KR20080025039A

KR20080025039A - 단백질 키나제 억제제로서의 화합물 및 조성물

Info

Publication number: KR20080025039A
Application number: KR1020077026230A
Authority: KR
Inventors: 아드바이트 네이글; 나타나엘 쉬안더 그레이; 이 리우; 핑다 렌; 태보 심; 수리 유
Original assignee: 아이알엠 엘엘씨
Priority date: 2005-05-13
Filing date: 2006-05-10
Publication date: 2008-03-19
Also published as: PL1891066T3; AU2006247757A1; PE20061366A1; CN101175753B; RU2411242C2; WO2006124462A3; EP1891066B1; US8183248B2; AU2006247757B2; RU2007145935A; EP1891066A2; CN101175753A; ATE492545T1; US20090118273A1; GT200600197A; WO2006124462A2; AR056346A1; JP5016593B2; CA2607299A1; BRPI0610278A2

Abstract

본 발명은 신규 부류의 화합물, 상기 화합물을 포함하는 제약 조성물 및 비정상적 또는 탈조절된 키나제 활성과 연관된 질환 또는 장애, 특히 Abl, Bcr-Abl, Bmx, BTK, b-RAF, c-RAF, CSK, cSRC, Fes, FGFR3, Flt3, IKKα, IKKβ, JNK1α1, JNK2α2, Lck, Met, MKK4, MKK6, p70S6K, PAK2, PDGFRα, PKA, PKCα, PKD2, ROCK-II, Ros, Rsk1, SAPK2α, SAPK2β, SAPK3, SAPK4, SGK, Syk, Tie2 및 TrkB 키나제의 비정상적 활성화를 수반하는 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 상기 화합물의 사용 방법을 제공한다.

키나제, 백혈병, 암, 심혈관 질환

Description

단백질 키나제 억제제로서의 화합물 및 조성물 {COMPOUNDS AND COMPOSITIONS AS PROTEIN KINASE INHIBITORS}

단백질 키나제는 다양한 세포 과정의 조절 및 세포 기능에 대한 조절 유지에 중요한 역할을 하는 단백질의 광범위한 족을 나타낸다. 상기 키나제의 부분적이고 비제한적인 목록에는 수용체 티로신 키나제, 예컨대 혈소판-유래 성장 인자 수용체 키나제 (PDGF-R), 신경 성장 인자 수용체, trkB, Met, 및 섬유모세포 성장 인자 수용체, FGFR3; 비-수용체 티로신 키나제, 예컨대 Abl 및 융합 키나제 BCR-Abl, Lck, Csk, Fes, Bmx 및 c-src; 및 세린/트레오닌 키나제, 예컨대 c-RAF, sgk, MAP 키나제 (예를 들어, MKK4, MKK6 등) 및 SAPK2α, SAPK2β 및 SAPK3가 포함된다. 이상 키나제 활성은 양성 및 악성 증식성 장애뿐만 아니라 면역계 및 신경계의 부적절한 활성화에 기인한 질환을 비롯한 다수의 질환 상태에서 관찰되어 왔다.

본 발명의 신규 화합물은 1종 이상의 단백질 키나제의 활성을 억제하며, 따라서 키나제-연관 질환의 치료에 유용할 것으로 예상된다.

발명의 개요

제1 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물, 및 그의 N-옥시드 유도체, 프로드러그 유도체, 보호된 유도체, 개별 이성질체 및 이성질체 혼합물; 및 상기 화합물의 제약상 허용가능한 염 및 용매화물 (예를 들어 수화물)을 제공한다.

식 중:

n은 0, 1 및 2로부터 선택되고;

m은 0, 1 및 2로부터 선택되고;

Y₁은 N 및 CR₅로부터 선택되고; 여기서 R₅는 수소 및 C₁ _- ₆알킬로부터 선택되고;

Y₂는 O 및 S로부터 선택되고;

R₁은 수소 및 C₁ _- ₆알킬로부터 선택되고;

R₂는 수소 및 C₁ _- ₆알킬로부터 선택되고;

R₃는 수소, 할로, 히드록시, C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알콕시, 할로-치환-C₁ _- ₆알킬 및 할로-치환-C₁ _- ₆알콕시로부터 선택되고;

R₄는 -NR₅C(O)R₆ 및 -C(O)NR₅R₆로부터 선택되고; 여기서 R₅는 수소 및 C₁ _- ₆알킬로부터 선택되고; 여기서 R₆는 C₆ _- ₁₀아릴-C₀ _- ₄알킬, C₅ _- ₁₀헤테로아릴-C₀ _- ₄알킬, C₃ _- ₁₀시클로알킬-C₀ _- ₄알킬 및 C₃ _- ₁₀헤테로시클로알킬-C₀ _- ₄알킬로부터 선택되고; 여기서 R₆의 임의의 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬은 할로, 히드록시, -NR₅R₅, C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알콕시, 할로-치환-C₁ _- ₆알킬, 할로-치환-C₁ _- ₆알콕시, C₅ _- ₁₀헤테로아릴C_0- ₄알킬, C₃ _- ₈헤테로시클로C₀ _- ₄알킬 및 C₃ _- ₈헤테로시클로C₀ _- ₄알콕시로부터 선택되는 1 내지 3개의 라디칼로 임의로 치환되고; 여기서 R₆의 임의의 헤테로아릴 또는 헤테로시클로알킬 치환기는 C₁ _- ₆알킬 및 히드록시-C₁ _- ₆알킬로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 3개의 라디칼로 임의로 치환되고;

R₇은 수소, 할로, 히드록시, C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알콕시, 할로-치환-C₁ _- ₆알킬, 할로-치환-C₁ _- ₆알콕시, C₆ _- ₁₀아릴-C₀ _- ₄알킬, C₅ _- ₁₀헤테로아릴-C₀ _- ₄알킬, C₃ _- ₁₀시클로알킬-C₀ _- ₄알킬 및 C₃ _- ₁₀헤테로시클로알킬-C₀ _- ₄알킬로부터 선택된다.

제2 측면에서, 본 발명은 화학식 I의 화합물 또는 그의 N-옥시드 유도체, 개별 이성질체 및 이성질체 혼합물; 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 1종 이상의 적합한 부형제와의 혼합물로 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

제3 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 N-옥시드 유도체, 개별 이성질체 및 이성질체 혼합물, 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 키나제 활성, 특히 Abl, Bcr-Abl, Bmx, BTK, b-RAF, c-RAF, CSK, cSRC, Fes, FGFR3, Flt3, IKKα, IKKβ, JNK1α1, JNK2α2, Lck, Met, MKK4, MKK6, p70S6K, PAK2, PDGFRα, PKA, PKCα, PKD2, ROCK-II, Ros, Rsk1, SAPK2α, SAPK2β, SAPK3, SAPK4, SGK, Syk, Tie2 및/또는 TrkB 활성의 억제가 질환의 병리상태 및/또는 증상을 예방, 억제 또는 완화할 수 있는 동물에서의 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

제4 측면에서, 본 발명은 키나제 활성, 특히 Abl, Bcr-Abl, Bmx, BTK, b-RAF, c-RAF, CSK, cSRC, Fes, FGFR3, Flt3, IKKα, IKKβ, JNK1α1, JNK2α2, Lck, Met, MKK4, MKK6, p70S6K, PAK2, PDGFRα, PKA, PKCα, PKD2, ROCK-II, Ros, Rsk1, SAPK2α, SAPK2β, SAPK3, SAPK4, SGK, Syk, Tie2 및/또는 TrkB 활성이 질환의 병리상태 및/또는 증상의 원인이 되는 동물에서의 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서 화학식 I의 화합물의 용도를 제공한다.

제5 측면에서, 본 발명은 화학식 I의 화합물 및 그의 N-옥시드 유도체, 프로드러그 유도체, 보호된 유도체, 개별 이성질체 및 이성질체 혼합물, 및 그의 제약상 허용가능한 염을 제조하는 방법을 제공한다.

정의

"알킬"은 하나의 기로서, 그리고 다른 기, 예를 들어 할로-치환-알킬 및 알콕시의 구조적 요소로서 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다. C₁ _-4-알콕시에는 메톡시, 에톡시 등이 포함된다. 할로-치환 알킬에는 트리플루오로메틸, 펜타플루오로에틸 등이 포함된다.

"아릴"은 6 내지 10개의 고리 탄소 원자를 포함하는 모노시클릭 또는 융합 비시클릭 방향족 고리단을 의미한다. 예를 들어, 아릴은 페닐 또는 나프틸, 바람직하게는 페닐일 수 있다. "아릴렌"은 아릴기로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다.

"헤테로아릴"은 상기 아릴에 대하여 정의된 바와 같되, 여기서 고리 구성원 중 하나 이상은 헤테로원자이다. 예를 들어 헤테로아릴에는 피리딜, 인돌릴, 인다졸릴, 퀴녹사졸릴, 퀴놀리닐, 벤조푸라닐, 벤조피라닐, 벤조티오피라닐, 벤조[1,3]디옥솔, 이미다졸릴, 벤조-이미다졸릴, 피리미디닐, 푸라닐, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 피라졸릴, 티에닐 등이 포함된다.

"시클로알킬"은 지정된 개수의 고리 원자를 함유하는 포화 또는 부분적 불포화, 모노시클릭, 융합 비시클릭 또는 가교 폴리시클릭 고리단을 의미한다. 예를 들어, C₃ _- ₁₀시클로알킬에는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 등이 포함된다.

"헤테로시클로알킬"은 본 출원에서 정의된 바와 같되, 단, 지정된 고리 탄소 중 하나 이상이 -O-, -N=, -NR-, -C(O)-, -S-, -S(O)- 또는 -S(O)₂- (여기서 R은 수소, C₁ _- ₄알킬 또는 질소 보호기임)로부터 선택되는 잔기로 치환되는 시클로알킬을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 화합물을 기술하기 위해서 본 출원에서 사용되는 바와 같은 C₃ _- ₈헤테로시클로알킬에는 모르폴리노, 피롤리디닐, 피롤리디닐-2-온, 피페라지닐, 피페리디닐, 피페리디닐론, 1,4-디옥사-8-아자-스피로[4.5]데스-8-일 등이 포함된다.

"할로겐" (또는 할로)은 바람직하게는 클로로 또는 플루오로를 나타내지만, 브로모 또는 요오도일 수도 있다.

"키나제 패널"은 Abl(인간), Abl(T315I), JAK2, JAK3, ALK, JNK1α1, ALK4, KDR, Aurora-A, Lck, Blk, MAPK1, Bmx, MAPKAP-K2, BRK, MEK1, CaMKII(래트), Met, CDK1/cyclinB, p70S6K, CHK2, PAK2, CK1, PDGFRα, CK2, PDK1, c-kit, Pim-2, c-RAF, PKA(h), CSK, PKBα, cSrc, PKCα, DYRK2, Plk3, EGFR, ROCK-I, Fes, Ron, FGFR3, Ros, Flt3, SAPK2α, Fms, SGK, Fyn, SIK, GSK3β, Syk, IGF-1R, Tie-2, IKKβ, TrKB, IR, WNK3, IRAK4, ZAP-70, ITK, AMPK(래트), LIMK1, Rsk2, Axl, LKB1, SAPK2β, BrSK2, Lyn(h), SAPK3, BTK, MAPKAP-K3, SAPK4, CaMKIV, MARK1, Snk, CDK2/cyclinA, MINK, SRPK1, CDK3/cyclinE, MKK4(m), TAK1, CDK5/p25, MKK6(h), TBK1, CDK6/cyclinD3, MLCK, TrkA, CDK7/cyclinH/MAT1, MRCKβ, TSSK1, CHK1, MSK1, Yes, CK1d, MST2, ZIPK, c-Kit (D816V), MuSK, DAPK2, NEK2, DDR2, NEK6, DMPK, PAK4, DRAK1, PAR-1Bα, EphA1, PDGFRβ, EphA2, Pim-1, EphA5, PKBβ, EphB2, PKCβI, EphB4, PKCδ, FGFR1, PKCη, FGFR2, PKCθ, FGFR4, PKD2, Fgr, PKG1β, Flt1, PRK2, Hck, PYK2, HIPK2, Ret, IKKα, RIPK2, IRR, ROCK-II(인간), JNK2α2, Rse, JNK3, Rsk1(h), PI3 Kγ, PI3 Kδ 및 PI3-Kβ를 포함하는 키나제 목록이다. 본 발명의 화합물은 상기 키나제 패널 (야생형 및/또는 그의 돌연변이)에 대하여 스크리닝되고, 상기 패널 구성원 중 하나 이상의 활성을 억제한다.

"BCR-Abl의 돌연변이 형태"는 야생형 서열로부터의 단일 또는 복수의 아미노산 변이를 의미한다. BCR-ABL에서의 돌연변이는 단백질과 억제제 (예를 들어, 글리벡(Gleevec) 등) 사이의 중요한 접촉점을 분열시킴으로써, 더욱 빈번하게는, 비활성에서 활성 상태, 즉, BCR-ABL과 글리벡이 결합할 수 없는 구조로의 전환을 유도함으로써 작용한다. 임상 표본의 분석으로부터, 내성 표현형과 관련하여 발견되는 돌연변이 레퍼토리는 천천히, 그러나 엄연히 시간이 흐르면서 증가해 왔다. 돌연변이는 4개의 주요 영역에 클러스터링하는 것으로 보인다. 돌연변이 제1 군 (G250E, Q252R, Y253F/H, E255K/V)은 ATP에 대한 인산염-결합 루프 (P-루프로도 알려짐)를 형성하는 아미노산을 포함한다. 제2 군 (V289A, F311L, T315I, F317L)은 글리벡 결합 부위에서 발견될 수 있으며, 수소 결합 또는 반데르발스 상호작용을 통해 억제제와 직접 상호작용한다. 돌연변이 제3 군 (M351T, E355G)은 촉매 도메인에 아주 근접하여 클러스터링한다. 돌연변이 제4 군 (H396R/P)은 그 구조가 키나제 활성화/불활성화를 조절하는 분자 스위치인 활성화 루프에 위치한다. CML 및 ALL 환자에서 탐지되는 글리벡 내성과 연관된 BCR-ABL 점 돌연변이로는 M224V, L248V, G250E, G250R, Q252R, Q252H, Y253H, Y253F, E255K, E255V, D276G, T277A, V289A, F311L, T315I, T315N, F317L, M343T, M315T, E355G, F359V, F359A, V379I, F382L, L387M, L387F, H396P, H396R, A397P, S417Y, E459K, 및 F486S (1문자 코드로 나타내는 아미노산 위치는 진뱅크(GenBank) 서열, 수탁 번호 AAB60394에서의 위치이며, ABL 타입 1a에 대응함; 문헌 [Martinelli et al., Haematologica/The Hematology Journal, 2005, April; 90-4])가 포함된다. 본 발명에 대하여 달리 명시하지 않는 한, Bcr-Abl은 상기 효소의 야생형 및 돌연변이 형태를 지칭한다.

"치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 질환 및/또는 그에 수반되는 증상을 완화 또는 경감시키는 방법을 가리킨다.

바람직한 실시양태의 기술

융합 단백질 BCR-Abl은 Abl 원-종양유전자와 Bcr 유전자를 융합시키는 상호전위의 결과이다. 이때 BCR-Abl은 분열촉진 활성의 증가를 통해서 B-세포를 전환시킬 수 있다. 상기의 증가는 세포자멸사에 대한 민감성을 감소시킬 뿐만 아니라 CML 전구세포의 유착 및 귀소를 변형시킨다. 본 발명은 키나제 관련 질환, 특히 Abl, Bcr-Abl, Bmx, BTK, b-RAF, c-RAF, CSK, cSRC, Fes, FGFR3, Flt3, IKKα, IKKβ, JNK1α1, JNK2α2, Lck, Met, MKK4, MKK6, p70S6K, PAK2, PDGFRα, PKA, PKCα, PKD2, ROCK-II, Ros, Rsk1, SAPK2α, SAPK2β, SAPK3, SAPK4, SGK, Syk, Tie2 및 TrkB 키나제 관련 질환의 치료를 위한 화합물, 조성물 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 백혈병 및 BCR-Abl과 관련된 기타 증식 장애는 Bcr-Abl의 야생형 및 돌연변이 형태의 억제를 통해서 치료할 수 있다.

한 실시양태에서는, 화학식 I의 화합물과 관련하여 하기 화학식 Ia의 화합물이 있다.

식 중:

n은 0 및 1로부터 선택되고;

Y₁은 N 및 CH로부터 선택되고;

Y₂는 O 및 S로부터 선택되고;

R₁은 수소 및 C₁ _- ₆알킬로부터 선택되고;

R₂는 수소 및 C₁ _- ₆알킬로부터 선택되고;

R₄는 -NR₅C(O)R₆ 및 -C(O)NR₅R₆로부터 선택되고; 여기서 R₅는 수소 및 C₁ _- ₆알킬로부터 선택되고; 여기서 R₆는 C₆ _- ₁₀아릴-C₀ _- ₄알킬, C₅ _- ₁₀헤테로아릴-C₀ _- ₄알킬, C₃ _- ₁₀시클로알킬-C₀ _- ₄알킬 및 C₃ _- ₁₀헤테로시클로알킬-C₀ _- ₄알킬로부터 선택되고; 여기서 R₆의 임 의의 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬은 할로, 히드록시, -NR₅R₅, C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알콕시, 할로-치환-C₁ _- ₆알킬, 할로-치환-C₁ _- ₆알콕시, C₅ _- ₁₀헤테로아릴C_0- ₄알킬, C₃ _- ₈헤테로시클로C₀ _- ₄알킬 및 C₃ _- ₈헤테로시클로C₀ _- ₄알콕시로부터 선택되는 1 내지 3개의 라디칼로 임의로 치환되고; 여기서 R₆의 임의의 헤테로아릴 또는 헤테로시클로알킬 치환기는 C₁ _- ₆알킬 및 히드록시-C₁ _- ₆알킬로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 3개의 라디칼로 임의로 치환된다.

또 다른 실시양태에서, R₂는 수소 및 메틸로부터 선택되고; R₃는 메틸 및 메톡시로부터 선택된다.

또 다른 실시양태에서, R₄는 -NHC(O)R₆ 및 -C(O)NHR₆로부터 선택되고; 여기서 R₆는 트리플루오로메틸, 디메틸-아미노, 이미다졸릴, 모르폴리노, 모르폴리노-메틸, 피페라지닐, 피페라지닐-메틸 및 피롤리디닐-메톡시로부터 선택되는 1 내지 3개의 라디칼로 임의로 치환된 페닐로부터 선택되고; 여기서 상기 이미다졸릴, 피페라지닐, 피페라지닐-메틸은 메틸, 에틸 및 히드록시-에틸로부터 선택되는 기로 임의로 치환된다.

본 발명의 바람직한 화합물은: N-[4-(4-에틸-피페라진-1-일메틸)-3-트리플루오로메틸-페닐]-4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-벤즈아미드; 4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-N-(4-피페라진-1-일메틸-3-트리플루오로메틸-페닐)-벤즈아미드; 3-(4-메틸-이미다졸- 1-일)-N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-5-트리플루오로메틸-벤즈아미드; N-[4-메틸-3-(2-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일-아세틸아미노)-페닐]-3-트리플루오로메틸-벤즈아미드; N-(3-이미다졸-1-일-5-트리플루오로메틸-페닐)-4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-벤즈아미드; N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-3-트리플루오로메틸-벤즈아미드; 4-(2-메틸-이미다졸-1-일)-N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-3-트리플루오로메틸-벤즈아미드; N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-4-모르폴린-4-일-3-트리플루오로메틸-벤즈아미드; N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-4-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-3-트리플루오로메틸-벤즈아미드; N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-4-모르폴린-4-일메틸-3-트리플루오로메틸-벤즈아미드; N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-3-모르폴린-4-일-5-트리플루오로메틸-벤즈아미드; N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-4-(4-메틸-피페라진-1-일)-3-트리플루오로메틸-벤즈아미드; 4-(4-에틸-피페라진-1-일)-N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-3-트리플루오로메틸-벤즈아미드; N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-3-(4-메틸-피페라진-1-일)-5-트리플루오로메틸-벤즈아미드; 3-디메틸아미노-N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-5-트리플루오로메틸-벤즈 아미드; 4-(4-에틸-피페라진-1-일메틸)-N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-3-트리플루오로메틸-벤즈아미드; 3-(4-에틸-피페라진-1-일)-N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-5-트리플루오로메틸-벤즈아미드; 4-메틸-N-[3-(4-메틸-이미다졸-1-일)-5-트리플루오로메틸-페닐]-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-벤즈아미드; 3-[4-(2-히드록시-에틸)-피페라진-1-일]-N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-5-트리플루오로메틸-벤즈아미드; N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-3-피페라진-1-일-5-트리플루오로메틸-벤즈아미드; N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-3-(피롤리딘-2-일메톡시)-5-트리플루오로메틸-벤즈아미드; N-{3-메톡시-5-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-3-모르폴린-4-일-5-트리플루오로메틸-벤즈아미드; N-{3-메톡시-5-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-3-(4-메틸-이미다졸-1-일)-5-트리플루오로메틸-벤즈아미드; 4-(4-에틸-피페라진-1-일메틸)-N-{3-메톡시-5-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-3-트리플루오로메틸-벤즈아미드; N-{3-메톡시-5-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-4-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-3-트리플루오로메틸-벤즈아미드; 및 N-{3-메톡시-5-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-4-(2-메틸-이미다졸-1-일)-3-트리플루오로메틸-벤즈아미드로부터 선택된다.

본 발명의 더욱 바람직한 화합물은 아래 실시예 및 표 1에서 상술한다.

약리 및 효용

본 발명의 화합물은 키나제 활성을 조절하며, 그로 인하여, 키나제가 질환의 병리상태 및/또는 증상의 원인이 되는 질환 또는 장애의 치료에 유용하다. 본원에 기재한 화합물 및 조성물에 의해서 억제되고, 본원에 기재한 방법이 유용한 키나제의 예로는 Abl 및 Bcr-Abl이 포함되지만, 여기에 한정되지는 않는다.

아벨슨 티로신 키나제 (즉, Abl, c-Abl)는 세포 주기의 조절, 유전자독성 스트레스에 대한 세포 반응, 및 인테그린 신호전달을 통한 세포 환경에 관한 정보의 전달에 관여한다. 전체적으로, Abl 단백질은 다양한 세포외 및 세포내 출처로부터의 신호를 통합하고, 세포 주기 및 세포자멸사에 관한 결정에 영향을 미치는 세포 모듈로서의 복잡한 역할을 수행하는 것으로 보인다. 아벨슨 티로신 키나제는 아형 유도체, 예컨대 탈조절된 티로신 키나제 활성을 갖는 키메라 융합체 (종양단백질) BCR-Abl, 또는 v-Abl을 포함한다. BCR-Abl은 만성 골수성 백혈병 (CML)의 95% 및 급성 림프성 백혈병의 10%의 발병에 있어서 결정적이다. STI-571 (글리벡)은 발암성 BCR-Abl 티로신 키나제의 억제제이고, 만성 골수성 백혈병 (CML)의 치료에 사용된다. 그러나, CML의 모구성 발증 단계에 있는 일부 환자는 BCR-Abl 키나제에서의 돌연변이 때문에 STI-571에 내성이 있다. 현재까지 22종이 넘는 돌연변이가 보고되었으며, 그 중 G250E, E255V, T315I, F317L 및 M351T가 가장 흔하다.

본 발명의 화합물은 abl 키나제, 특히 v-abl 키나제를 억제한다. 본 발명의 화합물은 또한 야생형 BCR-Abl 키나제 및 BCR-Abl 키나제의 돌연변이도 억제하고, 따라서 Bcr-abl-양성 암 및 종양 질환, 예컨대 백혈병 (주로, 특히 세포자멸 기작 작용이 발견되는 만성 골수성 백혈병 및 급성 림프모구성 백혈병)의 치료에 적합하며, 또한 백혈병 줄기 세포의 아군에 대한 효과뿐만 아니라, 상기 세포를 제거 (예를 들어, 골수 제거)한 후, 시험관 내에서 이들 세포를 정제하고, 이들 세포로부터 암세포를 제거한 뒤의 재이식 (예를 들어, 정제된 골수 세포의 재이식) 잠재성을 보여준다.

Ras-Raf-MEK-ERK 신호전달 경로는 성장 신호에 대한 세포 반응을 매개한다. Ras는 인간 암의 ~15%에서 발암성 형태로 돌연변이된다. Raf 족은 세린/트레오닌 단백질 키나제에 속하며, 세 가지 구성원인 A-Raf, B-Raf 및 c-Raf (또는 Raf-1)를 포함한다. Raf가 약물 표적이라는데 대한 초점은 Ras의 하향 이펙터로서의 Raf의 관계에 집중되어 있다. 그러나, 최근의 데이터는 B-Raf가 활성화된 Ras 대립 유전자에 대한 요건 없이 특정 종양의 형성에 주된 역할을 가질 수 있다는 것을 시사한다 (문헌 [Nature 417, 949-954 (01 Jul 2002)]). 특히, B-Raf 돌연변이는 대부분의 악성 흑색종에서 검출되었다.

흑색종에 대한 현존하는 의학적 치료는, 특히 말기 흑색종에서는, 그들의 유효성에 한정되어 있다. 본 발명의 화합물은 또한 b-Raf 키나제를 수반하는 세포 과정을 억제하여, 인간 암, 특히 흑색종의 치료에 있어서 새로운 치유 기회를 제공한다.

본 발명의 화합물은 또한 c-Raf 키나제를 수반하는 세포 과정을 억제한다. c-Raf는 다수의 인간 암에서 돌연변이된 ras 종양유전자에 의해서 활성화된다. 따라서 c-Raf의 키나제 활성의 억제는 ras 매개된 종양 성장을 예방하는 방법을 제공 할 수 있다 (문헌 [Campbell, S. L., Oncogene, 17, 1395 (1998)]).

PDGF (혈소판-유래 성장 인자)는 정상적인 성장뿐만 아니라, 예컨대 발암현상 및 혈관의 평활근 세포의 질환, 예를 들어 죽상동맥경화증 및 혈전증에서 보여지는 병리학적 세포 증식 양자 모두에 중요한 역할을 하는 아주 흔히 분포된 성장 인자이다. 본 발명의 화합물은 PDGF 수용체 (PDGFR) 활성을 억제할 수 있고, 따라서 종양 질환, 예컨대 신경아교종, 육종, 전립선 종양, 및 결장, 유방 및 난소 종양의 치료에 적합하다.

본 발명의 화합물은 예를 들어, 소세포 폐암에서 종양-억제 물질로서 뿐만 아니라, 비-악성 증식성 장애, 예컨대 죽상동맥경화증, 혈전증, 건선, 경피증 및 섬유증의 치료, 뿐만 아니라, 예를 들어 화학요법제, 예컨대 5-플루오로우라실의 혈액독성 효과에 대항하기 위한 줄기 세포의 보호, 및 천식에서의 작용제로서 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 특히 PDGF 수용체 키나제의 억제에 반응하는 질환의 치료에 사용할 수 있다.

본 발명의 화합물은 이식, 예를 들어 동종 이식의 결과로 발생하는 장애, 특히 조직 거부반응, 예컨대, 특히 폐색성 기관지염 (OB), 즉 동종 폐 이식물의 만성 거부반응의 치료에 유용한 효과를 나타낸다. OB가 없는 환자와 달리, OB를 갖는 환자들은 종종 기관지 폐포액 중 상승된 PDGF 농도를 나타낸다.

본 발명의 화합물은 또한 혈관 평활근 세포 이동 및 증식 (여기서는 PDGF 및 PDGF-R 역시 종종 일익을 담당함)과 연관된 질환, 예컨대 재협착 및 죽상동맥경화증에도 효과적이다. 본 발명의 화합물을 투여하고, 또한 생체내의 물리적 손상에 따르는 혈관 내막의 비후에 대한 그의 효과를 조사함으로써, 시험관 내 및 생체 내 혈관 평활근 세포의 증식 또는 이동에 대한 상기의 효과 및 그로부터의 결과를 입증할 수 있다.

신경영양인자 수용체의 trk 족 (trkA, trkB, trkC)은 신경세포성 및 비-신경세포성 조직의 생존, 성장 및 분화를 촉진시킨다. TrkB 단백질은 소장 및 결장에서의 신경내분비형 세포에서, 췌장의 알파 세포에서, 림프절 및 비장의 단핵구 및 대식세포에서, 그리고 표피의 과립층에서 발현된다 (문헌 [Shibayama and Koizumi, 1996]). TrkB 단백질의 발현은 윌름즈(Wilms) 종양 및 신경모세포종의 바람직하지 않은 진행과 연관되어 있다. TrkB는 또한 암성 전립선 세포에서는 발현되지만 정상 세포에서는 발현되지 않는다. trk 수용체의 신호전달 경로 하류는 Shc, 활성화된 Ras, ERK-1 및 ERK-2 유전자를 통한 MAPK 활성화의 캐스케이드, 및 PLC-감마1 전달 경로를 포함한다 (문헌 [Sugimoto et al., 2001]).

키나제 c-Src는 다수의 수용체의 발암성 신호를 전달한다. 예를 들어, 종양에서 EGFR 또는 HER2/neu의 과다발현은 c-src의 구성적 활성화를 야기하며, 이는 악성 세포에서의 특징이나, 정상 세포에는 없다. 한편, c-src의 발현이 결핍된 마우스는 골화성 표현형을 나타내며, 이는 파골세포 기능에서의 c-src의 중요한 참여 및 관련 장애에서의 가능한 연관성을 나타낸다.

비-수용체 단백질-티로신 키나제인 Tec 족 키나제 Bmx는 포유류 상피 암세포의 증식을 제어한다.

섬유모세포 성장 인자 수용체 3은 골 성장 및 연골세포 증식의 억제에 대하 여 음성적 조절 효과를 발휘하는 것으로 밝혀졌다. 치사성 이형성증은 섬유모세포 성장 인자 수용체 3에서의 여러 돌연변이에 의해서 야기되며, 한 돌연변이인 TDII FGFR3는 전사 인자 Stat1을 활성화시켜서 세포-주기 억제제의 발현, 성장 저지 및 비정상적 골 발달을 야기하는 구성적 티로신 키나제 활성을 갖는다 (문헌 [Su et al., Nature, 1997, 386, 288-292]). FGFR3는 또한 다발성 골수종형 암에서 종종 발현된다. FGFR3 활성의 억제제는 류마티스 관절염 (RA), 콜라겐 II 관절염, 다발성 경화증 (MS), 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 건선, 유년기 발병형 당뇨병, 쇼그렌(Sjogren) 질환, 갑상샘 질환, 사코이드증, 자가면역성 포도막염, 염증성 장 질환 (크론(Crohn) 및 궤양성 대장염), 복강 질환 및 중증근무력증을 포함하지만 여기에 한정되지는 않는 T-세포 매개 염증성 또는 자가면역성 질환의 치료에 유용하다.

혈청 및 글루코코르티코이드-조절된 키나제 (SGK)의 활성은, 특히 나트륨 및/또는 칼륨 통로의 교란된 이온-통로 활성과 상호연관되어 있으며, 본 발명의 화합물은 고혈압의 치료에 유용할 수 있다.

문헌 [Lin et al (1997) J. Clin. Invest. 100, 8: 2072-2078] 및 [P. Lin (1998) PNAS 95, 8829-8834]는 종양 성장 및 혈관화의 억제, 그리고 또한 아데노바이러스성 감염 도중 또는 유방 종양 및 흑색종 이종이식 모델에서 Tie-2 (Tek)의 세포외 도메인의 주입 도중에 폐 전이의 감소를 나타내었다. Tie2 억제제는 신혈관화가 부적절하게 발생하는 상황 (즉, 당뇨망막병증, 만성 염증, 건선, 카포시(Kaposi) 육종, 황반변성에 기인한 만성 신혈관화, 류마티스 관절염, 유아 혈관 종 및 암)에 사용할 수 있다.

Lck는 T-세포 신호전달에서 일익을 담당한다. Lck 유전자가 결핍된 마우스는 가슴샘세포를 발생시키는 능력이 불량하다. T-세포 신호전달의 양성 활성화제로서의 Lck의 기능은 Lck 억제제가 류마티스 관절염과 같은 자가면역성 질환을 치료하는데 유용할 수 있다는 것을 시사한다.

JNK는, 기타 MAPK와 함께, 암, 트롬빈-유발된 혈소판 응집, 면역결핍성 장애, 자가면역성 질환, 세포사, 알레르기, 골다공증 및 심장 질환에 대한 세포 반응을 매개하는 역할을 갖는데 연관되어 있다. JNK 경로의 활성화에 관련된 치료 표적에는 만성 골수성 백혈병 (CML), 류마티스 관절염, 천식, 골관절염, 허혈, 암 및 신경퇴행성 질환이 포함된다. 간 질환 또는 간 허혈 발작과 연관된 JNK 활성화의 중요성의 결과로서, 본 발명의 화합물은 또한 다양한 간 장애를 치료하는데 유용할 수 있다. 심혈관 질환, 예컨대 심근경색 또는 울혈성 심부전에서의 JNK의 역할은 또한, JNK가 다양한 형태의 심장 스트레스에 대한 비대 반응을 매개하는 것이 밝혀졌다고 보고되었다. JNK 캐스케이드가 또한 IL-2 프로모터의 활성화를 비롯한 T-세포 활성화에서의 역할을 한다는 것이 입증되었다. 따라서, JNK의 활성화는 병적 면역 반응을 변경시키는데 치료적 가치를 가질 수 있다. 다양한 암에서 JNK 활성화에 대한 역할이 또한 확립되었으며, 이는 암에서 JNK 억제제의 잠재적인 사용을 시사한다. 예를 들어, 구성적으로 활성화된 JNK는 HTLV-1 매개 종양형성과 연관되어 있다 (문헌 [Oncogene 13:135-42 (1996)]). JNK는 카포시 육종 (KS)에서의 역할을 가질 수 있다. KS 증식에 연루된 다른 시토킨, 예컨대 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), IL-6 및 TNFα의 기타 증식 효과는 또한 JNK에 의해서 매개될 수 있다. 또한, p210 BCR-ABL 형질전환된 세포에서 c-jun 유전자의 조절은 JNK의 활성과 조화되며, 이는 만성 골수성 백혈병 (CML)에 대한 치료에서 JNK 억제제에 대한 역할을 시사한다 (문헌 [Blood 92:2450-60 (1998)]).

특정의 비정상적 증식 상태는 raf 발현과 연관되어 있다고 여겨지며, 따라서, raf 발현의 억제에 반응할 것으로 여겨진다. 비정상적으로 높은 수준의 raf 단백질의 발현 또한 변형 및 비정상적 세포 증식과 연관되어 있다. 이러한 비정상적 증식 상태는 또한 raf 발현의 억제에 반응할 것으로 여겨진다. 예를 들어, c-raf 단백질의 발현은, 모든 폐 암종 세포주의 60%가 현저하게 높은 수준의 c-raf mRNA 및 단백질을 발현한다고 보고되었기 때문에, 비정상적 세포 증식에 일익을 담당할 것으로 여겨진다. 비정상적 증식 상태의 추가의 예는, 과증식성 장애, 예컨대 암, 종양, 과다형성증, 폐 섬유증, 혈관신생, 건선, 죽상동맥경화증 및 혈관에서의 평활근 세포 증식, 예컨대 협착증 또는 혈관성형술 후의 재협착이다. raf가 관여하는 세포성 신호전달 경로는 또한 예를 들어 조직 이식편 거부 반응, 내독소 쇼크 및 사구체 신염과 같은 T-세포 증식 (T-세포 활성화 및 성장)을 특징으로 하는 염증성 장애와 연관되어 있다.

스트레스 활성화된 단백질 키나제 (SAPK)는 c-jun 전사 인자의 활성화 및 c-jun에 의해서 조절되는 유전자의 발현을 일으키는 신호 전달 경로에서의 전종단 단계를 나타내는 단백질 키나제 족이다. 특히, c-jun은 유전자독성 손상에 기인하여 손상된 DNA의 복구에 관계하는 단백질을 암호화하는 유전자의 전사와 관련된다. 따라서, 세포에서 SAPK 활성을 억제하는 작용제는 DNA 복구를 막고, DNA 손상을 유발하거나 DNA 합성을 억제하며 세포의 세포자멸사를 유발시키는 작용제 또는 세포 증식을 억제하는 작용제에 대하여 세포를 감작시킨다.

미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK)는 전사 인자, 번역 인자 및 다양한 세포외 신호에 반응하는 기타 표적 분자를 활성화시키는 보존된 신호 전달 경로의 일원이다. MAPK는 미토겐-활성화된 단백질 키나제 키나제 (MKK)에 의해서 서열 Thr-X-Tyr을 갖는 이중 인산화 모티프에서의 인산화에 의해서 활성화된다. 고등 진핵생물에서, MAPK 신호전달의 생리학적 역할은 증식, 종양형성, 발생 및 분화와 같은 세포 사건과 상호연관되어 있다. 따라서, 상기 경로를 통해서 (특히 MKK4 및 MKK6을 통해서) 신호 전달을 조절하는 능력은 MAPK 신호전달과 연관된 인간 질환, 예컨대 염증성 질환, 자가면역성 질환 및 암에 대한 치료 및 예방적 요법의 발달을 이끌어낼 수 있다.

인간 리보솜 S6 단백질 키나제 족은 적어도 8개의 구성원 (RSK1, RSK2, RSK3, RSK4, MSK1, MSK2, p70S6K 및 p70S56 Kb)으로 이루어진다. 리보솜 단백질 S6 단백질 키나제는 중요한 다면발현성 기능을 하며, 그 중에서 단백질 생합성 도중 mRNA 번역의 조절이 중요한 역할이다 (문헌 [Eur J. Biochem 2000 November; 267(21): 6321-30, Exp Cell Res. Nov. 25, 1999; 253 (1):100-9, Mol Cell Endocrinol. May 25, 1999; 151(1-2):65-77). p70S6에 의한 S6 리보솜 단백질의 인산화는 또한 세포 운동성 (문헌 [Immunol. Cell Biol. 2000 August; 78(4):447-51]) 및 세포 성장 (문헌 [Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 2000; 65:101- 27])과 연관되어 있고, 따라서, 종양 전이, 면역 반응 및 조직 회복뿐만 아니라 기타 질환 상태에 있어서 중요할 수 있다.

SAPK's ("jun N-말단 키나제" 또는 "JNK's"라고도 칭함)는 c-jun 전사 인자의 활성화 및 c-jun에 의해서 조절되는 유전자의 발현을 일으키는 신호 전달 경로에서의 전종단 단계를 나타내는 단백질 키나제 족이다. 특히, c-jun은 유전자독성 손상에 기인하여 손상된 DNA의 복구에 관계하는 단백질을 암호화하는 유전자의 전사와 관련된다. 세포에서 SAPK 활성을 억제하는 작용제는 DNA 복구를 막고, DNA 손상 유발에 의해서 작용하는 암 치유 양식에 대하여 세포를 감작시킨다.

BTK는 자가면역성 및/또는 염증성 질환, 예컨대 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 류마티스 관절염, 다발성 혈관염, 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 중증근무력증, 및 천식에서 일익을 담당한다. B-세포 활성화에서의 BTK의 역할로 인하여, BTK의 억제제는 B-세포 매개 병원성 활동, 예컨대 자가항체 생성의 억제제로서 유용하고, B-세포 림프종 및 백혈병의 치료에 유용하다.

CHK2는 세린/트레오닌 단백질 키나제의 체크포인트 키나제 족의 일원이고, DNA 손상, 예컨대 환경상의 돌연변이원 및 내인성의 반응성 산소종에 의해 야기되는 손상의 감시에 사용되는 기작에 연관되어 있다. 그 결과, 상기는 암 치유에 있어서 종양 억제제 및 표적으로서 연루된다.

CSK는 암세포, 특히 결장암의 전이 가능성에 영향을 준다.

Fes는 다양한 시토킨 신호 전달 경로, 뿐만 아니라 골수 세포의 분화에 연관된 비-수용체 단백질 티로신 키나제이다. Fes는 또한 과립구 분화 수단의 주 구성 요소이다.

Flt3 수용체 티로신 키나제 활성은 백혈병 및 골수이형성 증후군에 연관되어 있다. 대략 25%의 AML에서, 백혈병 세포는 세포 표면에서 자가-인산화된 (p) FLT3 티로신 키나제의 구성상 활성인 형태를 발현시킨다. p-FLT3의 활성은 백혈병 세포에 성장 및 생존 이득을 준다. 백혈병 세포가 p-FLT3 키나제 활성을 발현시키는 급성 백혈병 환자는 전체적인 임상적 결과가 불량하다. p-FLT3 키나제 활성의 억제는 백혈병 세포의 세포자멸사 (프로그램화된 세포사)를 유발한다.

IKKα 및 IKKβ (1 & 2)의 억제제는 류마티스 관절염, 이식 거부, 염증성 장 질환, 골관절염, 천식, 만성 폐색성 폐 질환, 죽상동맥경화증, 건선, 다발성 경화증, 발작, 전신성 홍반성 루푸스, 알츠하이머 질환, 뇌허혈, 외상성 뇌손상, 파킨슨 질환, 근위축성 측삭 경화증, 거미막밑출혈 또는 뇌 및 중추신경계에서 염증 매개체의 과다 생성과 연관된 기타 질환 또는 장애를 포함하는 질환용 치료제이다.

Met는 주요 인간 암의 대부분의 유형과 연관되어 있고, 발현은 불량한 예후 및 전이와 종종 상호연관된다. Met의 억제제는 폐암, NSCLC (비소세포 폐암), 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 결장암, 유방암, 부인과 종양 (예를 들어, 자궁 육종, 자궁관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종 또는 외음 암종), 호지킨(Hodgkin) 질환, 식도암, 소장암, 내분비계 암 (예를 들어, 갑상샘암, 부갑상샘암 또는 부신암), 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 유년기 고형 종양, 림프성 림프종, 방광암, 신장 또는 요관 암 (예를 들어, 신 장 세포 암종, 신우 암종), 소아 악성종양, 중추신경계의 신생물 (예를 들어, 원발성 CNS 림프종, 척수 축 종양, 뇌줄기신경아교종 또는 뇌하수체샘종), 혈액암, 예컨대 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 등, 바레트(Barrett) 식도 (전암 증후군) 신생물성 피부 질환, 건선, 균상식육종 및 양성 전립선 비대증, 당뇨 관련 질환, 예컨대 당뇨망막병증, 망막허혈 및 망막신혈관화, 간경변, 심혈관 질환, 예컨대 죽상동맥경화증, 면역질환, 예컨대 자가면역성 질환 및 신장 질환과 같은 암을 포함하는 질환용 치료제이다. 바람직하게는, 상기 질환은 급성 골수성 백혈병 및 결장직장암과 같은 암이다.

Nima-관련 키나제 2 (Nek2)는 중심체에 집중되어 있는, 유사분열 개시시에 활성이 최대인 세포 주기-조절된 단백질 키나제이다. 기능적 연구는 Nek2를 중심체 분리 및 방추 형성의 조절과 연관시킨다. Nek2 단백질은 자궁경부, 난소, 전립선, 및 특히 유방을 비롯한 일정 범위의 인간 종양으로부터 유래한 세포주에서 2 내지 5배 증가하였다.

p70S6K-매개된 질환 또는 상태는 증식성 장애, 예컨대 암 및 결절 경화증을 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다.

키나제 억제제 요법이, 키나제 약물 표적이 유전자 돌연변이에 의해서 구조적으로 활성화되는 암에 대하여, 일관하여 확실하게 작용한다는 증거가 늘고 있다. 자연 종양 선택 과정으로부터 발생한 키나제에서 발견되는 돌연변이가 많이 보고되어 있다. 상기의 예의 비제한적 목록은: 흑색종 사례의 60% 초과에서의 b-raf V599E 돌연변이; AML 사례의 30%에서의 Flt3-ITD 돌연변이; GIST 환자에서의 c-kit 돌연변이; GIST 및 HES에서의 PDGFRα; CMML에서의 PDGFRβ; 결장암 및 위암, 및 교모세포종에서의 Pi3K 돌연변이; 및 폐암의 10% (이레사(Iressa)(등록상표)에 반응함)에서 그리고 교모세포종에서의 EGFR 돌연변이를 포함한다.

상기에 따르면, 본 발명은 치료 유효량 (하기 "투여 및 제약 조성물" 참고)의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 앞서 기재한 임의의 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 상기 질환 또는 장애의 예방 또는 치료 방법을 추가로 제공한다. 상기한 임의의 용도에 있어서, 필요한 투약량은 투여 방식, 치료할 특정 상태 및 원하는 효과에 따라 달라질 것이다.

투여 및 제약 조성물

일반적으로, 본 발명의 화합물은 당업계에 공지된 통상의 허용가능한 임의의 방식을 통해서, 단독으로 또는 1종 이상의 치료제와 함께 치료 유효량으로 투여될 것이다. 치료 유효량은 질환의 중증도, 대상체의 연령 및 상대적인 건강상태, 사용하는 화합물의 효능 및 기타 요소에 따라 광범위하게 바뀔 수 있다. 일반적으로, 약 0.03 내지 2.5 ㎎/체중 ㎏의 1일 투약량에서 전신적으로 만족스러운 결과가 수득되는 것으로 나타난다. 대형 포유류, 예를 들어 인간에서, 지시되는 1일 투약량은 약 0.5 ㎎ 내지 약 100 ㎎ 범위이며, 편의상 예를 들어 1일 4회 이하의 분할 용량으로 또는 서방형으로 투여된다. 경구 투여에 적합한 단위 투약 형태는 약 1 내지 50 ㎎의 활성 성분을 포함한다.

본 발명의 화합물은 임의의 통상적인 경로, 특히 장관으로, 예를 들어 경구 로, 예를 들어 정제 또는 캡슐제의 형태로, 또는 비경구로, 예를 들어 주사가능한 용액제 또는 현탁액제의 형태로, 국소적으로, 예를 들어 로션, 겔, 연고 또는 크림의 형태로, 또는 비강제 또는 좌제 형태로 제약 조성물로서 투여될 수 있다. 유리 형태 또는 제약상 허용가능한 염 형태의 본 발명의 화합물을 1종 이상의 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 포함하는 제약 조성물은 혼합, 과립화 또는 코팅법에 의하여 통상의 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 조성물은 활성 성분과 함께 a) 희석제, 예를 들어, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로스 및/또는 글리신; b) 윤활제, 예를 들어, 실리카, 탈크, 스테아르산, 그의 마그네슘 또는 칼슘 염 및/또는 폴리에틸렌글리콜; 정제에 있어서는 또한 c) 결합제, 예를 들어, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로스, 소듐 카르복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈; 경우에 따라 d) 붕해제, 예를 들어, 전분, 아가, 알긴산 또는 그의 나트륨 염, 또는 발포성 혼합물; 및/또는 e) 흡수제, 착색제, 향료 및 감미료를 포함하는 정제 또는 젤라틴 캡슐제일 수 있다. 주사가능한 조성물은 등장성 수용액제 또는 수현탁액제일 수 있고, 좌제는 지방 에멀션 또는 현탁액제로부터 제조할 수 있다. 조성물은 멸균되고/되거나 보조제, 예컨대 보존제, 안정화제, 습윤화제 또는 유화제, 용액 촉진제, 삼투압 조절용 염 및/또는 완충제를 함유할 수 있다. 또한, 치료적 가치가 있는 기타 물질도 함유할 수 있다. 경피적 적용에 적합한 제형은 본 발명의 화합물의 유효량과 담체를 포함한다. 담체는 숙주의 피부를 통과하는데 도움이 되는 약리학적으로 허용가능한 흡수성 용매를 포함할 수 있다. 예를 들어, 경피적 장치는 지지재, 화합물을 임의로 담체와 함께 함유하는 저장고, 임의로 상기 화합물을 숙주의 피부에 조절된 소정의 속도로 장기간에 걸쳐 전달하기 위한 속도 조절 배리어, 및 피부에 장치를 고정하는 수단을 포함하는 붕대 형태이다. 매트릭스 경피 제형 또한 사용할 수 있다. 예를 들어 피부 및 안구에 대한 국소 적용에 적합한 제형은 바람직하게는 당업계에 주지된 수용액제, 연고, 크림 또는 겔이다. 상기의 것들은 가용화제, 안정화제, 삼투성 증강제, 완충제 및 보존제를 함유할 수 있다.

본 발명의 화합물은 치료 유효량으로 1종 이상의 치료제와 함께 투여될 수 있다 (제약 조합물). 예를 들어, 다른 면역조절성 또는 항-염증성 물질과의 경우, 예를 들어 시클로스포린, 라파마이신 또는 아스코마이신, 또는 그의 면역억제성 유사체, 예를 들어, 시클로스포린 A (CsA), 시클로스포린 G, FK-506, 라파마이신, 또는 그에 상응하는 화합물, 코르티코스테로이드, 시클로포스파미드, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 브레퀴나르, 레플루노미드, 미조리빈, 마이코페놀산, 마이코페놀레이트 모페틸, 15-데옥시스페르구알린, 면역억제성 항체, 특히 백혈구 수용체, 예를 들어, MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, B7, CD45, CD58 또는 그들의 리간드에 대한 모노클로날 항체, 또는 CTLA41g와 같은 기타 면역조절성 화합물과 함께 사용할 때 상승 효과가 발생할 수 있다. 본 발명의 화합물이 다른 요법과 함께 투여되는 경우, 병용-투여되는 화합물의 투약량은 이용하는 병용-약물의 유형, 이용하는 특정 약물, 치료할 상태 등에 따라 물론 달라질 것이다.

본 발명은 또한 제약 조합물, 예를 들어 a) 유리 형태 또는 제약상 허용가능 한 염 형태의 본원에 개시한 바와 같은 본 발명의 화합물인 제1 작용제; 및 b) 1종 이상의 병용제를 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 투여를 위한 지침서를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "병용-투여" 또는 "조합 투여" 등의 용어는 선택한 치료제의 단일 환자에 대한 투여를 포괄함을 의미하며, 약제들이 반드시 동일한 투여 경로로 또는 동시에 투여될 필요는 없는 치료 처방을 포함하고자 한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "제약 조합물"이라는 용어는 하나를 초과하는 활성 성분을 혼합 또는 조합하여 생성된 산물을 의미하며, 활성 성분들의 고정적 및 비-고정적 조합물 양자 모두를 포함한다. "고정적 조합물"이라는 용어는 활성 성분, 예를 들어 화학식 I의 화합물 및 병용제가 양자 모두 단일체 또는 단일 투약량의 형태로 환자에게 동시에 투여됨을 의미한다. "비-고정적 조합물"은 활성 성분, 예를 들어 화학식 I의 화합물 및 병용제가 양자 모두 별개체로서, 일제히, 동시에 또는 특정의 시간 제한 없이 순차적으로 환자에게 투여됨을 의미하며, 여기서 상기의 투여는 환자의 체내에 치료적으로 유효한 수준의 2종의 화합물을 제공한다. 후자는 칵테일 요법, 예를 들어 3종 이상의 활성 성분의 투여에도 적용된다.

본 발명의 화합물의 제조 방법

본 발명은 또한 본 발명의 화합물의 제조 방법을 포함한다. 기재된 반응에서, 최종 생성물에 반응성 관능기, 예를 들어 히드록시, 아미노, 이미노, 티오 또는 카르복시기를 원할 경우, 그들의 원치않는 반응 참여를 피하기 위해서 그들을 보호하는 것이 필요할 수 있다. 통상의 보호기를 표준 실무에 따라 사용할 수 있 으며, 예를 들어 문헌 [T. W. Greene and P. G. M. Wuts in "Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley and Sons, 1991]을 참고한다.

화학식 I의 화합물은 하기의 반응식 I에서와 같이 진행하여 제조할 수 있다.

식 중, n, R₁, R₂, R₃, R₄, R₇, Y₁ 및 Y₂는 발명의 개요에 정의된 바와 같다. 화학식 I의 화합물은 적합한 용매 (예를 들어, 디클로로메탄 등) 및 적합한 염기 (예를 들어, 디이소프로필에틸아민 등)의 존재 하에 화학식 2의 화합물을 화학식 3의 화합물과 반응시켜 합성할 수 있다. 반응은 약 0℃ 내지 약 40℃의 온도 범위에서 진행되며, 완료되기까지는 약 10시간 정도가 소요될 수 있다. 반응 혼합물은 임의의 보호기를 제거하기 위해서 임의로 추가로 반응시킨다.

화학식 I의 화합물의 합성의 상세한 예는 아래 실시예에서 찾을 수 있다.

본 발명 화합물의 추가적 제조 방법

본 발명의 화합물은 상기 화합물의 유리 염기 형태를 제약상 허용가능한 무기 또는 유기 산과 반응시켜, 제약상 허용가능한 산 부가염으로서 제조할 수 있다. 다르게는, 본 발명의 화합물의 제약상 허용가능한 염기 부가염은 상기 화합물의 유리 산 형태를 제약상 허용가능한 무기 또는 유기 염기와 반응시켜 제조할 수 있다.

다르게는, 본 발명의 화합물의 염 형태는 출발 물질 또는 중간체의 염을 사용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 화합물의 유리 산 또는 유리 염기 형태는 상응하는 염기 부가염 또는 산 부가염 형태로부터 각각 제조할 수 있다. 예를 들어, 산 부가염 형태의 본 발명의 화합물은 적합한 염기 (예를 들어, 수산화암모늄 용액, 수산화나트륨 등)로 처리하여 상응하는 유리 염기로 전환할 수 있다. 염기 부가염 형태의 본 발명의 화합물은 적합한 산 (예를 들어, 염산 등)으로 처리하여 상응하는 유리 산으로 전환할 수 있다.

비산화된 형태의 본 발명의 화합물은 0 내지 80℃에서 적합한 비활성 유기 용매 (예를 들어, 아세토니트릴, 에탄올, 수성 디옥산 등) 중에서 본 발명의 화합물의 N-옥시드를 환원제 (예를 들어, 황, 이산화황, 트리페닐 포스핀, 리튬 보로히드라이드, 소듐 보로히드라이드, 포스포러스 트리클로라이드, 트리브로마이드 등)로 처리하여 제조할 수 있다.

본 발명의 화합물의 프로드러그 유도체는 당업자에게 공지된 방법 (예를 들어, 추가의 상세사항은 문헌 [Saulnier et al., (1994), Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 4, p. 1985] 참고)으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 적당한 프로드러그는 본 발명의 비-유도체화된 화합물을 적합한 카르바밀화제 (예를 들어, 1,1-아실옥시알킬카르바노클로리데이트, 파라-니트로페닐 카보네이트 등)와 반응시켜 제조할 수 있다.

본 발명의 화합물의 보호된 유도체는 당업자에게 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 보호기의 생성 및 그들의 제거에 적용가능한 기술에 대한 상세한 설명은 문헌 [T. W. Greene, "Protecting Groups in Organic Chemistry", 3^rd edition, John Wiley and Sons, Inc., 1999]에서 찾을 수 있다.

본 발명의 화합물은 편리하게는 본 발명의 방법 도중 용매화물 (예를 들어, 수화물)로서 제조 또는 형성될 수 있다. 본 발명의 화합물의 수화물은 편리하게는 디옥신, 테트라히드로푸란 또는 메탄올과 같은 유기 용매를 사용하여, 수성/유기 용매 혼합물로부터의 재결정화에 의하여 제조할 수 있다.

본 발명의 화합물은 상기 화합물의 라세미 혼합물을 광학 활성 분해제와 반응시켜 부분입체이성질체 화합물 쌍을 형성하고, 부분입체이성질체들을 분리하고, 광학적으로 순수한 거울상이성질체를 회수함으로써 그들의 개별 입체이성질체로서 제조할 수 있다. 거울상이성질체의 분해는 본 발명의 화합물의 공유 부분입체이성질성 유도체를 사용하여 수행할 수 있지만, 분리가능한 복합체가 바람직하다 (예를 들어, 결정성 부분입체이성질체 염). 부분입체이성질체는 별개의 물성 (예를 들어, 융점, 비점, 용해도, 반응성 등)을 갖고, 이러한 차이점을 이용하여 쉽게 분리할 수 있다. 부분입체이성질체는 크로마토그래피에 의하여, 또는 바람직하게는 용해도 차이에 기초하는 분리/분해 기술에 의하여 분리될 수 있다. 이때 광학적으로 순수한 거울상이성질체는 라세미화를 일으키지 않는 임의의 실무적 방법에 의해서 분해제와 함께 회수된다. 화합물의 라세미 혼합물로부터의 그의 입체이성질체의 분해에 적용가능한 기술의 더욱 상세한 설명은 문헌 [Jean Jacques, Andre Collet, Samuel H. Wilen, "Enantiomers, Racemates and Resolutions", John Wiley And Sons, Inc., 1981]에서 찾을 수 있다.

요약하면, 화학식 I의 화합물은 하기의 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조할 수 있다:

(a) 반응식 I의 단계; 및

(b) 임의로 본 발명의 화합물을 제약상 허용가능한 염으로 전환하는 단계;

(c) 임의로 본 발명의 화합물의 염 형태를 염이 아닌 형태로 전환하는 단계;

(d) 임의로 본 발명의 화합물의 비산화된 형태를 제약상 허용가능한 N-옥시드로 전환하는 단계;

(e) 임의로 본 발명의 화합물의 N-옥시드 형태를 그의 비산화된 형태로 전환하는 단계;

(f) 임의로 본 발명의 화합물의 이성질체 혼합물로부터 개별 이성질체를 분해하는 단계;

(g) 임의로 본 발명의 비-유도체화된 화합물을 제약상 허용가능한 프로드러그 유도체로 전환하는 단계; 및

(h) 임의로 본 발명의 화합물의 프로드러그 유도체를 비-유도체화된 형태로 전환하는 단계.

출발 물질의 제법을 특별히 기재하지 않는 한, 상기 화합물은 공지되어 있거나, 당업계에 공지된 방법과 유사하게 또는 이후의 실시예에 개시된 바와 같이 제조할 수 있다.

당업자는 상기 변형이 본 발명의 화합물의 제조 방법에 대한 예일 뿐, 주지된 기타의 방법도 유사하게 사용할 수 있음을 인식하게 될 것이다.

본 발명은 본 발명에 따른 화학식 I의 화합물의 제법을 예시하는 하기 실시예로 추가로 예시되지만, 여기에 한정되지는 않는다.

실시예 1

3-(4- 메틸 - 이미다졸 -1-일)-N-{4- 메틸 -3-[3- 메틸 -3-(7H- 피롤로[2,3-d]피리미 딘-4-일)- 우레이도 ]- 페닐 }-5- 트리플루오로메틸 - 벤즈아미드의 합성

4- 클로로 -7-(톨루엔-4- 술포닐 )-7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘

디클로로메탄 (65 ㎖) 중 6-클로로 데아자퓨린 (2.0 g, 13 m㏖, 1.0 당량)의 용액에 트리에틸아민 (1.98 ㎖, 14.3 m㏖, 1.1 당량) 및 4-디메틸아미노 피리딘 (촉매량)을 첨가하였다. 토실 클로라이드 (2.55 g, 13.4 m㏖, 1.03 당량)를 반응 혼합물에 조금씩 첨가하고, 이것을 추가로 30분 동안 평형을 유지하였다. 이어서 반응 혼합물을 디클로로메탄과 물 사이에 분배하였다. 유기층을 분리하고, 수성층을 디클로로메탄으로 추출하였다. 합친 유기 추출물을 물로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 여과 및 농축시켜 표제 생성물 2를 얻었다. 상기 표제 화합물을 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

메틸 -[7-(톨루엔-4- 술포닐 )-7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -4-일]-아민

메틸 아민 (THF 중 2.0 M 6.6 ㎖, 13.1 m㏖, 2.4 당량)을 23℃에서 THF (5 ㎖) 중 2 (1.7 g, 5.5 m㏖, 1.0 당량)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 주변 온도에서 3시간 동안 추가로 교반한 후, 고체 잔류물을 에틸 아세테이트와 물 사이에 분배하였다. 유기층을 분리하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 여과 및 농축시켜 표제 생성물을 얻었다. 상기 잔류물을 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

N- 클로로카르보닐 -N- 메틸 -[7-(톨루엔-4- 술포닐 )-7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -4-일]-아민

3 (0.250 g, 0.82 m㏖, 1.0 당량), 트리포스겐 (0.24 g, 0.82 m㏖, 1.0 당량) 및 디옥산 (2 ㎖)을 포함하는 스미스(Smith) 바이알 (2.5 ㎖)을 20분 동안 150℃에서 스미스 합성기를 사용하여 마이크로파 가열하였다. 이어서 반응 혼합물을 디클로로메탄과 물 사이에 분배하였다. 유기층을 분리하고 수성층을 디클로로메탄으로 추출하였다. 합친 유기 추출물을 물로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 여과 및 농축시켜 표제 생성물을 얻었고, 이것을 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

(4- 메틸 -3-{3- 메틸 -3-[7-(톨루엔-4- 술포닐 )-7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -4-일]-우 레이도 }- 페닐 )- 카르밤산 tert -부틸 에스테르

23℃에서 디클로로메탄 (2.0 ㎖) 중 5 (0.182 g, 0.82 m㏖, 1.0 당량), 및 디이소프로필에틸아민 (0.14 ㎖, 0.82 m㏖, 1.0 당량)의 용액에 15분에 걸쳐서 카르바모일 클로라이드 4 (0.3 g, 0.82 m㏖, 1.0 당량)를 적가하였다. 반응 혼합물을 8시간 동안 실온에서 추가로 교반한 후, 디클로로메탄과 물 사이에 분배하였다. 유기층을 분리하고 수성층을 디클로로메탄으로 추출하였다. 합친 유기 추출물을 물로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 여과 및 농축시켜 표제 생성물을 얻었고, 이것을 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

3-(5-아미노-2- 메틸 - 페닐 )-1- 메틸 -1-(7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -4-일)- 우레 아

디클로로메탄 (30 ㎖) 중 조 우레아 6 (3.2 g, 5.8 m㏖, 1.0 당량)에 이소프로판올 (11.6 ㎖, 58 m㏖, 10.0 당량) 중 5-6 N HCl을 첨가하여 맑은 용액을 얻었다. 반응 혼합물을 23℃에서 30분 동안 추가로 교반하여 생성물을 침전시켰다. 반응물을 진공에서 농축시키고, 중탄산나트륨 포화 수용액으로 중화시켰다. 유기물을 용매로서 에틸 아세테이트를 사용하여 추출해내고, Na₂SO₄로 건조시키고, 여과 및 농축시켜 deboc- 생성물을 얻었다.

(1:1 THF:MeOH)에 용해시킨 조 일차 아민 (2.3 g, 5.1 m㏖, 1.0 당량)의 용액에 Na-Hg (3.5 g, Na 기준으로 3.0 당량)를 첨가하였다. 반응물을 15분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 따라내어 수은 염을 제거하고 상청액을 감압 하에 농축시켰다. 고체 잔류물을 에틸 아세테이트와 물 사이에 분배하였다. 유기층을 분리하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 여과 및 농축시켜 조 생성물을 얻었다. 상기 조 생성물을 용매로서 9:1 v/v CH₂Cl₂:MeOH를 사용하는 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제하여 표제 화합물 7을 고체로서 얻었다.

3-(4- 메틸 - 이미다졸 -1-일)-N-{4- 메틸 -3-[3- 메틸 -3-(7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -4-일)- 우레이도 ]- 페닐 }-5- 트리플루오로메틸 - 벤즈아미드

DMF (0.5 ㎖) 중 7 (7 ㎎, 0.23 m㏖, 1.0 당량), 3-(4-메틸-이미다졸-1-일)- 5-트리플루오로메틸-벤조산 (7.6 ㎎, 0.27 m㏖, 1.2 당량), 및 DIPEA (40 ㎕, 0.27 m㏖, 1.2 당량)의 용액에 HATU (9.9 ㎎, 0.25 m㏖, 1.1 당량)를 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 용매를 진공 하에 제거하였다. 잔류물을 DMSO (1 ㎖)에 용해시켰다. 생성된 용액을 역상 LC-MS로 정제하여 표제 화합물을 TFA 염으로서 수득하였다:

실시예 2

N-[4- 메틸 -3-(2-7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -4-일- 아세틸아미노 )- 페닐 ]-3- 트리플루오로메틸 - 벤즈아미드의 합성

2-[7-(톨루엔-4- 술포닐 )-7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -4-일]-말론산 디메틸 에스테르

DMSO (2.0 ㎖) 중 NaH (25 ㎎, 0.62 m㏖, 3.1 당량)의 현탁액에 23℃에서 디메틸 말로네이트 (0.071 ㎖, 0.62 m㏖, 3.1 당량)를 첨가하였다. 수소의 방출이 멈춘 후, 2 (64 ㎎, 20 m㏖, 1.0 당량)를 첨가하였다. 반응물을 추가로 3시간 동안 80℃에서 평형을 유지시켰다. 이어서 반응물을 실온으로 냉각시키고, 포화 NH₄Cl로 켄칭하였다. 유기물을 용매로서 에틸 아세테이트를 사용하여 추출해내고, Na₂SO₄로 건조시키고, 여과 및 농축시켜 원하는 생성물 (79 ㎎, 94%)을 얻었다.

7-(톨루엔-4- 술포닐 )-7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -4-일]-아세트산 메틸 에스테르

MeOH (15 ㎖) 중 10 (0.63 g, 1.56 m㏖, 1.0 당량) 및 소듐 메톡시드 (25%w/v 용액 0.038 ㎖, 0.16 m㏖, 0.1 당량)의 혼합물을 1시간 동안 60℃에서 가열하였다. 이후에, 반응물을 농축시키고, 잔류물을 NH₄Cl로 켄칭시킨 후 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 Na₂SO₄로 건조시키고, 여과 및 농축시켰다. 조 생성물을 용매로서 헥산:에틸 아세테이트 (2:1)를 사용하여 정제하여 원하는 생성물을 얻었다.

N-(1-메틸렌-3-{2-[7-(톨루엔-4- 술포닐 )-7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -4-일]- 아세틸아미노 }- 펜트 -2- 에닐 )-3- 트리플루오로메틸 - 벤즈아미드

11 (60 ㎎, 0.17 m㏖, 1.0 당량) 및 12 (153 ㎎, 0.51 m㏖, 3.0 당량)의 혼합물을 4시간 동안 150℃로 가열하였다. 그때 반응을 완료시킨 후, 반응물을 실온으로 냉각시켰다. 조 생성물을 용매로서 헥산:에틸 아세테이트 (2:1)를 사용하여 정제하여 원하는 생성물을 얻었다.

5,5,5- 트리플루오로 -2- 메틸 - 펜트 -2- 엔산 [4- 메틸 -3-(2-7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -4-일- 아세틸아미노 )- 페닐 ]-아미드

(1:1 THF:MeOH)에 용해시킨 13 (61 ㎎, 0.1 m㏖, 1.0 당량)의 용액에 Na-Hg (172 ㎎, Na 기준으로 7.0 당량)를 첨가하였다. 반응물을 30분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 따라내어 수은 염을 제거하고 상청액을 감압 하에 농축시켰다. 고체 잔류물을 에틸 아세테이트와 물 사이에 분배시켰다. 유기층을 분리하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 여과 및 농축시켜 조 생성물을 얻었다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 용매를 진공 하에 제거하였다. 잔류물을 DMSO (1 ㎖)에 용해시켰다. 생성 된 용액을 역상 LC-MS로 정제하여 표제 화합물을 TFA 염으로서 수득하였다: MS m/z 454.2 (M + 1).

실시예 3

N-(3- 이미다졸 -1-일-5- 트리플루오로메틸 - 페닐 )-4- 메틸 -3-[3- 메틸 -3-(7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -4-일)- 우레이도 ]- 벤즈아미드의 합성

4- 메틸 -N-[3-(4- 메틸 - 이미다졸 -1-일)-5- 트리플루오로메틸 - 페닐 ]-3-{3- 메틸 -3-[7-(톨루엔-4- 술포닐 )-7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -4-일]- 우레이도 }- 벤즈아미드

23℃에서 디클로로메탄 (0.5 ㎖) 중 15 (15 ㎎, 0.04 m㏖, 1.0 당량), 및 디이소프로필에틸아민 (6.8 ㎕, 0.04 m㏖, 1.0 당량)의 용액에 15분에 걸쳐서 카르바모일 클로라이드 4 (14.5 ㎎, 0.04 m㏖, 1.0 당량)를 적가하였다. 반응 혼합물을 8시간 동안 실온에서 추가로 교반한 후, 디클로로메탄과 물 사이에 분배하였다. 유기층을 분리하고 수성층을 디클로로메탄으로 추출하였다. 합친 유기 추출물을 물로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 여과 및 농축시켜 표제 생성물 16을 얻었다. 상기 잔류물을 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

4- 메틸 -N-[3-(4- 메틸 - 이미다졸 -1-일)-5- 트리플루오로메틸 - 페닐 ]-3-[3- 메틸 - 3-(7H-피 롤로[2,3-d]피 리미딘-4-일)- 우레이도 ]- 벤즈아미드

(1:1 THF:MeOH)에 용해시킨 16 (22 ㎎, 0.031 m㏖, 1.0 당량)의 용액에 Na-Hg (22 ㎎, Na 기준으로 2.0 당량)를 첨가하였다. 반응물을 30분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 따라내어 수은 염을 제거하고 상청액을 감압 하에 농축시켰다. 고체 잔류물을 에틸 아세테이트와 물 사이에 분배하였다. 유기층을 분리하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 여과 및 농축시켜 조 생성물을 얻었다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 용매를 진공 하에 제거하였다. 잔류물을 DMSO (1 ㎖)에 용해시켰다. 생성된 용액을 역상 LC-MS로 정제하여 표제 화합물을 TFA 염으로서 수득하였다: MS m/z 549.2 (M + 1).

실시예 4

N-[4-(4-에틸-피페라진-1- 일메틸 )-3- 트리플루오로메틸 - 페닐 ]-4- 메틸 -3-[3- 메 틸-3-(7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -4-일)- 우레이도 ]- 벤즈아미드의 합성

1. 1-에틸-4-(4-니트로-2- 트리플루오로메틸 -벤질)-피페라진

사염화탄소 (250 ㎖) 중 1-메틸-4-니트로-2-트리플루오로메틸-벤젠 (1; 15 g, 73 m㏖, 1.0 당량)의 용액에 개시제로서 NBS (13 g, 98 ㎖, 73 m㏖, 1.0 당량) 및 AIBN (1.19 g, 7.3 m㏖, 0.1 당량)을 첨가하였다. 반응물을 밤새 환류시킨 후, 물로 분배시켰다. 유기층을 분리하고 수성층을 디클로로메탄으로 추출하였다. 합친 유기 추출물을 물로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 여과 및 농축시켜 고체를 얻었다. 상기 고체를 디클로로메탄 (300 ㎖)에 용해시켰다. 상기 맑은 용액을 DIEA (12.55 ㎖, 73 m㏖, 1.0 당량) 및 N-에틸피페라진 (8.25 g, 73 m㏖, 1.0 당량)으로 처리하였다. 반응 혼합물을 (LC-MS에 따라 반응이 완료될 때까지) 30분 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 여과 및 농축시켜 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 용매로서 1:1 v/v 헥산:에틸 아세테이트를 사용하여 플래시 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물 2를 고체로서 얻었다.

2. 4-(4-에틸-피페라진-1- 일메틸 )-3- 트리플루오로메틸 - 페닐아민

MeOH (250 ㎖) 중 4-(4-에틸-피페라진-1-일메틸)-3-트리플루오로메틸-페닐아민 (10 g, 31.54 m㏖, 1.0 당량) 용액에 라니(Raney) 니켈 (1.0 g, 10 중량%)을 첨가하였다. 현탁액을 24시간 동안 수소 분위기 (1 기압) 하에 교반하였다. LC-MS가 나타내는 반응의 종료시, 반응물을 셀라이트로 여과하고, 여과액을 감압 하에 농축시켜 원하는 생성물을 수득하였다.

3. N-[4-(4-에틸-피페라진-1- 일메틸 )-3- 트리플루오로메틸 - 페닐 ]-4- 메틸 -3-니트로- 벤즈아미드

디클로로메탄 (140 ㎖) 중 4-(4-에틸-피페라진-1-일메틸)-3-트리플루오로메틸-페닐아민 (8.0 g, 27.9 m㏖, 1.0 당량)의 용액에 디이소프로필에틸 아민 (5.27 ㎖, 30.69 m㏖, 1.1 당량)을 첨가하였다. 용액을 0℃로 냉각시킨 후, 4-메틸-3-니트로벤조일클로라이드 (4.18 ㎖, 28.73 m㏖, 1.03 당량)를 반응 혼합물에 조금씩 첨가하고, 이것을 추가로 30분 동안 평형을 유지시켰다. 이어서 반응 혼합물을 디클로로메탄과 물 사이에 분배시켰다. 유기층을 분리하고 수성층을 디클로로메탄으로 추출하였다. 합친 유기 추출물을 물로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 여과 및 농축시켜 원하는 생성물을 얻었고, 이것을 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

4. 3-아미노-N-[4-(4-에틸-피페라진-1- 일메틸 )-3- 트리플루오로메틸 - 페닐 ]-4- 메틸 - 벤즈아미드

MeOH (250 ㎖) 중 N-[4-(4-에틸-피페라진-1-일메틸)-3-트리플루오로메틸-페 닐]-4-메틸-3-니트로-벤즈아미드 (10 g, 22.2 m㏖, 1.0 당량)의 용액에 라니 니켈 (1.0 g, 10 중량%)을 첨가하였다. 현탁액을 24시간 동안 수소 분위기 (1 기압) 하에 교반하였다. HPLC가 나타내는 반응의 종료시, 반응물을 셀라이트로 여과하고, 여과액을 감압 하에 농축시켜 원하는 생성물 3을 수득하였다:

5. 4- 클로로 -7-(톨루엔-4- 술포닐 )-7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘

디클로로메탄 (325 ㎖) 중 6-클로로 데아자퓨린 (4, 10.0 g, 65 m㏖, 1.0 당량)의 용액에 트리에틸아민 (9.9 ㎖, 71.5 m㏖, 1.1 당량) 및 4-디메틸아미노 피리딘 (촉매량)을 첨가하였다. 토실 클로라이드 (12.76 g, 66.9 m㏖, 1.03 당량)를 반응 혼합물에 조금씩 첨가하고, 이것을 추가로 30분 동안 평형을 유지시켰다. 이어서 반응 혼합물을 디클로로메탄과 물 사이에 분배시켰다. 유기층을 분리하고 수성층을 디클로로메탄으로 추출하였다. 합친 유기 추출물을 물로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 여과 및 농축시켜 표제 생성물을 얻었고, 이것을 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

6. 메틸 -[7-(톨루엔-4- 술포닐 )-7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -4-일]-아민

메틸 아민 (THF 중 2.0 M 66 ㎖, 13.1 m㏖, 2.4 당량)을 23℃에서 THF (50 ㎖) 중 4-클로로-7-(톨루엔-4-술포닐)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘 (17 g, 55 m㏖, 1.0 당량)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 주변 온도에서 3시간 동안 추가로 교반하였다. 반응을 완료시킨 후, THF를 감압 하에 제거하고, 고체 잔류물을 에틸 아세테이트:THF (1:1)와 물 사이에 분배시켰다. 유기층을 분리하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 여과 및 농축시켜 표제 생성물 5를 얻었고, 이것을 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

7. N - 클로로카르보닐 - N - 메틸 -[7-(톨루엔-4- 술포닐 )-7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -4-일]-아민

5 (2.50 g, 8.2 m㏖, 1.0 당량), 트리포스겐 (2.4 g, 8.2 m㏖, 1.0 당량)및 디옥산 (15 ㎖)을 포함하는 스미스 바이알 (20 ㎖)을 20분 동안 150℃에서 스미스 합성기를 사용하여 마이크로파 가열시켯다. 반응 혼합물을 농축시켰다. 이어서 잔류물을 디클로로메탄과 물 사이에 분배시켰다. 유기층을 분리하고, 수성층을 디클로로메탄으로 추출하였다. 합친 유기 추출물을 물로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시 키고, 여과 및 농축시켜 표제 생성물 6을 얻었고, 이것을 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

8. N-[4-(4-에틸-피페라진-1- 일메틸 )-3- 트리플루오로메틸 - 페닐 ]-4- 메틸 -3-{3-메틸-3-[7-(톨루엔-4- 술포닐 )-7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -4-일]- 우레이도 }- 벤즈아미드

23℃에서 디클로로메탄 (40 ㎖) 중 3 (3.45 g, 8.2 m㏖, 1.0 당량), 및 피리딘 (0.66 ㎖, 0.82 m㏖, 1.0 당량)의 용액에 15분에 걸쳐서 카르바모일 클로라이드 6 (3 g, 8.2 m㏖, 1.0 당량)를 적가하였다. 반응 혼합물을 8시간 동안 실온에서 추가로 교반한 후, 디클로로메탄과 물 사이에 분배시켰다. 유기층을 분리하고 수성층을 디클로로메탄으로 추출하였다. 합친 유기 추출물을 물로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 여과 및 농축시켜 조 생성물 7을 얻었다. 상기 잔류물을 MeOH/CH₂Cl₂ (5:1)를 용리액으로 하는 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 정제하여 표제 생성물 7을 얻었다.

9. N -[4-(4-에틸-피페라진-1- 일메틸 )-3- 트리플루오로메틸 - 페닐 ]-4- 메틸 -3-[3-메틸-3-(7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -4-일)- 우레이도 ]- 벤즈아미드

THF (10 ㎖)에 용해시킨 토실화된 우레아 7 (1.5 g, 2.0 m㏖, 1.0 당량)에 Na-Hg (0.92 g, Na 기준으로 2.0 당량)에 이어서 트리플루오로에탄올 (291 ㎕, 4.0 m㏖, 2.0 당량)을 첨가하였다. 반응물을 15분 동안 교반하고, 따라내어 수은 염 및 상청액을 제거하고, 감압 하에 농축시켰다. 고체 잔류물을 에틸 아세테이트와 물 사이에 분배시켰다. 유기층을 분리하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 여과 및 농축시켜 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하여 표제 화합물 8을 얻었다.

적당한 출발 물질을 사용하여 상기 실시예에 기재한 절차를 반복함으로써, 표 1에서 확인되는 바와 같은 하기의 화학식 I의 화합물을 수득하였다.

검정

본 발명의 화합물을, 모 32D 세포에 비하여 BCR-Abl을 발현하는 32D 세포 (32D-p210)의 세포 증식을 선택적으로 억제하는 그들의 능력을 측정하기 위하여 검정하였다. 이러한 BCR-Abl 형질전환된 세포의 증식을 선택적으로 억제하는 화합물을 Bcr-abl의 야생형 또는 돌연변이 형태를 발현하는 Ba/F3 세포에 대한 항증식 활성에 대하여 시험하였다.

세포성 BCR - Abl 의존성 증식의 억제 ( 고처리량 방법)

사용한 뮤린 세포주는 BCR-Abl cDNA로 형질전환된 32D 조혈 전구 세포주이다 (32D-p210). 이 세포를 페니실린 50 ㎍/㎖, 스트렙토마이신 50 ㎍/㎖ 및 L-글루타민 200 mM로 보충한 RPMI/10% 송아지 태아 혈청 (RPMI/FCS) 중 유지하였다. 비형질전환된 32D 세포는 IL3의 공급원으로서 15%의 WEHI 적응용 배지를 첨가하여 유사하게 유지하였다.

50 ㎕의 32D 또는 32D-p210 세포 현탁액을 그라이너(Greiner) 384 웰 마이크로플레이트 (블랙)에 웰 당 5000개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 50 nl의 시험 화합물 (DMSO 저장액 중 1 mM)을 각 웰에 첨가하였다 (STI571은 양성 대조군으로서 포함됨). 세포를 37℃, 5% CO₂에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 10 ㎕의 60% 알라마르 블루(Alamar Blue) 용액 (텍 디아그노스틱스(Tek diagnostics))을 각 웰에 첨가하고, 세포를 추가로 24시간 동안 인큐베이션하였다. 형광 강도 (530 ㎚에서 여기, 580 ㎚에서 방출)를 액퀘스트(Acquest)(등록상표) 시스템 (몰리큘러 디바이시즈(Molecular Devices))을 사용하여 정량화하였다.

세포성 BCR - Abl 의존성 증식의 억제

32D-p210 세포를 96 웰 TC 플레이트에 웰 당 15,000개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 시험 화합물 (C_max는 40 μM)의 2배 순차 희석액 50 ㎕를 각 웰에 첨가하였다 (STI571은 양성 대조군으로서 포함됨). 세포를 37℃, 5% CO₂에서 48시간 동안 인큐베이션한 후, MTT (프로메가(Promega)) 15 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 세포를 추가로 5시간 동안 인큐베이션하였다. 570 ㎚에서의 광학 밀도를 분광광도계로 정량화하고, 용량 반응 곡선으로부터, 50% 억제에 필요한 화합물의 농도인 IC₅₀ 값을 결정하였다.

세포 주기 분포에 대한 효과

32D 및 32D-p210 세포를 6 웰 TC 플레이트에, 배지 5 ㎖ 중 웰 당 2.5×10⁶개 세포로 플레이팅하고, 1 또는 10 μM의 시험 화합물을 첨가하였다 (STI571은 대조군으로서 포함됨). 이어서 세포를 37℃, 5% CO₂에서 24 또는 48시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 현탁액 2 ㎖를 PBS로 세척하고, 70% EtOH로 1시간 동안 고정시키고, PBS/EDTA/RNase A로 30분 동안 처리하였다. 요오드화프로피듐 (Cf = 10 ㎍/㎖)을 첨가하고, 형광 강도를 팩스칼리버(FACScalibur)(등록상표) 시스템 (비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences))에서 유세포 분석법으로 정량화하였다. 본 발명의 시험 화합물은 32D-p210 세포에 대한 세포자멸 효과는 입증하였으나, 32D 모세포에서는 세포자멸사를 유도하지 않았다.

세포성 BCR - Abl 자가인산화에 대한 효과

BCR-Abl 자가인산화를 c-abl 특이적 포획 항체 및 항포스포티로신 항체를 사용하여 포획 엘리자(Elisa)로 정량화하였다. 32D-p210 세포를 96 웰 TC 플레이트에 배지 50 ㎕ 중 웰 당 2×10⁵개 세포로 플레이팅하였다. 시험 화합물 (C_max는 10 μM)의 2배 순차 희석액 50 ㎕를 각 웰에 첨가하였다 (STI571은 양성 대조군으로서 포함됨). 세포를 37℃, 5% CO₂에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 얼음에서 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA 및 1% NP-40) 150 ㎕로 1시간 동안 처리하였다. 세포 용해물 50 ㎕를 항-abl 특이적 항체로 미리 코팅시키고 블로킹한 96 웰 광학플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 4℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. TBS-트윈(Tween) 20 완충액으로 세척한 후, 알칼리-포스파타제 콘쥬게이션된 항-포스포티로신 항체 50 ㎕를 첨가하고, 플레이트를 밤새 4℃에서 추가로 인큐베이션하였다. TBS-트윈 20 완충액으로 세척한 후, 발광성 기질 90 ㎕를 첨가하고, 발광을 액퀘스트 시스템 (몰리큘러 디바이시즈)을 사용하여 정량화하였다. BCR-Abl 발현 세포의 증식을 억제하는 본 발명의 시험 화합물은 세포성 BCR-Abl 자가인산화를 용량-의존적 방식으로 억제하였다.

Bcr - abl 의 돌연변이 형태를 발현하는 세포의 증식에 대한 효과

본 발명의 화합물을 BCR-Abl의 야생형 또는 STI571에 대하여 내성이 부여되거나 민감성이 감소된 돌연변이 형태 (G250E, E255V, T315I, F317L, M351T)를 발현하는 Ba/F3 세포에 대한 그들의 항증식 효과에 대하여 시험하였다. 돌연변이-BCR-Abl 발현 세포 및 비형질전환된 세포에 대한 상기 화합물의 항증식 효과를 (IL3 결핍 배지 중) 앞서 기재한 바와 같이 10, 3.3, 1.1 및 0.37 μM에서 시험하였다. 비형질전환된 세포에 대하여 독성이 없는 화합물의 IC₅₀ 값을 앞서 기재한 바와 같이 수득한 용량 반응 곡선으로부터 결정하였다.

FGFR3 (효소 검정)

정제된 FGFR3 (업스테이트(Upstate))를 이용한 키나제 활성 검정을 키나제 완충액 (30 mM Tris-HCl pH 7.5, 15 mM MgCl₂, 4.5 mM MnCl₂, 15 μM Na₃V0₄ 및 50 ㎍/㎖ BSA), 및 기질 (5 ㎍/㎖ 비오틴-폴리-EY(Glu, Tyr) (시아이에스-유에스, 인코퍼레이티드(CIS-US, Inc.)) 및 3 μM ATP) 중 효소 0.25 ㎍/㎖를 함유하는 최종 부피 10 ㎕ 중에서 실시하였다. 2종의 용액을 제조하였다: 키나제 완충액 중 FGFR3 효소를 함유하는 제1 용액 5 ㎕를 먼저 384-포맷 프록시플레이트(ProxiPlate)(등록상표) (퍼킨-엘머(Perkin-Elmer))에 분산시킨 후, DMSO에 용해시킨 화합물 50 nL를 첨가하고, 이어서 키나제 완충액 중 기질 (폴리-EY) 및 ATP를 함유하는 제2 용액 5 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 30 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5 M KF, 50 mM ETDA, 0.2 ㎎/㎖ BSA, 15 ㎍/㎖ 스트렙트아비딘-XL665 (시아이에스-유에스, 인코퍼레이티드) 및 150 ng/㎖ 크립테이트 콘쥬게이션된 항-포스포티로신 항체 (시아이에스-유에스, 인코퍼레이티드)를 함유하는 HTRF 검출 혼합물 10 ㎕를 첨가하여 중지시켰다. 실온에서 1시간 인큐베이션하여 스트렙트아비딘-비오틴을 상호작용시킨 후, 애널리스트 지티(Analyst GT) (몰리큘러 디바이시즈 코퍼레이션(Molecular Devices Corp.))로 시분해 형광 신호를 판독하였다. 12 가지 농도 (50 μM 내지 0.28 nM의 1:3 희석)에서 각 화합물의 백분율 억제의 선형 회귀 분석에 의해서 IC₅₀ 값을 계산하였다. 상기 검정에서, 본 발명의 화합물의 IC₅₀ 값은 10 nM 내지 2 μM 범위였다.

FGFR3 (세포 검정)

본 발명의 화합물을, FGFR3 세포 키나제 활성에 의존적인, 형질전환된 Ba/F3-TEL-FGFR3 세포 증식을 억제하는 그들의 능력에 대하여 시험하였다. Ba/F3-TEL-FGFR3를 배양 배지로서 10% 소 태아 혈청을 보충한 RPMI 1640을 이용하여, 현탁액 중 800,000개 이하의 세포/㎖로 배양하였다. 세포를 384-웰 포맷 플레이트에 50 ㎕ 배양 배지 중 5000개 세포/웰로 분산시켰다. 본 발명의 화합물을 디메틸술폭시드 (DMSO)에 용해 및 희석시켰다. 12 가지 1:3 순차 희석액을 DMSO에 넣어 전형적으로 10 mM 내지 0.05 μM 범위의 농도 구배를 생성하였다. 세포에 희석 화합물 50 nL를 첨가하고, 세포 배양 인큐베이터에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 증식하는 세포에 의해 생성되는 환원 환경을 모니터링하는데 사용할 수 있는 알라마르블루(등록상표) (트렉 디아그노스틱 시스템즈(TREK Diagnostic Systems))를 세포에 최종 농도 10%로 첨가하였다. 37℃ 세포 배양 인큐베이터에서 추가로 4시간 인큐베이션한 후, 환원된 알라마르블루 (530 ㎚에서 여기, 580 ㎚에서 방출)로부터의 형광 신호를 애널리스트 지티 (몰리큘러 디바이시즈 코퍼레이션)로 정량화하였다. 12 가지 농도에서의 각 화합물의 백분율 억제의 선형 회귀 분석에 의해 IC₅₀ 값을 계산하였다.

FLT3 및 PDGFR β (세포 검정)

FLT3 및 PDGFRβ의 세포 활성에 대한 본 발명의 화합물의 효과를, Ba/F3-TEL-FGFR3 대신 Ba/F3-FLT3-ITD 및 Ba/F3-Tel-PDGFRβ를 각각 사용한 것을 제외하고는, FGFR3 세포 활성에 대하여 앞서 기재한 바와 동일한 방법을 사용하여 수행하였다.

b- Raf - 효소 검정

본 발명의 화합물을 b-Raf의 활성을 억제하는 그들의 능력에 대하여 시험하였다. 상기 검정은 벽이 검고 바닥이 투명한 384-웰 맥시소르프(MaxiSorp) 플레이트 (눈크(NUNC))에서 수행하였다. 기질인 IκBα를 DPBS에 희석 (1:750)시키고, 15 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 엠블라(EMBLA) 플레이트 세척기를 사용하여 TBST (25 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl 및 0.05% 트윈-20)로 3회 세척하였다. 플레이트를 수퍼블록(Superblock) (15 ㎕/웰)으로 3시간 동안 실온에서 블로킹하고, TBST로 3회 세척하고, 두드려서 건조시켰다. 20 μM ATP (10 ㎕)를 함유하는 검정 완충액에 이어서 100 nl 또는 500 nl의 화합물을 각 웰에 첨가하였다. B-Raf를 검정 완충액에 희석 (1 ㎕를 25 ㎕에)시키고, 희석시킨 b-Raf 10 ㎕를 각 웰에 첨가하였다 (0.4 ㎍/웰). 플레이트를 실온에서 2.5시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 TBST로 6회 세척하여 키나제 반응을 중지시켰다. 포스프-IκBα (Ser32/36) 항체를 수퍼블록에 희석 (1:10,000)시키고, 15 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, TBST로 6회 세척하였다. AP-콘쥬게이션된 염소-항-마우스 IgG를 수퍼블록에 희석 (1:1,500)시키고, 15 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, TBST로 6회 세척하였다. 형광 아토포스 에이피(Attophos AP) 기질 (프로메가) 15 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 형광 강도 프로그램(Fluorescence Intensity Program)을 사용하여 액퀘스트 또는 애널리스트 지티에서 플레이트를 판독하였다 (여기 455 ㎚, 방출 580 ㎚).

b- Raf - 세포 검정

본 발명의 화합물을 MEK의 인산화를 억제하는 그들의 능력에 대하여 A375 세포에서 시험하였다. A375 세포주 (ATCC)는 인간 흑색종 환자로부터 유래한 것이고, B-Raf 유전자에 V599E 돌연변이를 갖는다. 인산화되는 MEK의 수치가 B-Raf의 돌연변이로 인하여 상승한다. 서브-컨플루언트 내지 컨플루언트 A375 세포를 무혈청 배지 중 37℃에서 2시간 동안 상기 화합물과 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 냉 PBS로 1회 세척하고, 1% 트리톤(Triton) X100을 함유하는 용해 완충액으로 용해시켰다. 원심분리 후, 상청액을 SDS-PAGE에 적용한 후, 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 이어서 항-포스포-MEK 항체 (ser217/221) (셀 시그널링(Cell Signaling))를 이용하여 상기 막을 웨스턴 블라팅(western blotting)에 적용하였다. 인산화된 MEK의 양은 니트로셀룰로스 막에서의 포스포-MEK 밴드의 밀도로 모니터링하였다.

업스테이트 키나제프로파일러 ( Upstate KinaseProfiler )(등록상표) - 방사능-효소 필터 결합 검정

본 발명의 화합물을 키나제 패널의 개별 구성원을 억제하는 그들의 능력에 대하여 평가하였다. 다음의 일반적인 프로토콜에 따라, 최종 농도 10 μM에서 화합물을 이중으로 시험하였다. 키나제 완충액 조성물 및 기질은 "업스테이트 키나제프로파일러" 패널에 포함된 여러 키나제마다 다르다는 것을 주의한다. 키나제 완충액 (2.5 ㎕, 1O× - 필요한 경우 MnCl₂ 함유), 활성 키나제 (0.001-0.01 유닛; 2.5 ㎕), 키나제 완충액 중 특정 또는 폴리(Glu4-Tyr) 펩티드 (5-500 μM 또는 0.01 ㎎/㎖) 및 키나제 완충액 (50 μM; 5 ㎕)을 얼음에서 에펜도르프 내에서 혼합하였다. Mg/ATP 믹스 (10 ㎕; 67.5 (또는 33.75) mM MgCl₂, 450 (또는 225) μM ATP 및 1 μCi/㎕[γ-³²P]-ATP (3000 Ci/m㏖))를 첨가하고, 반응물을 약 30℃에서 약 10분 동안 인큐베이션하였다. 2 ㎝ × 2 ㎝ P81 (포스포셀룰로스, 양성 전하를 띠는 펩티드 기질용) 또는 와트먼 1호(Whatman No.1) (폴리(Glu4-Tyr)펩티드 기질용) 페이퍼 스퀘어 위에 반응 혼합물을 스포팅 (20 ㎕)하였다. 검정용 스퀘어를 0.75% 인산으로 각 5분씩 4회 세척하고, 아세톤으로 5분 동안 1회 세척하였다. 검정용 스퀘어를 섬광 바이알로 옮기고, 섬광 칵테일 5 ㎖를 첨가하고, 펩티드 기질에 대한 ³²P 혼입 (cpm)을 베크먼(Beckman) 섬광 계수기로 정량화하였다. 백분율 억제를 각 반응에 대하여 계산하였다.

유리 형태 또는 제약상 허용가능한 염 형태의 화학식 I의 화합물은, 예를 들어, 본 출원에 기재한 시험관 내 시험에 의해 나타낸 바와 같은 유용한 약리 특성을 나타낸다. 예를 들어, 화학식 I의 화합물은 바람직하게는 야생형 및 돌연변이 BCR-Abl에 대하여 1×10^-10 내지 1×10^-5 M 범위, 바람직하게는 500 nM, 250 nM, 100 nM 및 50 nM 미만의 IC₅₀을 나타내었다.

예를 들어, N-[4-(4-에틸-피페라진-1- 일메틸 )-3- 트리플루오로메틸 - 페닐 ]-4-메틸-3-[3- 메틸 -3-(7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -4-일)- 우레이도 ]- 벤즈아미드 (실시예 4)는 야생형, G250E, E255V, T315I, F317L 및 M351T Bcr-abl에 대하여 각각 IC₅₀이 5 nM 미만, 5 nM 미만, 5 nM 미만, 5 nM 미만, 5 nM 미만 및 0.5 nM 미만이었다.

예를 들어, N-[4-(4-에틸-피페라진-1- 일메틸 )-3- 트리플루오로메틸 - 페닐 ]-4-메틸-3-[3- 메틸 -3-(7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -4-일)- 우레이도 ]- 벤즈아미드 (실시예 4)는 FGFR3, FLT-3, PDGFR-β 및 B-RAF에 대하여 각각 IC₅₀이 36 nM, 15 nM, 3.8 nM 및 100 nM이었다.

본 발명의 화합물은 키나제 프로파일에 나열된 일부 키나제를 40% 초과, 바람직하게는 50% 초과, 더욱 바람직하게는 60% 초과로 억제하였다. 예를 들어, N-[4-(4-에틸-피페라진-1- 일메틸 )-3- 트리플루오로메틸 - 페닐 ]-4- 메틸 -3-[3- 메틸 -3-(7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -4-일)- 우레이도 ]- 벤즈아미드 (실시예 4)는 다음의 억제 프로파일을 나타내었다 (키나제를 괄호 안의 백분율 억제와 함께 나타냄): Abl(T315L) (98%); Abl(m) (98%); Bmk(h) (100%); BTK(h) (99%); c-RAF(h) (97%); CSK(h) (100%); cSRC(h) (99%); Fes(h) (97%); FGFR3(h) (98%); Flt3(h) (96%); IKKα(h) (98%); IKKβ(h) (96%); JNK1α1(h) (81%); JNK2α2(h) (99%); Lck(h) (100%); Met(h) (70%); MKK4(m) (87%); MKK6(h) (98%); p70S6K(h) (94%); PAK2(h) (62%); PDGFRα(h) (93%); PKA(h) (92%); PKCα(h) (61%); PKD2(h) (94%); ROCK-II(h) (78%); Ros(h) (62%); Rsk1(h) (95%); SAPK2α(h) (92%); SAPK2β(h) (85%); SAPK3(h) (92%); SAPK4(h) (82%); SGK(h) (81%); Syk(h) (63%); Tie2(h) (98%); 및 TrkB(h) (99%).

본원에 기재한 실시예 및 실시양태는 단지 예시를 위한 것이며, 그것으로 미루어보아 다양한 변경 및 변화가 당업자에게 제안될 것이고, 그것이 본 출원의 취지 및 범위 그리고 첨부한 청구의 범위의 범주 내에 속하게 될 것임은 물론이다. 본원에서 언급한 모든 공보, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.

Claims

하기 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용가능한 염, 수화물, 용매화물 또는 이성질체.

[화학식 I]

식 중:

n은 0, 1 및 2로부터 선택되고;

m은 0, 1 및 2로부터 선택되고;

Y₁은 N 및 CR₅로부터 선택되고; 여기서 R₅는 수소 및 C₁ _- ₆알킬로부터 선택되고;

Y₂는 O 및 S로부터 선택되고;

R₁은 수소 및 C₁ _- ₆알킬로부터 선택되고;

R₂는 수소 및 C₁ _- ₆알킬로부터 선택되고;

R₃는 수소, 할로, 히드록시, C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알콕시, 할로-치환-C₁ _- ₆알킬 및 할 로-치환-C₁ _- ₆알콕시로부터 선택되고;

R₄는 -NR₅C(O)R₆ 및 -C(O)NR₅R₆로부터 선택되고; 여기서 R₅는 수소 및 C₁ _- ₆알킬로부터 선택되고; 여기서 R₆는 C₆ _- ₁₀아릴-C₀ _- ₄알킬, C₅ _- ₁₀헤테로아릴-C₀ _- ₄알킬, C₃ _- ₁₀시클로알킬-C₀ _- ₄알킬 및 C₃ _- ₁₀헤테로시클로알킬-C₀ _- ₄알킬로부터 선택되고; 여기서 R₆의 임의의 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬은 할로, 히드록시, -NR₅R₅, C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알콕시, 할로-치환-C₁ _- ₆알킬, 할로-치환-C₁ _- ₆알콕시, C₅ _- ₁₀헤테로아릴C_0- ₄알킬, C₃ _- ₈헤테로시클로C₀ _- ₄알킬 및 C₃ _- ₈헤테로시클로C₀ _- ₄알콕시로부터 선택되는 1 내지 3개의 라디칼로 임의로 치환되고; 여기서 R₆의 임의의 헤테로아릴 또는 헤테로시클로알킬 치환기는 C₁ _- ₆알킬 및 히드록시-C₁ _- ₆알킬로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 3개의 라디칼로 임의로 치환되고;

R₇은 수소, 할로, 히드록시, C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알콕시, 할로-치환-C₁ _- ₆알킬, 할로-치환-C₁ _- ₆알콕시, C₆ _- ₁₀아릴-C₀ _- ₄알킬, C₅ _- ₁₀헤테로아릴-C₀ _- ₄알킬, C₃ _- ₁₀시클로알킬-C₀ _- ₄알킬 및 C₃ _- ₁₀헤테로시클로알킬-C₀ _- ₄알킬로부터 선택된다.
제1항에 있어서, 하기 화학식 Ia인 화합물.

[화학식 Ia]

식 중:

n은 0 및 1로부터 선택되고;

Y₁은 N 및 CH로부터 선택되고;

Y₂는 O 및 S로부터 선택되고;

R₁은 수소 및 C₁ _- ₆알킬로부터 선택되고;

R₂는 수소 및 C₁ _- ₆알킬로부터 선택되고;

R₃는 수소, 할로, 히드록시, C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알콕시, 할로-치환-C₁ _- ₆알킬 및 할로-치환-C₁ _- ₆알콕시로부터 선택되고;

R₄는 -NR₅C(O)R₆ 및 -C(O)NR₅R₆로부터 선택되고; 여기서 R₅는 수소 및 C₁ _- ₆알킬로부터 선택되고; 여기서 R₆는 C₆ _- ₁₀아릴-C₀ _- ₄알킬, C₅ _- ₁₀헤테로아릴-C₀ _- ₄알킬, C₃ _- ₁₀시클로알킬-C₀ _- ₄알킬 및 C₃ _- ₁₀헤테로시클로알킬-C₀ _- ₄알킬로부터 선택되고; 여기서 R₆의 임의의 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬은 할로, 히드록시, -NR₅R₅, C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알콕시, 할로-치환-C₁ _- ₆알킬, 할로-치환-C₁ _- ₆알콕시, C₅ _- ₁₀헤테로 아릴C_0- ₄알킬, C₃ _- ₈헤테로시클로C₀ _- ₄알킬 및 C₃ _- ₈헤테로시클로C₀ _- ₄알콕시로부터 선택되는 1 내지 3개의 라디칼로 임의로 치환되고; 여기서 R₆의 임의의 헤테로아릴 또는 헤테로시클로알킬 치환기는 C₁ _- ₆알킬 및 히드록시-C₁ _- ₆알킬로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 3개의 라디칼로 임의로 치환된다.
제2항에 있어서, R₂가 수소 및 메틸로부터 선택되고; R₃가 메틸 및 메톡시로부터 선택되는 것인 화합물.
제3에 있어서, R₄가 -NHC(O)R₆ 및 -C(O)NHR₆로부터 선택되고; 여기서 R₆가 트리플루오로메틸, 디메틸-아미노, 이미다졸릴, 모르폴리노, 모르폴리노-메틸, 피페라지닐, 피페라지닐-메틸 및 피롤리디닐-메톡시로부터 선택되는 1 내지 3개의 라디칼로 임의로 치환된 페닐로부터 선택되고; 여기서 상기 이미다졸릴, 피페라지닐, 피페라지닐-메틸이 메틸, 에틸 및 히드록시-에틸로부터 선택되는 기로 임의로 치환되는 것인 화합물.
제4항에 있어서, N-[4-(4-에틸-피페라진-1-일메틸)-3-트리플루오로메틸-페닐]-4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-벤즈아미드; 4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-N-(4-피페라진-1- 일메틸-3-트리플루오로메틸-페닐)-벤즈아미드; 3-(4-메틸-이미다졸-1-일)-N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-5-트리플루오로메틸-벤즈아미드; N-[4-메틸-3-(2-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일-아세틸아미노)-페닐]-3-트리플루오로메틸-벤즈아미드; N-(3-이미다졸-1-일-5-트리플루오로메틸-페닐)-4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-벤즈아미드; N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-3-트리플루오로메틸-벤즈아미드; 4-(2-메틸-이미다졸-1-일)-N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-3-트리플루오로메틸-벤즈아미드; N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-4-모르폴린-4-일-3-트리플루오로메틸-벤즈아미드; N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-4-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-3-트리플루오로메틸-벤즈아미드; N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-4-모르폴린-4-일메틸-3-트리플루오로메틸-벤즈아미드; N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-3-모르폴린-4-일-5-트리플루오로메틸-벤즈아미드; N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-4-(4-메틸-피페라진-1-일)-3-트리플루오로메틸-벤즈아미드; 4-(4-에틸-피페라진-1-일)-N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-3-트리플루오로메틸-벤즈아미드; N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-3-(4-메틸-피페라진-1-일)-5-트리플루오로메틸-벤즈아미드; 3-디메틸아미노-N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d] 피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-5-트리플루오로메틸-벤즈아미드; 4-(4-에틸-피페라진-1-일메틸)-N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-3-트리플루오로메틸-벤즈아미드; 3-(4-에틸-피페라진-1-일)-N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-5-트리플루오로메틸-벤즈아미드; 4-메틸-N-[3-(4-메틸-이미다졸-1-일)-5-트리플루오로메틸-페닐]-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-벤즈아미드; 3-[4-(2-히드록시-에틸)-피페라진-1-일]-N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-5-트리플루오로메틸-벤즈아미드; N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-3-피페라진-1-일-5-트리플루오로메틸-벤즈아미드; N-{4-메틸-3-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-3-(피롤리딘-2-일메톡시)-5-트리플루오로메틸-벤즈아미드; N-{3-메톡시-5-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-3-모르폴린-4-일-5-트리플루오로메틸-벤즈아미드; N-{3-메톡시-5-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-3-(4-메틸-이미다졸-1-일)-5-트리플루오로메틸-벤즈아미드; 4-(4-에틸-피페라진-1-일메틸)-N-{3-메톡시-5-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-3-트리플루오로메틸-벤즈아미드; N-{3-메톡시-5-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-4-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-3-트리플루오로메틸-벤즈아미드; 및 N-{3-메톡시-5-[3-메틸-3-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-우레이도]-페닐}-4-(2-메틸-이미다졸-1-일)-3-트리플루오로메틸-벤즈아미드로부터 선택되는 화합물.
치료 유효량의 제1항의 화합물을 제약상 허용가능한 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물.
치료 유효량의 제1항의 화합물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 키나제 활성의 억제가 질환의 병리상태 및/또는 증상을 예방, 억제 또는 완화할 수 있는 동물에서의 질환을 치료하는 방법.
제7항에 있어서, 키나제가 Abl, Bcr-Abl, Bmx, BTK, b-RAF, c-RAF, CSK, cSRC, Fes, FGFR3, Flt3, IKKα, IKKβ, JNK1α1, JNK2α2, Lck, Met, MKK4, MKK6, p70S6K, PAK2, PDGFRα, PKA, PKCα, PKD2, ROCK-II, Ros, Rsk1, SAPK2α, SAPK2β, SAPK3, SAPK4, SGK, Syk, Tie2 및 TrkB로부터 선택되는 것인 방법.
Abl, Bcr-Abl, Bmx, BTK, b-RAF, c-RAF, CSK, cSRC, Fes, FGFR3, Flt3, IKKα, IKKβ, JNK1α1, JNK2α2, Lck, Met, MKK4, MKK6, p70S6K, PAK2, PDGFRα, PKA, PKCα, PKD2, ROCK-II, Ros, Rsk1, SAPK2α, SAPK2β, SAPK3, SAPK4, SGK, Syk, Tie2 및 TrkB의 키나제 활성이 질환의 병리상태 및/또는 증상의 원인이 되는 동물에서의 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서 제1항의 화합물의 용도.