KR20120125674A

KR20120125674A - 돌연변이된 면역글로불린-결합 단백질

Info

Publication number: KR20120125674A
Application number: KR1020127028734A
Authority: KR
Inventors: 소피아 호버
Original assignee: 지이 헬스케어 바이오-사이언시스 에이비
Priority date: 2002-03-25
Filing date: 2003-03-20
Publication date: 2012-11-16
Also published as: AU2003217119B2; DK1972689T3; JP4391830B2; KR20040099368A; KR101067181B1; AU2003217119A1; EP1972689B1; JP2005538693A; US10918971B2; SE0200943D0; KR20120126129A; CN102558318A; KR101307714B1; EP3249047A2; DK3249047T3; US20050143566A1; EP3249047B1; CN1642976B; US20100022760A1; CN102516371A

Abstract

본 발명은 하나 이상의 아스파라긴 잔기가 글루타민 또는 아스파르트산 이외의 아미노산으로 돌연변이되고, 이 돌연변이가 모(母)분자에 비하여 약 13-14 이하의 pH에서 증가된 화학적 안정성을 부여하는 면역글로불린-결합 단백질에 관한 것이다. 이 단백질은 예를 들면, 상보성 결정 영역 (CDR)보다는 면역글로불린 분자의 다른 영역에 결합할 수 있는 단백질, 예컨대, 단백질 A 및 바람직하게는 스타필로코쿠스 단백질 A의 B-도메인으로부터 유도될 수 있다. 또한, 본 발명은 고체 지지체에 결합된 리간드로서, 하나 이상의 아스파라킨 잔기가 글루타민 이외의 아미노산으로 돌연변이된 면역글로불린-결합 단백질을 포함하는, 친화성 분리용 매트릭스에 관한 것이다.

Description

돌연변이된 면역글로불린-결합 단백질 {A Mutated Immunoglobulin-Binding Protein}

본 발명은 돌연변이 단백질, 더 구체적으로는 모(母)분자에 비하여 향상된 안정성을 나타내는 돌연변이 단백질 및 본 발명에 따른 돌연변이 단백질의 제조 방법 분야에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 돌연변이 단백질이 친화성 리간드로 사용되는 친화성 분리 매트릭스에 관한 것이다.

생명공학 및 제약 산업에서 매우 많은 응용분야가 오염물의 철저한 제거에 상당한 주의를 필요로 한다. 이러한 오염물은 예를 들어 단백질, 탄수화물, 지질, 세균 및 바이러스를 비롯한 원치않는 생물분자 또는 미생물과 같은, 크로마토그래피 과정에서 정지상 또는 매트릭스로 흡착되는 비용출 분자일 수 있다. 이러한 오염물을 매트릭스로부터 제거하는 것은 다음 사용 전에 매트릭스를 재생하기 위하여 원하는 생성물을 우선 용출한 후에 수행되는 것이 보통이다. 이러한 제거는 정지상으로부터 오염물을 용출시킬 수 있는 제제를 사용하는 클리닝-인-플레이스 (CIP)로 알려진 과정을 통상 수반한다. 자주 사용되는 그러한 제제 종류는 알칼리 용액이며 이는 상기 정시상 위를 통과한다. 현재는, 가장 널리 사용되는 세정 및 살균제는 NaOH이고, 그 농도는 오염의 정도나 성질에 따라서 0.1에서부터 예를 들면 1 M까지 범위일 수 있다. NaOH는 미생물, 단백질, 지질 및 핵산과 같은 오염물의 멀티로그 감소를 달성하는 효과적인 CIP 제제인 것으로 알려져 있다. NaOH의 또다른 이점은 그것이 아무런 추가의 처리없이도 쉽게 폐기될 수 있다는 점이다. 그러나, 이러한 전략은 13 이상의 pH 값에 매트릭스를 노출시키는 것을 수반한다. 단백성 친화성 리간드를 포함하는 많은 친화성 크로마토그래피 매트릭스의 경우 그러한 알칼리 환경은 매우 거친 조건이어서 결과적으로 관련 고 pH에 대한 리간드의 불안정성으로 인하여 용량의 감소가 초래된다.

따라서, 광범위한 연구가 알칼리 pH 값을 견딜 수 있는 향상된 용량을 나타내는 조작된 단백질 리간드의 개발에 대해 초점이 맞춰져 있었다. 예를 들면, 문헌 (Guelich et al, Susanne Guelich, Martin Linhult, Per-Åke Nygren, Mathias Uhlen, Sophia Hober, Journal of Biotechnology 80 (2000), 169-178: 알칼리 조건에 대한 안정성을 단백질 리간드로 도입하도록 조작할 수 있음)은 단백질 공학을 통해 알칼리 환경에서 스트렙토코쿠스 알부민-결합 도메인 (ABD)의 안정성 성질을 향상시킬 것을 제시하였다. 이전에, 알칼리 조건에서 아스파라긴 및 글루타민 잔기, 펩티드 골격의 탈아미드화 및 절단 등의 구조적 변형이 알칼리 용액으로 처리할 때 활성 손실의 주요 원인이고 아스파라긴이 둘 중에 가장 민감하다는 것이 밝혀졌다 (Geiger, T., and S. Clarke. 1987. Deamidation, Isomerization, and Racemization at Asparginyl and Aspartyl Residues in Peptides, J. Biol. Chem. 262: 785-794). 또한, 탈아미드 속도는 매우 특이적이고 입체구조에 의존적이라는 것도 알려져 있고 (Kosky, A.A., U.O. Razzaq, M.J. Treuheit, and D.N. Brems, 1999, The effects of alpha-helix on the stability of Asn residues: deamindation rates in peptides of varying helicity, Protein Sci . 8: 2519-2523, Kossiakoff, A.A., 1988, Tertiery structure is a principal determinant to protein deamidation, Science, 240: 191-194, Lura, R. and V. Schirch, 1988, Role of peptide conformation in the rate and mechanism of deamidation of asparaginyl residues, Biochemistry 27: 7671-7677) 최단 탈아미드화 반감기는 서열-아스파라긴-글리신- 및 아스파라긴-세린과 관련되었음도 알려져 있다. 따라서, 귈리히 등 (Guelich et al)이 천연 ABD의 4개 아스파라긴 잔기가 전부 루이신 (1개) 아스파르트 (2개), 및 리신 (1개)에 의하여 대체된 ABD 돌연변이를 만들었다. 또한, 귈리히 등은 그들의 돌연변이가 천연 단백질과는 표적 단백질 결합 거동이 유사하고 조작된 리간드를 포함하는 친화성 컬럼은 모(母) 비조작된 리간드를 사용하여 제조된 컬럼보다는 알칼리 조건에 반복 노출된 후에 더 큰 결합 용량을 나타낸다고 보고했다. 따라서, 거기서는 4개 아스파라긴 잔기가 전부 구조 및 기능에 아무런 상당한 영향을 주지 않고도 대체될 수 있다고 결론짓고 있다.

따라서, 귈리히 등에 의하여 수행된 연구는 스트렙토코쿠스 알부민-결합 도메인에 대해 수행되었다. 그러나, 친화성 크로마토그래피는 예를 들면 제약적 응용을 위해서 면역글로불린 등의 다른 분자들의 정제를 위한 프로토콜에도 사용된다. 특히 흥미로운 종류의 친화성 시약은 항체 분자의 불변 부분에 특이적 결합할 수 있고 그러한 상호작용이 항체의 항원-결합 특이성과는 무관한 단백질이다. 그러한 시약은, 혈청 또는 혈장 제제 또는 세포 배양물 유래 공급 원료에 제한되지 않으나 이들과 같은 상이한 샘플로부터 친화성 크로마토그래피에 의한 면역글로불린 회수에 널리 사용될 수 있다. 이런 단백질의 예는 상이한 종으로부터의 IgG 면역글로불린의 Fc 및 Fab 부분에 결합할 수 있는 도메인을 포함하는 스타필로코쿠스 단백질 A이다.

스타필로코쿠스 단백질 A (SpA) 기제 시약은 이들의 높은 친화성 및 선택도로 인하여 생명공학 분야, 예를 들면 항체의 포획 및 정제뿐만 아니라 검출을 위한 친화성 크로마토그래피에서 광범위하게 사용되어 왔다. 현재는, SpA 기제 친화성 매질은 아마도 세포 배양물로부터의 산업적 공급 원료를 포함하는 여러 샘플로부터 모노클론 항체 및 이들의 단편의 단리를 위한 가장 광범위하게 사용되는 친화성 매질이다. 따라서, 단백질 A-리간드를 포함하는 다양한 매트릭스는 예를 들면 천연 단백질 A의 형태로 시판되며 (예를 들면, 프로테인 A 세파로오스 (상표), 스웨덴 웁살라에 소재한 암머샴 바이오사이언스 (Amersham Biosciences) 제품), 또한 재조합 단백질 A (예를 들면, rProtein A Sepharose (상표), 스웨덴 웁살라에 소재한 암머샴 바이오사이언스 제품)로 이루어진다. 더 구체적으로는, 상기 시판되는 재조합 단백질 A 제품에 수행된 유전자 조작은 지지체로 그의 부착을 촉진하는 것을 목적으로 한다.

따라서, 면역글로불린에, 특히 그의 Fc-단편을 통해 결합할 수 있고 알칼리 제제를 사용하는 하나 이상의 세정 과정에 견딜 수도 있는 단백질 리간드를 얻는 것이 이 분야에서 필요하다.

본 발명의 한 목적은 증가된 pH 값에서의 안정성이 향상되고 따라서 모분자와 비교할 때 알칼리 조건하에서의 세정에 대한 내성도 향상된 돌연변이된 면역글로불린-결합 단백질 리간드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 IgG, IgA 및(또는) IgM과 같은 면역글로불린의 Fc 단편에 특이적으로 결합하는 단백질 리간드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 모분자보다 알칼리 조건에서 더 장기간 친화성이 보유되는 상기한 바와 같은 단백질 리간드를 제공하는 것이다.

본 발멸의 또다른 목적은 IgG, IgA 및(또는) IgM과 같은 면역글로블린에, 바람직하게는 이들의 Fc 단편을 통하여 결합할 수 있고 모분자 리간드와 비교할 때 알칼리 조건하에서의 세정에 대한 내성이 향상된 돌연변이 단백질 리간드를 포함하는 친화성 분리 매트릭스를 제공하는 것이다.

상기한 목적 중 하나 이상이 첨부한 청구의 범위에서 기재된 바와 같이 달성될 수 있다.

본 발명에 따르면, 증가된 pH 값에서의 안정성이 향상되고 따라서 모분자와 비교할 때 알칼리 조건하에서의 세정에 대한 내성도 향상된 돌연변이된 면역글로불린-결합 단백질 리간드를 제공할 수 있다.

도 1은 SpA의 5 개의 상동성 도메인 (E, D, A, B 및 C)의 아미노산 배열을 보여준다.
도 2a 및 도 2b는 불안정화된 단백질 Z와 비교하여 돌연변이 단백질의 알칼리 처리 (클리닝-인-플레이스) 후에 얻어진 결과를 보여준다.
도 3은 실시예 4(a)에 기재된 바와 같은, 벡터로 삽입 후의 Z(N23T/N3A/N6D)-Cys를 코딩하는 유전자를 보여준다.
도 4는 실시예 4(a)에 기재된 바와 같은, 플라스미드 pAY91의 플라스미드 지도를 보여준다.
도 5는 실시예 4(b)에 기재된 바와 같은 벡터로 삽입 후에 Z(N23T/N3A/N6D)를 코딩하는 유전자를 보여준다.
도 6은 실시예 5에 기재된 바와 같은 플라스미드 pAY100의 플라스미드 지도의 예를 보여준다.
도 7은 실시예 6에 따른 SPA 프로모터 및 신호 서열과 함께 벡터내로 KpnI-부위를 도입하기 위한 어댑터를 보여준다.
도 8은 실시예 6에 기재된 바와 같이, KpnI-부위를 포함하는 어댑터의 도입에 사용되는 SPA 프로모터 및 신호 서열을 포함하는 플라스미드 pAY104를 보여준다.
도 9는 실시예 6에 따른 어댑터의 삽입 후에 생성된 플라스미드 pAY128을 보여준다.
도 10은 실시예 6의 제작된 클로닝 카세트를 보여주며, 여기서 본래의 어댑터에 밑줄을 그었다.
도 11는 실시예 6에 기재된 Z(N23T/N3A/N6D)-Cys-사량체의 삽입 후의 플라스미드 pAY114를 보여준다.
도 12는 실시예 7의 제작된 클로닝 카세트를 보여주며, 여기서 본래의 어댑터에 밑줄을 그었다.
도 13은 실시예 7에 따른 어댑터의 삽입 후에 생성되는 플라스미드 pAY129를 보여준다.
도 14는 실시예 7에 기재된 Z(N23T/N3A/N6D)사량체-Cys의 삽입 후에 플라스미드 pAY125를 보여준다.
도 15는 실시예 8에 기재된 바와 같이 인간 IgG (hIgG)의 분리로부터 얻어진 크로마토그램이다.
도 16은 실시예 8에 따라 매트릭스의 남아있는 동적 결합 용량을 나타내는 그래프를 보여준다.

정의

용어 "단백질"은 단백질뿐만 아니라 이의 단편을 묘사하는 것으로 여기에 사용된다. 따라서, 3차 구조를 나타내는 모든 아미노산쇄는 "단백질"이란 용어에 포함되며, 따라서 단백질 단편도 포함된다.

본 명세서에서 단백질의 "기능적 변이체"란 용어는 본 발명과 관련하여 친화성 및 안정성으로 정의되는 기능을 본질적으로 보유하는 변이체 단백질을 뜻한다. 따라서 이러한 기능에 관련되지 않는 하나 이상의 아미노산은 교체될 수 있다.

본 명세서에서 "모(母)분자"란 용어는 본 발명에 다른 돌연변이가 도입되기 전의 형태의 상응하는 단백질에 대해 사용된다.

용어 "구조적 안정성"은 분자의 3차원 형태의 견뢰도를 가리키는 반면, "화학적 안정성"은 화학적 분해에 견딜 수 있는 능력을 가리킨다.

용어 "Fc 단편-결합" 단백질은 면역글로블린의 Fc 단편에 결합할 수 있는 단백질을 뜻한다. 그러나, Fc 단편-결합 단백질이 면역글로블린의 Fab 영역과 같은, 다른 영역에 결합할 수도 있음이 배제되지는 않는다.

본 명세서에서, 아미노산은 이들의 완전한 이름으로 명명되지 않는다면, 전통적인 한 글자 기호로 나타낸다.

본 명세서에서 돌연변이는, 야생형 또는 비돌연변이 아미노산 다음에, 교체되는 위치의 번호가 오고 그 다음에 돌연변이된 아미노산을 써서 정의된다. 따라서, 위치 23에서 아스파라긴의 트레오닌으로의 돌연변이는 N23T로 나타낸다.

한 측면에서, 본 발명은 모(母) 면역글로블린-결합 단백질의 아스파라긴 잔기 하나 이상이 글루타민 이외의 다른 아미노산으로 돌연변이되고 이 돌연변이가 모분자와 비교할 때 알칼리 pH 값에서의 화학적 안정성을 증가시키는, 상보성 결정 영역 (CDR)보다는 면역글로불린 분자의 다른 영역에 결합할 수 있는 면역글로블린-결합 단백질에 관한 것이다. 증가된 안정성이란 돌연변이된 단백질의 면역글로블린에 대한 초기 친화성이 하기한 바와 같이 연장된 기간 동안 본질적으로 보유되는 것을 뜻한다.

본 발명에 따라 달성된 표적 단백질에 대한 보유되는 친화성은 돌연변이 단백질의 공간적 입체구조가 보유된 데에 부분적으로 기인한다. 돌연변이된 단백질의 면역글로불린에 대한 친화성은 예를 들면 하기한 실험 부분에서 설명할 바와 같이, 비아코어 (Bioacore, 상표) 2000 표준 설정 (Biacore AB, 스웨덴 웁살라 소재)를 사용하는 생물센서 기술을 통해 당분야의 숙련자에 의하여 시험될 수 있다. 이러한 문맥에서 "본질적으로" 보유한다는 용어는 돌연변이된 단백질이 면역글로불린에 대해 모분자의 것과 동일한 정도의 크기의 친화성을 나타낸다는 것으로 이해된다. 따라서, 초기상에서 돌연변이된 단백질의 결합 용량은 모분자의 것에 필적한다. 그러나, 후술한 돌연변이된 단백질의 화학적 안정성 (조만간 보유됨)으로 인하여 알칼리 환경에서 이의 결합 용량은 모분자의 것보다 더 서서히 감소할 것이다. 환경은 일반적으로 알칼리 조건으로 표시되는 예를 들면, 약 10 이상, 예컨대 약 13 또는 14 이하, 즉, 10 내지 13 또는 10 내지 14인 증가된 pH 값을 의미하는 알칼리로서 정의된다. 이와 다르게는, 이 조건은 NaOH의 농도에 의하여 정의될 수 있으며, 그 농도는 약 1.0 M 이하, 예컨대 0.7 M 또는 구체적으로는 약 0.5 M, 따라서 7 내지 1.0 M 범위내일 수 있다.

본 발명에 따른 돌연변이된 단백질의 증가된 화학적 안정성은 후술한 실험 부분에서 기재된 바와 같이, 0.5 M 농도의 NaOH로 통상적으로 처리하는 등에 의하여 이 분야의 숙련자가 용이하게 확인할 수 있다. 이 문맥에서, "증가된 안정성"이란 상술한 바와 유사하게, 모분자에 의하여 달성되는 것보다 더 장기간 동안 초기 안정성을 보유한다는 것을 뜻하는 것으로 이해되어야 한다. 유사한 돌연변이가 스트렙토코쿠스 알부민-결합 도메인 (Guelich et al., 상기 참조)에 대해 보고되긴 하였으나, 알칼리 환경에서의 분해에 대한 단백질 감수성에 수반되는 탈아미드화의 속도가 서열 및 구조에 크게 의존적이라는 점이 잘 알려져 있다. ABD의 아미노산 서열은 스타필로코쿠스 단백질 A 개별 도메인과 같은 면역글로불린-결합 단백질에 대해 아무런 아미노산 서열 유사성을 포함하지 않기 때문에, 귈리히 등의 설명이 면역글로불린-결합 단백질에도 적용될 수 있을 것으로 보이지는 않을 것이다. 그러나, 본 발명은 면역글로불린-결합 단백질의 하나 이상의 아스파라긴 잔기를 돌연변이시키면 놀랍게도, pH가 약 10 이상, 예컨대 약 13 또는 14까지인 환경에서 화학적 안정성을 증가시키고 이에 따라 분해 속도를 감소시킨다는 것을 최초로 입증하였다.

따라서, 본 발명은 인간 등 포유동물종의 IgG, IgA 및(또는) IgM과 같은 면역글로불린의 선택적 흡착용 친화성 크로마토그래피에서 단백질 리간드 등으로서 유용한 돌연변이된 단백질을 제공한다. 흡착의 목적은 순수한 면역글로불린 분획 또는 면역글로불린이 제거된 지질 등 정제된 생성물을 제조하거나 또는 샘플 중의 면역글로불린의 존재를 검출하는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 리간드는 연장된 기간 동안 통상적인 알칼리 세정을 견디기에 충분한 화학적 안정성을 나타내기 때문에, 이 리간드는 컬럼의 재생이 필요한 비용 효율적 대규모 작업에 있어서 매력적인 후보가 된다.

따라서, 본 발명에 따른 단백질에서는, 하나 이상의 아스파라긴 (N) 잔기가 글리신 (G), 알라닌 (A), 발린 (V), 루이신 (L), 이소루이신 (I), 세린 (S), 트레오닌 (T), 시스테인 (C), 메티오닌 (M), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W), 글루탐산 (E), 아르기닌 (R), 히스티딘 (H), 리신 (K) 또는 프롤린 (P), 또는 원치않는 탈아미드화 및 이성질화에 감수성이 없는 임의의 변형된 아미노산으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산으로 돌연변이되었다. 이와 다르게는, 하나 이상의 아스파라긴 (N) 잔기가 글루타민 (Q)로 돌연변이되었다.

면역글로불린-결합 단백질은 스타필로코쿠크 단백질 A (SpA) 또는 스트렙토코쿠스 단백질 G (SpG) 등 천연 면역글로불린-결합 용량을 갖는 모든 단백질일 수 있다. 다른 그런 단백질을 검토하기 위하여는, 예를 들면 문헌 (Kronvall, G., Jonsson, K. Receptins: a novel term for an expanding spectrum of natural and engineered microbial proteins with binding properties for mammalian proteins), J. Mol . Recognit . 1999 Jan-Feb; 12(1): 38-44)를 참조한다.

한 구체예에서, 본 발명은 면역글로불린-결합 단백질의 결합 영역을 적어도 포함하며 그 영역 내에서 하나 이상의 아스파라긴 돌연변이가 존재하는 돌연변이된 단백질이다. 따라서, 이 구체예에서는 본 발명에 따른 돌연변이된 단백질은 서열 1 또는 2에 정의된 서열의 약 75 % 이상, 예컨대 약 80 % 이상, 또는 바람직하게는 약 95 % 이상을 포함하되, 다만 위치 21에는 아스파라긴 돌연변이가 존재하지 않는다.

본 명세서에서, 서열 1은 SpA의 B 도메인의 아미노산 서열을 정의하며, 서열 2는 단백질 Z로 알려진 단백질을 정의한다.

단백질 Z는 SpA의 B 도메인으로부터 유래된 합성 제작물이며, 여기서 위치 29의 글리신은 알라닌으로 대체되었고 문헌에 공개되어 있다. 예를 들면 문헌 (Stahl et al, 1999: Affinity fusions in biotechnology: focus on protein A and protein G, in the Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation. M.C. Fleckinger and S.W. Drew, editors. John Wiley and Sons Inc., New York, 8-22)를 참조한다. 또한 단백질 Z는 친화성 크로마토그래피에서 리간드로서 사용되었다. 그러나 단백질 Z가 SpA B-도메인과 비교할 때 NaOH 이외의 다른 특정한 화합물에 대해 향상된 화학적 안정성을 나타낸다고 하더라도 경제적 산업용 공장에서 필요한 많은 CIP 재생 단계를 견디는 데 필요한 만큼, 증가된 pH 값의 조건에서 안정한 것은 여전히 아니다.

한 구체예에서, 상술한 돌연변이 단백질은 서열 1 또는 2에 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이의 기능적 변이체이다. 이 맥락에서 사용된 용어 "기능적 변이체"는, 증가된 pH 값의 환경에서 돌연변이 단백질의 향상된 화학적 안정성 또는 면역글로불린에 대한 친화성에는 영향을 주지 않는 아미노산 위치에서 하나 이상의 추가 변이를 포함하는 모든 유사한 서열을 포함한다.

유익한 구체예에서, 본 돌연변이는 N23T, N23T와 N43E, N28A, N6A, N11S, N11S와 N23T, 및 N6A와 N23T로 이루어진 군에서 선택되며, 모분자는 서열 2에 의하여 정의된 서열을 포함한다. 상술한 바와 같이, 알칼리 조건에서 연장된 기간 동안 높은 결합 용량을 갖는 리간드로서 유용한 돌연변이 단백질을 얻기 위하여는, 위치 21에서 아스파라긴 잔기의 돌연변이는 피한다. 한 구체예에서는 위치 3의 아스파라긴 잔기는 돌연변이되지 않는다.

가장 유익한 구체예에서는, 본 단백질에서 루이신 잔기와 글루타민 잔기 사이에 위치한 아스파라긴 잔기를 예를 들어 트레오닌 잔기로 돌연변이시켰다. 따라서, 한 구체예에서는 서열 2에 정의된 서열의 위치 23의 아스파라긴 잔기가 예를 들어 트레오닌 잔기로 돌연변이되었다. 특정한 구체예에서는, 서열 2에 정의된 서열의 위치 43에서 아스파라긴 잔기도 예를 들어 글루탐산으로 돌연변이되었다. 아미노산 43번이 돌연변이된 한 구체예에서는, N23T와 같은 하나 이상의 추가의 돌연변이와 가장 유리하게 결합될 수 있는 것으로 보인다.

SpA의 B-도메인 및 단백질 Z의 여러 아스파라긴 잔기가 돌연변이된 단백질의 친화성 및 안정성 특성에 대해 상이한 영향을 줄 수 있다는 본 발명에 따른 발견은 전혀 예상치 못한 것이었다. 특히 ABD의 모든 아스파라긴 잔기가 아무런 내부적 차별화 없이 돌연변이될 수 있다고 결론을 내린 귈리히 등의 상술한 설명의 관점에서 볼 때 그러하다.

따라서, 본 발명은 상술한 단량체인 돌연변이 단백질을 포함한다. 그러나 그러한 단백질 단량체는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 등의 다량체 단백질로 결합될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또다른 측면은 본 발명에 따른 돌연변이 단백질 하나 이상을 하나 이상의 추가 단위, 바람직하게는 역시 본 발명의 돌연변이 단백질와 함께 포함하는 다량체이다. 따라서, 본 발명은 예를 들면 반복 단위 2개를 포함하는 이량체이다.

한 구체예에서, 본 발명에 따른 다량체는 단량체 단위들이 아미노산 스트레치, 바람직하게는 5 내지 10개 등 0 내지 15개의 아미노산 스트레치로 연결된다. 이러한 연결부의 성질은 바람직하게는 단백질 단위들의 공간적 입체구조를 불안정하게 하여서는 않된다. 또한 바람직하게는 이 연결부는 돌연변이 단백질 단위들의 성질을 훼손하지 않도록 알칼리 환경에서 충분히 안정적어야 한다.

현재 최선의 구체예에서 다량체는 연결 단위 길이가 아미노산 5 내지 10개이고 돌연변이 N23T를 포함하는 단백질 Z의 사량체이다. 한 구체예에서, 본 다량체는 서열 VDAKFN-Z(N23T)-QAPKVDAKFN-Z(N23T)QAPKC를 포함한다. 또다른 구체예에서는 다량체가 서열 VDAKFD-Z(N23T)-QAPKVDAKFD-Z(N23T)-ZQAPKC를 포함한다.

특정한 구체예에서 본 다량체는 또한, 스타필로코쿠스 단백질 A의 E, D, A, B 및 C 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 이 구체예에서는 루프 영역에 위치한 아스파라긴 잔기가 더욱 가수분해 안정성인 아미노산으로 돌연변이된 것이 바람직하다. 구조적 안정성을 이유로 유익한 구체예에서는 서열 1의 위치 29의 글리신 잔기 역시 바람직하게는 알라닌 잔기로 돌연변이되었다. 또한, 위치 52에서 아스파라긴 잔기의 돌연변이를 피하는 것이 구조적 안정성에 유리한데, 이는 그것이 단백질 A 분자의 α-나선 2차 구조 함량에 기여하는 것으로 발견되었기 때문이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 상술한 돌연변이 단백질 또는 다량체를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 잘 확립된 생명공학 방법에 따라 재조합 숙주내에서 돌연변이 단백질을 발현시킴으로써 돌연변이 단백질을 제조하는 데 사용될 수 있는 DNA 서열을 포함한다. 결과적으로, 본 발명의 또다른 측면은 상술한 돌연변이 단백질의 제조를 가능하게 하는 발현계이다. 세균 숙주를 예를 들면 하기한 실험 부분에 기재된 바와 같이 편리하게 사용할 수 있다. 또다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 돌연변이 단백질을 발현하도록 유전자 조작된 세포주이다. 이런 목적을 위한 방법에 관하여는 예를 들면 문헌 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed), vols 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)을 참조한다.

당연히, 원하는 서열이 확립되면, 본 발명에 따른 돌연변이 단백질은 합성 방법에 의하여도 달리 제조할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 돌연변이 단백질 또는 다량체를 제조하기 위한 생명공학적 방법 또는 합성 방법을 포함한다.

또다른 측면에서, 본 발명은, 고체 지지체에 결합되고 하나 이상의 아스파라긴 잔기가 글루타민 이외의 아미노산으로 돌연변이된 면역글로불린-결합 단백질을 포함하는 리간드를 포함하는 친화성 분리용 매트릭스에 관한 것이다. 본 매트릭스는 리간드로서 모분자를 포함하는 매트릭스와 비교할 때 간헐적 알칼리 세정에도 불구하고 2 이상의 분리 동안에 증가된 결합 용량을 나타낸다. 돌연변이된 단백질 리간드는 바람직하게는 Fc 단편-결합 단백질이며, IgG, IgA 및(또는) IgM, 바람직하게는 IgG의 선택적 결합에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 매트릭스는 리간드로서 그의 어떠한 구체예에서나 상술한 돌연변이 단백질을 포함할 수 있다. 가장 바람직한 구체예에서는 고체 지지체 상에 존재하는 리간드가 상술한 다량체를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 매트릭스의 고체 지지체는 모든 적합한 공지된 종류의 것일 수 있다. 통상적인 친화성 분리 매트릭스는 종종 유기 성질이며, 사용된 수성 매질로 친수성 표면을 노출시키는, 즉 자신의 외부로 그리고 존재한다면 내부 표면상에도 역시 히드록시 (-OH), 카르복시 (-COOH), 카르복스아미도 (-CONH₂, 아마도 N-치환된 형태로), 아미노 (-NH₂, 아마도 치환된 형태로), 올리고- 또는 폴리에틸렌옥시기를 노출시키는 중합체를 기제로 한다. 한 구체예에서, 중합체는 예를 들면, 덱스트란, 전분, 셀룰로오스, 풀루란, 아가로오스 등의 다당류, 유리하게는 예를 들어 비스에폭시드, 에피할로히드린, 1,2,3-트리할로 치환된 저급 탄화수소와 함께 가교결합된 다당류를 기제로 하여, 적합한 다공성 및 강도를 제공할 수 있다. 가장 바람직한 구체예에서는 고체 지지체가 다공성 아가로오스 비드이다. 본 발명에 사용된 지지체는 역 (inverse) 현탁액 겔라틴화 등 표준적 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있다 (S Hjerten: Biochem Biophys Acta 79 (2), 393-398 (1964)). 이와 다르게는, 기제 매트릭스가 시판되는 제품, 예컨대 세파로오스 (상표) FF (Amersham Biosciences, 스웨덴 웁살라 소재)이다. 대규모 분리에 특히 유리한 한 구체예에서 지지체는 그 강도를 증가시키도록 적응시켜서 매트릭스를 높은 유속에 대해서 더 적합하게 한다.

이와 다르게는 고체 지지체는 폴리비닐 알코올, 폴리히드록시알킬 아크릴레이트, 폴리히드록시알킬 메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 등의 합성 폴리머를 기제로 한다. 디비닐 및 모노비닐-치환된 벤젠을 기제로 한 매트릭스와 같은 소수성 폴리머의 경우에는, 매트릭스 표면이 종종 친수성화되어 둘러싼 수성 액체로 상기한 바와 같은 친수성 기를 노출시킨다. 이러한 폴리머는 표준적 방법에 따라 용이하게 제조하며, 예를 들면 문헌 ("Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization", R. Arshady: Chimica eL'Industria 70 (9), 70-75 (1988))을 참조한다. 이와 다르게는, 시판되는 제품, 예를 들면 소스 (Source, 상표) (Amersham Biosciences, 스웨덴 웁살라 소재)가 사용된다.

또다른 구체예에서는 본 발명에 따른 고체 지지체는 실리카, 산화지르코늄 등의 무기 성질의 지지체를 포함한다.

또다른 구체예에서는, 고체 지지체가 표면, 칩, 모세관 또는 필터 등의 다른 형태이다.

본 발명에 따른 매트릭스의 모양과 관련하여, 한 구체예에서는, 매트릭스는 다공성 모노리쓰 (monolith)의 형태이다. 또다른 구체예에서는, 매트릭스가 다공성 또는 비다공성일 수 있는 비드형 또는 입자형이다. 비드 또는 입자형 매트릭스가 꽉찬 베드로서 또는 현탁된 형태로 사용될 수 있다. 현탁된 형태는 확장된 베드 및 순수한 현탁액으로 알려진 것들을 포함하며, 그 안에서 입자 또는 비드는 자유롭게 움직인다. 모노리쓰, 꽉찬 베드 및 확장된 베드의 경우, 분리 과정은 농도 구배를 통한 통상적인 크로마토그래피 이후에 하는 것이 보통이다. 순수한 현탁액은 배치식 방식으로 사용될 것이다.

리간드는 예를 들어 리간드에 존재하는 아미노기 및(또는) 카르복시기를 사용하는 통상적인 커플링 기술을 통해 지지체에 부착될 수 있다. 비스에폭시드, 에피클로로히드린, CNBr, N-히드록시숙신이미드 (NHS) 등은 잘 알려진 커플링제이다. 지지체와 리간드 사이에, 스페이서로서 알려진 분자를 도입할 수 있으며, 이는 리간드의 활용도를 향상시키고 리간드의 지지체로의 화학적 커플링을 용이하게 할 것이다. 이와 다르게는, 리간드는 물리적 흡착 또는 생물특이적 흡착 등의 비공유결합에 의하여 지지체에 부착될 수 있다.

유리한 구체예에서는, 본 리간드가 티오에테르 결합에 의하여 지지체에 커플링되었다. 이러한 커플링을 수행하기 위한 방법은 이 분야에서는 잘 알려져 있고, 이 분야의 숙련자라면 표준적인 기술 및 장치를 사용하여 용이하게 수행할 것이다. 유리한 구체예에서는, 커플링에서 나중에 사용할 말단 시스테인 잔기를 리간드에 우선 제공한다. 이 분야의 숙련자라면 정제의 적절한 단계도 용이하게 수행할 것이다.

상술한 바와 같이, 본 리간드의 면역글로불린에 대한 친화성, 즉 결합 성질 및 이에 따른 매트릭스의 용량은 알칼리 제제로 처리하여도 조만간 본질적으로 변화되지 않는다. 통상적으로 친화성 분리 매트릭스의 클리닝-인-플레이스 처리의 경우, 사용되는 알칼리 제제는 NaOH이며, 그 농도는 0.75 M이하, 예컨대 0.5 M이다.

따라서, 본 발명에 따른 매트릭스를 특징분석하는 또다른 방법은 상술한 돌연변이로 인하여 0.5 M NaOH로 7.5 시간 동안 처리한 후에 그의 결합 용량이 약 70 % 미만, 바람직하게는 약 50 % 미만, 더 바람직하게는 약 30 % 미만, 예컨대, 약 28 %로 감소할 것이라는 것이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 돌연변이 단백질, 다량체 또는 매트릭스가 사용되는, IgG, IgA 및(또는) IgM 등의 면역글로불린을 단리하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 표적 화합물이 상기한 돌연변이 단백질 또는 다량체 또는 매트릭스에 흡착됨으로써 액체로부터 분리되는, 크로마토그래피 방법을 포함한다. 원하는 생성물이 분리된 화합물 또는 액체일 수 있다. 따라서, 본 발명의 이런 측면은 널리 사용되고 잘 알려진 분리 기술인 친화성 크로마토그래피에 관한 것이다. 간단하게 설명하면, 제1 단계에서 표적 화합물, 바람직하게는 상술한 바와 같은 항체를 포함하는 용액을 표적 화합물이 분리 매트릭스 상에 존재하는 리간드에 흡착될 수 있는 조건하에서 분리 매트릭스를 통과시킨다. 이러한 조건은 예를 들면 pH 및(또는) 염 농도, 즉 용액 중의 이온 세기에 의하여 조절된다. 매트릭스의 용량을 초과하지 않도록 주의해야 하는데, 즉 만족스러운 흡착이 가능하도록 충분히 흐름을 느리게 하여야 한다. 이 단계에서, 그 용액의 다른 성분들은 원칙적으로 막히지 않고 통과할 것이다. 필수적인 것은 아니나, 보유된 물질 및(또는) 느슨하게 결합된 물질을 제거하기 위하여 그 후 매트릭스는 수용액 사용하는 등에 의하여 세척한다. 본 매트릭스는 상술한 바와 같이, 알칼리 제제를 사용하는 세척 단계를 통해 가장 유리하게 사용된다. 다음 단계에서, 용출제로 칭하는 제2 용액을 표적 화합물의 탈착, 즉 방출을 가능케 하는 조건하에 매트릭스 위로 통과시킨다. 이러한 조건은 pH, 염 농도, 즉 이온 세기, 소수성 등의 변화에 의하여 통상 제공된다. 구배 용출 및 단계식 용출 등 여러 가지 용출 방법이 알려져 있다. 용출은 매트릭스 상에서 원하는 항체를 대체할 경쟁 물질을 포함하는 제2 용액에 의해도 가능할 수 있다. 친화성 크로마토그래피의 원리의 일반적 개관은 예를 들면 문헌 (Wilchek, M., and Chaiken, I. 2000, An overview of affinity chromatography, Methods Mol. Biol. 147:1-6)을 참조한다.

또다른 구체예에서, 본 발명에 따른 돌연변이 단백질은 유기 화합물이 그 3차원 구조를 닮도록 모델화하는 방법에서 유도 (lead) 화합물로서 사용된다. 그렇게 모델화된 화합물은 모방체 (mimetic)로서 알려져 있다. 모방체 디자인, 합성 및 시험을 사용하여 다량의 분자를 무작위로 스크리닝하는 것을 피할 수 있다. 간단하게 설명하면, 이러한 방법은 면역글로불린-결합과 같은 성질에 있어서 결정적이고(거나) 중요한 단백질의 특정 부분을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 일단 이들 부분이 밝혀지면, 그 구조는 분광 기술, X-선 회절 데이타 및 NMR 등의 소스 범위로부터의 데이타를 사용하여 예를 들면, 입체 화학, 결합, 크기, 전하 등의 물리적 성질에 따라 모델화된다. 컴퓨터 분석, 유사성 지도화 및 기타 기술을 이 방법에 사용할 수 있다. 이런 종류의 방법에서 중요한 고려사항은 화합물 합성의 용이성, 약리적 허용성, 생체내 분해 패턴 등이다.

마지막으로, 본 발명은 또한 어레이 등에서, 의학적 목적, 예를 들면 진단을 위한 분석적 방법에서와 같이 상술한 돌연변이 단백질의 다른 용도도 포함한다.

도면의 상세한 설명

도 1은 SpA의 5 개 상동성 도메인 (E, D, A, B 및 C)의 아미노산 배열을 보여준다. 수평한 선은 아미노산 동일성을 표시한다. 3개 박스는 타시로 및 그 공동연구자에 의하여 결정된 (Tashiro et al., 1997) Z_wt의 α-나선을 보여준다. B 도메인에서 교체된 아스파라긴 잔기 및 또한 하나의 글리신 잔기가 그 도면에서 밑줄로 표시되어 있다. 또한 Z_wt 및 Z(N23T)의 아미노산 배열을 보여준다.

도 2는 불안정화된 단백질 Z와 비교한, 본 발명에 따른 돌연변이 단백질의 알칼리 처리 (클리닝-인-플레이스) 후에 얻어진 결과를 보여준다. 통상적인 친화성 크로마토그래피 후에 반복된 CIP-처리 후의 용량의 비교. 0.5 M NaOH를 세정제로 사용하였다. 프로토콜을 16회 시행하고, 알칼리 세척 지속시간은 각 회마다 30 분이었다. 도 2a는 Z(F30A) 및 그 변이체의 불활성화 패턴을 보여주며, 도 2b는 Z_wt 및 Z(N23T)의 불활성화 패턴을 보여준다.

도 3은 실시예 4(a)에 기재된 바와 같이 벡터로 삽입 후의 Z(N23T/N3A/N6D)-Cys를 코딩하는 유전자를 보여준다. 돌연변이는 * 로 표시한다.

도 4는 실시예 4(a)에 기재된 바와 같이 Z(N23T/N3A/N6D)-Cys를 코딩하는 유전자를 포함하는, 플라스미드 pAY91의 플라스미드 지도를 보여준다.

도 5는 실시예 4(b)에 기재된 바와 같이 벡터로 삽입 후의 Z(N23T/N3A/N6D)를 코딩하는 유전자를 보여준다. 돌연변이는 * 로 표시한다.

도 6은 실시예 5에 기재된 바와 같이 Z(N23T/N3A/N6D)-Cys의 사량체를 발현하는 플라스미드 pAY100의 플라스미드 지도의 예를 보여준다.

도 7은 실시예 6에 따른 SPA 프로모터 및 신호 서열을 갖는 벡터 내로 Kpn-I 부위를 도입하기 위한 어댑터를 보여준다.

도 8은 실시예 6에 기재된 바와 같이, KpnI-부위를 포함하는 어댑터의 도입에 사용되는 SPA 프로모터 및 신호 서열을 포함하는 플라스미드 pAY104를 보여준다.

도 9는 실시예 6에 따른 어댑터의 삽입 후에 생성된 플라스미드 pAY128을 보여준다.

도 10은 실시예 6의 제작된 클로닝 카세트를 보여주며, 여기서 본래의 어댑터에 밑줄을 그었다.

도 11는 실시예 6에 기재된 Z(N23T/N3A/N6D)-Cys-사량체의 삽입 후의 플라스미드 pAY114를 보여준다.

도 12는 실시예 7의 제작된 클로닝 카세트를 보여주며, 여기서 본래의 어댑터에 밑줄을 그었다.

도 13은 실시예 7에 따른 어댑터의 삽입 후에 생성되는 플라스미드 pAY129를 보여준다.

도 14는 실시예 7에 기재된 Z(N23T/N3A/N6D)사량체-Cys의 삽입 후에 플라스미드 pAY125를 보여준다.

도 15는 실시예 8에 기재된 바와 같이 실행 후에 얻어진 크로마토그램이며, 여기서 제1 피크는 흐름 통과 물질에 상응하며 제2 피크는 용출된 hIgG에 상응한다.

도 16은 실시예 8에 따라 매트릭스의 남아있는 동적 결합 용량을 나타내는 그래프를 보여준다. 위에서부터 아래로 이들은 Z(N23T/N3A/N6D)이량체-Cys, Z(N23T/N3A)이량체-Cys, Z(N23T)이량체-Cys, 및 Z(N23T/K4G)이량체-Cys를 각각 나타낸다. 소프트웨어 문제로 인하여, Z(N23T/N3A)이량체-Cys에 대한 마지막 2개 측정 점은 없다.

실험 부분

이하에서는 본 발명이 예를 통해서 설명될 것이며, 그러한 예는 단지 예시 목적으로 제공되는 것이므로 첨부된 청구의 범위에 의하여 정의되는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 생각되어서는 않된다. 본 출원에서 하기에 또는 다른 곳에 제공된 모든 참고문헌은 언급에 의하여 본 명세서에 포함된다.

이 부분에서, 본래 형태의 Z는 알칼리 처리에 대한 안정성이 상당하나 충분하지 못하기 때문에, 돌연변이로 인한 안정성의 작은 변화는 실험실 시험에서 평가되기 어려울 것으로 생각되었다. 따라서, 서프레서 돌연변이 방법 (Kotsuka, T. , S. Akanuma, M. Tomuro, A. Yamagishi, and T. Oshima. 1996, Further stabilisation of 3-isopropylmalate dehydrogenase of an extreme thermophile, Thermus thermophilus, by a suppressor mutation method. J Bacteriol. 178: 723-727; 및 Sieber, V., A. Plueckthun, and F. X. Schmidt. 1998, Selecting proteins with improved stability by a phage-based method, Nature Biotechnology, 16: 955-960)을 사용하여 구조적 안정성이 감소된 Z 도메인의 변이체를 제공하였다. 이런 전략에 따라서, 단백질 Z의 불안정화된 변이체 (여기서는 Z(F30A)로 명명됨)(Cedergren et al., 1993, 앞의 문헌)를 알칼리 안정성의 연구에 관련된 추가의 돌연변이의 뒤이은 도입을 위한 골격으로 사용하였다. 이 변이체의 결합 성질은 천연 단백질 Z와 유사한데, F30이 Fc 결합에 관여하지 않기 때문이다. 또한 Zwt는 F30A 치환을 포함하지 않는 야생형 Z 도메인을 표시한다.

실험 전략

Z 도메인에서 어떤 아스파라긴이 알칼리 조건에서 불안정성에 대해 책임이 있는지를 분석하기 위하여, 상호 분석을 수행하였다. Z 도메인의 알칼리 안정성에 관한 개선을 검출할 수 있도록 하기 위해 돌연변이된 변이체 Z(F30A)의 사용을 결정했는데, Z 도메인은 이미 알킬리 조건에 대한 충분하지 않으나 상당한 안정성을 가지기 때문이다. Z(F30A)은 야생형과 유사한, IgG에 대한 친화성을 갖는 것으로 일찍이 입증되었으나, 또한 소수성 중심부에 보통 참여하는 아미노산의 돌연변이로 인하여 구조적 안정성이 현저히 감소하는 것으로 입증되었다 (Cedergren et al., 1993, 앞의 문헌; Jendeberg, L., B. Persson, R. Anderson, R. Karlsson, M. Uhlen, and B. Nilsson. 1995, Kinetic analysis of the interaction between protein A domain and human Fc using plasmon resonance detection, Journal of Molecular Recognition, 8:270-278). Z-도메인은 8개의 아스파라긴 (N3, N6, N11, N21, N23, N28, N43 및 N52) (도 1)을 포함하여 58 개 아미노산으로 이루어진 3-나선 다발이다 (Nilsson, B. , T. Moks, B. Jansson, L. Abrahmsen, A.Elmblad, E. Holmgren, C. Henrichson, T.A. Jones, and M. Uhlen, 1987, A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein A, Protein Eng. 1: 107-113). 알칼리 조건에서 탈아미드화 속도에 대한 여러 아스파라긴의 영향을 평가하기 위하여, 7 개의 이들 잔기를 다른 아미노산으로 교체하였다. N3은 그 도메인의 유연한 아미노-말단에 위치하기 때문에 연구로부터 제외되었다. 이 아미노산의 탈아미드화는 단량체 리간드의 활성에 영향을 주기 않기 때문에 보유된 활성을 측정하는 본 분석에서는 검출되지 않을 것으로 생각되었다. 또한 그 아미노산이 도메인의 구조적 부분의 외부에 위치하므로, 아마도 그 도메인의 다량체화 동안에 용이하게 교체되어 단백질 A-유사 분자를 얻을 수 있을 것으로 생각된다. 단백질 디자인을 용이하게 하기 위하여 단백질 A의 나머지 도메인의 상동성 서열과 비교하였다 (도 1)(Guelich et al., 2000a). 이 비교로부터 아스파라긴 11을 세린으로 교체하고 23을 트레오닌으로 교체하고, 마지막으로 43을 글루탐산으로 교체할 것을 결정하였다. 아스파라긴 6은 알라닌으로 교체했는데, 상동성 서열에서 관찰했을 때 그 대응 잔기 (alternative)가 알칼리 조건에서 민감한 것으로 보고된 아스파르트산이었기 때문이다. 단백질 A의 5 개 도메인 전부가 다른 위치 (21, 28, 52)에서 아스파라긴을 갖는다. 따라서, 이들이 알라닌으로 대체되었다.

< 실시예 1: 돌연변이 단백질 Z의 돌연변이유발, 발현 및 정제>

재료 및 방법

위치지정 (site-directed) 돌연변이 유발을 2 단계 PCR 기술을 통해 수행했다 (Higuchi et al., 1988). 플라스미드 pDHZF30A (Cedergren et al., 1993)을 주형 (template)으로 사용하였다. 상이한 아스파라긴 대체물을 코딩하는 올리고뉴클레오티드 및 A29G 대체물을 인터액티바 (Interactiva, Interactiva Biotechnologie GmbH, 독일 울름 소재)에 의하여 합성하였다. 제한 효소 XbaI 및 HindIII (MBI Fermentas Inc., 미국 뉴욕주 암허스트 소재)를 벡터 pDHZ (Jansson et al., 1996)내로의 클로닝에 사용하였고, 이는 샘브룩 (Sambrook et al., 1987)에 따라 수행되었다. pTrpZ를 만들기 위하여, Z 도메인을 플라스미드 pKN1을 주형으로 사용하여 PCR을 통해 증폭시켰다 (Nord et al., 1995). 단편을 XbaI 및 PstI으로 절단하여 동일한 효소로 절단한 벡터 pTrpABDT1T2 (Kraulis et al., 1996)내로 라이게이션시켰다. MegaBACE 1000 DNA 서열분석계 (Amersham Biosciences, 스웨덴 웁살라 소재)를 사용하여 삽입된 단편의 정확한 서열을 입증하였다. MegaBACE 터미네이터 화학 (Amersham Biosciences, 스웨덴 웁살라 소재)을 공급자의 조언에 따라서 디데옥시 방법 (Sanger et al., 1977)에 기초한 사이클 서열분석 프로토콜에 사용하였다. 클로닝 과정 동안에 대장균 (Escherichia coli) 균주 RR1ΔM15 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 미국 매사추세츠주 록크빌 소재)를 사용한 반면, 상이한 유전자 생성물의 발현을 위해서는 017 (Olsson, M.O., and L. A.Isaksson, 1979, Analysis of rpsD Mutations in Escherichia coli. I: Comparison of Mutants with Various Alterations in Ribosomal Protein S4. Molec . gen . Genet. 169:251-257)을 사용하였다.

Z(F30A) 및 이의 상이한 제작물의 제조 및 정제는 귈리히 (Guelich et al., 2000b, 상기 참조)에 의하여 개괄된 프로토콜에 따라 수행했다. Z 및 pZ(N23T)를 문헌 (Kraulis, P. J., P. Jonasson, P.-Å. Nygren, M. Uhlen, L. Jendeberg, B. Nilsson, and J. Koerdel, 1996, The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helix bundel: a heteronuclear NMR study. FEBS lett. 378: 190-194)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 관련 단편을 동결건조하였다. 단백질의 양을 비흡광계수 (1 g^-1cm^-1)를 사용하여 280 nm에서 흡광도 측정에 의하여 평가하였다: Z 0.156; Z(N23T), 0.169 ; Z(F30A), Z(F30A,N43E), Z(F30A,N23T,N43E) 0.157; Z(F30A,N6A), Z(F30A,N11S), Z(F30A,N21A), Z(F30A,N23T), Z(F30A,N28A), Z(F30A,N52A), Z(F30A,N6A,N23T), Z(F30A,N11S,N23T) 0.158. 농도는 아미노산 분석 (BMC, 스웨덴 웁살라)에 의하여 확인하였다. 상동성은 파스트 (Phast) 시스템을 사용하여 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)으로 분석하였다 (Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227:680-685). 동결건조된 단백질을 환원 조건 하에서 고밀도 겔 (암머샴 바이오사이언스, 스웨덴 웁살라 소재)상에 로딩하고, 공급자의 조언에 따라서 쿠마시 브릴리언트 블루 (Coomassie Brilliant Blue)로 염색하였다. 상동성 및 분자량은 질량분광계로 추가 확인하였다.

CD 분광계의 경우 단백질 샘플은 인산 완충액 (8.1 mM K₂HP0₄, 1.9 mM KH₂PO₄, pH 7.5) 중에 10 pM의 농도로 제조하였다. 스펙트럼은 J-720 분광편광계(JASCO, 일본 도쿄 소재)를 사용하여 통로 길이 0.1 cm의 수정격자에서 실온의 250 내지 200 nm의 원자외선 영역에서 스캔 속도 10 nm/분의 속도로 기록하였다. 각 스펙트럼은 5개의 축적된 스캔의 평균이었고, 최종 스펙트럼은 MRE (mean residue ellipticity) (degcm²dmol^-1)로 전환되었다.

결과 ( 실시예 1)

모든 Z 변이체가 37 ℃ 대장균에서 성공적으로 세포내 제조되었고 SDS-PAGE로부터 평가한 바로는 대략 50 mg/l로 동일한 발현율을 보인다. 단백질은 모두 IgG 친화성 크로마토그래피에 의하여 정제되었다. 정제 후에는 샘플을 SDS-PAGE로 분석하고 (데이타는 기재하지 않음), 동결건조하고, 추가 분석을 위해 보관하였다. 단백질 Z를 위한 분자량 및 이의 상이한 돌연변이도 질량 분광계에 의하여 확인되었다. 이 데이타를 통해 모든 돌연변이에 대한 정확한 아미노산 함량을 확인하였다 (데이타는 기재하지 않음). 또한 구조 분석을 원편광이색성 (CD) 장치로 수행하였는데, 왜냐하면 그것이 α-나선 단백질에서의 구조 변화를 검출하기에 적합하다는 것이 이전에 입증되어 있었기 때문이다 (Johnson, C. W. , Jr. 1990, Protein secondary structure and circular dichroism : a practical guide, Proteins, 7: 205-214; 및 Nord, K., J. Nilsson, B. Nilsson, M. Uhlen, and P.-Å. Nygren. 1995, A combinatorial library of an 알파-helical bacterial receptor domain. Prot. eng 8: 601-608). 모든 스펙트럼은 208 nm 및 222 nm에서 최소, 195 nm 주변에서 최대치를 보였는데, 이는 돌연변이와 모분자간의 구조가 유사함을 지시한다. 그러나, Z(F30A,N52A)는 야생형 Z 및 이의 다른 돌연변이보다는 어느 정도 더 낮은 알파-나선성을 갖는 것으로 보인다 (데이타는 기재하지 않음).

< 실시예 2: 생물특이적 상호작용 분석>

재료 및 방법

회합 및 해리 상태의 열역학 및 친화성 상수의 차이들을 비아코어 (상표) 2000 장치 (Biacore, 스웨덴 웁살라 소재)로 검출하였다. 인간 폴리클로날 IgG 및 HSA (음성 표준)를 공급자의 조언에 따라서 CM5 센서칩 (Biacore)의 카르복실화 덱스트란층상에 아민 커플링에 의하여 고정시켰다. IgG의 고정화는 대략 2000 RU. Z, ZF30A을 초래하고, 상이한 돌연변이들을 HBS (10 mM HEPES, 0.15 M NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.005 % 계면활성제 P20, pH 7.4) 중에 10 가지 상이한 농도 (100-550 nM)로 제조하였다. 샘플을 30 ㎕/분의 유속으로 무작위순으로 두 벌 (duplicate)로 표면 위에 주입하였다. 10 mM HCl을 사용하여 표면을 재생시켰다. 데이타를 BIA 평가 3.0.2b 소프트웨어 (Biacore AB)를 사용하여 분석하였다. HSA가 고정된 대조구 표면으로부터의 신호를 IgG 표면에서 뺐다. 1: 1 랑뮤어 모델을 가정하고, 겉보기 열역학 상수 및 친화성 상수를 계산하였다. 또한 천연 분자와 관련한 자유결합에너지의 변화 (ΔΔG =-RTln K_aff _, _mutant/K_aff _, _native)를 계산하였다.

결과 ( 실시예 2)

Z 변이체들의 IgG에 대한 친화성의 차이를 결정하기 위하여, 비아코어를 사용하여 표면 플라스몬 공명 (SPR)을 수행하였다. 그 목적은 모분자와 본 발명에 따른 여러 돌연변이된 Z 변이체들에 있어서의 친화성을 비교하기 위한 것이었다. 상술한 바와 같이, 모 Z 도메인의 높은 알칼리 안정성으로 인하여 F30A를 포함하는 구조적으로 불안정화된 Z 변이체를 사용하는 것으로 결정하였다 (Cedergren, L., R. Andersson, B. Jansson, M. Uhlen, and B. Nilsson, 1993, Mutational analysis of the interaction between staphylococcal protein A and human IgG_l. Protein eng. 6: 441-448). 따라서, 돌연변이된 분자와 IgG 사이의 친화성이 돌연변이에도 불구하고 보유된다는 것을 우선 확인하는 것이 중요했다. 아래 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, Z(F30A)의 친화성은 그다지 영향을 받지 않았다. 아주 작은 친화성 변화가 Z(F30A)와 IgG의 복합체에 대해 모분자 Z와 IgG와 비교할 때 약간 더 높은 안정성을 제공한다. 이는 문헌 (Cedergren et al., 1993, 앞의 문헌; Jendeberg et al. , 1995, 앞의 문헌)에서 옌데베르크 (Jendeberg)등이 일찍이 보고한 결과와 일치한다. 골격으로서 Z(F30A)를 써서 제작된 모든 돌연변이를 분석하였고 이들의 모분자 (Z(F30A))와 비교하였다. 그 결과는 전체적인 친화성은 돌연변이에 의하여 별다른 영향을 받지 않음을 보여주는데, 이는 본 발명에 따른 아스파라긴 돌연변이 중 어떤 것도 IgG로의 결합에 그다지 주요하지 않음을 지시한다 (하기 표 1 참조). N21A 또는 N43E 돌연변이를 포함하는 모든 Z 돌연변이에서, 약간 더 낮은 친화성 상수만이 관찰되었다. N23T 돌연변이가 있는 돌연변이체의 경우, 놀랍게도 친화성이 심지어 약간 더 높아진 것으로 보인다. 또한 N28A-돌연변이의 경우에는 친화성의 감소가 매우 작고, 돌연변이 단백질이 단백질 리간드로서 등으로 사용된다면 어떠한 본질적인 영향을 미칠 것으로 예상할 수 없다. 또한, N28A 돌연변이를 포함하는 모든 제작물은 두드러지게 증가된 오프 레이트 (off-rate)를 갖는다. N23T 돌연변이를 포함하는 돌연변이의 경우, 어느 정도 증가된 친화성은 약간 증가된 온-레이트 (on-rate)에 기인된 것으로 보인다. 또한, N6A-돌연변이는 더 높은 온-레이트를 제공하나, 친화성 상수는 돌연변이 이후의 증가된 오프-레이트 때문에 영향을 받지는 않는다.

비아코어를 사용하여 수행된 상이한 Z 도메인에 대한 열역학적 연구의 개관

돌연변이	kon [10⁵M^-1s^-1]	koff [10^-3s^-1]	Kaff [110⁷M^-1]	ΔΔG (vs Zwt) [kcal/mol]	ΔΔG (vs Z (F30A)) [kcal/mol]
Zwt	1.5	3.7	4.0	0
Z(N23T)	2.7	3.9	7	-0.3
Z(F30A)	1.9	4.17	4.5	-0.1	0.0
Z(F30A, N6A)	7	21	3.3	0.1	0.2
Z(F30A, N11S)	1.6	4.9	3.2	0.1	0.2
Z(F30A, N21A)	1	3.8	2.6	0.3	0.4
Z(F30A, N23T)	2.1	3.75	5.6	-0.2	-0.1
Z(F30A, N28A)	3.1	9.87	3.2	0.1	0.2
Z(F30A, N43E)	1.3	5.1	2.6	0.3	0.4
Z(F30A, N52A)	1.5	4.9	3	0.2	0.3
Z(F30A, N23T, N43E)	0.8	3.8	2	0.4	0.5
Zwt는 상이한 측정 동안에 내부 표준으로서 사용되었다. 자유결합에너지에서의 차이는 각기 Zwt 및 Z(F30A)에 대하여 계산되었다.

< 실시예 3: 알칼리 조건에 대한 안정성>

재료 및 방법

도메인 Z의 변이체의 친화성 리간드로서의 거동을 표준 친화성 매트릭스로 고정화하여 분석하였다. Z,Z(F30A) 및 돌연변이된 변이체를 N-히드록시숙신이미드 화학을 제조자의 조언에 따라 사용하여 하이트랩 (HiTrap, 상표) 친화성 컬럼 (암머샴 바이오사이언스, 스웨덴 웁살라 소재)에 공유결합에 의하여 커플링시켰다. 컬럼을 TST 및 0.2 M HAc, pH 3.1로 펄스를 가하였다. TST 중의 인간 폴리클로날 IgG를 제조하여 컬럼으로 과량 주입하였다. AEKTA (상표) 엑스플로러 (Explorer) 10 (암머샴 바이오사이언스, 스웨덴 웁살라 소재)에서 16 주기를 위해 표준 친화성 크로마토그래피 프로토콜을 따랐다. 각 주기의 사이에는 CIP 단계가 끼어있었다. 세정제는 0.5 NaOH이었고, 각 펄스를 위한 접촉 시간은 30 분이었으며, 결국 총노출시간은 7.5 시간이었다. 용출된 물질을 280 nm에서 검출하였다.

결과 ( 실시예 3)

Z, Z(F30A), 및 이의 돌연변이들을 NHS 화학을 사용하여 하이트랩 (상표) 컬럼에 공유결합에 의하여 부착시켰다. IgG 과량을 로딩하였고, 용출된 IgG의 양을 각 주기 이후에 측정하여 컬럼의 총 용량을 결정하였다. 각 주기 사이에는 컬럼을 0.5 M NaOH로 이루어진 CIP 처리에 노출시켰다. 총노출시간이 7.5 시간이 되는 16 펄스 후에, Z(F30A)-매트릭스를 갖는 컬럼은 용량의 70 % 감소를 보인다. 도 2a에서 분해 데이타는 교체된 아스파라긴 4 개(N6, N11, N43 및 N52)는 돌연변이가 이 실험에서 노출된 알칼리 조건에 덜 민감한 것임을 암시한다. 반대로 N23은 Z(F30A)의 안정성에 있어서 매우 중요한 것으로 보인다. Z(F30A, N23T)는 불안정화하는 F30A-돌연변이에도 불구하고 28 % 용량 감소만을 나타낸다. 따라서 Z(F30A, N23%)는 거의 Zwt 정도로 안정하고, 이로써 골격으로서 Z(F30A)를 갖는 가장 안정화된 변이체이다. 또한 두 개의 추가 돌연변이를 갖는 Z(F30A)-도메인 Z(F30A, N23T, N43E)는 Z(F30A, N23T)와 동일한 분해 패턴을 보인다. N28을 알라닌으로 교체하는 것도 알칼리 조건에 대한 Z(F30A)의 안정성을 향상시킨다. 놀랍게도, Z(F30A, N21A)를 친화성 리간드로서 포함하는 컬럼은 모분자와 비교할 때 NaOH에 노출시에 급격한 용량 손실을 드러냈다. 이들 데이타는 Z(N23T)를 IgG의 친화성 정제에 있어서 리간드로서 매우 유익한 후보로 만든다.

안정성의 검출가능한 작은 변화를 일으키기 위하여 분자의 구조적으로 불안정화된 변이체를 사용하는 전략의 신뢰성을 최종 입증하기 위하여, N23T-돌연변이를 모 Z-도메인 내로 이식하였다. 모 Z 도메인 및 Z(N23T) 양자를 하이트랩-컬럼으로 커플링시키고 이미 언급한 돌연변이체에 대해서와 동일한 방식으로 알칼리 조건에 노출시켰다. 도 2b에서 알 수 있듯이, Z(N23T)-돌연변이는 높은 pH에 노출되었을 때 Z_wt보다 더 높은 안정성을 나타낸다.

< 실시예 4: C-말단 시스테인이 있거나 없는 Z-돌연변이의 단량체의 제작>

3 개의 상이한 돌연변이를 Z(N23T)를 코딩하는 유전자에 도입하였다: K4G, N3A 및 이중 돌연변이 N3A/N6D.

돌연변이는 원래 두 개의 상이한 벡터로 도입되었는데, 하나는 C-말단에 시스테인이 있는 것이고 다른 하나는 시스테인이 없는 것이다. 이들은 하나의 단일 C-말단 시스테인이 있는 다량체의 제작을 이후에 용이하게 하기 위하여 행하여졌다.

실시예 4(a): 시스테인-함유 단량체 제작

제작을 위한 주형으로서, "pGEM ZN23T"로 명명되는 플라스미드를 사용하였다. 이것은 이미 Z-유전자에 N23T-돌연변이를 포함하고 있었다. 이 플라스미드를 주형으로 하고 두 개의 다음 올리고뉴클레오티드를 써서 PCR-반응을 수행하였다:

K4G-돌연변이용

AFFI-63: TTT TTT GTA GAC AAC GGA TTC AAC AAA GAA C

GRTO-40: GAT CTG CTG CAG TTA GCA TTT CGG CGC CTG AGC ATC ATT TAG

N3A-돌연변이용

AFFI-64: TTT TTT GTA GAC GCC AAA TTC AAC AAA GAA C

GRTO-40 : GAT CTG CTG CAG TTA GCA TTT CGG CGC CTG AGC ATC ATT TAG

N3A/N6D-돌연변이용

AFFI-65: TTT TTT GTA GAC GCC AAA TTC GAC AAA GAA C

GRTO-40: GAT CTG CTG CAG TTA GCA TTT CGG CGC CTG AGC ATC ATT TAG

PCR 반응 튜브는 주형 pGEM ZN23T [500 ng/㎕] 0.5 ㎕, 각 프라이머 (Interactiva, Thermo Hybaid GmbH, 독일 울름 소재) 5 pmol, dNTP-혼합물 ([10 mM], Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 소재) 5 ㎕, PCR-완충액 lOx (Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 소재) 5 ㎕, AmpliTaq([5 U/㎕], Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 소재) 0.1 ㎕ 및 최종 부피가 50 ㎕되게 하는 멸균수를 포함했다. PCR-프로그램은 94 ℃에서 2분 후 96 ℃ 15 초, 50 ℃ 15 초, 72 ℃ 1 분을 30 주기를 실시하고 72 ℃에서 추가의 1분으로 끝맺었다. 이 PCR 반응은 진앰프엑스 (GeneAmpX)(등록상표) PCR 시스템 9700 (Applied Biosystems, 미국 캘리포니아 소재)로 수행하였다.

PCR 생성물을 1 % 아가로오스 겔 상에서 분석하고, 정확한 크기의 얻어진 생성물을 확인하기 위하여, 퀴아퀵 (등록상표)(QIAquick^?) PCR 정제 키트 (QIAGEN GmbH, 독일 힐덴 소재)를 써서 정제하였다.

PCR 생성물을 샘브룩 (Sambrook et al.)에 따라서 제한 효소 AccI 및 PstI (New England Biolabs, NEB, 미국 매사추세츠주 소재)를 써서 절단하였다. 절단 생성물을 아가로오스 겔 상에서 분석하였고 라이게이션 전에 퀴아퀵 (등록상표) 겔 추출 키트 (QIAGEN GmbH, 독일 힐덴 소재)를 써서 아가로오스로부터 정제하였다. 이들 단편을 T4 DNA 리가제 및 라이게이션 완충액 (MBI Fermentas, 리투아니아 소재)를 첨가함으로써 미리 효소 AccI 및 PstI로 절단해 둔 "pTrp-protA-stab-(multi9)"로 명명되는 벡터내로 라이게이션하고 정제한 후, RRIΔM15-세포 (ATCC, 미국 매사추세츠주 소재)내로 형질전환시켰다. 이 제작물에 이름 pAY87 (Z(N23T/K4G)-Cys), pAY89 (Z (N23T/N3A)-Cys) 및 pAY91 (Z (N23T/N3A/N6D)-Cys)을 각기 붙였다. MegaBACE (상표) 1000 DNA 서열분석계 (Amersham Biosciences, 스웨덴 웁살라 소재)를 사용하여 삽입된 단편들의 정확한 서열을 입증하였다. MegaBACE (상표) 터미네이터 화학 (Amersham Biosciences, 스웨덴 웁살라 소재)을 공급자의 조언에 따라서 디데옥시 방법 (Sanger et al., 1977)에 기초한 사이클 서열분석 프로토콜에 사용하였다.

실시예 4(b): 시스테인 비함유 단량체 제작

제작을 위한 주형으로서 "pTrp(-N)ZN23T-Cys"이라 명명되는 플라스미드를 사용하였다. 이 플라스미드는 이미 N23T-돌연변이를 포함하는 유전자를 포함하고 있었다. 이 플라스미드를 주형으로 하고 두 개의 다음 올리고뉴클레오티드를 써서 PCR-반응을 수행하였다:

K4G-돌연변이용

AFFI-63: TTT TTT GTA GAC AAC GGA TTC AAC AAA GAA C

GRTO-41: GAT CTC GTC TAC TTT CGG CGC CTG AGC ATC ATT TAG

N3A-돌연변이용

AFFI-64: TTT TTT GTA GAC GCC AAA TTC AAC AAA GAA C

GRTO-41 : GAT CTC GTC TAC TTT CGG CGC CTG AGC ATC ATT TAG

N3A/N6D-돌연변이용

AFFI-65: TTT TTT GTA GAC AAC GGA TTC AAC AAA GAA C

GRTO-41: GAT CTC GTC TAC TTT CGG CGC CTG AGC ATC ATT TAG

PCR 반응 튜브는 주형 pTrp(-N)ZN23T-Cys [500 ng/㎕] 0.5 ㎕, 각 프라이머 (Interactiva, Thermo Hybaid GmbH, 독일 울름 소재) 5 pmol, dNTP-혼합물 ([10 mM], Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 소재) 5 ㎕, PCR-완충액 lOx (Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 소재) 5 ㎕, AmpliTaq([5 U/㎕], Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 소재) 0.1 ㎕ 및 최종 부피가 50 ㎕되게 하는 멸균수를 포함했다. PCR-프로그램은 94 ℃에서 2분 후 96 ℃ 15 초, 50 ℃ 15 초, 72 ℃ 1 분을 30 주기를 실시하고 72 ℃에서 추가의 1분으로 끝맺었다. 이 PCR 반응은 진앰프엑스 (GeneAmpX) (등록상표) PCR 시스템 9700 (Applied Biosystems, 미국 캘리포니아 소재)로 수행하였다.

PCR 생성물을 제조자 (Promega, 미국 위스콘신주 소재)의 지시에 따라서 벡터 pGEM 내로 직접 TA-클로닝한 후, RRIΔM15-세포 (ATCC, 미국 매사추세츠주 소재)내로 형질전환시켰다. 이 제작물에 이름 pAY86 (Z(N23T/K4G)-Cys), pAY88 (Z (N23T/N3A)-Cys) 및 pAY90 (Z (N23T/N3A/N6D)-Cys)을 각기 붙였다.

MegaBACE (상표) 1000 DNA 서열분석계 (Amersham Biosciences, 스웨덴 웁살라 소재)를 사용하여 삽입된 단편들의 정확한 서열을 입증하였다. MegaBACE (상표) 터미네이터 화학 (Amersham Biosciences, 스웨덴 웁살라 소재)을 공급자의 조언에 따라서 디데옥시 방법 (Sanger et al., 1977)에 기초한 사이클 서열분석 프로토콜에 사용하였다.

< 실시예 5: pTrp -벡터 내의, C-말단 시스테인을 갖는 단량체 및 올리고머를 코딩하는 유전자의 제작>

상기한 플라스미드 pAY 86 내지 pAY91 (총 6 개의 플라스미드) 전부를 제한 효소 AccI으로 절단하였다. 이에 의하여 pAY86-, pAY88- 및 pAY90-벡터로부터 Z-돌연변이체가 완전히 방출되며, pAY87-, pAY89- 및 pAY91-벡터로부터는 유전자의 3'-말단에서 한쪽만 열린다. 절단된 벡터를 소의 소장 알칼리 포스파타제 (CIAP, MBI Fermentas, 리투아니아 소재)로 제조자의 조언에 따라 처리하였다. 이 단계는 벡터의 자체 라이게이션을 막기 위해서 5'-말단에서 탈포스포릴화하기 위해 수행하였다.

방출된 Z-돌연변이-단편을 아가로오스 겔 상에서 분석한 후, 단편들을 아래에 따라서 열린 벡터내로 라이게이션하기 전에 아가로오스로부터 정제하였다:

pAY86로부터의 단편을 pAY87로, pAY88로부터의 단편을 pAY89로, pAY90로부터의 단편을 pAY91로 라이게이션.

라이게이션 반응을 위하여, 단편 대 벡터를 상이한 비율로 혼합하였고, 결과는 예상한 바와 같이 이량체에서 오량체에 이르는 상이한 다량체의 범위가 얻어졌다.

상이한 다량체를 RRIΔM15-세포 (ATCC, 미국 매사추세츠주 소재)내로 형질전환하고, 정확한 서열을 상기한 바와 같이 왕립기술연구소 (Royal Institute of Technology)에서 서열분석 장치상에서 분석하여 증명하였다. 새로 제작된 플라스미드는 다음 표에 나타낸 바와 같이 명명하였다:

제작된 플라스미드의 요약

플라스미드 번호 pAY	제작물에서 발현되는 단백질
86	Z(N23T/K4G)
87	Z(N23T/K4G)-Cys
88	Z(N23T/N3A)
89	Z(N23T/N3A)-Cys
90	Z(N23T/N3A/N6D)
91	Z(N23T/N3A/N6D)-Cys
92	Z(N23T/K4G)이량체-Cys
93	Z(N23T/N3A)이량체-Cys
94	Z(N23T/N3A/N6D)이량체-Cys
95	Z(N23T/K4G)삼량체-Cys
96	Z(N23T/N3A)삼량체-Cys
97	Z(N23T/N3A/N6D)삼량체-Cys
98	Z(N23T/K4G)사량체-Cys
99	Z(N23T/N3A)사량체-Cys
100	Z(N23T/N3A/N6D)사량체-Cys
101	Z(N23T/K4G)오량체-Cys
102	Z(N23T/N3A)오량체-Cys
103	Z(N23T/N3A/N6D)오량체-Cys

상기한 플라스미드 벡터중 pAY86, pAY88 및 pAY90를 제외하면 Trp 프로모터, Trp 리더 서열 및 가나마이신 (Km) 내성 유전자를 갖는다. pAY86, pAY88 및 pAY90은 대신에 암피실린 내성 유전자를 갖는다.

< 실시예 6: pK4 벡터내에 C-말단 시스테인을 갖는 단량체 및 다량체를 코딩하는 유전자의 제작>

표 2에 요약된 단백질을 코딩하는 유전자는 SPA 프로모터 및 신호 서열을 포함하는 벡터로 형질전이될 것이었다. 이 과정을 가능하게 하기 위하여 제한 효소 KpnI (New England Biolabs, NEB, 미국 매사추세츠주 소재)를 위한 절단 부위를 포함하는 어댑터가 제작되어야 했다. 이 어댑터는 2 개의 올리고뉴클레오티드 (Interactiva, Thermo Hybaid GmbH, 독일 울름 소재)에 의하여 제작되었다.

플라스미드 pAY104 (pK4-cys-ABDstabdimer)를 FspI 및 PstI (New England Biolabs, NEB, 미국 매사추세츠주 소재)로 절단하였다. 이 벡터를 아가로오스 겔 상에서 정제하고, 방출된 단편을 제거하고, 남아있는 벡터를 퀴아퀵 (등록상표) 겔 추출 키트 (QIAGEN GmbH, 독일 힐덴 소재)를 써서 아가로오스로부터 정제하였다.

두 개의 올리고머 AFFI-88 및 AFFI-89를 라이게이션 완충액 (MBI Fermentas, 리투아니아 소재) 중에서 혼합하고 50 ℃로 가열하고, 이 혼합물을 실온으로 냉각되게 하고 그 후 여기에 절단된 플라스미드 벡터를 T4 DNA 리가제 (MBI Fermentas, 리투아니아 소재)와 함께 첨가하였다. 라이게이션 반응 후에, 생성물을 RRIΔM15 세포내로 형절전환시키고, 정확한 서열을 상기한 바와 같이 입증했다. 생성된 플라스미드는 pAY128로 명명했다.

그 다음 플라스미드 pAY128을 제한 효소 KpnI 및 PstI로 절단하고, 절단된 벡터를 아가로오스 겔 상에서 분석한 후, 퀴아퀵 (등록상표) 겔 추출 키트 (QIAGEN GmbH, 독일 힐덴 소재)를 써서 아가로오스로부터 정제했다. pAY86 내지 pAY103으로부터의 두 개의 돌연변이된 Z-유전자 Z (N23T/N3A) 및 Z (N23T/N3A/N6A)를 발현하는 단편을 KpnI 및 PstI (New England Biolabs, NEB, 미국 매사추세츠주 소재)으로 절단하고 분리하고, 아가로오스 겔 분리 후 정제하였다. 상이한 단편들을 pAY128에서 유래한 절단된 벡터 내로 라이게이션시키고, 생성된 플라스미드를 정확한 서열을 입증한 후, 표 3에 요약한 바와 같이 pAY107 내지 pAY116으로 명명하였다.

SPA 프로모터 및 신호 서열을 가진 제작된 플라스미드의 요약

플라스미드 번호 pAY	제작물로부터 발현되는 단백질
107	Z(N23T/N3A)-Cys
108	Z(N23T/N3A/N6D)-Cys
109	Z(N23T/N3A)이량체-Cys
110	Z(N23T/N3A/N6D)이량체-Cys
111	Z(N23T/N3A)삼량체-Cys
112	Z(N23T/N3A/N6D)삼량체-Cys
113	Z(N23T/N3A)사량체-Cys
114	Z(N23T/N3A/N6D)사량체-Cys
115	Z(N23T/N3A)오량체-Cys
116	Z(N23T/N3A/N6D)오량체-Cys

< 실시예 7: pK4 벡터 내에서 C-말단 시스테인을 갖는 단량체 및 올리고머에 N-말단 융합된 단백질 A로부터 E 유전자의 일부 (E')를 코딩하는 유전자의 제작>

표 2에 요약된 바와 같은, 단백질을 코딩하는 유전자를 SPA 프로모터 및 신호 서열 및 단백질 A의 E 영역을 코딩하는 유전자의 일부 (E')를 포함하는 벡터로 형질전이시켰다. 성숙 단백질 A의 N-말단 IgG-결합 부분 (영역 E)의 추가는 정확한 프로세싱을 증가시키고 또한 주변의 배양 배지로 유전자 생성물의 분비를 촉진할 수 있다 (Abrahmsen et al., 1985). 제한 효소 KpnI를 위한 절단 부위를 포함하는 어댑터 및 단백질 A의 영역 E의 일부 (E')를 두 개의 올리고뉴클레오티드 (Interactiva, Thermo Hybaid GmbH, 독일 울름 소재)에 의하여 제작하였다.

플라스미드 pAY104 (pK4-cys-ABDstabdimer)를 FspI 및 PstI (New England Biolabs, NEB, 미국 매사추세츠주 소재)를 써서 절단하였다. 벡터를 아가로오스 겔 상에서 정제하고 방출된 단편을 제거하고 남은 벡터를 퀴아퀵 (등록상표) 겔 추출 키트 (QIAGEN GmbH, 독일 힐덴 소재)를 써서 아가로오스로부터 정제하였다. 두 개의 올리고뉴클레오티드를 라이게이션 완충액 중에서 혼합하고 75 ℃로 가열하고 이 혼합물을 실온으로 냉각하게 한 후, 이 상태에서 절단된 플라스미드 벡터를 T4 DNA 리가제 (MBI Fermentas, 리투아니아 소재)와 함께 첨가하였다. 라이게이션 반응 후에, 생성물을 RRIΔM15-세포 내로 형질전환시키고, 정확한 서열을 상술한 바와 같이 입증하였다. 생성된 플라스미드를 pAY129로 명명하였다.

플라스미드 pAY129를 그 후 제한 효소 KpnI 및 PstI로 절단하고, 절단된 벡터를 아가로오스 겔 상에서 분석한 후, 퀴아퀵 (등록상표) 겔 추출 키트 (QIAGEN GmbH, 독일 힐덴 소재)를 써서 아가로오스로부터 정제하였다. pAY86 내지 pAY103으로부터 얻은, 두 개의 돌연변이된 Z-유전자들 Z (N23T/N3A) 및 Z (N23T/N3A/N6A)을 발현하는 단편들을 KpnI 및 PstI로 절단하고 분리하고, 아가로오스 겔 분리 후에 정제하였다. 상이한 단편들을 pAY129로부터 얻은 절단된 벡터내로 라이게이션시키고 생성된 플라스미드는 정확한 서열의 입증 후에 표 4에 요약한 바와 같이 pAY118 내지 pAY127로 명명하였다.

SPA 프로모터 및 신호 서열 및 단백질 A-E' 중의 E 영역의 일부를 가진 제작된 플라스미드의 요약

플라스미드 번호 pAY	제작물로부터 발현되는 단백질
118	E'-Z(N23T/N3A)-Cys
119	E'-Z(N23T/N3A/N6D)-Cys
120	E'-Z(N23T/N3A)이량체-Cys
121	E'-Z(N23T/N3A/N6D)이량체-Cys
122	E'-Z(N23T/N3A)삼량체-Cys
123	E'-Z(N23T/N3A/N6D)삼량체-Cys
124	E'-Z(N23T/N3A)사량체-Cys
125	E'-Z(N23T/N3A/N6D)사량체-Cys
126	E'-Z(N23T/N3A)오량체-Cys
127	E'-Z(N23T/N3A/N6D)오량체-Cys

< 실시예 8: 알칼리 조건에 대한 안정성>

알칼리 조건에 대한 단백질의 안정성을 평가하기 위하여, 4 가지 다른 단백질을 고 pH 환경에서 시험하였다. 그 상이한 단백질들은 Z(N23T)이량체-Cys, Z(N23T/K4G)이량체-Cys, Z(N23T/N3A)이량체-Cys 및 Z(N23T/N3A/N6D)이량체-Cys였다.

(Z(N23T)이량체-Cys), (Z(N23T/N3A)이량체-Cys), (Z(N23T/N3A/N6D)이량체- Cys) 및 (Z(N23T/K4G)이량체-Cys)를 발효기 내에서 배양하였다. 수확한 배지를 정제하고 알칼리 시험 전에 표준적 방법을 사용하여 HF 아가로오스 (Amersham Biosciences, 스웨덴 웁살라 소재)에 커플링시켰다. HF 아가로오스-커플링된 단백질은 다음과 같이 명명하였다.

· Z(N23T)이량체-Cys U631049

· Z(N23T/K4G)이량체-Cys U631079

· Z(N23T/N3A)이량체-Cys U631064

· Z(N23T/N3A/N6D)이량체-Cys U631063

매트릭스를 컬럼 (HR5/2, Amersham Biosciences, 스웨덴 웁살라 소재)에 채워서 최종 부피가 0.1 내지 0.3 ml가 되게 하였다. 사용된 정제 장치는 통과 길이 2 mm인 UV 샘플 흐름 격자 (Amersham Biosciences, 스웨덴 웁살라 소재)가 있는 AEKTA (상표) 엑스플로어 10 (Amersham Biosciences, 스웨덴 웁살라 소재)였다.

사용된 완충액은 다음을 포함했다.

· 실행 (running) 완충액: 25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 200 mM NaCl, 0.05% 트윈 (Tween) 20, 5 mM 아세트산 암모늄, pH 8.0

· 용출 완충액: 0.2 M 아세트산 (HAc), pH 3.1

· 클리닝-인-플레이스 (CIP) 완충액: 0.5 M NaOH

전형적인 크로마토그래피 실행 사이클은

· 실행 완충액으로 컬럼을 평형화

· 10 mg 폴리클론 인간 IgG (hIgG)을 0.2 ml/분으로 샘플 적용

· 비결합된 단백질의 철저한 세척 제거

· 용출 완충액을 1.0 ml/분에서 용출

· 실행 완충액으로 재평형화

· 컬럼 매트릭스와 0.5 M NaOH 사이의 1 시간 접촉시간으로 CIP-완충액으로 클리닝-인-플레이스 (CIP)

· 실행 완충액으로 재평형화를 포함했다.

각 실행에 로딩된 hIgG의 양은 모든 경우에 컬럼으로 샘플을 로딩할 때 비결합된 단백질의 증가 (breakthrough)가 상당하기 때문에 컬럼의 동적 결합 용량을 훨씬 넘었다. 상기 단계를 포함하여 1 주기 후에, 0.5 M 수산화나트륨의 1 시간 노출을 포함하는 새로운 주기를 다시 시작했다. 컬럼의 동적 결합 용량의 감소를 측정하기 위해 용출된 피크의 피크 면적을 매트릭스가 수산화나트륨에 노출되지 않았을 때의 용출 피크의 본래 피크 면적과 비교하였다. 본래의 피크 면적을 100 % 결합 용량으로 설정할 때 hIgG의 결합 용량의 감소가 관찰되었다. 피크 면적을 정제계를 수반하는 유니콘 (UNICORN)(상표) 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.

각 주기를 21 회 반복하여 매트릭스와 수산화나트륨의 총 노출시간을 각기 상이한 매트릭스에 대해 20 시간이 되게 했다. 정상화된 피크 면적을 아래에서 볼 수 있는 바와 같이 (도 16) 그래프로 가시화하였다. 모든 21 주기를 각 돌연변이에 대해 반복하였다.

Z(N23T/N3A/N6D)이량체-Cys 및 Z(N23T/N3A)이량체-Cys는 둘 다 본래 제조된 Z(N23T)이량체-Cys와 비교할 때 알칼리 조건에 대한 향상된 안정성을 나타냈다.

SEQUENCE LISTING <110> Amersham Biosciences <120> MUTANT PROTEIN <130> PU 0215 <160> 4 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 1 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 2 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <221> MUTAGEN <222> (29)..(29) <223> <400> 2 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 3 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <221> MUTAGEN <222> (29)..(29) <223> <220> <221> MUTAGEN <222> (30)..(30) <223> <400> 3 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Ala Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 4 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <221> MUTAGEN <222> (23)..(23) <223> <220> <221> MUTAGEN <222> (29)..(29) <223> <400> 4 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55

Claims

서열 1 또는 2에 의하여 정의된 모(母) 면역글로불린-결합 단백질 또는 이의 기능적 변이체의 아스파라긴 잔기 하나 이상이 글루타민 이외의 아미노산으로 돌연변이되며, 이 돌연변이가 N3A와 N23T 또는 N3A와 N6D와 N23T에서 선택되고, 모분자에 비하여 알칼리 pH 값에서의 증가된 화학적 안정성을 부여하는, 상보성 결정 영역 (CDR)보다는 면역글로불린 분자의 다른 영역에 결합할 수 있는 면역글로불린-결합 단백질.
제1항에 있어서, Fc 단편-결합 단백질인 단백질.
제1 또는 2항에 있어서, 모분자는 서열 2에 의하여 정의된 서열을 포함하는 것인 단백질.
제1 또는 2항에 있어서, 위치 43에서의 아스파라긴 잔기도 글루탐산 잔기로 돌연변이된 단백질.
제1항에서 정의된 돌연변이된 단백질 단위를 포함하며 반복 단위를 둘 이상 포함하는 다량체.
제5항에 있어서, 단백질 단위가 15 개 이하의 아미노산을 포함하는 요소에 의하여 연결되는 것인 다량체.
제5 또는 6항에 있어서, 스타필로코쿠스 단백질 A의 E, D, A, B 및 C 도메인 중 하나 이상을 더 포함하는 다량체.
제5 또는 6항에 있어서, 사량체인 다량체.
제8항에 있어서, 각 단백질 단위가 서열 2에 의하여 정의된 단백질인 다량체.
제1항에서 정의된 단백질 또는 제5항에서 정의된 다량체를 코딩하는 핵산.
제10항에 따른 핵산을 포함하는 발현계.
제1항에 따른 면역글로불린-결합 단백질을 포함하는 복수의 리간드가 고체 지지체에 커플링된 친화성 크로마토그래피용 매트릭스.
제12항에 있어서, 리간드가 제5 또는 6항에 따른 하나 이상의 다량체를 포함하는 것인 매트릭스.
제12항에 있어서, 리간드가 티오에테르 결합에 의하여 지지체에 커플링된 것인 매트릭스.
제12항에 있어서, 지지체가 다당류와 같은 천연 폴리머 물질인 매트릭스.
제12항에 있어서, IgG, IgA, 및 IgM으로 이루어진 군에서 선택된 면역글로불린의 선택적 결합을 제공하는 매트릭스.
제12항에 있어서, 리간드가 모 단백질 분자에 비하여 간헐적 알칼리 세정하는 2 이상의 분리 동안 증가된 결합 용량을 나타내는 것인 매트릭스.
제17항에 있어서, 세정이 NaOH를 사용하여 수행되며 그 농도가 1 M 이하인 매트릭스.
제1항에 따른 돌연변이 단백질 또는 제5항에 따른 다량체 또는 제12항에 따른 매트릭스가 사용되는, IgG, IgA 또는 IgM과 같은 면역글로불린의 단리 방법.
제1항에 따른 돌연변이 단백질 또는 제5항에 따른 다량체 또는 제12항에 따른 매트릭스로의 흡착에 의하여 액체로부터 하나 이상의 표적 화합물이 분리되는 크로마토그래피 방법.
제18항에 있어서, 세정이 NaOH를 사용하여 수행되며 그 농도가 0.5 M인 매트릭스.