CN103214563B

CN103214563B - 一种性能改进的重组金黄色葡萄球菌蛋白a亲和配基及其构建方法

Info

Publication number: CN103214563B
Application number: CN201310097553.9A
Authority: CN
Inventors: 夏海锋; 吴璞强; 梁振东; 王沙莉; 郑梦杰
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiaxing Qianchun Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2013-03-26
Filing date: 2013-03-26
Publication date: 2015-09-30
Anticipated expiration: 2033-03-26
Also published as: CN103214563A

Abstract

本发明公开了一种性能改进的重组金黄色葡萄球菌蛋白A亲和配基及其构建方法。本发明利用分子生物学方法，选取天然蛋白A的B序列进行分子改造，在B序列的C端添加2个半胱氨酸，从而可以将蛋白A通过双位点偶联的层析基质，使连接更加稳定，在B序列第二个Loop后面添加了6个甘氨酸增加其长度，降低与抗体之间的结合力，从而使洗脱条件更加温和。在此基础上对蛋白A耐高浓度碱的性能进行改造，将B序列第23、30位的天冬酰胺和苯丙氨酸分别替换成苏氨酸和丙氨酸，得到耐碱性能更高的Z序列。然后，利用同尾酶将不同数量的Z序列首尾串联，并利用大肠杆菌的高效表达***进行过量表达。将表达的重组蛋白A偶联到琼脂糖基质制备亲和层析填料，并用于纯化抗体，结果表明本发明制备的重组蛋白A亲和配基具有较好的洗脱性能和耐碱性能。

Description

一种性能改进的重组金黄色葡萄球菌蛋白A亲和配基及其构建方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种性能改进的重组金黄色葡萄球菌蛋白A亲和配基及其构建方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌蛋白A简称蛋白A，是金黄色葡萄球菌表面的一种蛋白质，通过共价键连接到胞壁肽聚糖。蛋白A分子中存在五个同源性很高的E、D、A、B、C序列，由于能和人及多种哺乳动物IgG的Fc段结合，因此称之为抗体结合区。蛋白A与抗体的Fc段结合并不影响抗体对抗原的吸附活性，因此被广泛应用于抗体的亲和纯化。由于B结构域对抗体的结合力最稳定，而且本身结构也最稳定，因此人们对B序列的研究最多。B序列由3个α螺旋和连接螺旋片段的两个Loop组成，按照从N端到C端的顺序依次是Helix1-Loop1-Helix2-Loop2-Helix3。

以蛋白A为亲和配基吸附IgG时结合力很强，需要使用较低pH洗脱液(pH3.0左右)，往往会影响IgG的活性。蛋白A亲和层析柱在使用过程中会在柱内残留核苷酸、变性蛋白质、脂类和微生物等杂质，需要使用在位清洗进行清除，其中NaOH是工业生产中较为廉价和常用的清洗液。天然蛋白A虽然对碱性环境有着较好的耐受性，但是仍然不能满足长期使用强碱对其进行清洗。尽管天然蛋白A抗体结合区的E、D、A、B、C五个结构域彼此之间有很高的同源性，但是它们对IgG的结合能力存在差异，导致最适洗脱条件不一样。

因此，本发明针对以上几点，选取B结构域对天然蛋白A进行分子改造。利用分子生物学方法从核苷酸序列上进行改造和连接，利用大肠杆菌高效表达***实现高效表达，得到一系列个改造序列串联组成而且C端添加一个半胱氨酸的重组蛋白A，将得到的重组蛋白A作为亲和配基制备亲和层析填料，用于抗体的分离纯化，具备较温和洗脱性能和较高的耐碱性能。

发明内容

本发明的目的是提供一种性能改进的重组金黄色葡萄球菌蛋白A亲和配基，用于抗体制备的亲和层析填料，具有较好的洗脱性能和耐碱性能。

所述的重组蛋白A亲和配基由1到10个Z序列串联构成的一系列蛋白质。Z序列是B序列经过改造后的产物，与B序列的区别在于在Loop2与Helix3之间添加6个甘氨酸，并将第23、30位的天冬酰胺和苯丙氨酸分别替换成苏氨酸和丙氨酸，为了实现蛋白A与填料基质更稳定的连接，在B蛋白序列的C端添加了2个半胱氨酸，从而实现与基质实现双位点连接。将表达Z序列的基因命名为z，利用同尾酶将1到10个不同数量的z串联，所表达的重组蛋白A中每两个Z序列均由两个丝氨酸相连接。

所述的性能改进的重组蛋白A亲和配基的构建方法的步骤为：

(1)引物设计

本发明对蛋白A的B片段进行分子改造，根据重叠PCR和同尾酶连接原理设计引物，将改造后的B片段命名为Z，改造内容为Z(6G)的改造、Z(N23T，F30A)的改造、C端半胱氨酸的添加和1到10个z核苷酸序列的拼接，其中Z(6G)的改造是在B序列第二个Loop后面添加6个甘氨酸增加Loop2长度，从而降低其与抗体的结合力强度，使洗脱更容易进行，Z(N23T，F30A)的改造是对B序列的第23、30位的天冬酰胺和苯丙氨酸进行定点突变，分别替换为苏氨酸和丙氨酸，减少B序列的脱酰胺作用，增强对高浓度碱液的耐受性能，C端半胱氨酸的添加是在B序列的C端添加3个半胱氨酸，以实现重组蛋白A亲和配基与琼脂糖填料基质实现双位点连接，在引物中添加Nhe I、Xba I、Noc I和BamH I四个酶切位点，利用同尾酶作用原理将不同个数的z核苷酸序列首尾相连，组成含有不同个数z序列串联的重组蛋白A表达基因；

(2)重组菌的构建

本发明根据步骤(1)所设计的引物，以金黄色葡萄球菌基因组为模板进行重叠PCR，获得所需的目的核苷酸序列z，利用T载体pMD18-T构建重组质粒pMD18-T-z₁，转化感受态E.coliJM109进行甘油冻管保藏，以此为基础进行不同个数z序列(z_n)的构建，然后利用Noc I和BamH I两个酶切位点将构建好的z_n序列与表达质粒pET-28a进行酶切连接，得到重组表达质粒pET-28a-z_n，最后转化感受态E.coli BL21(DE3)，得到重组蛋白A的表达菌株E.coliBL21(DE3)/pET-28a-z_n，制备甘油冻管保藏备用；

(3)重组蛋白A的表达

本发明利用IPTG对步骤(2)所构建的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-z_n进行诱导表达，获得具有1-10个Z片段串联的重组蛋白A，以Z_n表示n(n为1-10)个Z片段串联的重组蛋白A。

本发明利用分子生物学方法对天然蛋白A的B序列进行分子改造，首次对蛋白A的B序列同时进行洗脱性能和耐碱性能的改造，以及实现将改造后的1到10个z紧密串联，构建重组表达质粒pET-28a-z_n并转化感受态E.coli BL21(DE3)进行表达。

利用本发明表达的重组蛋白A作为亲和配基制备亲和层析填料对抗体具有较好的结合能力、洗脱性能和耐碱性能：使用pH4.0、5.0和6.0的洗脱液分别可以实现97.7％、89.4％和67.5％的洗脱率；使用2.0mol/L的NaOH溶液浸泡7h和14h，牛初乳IgG结合率分别为86.1％和72.8％。

本发明的关键在于：对B序列进行洗脱性能改造，在B序列Loop2和Helix3之间添加6个甘氨酸，使洗脱条件更加温和；对B序列耐碱性能改造，利用重叠PCR技术将第23、30位的天冬酰胺和苯丙氨酸分别替换为苏氨酸和丙氨酸，减少脱酰胺作用，增强序列对高浓度碱溶液的耐受性能；利用同尾酶作用原理，将不同个数z序列进行串联，经过转化和诱导表达得到一系列包含不同个数Z片段的重组蛋白A。

附图说明

图1是本发明一种性能改进的重组金黄色葡萄球菌蛋白A表达的SDS-PAGE验证图。1，marker；2，E.coli BL21(DE3)/pET28a-z₅；3，E.coli BL21(DE3)/pET28a。

图2是本发明制备的重组金黄色葡萄球菌蛋白A亲和层析填料纯化牛初乳IgG的过程图。

图3是本发明制备的重组金黄色葡萄球菌蛋白A亲和层析填料纯化牛初乳IgG的SDS-PAGE验证图。1，marker；2，洗脱液；3，穿透液；4，粗样品IgG。

图4是本发明制备的重组金黄色葡萄球菌蛋白A亲和配基的洗脱性能分析。

图5是本发明制备的重组金黄色葡萄球菌蛋白A亲和配基的耐碱性能分析。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步描述：

(1)引物设计

实施例1

使用重叠PCR技术对蛋白A的B片段进行改造，并将改造后的B片段命名为Z片段，其表达基因为z。根据GeneBank提供的基因序列，利用分子生物软件DNAMAN设计z序列的正向引物F₀和反向引物R₀：

F₀：CGGATAACAAATTCAAC

R₀：TTAGCAACA TTTTGGTGCTTGTGC。

正向引物和反向引物分别引入Noc I和BamH I酶切位点，其中斜体部分为酶切位点，下划线部分为添加的两个半胱氨酸的密码子。

在B片段第二个Loop后面添加6个甘氨酸，降低蛋白A与IgG的结合力强度，表示为Z(6G)；为了增加蛋白A的耐碱性能，将第23位的天冬酰胺和第30位的苯丙氨酸分别替换成苏氨酸和丙氨酸，用Z(N23T，F30A)表示。根据GeneBank提供的基因序列设计z基因序列：GCGGATAACAAATTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTACATTTACCTAACTTAACCGAAGAACAACGCAATGGTGCCATCCAAAGCTTAAAAGATGACCCAAGCCAAGGTGGCGGAGGGGGCGGTAGCGCTAACCTTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAATGATGCACAAGCACCAAAA TGTTGCTAA其中下划线标记的是基因改造部分，斜体标记部分是酶切位点，在z前端添加Nhe I和Noc I两个酶切位点，后端添加XbaI和BamH I两个酶切位点。根据重叠PCR原理，利用分子生物软件DNAMAN设计两对引物：

F₁：ATGACCCAAGCCAAGGTGGCGGAGGGGGCGGTAGCGCTAACCTTTTA

R₁：TAAAAGGTTAGCGCTACCGCCCCCTCCGCCACCTTGGCTTGGGTC

F₂：ACTTAACCGAAGAACAACGCAATGGTGCCATCCAAAGCTTAA

R₂：TTGGATGGCACCATTGCGTTGTTCTTCGGTTAAGT

其中F₁和R₁分别是Z(6G)的正、反向引物，F₂和R₂分别是Z(N23T，F30A)的正、反向引物。将所设计的引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

(2)重组载体pMD18-T-z₁的构建

实施例2

提取金黄色葡萄球菌DNA，利用实施例1设计的F₀、R₀为引物，金黄色葡萄球菌DNA为模板，利用Pfu DNA聚合酶对B序列进行PCR。按照Pfu DNA聚合酶说明书，选择50μL进行。

PCR反应条件：预变性94℃反应5min；变性94℃反应40s，退火温度56℃反应1min30s，延伸温度72℃延伸30s，进行30个循环；最后72℃保持10min。

利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收B片段。使用重叠PCR的方法，利用Pfu DNA高保真聚合酶，以回收到的B片段为模板，分别以实施例1设计的F₀和R₁、F₁和R₀为引物进行PCR，反应体系和条件同上。将PCR回收产物按照体积比1∶1混合，将该混合物作为模板，以F₀和R₀为模板进行PCR，反应体系和条件同上，琼脂糖凝胶回收增加6个甘氨酸密码子的序列。再以相同的方法和体系对耐碱性进行突变，分别以实施例1设计的F₀和R₂、F₂和R₀以及F₀和R₀为引物，以得到的改造后的序列为模板进行重叠PCR，胶回收得到z序列。以F₀和R₀为引物、z序列为模板，利用Ex-Taq DNA聚合酶进行PCR，反应体系和条件同上，得到两端各带有一个腺嘌呤的z序列，利用碱基互补配对原则将z序列连接到T载体pMD18-T上，得到重组质粒pMD18-T-z₁。将重组质粒转化感受态E.coli JM109，得到重组菌E.coliJM109/pMD18-T-z₁进行甘油冻管保藏备用。

(3)重组载体pET-28a-z_n的构建

实施例3

z_n表示n(n为1-10)个z序列首尾相连。以Nhe I和BamHI作为第一组限制内切酶，XbaI和BamH I作为第二组限制内切酶。过夜培养实施例2得到的重组菌E.coliJM109/pMD18-T-z₁，质粒提取pMD18-T-z₁，用两组酶分别对重组质粒pMD18-T-z₁进行酶切反应。胶回收两组酶切产物，利用T4DNA连接酶将两组产物于16℃过夜连接，得到含有两个z序列首尾相连的重组质粒pMD18-T-z₂，将pMD18-T-z₂的转化到感受态E.coli JM109进行保存。

实施例4

过夜培养实施例3得到的重组菌E.coli JM109/pMD18-T-z₂，提取质粒pMD18-T-z₂，利用实施例3的第二组限制性内切酶对pMD18-T-z₁进行酶切，第一组限制性内切酶对pMD18-T-z₂进行酶切，将两组所得的酶切产物回收后进行连接得到含有3个z序列首尾相连的重组质粒pMD18-T-z₃，转化感受态E.coli JM109进行保存。根据相同的方法，利用实施例3提到的两组酶分别对pMD18-T-z₂进行酶切，将两组所得的酶切产物进行连接，可得到含有4个z序列首尾相连的重组质粒pMD18-T-z₄，转化感受态E.coli JM109进行保存；利用实施例3的一组酶对pMD18-T-z₂进行酶切，另一组酶对pMD18-T-z₃进行酶切，将两组所得的酶切产物进行连接，可得到含有5个z序列首尾相连的重组质粒pMD18-T-z₅，转化感受态E.coli JM109进行保存；利用实施例3提到的两组酶分别对pMD18-T-z₃进行酶切，将两组所得的酶切产物进行连接，可得到含有6个z序列首尾相连的重组质粒pMD18-T-z₆，转化感受态E.coli JM109进行保存；利用实施例3的一组酶对pMD18-T-z₃进行酶切，另一组酶对pMD18-T-z₄进行酶切，将两组所得的酶切产物进行连接，可得到含有7个z序列首尾相连的重组质粒pMD18-T-z₇，转化感受态E.coli JM109进行保存；利用实施例3提到的两组酶分别对pMD18-T-z₄进行酶切，将两组所得的酶切产物进行连接，可得到含有8个z序列首尾相连的重组质粒pMD18-T-z₈，转化感受态E.coli JM109进行保存；利用实施例3的一组酶对pMD18-T-z₄进行酶切，另一组酶对pMD18-T-z₅进行酶切，将两组所得的酶切产物进行连接，可得到含有9个z序列首尾相连的重组质粒pMD18-T-z₉，转化感受态E.coli JM109进行保存；利用实施例3提到的两组酶分别对pMD18-T-z₅进行酶切，将两组所得的酶切产物进行连接，可得到含有10个z序列首尾相连的重组质粒pMD18-T-z₁₀，转化感受态E.coli JM109进行保存。

实施例5

过夜培养实验室保藏菌株E.coli JM109/pET-28a和实施例4所得10株重组菌E.coliJM109/pMD18-T-z_1-10，提取质粒，利用限制性内切酶Noc I和BamH I对质粒pET-28a和pMD18-T-z_1-10进行酶切，将酶切产物胶回收后进行连接既得重组质粒pET-28a-z_1-10，转化感受态E.coli BL21(DE3)，得到10株表达不同片段长度重组蛋白A的基因工程菌E./oliBL21(DE3)/pET-28a-z_1-10，甘油冻管保藏。

实施例6

用烯丙基缩水甘油醚和NHS对Sepharose4FF进行活化和修饰，保藏备用。将实施例5所得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-z₅过夜培养后进行超声破碎，利用IgG亲和层析填料纯化所表达的Z₅蛋白片段，将纯化产物进行冷冻干燥备用。将制备的Z₅蛋白片段配成适当浓度溶液，偶联到经修饰的Sepharose4FF制备重组蛋白A亲和层析填料。

实施例7

基于purifier层析***，将实施例6制备的重组蛋白A亲和层析填料装柱进行性能测试。配制不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液作为洗脱液，检测填料的洗脱性能。使用pH4.0、5.0和6.0的洗脱液进行洗脱，分别实现了97.7％、89.4％和67.5％的洗脱率。使用2.0mol/L的NaOH溶液浸泡7h和14h后，本发明重组蛋白A制备的亲和填料对IgG的结合率分别为86.1％和72.8％。

Claims

1.一种性能改进的重组金黄色葡萄球菌蛋白A亲和配基，其特征在于：所述重组金黄色葡萄球菌蛋白A亲和配基由1到10个Z序列串联构成的一系列蛋白质，Z序列是B序列经过改造后的产物，与B序列的区别在于在Loop2与Helix3之间添加6个甘氨酸，并将第23、30位的天冬酰胺和苯丙氨酸分别替换成苏氨酸和丙氨酸，为了实现蛋白A与填料基质更稳定的连接，在B蛋白序列的C端添加了2个半胱氨酸，从而实现与基质实现双位点连接，将表达Z序列的基因命名为z，利用同尾酶将1到10个不同数量的z串联，所表达的重组蛋白A中每两个Z序列均由两个丝氨酸相连接；

其中，所述改造，其改造内容为Z(6G)的改造、Z(N23T，F30A)的改造、C端半胱氨酸的添加和1到10个z核苷酸序列的拼接，其中Z(6G)的改造是在所述B序列第二个Loop后面添加6个甘氨酸增加Loop2长度，从而降低其与抗体的结合力强度，使洗脱更容易进行，Z(N23T，F30A)的改造是对B序列的第23、30位的天冬酰胺和苯丙氨酸进行定点突变，分别替换为苏氨酸和丙氨酸，减少B序列的脱酰胺作用，增强对高浓度碱液的耐受性能，C端半胱氨酸的添加是在B序列的C端添加2个半胱氨酸，以实现重组蛋白A亲和配基与琼脂糖填料基质实现双位点连接，在引物中添加Nhe I、Xba I、Noc I和BamH I四个酶切位点，利用同尾酶作用原理将不同个数的z核苷酸序列首尾相连，组成含有不同个数z序列串联的重组蛋白A表达基因；所述Z序列的基因序列如序列表SEQ ID.3所示。

2.根据权利要求1所述的一种性能改造的重组金黄色葡萄球菌蛋白A亲和配基，其特征在于：所述Z序列的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.8所示。

3.根据权利要求1所述的一种性能改造的重组金黄色葡萄球菌蛋白A亲和配基，其特征在于：1到10个Z序列串联后的氨基酸序列分别如序列表SEQ ID No.8-17所示。

4.一种如权利要求1所述的性能改造的重组金黄色葡萄球菌蛋白A亲和配基的构建方法，其特征在于：克隆并改造Z基因序列的3对引物F₀和R₀、F₁和R₁、F₂和R₂，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7，利用重叠PCR得到z序列，使用一组同尾酶和限制性内切酶BamH I将1到10个z序列进行串联得到z_n序列，利用一组限制性内切酶将z_n连接到质粒pET-28a，转化感受态E.coli BL21(DE3)得到产不同个数z序列串联的重组蛋白A菌株，通过一定终浓度的IPTG诱导获得由1-10个z序列组成的重组金黄色葡萄球菌蛋白A亲和配基。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述同尾酶是Nhe I和Xba I。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述限制性内切酶是Noc I和BamH I。