ES2634145T3 - Proteína de unión a inmunoglobulinas mutada - Google Patents

Abstract

Una proteína de unión a inmunoglobulina mutada capaz de unirse a regiones de una molécula de inmunoglobulina distintas de las regiones determinantes de complementariedad (CDR), donde dicha proteína comprende al menos una unidad como se define por SEC ID NO: 2, en la que el resto de aminoácido en posición 23 en cada unidad es una treonina, y en donde en cada unidad a) el resto aminoácido en la posición 3 es una alanina, o b) los restos de aminoácido en las posiciones 3 y 6 son una alanina y un ácido aspártico respectivamente.

Description

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DESCRIPCION

Protema de union a inmunoglobulinas mutada Campo tecnico

La presente invencion se refiere al campo de protemas mutantes, y mas espedficamente a una protema mutante que exhibe estabilidad mejorada en comparacion con la molecula pariente as^ como a un metodo de produccion de una protema mutante segun la invencion. La invencion tambien se refiere a una matriz de separacion por afinidad, donde una protema segun la invencion es usada como un ligando de afinidad.

Antecedentes

Un gran numero de aplicaciones en la industria biotecnologica y farmaceutica necesitan atencion para comprender la separacion definitiva de contaminantes. Dichos contaminantes pueden, por ejemplo, ser moleculas no elrndas adsorbidas en la fase estacionaria o matriz en un procedimiento cromatografico, tal como moleculas o microorganismos no deseados, que incluyen por ejemplo, protemas, carbohidratos, ffpidos, bacterias y virus. La separacion de tales contaminantes a partir de la matriz normalmente es llevada a cabo tras una primera elusion del producto deseado con el fin de regenerar la matriz antes de su uso posterior. Tal separacion normalmente implica un procedimiento conocido como limpieza en el sitio (LES), donde se usan agentes capaces de eluir contaminantes de la fase estacionaria. En el presente, el agente de limpieza y sanitario mas extensamente usado es NaOH, y la concentracion del mismo puede estar en el intervalo de 0,1 hasta por ejemplo 1 M, dependiendo del grado y la naturaleza de la contaminacion. NaOH es conocido por ser un agente LES eficaz que logra la reduccion multirregistro de contaminantes, tales como microbios, protemas, ffpidos y acido nucleicos. Otra ventaja del NaOH es que se elimina facilmente sin ningun otro tratamiento. Sin embargo, esta estrategia esta asociada a la exposicion de la matriz a pH por encima de 13. Para muchas matrices de cromatograffa por afinidad que contienen ligandos de afinidad proteicos, tales como medio ambiente alcalino, es una condicion muy severa y, posteriormente, da como resultado capacidades disminuidas a causa de la inestabilidad del ligando implicado en el alto pH.

Asf, se ha enfocado una investigacion mas extensa sobre el desarrollo de ligandos proteicos manipulados que exhiben una capacidad mejorada para resistir valores de pH alcalino. Por ejemplo, Gulich et al (Susane Gulich, Martin Linhult, Per-Anke Nygren, Mathias Uhlen, Sophia Hober, Journal of Biotechnology 80 (2000), 169-178: Stability towards alkaline conditions can be engineered into a protein ligand) sugirieron la manipulacion de protemas para mejorar las propiedades de estabilidad de un dominio de union a albumina (DUA) de Staphylococcus en medios ambientes alcalinos. Anteriormente, se mostro que la modificacion estructural, tal como desaminacion y escision de la estructura pepffdica, de restos de asparagina y glutamina en condiciones alcalinas es la razon principal para la perdida de actividad en el tratamiento en soluciones alcalinas, y que la asparagina es el mas sensible de los dos (Geiger, T., y S. Clarke. 1987. Deamination, Isomerization, and Racemization al Asparaginyl and Aspartyl Residues in Peptides. J. Biol. Chem. 262:785-794). Tambien se conoce que el ritmo de desaminacion es altamente espedfico y dependiente de la conformacion (Kosky, A.A., U.O. Razzaq, M.J. Treuheit, y D.N. Brems. 1999. The effect of alpha- helix on the stability of Asn residues: deamination rates in peptides of varing helicity. Protein Sci. 8:2519-2523: Kosiakoff, A.A. 1988. Tertiary structure is a principal determinant to protein deamidation. Science. 240:191-194; y Lura, R., y V. Schirch. 1988. Role of peptide conformation in the rate and mechanism of deamidation of asparaginyl residues. Biochemistry. 27:7671-7677), y los semi-tiempos de desaminacion mas cortos han sido asociados con las secuencias -asparagina-glicina- y -asparagina-serina. Por consiguiente, Gulich et al. crearon un mutante de DUA, donde los cuatro restos de asparagina del DUA natural han sido sustituidos por leucina (un resto), asparatato (dos restos) y lisina (un resto). Ademas, Gulich et al. describen que su mutante exhibe un comportamiento de union a protema diana similar al de la protema natural, y que las columnas de afinidad que contienen el ligando manipulado muestran capacidades de union superiores tras exposicion repetida a condiciones alcalinas que las columnas preparadas usando el ligando pariente no manipulado. Asf, se concluyo en la presente memoria que los cuatro restos de asparagina pueden ser sustituidos sin ningun efecto significativo sobre la estructura y la funcion.

Asf, los estudios llevados a cabo por Gulich et al se llevaron a cabo sobre el dominio de union a albumina de Streptococcus. Sin embargo, la cromatograffa por afinidad tambien se usa para la purificacion de otras moleculas, tales como inmunoglobulinas, por ejemplo para aplicaciones farmaceuticas. Una clase particularmente interesante de reactivos de afinidad son las protemas capaces de unirse de forma espedfica a partes invariables de una molecula de anticuerpo, tal interaccion siendo independiente de la especificidad de union al anffgeno del anticuerpo. Tales reactivos pueden ser ampliamente usados para la recuperacion por cromatograffa por afinidad de inmunoglobulinas de diferentes muestras tales como, pero no limitadas a, preparaciones de suero o plasma o cultivos celulares derivados de conjuntos de alimentacion. Un ejemplo de tal protema es la protema A de Staphylococcus, que contiene dominios capaces de unirse a las porciones Fc y Fab de inmunoglobulinas IgG de diferentes especies.

Los reactivos basados en la protema A de Staphylococcus (SpA), debido a su alta afinidad y selectividad, han encontrado un amplio uso en el campo de la biotecnologfa, por ejemplo, en cromatograffa por afinidad para capturar y purificar anticuerpos asf como para su deteccion. En el presente, un medio de afinidad basado en SpA probablemente es el medio de afinidad mas ampliamente usado para aislar anticuerpos monoclonales y sus

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fragmentos a partir de diferentes muestras, incluyendo conjuntos de alimentacion de cultivos celulares. Por consiguiente, estan disponibles comercialmente varias matrices que comprenden ligandos de protema A, por

ejemplo, en forma de protema A nativa (por ejemplo Protema A SepharoseTM, Amersham Biosciences, Uppsala,

Suecia) y tambien comprendidas por protema A recombinante (por ejemplo, rProtema A SepharoseTM, Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia). Mas espedficamente, la manipulacion genetica llevada a cabo en dicha protema A recombinante comercial es realizada para facilitar la union de la misma al soporte.

Por consiguiente, existe la necesidad en este campo de obtener ligandos de protemas capaces de unir inmunoglobulinas, especialmente via los fragmentos Fc de las mismas, que tambien son tolerantes a uno o mas procedimientos de limpieza usando agentes alcalinos.

Compendio de la presente invencion

Un objeto de la presente invencion es proporcionar un ligando proteico mutado de union a inmunoglobulina que exhibe una estabilidad mejorada a valores de pH aumentados, y por consiguiente, una tolerancia mejorada a la limpieza bajo condiciones alcalinas, en comparacion a la molecula pariente.

Otro objeto de la invencion es proporcionar tal ligando proteico, que se une espedficamente al fragmento Fc de inmunoglobulinas, tales como IgG, IgA y/o IgM.

Todavfa otro objeto de la invencion es proporcionar un ligando proteico como se describe mas arriba, que tambien exhibe una afinidad que se conserva durante un periodo de tiempo mas largo en condiciones alcalinas que aquella molecula pariente.

Un objeto adicional de la presente invencion es proporcionar una matriz de separacion por afinidad, que comprende ligandos proteicos mutantes capaces de unir inmunoglobulinas, tales como IgG, IgA y/o IgM, preferiblemente via sus fragmentos Fc, cuyos ligandos exhiben una tolerancia mejorada a la limpieza bajo condiciones alcalinas, en comparacion con el ligando de la molecula pariente.

Uno o mas de los objetos arriba definidos pueden lograrse como se describe en las reivindicaciones posteriores. Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 muestra alineamientos de aminoacidos de los cinco dominios homologos (E, D, A, B y C) de SpA.

La Figura 2 (a) y (b) ilustra los resultados obtenidos tras tratamiento alcalino (limpieza en el lugar) de protemas mutantes segun la invencion en comparacion con la protema Z desestabilizada.

La Figura 3 muestra el gen que codifica la Z(N23T/N3A/N6D)-Cys tras insercion dentro de un vector como se describe en el ejemplo 4(a).

La Figura 4 muestra un mapa plasirndico del plamido pAY91, como se describe en el ejemplo 4(a).

La Figura 5 muestra el gen que codifica la Z(N23T/N3A/N6D) tras la insercion dentro de un vector como se describe en el ejemplo 4(b).

La Figura 6 muestra un ejemplo de mapa plasirndico para el plasmido pAY100 como se describe en el ejemplo 5.

La figura 7 muestra el adaptador para introducir un sitio Kpnl dentro de un vector con promotor SPA y secuencia senal segun el ejemplo 6.

La Figura 8 muestra el plasmido pAY104, que contiene el promotor SPA y la secuencia senal a ser usados para la introduccion de un adaptador que contiene un sitio Kpnl, tal como se describe en el ejemplo 6.

La Figura 9 muestra el plasmido resultante, pAY128, tras la insercion del adaptador segun el ejemplo 6.

La Figura 10 muestra el casete de clonacion construido del ejemplo 6, donde el adaptador original esta subrayado.

La Figura 11 muestra el plasmido pAY114 tras la insercion de Z(N23T/N3A/N6D)-Cys- tetramero como se describe en el ejemplo 6.

La Figura 12 muestra el casete de clonacion construido del ejemplo 7, donde el adaptador original esta subrayado.

La Figura 13 muestra el plasmido resultante, pAY129, tras la insercion del adaptador segun el ejemplo 7.

La Figura 14 muestra el plasmido pAY125 tras la insercion de Z(N23T/N3A/N6D)-Cys- tetramero como se describe en el ejemplo 7.

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La Figura 15 es una cromatograffa obtenida de una separacion de IgG humana (hIgG), como se describe en el ejemplo 8.

La Figura 16 muestra graficos que representan la capacidad de union dinamica restante de las matrices segun el ejemplo 8.

Definiciones

El termino “protema” se usa en la presente memoria para describir protemas, as^ como fragmentos de las mismas. Asf, cualquier cadena de aminoacidos que exhibe una estructura tridimensional esta incluida en el termino “protema”, y se abarcan fragmentos de protema.

El termino “variante funcional” de una protema significa en la presente memoria una protema variante, donde la funcion, en relacion a la invencion definida como afinidad y estabilidad, estan esencialmente conservadas. Asf, uno o mas aminoacidos que no son relevantes para dicha funcion pueden haber sido cambiados.

El termino “molecula pariente” se usa en la presente memoria para la protema correspondiente en la forma antes de que se haya introducido una mutacion segun la invencion.

El termino “estabilidad estructural” se refiere a la integridad de la forma tridimensional de una molecula, mientras que ’’estabilidad qmmica” se refiere a la capacidad para resistir a la degradacion qmmica.

El termino “protema de union al fragmento Fc” significa que la protema es capaz de unirse al fragmento Fc de una inmunoglobulina. Sin embargo, no se excluye que una protema de union al fragmento Fc tambien pueda unir otras regiones, tales como regiones Fab de inmunoglobulinas.

En la presente memoria, si no se refiere a sus nombres completos, los aminoacidos son denominados con los sfmbolos convencionales de una letra.

Las mutaciones se definen en la presente memoria por el numero de la posicion cambiada, precedido del aminoacido salvaje o no mutado y seguido del aminoacido mutado. Asf, por ejemplo, la mutacion de una asparagina en posicion 23 con una treonina se denomina N23T.

Descripcion detallada de la invencion

En un aspecto, la presente invencion se refiere a una protema de union a inmunoglobulina mutada capaz de unirse a otras regiones de la molecula de inmunoglobulina distintas de las regiones de determinacion de la complementariedad (CDR) donde, al menos un resto de asparagina de una protema de union a inmunoglobulina pariente ha sido mutada a treonina, para conferir una estabilidad qmmica aumentada en valores de pH alcalinos en comparacion con la molecula pariente. La estabilidad aumentada significa que la afinidad inicial de la protema mutada para la inmunoglobulina esta esencialmente conservada durante un periodo de tiempo mas largo, como se discutira mas abajo.

La afinidad conservada de la protema diana lograda segun la invencion, se debe en parte a una conformacion espacial conservada de la protema mutante. La afinidad de protemas mutadas a inmunoglobulinas puede, por ejemplo, ser ensayada por el experto en la materia usando tecnologfa de biosensores usando, por ejemplo, un

sistema BiacoreTM 2000 clasico (Biacore AB, Uppsala, Suecia), como se ilustrara en la parte experimental de mas abajo. En este contexto, se entiende del termino “esencialmente” conservado que la protema mutada exhibe una afinidad por inmunoglobulina que es del mismo orden de magnitud que la de la molecula pariente. Por consiguiente, en una fase inicial, la capacidad de union de la protema mutada es comparable con la de la protema pariente. Sin embargo, debido a la estabilidad qmmica de la protema mutada discutida mas abajo, que esta conservada en el tiempo, su capacidad de union disminuira mas lentamente que la de la molecula pariente en un medio ambiente alcalino. El medio ambiente puede definirse como alcalino, que significa un valor aumentado de pH, por ejemplo, por encima de aproximadamente 10, tal como hasta aproximadamente 13 o 14, es decir, de 10-13 o 10-14, en general denominado condiciones alcalinas. Alternativamente, las condiciones pueden estar definidas por la concentracion de NaOH, que puede se de hasta aproximadamente 1,0 M, tal como 0,7 M o espedficamente aproximadamente 0,5 M, por consiguiente dentro de un intervalo de 7-1,0 M.

La estabilidad qmmica aumentada de la protema mutada segun la invencion puede ser confirmada facilmente por el experto en la materia en este campo, por ejemplo, por tratamiento de rutina con NaOH a una concentracion de 0,5 M, tal como se describira en la parte experimental de mas abajo. En este contexto, se entiende que similar a lo que se dice mas arriba, una estabilidad “aumentada” significa que la estabilidad inicial esta conservada durante un periodo de tiempo mas largo que la que se logra por la molecula pariente. Aunque se han descrito mutaciones similares para un dominio de union de albumina de Streptococcus (Gulich et la., vease mas arriba), se conoce bien que el ritmo de desaminacion implicado en la susceptibilidad proteica a la degradacion en medio ambiente alcalino es altamente dependiente de la secuencia y de la conformacion. Mientras que la secuencia de aminoacidos de DUA no comprende similitud de secuencia aminoaddica con las protemas de union a inmunoglobulina tales como los dominios individuales de la protema A de Staphylococcus, no parece, por las ensenanzas de Gulich et al, que se

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puedan aplicar tambien a las protemas de union a inmunoglobulina. Sin embargo, la presente invencion muestra por primera vez que la mutacion de uno o mas restos de asparagina de una protema de union a inmunoglobulina proporciona de forma sorprendente una estabilidad qmmica aumentada y por ello, un ritmo de degradacion disminuido en medios ambientes donde el pH esta por encima de aproximadamente 10, tal como hasta aproximadamente 13 o 14.

Por ello, la presente invencion proporciona una protema mutada, que es util por ejemplo como protema ligando en cromatograffa por afinidad para la adsorcion selectiva de inmunoglobulinas, tales como IgG, IgA y/o IgM, preferiblemente IgG, de especies de mairnferos, tales como un ser humano. El proposito de la adsorcion puede ser tanto producir un producto purificado, tal como una fraccion de inmunoglobulina pura o un lfquido a partir del cual la inmunoglobulina ha sido separada, como detectar la presencia de inmunoglobulina en una muestra. El ligando segun la invencion exhibe una estabilidad qmmica suficiente para resistir la limpieza alcalina convencional durante un periodo de tiempo prolongado, que hace del ligando un candidato atractivo para la operacion eficaz a gran escala, donde la regeneracion de la columna es una necesidad.

La protema de union a inmunoglobulina mutada de la invencion es capaz de unirse a otras regiones de una molecula de inmunoglobulina distintas de las regiones de determinacion de la complementariedad (CDR), y comprende al menos una unidad como define la SEC ID NO.2, en la cual el resto aminoacido en la posicion 23 de cada unidad es una treonina y en donde en cada unidad a) el resto aminoacido en la posicion 3 es una alanina, o b) los restos de aminoacido en las posiciones 3 y 6 son una alanina y un acido aspartico respectivamente.

En la presente memoria, la SEC ID NO: 1 define una secuencia aminoaddica del dominio B de SpA y la SEC ID NO: 2 defina una protema conocida como protema Z.

La protema Z es una construccion sintetica derivada del dominio B de SpA, donde la glicina en posicion 29 ha sido intercambiada por alanina, y esto se ha descrito en la literatura, vease por ejemplo Sthal et al, 1999. Affinity fusions in biotechnology; focus on protein A and protein B, en la Enciclopedia de Tecnologfa de Bioprocesos: Fermentacion, Biocatalisis y Bioseparacion. M.C. Fleckinger y S.W. Drew, editores. John Wiley e Hijos Inc., Nueva York, 8-22. Ademas, la protema Z ha sido usada como ligando en cromatograffa de afinidad. Sin embargo, aunque la protema Z exhibe una estabilidad qmmica mejorada a ciertos compuestos qmmicos distintos de NaOH en comparacion con el dominio B de SpA, todavfa no es tan estable en condiciones de valores de pH aumentados, necesarios para soportar las muchas etapas CIP de regeneracion deseadas en una planta industrial economica.

El descubrimiento segun la invencion de que varios restos de asparagina del dominio B de SpA y la protema Z pueden ser atribuidos a distintas contribuciones a las propiedades de estabilidad y afinidad de la protema mutada fue un poco inesperado, especialmente en vista de las ensenanzas arriba discutidas de Gulich et al donde se concluyo que todos los restos de asparagina de DUA pueden ser mutados sin ninguna discriminacion interna.

Asf, la invencion abarca las protemas mutantes monomericas arriba discutidas. Sin embargo, dichos monomeros de protemas pueden ser combinados a protemas multimericas, tales como dfmeros, tnmeros, tetrameros, pentameros, etc. Por consiguiente, otro aspecto de la presente invencion es un multimero comprendido por al menos una de las protemas mutadas segun la invencion junto con una o mas unidades adicionales, preferiblemente tambien protemas mutantes segun la invencion. Asf, la presente invencion es, por ejemplo, un dfmero comprendido por dos unidades que se repiten.

En una realizacion, el multfmero segun la invencion comprende unidades monomericas unidas por un despliegue de aminoacidos, preferiblemente en el intervalo de 0 a 15 aminoacidos, tales como 5-10. La naturaleza de tal union preferiblemente no debena desestabilizar la conformacion espacial de las unidades proteicas. Ademas, dicha union preferiblemente tambien debena ser suficientemente estable en medios ambientes alcalinos para no afectar a las propiedades de las unidades proteicas mutadas.

En la mejor realizacion del presente, el multimero es un tetramero de protema Z que comprende la mutacion N23T,donde la longitud de las unidades de enlace es 5-10 aminoacidos. En una realizacion, el presente multimero comprende la secuencia VDAKFN-Z(N23T)-QAPKVDAKFN-Z(N23T)QAPKC. En otra realizacion, el multimero comprende la secuencia VDAKFD-Z(N23T)-QAPKVDAKFD-Z(N23T)ZQAPKC.

En una realizacion espedfica, el presente multfmero tambien comprende uno o mas de los dominios E, D, A, B y C de la protema A de Staphylococcus. En esta realizacion, se prefiere que los restos de asparagina localizados en regiones de bucle hayan sido mutados a aminoacidos mas estables a la hidrolisis. En una realizacion ventajosa por razones de estabilidad estructural, el resto de glicina en posicion 29 de SEC ID NO: 1 tambien ha sido mutado, preferiblemente a un resto de alanina. Tambien, el ventajoso para la estabilidad estructural evitar la mutacion del resto de asparagina en posicion 52, ya que se ha encontrado que contribuye al contenido del a estructura secundaria en helice a de la molecula de protema A.

En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a un acido nucleico que codifica una protema mutante o multimero como se describe mas arriba. Por consiguiente, la invencion abarca una secuencia de ADN que puede ser usada en la produccion de protema mutante por expresion de la misma en un hospedador recombinante segun los metodos biotecnologicos bien establecidos. Por consiguiente, otro aspecto de la presente invencion es un sistema

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de expresion, que permite la produccion de una protema mutante como se describe mas arriba. Convenientemente se pueden usar hospedadores bacterianos, por ejemplo, tal como se describen la parte experimental mas abajo. En una realizacion alternativa, la presente invencion es una lmea celular que ha sido manipulada geneticamente para expresar una protema mutante segun la invencion. Para metodos con este fin, vease por ejemplo Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed), vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989).

Naturalmente, una vez ha sido establecida la secuencia deseada, la protema mutante segun la invencion alternativamente puede ser producida por metodos sinteticos.

Por consiguiente, la presente invencion tambien incluye un metodo biotecnologico o sintetico para producir una protema o multimero mutante segun la invencion.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a una matriz para la separacion por afinidad, tal matriz comprende ligandos que comprenden una protema de union a inmunoglobulinas acopladas a un soporte solido, en cuya protema, al menos un resto de asparagina ha sido mutado a un aminoacido distinto de glutamina. La presente matriz, cuando se compara con una matriz comprendida por la molecula pariente como ligando, exhibe una capacidad de union aumentada durante dos o mas separaciones con limpieza alcalina intermitente. El ligando de protema mutado es preferiblemente una protema de union al fragmente Fc, y puede ser usada para union selectiva de IgG, IgA y/o IgM, preferiblemente IgG.

La matriz segun la invencion puede comprender la protema mutante como se describe mas arriba en cualquier realizacion de la misma como ligando. En la realizacion mas preferida, los ligandos presentes sobre el soporte solido comprenden un multimero como se describe mas arriba.

El soporte solido de la matriz segun la invencion puede ser de cualquier tipo adecuado bien conocido. Una matriz de separacion por afinidad convencional normalmente es de naturaleza organica y esta basada en polfmeros que exponen una superficie hidrofflica al medio acuoso usado, es decir, expone grupos hidroxi (-OH), carboxi (-COOH), carboxamido (-CONH,, posiblemente en forma N-sustituida), amino (-NHj, posiblemente en forma sustituida), oligo-

o polietilenoxi en sus superficies externas y, si estan presentes tambien en superficies internas. En una realizacion, los polfmeros pueden, por ejemplo, estar basados en polisacaridos, tales como dextrano, almidon, celulosa, pululano, agarosa, etc, que ventajosamente han sido reticulados, por ejemplo con bisepoxidos, epihalohidrinas, hidrocarburos inferiores 1,2,3-hihalo sustituidos, para proporcionar una adecuada porosidad y rigidez. En la realizacion mas preferida, el soporte solido es perlas de agarosa porosas. Los soportes usados en la presente invencion pueden ser preparados facilmente segun metodos clasicos, tales como gelificacion en suspension inversa (S Hjerten: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964). Alternativamente, las matrices base son productos

comercialmente disponibles, tales como SepharoseTM FF (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia). En una realizacion, que es especialmente ventajosa para separaciones a gran escala, el soporte ha sido adaptado para aumentar su rigidez, y asf hacer la matriz mas adecuada para ritmos de flujo rapidos.

Alternativamente, el soporte solido esta basado en polfmeros sinteticos, tales como alcohol de polivinilo, acrilatos de polihidroxialquilo, metacrilatos de polihidroxialquilo, poliacrilatos, polimetacrilamidas, etc. En el caso de polfmeros hidrofobicos, tales matrices basadas en bencenos divinil y monovinil sustituidos, la superficie de la matriz normalmente esta hidrofilizada para exponer grupos hidrofflicos como se define mas arriba en un entorno de lfquido acuoso. Tales polfmeros son producidos facilmente segun metodos clasicos, vease por ejemplo “Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization” (R Arshady: Chimica e L'industria 70(9), 70-75 (1988)).

Alternativamente, se usa un producto disponible comercialmente, tal como Source™ (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia).

En otra alternativa, el soporte solido segun la invencion comprende un soporte de naturaleza inorganica, por ejemplo, sflice, oxido de zirconio, etc.

Todavfa en otra realizacion, el soporte solido esta en otra forma tal como una superficie, un chip, capilares, o un filtro.

Como consideracion, la forma de la matriz segun la invencion, en una realizacion la matriz esta en forma de monolito poroso. En una realizacion alternativa, la matriz esta en forma de perla o partmula que puede ser porosa o no porosa. Las matrices en forma de perla o partmula pueden ser usadas como una perla llena o en forma suspendida. Las formas suspendidas incluyen aquellas conocidas como perlas expandidas y suspensiones puras, en las que las partmulas o perlas estan libres para moverse. En el caso de monolitos, perlas llenas o perlas expandidas, al procedimiento de separacion comunmente le sigue cromatograffa convencional con un gradiente de concentracion. En el caso de suspensiones puras, se usara el tratamiento a lo largo de lotes.

El ligando puede estar unido al soporte via tecnicas de acoplamiento convencionales usando, por ejemplo, grupos amino y/o carboxi presentes en el ligando. Bisepoxidos, epiclorohidrina, CNBr, N-hidroxisuccinimida (NHS), etc son reactivos de acoplamiento bien conocidos. Entre el soporte y el ligando, se puede introducir una molecula llamada espaciador, que mejorara la disponibilidad del ligando y facilitara el acoplamiento qrnmico del ligando al soporte.

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Alternativamente, el ligando puede estar unido al soporte por enlaces no covalentes, tales como adsorcion ffsica o adsorcion bioespedfica.

En una realizacion ventajosa, el presente ligando ha sido acoplado al soporte por enlaces tioeter. Metodos para llevar a cabo tal acoplamiento son bien conocidos en este campo y llevados a cabo facilmente por el experto en la materia en este campo usando tecnicas y equipos clasicos. En una realizacion ventajosa, el ligando esta proporcionado primeramente con un resto de cistema terminal para su uso posterior en el acoplamiento. El experto en la materia en este campo tambien lleva a cabo facilmente etapas apropiadas de purificacion.

Como se menciona mas arriba, la afinidad a inmunoglobulina, es decir, propiedades de union del presente ligando, y por ello, la capacidad de la matriz, no esta esencialmente cambiada en el tiempo por el tratamiento con un agente alcalino. Convencionalmente, para un tratamiento de limpieza en el sitio de una matriz de separacion por afinidad, el agente alcalino usado es NaOH y la concentracion del mismo es hasta 0,75 M, tal como 0,5 M.

Por ello, otra manera de caracterizar la matriz segun la invencion es que debido a las mutaciones discutidas mas arriba, su capacidad de union disminuira a menos de aproximadamente 70%, preferiblemente menos de aproximadamente 50% y mas preferiblemente a menos de aproximadamente 30%, tal como aproximadamente 28%, tras el tratamiento con NaOH 0,5 M durante 7,5 horas.

En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a un metodo para aislar una inmunoglobulina, tal como IgG, IgA, y/o IgM, donde se usa una protema mutante, un mulffmero o una matriz segun la invencion. Por ello, la invencion abarca un proceso de cromatograffa, donde al menos un compuesto diana es separado de un ffquido por adsorcion a una protema mutante o un mulffmero o matriz descrita mas arriba. El producto deseado puede ser el compuesto separado o el ffquido. Por ello, este aspecto de la invencion se refiere a cromatograffa por afinidad, que es una tecnica de separacion ampliamente usada y bien conocida. En breve, en una primera etapa, una solucion que comprende los compuestos diana, preferiblemente anticuerpos como se mencionan mas arriba, se hace pasar por una matriz de separacion en condiciones que permiten la adsorcion del compuesto diana a los ligandos presentes sobre dicha matriz. Tales condiciones estan controladas por ejemplo por pH y/o concentracion de sal, es decir, fuerza ionica en la solucion. Se debe tener cuidado para no exceder la capacidad de la matriz, es decir, el flujo debe ser suficientemente bajo para permitir una adsorcion satisfactoria. En esta etapa, otros componentes de la solucion pasaran a su traves sin dificultad adicional. Opcionalmente, luego la matriz se lava, por ejemplo, con una solucion acuosa, con el fin de separar las sustancias retenidas y/o holgadamente unidas. La presente matriz se usa de forma mucho mas ventajosa con una etapa de lavado que utiliza un agente alcalino, tal como se discute mas arriba. En una etapa siguiente, se hace pasar por la matriz una segunda solucion denominada eluyente, bajo condiciones que proporcionan la desorcion, es decir, la liberacion del compuesto diana. Tales condiciones estan comunmente proporcionadas por un cambio de pH, la concentracion de la sal, es decir, fuerza ionica, hidrofobicidad, etc. Se conocen varios esquemas de elusion, tales como elucion en gradiente y elusion de forma escalonada. La elusion tambien puede estar proporcionada por una segunda solucion que comprende una sustancia competitiva, que sustituira al anticuerpo deseado sobre la matriz. Para una revision general de los principios de cromatograffa por afinidad, vease, por ejemplo, Wichek, M., y Chaiken, I. 2000. An overview of affinity chromatography. Methods Mol. Biol. 147:1-6.

En una realizacion alternativa, una protema mutante segun la invencion es usada como compuesto ffder en un proceso donde un compuesto organico es modelado para parecerse a su estructura tridimensional. El compuesto modelado se conoce como mimetico. El diseno, smtesis y ensayo mimetico puede ser usado para evitar un gran numero de moleculas escrutadas al azar. En pocas palabras, tal metodo puede implicar determinar las partes particulares de la protema que son cffticas y/o importantes para una propiedad tal como union a inmunoglobulinas. Una vez identificadas estas partes, su estructura es modelada segun sus propiedades ffsicas, por ejemplo, estequiometffa, enlaces, tamano, carga, etc, usando datos de un intervalo de fuentes, tales como tecnicas de espectroscopia, datos de difraccion de rayos X y RMN. Se pueden usar en este proceso el analisis computacional, el cartografiado por similitud y otras tecnicas. Las consideraciones importantes en este tipo de procesos son la facilidad para sintetizar un compuesto, la aceptacion farmacologica, el patron de degradacion in vivo, etc.

Finalmente, la presente invencion tambien comprende otros usos de la protema mutante descrita mas arriba, tales como en metodos anaffticos, para propositos medicos, por ejemplo, diagnostico, en matrices, etc.

Descripcion detallada de los dibujos

La Figura 1 muestra alineamientos de aminoacidos de los cinco dominios homologos (E, D, A, B y C) de SpA. Las ffneas horizontales indican la identidad de aminoacidos. Las tres cajas muestran las helices a de como se

determino por Tashiro y colaboradores (Tashiro et al., 1997). Los restos de asparagina y tambien un resto de glicina en el dominio B, que se sustituyeron, estan subrayados en la figura. Tambien se muestran los alineamientos de aminoacidos para Z y Z(N23T).

La Figura 2 ilustra los resultados obtenidos tras tratamiento alcalino (limpieza en el lugar) de las protemas mutantes segun la invencion en comparacion con la protema Z desestabilizada. Una comparacion de la capacidad tras tratamiento CIP repetido tras un esquema de cromatograffa por afinidad ordinario. Se uso NaOH 0,5 M como agente

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limpiador. El protocolo se realizo 16 veces y la duracion del saneamiento alcalino fue de 30 minutos por cada ronda. La Figura 2(a) muestra el patron de inactivacion para Z(F30A) y variantes de la misma, mientras que la Figura 2(b) muestra el patron de inactivacion para Z^ y Z(N23T).

La Figura 3 muestra el gen que codifica Z(N23T/N3A/N6D)-Cys tras insercion dentro de un vector como se describe en el ejemplo 4(a). Las mutaciones estan marcadas con *.

La Figura 4 muestra un mapa plasmfdico del plasmido pAY91, que contiene el gen que codifica Z(N23T/N3A/N6D)- Cys como se describe en el ejemplo 4(a).

La Figura 5 muestra el gen que codifica Z(N23T/N3A/N6D) tras la insercion dentro de un vector como se describe en el ejemplo 4(b). Las mutaciones estan marcadas con *.

La Figura 6 muestra un ejemplo de mapa plasmfdico para el plasmido pAY100 que expresa el tetramero de Z(N23T/N3A/N6D)-Cys como se describe en el ejemplo 5.

La Figura 7 muestra el adaptador para introducir un sitio Kpnl dentro de un vector con promotor SpA y secuencia senal segun el ejemplo 6.

La Figura 8 muestra el plasmido pAY104, que contiene el promotor SPA y la secuencia senal a ser usados para la introduccion de un adaptador que contiene un sitio Kpnl, como se describe en el ejemplo 6.

La Figura 9 muestra el plasmido resultante, pAY128, tras la insercion del adaptador segun el ejemplo 6.

La Figura 10 muestra el casete de clonacion construido del ejemplo 6, donde esta subrayado el adaptador original.

La Figura 11 muestra el plasmido pAY114 tras la insercion de Z(N23T/N3A/N6D)-Cys-tetramero como se describe en el Ejemplo 6.

La Figura 12 muestra el casete de clonacion construido del ejemplo 7, donde esta subrayado el adaptador original.

La Figura 13 muestra el plasmido resultante, pAY129, tras la insercion del adaptador segun al ejemplo 7.

La Figura 14 muestra el plasmido pAY125 tras la insercion de Z(N23T/N3A/N6D)tetramero-Cys como se describe en el ejemplo 7.

La Figura 15 es un cromatograma obtenido de una prueba como se describe en el ejemplo 8, donde el primer pico corresponde al material de flujo a traves y el segundo pico corresponde a hlgG eludfa.

La Figura 16 muestra graficos que representan la capacidad de union dinamica restante de las matrices segun el ejemplo 8. De principio o fin, representan Z(N23T/N3A/N6D)dfmero-Cys, Z(N23T/N3A)dfmero-Cys, Z(N23T)dfmero- Cys, y Z(N23T/K4G)dfmero-Cys respectivamente. Debido a problemas de software, se han perdido los dos ultimos puntos de medida para Z(N23T/N3A)dfmero-Cys.

PARTE EXPERIMENTAL

Abajo, la presente invencion sera descrita a modo de ejemplos, que se proporcionan solo para propositos ilustrativos y por consiguiente, no pretenden limitar el alcance de la presente invencion tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

En esta parte, mientras que Z en su forma original ya tiene una estabilidad significativa pero no suficiente hacia un tratamiento alcalino, se asumio que pequenos cambios en la estabilidad debidos a las mutaciones pueden se difmiles de ser llevados a cabo en ensayos de laboratorio. Por tanto, se uso un metodo supresor de mutaciones (Kotsuka, T., S. Akanuma, M. Tomuro, A. Yamagishi; and T. Oshima. 1996. Further stabilisation of 3-isopropylmalate dehydrogenase of an extreme thermophile, Thermus thermophilus, by a suppressor mutation method. J Bacteriol. 178:723-727; and Sieber, V., A. Pluckthun, and F.X. Schmidt. 1998. Selecting proteins with improved stability by a phage-based method. Nature Biotechnology. 16:955-960) para proporcionar un variante del dominio Z con una estabilidad estructural disminuida. Segun esta estrategia, el variante desestabilizado de la protema Z, llamado aqrn Z(F30A) (Cedergren et al., 1993, arriba) se uso como pasaje para la introduccion posterior de mutaciones adicionales relacionadas con las investigaciones de estabilidad alcalina. Las propiedades de union de este variante son similares a las de la protema Z natural, mientras que F30 no esta implicada en la union Fc.

Ademas, Zwt denota el dominio Z de tipo salvaje, que no contiene la sustitucion F30A.

Estrategia experimental

Para analizar que asparaginas en el dominio Z son responsables de su inestabilidad en condiciones alcalinas, se llevo a cabo un analisis mutacional. Con el fin de permitir la deteccion de mejoras con respecto a la estabilidad alcalina del dominio Z, se decidio usar un variante mutado, Z(F30A), mientras que el dominio Z todavfa posee una

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estabilidad significativa pero no suficiente hacia condiciones alcalinas. Z(F30A) ha mostrado de forma temprana que posee una afinidad a IgG que es similar a la del tipo salvaje, pero tambien una estabilidad estructural marcadamente disminuida debido a la mutacion de un aminoacido y que normalmente forma parte del nucleo hidrofobico (Cedergren et al., 1993; arriba; Jerdeberg, L., B. Person, R. Andersson, R. Karlsson, M. Uhlen, y B. Nilsson, 1995. Kinetic analysis of the interaction between protein A domain variants and human Fc using plasmon resonance detection. Journal of Molecular Recognition. 8:270-278). El dominio Z es un paquete de tres helices que consiste de 58 aminoacidos, incluyendo ocho asparaginas (N3, N6, N11, N21, N23, N28, N43 y N52) (Figura 1) (Nilsson, B., T. Moks, B. Jansson, L. Abrahmsen, A. Elmblad, E. Holmgren, C. Henrichson, T.A. Jones, and M. Uhlen. 1987. A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein A. Protein Eng. 1:107-113). Para evaluar el efecto de las distintas asparaginas en el ritmo de desactivacion en condiciones alcalinas, siete de estos restos se intercambiaron por otros aminoacidos. Ya que N3 esta localizada en el extremo amino terminal flexible del dominio, se excluyo del estudio. Se asumio que una degradacion de este aminoacido no afectana a la actividad de un ligando monomerico y con ello no sena detectable en el ensayo presente, que mide la actividad conservada. Ademas, ya que el aminoacido esta localizado fuera de la parte estructurada del dominio, presumiblemente este sera facilmente reemplazable durante la multimerizacion del dominio para conseguir una molecula del tipo protema A. Para facilitar el diseno proteico, se hizo una comparacion con las secuencias homologas de los otros dominios de la protema A (Figura 1) (Gulich et al., 2000a). De la comparacion, se decidio intercambiar asparagina 11 por una serina y 23 por treonina y finalmente 43 por un acido glutamico. La asparagina 6 se intercambio por alanina mientras que la alternativa fue acido aspartico cuando se mira las secuencias homologas, que tambien ha mostrado ser sensible en condiciones alcalinas. Los cinco dominios de la protema A tienen asparaginas en otras posiciones (21, 28, 52). Por ello, se intercambiaron por alaninas.

Ejemplo 1: Mutagenesis, expresion y purificacion de la protema Z mutante Materiales y metodos

Se llevo a cabo la mutagenesis dirigida a sitio usando una tecnica de PCR en dos etapas (Higuchi et al., 1988). Se uso el plasmido pDHZF30A (Cedergren et al., 1993) como molde. Los oligonucleotidos que codifican para los distintos reemplazos de asparagina y el reemplazo A29G se sintetizaron por Interactiva (Interactiva Bio-technologie GmbH, Ulm, Alemania). Las enzimas de restriccion Xbal y Hindi (MBI Fermentas Inc., Amhurst, NY) se usaron para clonacion dentro del vector pDHZ (Jansson et al., 1996) que se llevo a cabo segun Sambrook (Sambrook et al., 1987). Para crear pTrpZ, el dominio Z se amplifico por PCR, usando el plasmido pKN1 como molde (Nord et al., 1995). El fragmento se restringio con Xbal y PstI y se ligo dentro del vector pTrpABDT1T2 (Kraulis et al., 1996) que ha sido restringido con las mismas enzimas. Se uso un Sistema se Secuenciacion de ADN MegaBACE 1000 (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) para verificar la secuencia correcta de los fragmentos insertados. Se utilizo un compuesto qmmico terminador MegaBACE (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) segun las recomendaciones del fabricante en un protocolo de secuenciacion en ciclo basado en el metodo didesoxi (Sanger et al., 1977). Durante los procesos de clonacion, se uso la cepa RR1AM15 de Escherichia coli (Coleccion de Cultivos Tipo Americana, Rockville, MA), mientras para la expresion de diferentes productos genicos se uso la 017 (Olsson, M.O., y L.A. Isaksson 1979. Analysis of rpsD Mutations in Escherichia coli. I: Comparison of Mutants with Various Alterations in Ribosomal Protein S4. Molec. gen. Genet. 169:251-257).

La produccion y purificacion de Z(F30A) y las diferentes construcciones del mismo se llevaron a cabo segun el protocolo subrayado por Gulich (Gulich et al., 2000b, vease mas arriba). La produccion de Z y pZ(N23T) se llevo a cabo como se describe en Kraulis et al (Kraulis, P.J., P. Jonasson, P.-A. Nygren, M. Uhlen, L. Jendeberg, B. Nilsson, y J. Kordel. 1996. The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helix bundel: a heteronuclear NMR study. FEBS lett. 378:190-194). Se liofilizaron fracciones relevantes. La cantidad de protema se estimo por medidas de absorbancia a 280 nm usando el coeficiente de absorbancia espedfico, un (1 g-1 cm-1); Z 0.156; Z(N23T), 0.169; Z(F30A), Z(F30A,N43E), Z(F30A,N23T,N43E).0.157; Z(F30A,N6A), Z(F30A,N11S), Z(F30A,N21A), Z(F30A,N23T), Z(F30A,N28A), Z(F30A,N52A), Z(F30A,N6A,N23T), Z(F30A,N11S,N23T) 0.158.. La concentracion se confirmo por analisis aminoaddico (BMC, Uppsala, Suecia). La homogeneidad se analizo por electroforesis en gel de poliacrilamida-Dodecil sulfato sodico (SDS-PAGE) (Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227:680-685) usando el sistema Phast. Las protemas liofilizadas se cargaron en geles de alta densidad (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) bajo condiciones reductoras y se tineron con Azul Brillante de Coomassie segun las recomendaciones del fabricante. La homogeneidad y lo pesos moleculares fueron ademas confirmados por espectrometna de masas.

Para espectroscopia CD, las muestras de protema se prepararon en un tampon fosfato (K2HPO4 8,1 mM, KH2PO4, 1,9 mM, pH 7,5) a una concentracion de 10 |iM. Los espectros se grabaron usando un espectropolanmetro J-720 (JASCO, Tokio, Japon) en la region UV lejana de 250 a 200 nm a RT en una celula de cuarzo de longitud de senda de 0,1 cm y con una velocidad de escaner de 10 nm min-1. Cada espectro era la media de los cinco escaneres acumulados y el espectro final se convirtio en elipticidad de resto medio (ERM) (deg cm2 dmol-1).

Resultados (ejemplo 1)

Todas las variantes Z se produjeron con exito de forma intracelular en E. coli a 37° C y mostraron los mismos niveles de expresion, aproximadamente 50 mg/l como se estimo por SDS-PAGE. Todas las protemas se purificaron por

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cromatograffa por afinidad con IgG. Tras la purificacion, las muestras se analizaron con SDS-PAGE (datos no mostrados), se liofilizaron y se almacenaron para analisis posteriores. La masa molecular para la protema Z y los distintos mutantes de la misma tambien se confirmaron por espectrometna de masas. Los datos confirmaron un correcto contenido en aminoacidos para todos los mutantes (datos no mostrados). Tambien, se llevaron a cabo analisis estructurales en un equipo de Dicronismo Circular (DC), mientras que se ha demostrado previamente ser adecuado para detectar cambios estructurales en protemas a helicoidales (Johnson, C.W., Jr. 1990. Protein secondary structure and circular dichroism: a practical guide. Proteins. 7:205-214; and Nord, K., J. Nilsson, B. Nilsson, M. Uhlen, and P.-A. Nygren. 1995. A combinatorial library of an a-helical bacterial receptor domain. Prot. eng. 8:601-608). Todos los espectros muestran un mmimo a 208 nm y a 222 nm en combinacion con un maximo alrededor de 195 nm, que indica una estructura similar para los mutantes y la molecula pariente. Sin embargo, Z(F30A, N52A) parece que tiene forma de helice a inferior que Z de tipo salvaje y los otros mutantes del mismo (datos no mostrados).

Ejemplo 2: Analisis de interaccion bioespecifica Materiales y metodos

Se detectaron diferencias en las constantes de afinidad y cinetica de los estados de asociacion y disociacion en un

instrumento Biacore™ 2000 (Biacore, Uppsala, Suecia). Se inmovilizaron IgG policlonal humana y HSA (referencia negativa) por acoplamiento amino sobre la capa de dextrano carboxilado de un chip sensor CM5 (Biacore) segun las recomendaciones del fabricante. La inmovilizacion de IgG dio como resultado aproximadamente 2000 RU. Z, ZF30A, y los diferentes mutantes se prepararon en HBS (HEPES 10 mM, NaCl 0,15 M, EDTA 3,4 mM, tensioactivo P20 al 0,005%, pH 7,4) a 10 concentraciones diferentes (100-550 nM). Las muestras se inyectaron sobre las superficies por duplicado en orden al azar a un ritmo de flujo de 30 pl min-1. Se uso HCl 10 mM para regenerar la superficie. Los datos se analizaron usando el software 3.0.2b de evaluacion BIA (Biacore AB). Las senales a partir de una superficie control inmovilizada con HSA se sustrajeron de la superficie de IgG. Se asumio un modelo 1:1 de Langmuir y se calcularon las constantes cineticas aparentes y tambien las constantes de afinidad. Tambien, se calculo el cambio en la energfa de union libre (AAG = -RTln Kaff, mutante/Kaff, nativa) en relacion a la molecula natural.

Resultados (ejemplo 2)

Para determinar las diferencias en la afinidad para las variantes de Z hacia IgG, se llevo a cabo una resonancia de superficie en plasmon (RSP) usando un Biacore. El objetivo era comparar la afinidad para las distintas variantes de Z mutado segun la invencion con la molecula pariente. Como se menciona mas arriba, debido a la alta estabilidad alcalina del dominio Z pariente se decidio usar un variante estructural desestabilizado de Z que incluye la mutacion F30A (Cedergren, L., R. Andersson, B. Jansson, M. Uhlen, and B. Nilsson. 1993. Mutational analysis of the interaction between staphylococcal protein A and human IgG1. Protein eng. 6:441-448). Por lo tanto, era de importancia confirmar primero que la afinidad entre la molecula mutada e IgG estaba mantenida a pesar de la mutacion. Como se puede ver en la Tabla 1 mas abajo, la afinidad de Z(F30A) no esta afectada de forma significativa. El pequeno cambio en la afinidad proporciona una estabilidad ligeramente superior al complejo de Z(F30A) e IgG en comparacion con la molecula Z pariente e IgG. Esto esta en consonancia con resultados descritos anteriormente por Jendeberg et al. (Cedergren et al., 1993, arriba; Jederberg et al., 1995, arriba). Todos los mutantes construidos con Z(F30A) como andamio se analizaron y compararon con su molecula pariente (Z(F30A)). Los resultados muestran que la afinidad global no esta afectada de forma significativa por las mutaciones, indicando que ninguna de las mutaciones en asparagina segun la invencion son muy importantes para la union a IgG (vease Tabla 1 abajo). En todas las variantes de Z, incluyendo la mutacion N21A o N43e, solo se observo una constante de afinidad ligeramente inferior. Para mutantes con la mutacion N23T, sorprendentemente, la afinidad incluso parece ser ligeramente superior. Tambien, en el caso de la mutacion N28A, el descenso en la afinidad es muy pequeno, y no se puede esperar que tenga influencia esencial si la protema mutante se usa, por ejemplo, como protema ligando. Ademas, todas las construcciones que incluyen la mutacion N28A tienen una constante de disociacion notablemente aumentada. Para los mutantes que incluyen la mutacion N23T afinidad un tanto aumentada parece que se debe a una constante de asociacion ligeramente aumentada. Tambien, la mutacion N6A da una constante de asociacion superior, pero la constante de afinidad no esta afectada debido a la constante de disociacion aumentada que tambien se da en la mutacion.

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Una vision general del estudio cinetico de los distintos dominios Z llevado a cabo usando Biacore

Mutante

Kon [105M-1s-1] Koff [10-3s-1] Kaf [1107M-1] AAG (vs Zwt) [kcal/mol] AAG (vs Z(F30A)) [kcal/mol]

Zwt

1,5 3,7 4,0 0

Z(N23T)

2,7 3,9 7 -0,3

Z(F30A)

1,9 4,17 4,5 -0,1 0,0

Z(F30A,N6A)

7 21 3,3 0,1 0,2

Z(F30A,N11S)

1,6 4,9 3,2 0,1 0,2

Z(F30A,N21A)

1 3,8 2,6 0,3 0,4

Z(F30A,N23T)

2,1 3,75 5,6 -0,2 -0,1

Z(F30A,N28A)

3,1 9,87 3,2 0,1 0,2

Z(F30A,N43E)

1,5 5,1 2,6 0,3 0,4

Z(F30A,N52A)

1,5 4,9 3 0,2 0,3

Z(F30A,N23T,N43E)

0,8 3,8 2 0,4 0,5

Z^ se uso como control interno durante las distintas medidas. Las diferencias en energfa de union libre se calcularon en relacion a Zwt y Z(F30A) respectivamente

Ejemplo 3: Estabilidad hacia condiciones alcalinas Materiales y metodos

El comportamiento de las variantes del dominio Z como ligandos de afinidad se analizo por inmovilizacion en una matriz de afinidad clasica. Z, Z(F30A) y las variantes mutadas se acoplaron de forma covalente a columnas de

afinidad HiTrap™ (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) usando el compuesto qmmico N-hidroxisuccinimida segun las recomendaciones del fabricante. Las columnas se pulsaron con TST y HAc 0,2 M, pH 3,1. se preparo e inyecto en las columnas en exceso IgG policlonal humana en TST. Se siguio un protocolo de cromatograffa por

afinidad clasico durante 16 ciclos en AktaTMExplorer 10 (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia). Entre cada ciclo se integro una etapa CIP. El agente limpiador fue NaOH 0,5 M y el tiempo de contacto para cada pulso fue de 30 minutos, dando como resultado un tiempo de exposicion total de 7,5 horas. El material eluido se detecto a 280 nm.

Resultados (ejemplo 3)

Z, Z(F30A) y mutantes de los mismos se unieron de forma covalente a columnas HiTrap™ usando un compuesto qmmico NHS. Se cargo IgG en exceso y la cantidad de IgG eluido se midio tras cada ciclo para determinar la capacidad total de la columna. Entre cada ciclo las columnas se expusieron a tratamiento CIP que consiste de NaOH 0,5 M. Tras 16 pulsos, con un tiempo de exposicion total de 7,5 horas, la columna con Z(F30A)-matriz muestra un 70% de disminucion de la capacidad. Los datos de degradacion en la Figura 2a sugieren que cuatro de las asparaginas intercambiadas (N6, N11, N43 y N52) son menos sensibles a las condiciones alcalinas que los mutantes expuestos para este experimento. Por el contrario, N23 parece que es muy importante para la estabilidad de Z(F30A). Z(F30A,N23T) muestra solo un 28% de disminucion de la capacidad a pesar de la mutacion desestabilizante F30A. Por consiguiente, Z(F30A,N23T) es casi tan estable como Zwt y por ello la variante mas estabilizada con Z(F30A) como andamio. El dominio Z(F30A) con dos mutaciones adicionales Z(F30A,N23T,N43E) tambien muestra el mismo patron de degradacion que Z(F30A,N23T). Un intercambio de N28 a una alanina mejora la estabilidad de Z(F30A) hacia condiciones alcalinas. Sorprendentemente, la columna con Z(F30A,N21A) como ligando de afinidad revela una perdida dramatica de capacidad cuando se expone a NaOH en comparacion con la

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molecula pariente. Estos datos hacen a Z(N23T) un candidate muy ventajoso como ligando en la purificacion por afinidad de IgG.

Para demostrar finalmente la fiabilidad de la estrategia usando una variante estructuralmente desestabilizada de un molecula con el fin de hacer pequenos cambios en la estabilidad detectable, la mutacion N23T se injerto dentro del

dominio Z pariente. El dominio Z pariente y Z(N23T) se acoplaron a columnas HiTrapTM y se expusieron a condiciones alcalinas del mismo modo que para los mutantes ya mencionados. Como se puede ver en la figura 2b, el mutante Z(N23T) muestra estabilidad superior a Zwt cuando se expone a pH superior.

Ejemplo 4: Construccion de monomeros de mutantes Z con y sin una cistema C-terminal

Se introdujeron tres mutaciones diferentes en un gen que codifica Z(N23T): K4G, N3A y la mutacion doble N3A/N6D.

Las mutaciones se introdujeron originalmente dentro de dos vectores diferentes: uno con una cistema en el extremo C-terminal y una sin la cistema. Esto se hizo para facilitar posteriormente la construccion de multimeros con una sola cistema en el extremo C-terminal..

Ejemplo 4(a): construccion del monomero que contiene cisteina

Como molde para la construccion, se uso un plasmido denominado “pGEM ZN23T”. Este ya contema la mutacion N23T en el gen Z.

Se llevo a cabo una reaccion de PCR con este plasmido como molde y los dos oligonucleotidos.

AFFI-63: TTT TTT GTA GAC AAC GGA TTC AAC AAA GAA C

GRTO-40: GAT CTG CTG CAG TTA GCA TTT CGG CGC CTG AGC ATC ATT TAG

para la mutacion K4G,

AFFI-64: TTT TTT GTA GAC GCC AAA TTC AAC AAA GAA C

GRTO-40: GAT CTG CTG CAG TTA GCA TTT CGG CGC CTG AGC ATC ATT TAG

para la mutacion N3A y,

AFFI-65: TTT TTT GTA GAC GCC AAA TTC GAC AAA GAA C

GRTO-40: GAT CTG CTG CAG TTA GCA TTT CGG CGC CTG AGC ATC ATT TAG

para la mutacion N3A/N6D.

Los tubos de la reaccion de PCR contienen: 0,5 |il de molde pGEM ZN23T [500 ng/|il], 5 pmol de cada cebador (Interactiva, Thermo Hybaid GmbH, Ulm, Alemania), 5 pl de mezcla de dNTPs ([10 mM], Applied Biosystems, CA, USA), 5 pl de tampon de PCR 10x (Applied Biosystems, CA, USA), 0,1 pl de AmpliTaq ([5 U/pl], Applied Biosystems, CA, USA) y agua esteril hasta un volumen final de 50 pl. El programa de PCR consistfa en 2 min a 94 °C seguido por 30 ciclos de 15 segundos a 96 °C, 15 segundos a 50 °C, 1 min a 72 °C y finaliza con un minuto adicional a 72 °C. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un Sistema de PCR GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems, CA, USA).

El producto de la PCR se analizo en un gel de agarosa al 1% tras confirmar la obtencion de un producto de tamano correcto, se purifico con el kit de purificacion de PCR QIAquick® (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania).

Los productos de PCR se escindieron segun Sambrook (Sambrook et al.) con las enzimas de restriccion ^ccI y PstI (New England Biolabs, NEB, MA, USA). Los productos de escision se analizaron en un gel de agarosa y se purificaron de la agarosa con el Kit de Extraccion en Gel QIAquick® (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania) antes de la ligacion. Los fragmentos se ligaron dentro de un vector denominado “pTrp-protA-stab-(multi9)”, ya escindido con las enzimas ^ccI y PstI y purificado, anadiendo la ADN ligasa T4 y el tampon de ligacion (MBI Fermentas, Lituania), y transformado posteriormente dentro de celulas RRIAM15 (ATCC, MA, USA). A las construcciones se les dio en nombre pAY87 (Z(N23T/K4G)-Cys), pAY89 (Z(N23T/N3A)-Cys) y pAY91 (Z(N23T/N3A/N6D)-Cys), respectivamente.

Se uso un Sistema de Secuenciacion de ADN MegaBACE™ 1000 (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) para verificar las secuencias correctas de fragmentos insertados. Se utilizo el compuesto qmmico terminador MegaBACE™ (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) segun las recomendaciones del fabricante en un protocolo de secuenciacion en ciclo basado en el metodo didesoxi (Sanger et al., 1977).

Ejemplo 4(b): construccion del monomero que no contiene cisteina

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Como molde para la construccion, se uso un plasmido denominado “pTrp(-N)ZN23T-Cys”. Este plasmido ya contema el gen con la mutacion N23T.

Se llevo a cabo una reaccion de PCR con este plasmido como molde y los dos oligonucleotidos AFFI-63: TTT TTT GTA GAC AAC GGA TTC AAC AAA GAA C GRTO-41: GAT CTC GTC TAC TTT CGG CGC CTG AGC ATC ATT TAG para la mutacion K4G,

AFFI-64: TTT TTT GTA GAC GCC AAA TTC AAC AAA GAA C GRTO-41: GAT CTC GTC TAC TTT CGG CGC CTG AGC ATC ATT TAG para la mutacion N3A y,

AFFI-65: TTT TTT GTA GAC AAC GGA TTC AAC AAA GAA C GRTO-41: GAT CTC GTC TAC TTT CGG CGC CTG AGC ATC ATT TAG para la mutacion N3A/N6D.

Los tubos de la reaccion de PCR contienen: 0,5 |il de molde pTrp(-N)ZN23T-Cys [500 ng/|il], 5 pmol de cada cebador (Interactiva, Thermo Hybaid GmbH, Ulm, Alemania), 5 pl de mezcla de dNTPs (10 mM, Applied Biosystems, CA, USA), 5 pl de tampon de PCR 10x (Applied Biosystems, CA, USA), 0,1 pl de AmpliTaq ([5 U/pl], Applied Biosystems, CA, USA) y agua esteril hasta un volumen final de 50 pl. El programa de pCr consistfa en 2 min a 94 °C seguido por 30 ciclos de 15 segundos a 96 °C, 15 segundos a 50 °C, 1 min a 72 °C y finaliza con un minuto adicional a 72 °C. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un Sistema de PCR GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems, CA, USA).

Los productos de PCR se clonaron directamente TA dentro del vector pGEM segun las recomendaciones del fabricante (Promega, WI, USA) y se transformaron posteriormente dentro de celulas RRIAM15 (ATCC, MA, USA). A las construcciones se les dio en nombre pAY86 (Z(N23T/K4G), pAY88 (Z(N23T/N3A) y pAY90 (Z(N23T/N3A/N6D), respectivamente.

Se uso un Sistema de Secuenciacion de ADN MegaBACE™ 1000 (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) para verificar las secuencias correctas de fragmentos insertados. Se utilizo el compuesto qrnmico terminador MegaBACE™ (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) segun las recomendaciones del fabricante en un protocolo de secuenciacion en ciclo basado en el metodo didesoxi (Sanger et al., 1977).

Ejemplo 5: Construccion del gen que codifica monomeros y oligomeros con una cisteina en el extremo C- terminal en el vector pTrp

Todos los plasmidos arriba descritos de pAY86 a pAY91 (un total de seis plasmidos) se escindieron con la enzima de restriccion ^ccI. Esto dio como resultado la liberacion de mutantes Z completamente a partir de vectores pAY86, pAY88 y pAY90 y una sola abertura en el extremo 3' del gen en los vectores pAY87, pAY89 y pAY91. Los vectores escindidos se trataron con Fosfatasa Alcalina de Intestino de Ternera (CIAP, MBI Fermentas, Lituania) segun las recomendaciones del fabricante. Esta etapa se llevo a cabo para defosforilar los extremos 5' para evitar autoligacion de los vectores.

Los fragmentos del mutante Z liberados se analizaron en un gel de agarosa y se purificaron posteriormente de la agarosa antes de ligar los fragmentos dentro de vectores abiertos segun lo siguiente:

Fragmento de pAY86 a pAY87

Fragmento de pAY88 a pAY89

Fragmento de pAY90 a pAY91

Para las reacciones de ligacion, se mezclaron diferentes proporciones de fragmento frente al vector y el resultado fue que se obtuvo un intervalo de multimeros diferentes, como se esperaba, en un intervalo de dfmeros a pentameros.

Los diferentes multimeros se transformaron dentro de celulas RRIAM15 (ATCC, MA, USA) y las secuencias correctas se verificaron por analisis en un equipo de secuenciacion en el Instituto Real de Tecnologfa tal como se describe mas arriba. Los plasmidos nuevamente construidos se denominaron como se muestra en la tabla de mas abajo:

Compendio de plasmidos construidos

Plasmido no. pAY

Protema expresada a partir de la construccion

86

Z(N23T/K4G)

87

Z(N23T/K4G)-Cys

88

Z(N23T/N3A)

89

Z(N23T/N3A)-Cys

90

Z(N23T/N3A/N6D)

91

Z(N23T/N3A/N6D)-Cys

92

Z(N23T/K4G)dfmero-Cys

93

Z(N23T/N3A)dfmero-Cys

94

Z(N23T/N3A/N6D)dfmero-Cys

95

Z(N23T/K4G)trimero-Cys

96

Z(N23T/N3A)trimero-Cys

97

Z(N23T/N3A/N6D)trimero-Cys

98

Z(N23T/K4G)tetramero-Cys

99

Z(N23T/N3A)tetramero-Cys

100

Z(N23T/N3A/N6D)tetramero-Cys

101

Z(N23T/K4G)pentamero-Cys

102

Z(N23T/N3A)pentamero-Cys

103

Z(N23T/N3A/N6D)pentamero-Cys

Los vectores plasmndicos arriba descritos, excepto pAY86, pAY88 y pAY90 tienen el promotor Trp, la secuencia Ifder Trp y el gen para la resistencia a kanamicina (Km). pAY86, pAY88 y pAY90 tienen un gen para resistencia a 5 ampicilina en su lugar.

Ejemplo 6: Construccion de genes que codifican monomeros y oligomeros con una cisteina en el extremo C- terminal en el vector pK4

Los genes que codifican las protemas enumeradas en la Tabla 2 se transfirieron a un vector que contiene el promotor SPA y una secuencia senal. Para permitir este procedimiento, se construyo un adaptador que contiene el 10 sitio de escision para la enzima de restriccion KnpI (New England Biolabs, NEB, MA, USA). El adaptador se construyo por los dos oligonucleotidos (Interactiva, Termo Hybaid GmbH, Ulm, Alemania).

El plasmido pAY104 (pK4-Cys-ABDstabd^ero) se escindio con FspI y PstI (New England Biolabs, NEB, MA, USA). El vector se purifico en un gel de agarosa y se separo el fragmento liberado y el vector restante se purifico del gel de agarosa con el Kit de Extraccion en Gel QIAquick® (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania).

15 Los dos oligomeros AFFI-88 y AFFI-89 se mezclaron en un tampon de ligacion (MBI Fermentas. Lituania) y se calentaron a 50° C y la muestra se dejo enfriar a temperatura ambiente tras lo cual el vector plasmfdico escindido se anadio junto con la ADN ligasa T4 (mBi Fermentas, Lituania). Tras la reaccion de ligacion, el producto se transformo dentro de celulas RRIAM15 y se verifico la secuencia correcta como se describe mas arriba. El plasmido resultante se denomino pAY128.

20 El plasmido pAY128 luego se escindio con las enzimas de restriccion KnpI y PstI y el vector escindido se analizo en un gel de agarosa y se purifico posteriormente con el Kit de Extraccion en Gel QIAquick® (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania). Los fragmentos que expresan los dos genes Z mutados Z(N23T/N3A) y Z(N23T/N3A/N6A) de pAY86 a pAY103 se escindieron con KnpI y PstI (New England Biolabs, NEB, MA, USA), se separaron y purificaron tras

5

10

15

20

25

30

separacion en un gel de agarosa. Los distintos fragmentos se ligaron dentro del vector escindido originado de pAY128 y los plasmidos resultantes fueron, tras verificar las secuencias correctas, denominados pAY107 a pAY116 tal como se enumera en la Tabla 3.

Tabla 3

Compendio de plasmidos construidos con el promotor SPA y la secuencia senal

Plasmido no. pAY

Proteina expresada a partir de la construccion

107

Z(N23T/N3A)-Cys

108

Z(N23T/N3A/N6D)-Cys

109

Z(N23T/N3A)dfmero-Cys

110

Z(N23T/N3A/N6D)dfmero-Cys

111

Z(N23T/N3A)trimero-Cys

112

Z(N23T/N3A/N6D)tnmero-Cys

113

Z(N23T/N3A)tetramero-Cys

114

Z(N23T/N3A/N6D)tetramero-Cys

115

Z(N23T/N3A)pentamero-Cys

116

Z(N23T/N3A/N6D)pentamero-Cys

Ejemplo 7: Construccion de genes que codifican una parte del gen E (E ) a partir de la proteina A fusionada en el extremo N-terminal a monomeros y oligomeros con una cisteina en el extremo C-terminal en el vector pK4

Los genes que codifican las protemas, como se enumeran en la Tabla 2, se transfirieron a un vector que contiene el promotor SPA y la secuencia senal y una parte del gen que codifica la region E de la proteina A (E'). Se ha mostrado anteriormente que una adicion del extremo N-terminal de la parte de union a IgG de la proteina A madura (region E), o partes de la misma, pueden aumentar el correcto procesamiento y tambien facilitar la secrecion del producto genico al medio de cultivo circundante (Abrahmse et al., 1985). Se construyo por los dos oligonucleotidos un adaptador que contiene el sitio de escision para la enzima de restriccion KnpI y una parte de la region E de la proteina A (E') (Interactiva, Termo Hybaid GmbH, Ulm, Alemania).

El Plasmido pAY104 (pK4-cys-ABDstabdfmero) se escindio con FspI y PstI (New England Biolabs, NRB, MA, USA). El vector se purifico en un gel de agarosa y se separo el fragmento liberado y el vector restante se purifico de la agarosa con el Kit de Extraccion en Gel QIAquick® (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania). Los dos oligonucleotidos se mezclaron en un tampon de ligacion y se calentaron a 75° C y la mezcla se dejo enfriar a temperatura ambiente tras anadir el vector plasirndico escindido, junto con ADN ligasa T4 (MBI Fermentas, Lituania). Tras la reaccion de ligacion, el producto se transformo dentro de celulas RRIAM15 y la secuencia correcta se verifico como se describe mas arriba. El plasmido resultante se denomino pAY129.

El Plasmido pAY129 luego se escindio con las enzimas de restriccion KnpI y PstI y el vector escindido se analizo en un gel de agarosa y se purifico posteriormente de la agarosa con el Kit de Extraccion en Gel QIAquick® (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania). Los fragmentos que expresan los dos genes Z mutados Z(N23T/N3A) y Z(N23T/N3A/N6A) de pAY86 a pAY103 se escindieron con KnpI y PstI , se separaron y purificaron tras la separacion de la agarosa. Los distintos fragmentos se ligaron dentro de un vector escindido originario de pAYl29 y los plasmidos resultantes, tras verificar las secuencias correctas, se denominaron pAY118 a pAY127 como se enumera en la Tabla 4.

5

10

15

20

25

Compendio de plasmidos construidos con el promotor SPA y la secuencia senal y una parte de la region E de la protema A - E'

Plasmido no. pAY

Protema expresada a partir de la construccion

118

E'-Z(N23T/N3A)-Cys

119

E'-Z(N23T/N3A/N6D)-Cys

120

E'-Z(N23T/N3A)dfmero-Cys

121

E'-Z(N23T/N3A/N6D)dfmero-Cys

122

E'-Z(N23T/N3A)tnmero-Cys

123

E'-Z(N23T/N3A/N6D)tnmero-Cys

124

E'-Z(N23T/N3A)tetramero-Cys

125

E'-Z(N23T/N3A/N6D)tetramero-Cys

126

E'-Z(N23T/N3A)pentamero-Cys

127

E'-Z(N23T/N3A/N6D)pentamero-Cys

Ejemplo 8: Estabilidad hacia condiciones alcalinas

Para evaluar la estabilidad de las protemas hacia condiciones alcalinas, se ensayaron cuatro protemas diferentes en un medio ambiente de pH alto. Las distintas protemas fueron Z(N23T)dfmero-Cys, Z(N23T/K4G)d^ero-Cys, Z(N23T/N3A)drnero-Cys y Z(N23T/N3A/N6D)dfmero-Cys.

(Z(N23T)drnero-Cys), (Z(N23T/N3A) d^ero -Cys), (Z(N23T/N3A/N6D) d^ero -Cys) y (Z(N23T/K4G)dfmero-Cys se cultivaron en fermentadores. El medo de cosecha se purifico y acoplo a Agarosa HF (Amersham Biosciences, Upssala, Suecia) usando metodos clasicos antes de los ensayos alcalinos. Las protemas acopladas a la agarosa HF se denominaron como sigue

•

Z(N23T) dfmero-Cys U631049

•

Z(N23T/K4G)dfmero-Cys U631079

•

Z(N23T/N3A)d^ero-Cys U631064

•

Z(N23T/N3A/N6D)d^ero-Cys U631063

La matrices se empaquetaron en columnas (HR 5/2, Amersham Biosciences, Upssala, Suecia) hasta un volumen final en un intervalo de 0,1 a 0,3 ml. El equipo de purificacion usado fue AKTA™ Explorer 10 (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) con una celda de flujo UV de muestra de 2 mm (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia).

Los tampones usados conteman

• Tampon de prueba: Tris-HCl 25 mM, EDTA 1 mM, NaCl 200 mM, Tween 20 al 0,05%, acetato amonico 5 mM, pH 8,0

• Tampon de elucion: acido acetico 0,2 M (HAc), pH 3,1

• Tampon de Limpieza en el Lugar (CIP): NaOH 0,5 M Un tfpico ciclo de prueba cromatografica consiste de

• Equilibrado de la columna con tampon de prueba

• Aplicacion de la muestra de 10 mg de IgG policlonal humana a 0,2 ml/min

• Lavado intenso de protemas no unidas

• Elucion a 1,0 ml/min con tampon de elucion

• Re-equilibrado con tampon de prueba

• Limpieza en el Sitio (CIP) con tampon CIP con un tiempo de contacto entre la matriz de la columna y NaOH

5 0,5 M de 1 hora

• Re-equilibrado con tampon de prueba

La cantidad de IgG cargada en cada prueba fue por encima de la capacidad de union dinamica total de la columna ya que el camino de las protemas no unidas era considerable cuando se carga la muestra dentro de la columna en todos los casos. Tras un ciclo, que incluyen las etapas de mas arriba, se empezo un nuevo ciclo que, de nuevo, 10 inclma una hora de exposicion de hidroxido sodico 0,5 M. Para medir la disminucion de la capacidad de union

dinamica de la columna, se comparo el area de pico del pico eluido con el area de pico del pico eluido cuando la matriz no habfa sido expuesta al hidroxido sodico. Considerando el area de pico original como 100% de la capacidad de union, se observo el descenso de la capacidad de union de hIgG. El area de pico se calculo con el software

UNICORN™ que acompana al sistema de purificacion.

15 Cada ciclo se repitio 21 veces, dando como resultado una exposicion total entre la matriz y el hidroxido sodico de 20 horas para cada matriz diferente. Las areas de pico normalizadas se vieron en una grafica como se puede ver mas abajo (Figura 16). Todos los 21 ciclos se repitieron para cada mutante.

Z(N23T/N3A/N6D)dfmero-Cys y Z(N23T/N3A)dfmero-Cys mostraron estabilidad mejorada frente a condiciones alcalinas en comparacion con Z(N23T)dfmero-Cys originalmente producido.

20

Claims (16)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Una protema de union a inmunoglobulina mutada capaz de unirse a regiones de una molecula de inmunoglobulina distintas de las regiones determinates de complementariedad (CDR), donde dicha protema comprende al menos una unidad como se define por SEC ID NO: 2, en la que el resto de aminoacido en posicion 23 en cada unidad es una treonina, y en donde en cada unidad a) el resto aminoacido en la posicion 3 es una alanina, o b) los restos de aminoacido en las posiciones 3 y 6 son una alanina y un acido aspartico respectivamente.
2. 2. Una protema segun la reivindicacion 1, que es una protema de union al fragmento Fc.
3. 3. Un multfmero que comprende unidades mutadas como se define en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende dos o mas unidades repetitivas.
4. 4. Un multimero segun la reivindicacion 3, que comprende un resto de cistema terminal.
5. 5. Un multimero segun una cualquiera de las reivindicaciones 3-4, que es un tetramero.
6. 6. Un acido nucleico que codifica una protema o un multimero tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
7. 7. Un sistema de expresion, que comprende un acido nucleico segun la reivindicacion 6.
8. 8. Una matriz para cromatograffa por afinidad, donde una pluralidad de ligandos que comprenden protemas de union a inmunoglobulinas segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 han sido acopladas a un soporte solido.
9. 9. Una matriz segun la reivindicacion 12, en la que los ligandos comprenden uno o mas multimeros segun una cualquiera de las reivindicaciones 3-5.
10. 10. Una matriz segun la reivindicacion 8 o 9, donde los ligandos han sido acoplados al soporte por enlace tioeter.
11. 11. Una matriz segun una cualquiera de las reivindicaciones 8-10, donde el soporte es un material polfmero natural, tal como un material de polisacarido.
12. 12. Una matriz segun una cualquiera de las reivindicaciones 8-11, que proporciona union selectiva de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en IgG, IgA e IgM, preferiblemente IgG.
13. 13. Una matriz segun una cualquiera de las reivindicaciones 8-12, donde los ligandos muestran una capacidad de union aumentada, durante dos o mas separaciones con limpieza alcalina intermitente, comparados con la molecula pariente.
14. 14. Una matriz segun la reivindicacion 13, donde la limpieza se lleva a cabo con NaOH y la concentracion del mimo es de hasta aproximadamente 1 M, tal como aproximadamente 0,5 M
15. 15. Un metodo para aislar una inmunoglobulina, tal como IgG, IgA y/o IgM, en el que se usa una protema mutante o un multimero segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o una matriz segun una cualquiera de las reivindicaciones 9-14.
16. 16. Un proceso de cromatograffa, donde al menos un compuesto diana es separado de un lfquido por adsorcion a una protema mutante o un multfmero segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o a una matriz segun una cualquiera de las reivindicaciones 9-14.