CN117700501A - 免疫球蛋白结合蛋白及其应用 - Google Patents
免疫球蛋白结合蛋白及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117700501A CN117700501A CN202211110150.9A CN202211110150A CN117700501A CN 117700501 A CN117700501 A CN 117700501A CN 202211110150 A CN202211110150 A CN 202211110150A CN 117700501 A CN117700501 A CN 117700501A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- domain
- igg
- dimer
- multimer
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000028557 immunoglobulin binding proteins Human genes 0.000 title description 3
- 108091009323 immunoglobulin binding proteins Proteins 0.000 title description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 102
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 100
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 100
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 94
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 94
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 claims abstract description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 89
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 58
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 58
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 53
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 26
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 25
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 23
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 23
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 15
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 13
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 13
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 13
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 11
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 11
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 8
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims description 7
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 4
- 102220479087 CD59 glycoprotein_D37R_mutation Human genes 0.000 claims description 4
- 102220483565 Nuclear cap-binding protein subunit 1_N23T_mutation Human genes 0.000 claims description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 102220002405 rs121908660 Human genes 0.000 claims description 4
- 102220181989 rs186074112 Human genes 0.000 claims description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 4
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 4
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 claims description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 23
- 238000009739 binding Methods 0.000 abstract description 17
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 40
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 26
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 21
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 16
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000012516 mab select resin Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 polymethacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 101000582398 Staphylococcus aureus Replication initiation protein Proteins 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 238000005305 interferometry Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920001289 polyvinyl ether Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000002477 vacuolizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Mycology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及蛋白纯化领域,具体地,本发明提供了一种由Protein A的突变的B结构域组成的分离的多肽,包含所述突变的B结构域的非天然免疫球蛋白结合蛋白,包含所述突变的B结构域或非天然免疫球蛋白结合蛋白的偶联物,以及相关用途。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白纯化领域,具体地,本发明提供了一种由Protein A的突变的B结构域组成的分离的多肽,包含所述突变的B结构域的免疫球蛋白结合蛋白,包含所述突变的B结构域或非天然免疫球蛋白结合蛋白的偶联物,以及相关用途。
背景技术
Protein A全称为staphylococcus protein A(金黄色葡萄球菌蛋白A),来源于金黄色葡萄球菌的一个株系,它含有5个高度同源的单结构域,自N端起分别为E、D、A、B和C,每个单结构域约含58个氨基酸残基,各结构域形成三股反向平行排列的α-螺旋空间结构。上述各单结构域均可以和抗体IgG(Immunoglobulin G,免疫球蛋白G)分子的Fc(fragmentcrystallizable,可结晶段)段以及Fab(fragment of antigen binding,抗原结合片段)段特异性结合,其中和Fc段结合区位于第二及第三恒定区(CH2和CH3)连接处,和Fab段结合区位于重链的可变区(VH,仅限于VH3基因家族)。
重组Protein A作为抗体分子纯化的配基材料主要具有以下优点:1)表达成本低,可用E.coli(大肠杆菌)原核体系进行大规模表达;2)特异性强,其对于人源IgG1、IgG2、IgG4和鼠源IgG2都具有较强的亲和性能;3)良好的再生性,可在碱性条件下反复再生循环使用。
然而,目前市场上多数重组Protein A填料都是同时结合Fc与VH区域,对于双特异性或多特异性抗体而言,分子通常含有多个VH区,其与Protein A的结合强度明显高于单克隆抗体,这便导致抗体纯化过程的洗脱条件较为苛刻,例如较低的pH值。这类条件本身会对抗体质量造成潜在风险并增加后续纯化工艺步骤与成本。
发明内容
本发明提供的包含Protein A的突变的B结构域的免疫球蛋白结合蛋白在具备与Fc结构域(例如,IgG Fc结构域)的高结合活性的同时,消除了与抗体重链可变区的结合活性,其可在双特异性或多特异性抗体(例如,含IgG Fc结构域的双特异性或多特异性抗体)纯化过程中提供更温和的洗脱条件,对样品质量提供有效的保障,并减少后期精细纯化的步骤与成本,从而可有效解决使用传统Protein A纯化双特异性或多特异性抗体时所面临的洗脱条件苛刻(例如,较低的pH值),抗体质量受到很大影响等问题。
因此,在一方面,本申请提供了分离的多肽,其由Protein A的突变的B结构域或其变体组成;其中,所述突变的B结构域与野生型Protein A的B结构域相比包含选自N23T、D36V、D37R、Q40V中的一个或多个(例如1个、2个、3个或4个)氨基酸置换;
其中,所述变体与所述突变的B结构域相比,具有至少90%,例如至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%的序列同一性;或者,具有一个或几个(例如,1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)氨基酸的置换(优选保守置换)、添加或缺失,且保留了所述突变的B结构域的功能;并且;
所述变体与所述突变的B结构域在相应于野生型Protein A的B结构域的第1位、第23位、第29位、第36位、第37位和第40位的位置处的氨基酸残基相同。
在某些实施方案中,所述突变的B结构域与野生型Protein A的B结构域相比进一步包含:(i)G29A,和/或,(ii)A1V。
在某些实施方案中,所述突变的B结构域与野生型Protein A的B结构域相比包含:A1V、N23T、G29A、D36V、D37R和Q40V。
在某些实施方案中,所述野生型Protein A的B结构域具有如SEQ ID NO:4所示的序列。
在某些实施方案中,所述突变的B结构域具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。此处所示序列在其N端不包含起始密码子(如ATG)编码的氨基酸(如甲硫氨酸(Met))。本领域技术人员理解,在通过基因工程制备蛋白的过程中,由于起始密码子的作用,所产生的多肽链第一位经常为起始密码子编码的氨基酸(如Met)。本发明的突变的B结构域不仅囊括在其N末端不包含起始密码子编码的氨基酸(如Met)的氨基酸序列,也囊括在其N末端包含起始密码子编码的氨基酸(如Met)的氨基酸序列。因此,在上述氨基酸序列的N端进一步包含起始密码子编码的氨基酸(如Met)的序列也在本发明的保护范围内。
在某些实施方案中,所述分离的多肽在pH 7.0-8.0(例如,pH 7.0-7.6,pH 7.0-7.4)的范围内与IgG Fc结构域特异性结合;和/或,所述分离的多肽在pH 2.7-4.5(例如,pH2.7-4.0,pH 3.5-4.5,或,pH 3.8-4.3)的范围内与IgG Fc结构域解离。
在另一方面,本申请还提供了重组蛋白,其包含如上所述的分离的多肽。
在某些实施方案中,所述重组蛋白不包含野生型Protein A的B结构域的氨基酸序列。
在某些实施方案中,所述重组蛋白不包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中,所述重组蛋白包含一个或多个(例如,1个,2个,3个、4个、5个、6个、7个或8个)如上所述的分离的多肽。在某些实施方案中,所述重组蛋白包含3个、4个、5个或6个如上所述的分离的多肽。
在某些实施方案中,各个所述分离的多肽之间任选地通过肽接头连接。在某些实施方案中,所述肽接头具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中,所述重组蛋白在其N端或C端进一步包含半胱氨酸。在某些实施方案中,所述重组蛋白在其C端进一步包含半胱氨酸。在某些实施方案中,所述半胱氨酸任选地通过接头(例如包含一个或多个甘氨酸(G)的柔性肽,例如GGGG)与所述分离的多肽连接。
在某些实施方案中,所述重组蛋白包含如SEQ ID NO:2或7所示的氨基酸序列或由其组成。此处所示序列在其N端不包含起始密码子(如ATG)编码的氨基酸(如甲硫氨酸(Met))。本领域技术人员理解,在通过基因工程制备蛋白的过程中,由于起始密码子的作用,所产生的多肽链第一位经常为起始密码子编码的氨基酸(如Met)。本发明的重组蛋白不仅囊括在其N末端不包含起始密码子编码的氨基酸(如Met)的氨基酸序列,也囊括在其N末端包含起始密码子编码的氨基酸(如Met)的氨基酸序列。因此,在上述氨基酸序列的N端进一步包含起始密码子编码的氨基酸(如Met)的序列也在本发明的保护范围内。
在某些实施方案中,所述重组蛋白还连接有另外的多肽,另外的多肽选自标签、酶切位点、信号肽或导肽、可检测的标记,或其任何组合。
在本文中,蛋白标签是本领域熟知的,其实例包括但不限于His、Flag、GST、MBP、HA、Myc、GFP或生物素,并且本领域技术人员已知如何根据期望目的(例如,纯化、检测或示踪)选择合适的蛋白标签。
在某些实施方案中,所述重组蛋白在pH 7.0-8.0(例如,pH 7.0-7.6,pH 7.0-7.4)的范围内与IgG Fc结构域特异性结合。
在某些实施方案中,所述重组蛋白在pH 2.7-4.5(例如,pH 2.7-4.0,pH 3.5-4.5,或,pH 3.8-4.3)的范围内与IgG Fc结构域解离。
在另一方面,本申请还提供了二聚体或多聚体,其包含两个或多个(例如,2个,3个、4个、5个、6个、7个或8个)如上所述的分离的多肽。在某些实施方案中,所述二聚体或多聚体包含3个、4个、5个或6个如上所述的分离的多肽。
在某些实施方案中,所述二聚体或多聚体不包含野生型Protein A的B结构域的氨基酸序列。
在某些实施方案中,所述二聚体或多聚体不包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中,所述二聚体或多聚体包含至少两条多肽链,所述两个或多个分离的多肽存在于至少两条多肽链中。
在某些实施方案中,所述分离的多肽之间通过接头可逆或不可逆地连接形成二聚体或多聚体。
在某些实施方案中,所述二聚体或多聚体中至少一条多肽链在其N端或C端进一步包含半胱氨酸。在某些实施方案中,所述多肽链在其C端进一步包含半胱氨酸。在某些实施方案中,所述半胱氨酸任选地通过接头(例如包含一个或多个甘氨酸(G)的柔性肽,例如GGGG)与所述分离的多肽连接。
在某些实施方案中,所述二聚体或多聚体中至少一条多肽链还连接有另外的多肽,另外的多肽选自标签、酶切位点、信号肽或导肽、可检测的标记,或其任何组合。
在本文中,蛋白标签是本领域熟知的,其实例包括但不限于His、Flag、GST、MBP、HA、Myc、GFP或生物素,并且本领域技术人员已知如何根据期望目的(例如,纯化、检测或示踪)选择合适的蛋白标签。
在某些实施方案中,所述二聚体或多聚体在pH 7.0-8.0(例如,pH 7.0-7.6,pH7.0-7.4)的范围内与IgG Fc结构域特异性结合。
在某些实施方案中,所述二聚体或多聚体在pH 2.7-4.5(例如,pH 2.7-4.0,pH3.5-4.5,或,pH 3.8-4.3)的范围内与IgG Fc结构域解离。
在另一方面,本申请还提供了偶联物,其包含固相支持物以及与所述固相支持物连接的如上所述的分离的多肽,重组蛋白,和/或,二聚体或多聚体。
在某些实施方案中,所述分离的多肽、重组蛋白或二聚体或多聚体直接或间接、可逆或不可逆地与固相支持物相连接。
在某些实施方案中,所述分离的多肽、重组蛋白或二聚体或多聚体通过共价和/或非共价键与所述固相支持物连接。
在某些实施方案中,所述固相支持物包括基于合成聚合物的那些固相支持物,例如,聚乙烯醚、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺和聚碳酸酯。
在某些实施方案中,所述固相支持物的形式包括但不限于珠(球形或不规则的形状)、中空纤维、固体纤维、垫、凝胶、膜、盒、柱、芯片、玻片、板或整体柱。
在某些实施方案中,所述固相支持物选自琼脂糖微粒、高分子聚合物微球、硅胶微球或磁珠。
任何合适的技术均可以用于将本文所述的分离的多肽、重组蛋白或二聚体或多聚体连接至固相支持物。例如,在一些实施方案中,可以通过常规偶联技术利用例如所述分离的多肽、重组蛋白或二聚体或多聚体中存在的氨基和/或羧基基团将其连接至固相支持物。例如,双环氧化合物(bisepoxide)、表氯醇、CNBr、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)是公知的偶联试剂。在一些实施方案中,在固相支持物和所述的分离的多肽、重组蛋白或二聚体或多聚体之间可引入间隔,从而其提高所述分离的多肽、重组蛋白或二聚体或多聚体的可用性,或者,促进所述分离的多肽、重组蛋白或二聚体或多聚体化学偶联至支持物。
在某些实施方案中,可将所述分离的多肽、重组蛋白或二聚体或多聚体上一个以上的位点连接至固体支持物(即,通过多点连接)。
在某些实施方案中,所述分离的多肽、重组蛋白或二聚体或多聚体通过其中的半胱氨酸与所述固相支持物之间形成二硫键连接。
在某些实施方案中,所述偶联物用于纯化免疫球蛋白。
在某些实施方案中,所述偶联物用于纯化含IgG Fc结构域的样品。
在某些实施方案中,所述含IgG Fc结构域的样品为IgG抗体或其重链,含IgG Fc结构域的双特异性或多特异性抗体,和/或,含IgG Fc结构域的纳米抗体。
在某些实施方案中,所述含IgG Fc结构域的样品为含IgG Fc结构域的双特异性或多特异性抗体。
在某些实施方案中,所述偶联物是亲和层析填料。
在某些实施方案中,所述偶联物在pH 7.0-8.0(例如,pH 7.0-7.6,pH 7.0-7.4)的范围内与IgG Fc结构域特异性结合。
在某些实施方案中,所述偶联物在pH 2.7-4.5(例如,pH 2.7-4.0,pH 3.5-4.5,或,pH 3.8-4.3)的范围内与IgG Fc结构域解离。
在某些实施方案中,如上所述的分离的多肽或重组蛋白或二聚体或多聚体特异性结合免疫球蛋白的Fc结构域(如IgG Fc结构域),并且不结合(例如不可检测的结合)免疫球蛋白的可变区(例如Fab)。
在另一方面,本申请还提供了分离的核酸分子,其编码如上所述的分离的多肽或重组蛋白或二聚体或多聚体或其所包含的多肽链。
在另一方面,本申请还提供了载体,其包含如上所述的核酸分子。在某些实施方案中,所述载体为克隆载体或表达载体。
在另一方面,本申请还提供了宿主细胞,其包含如上所述的核酸分子或载体。
此类宿主细胞包括但不限于,原核细胞例如细菌细胞(如大肠杆菌细胞),以及真核细胞例如真菌细胞(例如酵母细胞),昆虫细胞,植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞,例如小鼠细胞、人细胞等)。在某些实施方案中,所述宿主细胞是微生物。
本发明的分离的多肽、重组蛋白、二聚体或多聚体或其所包含的多肽链可以本领域已知的各种方法来制备,例如通过化学合成或基因工程重组技术来获得。例如,通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明分离的多肽、重组蛋白、二聚体或多聚体或其所包含的多肽链的DNA分子。将所得DNA分子***表达载体内,然后转染宿主细胞。然后,在特定条件下培养转染后的宿主细胞,并表达本发明的分离的多肽、重组蛋白、二聚体或多聚体或其所包含的多肽链。
在另一方面,本申请还提供了制备如上所述的分离的多肽或重组蛋白或二聚体或多聚体或其所包含的多肽链的方法,其包括,在允许蛋白表达的条件下,培养如上所述的宿主细胞,和从培养的宿主细胞培养物中回收所述分离的多肽或所述重组蛋白或所述二聚体或多聚体或其所包含的多肽链。
在另一方面,本申请还提供了制备如上所述的偶联物的方法,其包括将如上所述的分离的多肽,重组蛋白,和/或,二聚体或多聚体与固相支持物形成连接的步骤。
在某些实施方案中,所述方法包括:将所述分离的多肽,重组蛋白,和/或,二聚体或多聚体与所述固相支持物相接触,从而使所述分离的多肽,重组蛋白,和/或,二聚体或多聚体与所述固相支持物之间形成连接。
在某些实施方案中,所述连接是直接的或间接的,可逆或不可逆的。
在某些实施方案中,所述连接是共价连接或非共价连接。
在某些实施方案中,所述固相支持物选自琼脂糖微粒、高分子聚合物微球、硅胶微球或磁珠。
在某些实施方案中,所述连接包含二硫键。
在另一方面,本申请还提供了如上所述的分离的多肽,或重组蛋白,或二聚体或多聚体,或偶联物用于制备纯化试剂的用途,所述纯化试剂用于纯化免疫球蛋白。
在某些实施方案中,所述纯化试剂用于纯化含IgG Fc结构域的样品。
在某些实施方案中,所述含IgG Fc结构域的样品为IgG抗体或其重链,含IgG Fc结构域的双特异性或多特异性抗体,和/或,含IgG Fc结构域的纳米抗体。
在某些实施方案中,所述含IgG Fc结构域的样品为含IgG Fc结构域的双特异性或多特异性抗体。
在另一方面,本申请还提供了纯化免疫球蛋白的方法,其包括使用如上所述的偶联物。
在某些实施方案中,所述纯化是亲和层析。在某些实施方案中,所述亲和层析包括使用如上所述的偶联物作为固定相。
在某些实施方案中,所述方法用于纯化含IgG Fc结构域的样品。
在某些实施方案中,所述方法包含以下步骤:
(4)在第一溶剂中,使所述含IgG Fc结构域的样品与所述偶联物结合形成复合物;
(5)在第二溶剂中,使所述复合物解离;和,
(6)收集含有所述含IgG Fc结构域的样品的解离产物。
在某些实施方案中,所述第一溶剂的pH为7.0-8.0;例如,所述第一溶剂的pH为7.0-7.6或7.0-7.4。在某些实施方案中,所述第一溶剂为缓冲液(例如,Tris缓冲液)。
在某些实施方案中,所述含IgG Fc结构域的样品存在于所述第一溶剂中被提供。例如,通过将包含所述含IgG Fc结构域的样品的所述第一溶剂作为亲和层析的流动相被提供。
在某些实施方案中,所述第二溶剂的pH为2.7-4.5;例如,所述第二溶剂的pH为2.7-4.0、3.5-4.5或3.8-4.3。在某些实施方案中,所述第二溶剂为缓冲液(例如,甘氨酸缓冲液)。
在某些实施方案中,所述第二溶剂在亲和层析的流动相中被提供。
在另一方面,本申请还提供了试剂盒,其包含如上所述的分离的多肽,或重组蛋白,或二聚体或多聚体,或偶联物。
在某些实施方案中,所述试剂盒进一步包含蛋白纯化所用试剂(例如,如上所述的第一溶剂,和/或,如上所述的第二溶剂)。在某些实施方案中,所述纯化是亲和层析。
在某些实施方案中,所述第一溶剂为缓冲液(例如,Tris缓冲液)。
在某些实施方案中,所述第二溶剂为缓冲液(例如,甘氨酸缓冲液)。
在某些实施方案中,所述试剂盒用于纯化免疫球蛋白。
在某些实施方案中,所述试剂盒用于纯化含IgG Fc结构域的样品。
在某些实施方案中,所述含IgG Fc结构域的样品为IgG抗体或其重链,含IgG Fc结构域的双特异性或多特异性抗体,和/或,含IgG Fc结构域的纳米抗体。
在某些实施方案中,所述含IgG Fc结构域的样品为含IgG Fc结构域的双特异性或多特异性抗体。
术语定义
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
当本文使用术语“例如”、“如”、“诸如”、“包括”、“包含”或其变体时,这些术语将不被认为是限制性术语,而将被解释为表示“但不限于”或“不限于”。
除非本文另外指明或根据上下文明显矛盾,否则术语“一个”和“一种”以及“该”和类似指称物在描述本发明的上下文中(尤其在以下权利要求的上下文中)应被解释成覆盖单数和复数。
如本文中所使用的,当提及野生型Protein A的B结构域的氨基酸序列时,其使用SEQ ID NO:4所示的序列来进行描述。然而,本领域技术人员理解,在野生型Protein A的B结构域的氨基酸序列中,可天然产生突变,而不影响其生物学功能。因此,在本发明中,术语“野生型Protein A的B结构域”及其类似表述应包括所有此类序列,包括例如SEQ ID NO:4所示的序列以及其天然变体。并且,当描述野生型Protein A的B结构域的某一特定氨基酸位置时,其不仅包括SEQ ID NO:4的特定氨基酸位置,还包括其天然变体中的相应氨基酸位置。例如,表述“野生型Protein A的B结构域的第1位的位置处的氨基酸残基”时,其包括,SEQ ID NO:4的第1位的位置处的氨基酸残基,以及其天然变体中的相应位置处的氨基酸残基。根据本发明,表述“相应位置处的氨基酸残基”是指,当对序列进行最优比对时,即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时,进行比较的序列中位于等同位置的氨基酸残基。
如本文中所使用的,术语“特异性结合”是指,两分子间的非随机的结合反应,如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本发明中,术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数,其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小,抗体-抗原结合越紧密,抗体与抗原之间的亲和力越高。
两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kdis或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见Malmqvist M,Nature,1993,361:186-187)。kdis/kon的比率等于解离常数KD(参见Davies等人,Annual Rev Biochem,1990;59:439-473)。可用任何有效的方法测量KD、kon和kdis值。在某些实施方案中,可以使用表面等离子体共振术(SPR)在Biacore中来测量解离常数。除此以外还可用生物发光干涉测量法或Kinexa来测量解离常数。
如本文中所使用的,术语“载体(vector)”是指,可将多聚核苷酸***其中的一种核酸运载工具。当载体能使***的多核苷酸编码的蛋白获得表达时,载体称为表达载体。载体可以通过转化,转导或者转染导入宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的,包括但不限于:质粒;噬菌粒;柯斯质粒;人工染色体,例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC);噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于,逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件,包括但不限于,启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外,载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的,术语“宿主细胞”是指,可用于导入载体的细胞,其包括但不限于,如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞,如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞,如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞,或者如纤维原细胞,CHO细胞,COS细胞,NSO细胞,HeLa细胞,BHK细胞,HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。宿主细胞可以包括单个细胞或细胞群体。
如本文中所使用的,术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如,两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据,或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据),那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如,如果两个序列的10个位置中有6个匹配,那么这两个序列具有60%的同一性。例如,DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常,在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用,例如,可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.,4:11-17(1988))的算法,使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外,可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(JMoIBiol.48:444-453(1970))算法,使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中所使用的,术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如,可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换,例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质,包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如,赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此,优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见,例如,Brummell等人,Biochem.32:1180-1187(1993);Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999);和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997),其通过引用并入本文)。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如,Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991)),其以引用的方式并入本文中。在本发明中,术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中,氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如,丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文所使用的,术语“层析”指一种分离技术,其采用流动相和固定相以将样品中的一种类型的分子(例如免疫球蛋白)与其它分子(例如污染物)分开。液体流动相为包含待分离的特定类型的分子和其他分子的混合物。通过流动相将待分离的特定类型的分子和其他分子传送跨过或通过固定相(例如固体基质),由于流动相中不同分子与固定相的相互作用不同,可以将流动相中待分离的特定类型的分子与其他分子分离开。
如本文所使用的,术语“亲和层析”是指依赖于分子间特异性结合的层析方法,其中,偶联到固定相的配体与流动相(样品)中的分子(例如,免疫球蛋白)相互作用,即配体对待纯化的分子具有特异性亲和力。如在本发明的上下文中所理解的,亲和层析涉及将含有免疫球蛋白的样品加入到包含配体(例如,本发明的突变的B结构域,或包含所述突变的B结构域的免疫球蛋白结合蛋白)的固定相中。
发明的有益效果
本发明提供的包含Protein A的突变的B结构域的免疫球蛋白结合蛋白在具备与Fc的高结合活性的同时,消除了与抗体重链可变区的结合活性,其可在双特异性或多特异性抗体纯化过程中提供更温和的洗脱条件,对样品质量提供有效的保障,并减少后期精细纯化的步骤与成本,从而可有效解决使用传统Protein A纯化双特异性或多特异性抗体时所面临的洗脱条件苛刻(例如,较低的pH值),抗体质量受到很大影响等问题。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将理解,下列附图和实施例仅用于说明本发明,而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述,本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了本申请的Protein A突变体的改造位点。
图2显示了本申请的Protein A突变体的SDS-Page蛋白电泳结果;其中,泳道M为Marker蛋白样品,泳道1为诱导前Protein A突变体工程菌样品,泳道2为诱导后Protein A突变体全菌裂解液样品,泳道3为诱导后Protein A突变体菌裂解液上清样品,泳道4为诱导后Protein A突变体菌裂解液沉淀样品。
图3显示了本申请的Protein A突变体HPLC-SEC结果。
图4显示了本申请的Protein A突变体与抗体的亲和力性能测定结果。
图5显示了本申请的Protein A突变体所制备的层析介质与VHH-Fc、Fc alone及VHH alone的亲和力测定结果。
图6显示了本申请的Protein A突变体所制备的层析介质适用更为温和的洗脱条件。
序列信息
本申请涉及的序列的描述提供于下表中。
表1:序列信息
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
1.Protein A突变体表达载体的合成
采用DNA全序列合成的方法人工合成Protein A突变体的核苷酸序列(苏州金唯智生物科技有限公司),核苷酸序列为SEQ ID NO:3,其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:2,理论大小约为30kDa,并将所述核苷酸序列构建到Nco I/Hind III双酶切线性化的pET-28a载体上,得到Protein A突变体的表达质粒。其中,所述Protein A突变体相对于野生型Protein A的突变位点如图1所示。
此外,为便于蛋白表达及纯化,本实施例所用Protein A突变体的N末端含甲硫氨酸,C末端还融合有8×His(HHHHHHHH)标签。
2.Protein A突变体工程菌的构建
取上述步骤1中的质粒1μL,加到100μL商品化的BL21(DE3)感受态细胞中,进行30min冰浴;然后将质粒、感受态细胞混合物放入42℃水浴锅中热冲击90s;再拿出来冰浴2min;接着向混合物中加450μL LB,于37℃、220rpm培养45min;最后离心去除大部分培养基,将细菌涂布在含卡那霉素的LB平板中,放入37℃恒温箱中过夜培养。长出来的转化子用pET-28a载体通用引物经测序鉴定为阳性转化子。
3.小规模表达Protein A突变体
挑取上述步骤2中的阳性单克隆于10mL含卡那霉素的LB中培养(37℃、220rpm)约14h,作为种子液。取10mL种子液于1000mL含卡那霉素的LB培养基中,于37℃、220rpm培养2h(OD600读数为0.6);按培养体积的0.1%向培养基中加入1M IPTG,诱导表达条件为25℃、150rpm、16h。
将发酵液进行离心(6000rpm、4℃)30min去除培养基;用50mL Tris缓冲溶液(20mMTris-HCl,150mM NaCl,pH7.4)将菌泥悬浮起来,进行超声波破碎,破碎条件为25%功率,开5s、关5s,工作30min;将裂解液进行离心,条件为12000rpm、4℃离心30min,分离上清与沉淀,并进行SDS-PAGE蛋白电泳。SDS-PAGE蛋白电泳结果如图2所示,由图2可以看出ProteinA突变体被成功表达。
4.Protein A突变体的纯化
将上述步骤3中获得的细菌裂解液上清,使用AKTA***经Ni柱纯化,具体为:使用平衡液(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.4)冲洗蛋白纯化仪及Ni柱,直至基线平衡;选择合适的流速上裂解液上清,使样品在纯化柱中保留的时间为5min,并用洗杂液(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,5mM imidazole,pH7.4)洗除杂蛋白,直至基线平衡;最后用洗脱液(20mMTris-HCl,150mM NaCl,250mM imidazole,pH7.4)洗脱蛋白,洗脱后的蛋白使用5mM DTT进行还原并采用液相色谱(SEC)对其成分进行检测。HPLC-SEC检测结果如图3所示,由图3可知,还原后的蛋白纯度较高,接近90%,蛋白C端的His标签与色谱柱间的非特异性吸附导致蛋白特征峰存在一定程度的拖尾。此外在高保留时间可以观察到还原剂DTT的特征峰。
5.Protein A突变体与抗体的亲和力测定
ForteBio亲和力测定按照现有的方法(参见:Estep,P等人,基于溶液的高通量抗体-抗原亲和力和表位分级的测量,MAbs,2013.5(2):p.270-8)进行。简言之,传感器在分析缓冲液中线下平衡30min,然后线上检测60s建立基线,在线加载Biotin标记的双特异性抗体Ava-2GS-NSD(参见公开号CN114106190A)至SA传感器上。再将传感器放入100nM的Protein A突变体中作用110s,之后将传感器转移至PBS中解离5min。使用1:1结合模型进行动力学的分析。
结果如图4所示,由图4可知,本申请的Protein A突变体与双特异性抗体有很强的结合活性,可用于抗体的亲和纯化。
6.纯化用Protein A突变体亲和填料的制备
具体步骤如下:
(1)转移待偶联的层析介质到离心管中进行离心,去除上清并用0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)平衡,离心去除磷酸盐缓冲溶液并重复3次该过程;
(2)将Protein A突变体蛋白换液至上述磷酸盐缓冲溶液并加入到上述介质中进行偶联,37℃,130rpm,24h;
(3)待偶联结束后离心去除上清并加入乙醇胺进行封闭,37℃,130rpm,6h;
(4)用0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)清洗填料3次并将其在2-8℃保存待用。
7.Protein A突变体所制备的层析介质与VHH-Fc、Fc alone及VHH alone的亲和力测定
ForteBio亲和力测定按照现有的方法(参见:Estep,P等人,基于溶液的高通量抗体-抗原亲和力和表位分级的测量,MAbs,2013.5(2):p.270-8)进行。简言之,传感器在分析缓冲液中线下平衡30min,然后线上检测60s建立基线,在线加载本发明中Biotin标记的Protein A突变体至SA传感器上。再将传感器放入100nM的VHH-Fc(SEQ ID NO:8)、Fc(SEQID NO:9)或VHH(SEQ ID NO:10)中作用5mins,之后将传感器转移至PBS中解离5min。使用1:1结合模型进行动力学的分析。
结果如图5所示,由图5可知,由本申请Protein A突变体所制备的层析介质在保留与Fc的结合活性的同时,消除了与抗体重链可变区的结合活性。表明本申请Protein A突变体所制备的层析介质可有效避免抗体重链可变区与野生型Protein A的结合对抗体纯化过程带来的不利影响。
8.Protein A突变体所制备的层析介质用于双特异性抗体纯化
采用Protein A亲和层析柱MabSelect PrismA(Cytiva,货号17519901)或本申请Protein A突变体填料纯化目的蛋白Bi-088,所述目的蛋白(参见:公开号CN114195900A)为双特异性抗体,单个分子含有4个VHH区域(均为VH3基因家族)。使用5到10个柱体积的平衡缓冲液(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.4)平衡纯化柱,至流出液电导和pH值不变开始上样。上样结束后继续使用平衡缓冲液冲洗层析柱,至流出液UV值不再下降。使用洗脱缓冲液(20mM glycine-HCl,pH4.0或pH3.4)依次洗脱样品并收集流出液。待UV值稳定后用0.1MNaOH溶液进行再生。
结果如图6所示,由图6可知,由本申请Protein A突变体所制备的层析介质可在双特异性或多特异性抗体纯化过程中提供更温和的洗脱条件,对样品质量提供有效的保障,并减少后期精细纯化的步骤与成本。
具体来讲,同样上样量(22mg)情况下,本申请protein A亲和层析柱(柱体积0.7mL)在pH4.0洗脱条件下可以回收到14.6mg蛋白,在pH3.4条件下无额外蛋白流出,总回收率为66.4%;MabSelect PrismA层析柱在pH4.0洗脱条件下仅回收到1.1mg蛋白。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,但本领域技术人员将理解:根据已经公布的所有教导,可以对细节进行各种修改和变动,并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (16)
1.分离的多肽,其由Protein A的突变的B结构域或其变体组成,其中,所述突变的B结构域与野生型Protein A的B结构域相比包含选自N23T、D36V、D37R、Q40V中的一个或多个(例如1个、2个、3个或4个)氨基酸置换;
其中,所述变体与所述突变的B结构域相比,具有至少90%,例如至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%的序列同一性;或者,具有一个或几个(例如,1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)氨基酸的置换(优选保守置换)、添加或缺失,且保留了所述突变的B结构域的功能;并且;
所述变体与所述突变的B结构域在相应于野生型Protein A的B结构域的第1位、第23位、第29位、第36位、第37位和第40位的位置处的氨基酸残基相同。
2.权利要求1所述的分离的多肽,其中,所述突变的B结构域与野生型Protein A的B结构域相比进一步包含:(i)G29A,和/或,(ii)A1V;
优选地,所述突变的B结构域与野生型Protein A的B结构域相比包含:A1V、N23T、G29A、D36V、D37R和Q40V。
3.权利要求1或2所述的分离的多肽,其中,所述野生型Protein A的B结构域具有如SEQID NO:4所示的序列。
4.权利要求1-3任一项所述的分离的多肽,其中,所述突变的B结构域具有如SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列。
5.权利要求1-4任一项所述的分离的多肽,其中,所述分离的多肽在pH 7.0-8.0(例如,pH 7.0-7.6,pH 7.0-7.4)的范围内与IgG Fc结构域特异性结合;和/或,所述分离的多肽在pH 2.7-4.5(例如,pH 2.7-4.0,pH 3.5-4.5,或,pH 3.8-4.3)的范围内与IgG Fc结构域解离。
6.重组蛋白,其包含权利要求1-5任一项所述的分离的多肽;
优选地,所述重组蛋白不包含野生型Protein A的B结构域的氨基酸序列;
优选地,所述重组蛋白不包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列;
优选地,所述重组蛋白包含一个或多个(例如,1个,2个,3个、4个、5个、6个、7个或8个)权利要求1-5任一项所述的分离的多肽;
优选地,各个所述分离的多肽之间任选地通过肽接头连接;例如,所述肽接头具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列;
优选地,所述重组蛋白在其N端或C端进一步包含半胱氨酸;优选地,所述重组蛋白在其C端进一步包含半胱氨酸;优选地,所述半胱氨酸任选地通过接头(例如包含一个或多个甘氨酸(G)的柔性肽,例如GGGG)与所述分离的多肽连接;
优选地,所述重组蛋白包含如SEQ ID NO:2或7所示的氨基酸序列或由其组成;
优选地,所述重组蛋白还连接有另外的多肽,另外的多肽选自标签、酶切位点、信号肽或导肽、可检测的标记,或其任何组合;
优选地,所述重组蛋白在pH 7.0-8.0(例如,pH 7.0-7.6,pH 7.0-7.4)的范围内与IgGFc结构域特异性结合;
优选地,所述重组蛋白在pH 2.7-4.5(例如,pH 2.7-4.0,pH 3.5-4.5,或,pH 3.8-4.3)的范围内与IgG Fc结构域解离。
7.二聚体或多聚体,其包含两个或多个(例如,2个,3个、4个、5个、6个、7个或8个)权利要求1-5任一项所述的分离的多肽;
优选地,所述二聚体或多聚体不包含野生型Protein A的B结构域的氨基酸序列;
优选地,所述二聚体或多聚体不包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列;
优选地,所述二聚体或多聚体包含至少两条多肽链,所述两个或多个分离的多肽存在于至少两条多肽链中;
优选地,所述分离的多肽之间通过接头可逆或不可逆地连接形成二聚体或多聚体;
优选地,所述二聚体或多聚体中至少一条多肽链在其N端或C端进一步包含半胱氨酸;优选地,所述多肽链在其C端进一步包含半胱氨酸;优选地,所述半胱氨酸任选地通过接头(例如包含一个或多个甘氨酸(G)的柔性肽,例如GGGG)与所述分离的多肽连接;
优选地,所述二聚体或多聚体中至少一条多肽链还连接有另外的多肽,另外的多肽选自标签、酶切位点、信号肽或导肽、可检测的标记,或其任何组合;
优选地,所述二聚体或多聚体在pH 7.0-8.0(例如,pH 7.0-7.6,pH 7.0-7.4)的范围内与IgG Fc结构域特异性结合;
优选地,所述二聚体或多聚体在pH 2.7-4.5(例如,pH 2.7-4.0,pH 3.5-4.5,或,pH3.8-4.3)的范围内与IgG Fc结构域解离。
8.偶联物,其包含固相支持物以及与所述固相支持物连接的权利要求1-5任一项所述的分离的多肽,权利要求6所述的重组蛋白,和/或,权利要求7所述的二聚体或多聚体;
优选地,所述分离的多肽、重组蛋白或二聚体或多聚体直接或间接、可逆或不可逆地与固相支持物相连接;
优选地,所述分离的多肽、重组蛋白或二聚体或多聚体通过共价和/或非共价键与所述固相支持物连接;
优选地,所述固相支持物选自琼脂糖微粒、高分子聚合物微球、硅胶微球或磁珠;
优选地,所述分离的多肽、重组蛋白或二聚体或多聚体通过其中的半胱氨酸与所述固相支持物之间形成二硫键连接;
优选地,所述偶联物用于纯化免疫球蛋白;
优选地,所述偶联物用于纯化含IgG Fc结构域的样品;优选地,所述含IgG Fc结构域的样品为IgG抗体或其重链,含IgG Fc结构域的双特异性或多特异性抗体,和/或,含IgG Fc结构域的纳米抗体;
优选地,所述含IgG Fc结构域的样品为含IgG Fc结构域的双特异性或多特异性抗体;
优选地,所述偶联物是亲和层析填料;
优选地,所述偶联物在pH 7.0-8.0(例如,pH 7.0-7.6,pH 7.0-7.4)的范围内与IgG Fc结构域特异性结合;
优选地,所述偶联物在pH 2.7-4.5(例如,pH 2.7-4.0,pH 3.5-4.5,或,pH 3.8-4.3)的范围内与IgG Fc结构域解离。
9.分离的核酸分子,其编码权利要求1-5任一项所述的分离的多肽或权利要求6所述的重组蛋白或权利要求7所述的二聚体或多聚体或其所包含的多肽链。
10.载体,其包含权利要求9所述的核酸分子;优选地,所述载体为克隆载体或表达载体。
11.宿主细胞,其包含权利要求9所述的核酸分子或权利要求10所述的载体。
12.制备权利要求1-5任一项所述的分离的多肽或权利要求6所述的重组蛋白或权利要求7所述的二聚体或多聚体或其所包含的多肽链的方法,其包括,在允许蛋白表达的条件下,培养权利要求11所述的宿主细胞,和从培养的宿主细胞培养物中回收所述分离的多肽或所述重组蛋白或所述二聚体或多聚体或其所包含的多肽链。
13.制备权利要求8所述的偶联物的方法,其包括将权利要求1-5任一项所述的分离的多肽,权利要求6所述的重组蛋白,和/或,权利要求7所述的二聚体或多聚体与固相支持物形成连接的步骤;
优选地,所述方法包括:将所述分离的多肽,重组蛋白,和/或,二聚体或多聚体与所述固相支持物相接触,从而使所述分离的多肽,重组蛋白,和/或,二聚体或多聚体与所述固相支持物之间形成连接;
优选地,所述连接是直接的或间接的,可逆或不可逆的;
优选地,所述连接是共价连接或非共价连接;
优选地,所述固相支持物选自琼脂糖微粒、高分子聚合物微球、硅胶微球或磁珠;
优选地,所述连接包含二硫键。
14.权利要求1-5任一项所述的分离的多肽,或权利要求6所述的重组蛋白,或权利要求7所述的二聚体或多聚体,或权利要求8所述的偶联物用于制备纯化试剂的用途,所述纯化试剂用于纯化免疫球蛋白;
优选地,所述纯化试剂用于纯化含IgG Fc结构域的样品;
优选地,所述含IgG Fc结构域的样品为IgG抗体或其重链,含IgG Fc结构域的双特异性或多特异性抗体,和/或,含IgG Fc结构域的纳米抗体;
优选地,所述含IgG Fc结构域的样品为含IgG Fc结构域的双特异性或多特异性抗体。
15.纯化免疫球蛋白的方法,其包括使用权利要求8所述的偶联物;
优选地,所述纯化是亲和层析;优选地,所述亲和层析包括使用权利要求8所述的偶联物作为固定相;
优选地,所述方法用于纯化含IgG Fc结构域的样品;
优选地,所述方法包含以下步骤:
(1)在第一溶剂中,使所述含IgG Fc结构域的样品与所述偶联物结合形成复合物;
(2)在第二溶剂中,使所述复合物解离;和,
(3)收集含有所述含IgG Fc结构域的样品的解离产物;
优选地,所述第一溶剂的pH为7.0-8.0;例如,所述第一溶剂的pH为7.0-7.6或7.0-7.4;
优选地,所述第二溶剂的pH为2.7-4.5;例如,所述第二溶剂的pH为2.7-4.0、3.5-4.5或3.8-4.3。
16.试剂盒,其包含权利要求1-5任一项所述的分离的多肽,或权利要求6所述的重组蛋白,或权利要求7所述的二聚体或多聚体,或权利要求8所述的偶联物;
优选地,所述试剂盒进一步包含蛋白纯化所用试剂(例如,如权利要求15中所定义的第一溶剂,和/或,如权利要求15中所定义的第二溶剂);优选地,所述纯化是亲和层析;
优选地,所述试剂盒用于纯化免疫球蛋白;
优选地,所述试剂盒用于纯化含IgG Fc结构域的样品;
优选地,所述含IgG Fc结构域的样品为IgG抗体或其重链,含IgG Fc结构域的双特异性或多特异性抗体,和/或,含IgG Fc结构域的纳米抗体;
优选地,所述含IgG Fc结构域的样品为含IgG Fc结构域的双特异性或多特异性抗体。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211110150.9A CN117700501A (zh) | 2022-09-13 | 2022-09-13 | 免疫球蛋白结合蛋白及其应用 |
PCT/CN2023/118531 WO2024055988A1 (zh) | 2022-09-13 | 2023-09-13 | 免疫球蛋白结合蛋白及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211110150.9A CN117700501A (zh) | 2022-09-13 | 2022-09-13 | 免疫球蛋白结合蛋白及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117700501A true CN117700501A (zh) | 2024-03-15 |
Family
ID=90161213
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211110150.9A Pending CN117700501A (zh) | 2022-09-13 | 2022-09-13 | 免疫球蛋白结合蛋白及其应用 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117700501A (zh) |
WO (1) | WO2024055988A1 (zh) |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE0200943D0 (sv) * | 2002-03-25 | 2002-03-25 | Amersham Biosciences Ab | Mutant protein |
BR112013000097B1 (pt) * | 2010-07-02 | 2022-02-01 | The University Of Chicago | Polipeptídeo imunogênico isolado, composição imunogênica e seu uso |
JP5963248B2 (ja) * | 2012-06-14 | 2016-08-03 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 抗体精製用担体並びにその製造方法及びその用途 |
US9896486B2 (en) * | 2013-07-10 | 2018-02-20 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Mutated immunoglobulin-binding polypeptides |
US11566082B2 (en) * | 2014-11-17 | 2023-01-31 | Cytiva Bioprocess R&D Ab | Mutated immunoglobulin-binding polypeptides |
CA2991812C (en) * | 2015-07-16 | 2024-02-13 | Navigo Proteins Gmbh | Immunoglobulin-binding proteins and their use in affinity purification |
CN109219613B (zh) * | 2016-05-11 | 2022-09-23 | 思拓凡生物工艺研发有限公司 | 分离方法 |
CN110799521A (zh) * | 2017-02-15 | 2020-02-14 | 拜奥普罗塞亚科技有限责任公司 | 具有温和洗脱pH的亲和色谱配体 |
-
2022
- 2022-09-13 CN CN202211110150.9A patent/CN117700501A/zh active Pending
-
2023
- 2023-09-13 WO PCT/CN2023/118531 patent/WO2024055988A1/zh unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2024055988A1 (zh) | 2024-03-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20210388036A1 (en) | Caustic stable chromatography ligands | |
JP5229888B2 (ja) | 弱酸性域での易解離性を向上したプロテインa変異型タンパク質及び抗体捕捉剤 | |
EP2495254B1 (en) | Novel immunoglobulin-binding proteins with improved specificity | |
JP5812303B2 (ja) | 酸性域での親和性が低下したプロテインa変異型タンパク質及び抗体捕捉剤 | |
US20150080558A1 (en) | Chromatography matrices including novel staphylococcus aureus protein a based ligands | |
US20100168395A1 (en) | Novel polypeptide, an affinity chromatography material, and a method for separating and/or purifying immunoglobulin | |
JP5236311B2 (ja) | IgG−Fab断片抗体結合性ペプチド | |
WO2014021240A1 (ja) | プロテインgの細胞膜外ドメイン変異体のタンデム型多量体から成るタンパク質を含む捕捉剤 | |
WO2013018880A1 (ja) | プロテインgの細胞膜外ドメイン変異体のタンデム型多量体から成る新規な改変型タンパク質 | |
WO2015050153A1 (ja) | 免疫グロブリンG(IgG)のFc部分を有するタンパク質に対するアフィニティを有する複数のドメイン間をリンカーで結合させて成るタンパク質 | |
JP2009297018A (ja) | 弱酸性域での解離特性を改良した抗体結合性タンパク質及び抗体捕捉剤 | |
WO2024055988A1 (zh) | 免疫球蛋白结合蛋白及其应用 | |
JP2015019615A (ja) | プロテインgの細胞膜外ドメイン変異体の新規な改変型タンパク質 | |
JP4481260B2 (ja) | 抗体結合性ペプチド | |
EP2831092A1 (en) | Binding proteins to the constant region of immunoglobulin g | |
WO2015093507A1 (ja) | プロテインgの細胞膜外ドメインの新規な改変型タンパク質 | |
US10954275B1 (en) | Designed proteins for pH switchable antibody purification | |
JP2015003872A (ja) | マウスIgGの精製方法 | |
EP4114847A1 (en) | Novel immunoglobulin binding polypeptides |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication |