CN104945488B

CN104945488B - 一种具有免疫球蛋白结合能力的多肽

Info

Publication number: CN104945488B
Application number: CN201410120354.XA
Authority: CN
Inventors: 赵致; 安少朋
Original assignee: Mega Biomedicine Shanghai Co Ltd
Current assignee: Mega Biomedicine Shanghai Co Ltd
Priority date: 2014-03-27
Filing date: 2014-03-27
Publication date: 2020-02-18
Anticipated expiration: 2034-03-27
Also published as: CN104945488A

Abstract

本发明涉及一种具有免疫球蛋白结合能力的多肽。揭示了一种耐碱性的具有免疫球蛋白结合能力的多肽，其纯化免疫球蛋白的纯化效率高。

Description

一种具有免疫球蛋白结合能力的多肽

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种具有免疫球蛋白结合能力的多肽。

背景技术

葡萄球菌蛋白A(Protein A)来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus)，为金黄色葡萄球菌表面的一种膜蛋白。Protein A具有与免疫球蛋白特异性结合的能力，Protein A亲和层析柱已成为生物技术领域应用广泛的纯化抗体的亲和柱，可从腹水，血清和细胞培养上清或细胞抽提物中分离和纯化多种哺乳动物不同亚型的抗体或包含抗体Fc片段的基因工程重组蛋白。目前，Protein A已经可以通过基因工程重组技术生产。

但是，现有技术中，Protein A还具有不稳定的缺陷，特别是在碱性条件下稳定性较为不理想，从而影响其应用。因此，本领域还需要进一步开发具有免疫球蛋白结合能力的蛋白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有免疫球蛋白结合能力的多肽。

在本发明的第一方面，提供一种具有免疫球蛋白结合能力的多肽，所述的多肽具有以下式(I)结构：

(Y-X)_n-Y-Z (I)

其中，Y为氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽；

X为连接肽；

Z为无或半胱氨酸；

n为1-20的正整数。

在一个优选例中，所述的免疫球蛋白是IgG；更特别地为人IgG。

在另一优选例中，所述的具有免疫球蛋白结合能力的多肽在碱性pH值下具有化学稳定性。

在另一优选例中，所述的连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；或

n为2-10的正整数(更佳地，n为3-7的正整数；进一步更佳地，n为3-4的正整数)；或

Z为半胱氨酸时，半胱氨酸的数量为1-5个；较佳地2-3个；较佳地，应用半胱氨酸的巯基将蛋白定向偶联在介质上。

在另一优选例中，所述的多肽具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，提供一种变异型葡萄球菌蛋白A结构域，所述的结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽。

在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，其编码前面任一所述的多肽或所述的变异型葡萄球菌蛋白A结构域。

在本发明的另一方面，提供一种表达载体，其包含一多核苷酸，该多核苷酸编码前面任一所述的多肽。

在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞包含所述的表达载体；或其基因组中整合有一多核苷酸，该多核苷酸编码前面任一所述的多肽。

在本发明的另一方面，提供一种生产所述的具有免疫球蛋白结合能力的多肽的方法，包括步骤：

(1)培养所述的宿主细胞，获得培养物；和

(2)从培养物中分离所述的具有免疫球蛋白结合能力的多肽。

在另一优选例中，所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞。

在本发明的另一方面，提供前面任一所述的具有免疫球蛋白结合能力的多肽的用途，用于结合免疫球蛋白；或用于制备免疫球蛋白亲和介质或亲和柱；或用于免疫球蛋白的纯化。

在本发明的另一方面，提供一种纯化免疫球蛋白的亲和柱，其包括亲和介质，以及附着于所述亲和介质的所述的具有免疫球蛋白结合能力的多肽。

在另一优选例中，所述的亲和介质包括但不限于：琼脂糖(珠)，葡聚糖凝胶、纤维素、大孔吸附树脂/胶体金或者合成的微球等。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、完整的天然葡萄球菌蛋白A序列SEQ ID NO:5(蛋白序列Genbank登录号：AAA26677.1，核酸序列Genbank登录号：M18264.1)，氨基酸上端的线标记处EDABC的结构域。

图2、天然葡萄球菌蛋白A(SPA)的EDABC结构域以及融合蛋白Y结构域的氨基酸序列比对。

图3、实施例所述的在***载体Y(G26A)四聚体-CC之后的质粒pET28-Y4的质粒图谱。

图4、融合蛋白Y四聚体的表达鉴定12%SDS-PAGE电泳。条带1，2，3为诱导前，条带4，5，6为对应的诱导后。

图5、耐碱性实验；在位清洗条件：0.5M NaOH，每1个循环接触时间为10min，每20个循环测定一次结合能力；绘制亲和柱的相对结合能力与碱处理循环次数变化曲线。

图6、SDS-PAGE检测亲和柱经多次使用并在位碱处理循环次数后纯化样品的纯度。

条带1.蛋白Marker；2.上样液，稀释的免疫小鼠腹水；3.穿出液；4.第4轮处理后上样洗脱后样品；5.第21轮；6.第39轮；7.第57轮；8.第75轮；9.蛋白Marker；10.第95轮；11.第111轮；12.第129轮；13.第148轮；

图7、亲和柱的相对结合能力与亲和柱使用次数即在位碱处理循环次数变化曲线。

图8、SDS-PAGE检测亲和柱纯化人血清IgG

条带1.蛋白Marker；2.上样液，稀释的人血清；3.穿出液；4.洗脱后样品；

图9、亲和柱从细胞培养液中纯化Fc融合蛋白洗脱曲线。

图10、还原SDS-PAGE检测亲和柱从细胞培养液中纯化Fc融合蛋白，上样量：6μg。

条带1.上样液，细胞培养后的上清液；2.穿出液；3.洗脱后样品；M.蛋白Marker。

图11、ELISA方法测定宿主CHO细胞蛋白HCP的标准曲线。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次揭示一种高稳定性的具有免疫球蛋白结合能力的多肽，与Protein A相比，该多肽的稳定性大大提高，具有更强的免疫球蛋白结合能力，纯化效率高。在此基础上完成了本发明。

本发明提供了一种在Protein A的Y结构域基础上进行突变后获得的变异型Protein A结构域。该变异型结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，相对于原Y结构域(SEQ ID NO:1)，其在氨基酸第26位发生G→A的突变。该变异型结构域的重复结构具有免疫球蛋白结合能力。

本发明还提供了具有免疫球蛋白结合能力的所述变异型结构域的重复结构，其是具有式(I)结构的多肽。

所述的变异型Protein A结构域一般通过多肽连接子(连接肽)连接以制备重复结构。作为本发明的一种优选的方式，所述的变异型结构域通过多肽连接子(连接肽)连接，从而形成重复结构。所述的连接子包括1-20个氨基酸；较佳地为5-15个氨基酸，更佳地为8-12个氨基酸，如10个，只要该连接肽不影响重复结构的空间折叠方式且不影响重复结构对于免疫球蛋白的结合活性，则均可应用于本发明。较佳地，所述的连接肽也具有耐碱性。作为本发明的优选方式，所述的连接肽是氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的连接肽。

此外，可选择地，所述的具有免疫球蛋白结合能力的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是6-His，FLAG，HA，HA1，c-Myc等。这些标签可用于对该多肽进行分离纯化。一个具体的例子是多肽的N末端连接有6-His结构。本领域人员应理解，可以在蛋白标签氨基酸序列与本发明多肽的氨基酸序列之间设置可酶切结构，从而可将标签从融合蛋白上分离。

作为本发明的优选方式，所述的具有免疫球蛋白结合能力的羧基端或氨基端设置可与亲和介质相连接的结构。例如，可设置一或多个半胱氨酸，以将蛋白定向偶联在亲和介质上，与环氧类或者其它类的亲和介质相连。此外，还可应用其它方式将之与不同亲和介质的连接。应理解，本领域已确定可用于将多肽与亲和介质相连的任何方法均可被应用于本发明中。

重复结构中，变异型Protein A结构域的数量可以是2-21个；更优选为3-11个；更优选为4-8个。

作为本发明的优选方式，所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明还包括在该变异型结构域或其重复结构的氨基酸序列的基础上，不改变其功能(即当其组成重复结构时仍然具有与本申请SEQ ID NO:4效果类似的免疫球蛋白结合能力)的片段、衍生物和类似物(即保守性变异多肽)。例如可以是(i)有一个或多个(如1-10个；更小的范围如1-5个；进一步更小的范围如1-3个)保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个(如1-10个；更小的范围如1-5个；进一步更小的范围如1-3个)氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)成熟蛋白与另一个化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。然而，所述的变异型结构域及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，相对于野生型结构域Y，其氨基酸第26位发生G→A的突变。

本发明的多肽可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

本发明还提供了编码所述的具有免疫球蛋白结合能力的多肽或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是单链的或是双链的。

编码所述的具有免疫球蛋白结合能力的多肽的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

本发明的具有免疫球蛋白结合能力的多肽的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关序列设计引物，并用常规方法制备cDNA作为模板，扩增而得有关序列。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列。目前已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或具有免疫球蛋白结合能力的多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白的方法。

本发明中，具有免疫球蛋白结合能力的多肽多核苷酸序列可***到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

通过常规的重组DNA技术，可利用所述的宿主细胞表达或生产重组的具免疫球蛋白结合能力的多肽。可将制备获得的多肽纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。

本发明的具有免疫球蛋白结合能力的多肽具有与免疫球蛋白结合的能力，同时具有对碱的耐受性。

本发明也涉及一种偶联有本发明的具免疫球蛋白结合能力的多肽的亲和介质。

本发明也涉及具有免疫球蛋白结合能力的多肽较佳地可以用于制备纯化免疫球蛋白用的亲和柱。因此，本发明提供了一种纯化免疫球蛋白的亲和柱，其包括亲和介质，以及附着于所述亲和介质的本发明所述的具有免疫球蛋白结合能力的多肽。

本发明对所述的亲和介质没有特别但限制，任何适合于附着蛋白A的亲和介质都是可用的，例如但不限于：琼脂糖(珠)，葡聚糖凝胶、纤维素、大孔吸附树脂/胶体金或者合成的微球等。

利用本发明的具免疫球蛋白结合能力的多肽制备所述的亲和柱的方法没有特别的限制，可以采用本领域技术人员熟知的方法和条件。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、融合蛋白Y4的表达鉴定

根据天然葡萄球菌蛋白A的C结构域、B结构域和E结构域的氨基酸序列(图1-2)，进行改造和优化，改造的序列为Y(G26A)，并设计四个Y(G26A)串联的融合蛋白Y4(G26A)。

Y的序列为：KFDKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADA(SEQ ID NO:1)；

Y(G26A)序列为：KFDKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADA(SEQ ID NO:2)；

Y4(G26A)序列为：ADAKFD-[Y(G26A)-QAPKADAKFD]₃-Y(G26A)-QAPKCC。也即为：

ADAKFDKFDKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADAQAPKADAKFDKFDKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADAQAPKADAKFDKFDKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADAQAPKADAKFDKFDKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADA QAPK CC(SEQ ID NO:4)

上述Y4(G26A)序列中，“QAPKADAKFD”(SEQ ID NO:3)为连接单元。“ADAKFD”、“QAPK”为连接单元的部分序列，“CC”为2个半胱氨酸。

按照大肠杆菌密码子偏爱性设计相对应的基因，人工合成基因序列(GeneY4(G26A))，基因通过酶切位点Nco I/Hind III装入表达质粒pET-28a(购自Invitrogen)中，获得重组质粒pET28-Y4(图3)，转化入感受态细胞BL21(DE3)中。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，获得转化子。挑取转化平板上的单克隆菌落，接种至30ml LB培养液中(含100μg/ml Kana)，置于37℃摇床过夜培养(10-12h)后，以1%接种量转入二级瓶中，继续培养。菌密度至OD6000.5-0.6时，加入终浓度为0.5mmo/L IPTG诱导3h，10000rpm离心收集菌体，SDS-PAGE电泳鉴定(图4)。

结果：多聚体Y4(G26A)基因在大肠杆菌中胞内成功表达，由SDS-PAGE电泳可知获得非常高的表达量，由SDS-PAGE估计表达量占菌体总蛋白的60%以上。

实施例2、融合蛋白Y4(G26A)的无蛋白培养基发酵及纯化

对实施例1中构建的重组表达菌进行10L罐发酵，采用无蛋白培养基(配方：甘油4g/L、葡萄糖5g/L、酵母粉5g/L，磷酸盐11g/L)罐中装液量6L，3%接种量接种菌株，发酵条件：37℃发酵，pH7.0，发酵过程中保持溶氧量10-30%。发酵后获得湿菌体450g，用pH7.5PBS按照1:10比例进行悬浮后，破碎细胞，离心，弃沉淀，上清加热80℃10min沉淀杂蛋白，离心，将溶液对10体积的pH7.510mM PB透析，换液4次，透析后样品上DEAE-FF柱纯化，分部收集，SDS-PAGE非还原电泳鉴定收集部分，并分别测定在275nm和250nm下OD275_nm和OD250_nm，将OD275_nm/OD250_nm>1.2的组分合并，对水透析后，无菌过滤，冻干，即得SPA冻干粉。冻干粉用于后续的测定，与胶的连接等操作。

结果：10L罐发酵可获得大于70g/L的湿菌体，菌体经破碎，离心，热沉淀，离心，透析，柱纯化，透析，无菌过滤冻干后，可获得大于1g/L的纯蛋白。收率比现有技术中ProteinA表达工艺的收率高20倍以上。

实施例3、SPA冻干粉的质量标准

根据每批SPA冻干粉，纯水配制成1mg/ml，在275nm和250nm下测定OD值，将OD275_nm/OD250_nm>1.2。确定质量标准。主要质量指标如下：

OD275_nm/OD250_nm>1.2。

1mg/ml SPA的质量消光系数：A^0.1% _275nm=0.14-0.23。

实施例4、Y4(G26A)对碱处理的耐受性

通过固定于标准的亲和性基质来分析作为亲和配体的Y4(G26A)蛋白的稳定性。利用Y4(G26A)蛋白C末端的半胱氨酸上的-SH与含有环氧功能基团的基质(环氧琼脂糖凝胶FF，购自GE)通过S-O键定向连接，获得偶联有Y4(G26A)蛋白的亲和基质。将偶联好的亲和基质装入小型柱(注射器型)内。利用在位清洗的方法进行碱耐受性实验：将NaOH流入装好亲和基质的小型柱并停留与亲和基质接触一段时间后流走，循环操作该步骤，在一定的循环次数后进行结合力测定。

在位清洗条件：0.5M NaOH(pH13-14)，每1个循环接触时间为10min，每20次NaOH循环测定一次结合能力。共计120个循环，与0.5M NaOH的总的接触时间为20h。

测定结合能力采用如下材料：

上样液：1mg/ml hIgG(获自Sigma)+BSA+溶菌酶混合蛋白(获自Sigma)样品(三种材料的配比是1:1:1)；

平衡与冲洗：20mM PB，0.15M NaCl，pH7.4，5CV；

洗脱：0.1M Gly-HCl，pH3.0，5CV。

测定结合能力操作步骤：测定经洗脱后洗脱液中的hIgG的量。

经120个循环后，与0.5M NaOH的总的接触时间为20h，测定Y4(G26A)蛋白的结合能力。结果发现，120个循环后Y4(G26A)仍保持90%的结合能力，如图5。

实施例5、Y4(G26A)耐碱性及在位处理后的纯化效果

利用Y4(G26A)蛋白C末端的半胱氨酸上的-SH与含有环氧功能基团的基质(环氧琼脂糖凝胶FF，购自GE)通过S-O键定向连接，获得偶联有将Y4(G26A)蛋白的亲和基质。将偶联好的亲和基质装柱，150次上样、平衡、洗脱、在位清洗循环，每一个循环均采用0.5M NaOH在位清洗，洗脱液进行SDS-PAGE纯度鉴定和相对结合力测定。

上样液：稀释的免疫小鼠腹水(5倍稀释)；

平衡与冲洗：20mM PB，0.15M NaCl，pH7.4，5CV；

洗脱：0.1M Gly-HCl，pH3.0，5CV；

在位清洗：0.5M NaOH，5CV；15min。

循环次数：150次，与0.5M NaOH的总的接触时间为37.5h。

如图7，经150次循环使用，与0.5M NaOH的总的接触时间为37.5h，仍保持80%的结合能力。

如图6，SDS-PAGE鉴定表明，Y4(G26A)对于IgG的纯化效果没有改变。

实施例6、应用1——从人血清纯化人IgG

柱子：4.6ID*50mml；包含实施例4相同的偶联有Y4(G26A)的亲和性基质；

样品：稀释的人血清(稀释5倍)；

上样缓冲液：20mM PB，0.15M NaCl，pH7.4；

洗脱缓冲液：0.1M Gly-HCl，pH3.0。

将稀释的人血清上样，上样缓冲液平衡，用洗脱缓冲液洗脱。对上样液、穿出液和洗脱液进行SDS-PAGE电泳鉴定。

结果如图8，Y4(G26A)蛋白的亲和柱可很好的从血清中分离人血清hIgG。

实施例7、应用2——从细胞培养液中纯化Fc融合蛋白

Fc融合蛋白的制备：将目的蛋白(Cytotoxic T-lymphocyte protein4，GenBank:L15006.1)的DNA序列的3’端与Fc基因序列的5’端融合，***到真核质粒中，酶切位点为HindⅢ/EcoRⅠ，成功构建pcDNA3.1(+)-CTLA4表达质粒，转化CHO细胞，表达后上清中包含Fc融合蛋白。Fc片段为抗体的一个片段，具有和蛋白A结合的能力，可以蛋白A亲和柱进行纯化。

亲和柱：1.0*2.5cm，CV2ml；包含实施例4相同的偶联有Y4(G26A)的亲和性基质；

样品：Fc融合蛋白(2g/L)的培养上清；

上样缓冲液：10mM PB+0.2M NaCl，pH7.5；

洗脱缓冲液：20mM柠檬酸钠+0.2M NaCl，pH3.7；

线性流速：115cm/h；

将Fc融合蛋白的培养上清上样，上样缓冲液平衡，用洗脱缓冲液洗脱。对上样液、穿出液和洗脱液进行SDS-PAGE电泳鉴定。

亲和柱从细胞培养液中纯化Fc融合蛋白洗脱曲线如图9。SDS-PAGE电泳鉴定结果如图10，Y4(G26A)蛋白的亲和柱可很好的从培养基上清中分离Fc融合蛋白。

实施例8、与Fc融合蛋白结合的特异性——宿主细胞蛋白(HCP)去除实验

样品：重组表达Fc融合蛋白的CHO重组细胞的培养上清，之后如实施例7相同的方法应用Y4(G26A)蛋白的亲和柱进行纯化，获得的洗脱液进行后续测定。

应用CHO宿主细胞蛋白检测ELISA试剂盒：Cygnus，批号：CM015。

ELISA方法：按照说明书操作。将标准品、样品、特殊杂质、内标放进标记好的96孔板内进行孵育，加入抗CHO蛋白抗体进入显色阶段，最后在450nm下读取吸光值。

结果：绘制标准曲线(图11)，按照下式计算HCP含量：

HCP含量(ng/mg)=R_TS/(C_ST/d_TS)

式中：R_TS是ELISA样品中HCP的浓度(ng/mL)，C_ST是样品浓度(mg/mL)，d_TS是稀释因子。

表1

试液	HCP(ng/mg)
		上样液	1754.3
洗脱液	1.9
		纯化倍数	920

结果如表1，HCP去除的纯化倍数为920，经亲和柱后，HCP含量为1754.3ng/mg的样品降为1.9ng/mg。符合生物制品要求。结果显著好于现有产品。

实施例9、与Fc融合蛋白结合的特异性——宿主细胞DNA去除实验

应用CHO宿主DNA测定试剂盒，AB公司，批号：4413713。

方法：按照试剂盒使用说明操作。利用磁珠从溶液中提取DNA，DNA样品、标准溶液按照说明书进行实时荧光定量PCR。

结果分析：按照说明书计算DNA含量，如表2。

表2

试液	DNA(pg/mg)
		上样液	1.5×10<sup>7</sup>
洗脱液	154.4
		纯化倍数	9.7×10<sup>4</sup>

表2结果：HCP去除的纯化倍数为9.7×10⁴，经亲和柱后，宿主DNA含量从1.5×10⁷pg/mg的样品降为154.4pg/mg，符合生物制品要求。结果显著好于现有产品。

实施例10、配基脱落实验

采用实施例4的亲和柱，相同条件下，分别上样10mg，20mg hIgG，洗脱，收集，用ELISA方法检测洗脱收集液中的蛋白A含量。

结果如表3。

表3

hIgG上样量(mg)	OD	浓度(ng/ml)	ppm
				10	0.065	0.279206	0.111683
20	0.071	0.497801	0.09956

结果显示，蛋白A的配基脱落小于0.2ppm。符合生物制品要求。与现有的产品相比，配基脱落量相对低或相当。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种具有免疫球蛋白结合能力的多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列如SEQID NO: 4所示。

2.分离的多核苷酸，其特征在于，其编码权利要求1所述的多肽。

3.一种表达载体，其特征在于，其包含一多核苷酸，该多核苷酸编码权利要求1所述的多肽。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含权利要求3所述的表达载体；或其基因组中整合有一多核苷酸，该多核苷酸编码权利要求1所述的多肽。

5.一种生产权利要求1所述的具有免疫球蛋白结合能力的多肽的方法，其特征在于，包括步骤：

(1) 培养权利要求4所述的宿主细胞，获得培养物；和

(2) 从培养物中分离权利要求1所述的具有免疫球蛋白结合能力的多肽。

6.权利要求1所述的具有免疫球蛋白结合能力的多肽的用途，用于制备结合免疫球蛋白的产品。

7.权利要求1所述的具有免疫球蛋白结合能力的多肽的用途，用于制备免疫球蛋白亲和介质或亲和柱。

8.权利要求1所述的具有免疫球蛋白结合能力的多肽的用途，用于制备纯化免疫球蛋白的产品。

9.一种纯化免疫球蛋白的亲和柱，其包括亲和介质，以及附着于所述亲和介质的权利要求1所述的具有免疫球蛋白结合能力的多肽。

10.如权利要求9所述的纯化免疫球蛋白的亲和柱，其特征在于，所述的亲和介质包括：琼脂糖珠，葡聚糖凝胶、纤维素、大孔吸附树脂或胶体金。