ES2325362T3 - Una proteina mutada de union a inmunoglobulina. - Google Patents
Una proteina mutada de union a inmunoglobulina. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2325362T3 ES2325362T3 ES03713152T ES03713152T ES2325362T3 ES 2325362 T3 ES2325362 T3 ES 2325362T3 ES 03713152 T ES03713152 T ES 03713152T ES 03713152 T ES03713152 T ES 03713152T ES 2325362 T3 ES2325362 T3 ES 2325362T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- protein
- immunoglobulin
- matrix
- binding
- baselineskip
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
- B01D15/3804—Affinity chromatography
- B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
- B01J20/24—Naturally occurring macromolecular compounds, e.g. humic acids or their derivatives
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
- B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
- B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
- B01J20/289—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers bonded via a spacer
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
- B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
- B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
- C07K16/065—Purification, fragmentation
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
- B01J2220/40—Aspects relating to the composition of sorbent or filter aid materials
- B01J2220/44—Materials comprising a mixture of organic materials
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
- B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
- B01J2220/52—Sorbents specially adapted for preparative chromatography
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
Una proteína de unión a inmunoglobulina capaz de unirse a regiones de una molécula de inmunoglobulina distintas de las regiones determinantes de complementariedad (CDR), donde dicha proteína comprende dos o más unidades que se repiten como se define por SEQ ID NO: 1 o 2, en la que el resto de aminoácido en posición 23 en cada unidad es una treonina.
Description
Una proteína mutada de unión a
inmunoglobulina.
La presente invención se refiere al campo de
proteínas mutantes, y más específicamente a una proteína mutante
que exhibe estabilidad mejorada en comparación con la molécula
pariente así como a un método de producción de una proteína mutante
según la invención. La invención también se refiere a una matriz de
separación por afinidad, donde una proteína según la invención es
usada como un ligando de afinidad.
Un gran número de aplicaciones en la industria
biotecnológica y farmacéutica necesitan atención para comprender la
separación definitiva de contaminantes. Dichos contaminantes pueden,
por ejemplo, ser moléculas no eluidas adsorbidas en la fase
estacionaria o matriz en un procedimiento cromatográfico, tal como
moléculas o microorganismos no deseados, que incluyen por ejemplo,
proteínas, carbohidratos, lípidos, bacterias y virus. La separación
de tales contaminantes a partir de la matriz normalmente es llevada
a cabo tras una primera elusión del producto deseado con el fin de
regenerar la matriz antes de su uso posterior. Tal separación
normalmente implica un procedimiento conocido como limpieza en el
sitio (LES), donde se usan agentes capaces de eluir contaminantes
de la fase estacionaria. En el presente, el agente de limpieza y
sanitario más extensamente usado es NaOH, y la concentración del
mismo puede estar en el intervalo de 0,1 hasta por ejemplo 1 M,
dependiendo del grado y la naturaleza de la contaminación. NaOH es
conocido por ser un agente LES eficaz que logra la reducción
multirregistro de contaminantes, tales como microbios, proteínas,
lípidos y ácido nucleicos. Otra ventaja del NaOH es que se elimina
fácilmente sin ningún otro tratamiento. Sin embargo, esta estrategia
está asociada a la exposición de la matriz a pH por encima de 13.
Para muchas matrices de cromatografía por afinidad que contienen
ligandos de afinidad proteicos, tales como medio ambiente alcalino,
es una condición muy severa y, posteriormente, da como resultado
capacidades disminuidas a causa de la inestabilidad del ligando
implicado en el alto pH.
Así, se ha enfocado una investigación más
extensa sobre el desarrollo de ligandos proteicos manipulados que
exhiben una capacidad mejorada para resistir valores de pH alcalino.
Por ejemplo, Gülich et al (Susane Gülich, Martín Linhult,
Per-Anke Nygren, Mathias Uhlén, Sophia Hober,
Journal of Biotechnology 80 (2000), 169-17:
Stability towards alkaline conditions can be engineered into a
protein ligand) sugirieron la manipulación de proteínas para
mejorar las propiedades de estabilidad de un dominio de unión a
albúmina (DUA) de Staphylococcus en medios ambientes alcalinos.
Anteriormente, se mostró que la modificación estructural, tal como
desaminación y escisión de la estructura peptídica, de restos de
asparagina y glutamina en condiciones alcalinas es la razón
principal para la pérdida de actividad en el tratamiento en
soluciones alcalinas, y que la asparagina es el más sensible de los
dos (Geiger, T., y S. Clarke. 1987. Deamination, Isomerization, and
Racemization al Asparaginyl and Aspartyl Residues in Peptides. J.
Biol. Chem. 262:785-794). También se conoce que el
ritmo de desaminación es altamente específico y dependiente de la
conformación (Kosky, A.A., U.O. Razzaq, M.J. Treuheit, y D.N.
Brems. 1999. The effect of alpha-helix on the
stability of Asn residues: deamination rates in peptides of varing
helicity. Protein Sci. 8:2519-2523: Kosiakoff, A.A.
1988. Tertiary structure is a principal determinant to protein
deamidation. Science. 240:191-194; y Lura, R., y V.
Schirch. 1988. Role of peptide conformation in the rate and
mechanism of deamidation of asparaginyl residues. Biochemistry.
27:7671-7677), y los semi-tiempos
de desaminación más cortos han sido asociados con las secuencias
-asparagina-glicina- y
-asparagina-serina. Por consiguiente, Gülich et
al. crearon un mutante de DUA, donde los cuatro restos de
asparagina del DUA natural han sido sustituidos por leucina (un
resto), asparatato (dos restos) y lisina (un resto). Además, Gülich
et al. describen que su mutante exhibe un comportamiento de
unión a proteína diana similar al de la proteína natural, y que las
columnas de afinidad que contienen el ligando manipulado muestran
capacidades de unión superiores tras exposición repetida a
condiciones alcalinas que las columnas preparadas usando el ligando
pariente no manipulado. Así, se concluyó en la presente memoria que
los cuatro restos de asparagina pueden ser sustituidos sin ningún
efecto significativo sobre la estructura y la función.
Así, los estudios llevados a cabo por Gülich
et al se llevaron a cabo sobre el dominio de unión a albúmina
de Streptococcus. Sin embargo, la cromatografía por afinidad
también se usa para la purificación de otras moléculas, tales como
inmunoglobulinas, por ejemplo para aplicaciones farmacéuticas. Una
clase particularmente interesante de reactivos de afinidad son las
proteínas capaces de unirse de forma específica a partes invariables
de una molécula de anticuerpo, tal interacción siendo independiente
de la especificidad de unión al antígeno del anticuerpo. Tales
reactivos pueden ser ampliamente usados para la recuperación por
cromatografía por afinidad de inmunoglobulinas de diferentes
muestras tales como, pero no limitadas a, preparaciones de suero o
plasma o cultivos celulares derivados de conjuntos de alimentación.
Un ejemplo de tal proteína es la proteína A de Staphylococcus, que
contiene dominios capaces de unirse a las porciones Fc y Fab de
inmunoglobulinas IgG de diferentes especies.
Los reactivos basados en la proteína A de
Staphylococcus (SpA), debido a su alta afinidad y selectividad, han
encontrado un amplio uso en el campo de la biotecnología, por
ejemplo, en cromatografía por afinidad para capturar y purificar
anticuerpos así como para su detección. En el presente, un medio de
afinidad basado en SpA probablemente es el medio de afinidad más
ampliamente usado para aislar anticuerpos monoclonales y sus
fragmentos a partir de diferentes muestras, incluyendo conjuntos de
alimentación de cultivos celulares. Por consiguiente, están
disponibles comercialmente varias matrices que comprenden ligandos
de proteína A, por ejemplo, en forma de proteína A nativa (por
ejemplo Proteína A Sepharose^{TM}, Amersham Biosciences, Uppsala,
Suecia) y también comprendidas por proteína A recombinante (por
ejemplo, rProteína A Sepharose^{TM}, Amersham Biosciences,
Uppsala, Suecia). Más específicamente, la manipulación genética
llevada a cabo en dicha proteína A recombinante comercial es
realizada para facilitar la unión de la misma al soporte.
Por consiguiente, existe la necesidad en este
campo de obtener ligandos de proteínas capaces de unir
inmunoglobulinas, especialmente vía los fragmentos Fc de las
mismas, que también son tolerantes a uno o más procedimientos de
limpieza usando agentes alcalinos.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un ligando proteico mutado de unión a inmunoglobulina
que exhibe una estabilidad mejorada a valores de pH aumentados, y
por consiguiente, una tolerancia mejorada a la limpieza bajo
condiciones alcalinas, en comparación a la molécula pariente.
Otro objeto de la invención es proporcionar tal
ligando proteico, que se une específicamente al fragmento Fc de
inmunoglobulinas, tales como IgG, IgA y/o IgM.
Todavía otro objeto de la invención es
proporcionar un ligando proteico como se describe más arriba, que
también exhibe una afinidad que se conserva durante un periodo de
tiempo más largo en condiciones alcalinas que aquella molécula
pariente.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar una matriz de separación por afinidad, que comprende
ligandos proteicos mutantes capaces de unir inmunoglobulinas, tales
como IgG, IgA y/o IgM, preferiblemente vía sus fragmentos Fc, cuyos
ligandos exhiben una tolerancia mejorada a la limpieza bajo
condiciones alcalinas, en comparación con el ligando de la molécula
pariente.
Uno o más de los objetos arriba definidos pueden
lograrse como se describe en las reivindicaciones posteriores.
La Figura 1 muestra alineamientos de aminoácidos
de los cinco dominios homólogos (E, D, A, B y C) de SpA.
La Figura 2 (a) y (b) ilustra los resultados
obtenidos tras tratamiento alcalino (limpieza en el lugar) de
proteínas mutantes según la invención en comparación con la proteína
Z desestabilizada.
La Figura 3 muestra el gen que codifica la
Z(N23T/N3AN6D)-Cys tras inserción dentro de
un vector como se describe en el ejemplo 4(a).
La Figura 4 muestra un mapa plasmídico del
plámido pAY91, como se describe en el ejemplo 4(a).
La Figura 5 muestra el gen que codifica la
Z(N23T/N3A/N6D) tras la inserción dentro de un vector como se
describe en el ejemplo 4(b).
La Figura 6 muestra un ejemplo de mapa
plasmídico para el plásmido pAY100 como se describe en el
ejemplo
5.
5.
La figura 7 muestra el adaptador para introducir
un sitio KpnI dentro de un vector con promotor SPA y
secuencia señal según el ejemplo 6.
La Figura 8 muestra el plásmido pAY104, que
contiene el promotor SPA y la secuencia señal a ser usados para la
introducción de un adaptador que contiene un sitio KpnI, tal
como se describe en el ejemplo 6.
La Figura 9 muestra el plásmido resultante,
pAY128, tras la inserción del adaptador según el ejemplo 6.
La Figura 10 muestra el casete de clonación
construido del ejemplo 6, donde el adaptador original está
subrayado.
La Figura 11 muestra el plásmido pAY114 tras la
inserción de Z(N23T/N3A/N6D)-Cys- tetrámero
como se describe en el ejemplo 6.
La Figura 12 muestra el casete de clonación
construido del ejemplo 7, donde el adaptador original está
subrayado.
La Figura 13 muestra el plásmido resultante,
pAY129, tras la inserción del adaptador según el ejemplo 7.
La Figura 14 muestra el plásmido pAY125 tras la
inserción de Z(N23T/N3A/N6D)-Cys- tetrámero
como se describe en el ejemplo 7.
\newpage
La Figura 15 es una cromatografía obtenida de
una separación de IgG humana (hIgG), como se describe en el ejemplo
8.
La Figura 16 muestra gráficos que representan la
capacidad de unión dinámica restante de las matrices según el
ejemplo 8.
El término "proteína" se usa en la presente
memoria para describir proteínas, así como fragmentos de las mismas.
Así, cualquier cadena de aminoácidos que exhibe una estructura
tridimensional está incluida en el término "proteína", y se
abarcan fragmentos de proteína.
El término "variante funcional" de una
proteína significa en la presente memoria una proteína variante,
donde la función, en relación a la invención definida como afinidad
y estabilidad, están esencialmente conservadas. Así, uno o más
aminoácidos que no son relevantes para dicha función pueden haber
sido cambiados.
El término "molécula pariente" se usa en la
presente memoria para la proteína correspondiente en la forma antes
de que se haya introducido una mutación según la invención.
El término "estabilidad estructural" se
refiere a la integridad de la forma tridimensional de una molécula,
mientras que "estabilidad química" se refiere a la capacidad
para resistir a la degradación química.
El término "proteína de unión al fragmento
Fc" significa que la proteína es capaz de unirse al fragmento Fc
de una inmunoglobulina. Sin embargo, no se excluye que una proteína
de unión al fragmento Fc también pueda unir otras regiones, tales
como regiones Fab de inmunoglobulinas.
En la presente memoria, si no se refiere a sus
nombres completos, los aminoácidos son denominados con los símbolos
convencionales de una letra.
Las mutaciones se definen en la presente memoria
por el número de la posición cambiada, precedido del aminoácido
salvaje o no mutado y seguido del aminoácido mutado. Así, por
ejemplo, la mutación de una asparagina en posición 23 con una
treonina se denomina N23T.
En un aspecto, la presente invención se refiere
a una proteína de unión a inmunoglobulina capaz de unirse a otras
regiones de la molécula de inmunoglobulina distintas de las regiones
de determinación de la complementariedad (CDR), dicha proteína
comprende dos o más unidades que se repiten de la proteína 2 en la
cual la posición 23 está definida como SEQ ID NO:1 o treonina. Así,
al menos un resto de asparagina de una proteína de unión a
inmunoglobulina pariente ha sido mutada a un aminoácido distinto de
glutamina, tal mutación confiere una estabilidad química aumentada
en valores de pH alcalinos en comparación con la molécula pariente.
La estabilidad aumentada significa que la afinidad inicial de la
proteína mutada para la inmunoglobulina está esencialmente
conservada durante un periodo de tiempo más largo, como se discutirá
más abajo.
La afinidad conservada de la proteína diana
lograda según la invención, se debe en parte a una conformación
espacial conservada de la proteína mutante. La afinidad de proteínas
mutadas a inmunoglobulinas puede, por ejemplo, ser ensayada por el
experto en la materia usando tecnología de biosensores usando, por
ejemplo, un sistema Biacore^{TM} 2000 clásico (Biacore AB,
Uppsala, Suecia), como se ilustrará en la parte experimental de más
abajo. En este contexto, se entiende del término
"esencialmente" conservado que la proteína mutada exhibe una
afinidad por inmunoglobulina que es del mismo orden de magnitud que
la de la molécula pariente. Por consiguiente, en una fase inicial,
la capacidad de unión de la proteína mutada es comparable con la de
la proteína pariente. Sin embargo, debido a la estabilidad química
de la proteína mutada discutida más abajo, que está conservada en
el tiempo, su capacidad de unión disminuirá más lentamente que la de
la molécula pariente en un medio ambiente alcalino. El medio
ambiente puede definirse como alcalino, que significa un valor
aumentado de pH, por ejemplo, por encima de aproximadamente 10, tal
como hasta aproximadamente 13 o 14, es decir, de
10-13 o 10-14, en general
denominado condiciones alcalinas. Alternativamente, las condiciones
pueden estar definidas por la concentración de NaOH, que puede se
de hasta aproximadamente 1,0 M, tal como 0,7 M o específicamente
aproximadamente 0,5 M, por consiguiente dentro de un intervalo
de
7-1,0 M.
7-1,0 M.
La estabilidad química aumentada de la proteína
mutada según la invención puede ser confirmada fácilmente por el
experto en la materia en este campo, por ejemplo, por tratamiento de
rutina con NaOH a una concentración de 0,5 M, tal como se
describirá en la parte experimental de más abajo. En este contexto,
se entiende que similar a lo que se dice más arriba, una
estabilidad "aumentada" significa que la estabilidad inicial
está conservada durante un periodo de tiempo más largo que la que
se logra por la molécula pariente. Aunque se han descrito
mutaciones similares para un dominio de unión de albúmina de
Streptococcus (Gülich et al., véase más arriba), se conoce
bien que el ritmo de desaminación implicado en la susceptibilidad
proteica a la degradación en medio ambiente alcalino es altamente
dependiente de la secuencia y de la conformación. Mientras que la
secuencia de aminoácidos de DUA no comprende similitud de secuencia
aminoacídica con las proteínas de unión a inmunoglobulina tales
como los dominios individuales de la proteína A de Staphylococcus,
no parece, por las enseñanzas de Gülich et al, que se puedan
aplicar también a las proteínas de unión a inmunoglobulina. Sin
embargo, la presente invención muestra por primera vez que la
mutación de uno o más restos de asparagina de una proteína de unión
a inmunoglobulina proporciona de forma sorprendente una estabilidad
química aumentada y por ello, un ritmo de degradación disminuido en
medios ambientes donde el pH está por encima de aproximadamente 10,
tal como hasta aproximadamente
13 o 14.
13 o 14.
Por ello, la presente invención proporciona una
proteína mutada, que es útil por ejemplo como proteína ligando en
cromatografía por afinidad para la adsorción selectiva de
inmunoglobulinas, tales como IgG, IgA y/o IgM, preferiblemente IgG,
de especies de mamíferos, tales como un ser humano. El propósito de
la adsorción puede ser tanto producir un producto purificado, tal
como una fracción de inmunoglobulina pura o un líquido a partir del
cual la inmunoglobulina ha sido separada, como detectar la presencia
de inmunoglobulina en una muestra. El ligando según la invención
exhibe una estabilidad química suficiente para resistir la limpieza
alcalina convencional durante un periodo de tiempo prolongado, que
hace del ligando un candidato atractivo para la operación eficaz a
gran escala, donde la regeneración de la columna es una
necesidad.
Por consiguiente, en la proteína según la
invención, uno o más restos de asparagina (N) han sido mutados a
aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en glicina (G),
alanina (A), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), serina (S),
treonina (T), cisteína (C), metionina (M), fenilalanina (F),
tirosina (Y), triptófano (W), ácido glutámico (E), arginina (R),
histidina (H), lisina (K) o prolina (P), o cualquier aminoácido
modificado que no es susceptible a desaminación o isomerización no
deseada. Alternativamente, uno o más restos de asparagina (N) han
sido mutados a glutamina (Q).
La proteína de unión a inmunoglobulina puede ser
cualquier proteína con una capacidad de unión a inmunoglobulina
natural, tal como proteína A de Staphylococcus (SpA), o proteína G
de Streptococcus (SpG). Para una revisión de otras proteínas, véase
por ejemplo, Krovall, G., Jonson, K. Receptins: a novel term for an
expanding spectrum of natural and engineered microbial proteins
with binding properties for mammalian proteins, J. Mol. Recognit.
1999 Jan-Feb; 12(1):38-44.
Revisión.
En una realización, la presente invención es una
proteína mutada, que comprende al menos la región de unión de una
proteína de unión a inmunoglobulina y donde al menos está presente
una mutación de asparagina dentro de dicha región. Por
consiguiente, en esta realización, una proteína mutada según la
invención comprende al menos aproximadamente 75%, tal como al menos
aproximadamente 80% o preferiblemente al menos aproximadamente 95%,
de la secuencia tal como se defina en SEQ ID NO: 1 o 2, siempre que
la mutación de asparagina no esté en posición 21.
En la presente memoria, la SEQ ID NO: 1 define
una secuencia aminoacídica del dominio B de SpA y la SEQ ID NO:
2defina una proteína conocida como proteína Z.
La proteína Z es una construcción sintética
derivada del dominio B de SpA, donde la glicina en posición 29 ha
sido intercambiada por alanina, y esto se ha descrito en la
literatura, véase por ejemplo Sthal et al, 1999. Affinity
fusions in biotechnology; focus on protein A and protein B, en la
Enciclopedia de Tecnología de Bioprocesos: Fermentación,
Biocatálisis y Bioseparación. M.C. Fleckinger y S.W. Drew, editores.
John Wiley e Hijos Inc., Nueva York, 8-22. Además,
la proteína Z ha sido usada como ligando en cromatografía de
afinidad. Sin embargo, aunque la proteína Z exhibe una estabilidad
química mejorada a ciertos compuestos químicos distintos de NaOH en
comparación con el dominio B de SpA, todavía no es tan estable en
condiciones de valores de pH aumentados, necesarios para soportar
las muchas etapas CIP de regeneración deseadas en una planta
industrial económica.
En una realización, la proteína mutante arriba
descrita está comprendida por una secuencia de aminoácidos definida
en SEQ ID NO: 1 o 2, o es una variante funcional de la misma. El
término "variante funcional" como se usa en este contexto
incluye cualquier secuencia similar, que comprende una o más
variaciones adicionales en posiciones de aminoácidos que no tienen
influencia en la afinidad de la proteína mutante con las
inmunoglobulinas o en su estabilidad química mejorada en medios
ambientes de valores de pH aumentados.
En una realización ventajosa, la(s)
presente(s) mutacione(s) están seleccionadas del grupo
que consiste en N23T; N23T y N43E; N28A; N6A; N11S; N11S y N23T; y
N6A y N23T; y donde la molécula pariente comprende la secuencia
definida por SEQ ID NO: 2. Tal como se menciona más arriba, con el
fin de conseguir una proteína mutante útil como ligando con alta
capacidad de afinidad durante un periodo de tiempo prolongado en
condiciones alcalinas, se evita la mutación del resto de asparagina
en posición 21. En una realización, el resto de asparagina en
posición 3 no está mutado.
En la realización más ventajosa, en la presente
proteína, se ha mutado un resto de asparagina localizado entre un
resto de leucina y un resto de glutamina, por ejemplo a un resto de
treonina. Así, en una realización, el resto de asparagina en
posición 23 de la secuencia definida en SEQ ID NO: 2 ha sido mutado,
por ejemplo a un resto de treonina. En una realización específica,
el resto de asparagina en posición 43 de la secuencia definida por
SEQ ID NO: 2 también ha sido mutado, por ejemplo a un ácido
glutámico. En la realización donde el aminoácido número 43 ha sido
mutado, parece ser combinado de forma más ventajosa con al menos una
mutación adicional, tal como N23T.
El descubrimiento según la invención de que
varios restos de asparagina del dominio B de SpA y la proteína Z
pueden ser atribuidos a distintas contribuciones a las propiedades
de estabilidad y afinidad de la proteína mutada fue un poco
inesperado, especialmente en vista de las enseñanzas arriba
discutidas de Gülich et al donde se concluyó que todos los
restos de asparagina de DUA pueden ser mutados sin ninguna
discriminación interna.
Así, la invención abarca las proteínas mutantes
monoméricas arriba discutidas. Sin embargo, dichos monómeros de
proteínas pueden ser combinados a proteínas multiméricas, tales como
dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros, etc. Por consiguiente,
otro aspecto de la presente invención es un multímero comprendido
por al menos una de las proteínas mutadas según la invención junto
con una o más unidades adicionales, preferiblemente también
proteínas mutantes según la invención. Así, la presente invención
es, por ejemplo, un dímero comprendido por dos unidades que se
repiten.
En una realización, el multímero según la
invención comprende unidades monoméricas unidas por un despliegue
de aminoácidos, preferiblemente en el intervalo de 0 a 15
aminoácidos, tales como 5-10. La naturaleza de tal
unión preferiblemente no debería desestabilizar la conformación
espacial de las unidades proteicas. Además, dicha unión
preferiblemente también debería ser suficientemente estable en
medios ambientes alcalinos para no afectar a las propiedades de las
unidades proteicas mutadas.
En la mejor realización del presente, el
multímero es un tetrámero de proteína Z que comprende la mutación
N23T,donde la longitud de las unidades de enlace es
5-10 aminoácidos. En una realización, el presente
multímero comprende la secuencia
VDAKFN-Z(N23T)-QAPKVDAKFN-Z(N23T)QAPKC.
En otra realización, el multímero comprende la secuencia
VDAKFD-Z(N23T)-QAPKVDAKFD-Z(N23T)ZQAPKC.
En una realización específica, el presente
multímero también comprende uno o más de los dominios E, D, A, B y
C de la proteína A de Staphylococcus. En esta realización, se
prefiere que los restos de asparagina localizados en regiones de
bucle hayan sido mutados a aminoácidos más estables a la hidrólisis.
En una realización ventajosa por razones de estabilidad
estructural, el resto de glicina en posición 29 de SEQ ID NO: 1
también ha sido mutado, preferiblemente a un resto de alanina.
También, el ventajoso para la estabilidad estructural evitar la
mutación del resto de asparagina en posición 52, ya que se ha
encontrado que contribuye al contenido del a estructura secundaria
en \alpha hélice de la molécula de proteína A.
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere a un ácido nucleico que codifica una proteína mutante o
multímero como se describe más arriba. Por consiguiente, la
invención abarca una secuencia de ADN que puede ser usada en la
producción de proteína mutante por expresión de la misma en un
hospedador recombinante según los métodos biotecnológicos bien
establecidos. Por consiguiente, otro aspecto de la presente
invención es un sistema de expresión, que permite la producción de
una proteína mutante como se describe más arriba. Convenientemente
se pueden usar hospedadores bacterianos, por ejemplo, tal como se
describen la parte experimental más abajo. En una realización
alternativa, la presente invención es una línea celular que ha sido
manipulada genéticamente para expresar una proteína mutante según
la invención. Para métodos con este fin, véase por ejemplo Sambrook
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed), vols.
1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989).
Naturalmente, una vez ha sido establecida la
secuencia deseada, la proteína mutante según la invención
alternativamente puede ser producida por métodos sintéticos.
Por consiguiente, la presente invención también
incluye un método biotecnológico o sintético para producir una
proteína o multímero mutante según la invención.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a una matriz para la separación por afinidad, tal matriz
comprende ligandos que comprenden una proteína de unión a
inmunoglobulinas acopladas a un soporte sólido, en cuya proteína,
al menos un resto de asparagina ha sido mutado a un aminoácido
distinto de glutamina. La presente matriz, cuando se compara con
una matriz comprendida por la molécula pariente como ligando, exhibe
una capacidad de unión aumentada durante dos o más separaciones con
limpieza alcalina intermitente. El ligando de proteína mutado es
preferiblemente una proteína de unión al fragmente Fc, y puede ser
usada para unión selectiva de IgG, IgA y/o IgM, preferiblemente
IgG.
La matriz según la invención puede comprender la
proteína mutante como se describe más arriba en cualquier
realización de la misma como ligando. En la realización más
preferida, los ligandos presentes sobre el soporte sólido
comprenden un multímero como se describe más arriba.
El soporte sólido de la matriz según la
invención puede ser de cualquier tipo adecuado bien conocido. Una
matriz de separación por afinidad convencional normalmente es de
naturaleza orgánica y está basada en polímeros que exponen una
superficie hidrofílica al medio acuoso usado, es decir, expone
grupos hidroxi (-OH), carboxi (-COOH), carboxamido (-CONH_{2},
posiblemente en forma N-sustituida), amino
(-NH_{2}, posiblemente en forma sustituida), oligo- o
polietilenoxi en sus superficies externas y, si están presentes
también en superficies internas. En una realización, los polímeros
pueden, por ejemplo, estar basados en polisacáridos, tales como
dextrano, almidón, celulosa, pululano, agarosa, etc, que
ventajosamente han sido reticulados, por ejemplo con bisepóxidos,
epihalohidrinas, hidrocarburos inferiores
1,2,3-hihalo sustituidos, para proporcionar una
adecuada porosidad y rigidez. En la realización más preferida, el
soporte sólido es perlas de agarosa porosas. Los soportes usados en
la presente invención pueden ser preparados fácilmente según métodos
clásicos, tales como gelificación en suspensión inversa (S Hjertén:
Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964).
Alternativamente, las matrices base son productos comercialmente
disponibles, tales como Sepharose^{TM} FF (Amersham Biosciences,
Uppsala, Suecia). En una realización, que es especialmente
ventajosa para separaciones a gran escala, el soporte ha sido
adaptado para aumentar su rigidez, y así hacer la matriz más
adecuada para ritmos de flujo rápidos.
Alternativamente, el soporte sólido está basado
en polímeros sintéticos, tales como alcohol de polivinilo,
acrilatos de polihidroxialquilo, metacrilatos de polihidroxialquilo,
poliacrilatos, polimetacrilamidas, etc. En el caso de polímeros
hidrofóbicos, tales matrices basadas en bencenos divinil y monovinil
sustituidos, la superficie de la matriz normalmente está
hidrofilizada para exponer grupos hidrofílicos como se define más
arriba en un entorno de líquido acuoso. Tales polímeros son
producidos fácilmente según métodos clásicos, véase por ejemplo
"Styrene based polymer supports developed by suspensión
polymerization" (R Arshady: Chimica e L'industria 70(9),
70-75 (1988)). Alternativamente, se usa un producto
disponible comercialmente, tal como Source^{TM} (Amersham
Biosciences, Uppsala, Suecia).
En otra alternativa, el soporte sólido según la
invención comprende un soporte de naturaleza inorgánica, por
ejemplo, sílice, óxido de zirconio, etc.
Todavía en otra realización, el soporte sólido
está en otra forma tal como una superficie, un chip, capilares, o
un filtro.
Como consideración, la forma de la matriz según
la invención, en una realización la matriz está en forma de
monolito poroso. En una realización alternativa, la matriz está en
forma de perla o partícula que puede ser porosa o no porosa. Las
matrices en forma de perla o partícula pueden ser usadas como una
perla llena o en forma suspendida. Las formas suspendidas incluyen
aquellas conocidas como perlas expandidas y suspensiones puras, en
las que las partículas o perlas están libres para moverse. En el
caso de monolitos, perlas llenas o perlas expandidas, al
procedimiento de separación comúnmente le sigue cromatografía
convencional con un gradiente de concentración. En el caso de
suspensiones puras, se usará el tratamiento a lo largo de lotes.
El ligando puede estar unido al soporte vía
técnicas de acoplamiento convencionales usando, por ejemplo, grupos
amino y/o carboxi presentes en el ligando. Bisepóxidos,
epiclorohidrina, CNBr, N-hidroxisuccinimida (NHS),
etc son reactivos de acoplamiento bien conocidos. Entre el soporte y
el ligando, se puede introducir una molécula llamada espaciador,
que mejorará la disponibilidad del ligando y facilitará el
acoplamiento químico del ligando al soporte. Alternativamente, el
ligando puede estar unido al soporte por enlaces no covalentes,
tales como adsorción física o adsorción bioespecífica.
En una realización ventajosa, el presente
ligando ha sido acoplado al soporte por enlaces tioéter. Métodos
para llevar a cabo tal acoplamiento son bien conocidos en este campo
y llevados a cabo fácilmente por el experto en la materia en este
campo usando técnicas y equipos clásicos. En una realización
ventajosa, el ligando está proporcionado primeramente con un resto
de cisteína terminal para su uso posterior en el acoplamiento. El
experto en la materia en este campo también lleva a cabo fácilmente
etapas apropiadas de purificación.
Como se menciona más arriba, la afinidad a
inmunoglobulina, es decir, propiedades de unión del presente
ligando, y por ello, la capacidad de la matriz, no está
esencialmente cambiada en el tiempo por el tratamiento con un
agente alcalino. Convencionalmente, para un tratamiento de limpieza
en el sitio de una matriz de separación por afinidad, el agente
alcalino usado es NaOH y la concentración del mismo es hasta 0,75 M,
tal como 0,5 M.
Por ello, otra manera de caracterizar la matriz
según la invención es que debido a las mutaciones discutidas más
arriba, su capacidad de unión disminuirá a menos de aproximadamente
70%, preferiblemente menos de aproximadamente 50% y más
preferiblemente a menos de aproximadamente 30%, tal como
aproximadamente 28%, tras el tratamiento con NaOH 0,5 M durante 7,5
horas.
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere a un método para aislar una inmunoglobulina, tal como
IgG, IgA, y/o IgM, donde se usa una proteína mutante, un multímero o
una matriz según la invención. Por ello, la invención abarca un
proceso de cromatografía, donde al menos un compuesto diana es
separado de un líquido por adsorción a una proteína mutante o un
multímero o matriz descrita más arriba. El producto deseado puede
ser el compuesto separado o el líquido. Por ello, este aspecto de la
invención se refiere a cromatografía por afinidad, que es una
técnica de separación ampliamente usada y bien conocida. En breve,
en una primera etapa, una solución que comprende los compuestos
diana, preferiblemente anticuerpos como se mencionan más arriba, se
hace pasar por una matriz de separación en condiciones que permiten
la adsorción del compuesto diana a los ligandos presentes sobre
dicha matriz. Tales condiciones están controladas por ejemplo por pH
y/o concentración de sal, es decir, fuerza iónica en la solución.
Se debe tener cuidado para no exceder la capacidad de la matriz, es
decir, el flujo debe ser suficientemente bajo para permitir una
adsorción satisfactoria. En esta etapa, otros componentes de la
solución pasarán a su través sin dificultad adicional.
Opcionalmente, luego la matriz se lava, por ejemplo, con una
solución acuosa, con el fin de separar las sustancias retenidas y/o
holgadamente unidas. La presente matriz se usa de forma mucho más
ventajosa con una etapa de lavado que utiliza un agente alcalino,
tal como se discute más arriba. En una etapa siguiente, se hace
pasar por la matriz una segunda solución denominada eluyente, bajo
condiciones que proporcionan la desorción, es decir, la liberación
del compuesto diana. Tales condiciones están comúnmente
proporcionadas por un cambio de pH, la concentración de la sal, es
decir, fuerza iónica, hidrofobicidad, etc. Se conocen varios
esquemas de elusión, tales como elución en gradiente y elusión de
forma escalonada. La elusión también puede estar proporcionada por
una segunda solución que comprende una sustancia competitiva, que
sustituirá al anticuerpo deseado sobre la matriz. Para una revisión
general de los principios de cromatografía por afinidad, véase, por
ejemplo, Wichek, M., y Chaiken, I. 2000. An overview of affinity
chromatography. Methods Mol. Biol. 147:1-6.
En una realización alternativa, una proteína
mutante según la invención es usada como compuesto líder en un
proceso donde un compuesto orgánico es modelado para parecerse a su
estructura tridimensional. El compuesto modelado se conoce como
mimético. El diseño, síntesis y ensayo mimético puede ser usado para
evitar un gran número de moléculas escrutadas al azar. En pocas
palabras, tal método puede implicar determinar las partes
particulares de la proteína que son críticas y/o importantes para
una propiedad tal como unión a inmunoglobulinas. Una vez
identificadas estas partes, su estructura es modelada según sus
propiedades físicas, por ejemplo, estequiometría, enlaces, tamaño,
carga, etc, usando datos de un intervalo de fuentes, tales como
técnicas de espectroscopia, datos de difracción de rayos X y RMN.
Se pueden usar en este proceso el análisis computacional, el
cartografiado por similitud y otras técnicas. Las consideraciones
importantes en este tipo de procesos son la facilidad para
sintetizar un compuesto, la aceptación farmacológica, el patrón de
degradación in vivo, etc.
Finalmente, la presente invención también
comprende otros usos de la proteína mutante descrita más arriba,
tales como en métodos analíticos, para propósitos médicos, por
ejemplo, diagnóstico, en matrices, etc.
La Figura 1 muestra alineamientos de aminoácidos
de los cinco dominios homólogos (E, D, A, B y C) de SpA. Las líneas
horizontales indican la identidad de aminoácidos. Las tres cajas
muestran las hélices \alpha de Z_{wt} como se determinó por
Tashiro y colaboradores (Tashiro et al., 1997). Los restos de
asparagina y también un resto de glicina en el dominio B, que se
sustituyeron, están subrayados en la figura. También se muestran
los alineamientos de aminoácidos para Z_{wt} y Z(N23T).
La Figura 2 ilustra los resultados obtenidos
tras tratamiento alcalino (limpieza en el lugar) de las proteínas
mutantes según la invención en comparación con la proteína Z
desestabilizada. Una comparación de la capacidad tras tratamiento
CIP repetido tras un esquema de cromatografía por afinidad
ordinario. Se usó NaOH 0,5 M como agente limpiador. El protocolo se
realizó 16 veces y la duración del saneamiento alcalino fue de 30
minutos por cada ronda. La Figura 2(a) muestra el patrón de
inactivación para Z(F30A) y variantes de la misma, mientras
que la Figura 2(b) muestra el patrón de inactivación para
Z_{wt} y Z(N23T).
La Figura 3 muestra el gen que codifica
Z(N23T/N3A/N6D)-Cys tras inserción dentro de
un vector como se describe en el ejemplo 4(a). Las
mutaciones están marcadas con *.
La Figura 4 muestra un mapa plasmídico del
plásmido pAY91, que contiene el gen que codifica
Z(N23T/N3A/
N6D)-Cys como se describe en el ejemplo 4(a).
N6D)-Cys como se describe en el ejemplo 4(a).
La Figura 5 muestra el gen que codifica
Z(N23T/N3A/N6D) tras la inserción dentro de un vector como se
describe en el ejemplo 4(b). Las mutaciones están marcadas
con *.
La Figura 6 muestra un ejemplo de mapa
plasmídico para el plásmido pAY100 que expresa el tetrámero de
Z(N23T/N3A/N6D)-Cys como se describe en el
ejemplo 5.
La Figura 7 muestra el adaptador para introducir
un sitio KpnI dentro de un vector con promotor SpA y
secuencia señal según el ejemplo 6.
La Figura 8 muestra el plásmido pAY104, que
contiene el promotor SPA y la secuencia señal a ser usados para la
introducción de un adaptador que contiene un sitio KpnI, como
se describe en el ejemplo 6.
La Figura 9 muestra el plásmido resultante,
pAY128, tras la inserción del adaptador según el ejemplo 6.
La Figura 10 muestra el casete de clonación
construido del ejemplo 6, donde está subrayado el adaptador
original.
La Figura 11 muestra el plásmido pAY114 tras la
inserción de
Z(N23T/N3A/N6D)-Cys-tetrámero
como se describe en el Ejemplo 6.
La Figura 12 muestra el casete de clonación
construido del ejemplo 7, donde está subrayado el adaptador
original.
La Figura 13 muestra el plásmido resultante,
pAY129, tras la inserción del adaptador según al ejemplo 7.
La Figura 14 muestra el plásmido pAY125 tras la
inserción de
Z(N23T/N3A/N6D)tetrámero-Cys como se
describe en el ejemplo 7.
\newpage
La Figura 15 es un cromatograma obtenido de una
prueba como se describe en el ejemplo 8, donde el primer pico
corresponde al material de flujo a través y el segundo pico
corresponde a hIgG eludía.
La Figura 16 muestra gráficos que representan la
capacidad de unión dinámica restante de las matrices según el
ejemplo 8. De principio o fin, representan
Z(N23T/N3A/N6D)dímero-Cys,
Z(N23T/N3A)dímero-Cys,
Z(N23T)dímero-Cys, y
Z(N23T/IL4G)dímero-Cys
respectivamente. Debido a problemas de software, se han perdido los
dos últimos puntos de medida para
Z(N23T/N3A)dímero-Cys.
Abajo, la presente invención será descrita a
modo de ejemplos, que se proporcionan sólo para propósitos
ilustrativos y por consiguiente, no pretenden limitar el alcance de
la presente invención tal como se define en las reivindicaciones
adjuntas.
En esta parte, mientras que Z en su forma
original ya tiene una estabilidad significativa pero no suficiente
hacia un tratamiento alcalino, se asumió que pequeños cambios en la
estabilidad debidos a las mutaciones pueden se difíciles de ser
llevados a cabo en ensayos de laboratorio. Por tanto, se usó un
método supresor de mutaciones (Kotsuka, T., S. Akanuma, M. Tomuro,
A. Yamagishi; and T. Oshima. 1996. Further stabilisation of
3-isopropylmalate dehydrogenase of an extreme
thermophile, Thermus thermophilus, by a suppressor mutation
method. J Bacteriol. 178:723-727; and Sieber, V.,
A. Plückthun, and F.X. Schmidt. 1998. Selecting proteins with
improved stability by a phage-based method. Nature
Biotechnology. 16:955-960) para proporcionar un
variante del dominio Z con una estabilidad estructural disminuida.
Según esta estrategia, el variante desestabilizado de la proteína
Z, llamado aquí Z(F30A) (Cedergren et al., 1993,
arriba) se usó como pasaje para la introducción posterior de
mutaciones adicionales relacionadas con las investigaciones de
estabilidad alcalina. Las propiedades de unión de este variante son
similares a las de la proteína Z natural, mientras que F30A no está
implicada en la unión Fc.
Además, Z_{wt} denota el dominio Z de tipo
salvaje, que no contiene la sustitución F30A.
Para analizar qué asparaginas en el dominio Z
son responsables de su inestabilidad en condiciones alcalinas, se
llevó a cabo un análisis mutacional. Con el fin de permitir la
detección de mejoras con respecto a la estabilidad alcalina del
dominio Z, se decidió usar un variante mutado, Z(F30A),
mientras que el dominio Z todavía posee una estabilidad
significativa pero no suficiente hacia condiciones alcalinas.
Z(F30A) ha mostrado de forma temprana que posee una afinidad
a IgG que es similar a la del tipo salvaje, pero también una
estabilidad estructural marcadamente disminuida debido a la
mutación de un aminoácido y que normalmente forma parte del núcleo
hidrofóbico (Cedergren et al., 1993; arriba; Jerdeberg, L.,
B. Person, R. Andersson, R. Karlsson, M. Uhlen, y B. Nilsson, 1995.
Kinetic analysis of the interaction between protein A domain
variants and human Fc using plasmon resonance detection. Journal of
Molecular Recognition. 8:270-278). El dominio Z es
un paquete de tres hélices que consiste de 58 aminoácidos,
incluyendo ocho asparaginas (N3, N6, N11, N21, N28, N43 y N52)
(Figura 1) (Nilsson, B., T. Moks, B. Jansson, L. Abrahmsen, A.
Elmblad, E. Holmgren, C. Henrichson, T.A. Jones, and M. Uhlen. 1987.
A synthetic IgG-binding domain based on
staphylococcal protein A. Protein Eng. 1:107-113).
Para evaluar el efecto de las distintas asparaginas en el ritmo de
desactivación en condiciones alcalinas, siete de estos restos se
intercambiaron por otros aminoácidos. Ya que N3 está localizada en
el extremo amino terminal flexible del dominio, se excluyó del
estudio. Se asumió que una degradación de este aminoácido no
afectaría a la actividad de un ligando monomérico y con ello no
sería detectable en el ensayo presente, que mide la actividad
conservada. Además, ya que el aminoácido está localizado fuera de
la parte estructurada del dominio, presumiblemente éste será
fácilmente reemplazable durante la multimerización del dominio para
conseguir una molécula del tipo proteína A. Para facilitar el
diseño proteico, se hizo una comparación con las secuencias
homólogas de los otros dominios de la proteína A (Figura 1) (Gülich
et al., 2000a). De la comparación, se decidió intercambiar
asparagina 11 por una serina y 23 por treonina y finalmente 43 por
un ácido glutámico. La asparagina 6 se intercambió por alanina
mientras que la alternativa fue ácido aspártico cuando se mira las
secuencias homólogas, que también ha mostrado ser sensible en
condiciones alcalinas. Los cinco dominios de la proteína A tienen
asparaginas en otras posiciones (21, 28, 52). Por ello, se
intercambiaron por
alaninas.
alaninas.
Se llevó a cabo la mutagénesis dirigida a sitio
usando una técnica de PCR en dos etapas (Higuchi et al.,
1988). Se usó el plásmido pDHZF30A (Cedergren et al., 1993)
como molde. Los oligonucleótidos que codifican para los distintos
reemplazos de asparagina y el reemplazo A29G se sintetizaron por
Interactiva (Interactiva Bio-technologie GmbH, Ulm,
Alemania). Las enzimas de restricción XbaI y Hindi
(MBI Fermentas Inc., Amhurst, NY) se usaron para clonación dentro
del vector pDHZ (Jansson et al., 1996) que se llevó a cabo
según Sambrook (Sambrook et al., 1987). Para crear pTrpZ, el
dominio Z se amplificó por PCR, usando el plásmido pKN1 como molde
(Nord et al., 1995). El fragmento se restringió con
XbaI y PstI y se ligó dentro del vector pTrpABDTIT2
(Kraulis et al., 1996) que ha sido restringido con las mismas
enzimas. Se usó un Sistema se Secuenciación de ADN MegaBACE 1000
(Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) para verificar la secuencia
correcta de los fragmentos insertados. Se utilizó un compuesto
químico terminador MegaBACE (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia)
según las recomendaciones del fabricante en un protocolo de
secuenciación en ciclo basado en el método didesoxi (Sanger et
al., 1977). Durante los procesos de clonación, se usó la cepa
RR1\DeltaM15 de Escherichia coli (Colección de Cultivos
Tipo Americana, Rockville, MA), mientras para la expresión de
diferentes productos génicos se usó la 017 (Olsson, M.O., y L.A.
Isaksson 1979. Analysis of rpsD Mutations in Escherichia
coli. I: Comparison of Mutants with Various Alterations in
Ribosomal Protein S4. Molec. gen. Genet.
169:251-257).
La producción y purificación de Z(F30A) y
las diferentes construcciones del mismo se llevaron a cabo según el
protocolo subrayado por Gülich (Gülich et al., 2000b, véase
más arriba). La producción de Z y pZ(N23T) se llevó a cabo
como se describe en Kraulis et al (Kraulis, P.J., P.
Jonasson, P.-A. Nygren, M. Uhlén, L. Jendeberg, B. Nilsson, y J.
Kördel. 1996. The serum albumin-binding domain of
streptococcal protein G is a three-helix bundel: a
heteronuclear NMR study. FEBS lett. 378:190-194). Se
liofilizaron fracciones relevantes. La cantidad de proteína se
estimó por medidas de absorbancia a 280 nm usando el coeficiente de
absorbancia específico, un (1 g^{-1} cm^{-1}); Z 0.15.6;
Z(N23T), 0.169; Z(F30A), Z(F30A,N43E),
Z(F30A,N23T,N43E).0.157; Z(F30A,N6A),
Z(F30A,N11S), Z(F30A,N21A), Z(F30A,N23T),
Z(F30A,N28A), Z(F30A,N52A), Z(F30A,N6A,N23T),
Z(F30A,N11S,N23T) 0.158.. La concentración se confirmó por
análisis aminoacídico (BMC, Uppsala, Suecia). La homogeneidad se
analizó por electroforesis en gel de
poliacrilamida-Dodecil sulfato sódico
(SDS-PAGE) (Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of
Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage
T4. Nature. 227:680-685) usando el sistema Phast.
Las proteínas liofilizadas se cargaron en geles de alta densidad
(Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) bajo condiciones reductoras
y se tiñeron con Azul Brillante de Coomassie según las
recomendaciones del fabricante. La homogeneidad y lo pesos
moleculares fueron además confirmados por espectrometría de
masas.
Para espectroscopia CD, las muestras de proteína
se prepararon en un tampón fosfato (K_{2}HPO_{4} 8,1 mM,
KH_{2}PO_{4}, 1,9 mM, pH 7,5) a una concentración de 10 \muM.
Los espectros se grabaron usando un espectropolarímetro
J-720 (JASCO, Tokio, Japón) en la región UV lejana
de 250 a 200 nm a RT en una célula de cuarzo de longitud de senda
de 0,1 cm y con una velocidad de escáner de 10 nm min^{-1}. Cada
espectro era la media de los cinco escáneres acumulados y el
espectro final se convirtió en elipticidad de resto medio (ERM)
(deg cm^{2} dmol^{-1}).
Todas las variantes Z se produjeron con éxito de
forma intracelular en E. coli a 37ºC y mostraron los mismos
niveles de expresión, aproximadamente 50 mg/l como se estimó por
SDS-PAGE. Todas las proteínas se purificaron por
cromatografía por afinidad con IgG. Tras la purificación, las
muestras se analizaron con SDS-PAGE (datos no
mostrados), se liofilizaron y se almacenaron para análisis
posteriores. La masa molecular para la proteína Z y los distintos
mutantes de la misma también se confirmaron por espectrometría de
masas. Los datos confirmaron un correcto contenido en aminoácidos
para todos los mutantes (datos no mostrados). También, se llevaron a
cabo análisis estructurales en un equipo de Dicronismo Circular
(DC), mientras que se ha demostrado previamente ser adecuado para
detectar cambios estructurales en proteínas \alpha helicoidales
(Johnson, C.W., Jr. 1990. Protein secondary structure and circular
dichroism: a practical guide. Proteins. 7:205-214;
and Nord, K., J. Nilsson, B. Nilsson, M. Uhlén, and P.-\ring{A}.
Nygren. 1995. A combinatorial library of an
a-helical bacterial receptor domain. Prot. eng.
8:601-608). Todos los espectros muestran un mínimo a
208 nm a 222 nm en combinación con un máximo alrededor de 195 nm,
que indica una estructura similar para los mutantes y la molécula
pariente. Sin embargo, Z(F30A, N52A) parece que tiene una
forma helicoidal \alpha inferior que Z de tipo salvaje y los
otros mutantes del mismo (datos no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
Se detectaron diferencias en las constantes de
afinidad y cinética de los estados de asociación y disociación en
un instrumento Biacore^{TM} 2000 (Biacore, Uppsala, Suecia). Se
inmovilizaron IgG policlonal humana y HSA (referencia negativa) por
acoplamiento amino sobre la capa de dextrano carboxilado de un chip
sensor CM5 (Biacore) según las recomendaciones del fabricante. La
inmovilización de IgG dio como resultado aproximadamente 2000 RU.
Z, ZF30A, y los diferentes mutantes se prepararon en HBS (HAPES 10
mM, NaCl 0,15 M, EDTA 3,4 mM, tensioactivo P20 al 0,005%, pH 7,4) a
10 concentraciones diferentes (100-550 nM). Las
muestras se inyectaron sobre las superficies por duplicado en orden
al azar a un ritmo de flujo de 30 \mul min^{-1}. Se usó HCl 10
mM para regenerar la superficie. Los datos se analizaron usando el
software 3.0.2b de evaluación BIA (Biacore BIA). Las señales a
partir de una superficie control inmovilizada con HSA se sustrajeron
de la superficie de IgG. Se asumió un modelo 1:1 de Langmuir y se
calcularon las constantes cinéticas aparentes y también las
constantes de afinidad. También, se calculó el cambio en la energía
de unión libre (\Delta\DeltaG = -RTln K_{aff, \
mutante}/K_{aff}, nativa) en relación a la molécula natural.
\newpage
Para determinar las diferencias en la afinidad
para las variantes de Z hacia IgG, se llevó a cabo una resonancia
de superficie en plasmón (RSP) usando un Biacore. El objetivo era
comparar la afinidad para las distintas variantes de Z mutado según
la invención con la molécula pariente. Como se menciona más arriba,
debido a la alta estabilidad alcalina del dominio Z pariente se
decidió usar un variante estructural desestabilizado de Z que
incluye la mutación F30A (Cedergren, L., R. Andersson, B. Jansson,
M. Uhlén, and B. Nilsson. 1993. Mutational analysis of the
interaction between staphylococcal protein A and human IgG1. Protein
eng. 6:441-448). Por lo tanto, era de importancia
confirmar primero que la afinidad entre la molécula mutada e IgG
estaba mantenida a pesar de la mutación. Como se puede ver en la
Tabla 1 más abajo, la afinidad de Z(F30A) no está afectada
de forma significativa. El pequeño cambio en la afinidad proporciona
una estabilidad ligeramente superior al complejo de Z(F30A)
e IgG en comparación con la molécula Z pariente e IgG. Esto está en
consonancia con resultados descritos anteriormente por Jendeberg
et al. (Cedergren et al., 1993, arriba; Jederberg
et al., 1995, arriba). Todos los mutantes construidos con
Z(F30A) como andamio se analizaron y compararon con su
molécula pariente (Z(F30A)). Los resultados muestran que la
afinidad global no está afectada de forma significativa por las
mutaciones, indicando que ninguna de las mutaciones en asparagina
según la invención son muy importantes para la unión a IgG (véase
Tabla 1 abajo). En todas las variantes de Z, incluyendo la mutación
N21A o N43E, sólo se observó una constante de afinidad ligeramente
inferior. Para mutantes con la mutación N23T, sorprendentemente, la
afinidad incluso parece ser ligeramente superior. También, en el
caso de la mutación N28A, el descenso en la afinidad es muy
pequeño, y no se puede esperar que tenga influencia esencial si la
proteína mutante se usa, por ejemplo, como proteína ligando.
Además, todas las construcciones que incluyen la mutación N28A
tienen una constante de disociación notablemente aumentada. Para los
mutantes que incluyen la mutación N23T afinidad un tanto aumentada
parece que se debe a una constante de asociación ligeramente
aumentada. También, la mutación N6A da una constante de asociación
superior, pero la constante de afinidad no está afectada debido a
la constante de disociación aumentada que también se da en la
mutación.
\vskip1.000000\baselineskip
El comportamiento de las variantes del dominio Z
como ligandos de afinidad se analizó por inmovilización en una
matriz de afinidad clásica. Z, Z(F30A) y las variantes
mutadas se acoplaron de forma covalente a columnas de afinidad
HiTrap^{TM} (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) usando el
compuesto químico N-hidroxisuccinimida según las
recomendaciones del fabricante. Las columnas se pulsaron con TST y
HAc 0,2 M, pH 3,1. se preparó e inyectó en las columnas en exceso
IgG policlonal humana en TST. Se siguió un protocolo de
cromatografía por afinidad clásico durante 16 ciclos en
AktaTMExplorer 10 (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia). Entre
cada ciclo se integró una etapa CIP. El agente limpiador fue NaOH
0,5 M y el tiempo de contacto para cada pulso fue de 30 minutos,
dando como resultado un tiempo de exposición total de 7,5 horas. El
material eluido se detectó a
280 nm.
280 nm.
Z, Z(F30A) y mutantes de los mismos se
unieron de forma covalente a columnas HiTrap^{TM} usando un
compuesto químico NHS. Se cargó IgG en exceso y la cantidad de IgG
eluido se midió tras cada ciclo para determinar la capacidad total
de la columna. Entre cada ciclo las columnas se expusieron a
tratamiento CIP que consiste de NaOH 0,5 M. Tras 16 pulsos, con un
tiempo de exposición total de 7,5 horas, la columna con
Z(F30A)-matriz muestra un 70% de disminución
de la capacidad. Los datos de degradación en la Figura 2a sugieren
que cuatro de las asparaginas intercambiadas (N6, N11, N43 y N52)
son menos sensibles a las condiciones alcalinas que los mutantes
expuestos para este experimento. Por el contrario, N23 parece que es
muy importante para la estabilidad de Z(F30A).
Z(F30A,N23T) muestra sólo un 28% de disminución de la
capacidad a pesar de la mutación desestabilizante F30A. Por
consiguiente, Z(F30A,N23T) es casi tan estable como Z_{wt}
y por ello la variante más estabilizada con Z(F30A) como
andamio. El dominio Z(F30A) con dos mutaciones adicionales
Z(F30A,N23T,N43E) también muestra el mismo patrón de
degradación que Z(F30A,N23T). Un intercambio de N28 a una
alanina mejora la estabilidad de Z(F30A) hacia condiciones
alcalinas. Sorprendentemente, la columna con Z(F30A,N21A)
como ligando de afinidad revela una pérdida dramática de capacidad
cuando se expone a NaOH en comparación con la molécula pariente.
Estos datos hacen a Z(N23T) un candidato muy ventajoso como
ligando en la purificación por afinidad de
IgG.
IgG.
Para demostrar finalmente la fiabilidad de la
estrategia usando una variante estructuralmente desestabilizada de
un molécula con el fin de hacer pequeños cambios en la estabilidad
detectable, la mutación N23T se injertó dentro del dominio Z
pariente. El dominio Z pariente y Z(N23T) se acoplaron a
columnas HiTrap^{TM} y se expusieron a condiciones alcalinas del
mismo modo que para los mutantes ya mencionados. Como se puede ver
en la figura 2b, el mutante Z(N23T) muestra estabilidad
superior a Z_{wt} cuando se expone a pH superior.
\vskip1.000000\baselineskip
Se introdujeron tres mutaciones diferentes en un
gen que codifica Z(N23T): K4G, N3A y la mutación doble
N3A/N6D.
Las mutaciones se introdujeron originalmente
dentro de dos vectores diferentes: uno con una cisteína en el
extremo C-terminal y una sin la cisteína. Esto se
hizo para facilitar posteriormente la construcción de multímeros
con una sola cisteína en el extremo C-terminal.
Ejemplo
4(a)
Como molde para la construcción, se usó un
plásmido denominado "pGEM ZN23T". Este ya contenía la mutación
N23T en el gen Z.
\newpage
Se llevó a cabo una reacción de PCR con este
plásmido como molde y los dos oligonucleótidos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los tubos de la reacción de PCR contienen: 0,5
\mul de molde pGEM ZN23T [500 ng/\mul], 5 pmol de cada cebador
(Interactiva, Thermo Hybaid GmbH, Ulm, Alemania), 5 \mul de mezcla
de dNTPs ([10 mM], Applied Biosystems, CA, USA), 5 \mul de tampón
de PCR 10x (Applied Biosystems, CA, USA), 0,1 \mul de AmpliTaq ([5
U/\mul], Applied Biosystems, CA, USA) y agua estéril hasta un
volumen final de 50 \mul. El programa de PCR consistía en 2 min a
94ºC seguido por 30 ciclos de 15 seg a 96ºC, 15 seg a 50ºC, 1 min a
72ºC y finaliza con un minuto adicional a 72ºC. Las reacciones de
PCR se llevaron a cabo en un Sistema de PCR GeneAmp® PCR System
9700 (Applied Biosystems, CA, USA).
El producto de la PCR se analizó en un gel de
agarosa al 1% tras confirmar la obtención de un producto de tamaño
correcto, se purificó con el kit de purificación de PCR QIAquick®
(QIAGEN GMBH, Hilden, Alemania).
Los productos de PCR se escindieron según
Sambrook (Sambrook et al.) con las enzimas de restricción
AccI y PstI (New England Biolabs, NEB, MA, USA). Los
productos de escisión se analizaron en un gel de agarosa y se
purificaron de la agarosa con el Kit de Extracción en Gel QIAquick®
(QIAGEN GMBH, Hilden, Alemania) antes de la ligación. Los
fragmentos se ligaron dentro de un vector denominado
"pTrp-protA-stab-(multi9)", ya
escindido con las enzimas AccI y PstI y purificado,
añadiendo la ADN ligasa T4 y el tampón de ligación (MBI Fermentas,
Lituania), y transformado posteriormente dentro de células
RRI\DeltaM15 (ATCC, MA, USA). A las construcciones se les dio en
nombre pAY87 (Z(N23T/K4G)-Cys), pAY89
(Z(N23T/N3A)-Cys) y pAY91
(Z(N23T/N3A/N6D)-Cys), respectivamente.
Se usó un Sistema de Secuenciación de ADN
MegaBACE^{TM} 1000 (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) para
verificar las secuencias correctas de fragmentos insertados. Se
utilizó el compuesto químico terminador MegaBACE^{TM} (Amersham
Biosciences, Uppsala, Suecia) según las recomendaciones del
fabricante en un protocolo de secuenciación en ciclo basado en el
método didesoxi (Sanger et al., 1977).
Ejemplo
4(b)
Como molde para la construcción, se usó un
plásmido denominado "pTrp(-N)ZN23T-Cys".
Este plásmido ya contenía el gen con la mutación N23T.
\newpage
Se llevó a cabo una reacción de PCR con este
plásmido como molde y los dos oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los tubos de la reacción de PCR contienen: 0,5
\mul de molde pTrp(-N)ZN23T-Cys [500
ng/\mul], 5 pmol de cada cebador (Interactiva, Thermo Hybaid
GmbH, Ulm, Alemania), 5 \mul de mezcla de dNTPs (10 mM, Applied
Biosystems, CA, USA), 5 \mul de tampón de PCR 10x (Applied
Biosystems, CA, USA), 0,1 \mul de AmpliTaq ([5 U/\mul], Applied
Biosystems, CA, USA) y agua estéril hasta un volumen final de 50
\mul. El programa de PCR consistía en 2 min a 94ºC seguido por 30
ciclos de 15 seg a 96ºC, 15 seg a 50ºC, 1 min a 72ºC y finaliza con
un minuto adicional a 72ºC. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo
en un Sistema de PCR GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems,
CA, USA).
Los productos de PCR se clonaron directamente TA
dentro del vector pGEM según las recomendaciones del fabricante
(Promega, WI, USA) y se transformaron posteriormente dentro de
células RRI\DeltaM15 (ATCC, MA, USA). A las construcciones se les
dio en nombre pAY86 (Z(N23T/K4G), pAY88 (Z(N23T/N3A) y
pAY90 (Z(N23T/N3A/N6D), respectivamente.
Se usó un Sistema de Secuenciación de ADN
MegaBACE^{TM} 1000 (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) para
verificar las secuencias correctas de fragmentos insertados. Se
utilizó el compuesto químico terminador MegaBACE^{TM} (Amersham
Biosciences, Uppsala, Suecia) según las recomendaciones del
fabricante en un protocolo de secuenciación en ciclo basado en el
método didesoxi (Sanger et al., 1977).
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los plásmidos arriba descritos de pAY86 a
pAY91 (un total de seis plásmidos) se escindieron con la enzima de
restricción AccI. Esto dio como resultado la liberación de
mutantes Z completamente a partir de vectores pAY86, pAY88 y pAY90
y una sola abertura en el extremo 3' del gen en los vectores pAY87,
pAY89 y pAY91. Los vectores escindidos se trataron con Fosfatasa
Alcalina de Intestino de Ternera (CIAP, MBI Fermentas, Lituania)
según las recomendaciones del fabricante. Esta etapa se llevó a cabo
para defosforilar los extremos 5' para evitar autoligación de los
vectores.
Los fragmentos del mutante Z liberados se
analizaron en un gel de agarosa y se purificaron posteriormente de
la agarosa antes de ligar los fragmentos dentro de vectores abiertos
según lo siguiente:
Fragmento de pAY86 a pAY87
Fragmento de pAY88 a pAY89
Fragmento de pAY90 a pAY91
\vskip1.000000\baselineskip
Para las reacciones de ligación, se mezclaron
diferentes proporciones de fragmento frente al vector y el resultado
fue que se obtuvo un intervalo de multímeros diferentes, como se
esperaba, en un intervalo de dímeros a pentámeros.
Los diferentes multímeros se transformaron
dentro de células RRI\Delta\DeltaM15 (ATCC, MA, USA) y las
secuencias correctas se verificaron por análisis en un equipo de
secuenciación en el Instituto Real de Tecnología tal como se
describe más arriba. Los plásmidos nuevamente construidos se
denominaron como se muestra en la tabla de más abajo:
\vskip1.000000\baselineskip
Los vectores plasmídicos arriba descritos,
excepto pAY86, pAY88 y pAY90 tienen el promotor Trp, la secuencia
líder Trp y el gen para la resistencia a kanamicina (Km). pAY86,
pAY88 y pAY90 tienen un gen para resistencia a ampicilina en su
lugar.
\vskip1.000000\baselineskip
Los genes que codifican las proteínas enumeradas
en la Tabla 2 se transfirieron a un vector que contiene el promotor
SPA y una secuencia señal. Para permitir este procedimiento, se
construyó un adaptador que contiene el sitio de escisión para la
enzima de restricción KnpI (New England Biolabs, NEB, MA,
USA). El adaptador se construyó por los dos oligonucleótidos
(Interactiva, Termo Hybaid GMBH, Ulm, Alemania).
El plásmido pAY104
(pK4-Cys-ABDstabdímero) se escindió
con FspI y PstI (New England Biolabs, NEB, MA, USA).
El vector se purificó en un gel de agarosa y se separó el fragmento
liberado y el vector restante se purificó del gel de agarosa con el
Kit de Extracción en Gel QIAquick® (QIAGEN GmbH, Hilden,
Alemania).
Los dos oligómeros AFFI-88 y
AFFI-89 se mezclaron en un tampón de ligación (MBI
Fermentas. Lituania) y se calentaron a 50ºC y la muestra se dejó
enfriar a temperatura ambiente tras lo cual el vector plasmídico
escindido se añadió junto con la ADN ligasa T4 (MBI Fermentas,
Lituania). Tras la reacción de ligación, el producto se transformó
dentro de células RRI\Delta\DeltaM15 y se verificó la secuencia
correcta como se describe más arriba. El plásmido resultante se
denominó pAY128.
El plásmido pAY128 luego se escindió con las
enzimas de restricción KnpI y PstI y el vector
escindido se analizó en un gel de agarosa y se purificó
posteriormente con el Kit de Extracción en Gel QIAquick® (QIAGEN
GmbH, Hilden, Alemania). Los fragmentos que expresan los dos genes Z
mutados Z(N23T/N3A) y Z(N23T/N3A/N6A) de pAY86 a
pAY103 se escindieron con KnpI y PstI (New England
Biolabs, NEB, MA, USA), se separaron y purificaron tras separación
en un gel de agarosa. Los distintos fragmentos se ligaron dentro del
vector escindido originado de pAY128 y los plásmidos resultantes
fueron, tras verificar las secuencias correctas, denominados pAY107
a pAY116 tal como se enumera en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los genes que codifican las proteínas, como se
enumeran en la Tabla 2, se transfirieron a un vector que contiene
el promotor SPA y la secuencia señal y una parte del gen que
codifica la región E de la proteína A (E'). Se ha mostrado
anteriormente que una adición del extremo N-terminal
de la parte de unión a IgG de la proteína A madura (región E), o
partes de la misma, pueden aumentar el correcto procesamiento y
también facilitar la secreción del producto génico al medio de
cultivo circundante (Abrahmsé et al., 1985). Se construyó por
los dos oligonucleótidos un adaptador que contiene el sitio de
escisión para la enzima de restricción KnpI y una parte de
la región E de la proteína A (E') (Interactiva, Termo Hybaid GMBH,
Ulm, Alemania).
El Plásmido pAY104
(pK4-cys-ABDstabdímero) se escindió
con FspI y PstI (New England Biolabs, NRB, MA, USA).
El vector se purificó en un gel de agarosa y se separó el fragmento
liberado y el vector restante se purificó de la agarosa con el Kit
de Extracción en Gel QIAquick® (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania). Los
dos oligonucleótidos se mezclaron en un tampón de ligación y se
calentaron a 75ºC y la mezcla se dejó enfriar a temperatura
ambiente tras añadir el vector plasmídico escindido, junto con ADN
ligasa T4 (MBI Fermentas, Lituania). Tras la reacción de ligación,
el producto se transformó dentro de células RRI\Delta\DeltaM15 y
la secuencia correcta se verificó como se describe más arriba. El
plásmido resultante se denominó pAY129.
El Plásmido pAY129 luego se escindió con las
enzimas de restricción KnpI y PstI y el vector
escindido se analizó en un gel de agarosa y se purificó
posteriormente de la agarosa con el Kit de Extracción en Gel
QIAquick® (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania). Los fragmentos que
expresan los dos genes Z mutados Z(N23T/N3A) y
Z(N23T/N3A/N6A) de pAY86 a pAY103 se escindieron con
KnpI y PstI, se separaron y purificaron tras la
separación de la agarosa. Los distintos fragmentos se ligaron dentro
de un vector escindido originario de pAY129 y los plásmidos
resultantes, tras verificar las secuencias correctas, se denominaron
pAY118 a pAY127 como se enumera en la Tabla 4.
Para evaluar la estabilidad de las proteínas
hacia condiciones alcalinas, se ensayaron cuatro proteínas
diferentes en un medio ambiente de pH alto. Las distintas proteínas
fueron Z(N23T)dímero-Cys,
Z(N23T/K4G)dímero-Cys,
Z(N23T/N3A)dímero-Cys y
Z(N23T/N3A/N5D)dímero-Cys.
(Z(N23T)dímero-Cys),
(Z(N23T/N3A) dímero -Cys), (Z(N23T/N3A/N6D) dímero
-Cys) y (Z(N23T/K4G)dímero-Cys se
cultivaron en fermentadores. El medo de cosecha se purificó y acopló
a Agarosa HF (Amersham Biosciences, Upssala, Suecia) usando métodos
clásicos antes de los ensayos alcalinos. Las proteínas acopladas a
la agarosa HF se denominaron como sigue
- \bullet
- Z(N23T) dímero-Cys U631049
- \bullet
- Z(N23T/K4G)dímero-Cys U631079
- \bullet
- Z(N23T/N3A)dímero-Cys U631064
- \bullet
- Z(N23T/N3A/N6D)dímero-Cys U631063
La matrices se empaquetaron en columnas (HR 5/2,
Amersham Biosciences, Upssala, Suecia) hasta un volumen final en un
intervalo de 0,1 a 0,3 ml. El equipo de purificación usado fue
ÄKTA^{TM} Explorer 10 (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) con
una celda de flujo UV de muestra de 2 mm (Amersham Biosciences,
Uppsala, Suecia).
Los tampones usados contenían
- \bullet
- Tampón de prueba: Tris-HCl 25 mM, EDTA1 mM, NaCl 200 mM, Tween 20 al 0,05%, acetato amónico 5 mM, pH 8,0
- \bullet
- Tampón de elución: ácido acético 0,2 M (HAc), pH 3,1
- \bullet
- Tampón de Limpieza en el Lugar (CIP): NaOH 0,5 M
\vskip1.000000\baselineskip
Un típico ciclo de prueba cromatográfica
consiste de
- \bullet
- Equilibrado de la columna con tampón de prueba
- \bullet
- Aplicación de la muestra de 10 mg de IgG policlonal humana a 0,2 ml/min
- \bullet
- Lavado intenso de proteínas no unidas
- \bullet
- Elución a 1,0 ml/min con tampón de elución
- \bullet
- Re-equilibrado con tampón de prueba
- \bullet
- Limpieza en el Sitio (CIP) con tampón CIP con un tiempo de contacto entre la matriz de la columna y NaOH 0,5 M de 1 hora
- \bullet
- Re-equilibrado con tampón de prueba
La cantidad de IgG cargada en cada prueba fue
por encima de la capacidad de unión dinámica total de la columna ya
que el camino de las proteínas no unidas era considerable cuando se
carga la muestra dentro de la columna en todos los casos. Tras un
ciclo, que incluyen las etapas de más arriba, se empezó un nuevo
ciclo que, de nuevo, incluía una hora de exposición de hidróxido
sódico 0,5 M. Para medir la disminución de la capacidad de unión
dinámica de la columna, se comparó el área de pico del pico eluido
con el área de pico del pico eluido cuando la matriz no había sido
expuesta al hidróxido sódico. Considerando el área de pico original
como 100% de la capacidad de unión, se observó el descenso de la
capacidad de unión de hIgG. El área de pico se calculó con el
software UNICORN^{TM} que acompaña al sistema de purificación.
Cada ciclo se repitió 21 veces, dando como
resultado una exposición total entre la matriz y el hidróxido sódico
de 20 horas para cada matriz diferente. Las áreas de pico
normalizadas se vieron en una gráfica como se puede ver más abajo
(Figura 16). Todos los 21 ciclos se repitieron para cada
mutante.
Z(N23T/N3A/N6D)dímero-Cys
y Z(N23T/N3A)dímero-Cys mostraron
estabilidad mejorada frente a condiciones alcalinas en comparación
con Z(N23T)dímero-Cys originalmente
producido.
<110> Amersham Biosciences
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROTEÍNA MUTANTE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PU 0215
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MUTÁGENO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (29) .. (29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MUTÁGENO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (29) .. (29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MUTÁGENO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (30)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MUTÁGENO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23) .. (23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MUTÁGENO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (29) .. (29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
Claims (20)
1. Una proteína de unión a inmunoglobulina capaz
de unirse a regiones de una molécula de inmunoglobulina distintas
de las regiones determinantes de complementariedad (CDR), donde
dicha proteína comprende dos o más unidades que se repiten como se
define por SEQ ID NO: 1 o 2, en la que el resto de aminoácido en
posición 23 en cada unidad es una treonina.
2. Una proteína según la reivindicación 1, que
es una proteína de unión al fragmento Fc.
3. Una proteína según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde las unidades están unidas por
elementos comprendidos por hasta aproximadamente 15 aminoácidos.
4. Una proteína según la reivindicación 3, donde
el elemento de unión comprende la secuencia VDAFKD.
5. Una proteína según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que también comprende una o más
unidades que se repiten que comprenden los dominios E, D, A, B y C
de la proteína A de Staphylococcus.
6. Una proteína según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que es un tetrámero.
7. Una proteína según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde al menos una unidad comprende al
menos el 80% de la secuencia definida por SEQ ID NO: 4.
8. Una proteína según la reivindicación 7, que
es un tetrámero donde al menos una unidad comprende la secuencia
definida por SEQ ID NO: 4.
9. Una proteína según la reivindicación 7 u 8,
que es un tetrámero donde el elemento de unión comprende la
secuencia VDAKFD.
10. Un ácido nucleico que codifica una proteína
tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones
1-9.
11. Un sistema de expresión, que comprende un
ácido nucleico según la reivindicación 10.
12. Una matriz para cromatografía por afinidad,
donde una pluralidad de ligandos que comprenden proteínas de unión
a inmunoglobulinas según una cualquiera de las reivindicaciones
1-9 han sido acopladas a un soporte sólido.
13. Una matriz según la reivindicación 12, donde
los ligandos comprenden uno o más tetrámeros.
14. Una matriz según la reivindicación 12 o 13,
donde los ligandos han sido acoplados al soporte por enlace
tioéter.
15. Una matriz según una cualquiera de las
reivindicaciones 12-14, donde el soporte es un
material de polisacárido.
16. Una matriz según una cualquiera de las
reivindicaciones 12-15, que proporciona unión
selectiva de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que
consiste en IgG, IgA e IgM, preferiblemente IgG.
17. Uso de una matriz según una cualquiera de
las reivindicaciones 12-16 en el aislamiento
cromatográfico de una inmunoglobulina, cuyo uso comprende las
etapas de adsorber la inmunoglobulina a la matriz; eluir dicha
inmunoglobulina; limpiar la matriz con álcali; adsorber una
inmunoglobulina a la matriz lavada, y eluir la inmunoglobulina.
18. Uso según la reivindicación 17, donde la
limpieza es llevada a cabo con NaOH a una concentración de hasta
aproximadamente 1 M, tal como aproximadamente 0,5 M.
19. Un proceso de cromatografía, donde al menos
un compuesto diana es separado de un líquido por adsorción a una
proteína según una cualquiera de las reivindicaciones
1-9, o a una matriz según una cualquiera de las
reivindicaciones 12-16.
20. Un proceso según la reivindicación 19, donde
el compuesto diana es una inmunoglobulina.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE0200943A SE0200943D0 (sv) | 2002-03-25 | 2002-03-25 | Mutant protein |
SE0200943 | 2002-03-25 | ||
SE2002100943 | 2002-03-25 | ||
PCT/SE2003/000475 WO2003080655A1 (en) | 2002-03-25 | 2003-03-20 | A mutated immunoglobulin-binding protein |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2325362T3 true ES2325362T3 (es) | 2009-09-02 |
ES2325362T5 ES2325362T5 (es) | 2013-02-20 |
Family
ID=20287415
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES08004374.8T Expired - Lifetime ES2634145T3 (es) | 2002-03-25 | 2003-03-20 | Proteína de unión a inmunoglobulinas mutada |
ES03713152T Expired - Lifetime ES2325362T5 (es) | 2002-03-25 | 2003-03-20 | Una proteína de unión a inmunoglobulina mutada |
ES17166519T Expired - Lifetime ES2783876T3 (es) | 2002-03-25 | 2003-03-20 | Proteína mutante |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES08004374.8T Expired - Lifetime ES2634145T3 (es) | 2002-03-25 | 2003-03-20 | Proteína de unión a inmunoglobulinas mutada |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES17166519T Expired - Lifetime ES2783876T3 (es) | 2002-03-25 | 2003-03-20 | Proteína mutante |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (9) | US7834158B2 (es) |
EP (3) | EP1972689B1 (es) |
JP (1) | JP4391830B2 (es) |
KR (4) | KR101067181B1 (es) |
CN (6) | CN102558317A (es) |
AT (1) | ATE431360T1 (es) |
AU (1) | AU2003217119B2 (es) |
CA (1) | CA2479896C (es) |
DE (1) | DE60327606D1 (es) |
DK (2) | DK3249047T3 (es) |
ES (3) | ES2634145T3 (es) |
SE (1) | SE0200943D0 (es) |
WO (1) | WO2003080655A1 (es) |
Families Citing this family (115)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE0200943D0 (sv) | 2002-03-25 | 2002-03-25 | Amersham Biosciences Ab | Mutant protein |
SE0301936D0 (sv) * | 2003-06-30 | 2003-06-30 | Affibody Ab | New polypeptide |
SE0400274D0 (sv) * | 2004-02-09 | 2004-02-09 | Affibody Ab | New polypeptide |
US8597908B2 (en) * | 2004-07-06 | 2013-12-03 | Kaneka Corporation | Process for producing protein A-like protein with use of Brevibacillus genus bacterium |
AU2005317279C1 (en) * | 2004-12-14 | 2014-07-17 | Cytiva Bioprocess R&D Ab | Purification of immunoglobulins |
US8728828B2 (en) | 2004-12-22 | 2014-05-20 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Purification of immunoglobulins |
DK1869071T3 (da) | 2005-03-01 | 2011-02-28 | Affibody Ab | TNF-alfa-bindende polypeptid, anvendelser deraf og fremgangsmåder, der gør brug deraf |
EP1992692B1 (en) * | 2006-02-21 | 2013-01-09 | Protenova Co., Ltd. | Immunoglobulin affinity ligand |
CA2664530C (en) | 2006-09-29 | 2015-11-17 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Chromatography ligand comprising domain c from staphyloccocus aureus protein a for antibody isolation |
US7691608B2 (en) * | 2006-12-06 | 2010-04-06 | Repligen Corporation | Nucleic acids encoding recombinant protein A |
JP5522723B2 (ja) | 2007-05-21 | 2014-06-18 | ノマディックバイオサイエンス株式会社 | 新規ポリペプチド,アフィニティークロマトグラフィー用材,及びイムノグロブリンの分離及び/又は精製方法 |
SG149759A1 (en) | 2007-07-10 | 2009-02-27 | Millipore Corp | Media for affinity chromatography |
GB2452301A (en) | 2007-08-30 | 2009-03-04 | Ge Healthcare Bio Sciences Ab | Sterilization Method |
KR101104417B1 (ko) * | 2008-05-09 | 2012-01-16 | 한국생명공학연구원 | 단백질 g 변형체를 이용한 항체의 특이적 공유결합 커플링방법 |
CN102027010A (zh) * | 2008-05-15 | 2011-04-20 | 诺沃-诺迪斯克有限公司 | 抗体纯化方法 |
JP5677943B2 (ja) * | 2008-06-05 | 2015-02-25 | アフィボディ・アーベーAffibody Ab | ポリペプチド |
US8592555B2 (en) * | 2008-08-11 | 2013-11-26 | Emd Millipore Corporation | Immunoglobulin-binding proteins with improved specificity |
WO2010035757A1 (ja) * | 2008-09-25 | 2010-04-01 | Jsr株式会社 | アフィニティークロマトグラフィー用充填剤 |
JP5229888B2 (ja) * | 2008-09-30 | 2013-07-03 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 弱酸性域での易解離性を向上したプロテインa変異型タンパク質及び抗体捕捉剤 |
BRPI0919879A2 (pt) * | 2008-10-29 | 2016-02-16 | Wyeth Llc | métodos para purificação de moléculas de ligação a antígeno de domínio único |
SG162687A1 (en) * | 2008-12-24 | 2010-07-29 | Millipore Corp | Caustic stable chromatography ligands |
EP2389386A4 (en) * | 2009-01-12 | 2013-11-06 | Ge Healthcare Bio Sciences Ab | affinity chromatography |
JPWO2010110288A1 (ja) | 2009-03-24 | 2012-09-27 | 株式会社カネカ | 免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド |
KR101893225B1 (ko) | 2010-03-24 | 2018-08-29 | 가부시키가이샤 가네카 | 면역 글로불린에 특이적으로 결합하는 단백질 및 면역 글로불린 결합성의 친화성 리간드 |
WO2011125673A1 (ja) | 2010-03-31 | 2011-10-13 | Jsr株式会社 | アフィニティークロマトグラフィー用充填剤 |
US20130052209A1 (en) | 2010-04-23 | 2013-02-28 | Purdue Research Foundation | Protein drug formulations and packages |
WO2012001142A1 (en) | 2010-07-02 | 2012-01-05 | Novo Nordisk A/S | Improved antibody binding affinity ligands |
CA2815267C (en) * | 2010-10-27 | 2019-06-25 | Spiber Technologies Ab | Spider silk fusion protein structures for binding to an organic target |
CN103228328A (zh) * | 2010-11-29 | 2013-07-31 | 通用电气健康护理生物科学股份公司 | 亲和色谱基质 |
JP5974343B2 (ja) * | 2010-12-20 | 2016-08-23 | ジーイー・ヘルスケア・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ | アフィニティークロマトグラフィーマトリックス |
CN103269761B (zh) | 2010-12-20 | 2016-05-18 | 通用电气健康护理生物科学股份公司 | 亲和色谱基质 |
WO2012083425A1 (en) | 2010-12-21 | 2012-06-28 | The University Of Western Ontario | Novel alkali-resistant variants of protein a and their use in affinity chromatography |
US9040661B2 (en) | 2010-12-21 | 2015-05-26 | Jsr Corporation | Support for affinity chromatography and method for isolating immunoglobulin |
JPWO2012086837A1 (ja) * | 2010-12-24 | 2014-06-05 | 旭化成メディカル株式会社 | 温度応答性プロテインaの固定化方法 |
EP2666049B1 (en) | 2011-01-20 | 2018-02-28 | GE Healthcare Bio-Sciences Corp. | Light-scanning systems |
WO2012124145A1 (ja) | 2011-03-15 | 2012-09-20 | オムロン株式会社 | 演算ユニット、支援装置、支援プログラム、支援プログラムを格納した記憶媒体、および、支援装置における動作方法 |
WO2012128353A1 (ja) | 2011-03-24 | 2012-09-27 | 株式会社カネカ | タンパク性物質結合性低分子化合物 |
JP5933526B2 (ja) | 2011-03-25 | 2016-06-08 | 株式会社カネカ | 免疫グロブリン結合性新規ポリペプチド |
KR101678271B1 (ko) * | 2011-06-05 | 2016-11-21 | 애플 인크. | 다수의 애플리케이션들로부터 수신된 통지들을 디스플레이하기 위한 시스템들 및 방법들 |
SG186552A1 (en) | 2011-06-08 | 2013-01-30 | Emd Millipore Corp | Chromatography matrices including novel staphylococcus aureus protein a based ligands |
WO2013081540A1 (en) * | 2011-11-30 | 2013-06-06 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Affinity chromatography matrix |
US10189891B2 (en) | 2012-03-28 | 2019-01-29 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Affinity chromatography matrix |
CN104470607B (zh) * | 2012-05-02 | 2017-04-05 | 思百博技术股份公司 | 作为亲和配体的掺入有免疫球蛋白片段的蜘蛛丝融合蛋白结构 |
JP6335785B2 (ja) | 2012-09-03 | 2018-05-30 | 株式会社カネカ | ミックスモード抗体アフィニティー分離マトリックスとそれを用いた精製方法および標的分子 |
CN104718453B (zh) | 2012-10-03 | 2017-03-08 | Gyros专利公司 | 酸性条件下分析物测定用方法和试剂盒 |
EP2931400B1 (en) | 2012-12-14 | 2021-07-07 | Cytiva BioProcess R&D AB | Method for cleaning of packed bed chromatography columns |
CN104059133B (zh) * | 2013-03-18 | 2019-03-15 | 南京金斯瑞生物科技有限公司 | 一类突变的具有高耐碱特性的蛋白a及其应用 |
CN103214563B (zh) * | 2013-03-26 | 2015-09-30 | 江南大学 | 一种性能改进的重组金黄色葡萄球菌蛋白a亲和配基及其构建方法 |
US9896486B2 (en) * | 2013-07-10 | 2018-02-20 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Mutated immunoglobulin-binding polypeptides |
WO2015034000A1 (ja) | 2013-09-04 | 2015-03-12 | プロテノバ株式会社 | イムノグロブリン結合ドメイン多量体 |
WO2015034056A1 (ja) * | 2013-09-06 | 2015-03-12 | 株式会社カネカ | アフィニティー分離マトリックス用分離能強化リガンド |
CN105555795A (zh) | 2013-09-17 | 2016-05-04 | 株式会社钟化 | 新抗体纯化方法和由该方法得到的抗体、以及使用了阳离子交换基团的新抗体纯化法和由该方法得到的抗体 |
CN103540588B (zh) * | 2013-10-08 | 2016-06-08 | 杨波 | 一种基因工程改造的免疫球蛋白-亲和蛋白 |
JP6442409B2 (ja) | 2013-10-15 | 2018-12-19 | 株式会社カネカ | 多孔質セルロースビーズの製造方法 |
EP3059252B1 (en) | 2013-10-15 | 2018-12-05 | Kaneka Corporation | Production method for porous cellulose beads and absorbent employing same |
EP3059320A4 (en) | 2013-10-15 | 2017-06-21 | Kaneka Corporation | Production method for porous cellulose beads, and absorbent employing same |
CN104945488B (zh) * | 2014-03-27 | 2020-02-18 | 迈格生物医药(上海)有限公司 | 一种具有免疫球蛋白结合能力的多肽 |
CN105481954B (zh) * | 2014-09-16 | 2021-03-26 | 亿一生物制药(北京)有限公司 | 一种重组蛋白a及其应用 |
JP6369807B2 (ja) * | 2014-10-21 | 2018-08-08 | 株式会社プロテイン・エクスプレス | プロテインl変異体 |
US11566082B2 (en) * | 2014-11-17 | 2023-01-31 | Cytiva Bioprocess R&D Ab | Mutated immunoglobulin-binding polypeptides |
EP3233892B1 (en) | 2014-12-17 | 2024-03-13 | Cytiva BioProcess R&D AB | Modified kappa light chain-binding polypeptides |
JPWO2016121701A1 (ja) | 2015-01-26 | 2017-11-09 | 株式会社カネカ | 免疫グロブリンκ鎖可変領域含有タンパク質精製用アフィニティー分離マトリックス |
WO2016121703A1 (ja) | 2015-01-26 | 2016-08-04 | 株式会社カネカ | 変異型免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド |
EP3255058B1 (en) | 2015-02-05 | 2021-03-24 | Mitsubishi Chemical Corporation | Protein having affinity to immunoglobulin, and affinity separation medium and column for liquid chromatography using same |
JP6705806B2 (ja) * | 2015-03-26 | 2020-06-03 | Jsr株式会社 | イムノグロブリン結合タンパク質およびそれを用いたアフィニティー担体 |
CN106188251B (zh) * | 2015-05-06 | 2020-07-31 | 上海迈泰君奥生物技术有限公司 | 一种免疫球蛋白结合蛋白突变体及其用途 |
CN107849088A (zh) * | 2015-07-22 | 2018-03-27 | 株式会社钟化 | 抗体样蛋白质的纯化方法 |
WO2017014257A1 (ja) * | 2015-07-22 | 2017-01-26 | 株式会社カネカ | 酸性pH領域での抗体結合能が低下した抗体結合性タンパク質 |
GB201515339D0 (en) | 2015-08-28 | 2015-10-14 | Ge Healthcare Bio Sciences Ab | A seperation matrix and a method of seperating antibodies |
KR101993845B1 (ko) * | 2016-02-18 | 2019-06-28 | (주)에이피테크놀로지 | 알칼리 저항성이 증대된 항체 친화성 리간드 |
WO2017191748A1 (ja) * | 2016-05-02 | 2017-11-09 | 株式会社カネカ | 改変型免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド |
WO2017195638A1 (ja) | 2016-05-09 | 2017-11-16 | 株式会社カネカ | 抗体またはκ鎖可変領域含有抗体断片の精製方法 |
US10889615B2 (en) | 2016-05-11 | 2021-01-12 | Cytiva Bioprocess R&D Ab | Mutated immunoglobulin-binding polypeptides |
US10730908B2 (en) | 2016-05-11 | 2020-08-04 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Separation method |
US10654887B2 (en) | 2016-05-11 | 2020-05-19 | Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab | Separation matrix |
US10703774B2 (en) | 2016-09-30 | 2020-07-07 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Separation method |
US11753438B2 (en) | 2016-05-11 | 2023-09-12 | Cytiva Bioprocess R&D Ab | Method of cleaning and/or sanitizing a separation matrix |
CN109071613A (zh) * | 2016-05-11 | 2018-12-21 | 通用电气医疗集团生物工艺研发股份公司 | 分离基质 |
WO2017194592A1 (en) * | 2016-05-11 | 2017-11-16 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Method of storing a separation matrix |
KR101857953B1 (ko) * | 2016-07-06 | 2018-05-16 | 아미코젠주식회사 | 알칼리 내성이 증가된 변이 면역글로불린 결합 단백질 |
CN106117324A (zh) * | 2016-07-29 | 2016-11-16 | 湖北爱晟生物科技有限公司 | 重组蛋白a及其编码基因和应用 |
JP6951417B2 (ja) * | 2016-08-11 | 2021-10-20 | レプリゲン・コーポレイションRepligen Corporation | アフィニティークロマトグラフィーのためのFC−結合タンパク質、並びにFc−結合タンパク質を含むアフィニティー分離マトリックスおよびその使用 |
WO2018048941A2 (en) * | 2016-09-08 | 2018-03-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Use of high affinity monoclonal antibody product binders to increase the duration of action of therapeutic monoclonal antibody products in a biologic tissue |
CN106543274B (zh) * | 2016-10-18 | 2020-10-27 | 天津大学 | 一种对抗体具有特异性结合作用的a蛋白结构域z的衍生物及其应用 |
CA3046561A1 (en) | 2016-12-12 | 2018-06-21 | Hurrah S.A R.L. | Compositions and methods for increasing the immunoglobulin binding capacities of immunoglobulin-binding polypeptides and oligopeptides |
GB201703116D0 (en) | 2017-02-27 | 2017-04-12 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | A seperation matrix and a method of seperating antibodies |
US11779860B2 (en) | 2017-08-07 | 2023-10-10 | Repligen Corporation | Fc binding proteins with cysteine in the C-terminal helical region |
CN109721645A (zh) * | 2017-12-29 | 2019-05-07 | 兆生生物科技南京有限公司 | 一种基因突变的蛋白a及其应用 |
CN111902720A (zh) | 2018-03-21 | 2020-11-06 | 沃特世科技公司 | 基于非抗体高亲和力的样品制备、吸附剂、装置和方法 |
US20210179671A1 (en) * | 2018-08-24 | 2021-06-17 | Jsr Corporation | Immunoglobulin-binding protein, and affinity carrier using same |
WO2020075670A1 (ja) * | 2018-10-10 | 2020-04-16 | 国立大学法人鹿児島大学 | IgG結合性ペプチドを含む固相担体及びIgGの分離方法 |
US20220112236A1 (en) * | 2019-02-01 | 2022-04-14 | Navigo Proteins Gmbh | Immunoglobulin binding proteins for affinity purification |
WO2020196938A1 (ko) * | 2019-03-25 | 2020-10-01 | 아미코젠주식회사 | 불순물 제거능이 우수한 항체 정제용 레진 |
GB201904125D0 (en) | 2019-03-26 | 2019-05-08 | Ge Healthcare Bio Sciences Ab | Method for sanitization of a chromatography column |
JP2022530852A (ja) * | 2019-04-17 | 2022-07-04 | ブリストル-マイヤーズ スクイブ カンパニー | クロマトグラフィー樹脂の再生方法 |
EP3962923B1 (en) | 2019-04-29 | 2023-04-19 | Cytiva BioProcess R&D AB | Method for separation of antibodies or antibody fragments being devoid of an fc region capable of binding to protein a |
CN112210013A (zh) | 2019-07-03 | 2021-01-12 | 拜奥普罗塞亚科技有限责任公司 | 碱耐受性亲和色谱配体 |
TW202128230A (zh) | 2019-10-18 | 2021-08-01 | 日商日本醫事物理股份有限公司 | 具有經ri標定之人類化抗體的複合體、放射性醫藥 |
CN111057153B (zh) * | 2019-12-06 | 2021-09-07 | 广州康盛生物科技股份有限公司 | 一种免疫球蛋白结合蛋白及其制备方法和应用 |
CN112461943A (zh) * | 2020-10-12 | 2021-03-09 | 河南省奶牛生产性能测定有限公司 | 一种牛乳中免疫球蛋白igG高效液相色谱检测方法 |
KR20230112616A (ko) | 2020-10-13 | 2023-07-27 | 아비타이드 엘엘씨 | 3중-나선 번들 단백질들의 친화성 리간드 라이브러리 및 이의 용도 |
GB202018588D0 (en) | 2020-11-26 | 2021-01-13 | Cytiva Bioprocess R & D Ab | Separation matrix |
US20240076327A1 (en) | 2020-12-21 | 2024-03-07 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidal hexatoxin polypeptides and methods of use thereof |
CN117241866A (zh) | 2021-02-19 | 2023-12-15 | 艾维泰有限责任公司 | Aav2亲和剂 |
TW202308706A (zh) | 2021-04-21 | 2023-03-01 | 日商日本醫事物理股份有限公司 | 放射性抗腫瘤劑 |
CA3217638A1 (en) | 2021-04-21 | 2022-10-27 | Nihon Medi-Physics Co., Ltd. | Humanised antibodies labelled with radionuclides that emit .beta.-rays |
GB2609185A (en) | 2021-05-24 | 2023-02-01 | Astrea Uk Services Ltd | Scaffold for isolation of a biomolecule |
GB202109246D0 (en) | 2021-06-28 | 2021-08-11 | Cytiva Bioprocess R & D Ab | A method of separating bispecific antibodies |
GB202113626D0 (en) | 2021-09-24 | 2021-11-10 | Cytiva Bioprocess R & D Ab | FC binding polypeptides |
CN114315996B (zh) * | 2021-12-31 | 2023-01-17 | 博格隆(浙江)生物技术有限公司 | 一种重组ProteinA蛋白及亲和层析介质的制备方法 |
CN114409748A (zh) * | 2022-01-28 | 2022-04-29 | 博格隆(浙江)生物技术有限公司 | 蛋白a的b结构域和z结构域突变体及其应用 |
GB202203478D0 (en) | 2022-03-14 | 2022-04-27 | Cytiva Bioprocess R & D Ab | Vh3 binding polypeptides |
CN114605508B (zh) * | 2022-05-11 | 2022-07-29 | 北京达成生物科技有限公司 | 能够结合于抗体分子Fc区域的抗体结合蛋白及其应用 |
CN117700501A (zh) * | 2022-09-13 | 2024-03-15 | 普米斯生物技术(珠海)有限公司 | 免疫球蛋白结合蛋白及其应用 |
CN117024529B (zh) * | 2023-07-17 | 2024-01-26 | 北京达成生物科技有限公司 | 抗体结合蛋白及其应用 |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE8505922D0 (sv) | 1985-12-13 | 1985-12-13 | Kabigen Ab | Construction of an igg binding protein to facilitate downstream processing using protein engineering |
EP0550771B1 (en) | 1991-07-25 | 1999-09-29 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Immunoglobulin-binding artificial protein |
SE9400088D0 (sv) * | 1994-01-14 | 1994-01-14 | Kabi Pharmacia Ab | Bacterial receptor structures |
US5834597A (en) * | 1996-05-20 | 1998-11-10 | Protein Design Labs, Inc. | Mutated nonactivating IgG2 domains and anti CD3 antibodies incorporating the same |
GB9823071D0 (en) | 1998-10-21 | 1998-12-16 | Affibody Technology Ab | A method |
US7709209B2 (en) * | 2002-03-25 | 2010-05-04 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Protein ligands |
SE0200943D0 (sv) * | 2002-03-25 | 2002-03-25 | Amersham Biosciences Ab | Mutant protein |
ATE416190T1 (de) * | 2003-07-04 | 2008-12-15 | Affibody Ab | Polypeptide mit bindungsaffinität für her2 |
US8728828B2 (en) * | 2004-12-22 | 2014-05-20 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Purification of immunoglobulins |
DK1869071T3 (da) * | 2005-03-01 | 2011-02-28 | Affibody Ab | TNF-alfa-bindende polypeptid, anvendelser deraf og fremgangsmåder, der gør brug deraf |
EP2389386A4 (en) * | 2009-01-12 | 2013-11-06 | Ge Healthcare Bio Sciences Ab | affinity chromatography |
WO2012083425A1 (en) * | 2010-12-21 | 2012-06-28 | The University Of Western Ontario | Novel alkali-resistant variants of protein a and their use in affinity chromatography |
US9896486B2 (en) * | 2013-07-10 | 2018-02-20 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Mutated immunoglobulin-binding polypeptides |
US11566082B2 (en) * | 2014-11-17 | 2023-01-31 | Cytiva Bioprocess R&D Ab | Mutated immunoglobulin-binding polypeptides |
US10654887B2 (en) * | 2016-05-11 | 2020-05-19 | Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab | Separation matrix |
US10703774B2 (en) * | 2016-09-30 | 2020-07-07 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Separation method |
US10730908B2 (en) * | 2016-05-11 | 2020-08-04 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Separation method |
-
2002
- 2002-03-25 SE SE0200943A patent/SE0200943D0/xx unknown
-
2003
- 2003-03-20 AU AU2003217119A patent/AU2003217119B2/en not_active Expired
- 2003-03-20 ES ES08004374.8T patent/ES2634145T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-20 KR KR1020047015303A patent/KR101067181B1/ko active IP Right Grant
- 2003-03-20 CN CN2011104134571A patent/CN102558317A/zh active Pending
- 2003-03-20 US US10/508,625 patent/US7834158B2/en active Active
- 2003-03-20 EP EP08004374.8A patent/EP1972689B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-20 DE DE60327606T patent/DE60327606D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-20 CN CN2011104134586A patent/CN102558318A/zh active Pending
- 2003-03-20 AT AT03713152T patent/ATE431360T1/de not_active IP Right Cessation
- 2003-03-20 EP EP17166519.3A patent/EP3249047B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-20 ES ES03713152T patent/ES2325362T5/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-20 WO PCT/SE2003/000475 patent/WO2003080655A1/en active Application Filing
- 2003-03-20 CN CN201110407855.2A patent/CN102532284B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-20 CN CN2011104078514A patent/CN102516372A/zh active Pending
- 2003-03-20 JP JP2003578408A patent/JP4391830B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-20 KR KR1020127028734A patent/KR101307651B1/ko active IP Right Grant
- 2003-03-20 DK DK17166519.3T patent/DK3249047T3/da active
- 2003-03-20 KR KR1020127028735A patent/KR101307714B1/ko active IP Right Grant
- 2003-03-20 CN CN2011104078321A patent/CN102516371A/zh active Pending
- 2003-03-20 KR KR1020107026798A patent/KR101307700B1/ko active IP Right Grant
- 2003-03-20 DK DK08004374.8T patent/DK1972689T3/en active
- 2003-03-20 ES ES17166519T patent/ES2783876T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-20 EP EP03713152A patent/EP1485407B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-20 CA CA2479896A patent/CA2479896C/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-20 CN CN038067935A patent/CN1642976B/zh not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-03-13 US US11/374,532 patent/US20060194950A1/en not_active Abandoned
-
2009
- 2009-09-29 US US12/568,854 patent/US8354510B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2010
- 2010-10-08 US US12/900,958 patent/US8198404B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2012
- 2012-06-05 US US13/488,662 patent/US9156892B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2013
- 2013-01-14 US US13/740,793 patent/US9296791B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2015
- 2015-09-04 US US14/845,817 patent/US9534023B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2016
- 2016-12-02 US US15/367,640 patent/US10918971B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2021
- 2021-01-20 US US17/153,015 patent/US20210162319A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2325362T3 (es) | Una proteina mutada de union a inmunoglobulina. | |
US7709209B2 (en) | Protein ligands | |
JP5974343B2 (ja) | アフィニティークロマトグラフィーマトリックス | |
JP2016523959A (ja) | 突然変異免疫グロブリン結合ポリペプチド | |
JP2014502272A (ja) | アフィニティークロマトグラフィーマトリックス | |
CN114591407A (zh) | 耐碱蛋白a变体及其应用 |