을 통해 DNA 올리고뉴클레오타이드를 증폭하였으며, 반응 조성은 주형 DNA 1㎕, 10 X PCR 완충용액 5 ㎕, dNTP 혼합물 4 ㎕, 10 pM 정방향 프라이머 1 ㎕, 10 pM 역방향 프라이머 1 ㎕, Ex Taq 중합효소 (Takara, Japan) 0.2 ㎕ (1 unit/㎕)와 37.8 ㎕의 증류수로 구성하였다. 주형 DNA의 증폭을 위한 반응 조건은 95 ℃에서 5 분간 변성시키고, 95 ℃에서 30 초, 53.5 ℃에서 30 초, 그리고 72 ℃에서 1 분 30 초간 반응을 34주기 반복한 후, 72 ℃에서 7 분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 4㎕를 취하여, 0.7% 아가로오스 겔 전기영동을 통하여 증폭 산물을 확인 한 뒤, PCR 정제 키트 (GeneAll, Korea)를 이용하여 정제하여 증류수 30 ㎕에 회수하였다.
| 프라이머 서열 (5‘ -> 3’) | |
| Phage-F | CCG ATT CCT TTA GTG GTA CCT TTC TAT |
| Phage-R | CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG |
<실시예 5> 특이적으로 결합하는 펩타이드 서열 분석
혈액 내 비타민 D를 결합시키는 단백질 (vitamin D-binding protein)과 결합하고 세포막을 통과하여 세포 내로 이동한 비타민 D 바이오 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드 서열을 찾기 위하여 실시예 1에서 비타민 관련 바이오 물질들을 페트리 디쉬에 고정하였으며, 실시예 2와 3을 통해 획득한 특이적 결합력을 보이는 펩타이드를 가지는 파지의 DNA를 선별 및 추출하여 실시예 4에서 증폭 회수한 DNA로 서열 분석 (Bioneer, Korea)을 수행하였다.
도 2는 비타민 D 바이오 복합체 (VDBP-Complex)에 대해 특이적으로 결합하는 펩타이드의 서열 분석을 나타낸 도이다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 서열 분석을 통해 비타민 D 바이오 복합체에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 펩타이드를 확인하였으며, 라운드간 반복되는 서열들은 따로 색상을 통해 표시하였다 (도 2 참조).
<실시예 6> 선별된 비타민 관련 바이오 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 결합 친화도 확인
7회의 biopanning을 거쳐 선별된 대조군(페트리 디쉬) 특이적인 파지 후보군 펩타이드(서열번호 3)와 비타민 D 바이오 복합체 특이적 파지 후보군 펩타이드 7개(도 2 참조)를 선정하여 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 실험에 이용하기 위해 amplification을 진행하였다. 각각의 파지 stock을 미리 배양해둔 E. coli ER2738에 접종시켜 20 ml의 LB배양액에 혼합하여 37 ℃에서 7 시간동안 배양하여 증폭시켜주었다. 반응액을 4 ℃에서 12,000 g로 원심분리하여 상층액의 80%를 회수하여 20% PEG/2.5 M NaCl을 혼합하여 4 ℃에서 15 시간 동안 반응시켜 특이적 펩타이드를 포함하는 파지 후보군들을 침전시킨 뒤, 4 ℃에서 12,000 g로 원심분리하여 특이적 펩타이드를 포함하는 파지 후보군들만을 침전시켜 회수하였다. 침전물은 TBS에 녹인 후 파지 titration을 실시하여 각각의 파지의 농도 (PFU/ml)가 최소 10^13 PFU/ml가 되는 것을 확인하였다. 비타민 D 관련 바이오 물질들은 실시예 1에서와 동일하게 희석하였고, 96 well plate (Thermo Fisher Scientific, Cat#167008, USA)에 200 ㎕씩 분주하여 실시예 1에서와 동일한 방법으로 고정하였다. 비타민 D의 경우 100% EtOH를 이용하여 200 μM로 희석하였고, 200 ㎕씩 분주하여 재결정화를 통해 고정하였다. 각각 8개의 파지와 비타민 관련 바이오 물질들의 결합력을 비교하고자 ELISA를 진행하였다. ELISA 분석은 Anti-M13 antibody [B62-FE2] (HRP)와 ABTS를 이용하여 410 nm에서 OD 값을 측정, 비교하였다.
그 결과, SFTKTSTFTWRD(서열번호 1) 펩타이드 및 SLFTKQYDYFDT(서열번호 2) 펩타이드가 비타민 관련 바이오 복합체에 대해 높은 결합력을 가지는 것으로 확인되었으며, 그 중 SFTKTSTFTWRD 서열을 갖는 파지가 상대적으로 높은 결합력을 보이는 것으로 관찰되었다 (도 3 참조).
유의성 있는 바이오마커의 선택은 검출과 진단 결과에 있어 신뢰도를 결정한다. 유의성 있는 바이오마커란, 얻어진 결과가 정확하여 타당도 (validity)가 높고, 반복하여 얻어지는 데이터가 일관된 경향을 보여 신뢰도 (reliability)가 높다는 것을 내포한다.
본 발명의 비타민 D 바이오 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 phage library에서 대조군으로 사용되는 물질에 강한 선택도를 갖는 phage를 미리 제거하는 과정과 표적 물질에 선택도를 갖는 phage 중 대조군에 동시에 선택도를 갖는 phage를 추가적으로 제거하는 과정이 포함되어 있다. 그러므로 본 발명의 펩타이드는 비타민 D 바이오 복합체에만 특이적으로 결합하는 것이므로 타당도 (validity) 및 신뢰도 (reliability)가 우수한 바이오마커임을 알 수 있다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명되었으나, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 본 발명 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION JEONBUK NATIONAL UNIVERSITY
<120> Peptides that specifically bind to vitamin-related biocomplex and
use thereof
<130> P-2022-065
<160> 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> VDBP-Complex specific peptide
<400> 1
Ser Leu Phe Thr Lys Gln Tyr Asp Tyr Phe Asp Thr
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VDBP-Complex specific peptide
<400> 2
Ser Phe Thr Lys Thr Ser Thr Phe Thr Trp Arg Asp
1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Petri dish (polystyrene) specific peptide
<400> 3
Tyr Glu Phe His Pro Met Gly Asn Pro Leu His Arg
1 5 10
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phage primer-F
<400> 4
ccgattcctt tagtggtacc tttctat 27
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phage primer-R
<400> 5
ccctcatagt tagcgtaacg 20
Claims (10)
- 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 표시되는 비타민 D 바이오 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드.
- 제1항에 있어서,
상기 비타민 D 바이오 복합체는 비타민 D 및 비타민 D 결합단백질(vitamin D binding protein)이 결합된 형태인 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
- 제1항의 비타민 D 바이오 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 암호화 하는 폴리뉴클레오티드.
- 제1항의 비타민 D 바이오 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는, 비타민 D 검출용 조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 조성물은 비타민 D 및 비타민 D 결합단백질(vitamin D binding protein)이 결합된 형태의 비타민 D 바이오 복합체를 검출하는 것을 특징으로 하는, 비타민 D 검출용 조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 비타민 D는 25-하이드록시 비타민 D3(25-hydroxyvitamin D3, 25(OH)D3)인 것을 특징으로 하는, 비타민 D 검출용 조성물.
- 제4항의 비타민 D 검출용 조성물을 포함하는, 비타민 D 검출 키트.
- 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 비타민 D 부족 또는 결핍 진단용 조성물.
- 검사 대상으로부터 혈액검체를 채취하는 단계;
상기 혈액검체에 제4항의 비타민 D 검출용 조성물을 처리하여 비타민 D 바이오 복합체를 검출하는 단계; 및
비타민 D 바이오 복합체 검출량을 분석하여 혈중 비타민 D 함량을 정량화하는 단계;를 포함하는, 비타민 D 혈중 농도 측정 방법.
- 제9항에 있어서,
상기 혈액검체는 전혈(Whole blood), 혈청(Serum) 및 혈장(Plasma)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 비타민 D 혈중 농도 측정 방법.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102124352B1 (ko) | 2012-11-30 | 2020-06-18 | 지멘스 헬쓰케어 다이아그노스틱스 인크. | 비타민 ｄ를 검출하기 위한 조성물 및 방법 |
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2022
- 2022-06-21 KR KR1020220075710A patent/KR20230174589A/ko unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102124352B1 (ko) | 2012-11-30 | 2020-06-18 | 지멘스 헬쓰케어 다이아그노스틱스 인크. | 비타민 ｄ를 검출하기 위한 조성물 및 방법 |
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