JP6951417B2 - アフィニティークロマトグラフィーのためのFC−結合タンパク質、並びにFc−結合タンパク質を含むアフィニティー分離マトリックスおよびその使用 - Google Patents
アフィニティークロマトグラフィーのためのFC−結合タンパク質、並びにFc−結合タンパク質を含むアフィニティー分離マトリックスおよびその使用 Download PDFInfo
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Description
一部の実施形態では、タンパク質のドメインの少なくとも1つは、配列番号1〜6または21のいずれか1つの誘導体であって、そのN末端の最初の4つのアミノ酸(1、2、3および/または4位)内の1、2、3または4つのアミノ酸の欠失および/またはそれをベースとする配列番号1〜6または21の1つに比較してC末端(57および/または58位)での1または2つのアミノ酸の欠失を有する以外は、配列番号1〜6または21の1つと100%同一である1つのアミノ酸配列を有する誘導体である。
第3態様では、本発明は、第1態様のFc結合タンパク質または免疫グロブリンをアフィニティー精製するための第2態様のアフィニティー分離マトリックスまたは免疫グロブリンのFc配列を含むタンパク質の使用に関する。
本発明について下記で詳細に記載する前に、本明細書に記載した特定の方法、プロトコールおよび試薬は変動する可能性があるので、本発明はそれらに限定されないと理解すべきである。さらに、本明細書において使用する用語は、特定の実施形態を記載する目的のためだけであり、特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されていないことも理解すべきである。他に定義しない限り、本明細書において使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。
本明細書の本文を通して、複数の文献(例えば、特許、特許出願、科学的刊行物、製造業者の仕様書、取扱説明書、GenBankアクセッション番号配列登録書など)が言及されている。本明細書では、本発明が先行発明によってそのような開示が先行することを認めていないとの承認であると何も解釈すべきではない。本明細書に言及した文献の一部は、「参照により組み込まれる」と特徴付けられている。そのような組み込まれた参考文献の用語の定義または教示と本明細書に列挙された用語の定義または教示との間に万一矛盾がある場合は、本明細書の本文が優先されるものとする。
本発明の状況では、用語「免疫グロブリン結合タンパク質」は、免疫グロブリンのFc領域に特異的に結合することができるタンパク質を記載するために使用される。Fc領域へのこの特異的結合に起因して、本発明の免疫グロブリン結合タンパク質は、全免疫グロブリン、Fc領域を含む免疫グロブリン断片、免疫グロブリンのFc領域を含む融合タンパク質、および免疫グロブリンのFc領域を含むコンジュゲートに結合することができる。本明細書の本発明の「免疫グロブリン結合タンパク質」は、免疫グロブリンのFc領域への特異的結合を示すが、「免疫グロブリン結合タンパク質」が例えば免疫グロブリンのFab領域などの他の領域へ低下したアフィニティーで追加して結合できることは排除されない。
本発明の好ましい実施形態では、Fc結合タンパク質は、1つ以上のFc結合ドメインを含む。
用語「融合タンパク質」は、少なくとも1つの第2タンパク質へ遺伝子的に結合された少なくとも1つの第1タンパク質を含むタンパク質に関する。融合タンパク質は、本来は別個のタンパク質をコードする2つ以上の遺伝子の結合を通して作製される。したがって、融合タンパク質は、単一の直鎖状ポリペプチドとして表示される同一または異なるタンパク質の多量体を含み得る。
本明細書で互換的に使用する用語「アフィニティーマトリックス」または「アフィニティー分離マトリックス」または「アフィニティークロマトグラフィーマトリックス」は、その上にアフィニティーリガンド、例えば本発明のFc結合タンパク質が付加されるマトリックス、例えば、クロマトグラフィーマトリックスを意味する。リガンド(例えば、Fc結合タンパク質)は、混合物から精製または除去すべき関心対象の分子(例えば、免疫グロブリンまたはFc含有タンパク質)に特異的に結合することができる。
以下では、本発明について詳細に説明する。下記では、本発明の様々な態様についてより詳細に規定する。以下に規定する各態様は、その反対を明確に指示しない限り、任意の1つ以上の他の態様と結合することができる。特に、好ましいまたは有利であると指示されたあらゆる特徴は、また別の好ましいまたは有利であると指示された他の1つ以上の特徴と組み合わせることができる。
第1態様の一部の実施形態では、多量体は、ヘテロ多量体であり、例えば少なくとも1つのFc結合ドメインは、Fc結合タンパク質内の他のFc結合ドメインとは異なるアミノ酸配列を有する。
第2態様の好ましい実施形態では、アフィニティー分離マトリックスは、固体支持体である。アフィニティー分離マトリックスは、配列番号1〜6または21のいずれか1つを含む少なくとも1つのFc結合ドメインを含む少なくとも1つのFc結合タンパク質を含む。
Fc結合タンパク質および特定の条件に依存して、カップリングは、例えば数種のリシンによるマルチポイント・カップリングまたは例えばシステインによるシングルポイント・カップリングであってよい。
(a)Fc配列を含むタンパク質を含有する溶液を提供する工程;
(b)本発明の少なくとも1つのFc結合タンパク質を含むアフィニティー分離マトリックスをそれに提供する工程;
(c)Fc配列を含むタンパク質への本発明の少なくとも1つのFc結合タンパク質の特異的結合を許容する条件下で、前記アフィニティー分離マトリックスとその溶液とを接触させる工程;および
(d)前記アフィニティー精製マトリックスからFc配列を含む前記タンパク質を溶出させる工程、および
(e)任意選択的に、工程(c)と(d)との間にアフィニティーマトリックスを洗浄する工程を含む方法に向けられる。
第4態様の一部の実施形態では、工程(d)におけるマトリックスからの免疫グロブリンの溶出は、pHの変化および/または塩濃度の変化を通して実行される。プロテインA媒体からの溶出のために使用される任意の好適な溶液は、例えば、5以下のpHを備える溶液、または11以上のpHを備える溶液によって使用され得る。
本発明のFc結合分子は、例えば単純な有機合成戦略、固相支援合成技術などの多数の従来型技術ならびに周知の技術または市販で入手できる自動合成装置のいずれかによって調製することができる。他方、それらはさらに、従来型の組換え技術単独によって、または従来型合成技術と組み合わせて調製することができる。
(実施例)
下記の実施例は、本発明をさらに具体的に例示するために提供する。しかし本発明は、それらに限定されるものではなく、以下の実施例は、上記の説明を根拠に単に本発明の実行可能性を示すものである。
親タンパク質の配列番号17または配列番号18を、天然型プロテインAドメインをシャッフリングするプロセスにより初めに生成した。より詳細には、本明細書において理解されるシャッフリングプロセスは、同一ではない公知のアミノ酸配列のセットから出発する、人工アミノ酸配列を結果として生じるアセンブリプロセスである。シャッフリングプロセスは、以下の:a)5つの天然型プロテインAのドメインE、B、D、AおよびCならびにプロテインA変異体のドメインZの配列を提供する工程;b)前記配列のアラインメント;c)組み換えられた部分配列を同定するためのコンピューター内(in silico)での統計的断片化、およびその後にd)モザイク産物、すなわち新規なアミノ酸配列を生成するための様々な断片の新規な人工配列のアセンブリを含んでいた。工程c)において生成される断片は、任意の長さの断片であった。例えば、断片化された親配列が長さnを有した場合、断片の長さは1〜n−1であった。
特異的な膜付着および精製のために、C末端Cys(配列番号19)および任意選択的にストレプタグ(strep−tag)(配列番号20)を備える短鎖ペプチドアミノ酸配列をFc結合タンパク質のC末端に付加した。
部位特異的突然変異誘発のために、Q5(登録商標)部位特異的突然変異誘発キット(NEB、製品番号E0554S)を製造業者の取扱説明書にしたがって使用した。いくつかの点突然変異の組合せを、ジーンアート(GeneArt)(商標)ストリングス(Strings)(商標)合成法(サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(Thermo Fisher Scientific))によって生成した。Strings(ストリングス)DNA断片は精製PCR産物に該当しており、これをpET28aベクターの誘導体内にクローン化した。ライゲーション産物は、エレクトロポレーション法によって大腸菌(E.coli)XL2−ブルー(blue)細胞内に形質転換させた。単一コロニーは、正しいサイズのインサートを含有する構築物を同定するためにPCRによってスクリーニングした。正確な配列を検証するために、DNAシーケンシングを使用した。
BL21(DE3)コンピテント細胞は、Fc結合タンパク質をコードする発現プラスミドを用いて形質転換させた。細胞は、選択的寒天プレート(カナマイシン)上に塗布し、37℃で一晩インキュベートした。前培養は、100mLの2xYT培地中で単一コロニーから接種し、ラクトースおよび消泡剤を含まない、150μg/mLのカナマイシンが補給されたバッフル付き1Lのエルレンマイヤーフラスコ内の従来型軌道シェーカー内において37℃、160rpmで16時間にわたり培養した。OD600読み出しは、6〜12の範囲内にあるはずである。本培養は、150μg/mLのカナマイシンが補給された1Lの厚肉エルレンマイヤーフラスコ内で400mLのスーパーリッチ培地(改変H15培地、2%のグルコース、5%の酵母抽出物、0.89%のグリセロール、0.76%のラクトース、250mMのMOPS、202mMのTRIS(pH7.4)、消泡剤SE15)中で、0.5の調整開始時OD600を有する、先の一晩培養物から接種した。培養物を共鳴音響式ミキサー(RAMビオ(RAMbio))に移し、37℃、20×gでインキュベートした。エアレーションは、オキシ−ポンプ(Oxy−Pump)ストッパーによって促進した。組換えタンパク質の発現は、グルコースを代謝させ、続いてラクトースが細胞内に進入するのを許容することによって誘導した。既定の時点で、OD600を測定し、5/OD600に調整した試料を抜去し、ペレット化し、−20℃で凍結させた。細胞を、約45〜60の最終OD600に達するまでおよそ24時間にわたり一晩増殖させた。バイオマスを収集するために、細胞は20℃で10分間にわたり16,000×gで遠心分離した。ペレットを計量し(湿性重量)、上清中でpHを測定した。細胞は、プロセッシングするまで−20℃で貯蔵した。
発酵中に採取した試料を、300μLの抽出バッファー(0.2mg/mLのリゾチーム、0.5×のバグバスター(BugBuster)、7.5mMのMgSO4、40Uのベンゾナーゼ(Benzonase)が補給されたPBS)中に再懸濁させ、15分間にわたり700rpm、室温でサーモミキサー内での撹拌によって溶解させた。可溶性タンパク質を、遠心分離(16,000×g、2分間、室温)によって不溶性タンパク質から分離した。上清(可溶性分画)を抜去し、ペレット(不溶性分画)を同等量の尿素バッファー(8Mの尿素、0.2MのTris、2mMのEDTA、pH8.5)中に再懸濁させた。可溶性および不溶性両方の分画から50μLを採取し、12μLの5×試料バッファーならびに5μLの0.5MのDTTを添加した。試料を、5分間にわたり95℃で煮沸した。最後に、8μLのそれらの試料を、ニューペイジ・ノベックス(NuPage Novex)の4〜12%のビス−トリス(Bis−Tris)SDSゲルに適用して製造業者の勧告にしたがってランし、クーマジーを用いて染色した。Fc結合タンパク質の高レベル発現が、選択された時間内の最適化条件下で見出された(データは示していない)。全ての発現したFc結合タンパク質は、SDS−PAGEによると95%超可溶性であった。
Fc結合タンパク質を、C末端ストレプタグ(StrepTag)II(配列番号20)を用いて大腸菌(E.coli)の可溶性分画内で発現させた。細胞を2回の凍結/解凍サイクルによって溶解させ、精製工程を、製造業者の取扱説明書(IBA、ゲッティンゲン、独国)にしたがってストレプタクチン(Strep−Tactin)(登録商標)樹脂を用いて実施した。ジスルフィド形成を回避するために、バッファーには1mMのDTTを補給した。
CM5センサーチップ(GEヘルスケア(GE Healthcare))を、SPRランニングバッファーを用いて平衡させた。表面が露出したカルボン酸基を、反応性エステル基を産生するためにEDCおよびNHSの混合物を通過させることによって活性化させた。700〜1,500RUのオンリガンドをフローセル上に固定化し、オフリガンドをまた別のフローセル上に固定化した。リガンド固定化後にエタノールアミンを注入し、非共有的に結合したFc結合タンパク質を除去するために、エタノールアミンおよび10nMのグリシン(pH2.0)を注入した。リガンド結合後、タンパク質分析物は表面上に蓄積し、屈折率を増大させた。屈折率におけるこの変化をリアルタイムで測定し、時間に対する反応または共鳴単位(RU)としてプロットした。分析物を、好適な流量(μL/分)を用いて連続希釈中のチップに適用した。各ラン後、再生バッファーを用いてチップ表面を再生し、ランニングバッファーを用いて平衡させた。コントロール試料をマトリックスに適用した。再生および再平衡化を、先に言及したように実施した。結合試験を、25℃でのビアコア(Biacore)(登録商標)3000(GEヘルスケア(GE Healthcare))を使用することによって実施し;データ評価を、製造業者によって提供されるように、BIAエバリュエーション(BIAevaluation)3.0ソフトウエアによって、ラングミュア1:1モデル(Rl=0)の使用によって実施した。評価した解離定数(KD)を、オフターゲットに対して標準化した。ヒトIgG1(セツキシマブ)、ヒトIgG2(パニツモマブ)およびヒトIgG4(ナタリツマブ)に対する配列番号1および配列番号2の結合アフィニティーを、表1に示した。
精製Fc結合タンパク質を、製造業者の取扱説明書(結合条件:pH9.0、一晩、エタノールアミンを用いる5時間にわたるブロッキング)にしたがってエポキシ活性化マトリックス(セファロース(Sepharose)6B、GE;製品番号17−0480−01)に結合させた。セツキシマブを、IgG1試料(5mg;1mg/mLのマトリックス)として使用した。セツキシマブを、固定化Fc結合タンパク質を含むマトリックスに飽和量で適用した。マトリックスを、固定化IgG結合タンパク質に結合したセツキシマブを溶出させるために100mMのグリシンバッファー(pH2.5)を用いて洗浄した。溶出したIgGの濃度を、Fc結合タンパク質の結合活性を決定するために、BLI(プロテインAオクテット(Octet)センサーおよび標準物質としてのセツキシマブを用いた定量)によって測定した。カラムを、室温(22℃±3℃)で6時間にわたり、0.5MのNaOHとともにインキュベートした。固定化タンパク質のIgG結合活性を、6時間にわたる0.5MのNaOHとのインキュベーションの前後に分析した。NaOH処理前の固定化タンパク質のIgG結合活性を100%であると規定した。
精製Fc結合タンパク質を、製造業者の取扱説明書にしたがって、アガロースベースのクロマトグラフィービーズ(プレスト(Praesto)(商標)ピュア(Pure)45、ピュロライト(Purolite);製品番号PR01262−166)に結合させた(結合条件:pH9.5、3時間、35℃、エタノールアミンを用いた一晩のブロッキング)。ポリクローナルヒトIgGガンマノルム(Gammanorm)(登録商標)(オクタファルマ(Ocatpharm))をIgG試料(濃度、2.2mg/mL)として使用した。ポリクローナルhIgG試料を、固定化Fc結合タンパク質を含むマトリックスに飽和量で適用した。マトリックスを、固定化IgG結合タンパク質に結合したhIgGを溶出させるために100mMのクエン酸バッファー(pH2.0)を用いて洗浄した。動的結合能力を、6分間の滞留時間、10%破過で注入されたhIgGの質量によって決定した。カラムを、室温(22℃±3℃)で6時間にわたり0.5MのNaOHとともにインキュベートした。固定化タンパク質のIgG結合活性を、6時間にわたる0.5MのNaOHとのインキュベーションの前後に分析した。NaOH処理前の固定化タンパク質のIgG結合活性を、100%であると規定した。
精製Fc結合タンパク質を、製造業者の取扱説明書にしたがって、アガロースベースのクロマトグラフィービーズ(プレスト(Praesto)(商標)ピュア(Pure)45またはピュア(Pure)5)に結合させた。IgG試料として、DBC10%まで装填した、ポリクローナルヒトIgGガンマノルム(Gammanorm)(登録商標)を使用した(濃度、2.2mg/mL)。ポリクローナルhIgG試料を、固定化Fc結合タンパク質を含むマトリックスに飽和量で適用した。2工程プロセスでは、マトリックスを最初に100mMのクエン酸バッファー(pH3.5)、次に100mMのクエン酸バッファー(pH2.0)を用いて洗浄し、固定化Fc結合タンパク質に結合したhIgGを溶出させた。
Claims (19)
- 1つ以上のドメインを含むFc結合タンパク質であって、少なくとも1つのドメインは、配列番号1〜6または21のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含む、Fc結合タンパク質。
- 前記タンパク質は、相互に連結した2、3、4、5または6つのドメインを含む、請求項1に記載のFc結合タンパク質。
- 前記ドメインの全部は、配列番号1〜6または21のいずれか1つから選択される、請求項2に記載のFc結合タンパク質。
- 前記ドメインの少なくとも1つは、配列番号1〜6または21のいずれか1つの誘導体であって、前記誘導体は、そのN末端の最初の4つのアミノ酸内の1、2もしくは3つのアミノ酸の欠失および/またはそのC末端の最初の2つのアミノ酸内の1もしくは2つのアミノ酸の欠失を有する以外は、配列番号1〜6または21の1つと100%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項2に記載のFc結合タンパク質。
- 前記タンパク質はホモ多量体である、請求項2に記載のFc結合タンパク質。
- 前記タンパク質はヘテロ多量体である、請求項2に記載のFc結合タンパク質。
- 1つ以上のドメインは、相互に直接的に、または1つ以上のリンカーを用いて連結されている、請求項2〜4のいずれか一項に記載のFc結合タンパク質。
- 前記リンカーは、ペプチドリンカーである、請求項7に記載のFc結合タンパク質。
- 前記タンパク質は、少なくとも5時間にわたる0.5MのNaOH中でのインキュベーション後に結合能力における15%未満の減少を有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載のFc結合タンパク質。
- 前記Fc結合タンパク質は、固体支持体にコンジュゲート化されている、請求項1〜9のいずれか一項に記載のFc結合タンパク質。
- 前記Fc結合タンパク質は、固体支持体に前記Fc結合タンパク質を部位特異的共有結合させるための付着部位をさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載のFc結合タンパク質。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の前記Fc結合タンパク質を含むアフィニティー分離マトリックス。
- Fc配列を含む任意のタンパク質をアフィニティー精製するための、請求項1〜11のいずれか一項に記載の前記Fc結合タンパク質または請求項12に記載のアフィニティー分離マトリックスの使用。
- Fc配列を含む前記タンパク質の95%以上が3.5以上のpHで溶出される、請求項13に記載の使用。
- Fc配列を含むタンパク質をアフィニティー精製するための方法であって:
(a)Fc配列を含むタンパク質を含有する溶液を提供する工程;
(b)アフィニティー分離マトリックスに結合した請求項1〜7のいずれか一項に記載の少なくとも1つのFc結合タンパク質を含む前記アフィニティー分離マトリックスを提供する工程;
(c)Fc配列を含むタンパク質への請求項1〜7のいずれか一項に記載の少なくとも1つのFc結合タンパク質の特異的結合を許容する条件下で、前記アフィニティー分離マトリックスを前記溶液と接触させる工程;および
(d)Fc配列を含む前記タンパク質を前記アフィニティー分離マトリックスから溶出させる工程を含む方法。 - 工程(c)と(d)との間に前記アフィニティーマトリックスを洗浄する工程をさらに含む、請求項15に記載の方法。
- Fc配列を含む前記タンパク質は、免疫グロブリン分子またはその断片もしくは誘導体を含む、請求項15または16に記載の方法。
- Fc配列を含む前記タンパク質の95%以上が3.5以上のpHで溶出される、請求項15〜17のいずれか一項に記載の方法。
- Fc配列を含むタンパク質をアフィニティー精製するための方法であって:
(a)アフィニティー分離マトリックスに結合した請求項1〜7のいずれか一項に記載の少なくとも1つのFc結合タンパク質を含む前記アフィニティー分離マトリックスを、Fc配列を含む前記タンパク質への前記少なくとも1つのFc結合タンパク質の結合を許容する条件下で、Fc配列を含む前記タンパク質を含有する溶液と接触させる工程;および
(b)前記アフィニティー分離マトリックスから、前記少なくとも1つのFc結合タンパク質に結合したFc配列を含む前記タンパク質を溶出させる工程を含む方法。
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