KR101227434B1 - 유방암 줄기세포 특이적 마커인 ｃｄ４４ 단백질 표적용 펩타이드 및 이의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유방암 줄기세포특이적 마커인 CD44 표적용 펩타이드 및 이를 이용한 암 진단 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 펩타이드는 유방암세포 발현 여부를 진단할 수 있는 저분자 진단 탐침 및 암의 치료 및 예방을 위한 약물 전달 물질로 이용될 수 있다.

Description

유방암 줄기세포 특이적 마커인 ＣＤ４４ 단백질 표적용 펩타이드 및 이의 이용{PEPTIDES TARGETING THE CD44 PROTEIN AS A BIOMARKER FOR BREAST CANCER STEM CELL AND USES THEREOF}

본 발명은 유방암 줄기세포 특이적 마커인 CD44 단백질 표적용 펩타이드 및 이를 이용한 암 진단 키트에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 유방암 줄기세포 바이오 마커인 CD44 단백질에 특이적으로 결합하는 진단 탐침용 저분자 펩타이드 및 이를 이용한 암 진단 키트에 대한 것이다.

인체는 외부의 수많은 화학 물질과 내부 인자들에 노출되어 있기 때문에 체내에 여러 가지 유전적 변이들이 축적된다. 이 변이들의 일부는 서로 협력을 통해, 일부는 단독으로 인체의 내부 신호 전달 인자들에 영향을 주어 기능 장애를 일으키고, 이 같은 돌연변이로 인해 지속적인 복제가 유지되면 세포 내에 비정상 콜로니(colony)가 형성되고 이것이 축적되어 암을 일으킨다.

그 중에서 유방암은 우리나라 여성암 발생율 1위를 차지하고 있고, 25~49세 여성들의 유방암 사망률은 전세계 1위를 차지한다. 2020년에 유방암 사망자는 3,000명을 넘어설 것이라는 발표도 있다. 또한 환자 수는 빠른 증가를 보이고 있으며 환자 연령대는 갈수록 젊어지고 있다.

유방암의 치료는, 조기에 유방암을 발견하여 적극적인 치료로 완치하는 것을 목적으로 하고 있다. 하지만 이러한 노력에도 불구하고 유방암 수술 후나 항암 화학요법 및 호른몬 치료 후에 재발되는 환자들에 대한 치료법이 부족한 상태이다.

인체를 구성하는 장기에는 각기 고유한 성체 줄기세포가 있다. 이 세포들은 장기가 손상을 받을 때 장기를 재생하고 유지하는 데 필수적이다. 그런데 암 조직에도 일반 장기처럼 암 조직을 유지하는 구실을 하는 암 줄기세포가 존재하며, 이것이 암치료 후 줄어든 암세포를 재생하는 데 관여함으로써 암의 재발이나 전이에 깊은 영향을 미친다고 알려져 있다. 백혈병과 같은 혈액암은 물론이고 유방암이나 뇌암 등 고형암(Solid tumor)의 조직에도 암 줄기세포가 존재한다고 알려져 있다.

최근에 이러한 유방암 줄기세포(Breast cancer stem cells)가 암세포와 여러 면에서 동일한 특징을 가지고 있어서 유방암의 발생에 밀접한 관계가 있을 것이라는 보고가 있었다. 그리고 유방암 수술 후의 조직 재건시에 유방암 줄기세포를 이용한 조직공학의 개념이 도입되어 유방암 줄기세포의 존재 여부, 특성 등을 연구하는 것이 유방암의 치료에서 중요해지고 있다.

따라서 암 조직의 대부분을 차지하는 일반 암세포만 표적으로 이용해온 기존의 암 치료보다는, 암 조직의 극히 일부만 차지하면서도 암의 발병과 유지, 재발에 핵심 구실을 하는 암 줄기세포에 연구개발의 초점을 맞춰야 한다.

1997년 John E. Dick 박사에 의해 백혈병에서 암 줄기세포의 존재가 밝혀진 이래로, 암 줄기 세포를 다른 암세포들과 구별하기 위해서는 암 줄기세포만의 표지자(marker)가 필요하다. 유방암 줄기세포는 특이적으로 CD44를 발현한다고 알려졌다. Muhammad Al-Hajj 등은 NOD/SCID 생쥐를 이용, 인간의 유방암 세포를 이식하여 유방암 줄기세포를 확인하였다(Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100:3983-3988.). 더구나 그들은 CD44+/CD24-를 갖는 약 100-200개의 암세포를 면역결핍 생쥐에 이식할 경우 암을 유발하지만 이들 표식 인자가 없는 약 104-105개의 세포는 면역결핍 생쥐에서 암을 유발하지 않음을 증명하였다.

또한 암은 수술과 항암제를 사용하여 치료한 후에도 재발할 수 있으며, 전문가들은 그 원인이 체내에 존재하는 암 줄기세포에 있을 것이라고 생각하고 있다.

상기와 같은 이유로 유방암 줄기세포 특이표식 인자인 CD44 단백질에 대한 연구가 필요하다. CD44는 유방암과 관련이 있는 것으로 알려져 있으며, 두경부암 뿐만 아니라 다른 형태의 암과도 관련이 있을 수 있다.

CD44는 유방암과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 그리고 CD44를 이용하여, 최근 널리 알려진 가설- 암세포 중에 소집단이 암의 성장과 진행에서 중요한 역할을 하며 암을 치료하기 위해서는 암 줄기세포를 사멸시켜야 한다-을 뒷받침해줄 더 많은 연구가 필요하다.

암의 초기 단계에는 특별한 증상이 없는 경우가 많고, 증상이 비특이적이라 다른 질환과의 구분이 어렵다. 따라서 이 CD44를 유방암 마커로 이용하고 이 CD44를 효과적이며 특이적으로 인지하는 펩타이드 탐침을 발굴하여 항체가 가지고 있는 단점을 보완할 수 있다.

CD44 표적용의 새로운 탐침 펩타이드를 다양한 분야에 응용할 수 있다. 구체적으로, CD44 표적용의 새로운 탐침 펩타이드는 유방암의 예후인자로의 작용할 수 있고, 실제 암 세포를 차단하는 약물을 전달하는 약물 전달물질로 이용될 수 있다.

목표물을 인지하는 탐침과 새로운 다양한 영상화를 통한 이미징 기술 및 항암 물질들의 혼합은 암의 조기 발견에 따른 치료를 향상시키고 잠재성 있는 진단 방법들을 개발할 수 있는 기회를 제공한다. 암의 조기 발견을 목적으로 한 탐침을 개발하기 위해 높은 친화성을 갖고 선별적으로 조기 암 세포에 붙은 탐침을 발굴하여 이를 암 조기 진단에 사용할 필요가 있다.

또한 유전자 분야에서도 많은 연구가 진행되고 있다. 이러한 유전자 분석결과를 토대로 암 유전자의 기능을 끊어버리거나 표현되지 못하도록 하는 유전자 변형 연구가 진행 중이다.

종래 기술에 의하면, 진단 대상체를 진단하기 위한 가장 보편적인 방법으로 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 이용하는 방법이 있다. 이 방법은 진단 대상체가 지니는 고유한 유전자를 분석한 후, 이를 시험관 내(in vitro) 증폭함으로써 소량의 진단 대상체를 분석하는 방법이다. 또한, 이 방법은 유전자가 지니는 고유한 염기서열을 이용하여 진단 대상체 만의 고유한 염기서열을 분석의 대상으로 한다. 이러한 PCR 방법은 근래의 휴먼 지놈 프로젝트 등을 통한 광범위한 유전자 정보 데이터베이스 확보를 통하여 그 활용 범위를 확대할 수 있다. 또한 PCR 방법은 증폭하여 얻은 유전자를 대상으로 이들의 유전적 변이를 다양한 탐침을 이용해 확인하는 SSCP(Single-strand conformation polymorphism), RFLP(Restriction fragment length polymorphism) 및 AFLP(Amplified fragment length polymorphism) 방법들과 연계하여 유용한 정보를 제공하고 있다.

그러나 PCR을 이용하는 진단 방법의 경우, 진단 대상체만이 지니는 고유한 염기서열을 소량으로 얻는 데에 있어서 높은 감도를 가지는 장점이 있지만, 시료의 전처리 및 현장적응성에 대한 어려움 등의 문제점이 있어서 진단 시스템으로 사용하기에는 한계가 있다.

유방암을 검사 및 조기 발견할 수 있는 유방암 진단에는 자가 검진에도 쓰이는 시진과 촉진이 있다. 현재 진단에는 시진, 촉진, 유상 x-선 촬영(조영술) 및 초음파 검사가 가장 기본적이다. 그러나 유방의 몽우리 중 90% 이상은 미혼 여성들에게 흔한 섬유 선종 등의 양성종양으로 암이 아니다. 그러므로 좀 더 정확하게 암을 검사 및 조기 발견을 할 수 있도록 해야 한다.

암을 검사하고 조기에 발견할 수 있는 암 표지 마커는, 종양의 초기 발생을 동정할 수 있는 항체에 대한 연구를 통해 진행되고 있다. 혈액은 가장 대표적인 체액으로 질병 발병과 진행 과정에서 민감하게 그 성분이 변화하는 일종의 ‘생체 내 바로미터’와 같다. 혈장 단백체는 구성분이 약 50,000 개 이상으로 예측되는 데다, 각 단백질 성분의 농도 또한 매우 다이나믹(1-10^-12 mg/mL)하여, 검출 한계가 약 10^-6-10^-9 mg/mL 정도인 항원-항체 반응으로는 저/중농도로 존재하는 바이오마커 단백질의 검출과 정량 분석이 매우 어렵다. 그러나, 아직까지 높은 감도, 신속성과 현장 적응성을 지닌 진단 키트 및 높은 물리 화학적 안정성, 민감도, 특이성, 응용성 등의 특성을 지닌 진단 탐침 물질(diagnostic probe)은 아직까지 제시된 바 없다.

항체는 암에 대한 높은 특이성을 갖고 있기 때문에 암의 발견과 약물 전달을 위해 많은 연구가 진행되고 있으나, 생체 내에서 면역 반응성을 발생시키는 문제점이 발생할 수 있다. 또한 항체는 열이나 화학물질 처리에 의해 변성될 위험성이 있다.

근래의 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)는 질병으로 유발된 특정 단백질의 발현량 증가 및 변화를 판단하는 방법이다. 상기 특정 단백질의 인식을 위해서 이들 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 항체를 진단 탐침으로 사용하여 혈액, 소변 등의 생체 검체로부터 진단 대상체를 분리하며, 이를 위하여 효소-항체 반응(ECL)을 이용한다. 그러나 나노몰(10^-9M) 수준의 반응감도는 생체 내 작용점인 단백질을 대상으로 할 수 있다는 장점에도 불구하고, PCR 진단법에 비하여 낮은 민감도를 가진다는 단점이 있다.

상기와 같은 단점을 극복할 수 있는 관련 연구의 일환으로, 현재의 진단방법인 PCR 및 ELISA 방법 등을 기초로 나노 기술(NT)이 접목된 표면 증강 라만 분광분석법(SERS) 및 바이오-바코드 기술이 개발되면서, 펨토몰(10^-15M) 수준의 진단 대상체 분석이 실험적으로 가능함이 입증되었다. 상기 두 방법은 모두 라만 분광분석이 갖는 신호적 특성(좁은 라만 밴드; 습기, 산소 및 담금자에 대한 낮은 민감도; 및 낮은 광표백도)과 형광분석에 상응하는 높은 민감도를 통하여 금속 나노입자를 이용한 신호증폭을 이루어 펨토몰 수준의 진단 대상체 인식이 가능하게 되어, 혈액 등의 손쉬운 검체 시료를 이용한 암 진단(Prostate specific antigen, PSA)에 대한 접근법을 제안하였다. 그러나 이러한 방법들은 바이오마커(진단 대상체)를 인식하는 항체를 이용한 시스템을 토대로 하는데, 이러한 방법들은 모두 항체의 물리, 화학적 구조에 의한 크기적 제한으로 인하여 결합수가 제한될 뿐만 아니라, 여러 가지의 화학적 반응 하에서 구조변성으로 인한 불안정성을 보인다는 중대한 단점이 있다.

따라서 상기 언급한 항체 진단 시스템 기술과 차별화된 새로운 저분자 진단 탐침의 개발이 필요하다. 이러한 저분자 진단 시스템에 이용될 수 있는 것으로 저분자 펩타이드를 들 수 있다.

이에 본 발명자들은 현재 암 진단을 위하여 사용되는 항체를 대체할 수 있는 새로운 진단 물질로서 신규 펩타이드를 개발하기에 이르렀다. 구체적으로, 본 발명자들은 유방암을 조기에 발견할 확률을 높이는 데 이용될 수 있는 유방암 줄기세포 특이적 바이오마커인 CD44 단백질을 인지하는 펩타이드를 개발하였다.

본 발명의 목적은 유방암의 조기 진단, 예방 및 치료를 위해 유방암 줄기세포의 바이오마커인 CD44 단백질을 인식하고 특이적으로 결합하는 신규 펩타이드를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 서열번호 1 또는 2로 구성되는 아미노산 서열로 이루어지는 CD44 단백질 표적용 펩타이드 및 상기 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 암 진단 키트를 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 서열번호 1 또는 2로 구성되는 아미노산 서열로 이루어지는 유방암 줄기세포 특이적 마커인 CD44 단백질 표적용 펩타이드를 제공한다.

상기 CD44 단백질은 이 기술분야에서 널리 공지된 단백질이다. 구체적으로 서열번호 5의 염기서열을 가지는 유전자로 이루어질 수 있으나, 반드시 이에 제한 되는 것은 아니다.

본 발명에서는 앞서 언급한 항체의 단점을 극복하기 위해 저분자 펩타이드를표적 물질로 이용한다. 이러한 저분자 펩타이드는 그 크기가 작아서 3차원적으로 안정화되어 있고 점막을 쉽게 통과하며 조직 깊은 곳에서도 분자 목표물을 인지할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 국소 주사를 통해 안정성이 확보되고 면역 반응성을 최소화 할 수 있기 때문에, 암을 조기 진단할 수 있는 장점이 있다. 그리고 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 대량 생산이 항체에 비해 상대적으로 간단하고, 독성이 약하다.

이외에도 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 항체보다 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용된다.

상기 CD44 표적 펩타이드는 CD44 단백질의 특정 부위에 결합하는 것을 특징으로 하며, 12개의 아미노산으로 이루어져 있다. 이 아미노산은 CD44 단백질에 대해 높은 친화도를 가지는 펩타이드로서, 서열번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로는 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함되나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 AppliedBiosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 펩타이드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Edition; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif,1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.

본 발명의 펩타이드가 암 세포 조직에 결합하였는지 여부를 용이하게 확인, 검출 및 정량하기 위하여, 본 발명의 펩타이드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 발색효소(예: 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)), 방사성 동위원소(예:124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P,35S), 크로모포어(chromophore), 발광물질 또는 형광물질(예: FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots))등 일 수 있다.

유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프(epitope), 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩타이드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩타이드에 추가로 수행될 수도 있다.

만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 형광단층촬영(Fluorescence mediated tomography:FMT)으로 암을 진단할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 펩타이드를 혈액 내로 순환시키고 형광단층촬영으로 펩타이드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 형광이 관찰된다면, 암으로 진단된다.

한편, 본 발명은 서열번호 1 또는 2로 구성되는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 상기에서 기재한 바와 같이 수득할 수 있으며, 바람직하게는 각각 서열번호 3(서열번호 1의 아미노산에 대응하는 염기서열) 또는 4(서열번호 2의 아미노산에 대응하는 염기서열)의 염기서열을 가질 수 있다.

발현벡터는 숙주 세포 내에서 삽입된 핵산을 발현할 수 있는 이 기술분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미하는 것으로서, 이 기술분야에 공지된 통상의 발현벡터에 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 발현벡터는 일반적으로 숙주세포에서 증식할 수 있는 복제원점, 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(예: 프로모터, 인핸서 등), 선별 마커(selective marker) 및 발현 조절 서열과 작동가능하게 연결된 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

형질전환체는 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 것일 수 있다. 바람직하게는 형질전환체는 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 이 기술분야에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 숙주세포에 도입하여 수득할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio.Chem., 263:14621-14624, 1988).

본 발명에 사용할 수 있는 숙주세포로는 대장균, 효모, 심장 세포, 림프구, 간 세포, 혈관내피 세포, 비장 세포, 암세포, CHO, Cos7, NIH3T3 같은 동물세포주, 곤충세포로 이루어진 군에서 선택할 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니며 가능한 모든 세포는 숙주 세포로 사용이 가능하다.

또한 본 발명은 상기 CD44 단백질 표적용 펩타이드에 특이적인 항체를 제공한다. 본 발명에서 “항체”란 항원성 부위에 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 CD44 단백질 표적용 펩타이드를 특이적으로 인지하는 항체를 의미하며, 다클론 항체 및 단클론 항체를 모두 포함한다. 상기한 바와 같이 본 발명에 의해 CD44 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Edition).

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 융합 방법(fusion method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology, 6:511-519 참조), 재조합 DNA 방법 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

다클론 항체는 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 갖는 CD44 단백질 표적용 펩타이드를 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드를 CFA(Complete Freund's Adjuvant)와 함께 염소나 토끼에 피하 주사로 주입하고, 부스터(booster)를 CFA와 함께 피하 또는 복강 내로 주입함으로써 제조될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소 토끼 이외에 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

항체는 마커, 예컨대, 방사성 또는 형광성 마커로 표지되는 것이 바람직하다. 항체는 마커 화합물에 공유적으로 결합된 항-염소 또는 항-토끼 항체에 결합시킴으로써 간접적으로 표지될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트에 포함되는 펩타이드는 서열번호 1 내지 2의 펩타이드 또는 이를 암호화하는 서열번호 3 내지 4의 폴리뉴클레오타이드를 가질 수 있으며, 앞서 기재한 바와 같이 화학적 또는 유전공학적 방법에 의해 수득된 것일 수 있다. 본 발명의 진단용 키트에는 펩타이드의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 안정성을 유지하기 위해, 분말 상태 또는 적절한 완충액에 용해된 상태 또는 4℃ 유지된 상태로 제공될 수 있다.

이 때, 본 발명에서 "진단"이란 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 암의 존재 또는 특징을 확인하는 것이다.

또한 암세포 조직에 결합한 본 발명의 펩타이드의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 펩타이드는 상기에서 기재한 바와 같이 표지된 상태로 제공될 수 있다.

한편, 본 발명의 펩타이드가 표지되지 않은 채로 제공되는 경우에는, 본 발명의 암 진단용 키트는 본 발명의 펩타이드의 시험관 내 또는 생체 내에서 암 유발 부위, 특히 암세포와 결합여부 또는 그 위치를 탐색하기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분은 본 발명의 펩타이드의 표지를 위한 공지의 화합물이거나, 항원-항체반응을 통한 탐색을 위하여 본 발명의 펩타이드 또는 본 발명의 펩타이드와 결합하는 특정 수용체에 대한 항체 또는 이들에 대한 2차 항체 및 이의 검출을 위한 시약일 수 있다.

또한 본 발명의 펩타이드는 플레이트의 표면에 코팅된 형태로 제공될 수도 있다. 이 경우에는 상기 플레이트에 직접 대상 세포를 접종하여 적당한 조건에서 반응시킨 후, 플레이트의 표면상에서의 암 세포와 펩타이드의 결합을 관찰하여 암을 진단할 수 있다.

상기 방법들에서 이용될 수 있는 실험 과정, 시약 및 반응 조건은 종래 이 기술분야에서 통상적으로 알려져 있는 것들을 이용할 수 있으며, 이는 통상의 기술자들에게 자명한 일이다.

본 발명의 펩타이드는 유방암 줄기세포 특이적 마커인 CD44 단백질에 특이적으로 결합하므로, 본 발명의 펩타이드를 진단 탐침으로 이용하여 CD44 단백질의 과다 활성을 확인함으로써 유방암을 진단할 수 있다. 본 발명의 펩타이드와 항암제와 같은 약물을 연결하여 암 치료에 사용하는 경우, 항암제를 암 조직에 선택적으로 전달하여 약물의 효과를 높이고 면역반응이나 변성 반응 등의 부작용이 거의 없는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 CD44 단백질 서열을 이용하여 PCR을 실시하여 유전자를 확보하고(a), 확보한 CD44(ED1-CD44) 유전자를 pGEX-4T-1의 재조합 발현벡터에 삽입하여 제한효소(BamHI, XhoI)로 처리 후 ED1-CD44의 삽입되었음(b)을 보여주는 것이다: (a)의 P는 CD44 유전자를, (b)의 P는, 발현벡터 pGEX-4T-1에 CD44 유전자를 삽입하여 이를 확인하기 위해 제한효소 처리 후 벡터(V)와 CD44(I) 크기에 해당되는 5.0, 1.8Kb 에서 밴드를 확인한 것을 나타내며, M은 분자량 마커임.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 발현 벡터에 클로닝된 CD44 단백질의 생산, 유도, 분리 및 정제 결과를 보여주는 것이다: M은 분자량 마커; BI은 유도 전; AI은유도 후; S1은 용해성 단백질; S2는 배양되고 소니케이션으로 분쇄된 세포; FT는 Flowthrough; F1-7은 CD44 단백질을 포함하는 분획물임.
도 3은 파지 디스플레이 전에 GST-프리 CD44 단백질을 얻었음을 나타내는 전기영동 결과이다: M은 분자량 마커; C는 트롬빈 처리 후 Mono-Q로 정제하기 전; 그리고 P는 GST-프리 단백질 CD44임.
도 4는 CD44와 결합하는 펩타이드를 스크리닝하기 위한 M13 파지 스크리닝의 계획도이다.
도 5은 CD44에 대해 높은 특이성 및 결합력을 가진 펩타이드가 발현된 파지를 검출하기 위한 4 단계 바이오 패닝 조건을 정리한 도표이다.
도 6은 본 발명의 펩타이드 발현 파지를 증폭한 뒤 농도를 측정하여 CD44와 결합력을 분석한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 CD44에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 결합 펩타이드 서열 및 결합력을 정리한 것이다.
도 8은 합성된 FITC-표지 펩타이드(P7)에 대한 CD44와의 실제 CD44 MCF7 세포 시스템에서의 결합 능력을 형광현미경으로 확인한 실험결과이다: (A)는 정상 세포주(MCF7)에서 펩타이드가 없을 때의 사진; (B)는 MCF7에서 본 발명에 따른 펩타이드를 넣어준 뒤 살펴본 형광사진이며; (C)는 CD44를 발현시키기 위한 방사선 처리(2gray씩 3번)를 한 후 펩타이드를 결합시켜 살펴본 결과임. 이 형광 펩타이드의 결합은 형광현미경과 Fluorescence Image Station 2000R(Olympus Ix71)을 통해 분석하였다.
도 9는 정상 MCF-7 세포와 방사선을 처리한 CD44 MCF-7 세포에서 본 발명의의 펩타이드가 특이적으로 결합함을 확인하기 위한 FACS 분석을 실시하여 얻은 결과이다. 빨간색 선을 보면 그래프가 시트됨을 알 수 있는데, 이는 강도의 증가로 펩타이드가 CD44와 선택적으로 더 많이 결합하였음을 보여주는 것이다. 검은색 선은 정상 MCF7 세포주이다.
도 10는 본 발명에 따른 바이오틴-표지 펩타이드(P7)의 특이성을 확인하기 위해 면역침전법(IP)을 사용하여 웨스턴 블랏을 한 결과이다.
도 11은 본 발명에 따른 FITC-표지 펩타이드(P7)와 기존 항체(PE)의 CD44에 대한 결합력을 비교하기 위한 FACS 분석 결과이다: (a)는 CD44-PE 항체를 결합시켜 찍은 결과이고 (b)는 본 발명의 펩타이드(P7)를 찍은 결과임.
도 12는 본 발명에 따른 FITC-표지 펩타이드(P7)와 기존 항체(PE)의 CD44에 대한 특이적 결합력을 보여주기 위한 면역염색 사진이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 이 기술분야의 통상의 기술자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

실시예 1: CD44 단백질의 대량 생산 및 분리

우선 CD44 단백질을 E.coli 상에서 발현시키고 대량생산 및 분리를 위하여, CD44 유전자(서열번호 5)를 다음과 같이 PCR을 통하여 증폭하였다: CD44 센스 프라이머는 5'-AA GAA TTC(EcoRI) ATG GAC AAG TTT TGG TGG CAC GCA-3'를, CD44 안티센스 프라이머는 5'-AA CTC GAG(XhoI) TTA TTC TGG AAT TTG GGG TGT CCT-3'를 사용하였다. 상기 합성 프라이머 및 주형(template) DNA를 포함하는 5 % DMSO가 함유된 반응 용액에서, 전변성(pre-denaturation) 95℃ 1분, 변성(denaturation) 94℃ 30초, 어닐링(annealing) 70℃ 45초, 신장(extension) 72℃ 2분 45초를 1 사이클로 하여, 20 사이클의 PCR 반응 후 얻은 주형 DNA를 유전자 염기서열을 통해 확인하였다(도 1 참고). 이 증폭된 유전자를 각각의 제한효소로(EcoRI, XhoI) 잘라 박테리아 발현벡터인 pGEX-4T-1(Promega, USA)에 삽입하여 제조사의 매뉴얼에 따라 클로닝한 뒤 이 발현 벡터를 발현 숙주인 단백질 발현용 대장균 BL21(DE3)에 형질전환시킨 뒤, 0.5 mM IPTG, 18℃ 조건하에서 12 시간 동안 CD44 단백질의 생산을 유도하였다. 상기 형질전환 방법을 간략하게 기재하면 다음과 같다: 우선 DNA 5 ㎕를 경쟁세포(competent cell) 100 ㎕에 넣고 잘 섞어 준 뒤 얼음에 30분간 놓아 두었다. 그 다음엔 42℃에서 90초간 열 충격을 가하였다. 오염을 방지하기 위해서, 우선 알콜 램프를 켜놓은 뒤에, LB 배지 800 ㎕을 넣고 37℃에서 45분간 인큐베이션시켰다. 마지막으로 LBA 플레이트에 도포시켜주고, 37℃ 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션 하였다.

그리고 박테리아 세포를 원심분리를 통하여 수획하여 단백질의 용해도를 조사한 결과, 대부분의 단백질이 용해됨을 확인할 수 있었다. 따라서 GST 융합 단백질인 CD44의 분리 및 정제를 위하여 수용성 단백질을 얻어낸 뒤 이를 GSH-세파로오스 컬럼을 통과시켜 CD44 단백질을 결합시킨 뒤에 20 mM GSH(reduced form of glutathione) 선형 구배(linear gradient)하에 용출시켰다.

얻어낸 단백질은 디솔팅(desalting) 컬럼(Amersham Biosciences, USA)을 이용하여 과량의 GSH를 제거하였고, 이를 통해 얻은 단백질의 정제도를 SDS/PAGE를 통하여 확인하였다(도 2). 그 다음, CD44 단백질에만 결합하는 펩타이드를 찾아내는 스크리닝 과정을 진행하기 위해서는 분자량(26KDa)의 크기가 큰 GST-태그를 제거하여야 CD44 단백질에만 특이적으로 결합하는 펩타이드를 찾아낼 수 있다. 이를 위하여 트롬빈(thrombin)(5 unit of thrombin/mg of protein)을 이용하여 GST-태그를 잘라냈다. 트롬빈 처리를 하였을 때 GST 융합 CD44 단백질은 GST-태그(26KDa)과 CD44(KDa)로 2개의 단편으로 나눠지기 때문에, 위의 방법으로 분리 정제한 CD44 단백질을 트롬빈으로 처리하여 같은 결과가 나오는지를 확인하였다. 트롬빈 처리 결과 GST-태그와 CD44의 두 개의 단백질 단편이 생김을 확인하였다. 1 mM의 벤즈아미딘(benzamidine)을 첨가하여 반응을 종료하였다. GST-태그를 제거하고 순수한 GST-프리 단백질만 얻기 위해 음이온교환 크로마토그래피(Mono Q HR 5/5컬럼)를 통해 0.5M NaCl 선형 구배로 GST-프리 단백질을 얻었다(도 3).

실시예 2: M13 파지 펩타이드 라이브러리 스크리닝 - 파지 디스플레이

상기 실시예 1에서 얻은 단백질을 96-웰 플레이트에 고정시키기 위해서 플레이트 표면이 폴리스티렌(polystyrene) 재질로 되어 있는 폴리스티렌 플레이드(SPR)를 사용하였다. 단백질과 플레이트 표면 사이의 친수성 상호작용(hydrophilic interaction)을 이용하여 단백질을 플레이트 표면 바닥에 고정시킴으로써, 랜덤 펩타이드 라이브러리(12개의 아미노산으로 구성된 무작위 배열을 통하여 약 27 억개의 다양한 아미노산 서열을 가지도록 제작된 펩타이드 라이브러리-Ph.DTM(phage display peptide library kit, New England Biolabs(NEB)를 구입하여 사용함)를 이용한 스크리닝 과정에서 보다 높은 특이성 및 결합력 분석이 가능하도록 디자인하였다. 상기 결합을 도 4에 나타내었다.

구체적으로, 도 4에서는 유방암 줄기세포 특이마커 CD44와 결합하는 펩타이드를 스크리닝 하기 위하여, CD44를 플레이트(SPL) 표면에 결합시킨 후, M13 파지 펩타이드 라이브러리(약 27억 개의 서로 다른 아미노산 서열을 지닌 12개 아미노산으로 구성된 펩타이드가 M13 파지 gp3 minor coat 단백질에 융합된 라이브러리)를 넣어 결합시킨 후(M13 파지와 펩타이드 라이브러리의 결합 방법), 다양한 결합 시간 및 세척조건을 통하여 높은 친화력으로 결합하는 펩타이드 발현 파지를 선별하였다. 이와 관련한 스크리닝 계획 및 반응조건들을 각각 도 4 및 도 5에 나타내었다.

구체적으로, 도 4는 CD44와 결합하는 펩타이드 스크리닝을 위한 M13 파지스크리닝의 계획도로서, (1) 96-웰 플레이트의 표면에 CD44 단백질을 고정시키고, (2) M13 파지 표면에 12개 아미노산으로 구성된 펩타이드 라이브러리가 발현된 파지 라이브러리를 CD44 단백질과 결합시킨 뒤에, (3) 이를 다양한 조건으로 세척한 후, (4) 최종적으로 결합된 파지를 용출하여 파지를 얻었다. 상기와 같이 얻은 파지를 대장균에 감염시켜 증폭시키고, 이를 다시 CD44 단백질과 결합시킨 후, 보다 높은 강도의 세척 조건 및 짧은 반응 시간 등의 조건으로 반복시킴으로써, 보다 강한 결합력을 갖는 파지를 찾는 과정을 반복하였다(바이오패닝; biopanning).

또한, 도 5은 CD44 단백질에 대하여 높은 특이성 및 결합력을 가진 펩타이드가 발현된 파지를 검출하기 위한 4 단계 바이오 패닝 조건을 도표화한 것이다. 각각의 단계마다 강한 세척 조건, 짧은 반응 시간으로 반응 조건을 다양하게 변화시켰으며, 이에 따라 각각 4 회씩의 바이오패닝을 실시하여 CD44 단백질에 결합하는 펩타이드를 가진 파지를 확보할 수 있었다.

상기에 의하여 얻어진 파지를 숙주세포인 대장균 ER2738 세포에 감염시켜서 LB 배지에서 증폭시킨 후, 45여 개의 파지 플라그를 선택하여 M13 파지 게놈성 DNA(단일 스트랜드화 원형 DNA)를 분리 정제하여 유전자 염기서열을 확인하여, 파지 표면 단백질(gp3 minor coat 단백질)에 발현되어 CD44와 결합하도록 제작된 펩타이드 부분의 아미노산 염기서열을 규명하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

펩타이드 번호	펩타이드 서열
P 1	HPLCTSHAPVPP
P 2	FPTRFKKQWSLP
P 3	NAGDNKFVRVSP
P 4	SVSVGMKPSPRP
P 5	WHKSEQGPRLYR
P 6	FSRPPARHQPHQ
P 7	FNLPLPSRPLLR

P 1 내지 P 7의 펩타이드의 아미노산 상동성 분석 결과, 같은 군에 속하는 펩타이드의 서열에서는 높은 유사성을 관찰할 수 있다. 그 결과, 이들 아미노산이 CD44 단백질과 해당 펩타이드와의 결합에 있어 중요한 작용을 하는 잔기임을 시사한다.

실시예 3: CD44 와 결합하는 펩타이드의 결합력 분석

스크리닝하여 얻어진 CD44 표적 특이적인 펩타이드의 결합력 분석을 위하여, 각각의 펩타이드가 발현된 파지를 증폭한 뒤, 타이터링(titering)을 통하여 파지 용액의 농도를 결정하고 CD44가 결합된 플레이트에 농도별로 넣어 주어 결합한 파지의 양을 측정함으로써 해당 펩타이드의 결합력을 추론하였다.

CD44가 결합된 플레이트에 파지를 넣어준 뒤 세척하여 파지 표면 단백질을 인식하는 항체를 이용한 ELISA(Biotrak multiwell plate reader, Amersham Bioscience, USA)를 수행하였다. 해당 농도에 따르는 ELISA 신호강도를 표시하여 이를 포화곡선에 맞추어 외견상 Kd 값을 결정하였다. Kd 값은 이미 알려진 방법을 이용하여 구하였다(Kim JM et. al, (2006) Journal of Microbiolgy and Biotechnology 16, 1784-1790.). 구체적으로, CD44 단백질(0.5 g/well)을 SPL(polystyrene plate)에 고정시킨 후 증폭된 파지를 넣어준 뒤 1 시간 고정시켰다. 그 뒤에 1 X TBST 버퍼로 5번 세척해 준 뒤, 항-M13 항체(마우스 모노클로날 항체, TBST에서 1:5000로 희석, Amersham Bioscience)를 1 시간 붙여주었다. 그 후 상기 항체가 붙은 단백질을 10번 세척한 다음 2차 항체를 결합시켰다(항-마우스 IgG-HRP, TBST에서 1:4000로 희석, Santascruz) 그리고 나서 TMB 기질 용액(3,3' 5,5'-tetramethylbenzidine(TMB)/H2O2, Chemicon)을 넣고 15분 뒤 1M 황산을 넣어 반응을 종결시킨 뒤, 450 nm에서 측정하여 얻어진 값으로 포화곡선을 그리고 Kd값을 결정하였다 그 결과, 도 6 및 도 7에서 보는 바와 같이, 7개 펩타이드군 모두 피코몰 농도 (pM) 범위의 결합력을 보여주고 있다. 또한 표 1 및 도 7의 P 6번(P 6, 서열번호 1에 해당) 및 P 7번(P 7, 서열번호 2에 해당)은 10 pM 이하의 우수한 결합력을 보여줌으로써 기존의 항체-항원 반응의 결합력에 상응하는 결합력을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 합성 펩타이드와 CD44 의 실제 결합 여부 확인을 위한 in vivo 테스트

서열번호 2의 펩타이드에 직접 형광 프로브(FITC) 및 바이오틴(biotin)을 붙이고 CD44와 결합시켜서 결합력을 측정하였다. FITC와 바이오틴을 이용한 펩타이드 결합력 측정은 이 기술분야에서 통상적으로 쓰이는 방법을 이용하였다.

서열번호 2(P 7)-FITC: Ac-FNLPLPSRPLLRGCGK-FITC

서열번호 2(P 7)-Biotin: Ac-FNLPLPSRPLLR-Biotin

펩타이드 서열번호 2-FITC는 카르복시 말단에 FITC 형광 프로브를 결합하여 감지 신호(detection signal)의 다양화 및 증가를 기대하였으며 활성(activated) pLys (SPDP coupled pLYS)과 결합하기 위한 Cys기를 넣어주었다.

또한 서열번호 2-Biotin은 카르복시 말단에 바이오틴 프로브를 결합시켜서 형광 프로브만이 아닌 흔히 사용하는 바이오틴-아비딘 결합의 펩타이드를 합성하였다. 그리고 모든 펩타이드는 아미노말단의 반응성 제거를 위해 N-말단을 아세틸화시켜(Ac) 준비하였다.

우선 FITC가 결합된 펩타이드의 결합력 분석을 위하여, 각각의 서열번호 2펩타이드를 CD44가 결합된 플레이트에 농도별로 넣어주고, 결합한 펩타이드의 형광 프로브(FITC)에서 방출되어 나오는 형광세기(fluorescence Intensity)를 측정함으로써 해당 펩타이드의 결합력을 결정하였다. CD44가 결합된 플레이트에 펩타이드를 넣어준 뒤 세척하여 서열번호 2의 펩타이드에 연결된 FITC 형광 프로브의 최대 파장을 정하고(Extinction 495 nm, Emission 510 nm) 이를 이용한 형광광도계를 이용한 형광 세기 측정을 수행하였다. 해당 농도에 따르는 FITC 형광 프로브 신호강도를 표시하여 이를 포화곡선에 맞추어 펩타이드의 Kd 값을 결정하였다.

그 다음 바이오틴이 결합된 서열번호 2의 펩타이드의 결합력 분석을 위해, 펩타이드를 CD44가 결합된 플레이트에 농도별로 넣어주어 결합한 펩타이드의 바이오틴을 통해 아비딘(streptavidn-HRP, TBST에서 1:4000로 희석, BD bioscience)항체를 이용하여 결합시킨 뒤 TMB 기질 용액(3,3' 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)/H2O2, Chemicon)을 넣고 15분 뒤 1M 황산을 넣어 반응을 종결시킨 뒤, 450 nm에서 측정하여 얻어진 값으로 포화곡선을 그리고 Kd값을 결정하였다.

그 결과, 표 2에 나타난 것과 같이, 합성된 FITC- 또는 바이오틴 표지-펩타이드는 나노몰 농도 (nM) 범위의 결합력을 보여주고 있다.

펩타이드	해리상수 (Kd)
Ac-FNLPLPSRPLLRGCGK-FITC	115.8 ± 11.0 nM
Ac-FNLPLPSRPLLR-Biotin	256 ± 17.5 nM

실제 동물세포주에서 본 발명 펩타이드(서열번호 2)의 CD44와의 결합능력을 in vivo 상에서 보기 위해, 인간 유방암 줄기 세포주 MCF-7을 이용하였다. 우선 세포배양은 인간 유방암 줄기 세포주 MCF-7(한국세포주은행, No. 30022)을 사용하여 10% FBS(fatal bovine serum)와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)/F12 (Gibco, invitrogen Corp, San Diego, CA, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2가 유지되는 습윤배양기를 이용하여 배양하였다.

정상 세포주 MCF-7와 유방암 세포주 CD44 MCF-7 에서의 펩타이드 결합을 확인하기 위하여 형광현미경과 MitofluorTM을 이용하여 FACS(Fluorescence activated cell sorter, FACSCalibur instrument, Becton Kickinson, Erembodegem, Belgium) 분석을 실시하였다. 정상 세포주 MCF-7에 방사선을 조사하여 CD44의 발현을 유도하고, FITC가 결합된 서열번호 2의 펩타이드를 결합시켜 정상 세포와 유방암 세포의 CD44의 발현의 차이를 통해 CD44에 본 발명의 펩타이드가 특이적으로 결합함을 in vivo 상에서 확인하였다(도 8 및 9). 이를 위하여 충분하게 배양된 세포를 트립신 처리하여 세포를 분리하고, 1XPBS(phosphate buffer saline)로 세척한 후 세포를 분주하고, 각 분주한 세포에 서열번호 2의 펩타이드(FITC-labeled peptide)를 넣어 반응시켜 결합시킨 후 3회 세척하고 유세포 측정기를 이용하여 평균 형광 강도를 구했다(도 9). 이 결과에서 CD44의 양이 많아지면 펩타이드가 더 많이 결합하여 형광 강도가 강해짐에 따라 강도 세기에 변화에 그래프가 시프트됨을 보였다. 이는 펩타이드가 CD44에 특이적으로 결합함을 보여주는 결과이다.

또한 형광현미경 분석을 위해서 FITC-표지 펩타이드 P7(400 nM)를 CD44 세포주 MCF-7과 반응시켜 결합시킨 후 0.25% 트립신을 처리하여 24-웰 챔버 슬라이드에 12시간 동안 자라도록 하였다. 그 다음엔 1XPBS로 3번 세척한 후에 슬라이드 글라스 위에 커버 슬립을 붙인 후 형광현미경(Olympus, Melvile, NY) 관찰을 수행하였다(도 8).

면역침전(immunoprecipitation, IP) 및 웨스턴 블랏을 실시하기 위하여 상기 배양된 MCF-7 세포주에서 라이시스 버퍼(40 mM Tris-HCl, pH8.0, 120 mM NaCl, 0.1% NP-4, proteinase inhibitor)를 이용하여 세포 용해물을 추출한 후 바이오틴이 결합된 서열번호 2의 펩타이드(P7)를 400 nM을 넣고 4℃에서 24 시간 흔들어 주면서 면역침전을 시켰다. 면역침전된 CD44-펩타이드 복합체에 스트렙트아비딘-결합 아가로스 비드(streptavidin-conjugated agarose bead)를 넣고 4℃에서 30분 동안 결합시킨 다음, 원심분리를 통해 침전시키고 셀 라이시스 버퍼로 세척해 주었다. 세척 후 SDS 샘플 버퍼를 가하여 끓이고 SDS-PAGE 겔 전기영동을 수행하였다. 전기영동에 의해 분리된 단백질들을 니트로셀룰로오스 멤브레인에 트랜스퍼한 후, HCAM(H-300)(Santa Cruz Biotechnology, INC.)을 1차 항체로, 항-래빗 IgG HRP 컨쥬게이트(Santa Cruz Biotechnology, INC)를 2차 항체로 사용하여 블랏팅 한 다음, ECL 감지 키트(Amersham Pharmacia Biotech)에 의해 단백질 밴드를 관찰하였다. 도 10에서 보듯이 방사선을 조사하여 CD44를 발현시켰을 때 많은 양의 CD44 때문에 상대적으로 펩타이드가 많이 결합할 수 있게 되어 정상세포주 보다 두꺼운 밴드로 나타나게 된다(도 10).

이는 본 발명의 펩타이드가 타겟이 되는 유방암 줄기세포 특이 마커 CD44에 선택적으로 잘 결합함을 보여주는 결과이다. 따라서 본 발명의 펩타이드는 항체를 대체할 수 있는 새로운 유방암 검출 프로브로서의 가능성을 보여준다.

실시예 5: 본 발명 펩타이드의 CD44 에 대한 우수한 결합력 확인- FACS 분석

도 11은 본 발명에 따른 FITC-서열번호 2 펩타이드(P7)가 기존에 사용되는 항체와 비교하여 우수한 효과가 있음을 증명하는 결과이다. FACS를 이용하여 실제 CD44-PE(Phycoerythrin) (BD Biosciences Pharmingen) 항체를 결합시켜 찍은 결과(도 11의 (a))와 본 발명의 펩타이드(P7)를 통해 FACS (도 11의 (b))를 찍은 결과이다. 도 10의 왼쪽 그래프는 정상 MCF-7세포주 즉, 방사선을 주기 전으로 CD44의 발현이 되기 전을 나타내고 오른쪽 그래프가 방사선을 조사 후 발현된 CD44를 나타낸다. 도 10을 보면, 그래프 아래에 %Gated에서 빨간색 선이 표시된 수치((a)의 3.73 및 8.68과 (b)의 2.38 및 8.54)를 보면, 항체와 펩타이드가 각각 8.68, 8.54이다. 이 결과를 토대로 현재 사용되는 항체와 본 연구진이 발굴한 펩타이드가 유사하게 CD44를 인지하고 있음을 알 수 있다.

실시예 6: 본 발명 펩타이드의 CD44 에 대한 우수한 결합력 확인- 면역염색 이미지

본 발명에 따른 펩타이드가 실제 CD44에 결합하는지를 즉, 특이적으로 결합하는지 확인하기 위해서 CD44 항체를 이용한 면역염색(immunostaining) 이미지가 형광 펩타이드 P7 이미지와 오버랩되는 것을 보여주기 위한 실험을 진행하였다. 도 12에 나타난 것과 같이, 본 발명에 따른 형광 펩타이드 P7은 FITC이므로 CD44 면역염색은 붉은색 이미지를 보여주는 CD44-PE 항체를 이용하여 FITC 그린 이미지와 겹쳐 보았을 때 노란색 이미지(도 12의 화살표 표시)가 보임을 확인하였다. 이는 CD44에 펩타이드와 항체가 동시에 위치함(co-localization)을 보여주는 결과이다. 도 12의 MCF7-cont은 대조군으로서 방사선을 조사하기 전으로 소량의 CD44가 있을 때의 결과이며, 아래 MCF7-2GyX3은 방사선을 2Gy씩 3번을 분할하여 방사선을 조사시킨 후 CD44를 발현시켰을 때 훨씬 더 많은 펩타이드가 CD44에 결합함으로써 형광이미지가 더 잘 보임을 알 수 있다. 이는 본 발명에 따른 펩타이드가 펩타이드가 CD44에 특이적으로 결합함을 보여주는 결과이다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> PEPTIDES TARGETING THE CD44 PROTEIN AS A BIOMARKER FOR BREAST CANCER STEM CELL AND USES THEREOF <130> P10-0444/HYU <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P6 peptide targeting the CD44 <400> 1 Phe Ser Arg Pro Pro Ala Arg His Gln Pro His Gln 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P7 peptide targeting the CD44 <400> 2 Phe Asn Leu Pro Leu Pro Ser Arg Pro Leu Leu Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P6 DNA <400> 3 tttagccgcc cgccggcgcg ccatcagccg catcag 36 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P7 DNA <400> 4 tttaacctgc cgctgccgag ccgcccgctg ctgcgc 36 <210> 5 <211> 1821 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atggacaagt tttggtggca cgcagcctgg ggactctgcc tcgtgccgct gagcctggcg 60 cagatcgatt tgaatataac ctgccgcttt gcaggtgtat tccacgtgga gaaaaatggt 120 cgctacagca tctctcggac ggaggccgct gacctctgca aggctttcaa tagcaccttg 180 cccacaatgg cccagatgga gaaagctctg agcatcggat ttgagacctg caggtatggg 240 ttcatagaag ggcatgtggt gattccccgg atccacccca actccatctg tgcagcaaac 300 aacacagggg tgtacatcct cacatccaac acctcccagt atgacacata ttgcttcaat 360 gcttcagctc cacctgaaga agattgtaca tcagtcacag acctgcccaa tgcctttgat 420 ggaccaatta ccataactat tgttaaccgt gatggcaccc gctatgtcca gaaaggagaa 480 tacagaacga atcctgaaga catctacccc agcaacccta ctgatgatga cgtgagcagc 540 ggctcctcca gtgaaaggag cagcacttca ggaggttaca tcttttacac cttttctact 600 gtacacccca tcccagacga agacagtccc tggatcaccg acagcacaga cagaatccct 660 gctaccagta cgtcttcaaa taccatctca gcaggctggg agccaaatga agaaaatgaa 720 gatgaaagag acagacacct cagtttttct ggatcaggca ttgatgatga tgaagatttt 780 atctccagca ccatttcaac cacaccacgg gcttttgacc acacaaaaca gaaccaggac 840 tggacccagt ggaacccaag ccattcaaat ccggaagtgc tacttcagac aaccacaagg 900 atgactgatg tagacagaaa tggcaccact gcttatgaag gaaactggaa cccagaagca 960 caccctcccc tcattcacca tgagcatcat gaggaagaag agaccccaca ttctacaagc 1020 acaatccagg caactcctag tagtacaacg gaagaaacag ctacccagaa ggaacagtgg 1080 tttggcaaca gatggcatga gggatatcgc caaacaccca gagaagactc ccattcgaca 1140 acagggacag ctgcagcctc agctcatacc agccatccaa tgcaaggaag gacaacacca 1200 agcccagagg acagttcctg gactgatttc ttcaacccaa tctcacaccc catgggacga 1260 ggtcatcaag caggaagaag gatggatatg gactccagtc atagtacaac gcttcagcct 1320 actgcaaatc caaacacagg tttggtggaa gatttggaca ggacaggacc tctttcaatg 1380 acaacgcagc agagtaattc tcagagcttc tctacatcac atgaaggctt ggaagaagat 1440 aaagaccatc caacaacttc tactctgaca tcaagcaata ggaatgatgt cacaggtgga 1500 agaagagacc caaatcattc tgaaggctca actactttac tggaaggtta tacctctcat 1560 tacccacaca cgaaggaaag caggaccttc atcccagtga cctcagctaa gactgggtcc 1620 tttggagtta ctgcagttac tgttggagat tccaactcta atgtcaatcg ttccttatca 1680 ggagaccaag acacattcca ccccagtggg gggtcccata ccactcatgg atctgaatca 1740 gatggacact cacatgggag tcaagaaggt ggagcaaaca caacctctgg tcctataagg 1800 acaccccaaa ttccagaata a 1821

Claims (5)

1. 서열번호 1 또는 2로 구성되는 아미노산 서열로 이루어지는 유방암 줄기세포특이적 마커인 CD44 표적용 펩타이드.
   
2. 제1항의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3 또는 4로 구성되는염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드.
   
4. 제1항의 펩타이드를 포함하는 암 진단용 키트.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 펩타이드는 발색효소, 방사성 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나로 표지되는 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트.

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