KR20070107693A

KR20070107693A - 제피티니브 내성암 치료방법

Info

Publication number: KR20070107693A
Application number: KR1020077017963A
Authority: KR
Inventors: 다니엘 하버; 다프네 위니프레드 벨; 제프리 이. 세틀만; 라파엘라 소델라; 나디아 지. 고딘-하이만; 유니스 엘. 크왁; 스리다르 크리쉬나 라빈드란
Original assignee: 더 제너럴 하스피탈 코포레이션; 와이어쓰
Priority date: 2005-02-03
Filing date: 2006-02-02
Publication date: 2007-11-07
Also published as: NZ556673A; EP1848414B1; CY2016026I2; FR16C1004I1; US20100087482A1; RU2405566C2; CN113975393A; AU2006210572A1; AU2006210572B2; CN113952338A; DE602006021142D1; CN108421044A; RU2405566C9; EP1848414A4; CY1111676T1; RU2007132902A; HK1105285A1; EP1848414A2; WO2006084058A2; IL259741A

Abstract

본 발명은 제피티니브 및/또는 에를로티니브 내성암의 치료방법에 관한 것이다. 암에 걸린 개체를 제피티니브 및/또는 에를로티니브로 치료한 후 암 진행에 대해 모니터링한다. 암 진행은 암이 제피티니브 및/또는 에를로티니브에 대한 내성암임을 나타낸다. 암 진행이 확인되었을 때, 상기 개체에게 비가역적 표피성장인자 수용체(EGFR) 저해제를 포함하는 약제학적 조성물을 투여한다. 바람직한 태양에서는, 상기 비가역적 EGFR 저해제는 EKB-569, HKI-272 및 HKI-357이다.

제피티니브, 에를로티니브, EGFR 저해제, 내성암

Description

제피티니브 내성암 치료방법{METHOD FOR TREATING GEFITINIB RESISTANT CANCER}

전립선암, 유방암, 직장암, 폐암, 췌장암, 난소암, 비장암, 고환암, 갑상선암 등의 상피세포암은 상피세포의 비정상적인 가속 성장을 특징으로 하는 질병이다. 이 가속 성장은 처음에는 종양 형성의 원인이 되며, 결국에는, 다른 기관으로의 전이도 일어날 수 있다. 각종 암의 진단 및 치료에 있어서 진전이 이루어지고 있으나, 이 질병들은 여전히 상당한 사망률을 나타낸다.

폐암은 산업화된 국가에서 주요한 암 사망 원인이다. 폐에서 발병한 암은, 현미경하에서 세포가 어떻게 보이는가에 따라, 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer: NSCLC)과 소세포 폐암(small cell lung cancer)의 2가지 주요 타입으로 나뉜다. 비소세포 폐암(편평세포암종(squamous cell carcinoma), 선암종(adenocarcinoma), 및 대세포 암종(large cell carcinoma))은 일반적으로 소세포 폐암보다 느리게 다른 기관으로 퍼진다. 폐암 사례의 약 75%는 비소세포 폐암(예, 선암종)으로 분류되며, 나머지 25%는 소세포 폐암이다. 비소세포 폐암(NSCLC)은 미국, 일본 및 서유럽에서 주요한 암 사망 원인이다. 진행성 질병 환자에 대하여, 화학치료요법이 생존에 다소 유리하지만, 상당한 독성을 견뎌야 하고, 종양 성장을 지시하는 주요 유전자 부위를 특이적으로 표적으로 하는 치료제를 필요로 한 다(Schiller JH et al., N Engl J Med, 346: 92-98, 2002).

표피성장인자 수용체(Epideraml growth factor receptor(EGFR))는 상피 세포의 표면에서 발현되는 170킬로달톤(kDa)의 막결합 단백질이다. EGFR은 단백질 티로신 키나제의 성장인자 수용체 패밀리, 세포주기 조절 분자 클래스의 구성원이다(W. J. Gullick et al., 1986, Cancer Res., 46:285-292). EGFR은 그 리간드(EGF 또는 TFR-α 중 어느 하나)가 세포외 도메인에 결합하면 활성화되며, 그 결과 상기 수용체의 세포내 티로신 키나제 도메인의 자동인산화가 일어난다(S. Cohen et al., 1980, J. Biol. Chem, 255:4834-4842; A. B. Schreiber et al., 1983, J. Biol. Chem., 258:846-853).

EGFR은 성장 촉진 종양유전자(oncogene)인 erbB 또는 ErbB1의 단백질 산물로, 원발암유전자의 ERBB 패밀리의 구성원이며, 많은 인간 암의 발병 및 진행에 중추적인 역할을 하는 것으로 여겨진다. 특히, 유방암, 방광암, 폐암, 두부암, 경부암 및 위암은 물론 교모세포종(glioblastma)에서, 증가된 EGFR 발현이 관찰되고 있다. 종양유전자의 ERBB 패밀리는 4개의 구조적으로 관련된 막횡단 수용체(transmembrane receptor), 즉, EGFR, HER-2/neu(erbB2), HER-3(erbB3) 및 HER-4(erbB4)를 코딩한다. 임상적으로, 종양에서 ERBB 종양유전자 증폭 및/또는 수용체 과다발현은 질병의 재발 및 환자의 불량한 예후는 물론, 치료에 대한 반응성과 상관관계가 있다고 보고되어 있다(L. Harris et al., 1999, Int. J. Biol. Markers, 14:8-15; 및 J. Mendelsohn 및 J. Baselga, 2000, Oncogene, 19:6550-6565).

EGFR은 3개의 주요 도메인, 즉, 글리코실화되어 있고 2개의 시스테인-리치 영역을 가진 리간드 결합 포킷(pocket)을 포함하는 세포외 도메인(ECD); 짧은 막횡단 도메인; 및 내재성(intrinsic) 티로신 키나제 활성을 가진 세포내 도메인으로 구성된다. 상기 막횡단 부위는 리간드 결합 도메인과 세포내 도메인을 연결시킨다. 아미노산 및 DNA 서열 분석은 물론, EGFR의 비글리코실화 형태의 연구 결과, EGFR 단백질 주쇄는 질량이 132kDa이고, 1186개의 아미노산 잔기를 갖는 것으로 나타났다(A. L. Ullrich et al., 1984, Nature, 307:418-425; J. Downward et al., 1984, Nature, 307:521-527; C. R. Carlin et al., 1986, Mol. Cell. Biol., 6:257-264; and F. L. V. Mayes and M. D. Waterfield, 1984, The EMBO J., 3:531-537).

EGF 또는 TGF-α의 EGFR에의 결합에 의해 신호전달경로가 활성화되고 그 결과 세포 증식이 일어난다. EGFR 분자의 이량화(dimerization), 입체구조적 변화(conformational change) 및 내재화(internalization)는 세포내 신호를 전달하여 세포 성장 조절을 유도하는 기능을 한다(G. Carpenter and S. Cohen, 1979, Ann. Rev. Biochem., 48:193-216). 성장인자 수용체의 기능 조절에 영향을 미치거나, 수용체 및/또는 리간드의 과다발현을 유도하는 유전적 변이의 결과, 세포 증식이 일어난다. 게다가, EGFR은 세포 분화, 세포 운동성 증강, 단백질 분비, 혈관신생, 침범(invasion), 전이 및 화학치료제 및 방사선에 대한 암세포의 내성에 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다(M. J. Oh et al., 2000, Clin. Cancer Res., 6:4760-4763).

이미 각종 암 치료에 대한 임상시험을 수행중인 다수를 포함하여, 다양한 EGFR의 저해제가 동정되었다. 최근의 개요로, Bono, J. S. 및 Rowinsky, E. K.(2002)에 의한, "The ErbB 수용체 패밀리: 암 치료 표적", Trends in Molecular Medicine, 8, S 19-26을 참조하라.

암 치료 시 치료 개입용 표적으로 유망한 세트로는 HER-키나제 축(axis)의 구성원들을 들 수 있다. 그들은, 예를 들면, 전립선, 폐 및 유방의 고형 상피종양에서 빈빈하게 상향조절(upregulate)되며, 교모세포종 종양에서도 상향조절된다. 표피성장인자 수용체(EGFR)는 HER-키나제 축의 구성원이며, 여러 상이한 암 치료요법 개발을 위해 선택되는 표적이 되어왔다. EGFR 티로신 키나제 저해제(EGFR-TKI)는 이들 치료요법 중에 포함되며, 이는 EGFR 경로의 활성화에 티로신 잔기의 가역적 인산화가 요구되기 때문이다. 바꿔말해, EGFR-TKI는 종양세포의 성장 및 분열을 유도하는 세포 신호전달 경로의 유발(triggering) 및/또는 유지를 담당하는 세포 표면 수용체를 봉쇄(block)한다. 특히, 이 저해제들은 HER-1이라고 하는 EGFR 키나제 도메인을 방해하는 것으로 여겨진다. 더 유망한 EGFR-TKI 중에는 3개의 화합물 시리즈가 있다: 퀴나졸린류, 피리도피리미딘류 및 피롤로피리미딘류.

임상 개발에서 더 진전된 화합물들 중 두 개로는 제피티니브(Gefitinib) (AstraZeneca UK Ltd.에 의해 개발된 화합물 ZD 1839; 상품명 이레사(IRESSA)로 시판됨; 이하, "이레사"라고 함)와 에를로티니브(Erlotinib)(Genentech, Inc. 및 OSI Pharmaceuticals, Inc.에 의해 개발된 화합물 OSI-774; 상품명 타세바(TARCEVA)로 시판됨; 이하, "타세바"라고 함)를 들 수 있으며; 둘 다 고무적인 임상 결과를 내 놓았다. 이레사와 타세바 둘 다를 이용한 종래의 암 치료법은 매일 각 화합물을 500mg 이하로 경구투여한다. 2003년 5월, 이레사는 진행성 비소세포 폐암 환자의 치료용으로 승인되어, 미국시장에 진입한 최초의 제품이 되었다.

이레사는 EGFR 분자상의 티로신 키나제 인산화를 직접 저해하는 기능을 가진 경구적으로 활성이 있는 퀴나졸린이다. 이레사는 아데노신삼인산(ATP) 결합 부위에 경쟁적으로 작용하여, HER-키나제 축의 억제(suppression)를 유도한다. 이레사 반응의 정확한 메카니즘은 완전히 알려져 있지 않으나, 많은 연구들은 EGFR의 존재가 이레사 작용의 필수 전제요건임을 시사한다.

이들 화합물을 사용함에 있어서 주요한 한계는, 그 수용자들이, 처음에 치료에 반응한 후에 그들의 치료 효과에 대한 내성을 발현하거나, 또는 그들이 EGFR-TKI에 대하여 측정가능할 정도로는 전혀 반응할 수 없다는 것이다. EGFR-TKI에 대한 반응률은 상이한 인종 간에 다양하다. 몇몇 집단에서는, EGFR-TKI 반응자의 하한으로, 진행성 비소세포 폐암 환자의 10∼15%만이 EGFR 키나제 저해제에 반응한다. 따라서, 이레사 및 타세바에 대한 감수성의 근거가 되는 분자 메카니즘을 보다 잘 이해하는 것이 상기 치료로부터 가장 이득을 얻을 수 있을 것 같은 개체에 대한 표적 치료에 매우 유용할 것이다.

당 기술분야에서는 TKI 치료요법의 이점을 포함하며 환자가 나타내는 비반응성(non-responsiveness)을 극복한, 암, 특히 폐암, 난소암, 유방암, 뇌암, 직장암 및 전립선암 등의 상피세포암의 만족스러운 치료법에 대한 상당한 요구가 있다.

[발명의 개요]

본 발명자들은 놀랍게도 비가역적 EGFR 저해제가 제피티니브 및/또는 에를로티니브 치료에 더이상 반응하지 않는 개체의 암치료에 유효함을 알아내었다. 그래서, 하나의 태양에서, 본 발명은 제피티니브 및/또는 에를로티니브 내성 암의 치료방법을 제공한다. 이 태양에서, 개체의 암 진행은, 그 개체가 제피티니브 및/또는 에를로티니브 치료를 개시한 이후 시점에, 모니터링한다. 암 진행은 그 암이 제피티니브 및/또는 에를로티니브 치료에 대한 내성암임을 나타내며, 그 개체에는 비가역적 표피성장인자 수용체(EGFR) 저해제를 포함하는 약제학적 조성물을 투여한다.

바람직한 태양에서는, 상기 비가역적 EGFR 저해제는 EKB-569, HKI-272 또는 HKI-357이다. 필요에 따라서, 상기 비가역적 EGFR 저해제는 EGFR(서열번호 1)의 시스테인 773에 결합하는 것이면 어떠한 화합물이어도 좋다.

암 진행은 당업자에게 잘 공지된 방법에 의해 모니터링할 수 있다. 예를 들면, 암 진행은 X-ray, CT 스캔 또는 MRI 등에 의한 암의 외관검사(visual inspection)를 통해 모니터링할 수 있다. 필요에 따라, 암 진행은 종양 바이오마커 검출(tumor biomarker detection)을 통해 모니터링할 수 있다.

하나의 태양에서, 상기 환자는 암치료 과정을 통하여 다양한 시점에 모니터링된다. 예를 들면, 암 진행은 두번째 시점에 암 진행을 분석하고 이 분석 결과와 첫번째 시점의 분석결과를 비교함으로써, 모니터링할 수 있다. 상기 첫번째 시점은 제피티니브 및/또는 에를로티니브 치료의 개시 전 또는 후일 수 있으며 상기 두번째 시점은 첫번째 시점 후이다. 증가된 암 성장은 암 진행을 나타낸다.

하나의 태양에서, 암 진행은 암의 크기 분석에 의해 모니터링된다. 하나의 태양에서는, 암의 크기는 X-ray, CT 스캔 또는 MRI에 의한 암의 외관검사(visual inspection)를 통해 분석된다. 하나의 태양에서, 암의 크기는 종양 바이오마커 검출을 통해 모니터링된다.

하나의 태양에서, 상기 암은 상피세포암이다. 하나의 태양에서, 상기 암은 위장암, 전립선암, 난소암, 유방암, 두경부암, 식도암, 폐암, 비소세포 폐암, 신경계 암, 신장암, 망막암, 피부암, 간암, 췌장암, 생식기-비뇨기암 및 방광암이다.

하나의 태양에서, 암의 크기는 추가 시점에 모니터링되며, 상기 추가 시점은 상기 두번째 시점 후이다.

하나의 태양에서, 후(later) 시점은 이전 시점의 적어도 2개월 후이다. 하나의 태양에서, 후 시점은 이전 시점의 적어도 6개월 후이다. 하나의 태양에서, 후 시점은 이전 시점의 적어도 10개월 후이다. 하나의 태양에서, 상기 후 시점은 이전 시점의 적어도 1년 후이다.

또 다른 태양에서는, 본 발명은 EGFR에 돌연변이(즉, 서열번호 1의 790번 위치의 트레오닌이 메티오닌으로 치환(T790M))를 가진 개체에, 비가역적 EGFR 저해제를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암 치료방법을 제공한다. 상기 T790M 돌연변이는 제피티니브 및/또는 에를로티니브 치료에 대한 내성을 나타낸다.

도 1a-b는 후천적인 제피티니브 내성을 가진 두명의 NSCLC 환자로부터의 재 발한 전이성 병변의 EGFR 서열 분석을 나타낸다. 도 1a는 사례 1에 대한 서열 분석을 나타낸다. EGFR의 T790M 돌연변이는 임상적으로 제피티니브 내성 발현 후 재발한 간 병변에 존재한다. (왼쪽)진단시 원발성 폐 병변에는 상기 돌연변이가 검출되지 않았다. (오른쪽)원발성 폐 종양과 재발성 간 병변 모두 L858R 제피티니브-감수성 돌연변이를 보유하고 있었다. 주해(note) 중, L858R 돌연변이는 원발성과 재발성 병변 모두에서 이형접합성 돌연변이에 대한 기대비(expected ratio)로 존재하는 반면, T790M 돌연변이는 야생형 대립유전자에 비해 낮은 수준으로 검출할 수 있다. 클로닝되지 않은 PCR 산물에서, 두 대립유전자가 동등한 표시를 나타내는 동일한 트레이싱(tracing)에서 다형성(polymorphism)(G/A)이 보인다. 도 1b는 사례 2에 대한 서열 분석을 나타낸다. T790M 돌연변이는 극소수의 제피티니브 내성 세포에 존재한다. (왼쪽)폐 원발성 종양 또는 이 사례로부터의 8개의 재발한 간 병변 중 어느 것에서도, 클로닝되지 않은 PCR 산물의 염기서열분석에 의해 T790M 돌연변이를 검출할 수 없었다. 인접한 다형성(G/A)에서의 이형접합성에 의해, 이들 표본 유래의 EGFR 대립유전자가 둘 다 증폭되었음이 확증(confirm)된다. 상기 이형접합성 제피티니브 감수성 돌연변이인 L861Q는 원발성 폐 종양은 물론 8개의 재발성 간 병변 각각에서 기대비로 검출되었다.

도 2a-2c는 기관지폐포암 세포주의 제피티니브에 대한 후천적 내성과 비가역적 ERBB 패밀리 저해제에 대한 지속적 감수성(persistent sensitivity)을 나타낸다. 도 2a는 야생형 EGFR을 가진 기관지폐포암 세포주(NCI-H1666), EGFR에 활성화 delE746-A750 돌연변이를 가진 기관지폐포암 세포주(NCI-H1650), 또는 NCI-H1650의 2개의 대표적인 제피티니브 내성 서브클론(G7 및 C11)의 증식의, 티로신 키나제 저해제에 의한 저해를 나타낸다. 상기 가역적 저해제 제피티니브의 효과는 비가역적 저해제 HKI-357의 효과와 비교된다. 다른 비가역적 저해제에 의해서도 유사한 결과가 관찰되었다. 세포수는 표시된 약물 농도에 노출 72시간 후에, 100ng/ml EGFR을 함유한 5% FCS에서 배양한 후에 크리스탈 바이오렛 염색으로 측정하였다. 각 데이터 포인트는 4개 시료의 평균값을 나타낸다. 도 2b는 EGFR의 가역적 저해제인 제피티니브; EGFR의 비가역적 저해제인 EKB-569; EGFR과 ERBB2의 비가역적 이중(dual) 저해제인 HKI-272 및 HKI-357의 화학적 구조를 나타낸다. 도 2c는 다양한 농도의 제피티니브 또는 비가역적 ERBB 저해제 EKB-569로 치료한 후의 약물내성 NCI-H1650 세포의 생성을 나타낸다. 콜로니는 저해제 존재하에 12일 배양한 후 염색하였다.

도 3a-3d는 제피티니브 내성 세포의 EGFR 및 ERBB2의 신호전달에 관한 지속 의존성, 및 변이된 수용체 트래피킹(trafficking)을 나타낸다. 도 3a는 야생형 EGFR을 갖는 기관지폐포 세포주(NCI-H1666)의 EGFR 및 ERBB2의 siRNA 매개 녹다운(knockdown) 후의 세포 생존율을, EGFR에 활성화 delE746-A760 돌연변이를 가진 세포(NCI-H1650) 및 두 개의 제피티니브 내성 유도체(G7 및 C11)와 비교하여 나타낸다. 이중가닥 RNA로 처리 72시간 후에 생세포를 계수하여, 3개의 시료에 대한 표준편차와 함께, 비특이적 siRNA로 처리한 세포에 대한 분율로서 나타내었다. 도 3b는 제피티니브 또는 비가역적 저해제 HKI-357를 증가된 농도로 처리한 다음 EGF로 2시간 펄스한 세포내에서의 EGFR 자동인산화(Y1068) 저해 및 하류 작동 자(effector) AKT 및 MAPK의 인산화(ERK) 저해를 나타낸다. 모세포주 NCI-H1650은 대표적인 제피티니브 내성주인 G7과 비교된다. 총 AKT 및 MAPK는 대조군으로서 나타낸다; 튜불린은 총 EGFR 레벨에 대한 로딩 대조군으로서 사용되며, 그 레벨은 이들 세포에서의 검출의 하한에 있다. 도 3c는 감수성 NCI-H1650 모세포주와 비교하여, 제피티니브 내성 NCI-H1650(G7) 세포의 변이된 EGFR 내재화를 나타낸다. 리간드 부가 5분 후 및 20분 후에, 로다민 표지 EGF를 사용하여 EGFR를 표지한다. 상기 NCI-H1650(G7) 세포에서의 EGFR의 증가된 내재화는 20분에 가장 분명히 나타났다(Zeiss microscope, 63배 확대). 도 3d는 비오틴화(biotinylation)에 의한 세포 표면 단백질의 펄스 표지 및 20분에 걸친 체이스(chase) 후의 NCI-H1650 모세포 및 내성 유도체 G7 유래의 내재화된 EGFR의 면역블로팅을 나타낸다. NCI-H1650(G7)의 증가된 세포내 EGFR은 변이가 없는 트랜스페린 수용체(TR) 내재화와 비교된다.

도 4a-4b는 T790M EGFR 돌연변이 억제에 있어서의 비가역적 ERBB 저해제의 유효성을 나타낸다. 도 4a는 민감화 돌연변이(L858R)와 내성 관련 돌연변이(T790M) 둘다를 보유하고 있는 NCI-H1975 기관지폐포 세포주의 EGFR 자동인산화(Y1068)와 하류 작동자 AKT 및 MAPK의 인산화(ERK)를 억제하는 능력에 있어서, 제피티니브와 2개의 비가역적 저해제 HKI-357 및 HKI-272의 비교를 나타낸다. 총 EGFR, AKT 및 MAPK는 로딩 대조구로서 나타낸다. 도 4b는 3개의 비가역적 ERBB 패밀리 저해제에 의한 L858R 및 T790M 돌연변이를 보유하고 있는 NCI-H1975 세포의 증식 억제를, 제피티니브와 비교하여 나타낸다.

도 5a-5d는 EGFR의 뉴클레오티드 서열(서열번호 2) 및 아미노산 서열(서열번 호 1)을 나타낸다.

도 6은, 제피티니브와 마찬가지로, HKI 357과 EKB 569("와이어쓰(Wyeth)"로 표시)가, EGFR 돌연변이를 보유하고 있는 NSCLC 세포의 증가된 세포 사멸을 나타내었지만, 제피티니브와 달리, 이들 약물에 대한 내성 클론이 시험관내에(in vitro) 쉽게 생성되지 않고, 그들이 제피티니브 내성 클론에 대한 그들의 유효성을 보유하고 있음을 나타낸다.

제피티니브 ( gefitinib ) 및 에를로티니브 ( erlotinib ) 내성암

제피티니브(AstraZeneca UK Ltd.에 의해 개발된 화합물 ZD1839; 상품명 이레사(IRESSA)로 시판됨)와 에를로티니브(Genentech, Inc. 와 OSI Pharmaceuticals, Inc.에 의해 개발된 화합물 OSI-774; 상품명 타세바(TARCEVA)로 시판됨)는, 이들 ATP 결합의 경쟁적 저해제에 의해 표적으로 되는 EGF 수용체(EGFR)(4, 5)에 활성화 돌연변이를 보유하고 있는 비소세포 폐암의 사례에서(1-3), 극적인 임상 반응을 유도한다. 이들 티로신 키나제 저해제의 유효성은, 이들 약물에 의한 돌연변이 키나제의 증강된 저해를 유도하는, 이들 돌연변이와 관련된 ATP 클레프트(cleft)의 변이(alteration)와, 상기 돌연변이 수용체에 의해 전달되는 증가된 생존 신호에 대한 이들 암세포의 생물학적 의존성, 즉 "종양유전자 중독(oncogene addiction)"으로 묘사되는 현상의 둘 다로부터 유래한다(6, 7).

제피티니브와 에를로티니브 둘다에 대한 치료 반응은 2∼3년 동안 지속될 수 있으나, NSCLC의 대부분의 사례에서의 평균 반응 지속기간은 단지 6∼8개월이다(8-10). 후천적인 약물 내성의 근거가 되는 메카니즘은 잘 알려져 있지 않다. 골수성 백혈병(CMLs)에 관여하는 BCR-ABL 키나제, 위장관 간질 종양(GIST)과 관련된 C-KIT 키나제, 및 특발성 과호산구 증후군(HES)과 관련된 FIPlLl-PDGFR-α키나제를 저해하는 이마티니브(imatinib)(GLEEVEC)에 의해 유추해보면, 2차 키나제 도메인 돌연변이는 약물 결합을 강력하게 억제할 수 있다(11-16). 그러나, 재발 NSCLC는 쉽게 생검되지 않는다; 따라서, 단지 제한된 임상적 표본만이 분석용으로 이용가능하다. 최근에는, 제피티니브 또는 에를로티니브 치료 후 병이 재발한 6 사례 중의 3 사례에서, EGFR 키나제 도메인 내의 단일 2차 돌연변이 T790M이 보고되었다(17, 18). EGFR 코돈 790과 유사한 BCR - ABL의 코돈 315은 이마티니브 내성 CML에서 빈번하게 돌연변이되며, C-XJr(COdOn 670) 및 FIPlLl - PDGFR -α(코돈 674)의 대응 잔기의 돌연변이는 각각 이마티니브 내성 GIST 및 HES와 관련된다(15, 16). EGFR 저해제에 대한 내성의 초기 시험관내(in vitro) 모델링은 야생형 수용체내의 코돈 790의 돌연변이가 EGFR 티로신 키나제 저해제에 의한 저해를 마찬가지로 억제할 것임을 시사하였다(19). 최근에는, T790M 치환과 함께 활성화 돌연변이를 포함하고 있는 트랜스펙트된 EGFR 단백질은 제피티니브 및 에를로티니브에 의한 감소된 저해를 나타냄이 밝혀졌다(17, 18). T790M 돌연변이가 NSCLC의 몇몇 사례의 후천성 내성의 원인이 되는 듯 하나, 2차 EGFR 돌연변이가 없는 사례에서의 치료 실패의 근거 메카니즘은 여전히 밝혀지지 않았다.

세포질 키나제 BCR-ABL과 달리, 막결합 EGFR에 의한 신호전달은 리간드 결합, 수용체 호모이량체화(homodimerization), ERBB2와 기타 패밀리 구성원의 헤테로이량체화(heterodimerization) 후, 내재화 및 리간드 결합 수용체의 재순환 또는 유비퀴틴 매개 수용체 분해의 복잡한 경로를 포함한다(20). 주요한 EGF 의존적 신호전달은 내재화 과정 동안 일어나며, 이 내재화 과정은 세포내 소포(vesicle)의 낮은 pH에서의 EGFR 복합체 분해와도 관련되는 것으로 생각된다. 이와 같이, 다중인자가 수용체에 의해 전달되는 신호의 강도와 질을 조정하며, EGFR 트래피킹에서의 변이는 EGF 의존적 세포 반응의 조절과 밀접하게 관련되어 있다(20).

본 발명은, 제피티니브 내성암은 T790M EGFR 돌연변이가 단지 내성 종양세포의 서브세트에만 존재하는 것과, T790M 돌연변이는 관찰되지 않지만 증가된 EGFR 내재화가 관찰되는 것을 포함할 수 있다는 발견에 근거한 것이다. 또한, 본 발명은 수용체에 공유적으로 가교결합하는 비가역적 EGFR 저해제가 T790M 돌연변이를 가진 암을 저해하는데 유효하고, 제피티니브 및/또는 에를로티니브에 의한 치료에 내성이 있는 암을 생성할 수 있는 변이된 EGFR 트래피킹을 가진 암에 유효하다는 발견에 근거한 것이다. 따라서, 본 발명은 비가역적 EGFR 저해제를 투여하는 단계를 포함하는, 제피티니브 및/또는 에를로티니브 내성암의 치료방법을 제공한다.

환자의 치료 방법

하나의 태양에서, 본 발명은 제피티니브/에를로티니브 내성암을 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은, 상기 치료를 필요로 하는 환자에게, EKB-569(4-아닐리노퀴놀린-3-카르보니트릴; Greenberger et al., 암치료의 새로운 약물에 대한 11번째 NCI-EORTC-AACR 심포지움, Amsterdam, November 7-10, 2000, abstract 388; Wyeth), HKI-357(4-아닐리노퀴놀린-3-카르보니트릴 유도체; Tsou et al. J. Med. Chem. 2005, 48: 1107-1131; Wyeth) 및/또는 HKI-272(4-아닐리노퀴놀린-3-카르보니트릴 유도체; Rabindran et al. Cancer Res. 2004, 64, 3958-3965; Wyeth) 등의 특정한 비가역적 EGFR 저해제를 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 바람직한 태양에서, 본 발명은 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 EKB-569를 투여하는 단계를 포함하는 방법이다. 하나의 바람직한 태양에서, 본 발명은 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 HKI-357을 투여하는 단계를 포함한다.

상기 치료는 티로신 키나제 저해제를 다른 티로신 키나제와 조합하는 것, 화합요법, 방사선요법 등의 치료와 병행한 치료를 포함할 수도 있으며, 이들에 한정되는 것은 아니다.

암은 Lynch et al., 2004; 350: 2129-2139에 기재된 방법에 의하여, 초기에 제피티니브/에를로티니브 감수성으로 진단하거나 또는 제피티니브/에를로티니브 감수성일 것으로 예상할 수 있다. 제피티니브/에를로티니브 감수성은, 예를 들면, 750(알라닌)에서의 돌연변이와 함께 747(리신)∼749(글루탐산) 잔기의 결실, 747(리신)∼750(알라닌) 잔기의 결실, 잔기 858의 류신이 아르기닌으로 치환, 잔기 861의 류신이 글루타민으로 치환을 포함한, EGFR 돌연변이 종양의 존재에 의해 예상할 수 있다.

암은 제피티니브 및/또는 에를로티니브에 의한 치료를 개시한 후에 제피티니브 및/또는 에를로티니브 내성암으로서 진단될 수 있다. 필요에 따라, 암이 제피티니브 및/또는 에를로티니브에 의한 치료 개시 전에 제피티니브 및/또는 에를로티니브 내성으로서 진단될 수 있다. 종양의 제피티니브 및/또는 에를로티니브 내성은, 예를 들면, 제피티니브 및/또는 에를로티니브로 치료한 지 6개월 이상 지난 후에 발생할 수 있다. 필요에 따라, 종양의 제피티니브 및/또는 에를로티니브 내성은 제피티니브 및/또는 에를로티니브로 치료한 지 6개월 미만에 진단될 수 있다. 제피티니브 및/또는 에를로티니브 내성의 진단은 제피티니브 및/또는 에를로티니브 치료 동안 종양 진행을 모니터링함에 의해 수행할 수 있다. 종양 진행은 치료 개시 후의 시점들 간의 종양 상태를 비교하거나, 또는 제피티니브 및/또는 에를로티니브 치료 개시 후 시점과 전 시점 간의 종양 상태를 비교하여 결정할 수 있다. 종양 진행은 제피티니브 및/또는 에를로티니브 치료 동안, 예를 들면, X-ray, CT 스캔 등의 방사선사진술, 또는 암의 심계항진(palpitation)을 포함한 당업자에게 알려진 다른 모니터링 방법, 또는 종양 바이오마커 레벨을 모니터링하는 방법에 의해 시각적으로 모니터링할 수 있다. 제피티니브 및/또는 에를로티니브로 치료하는 동안의 암 진행은 제피티니브 및/또는 에를로티니브 내성을 나타낸다. 종양 바이오마커의 레벨 상승은 종양 진행을 나타낸다. 따라서, 제피티니브 및/또는 에를로티니브로 치료하는 동안의 종양 바이오마커의 레벨 상승은 제피티니브 및/또는 에를로티니브 내성을 나타낸다. 새로운 종양의 검출 또는 전이의 검출은 종양 진행을 나타낸다. 종양 수축의 정지는 종양 진행을 나타낸다. 암 성장은, 예를 들면, 종양의 크기 증가, 새로운 종양의 검출 또는 전이, 및/또는 종양 바이오마커의 레벨 상승으로 표시된다.

제피티니브 및/또는 에를로니티브 내성의 발생은, 개체의 순환계, 또는 다른 체액으로부터 얻어진 순환하는 종양 세포에서의 제피티니브 및/또는 에를로티니브 내성 관련 돌연변이의 존재를 시험함에 의해 모니터링될 수 있다. 개체의 종양 세포에 제피티니브 및/또는 에를로티니브 내성 관련 돌연변이의 존재는 제피티니브 및/또는 에를로티니브 내성 종양임을 나타낸다.

하나의 태양에서, 상기 개체의 종양은 제피티니브 및/또는 에를로티니브 감수성을 나타내는 돌연변이를 보유하며, 여전히 그것도 제피티니브 및/또는 에를로티니브 치료에 내성을 나타낸다. 하나의 태양에서, 상기 개체의 종양은 제피티니브 및/또는 에를로티니브 감수성을 나타내는 돌연변이를 보유하고 있으며, 제피티니브 및/또는 에를로티니브 내성을 나타내는 돌연변이(예를 들면, EGFR의 T790M 돌연변이, 즉, 본래의 트레오닌잔기가 메티오닌 잔기로 치환된 돌연변이), 예를 들면, 증가된 EGFR 내재화를 나타내는 돌연변이를 보유하고 있다. 하나의 태양에서, 상기 개체의 종양은 제피티니브 및/또는 에를로티니브 감수성을 나타내는 돌연변이를 보유하지 않고 제피티니브 및/또는 에를로티니브 내성을 나타내는 돌연변이, 예를 들면, EGFR의 T790M 돌연변이, 예를 들면, 증가된 EGFR 내재화를 나타내는 돌연변이를 보유한다.

약물의 투여와 관련하여, "유효량(effective amount)"은 증상의 개선, 치료, 질병 부하(load)의 감소, 종양 질량 또는 세포 수 감소, 수명 연장, 삶의 질 향상, 또는 특정 타입의 질병 또는 이상상태의 치료에 정통한 의사에 의해 통상 긍정적으로 인식되는 기타 효과 등의, 환자에 대해 적어도 통계학적으로 유의한 분율로 유용한 효과를 가져오는 양을 가리킨다.

사용되는 활성 성분의 유효 투여량은 사용되는 특정 화합물, 투여 방식 및 치료할 이상상태의 중증도(severity)에 따라 다를 수 있다. 당업자는 각 환자에 대한 유효 투여량이 병의 중증도, 개체의 유전적 다양성, 또는 대사율에 따라 다를 수 있음을 인지하고 있다. 그러나, 일반적으로, 만족스러운 결과는 본 발명의 화합물을 약 0.5∼1000mg/kg 체중을 1일 투여량으로 하여, 필요에 따라 하루에 2∼4회로 나누어서 투여거나, 또는 제어 방출 형태로 투여할 때, 얻어진다. 1일 총 투여량은 약 1∼1000mg, 바람직하게는 2∼500mg으로 되도록 계획된다. 내복용으로 적합한 투여 형태는 약 0.5∼1000mg의 활성 성분을 고형 또는 액상의 약제학적으로 허용가능한 담체와 잘 혼합하여 구성한다. 이 투여 처방은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들면, 하루에 투여량을 수회로 나누어서 투여하거나 또는 치료 상황의 긴박함에 따라 투여량을 비례하여 감소시킬 수 있다.

투여 경로는 정맥내(I.V.), 근육내(I.M), 피하(S.C.), 진피내(I.D.), 복막내(I.P.), 경막내(I.T.), 흉막강내, 자궁내, 직장내, 질내, 국소, 종양내 투여 등일 수 있다. 본 발명의 화합물은 주사에 의해 또는 경시적으로 점진적인 주입에 의해 비경구적으로 투여할 수 있으며 연동 수단(peristaltic means)에 의해 전달할 수 있다.

투여는 경점막 또는 경피 수단에 의할 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해서는, 투과해야 할 배리어에 적합한 침투제를 제제내에 사용한다. 이러한 침투제는 당업자에게 일반적으로 알려져 있으며, 예를 들면, 경점막 투여용으로 담즙염 및 푸시드산(fusidic acid) 유도체를 들 수 있다. 또한, 계면활성제를 사용하여 투과를 촉진시킬 수 있다. 경점막 투여는, 예를 들면, 비강 스프레이를 통하여, 또는 좌약을 사용하여 할 수 있다. 경구 투여용으로, 본 발명의 화합물은 캡슐, 정제(tablet) 및 토닉(tonic) 등의 종래의 경구 투여 형태로 제제화된다.

국소 투여용으로, 상기 약제학적 조성물(키나제 활성 저해제)은, 당 기술분야에 일반적으로 알려진 바와 같이, 연고, 고약(salve), 젤, 또는 크림으로 제제화된다.

본 발명의 치료학적 조성물, 예를 들면, 비가역적 EGFR 저해제는, 통상, 정맥내에, 예를 들면 단위 투여량을 주사하여 투여한다. 본 발명의 치료 조성물에 관련하여 사용되는 "단위 투여량"이라 함은 개체에 대한 단위 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 말하며, 각 단위는 필요한 희석제(즉, 담체 또는 매개체(vehicle))와 함께 원하는 치료 효과를 얻도록 계산된 소정량의 활성 물질을 함유한다.

상기 조성물은 투여 제형에 적합한 방식으로, 치료학적 유효량으로 투여된다. 투여할 양과 시기는 치료할 개체, 개체 시스템의 활성성분 이용능력, 및 원하는 치료 효과의 정도에 따라 다르다. 투여해야 할 활성성분의 정확한 양은 진료의사의 판단에 따르며 각 개체마다 다르다.

본 발명의 방법 실행에 유용한 치료학적 조성물, 예를 들면, 비가역적 EGFR 저해제는 본 명세서에 기재되어 있다. 상기 활성성분을 함유하는 제제 또는 약물 전달 시스템으로는, 의도한 용도에 적합하고 당업자에게 일반적으로 알려진 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 경구 투여, 직장 투여, 국소 투여 또는 비경구 투여(흡입, 피하, 복막내, 근육내 및 정맥내 투여를 포함)용으로 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체는 당업자에게 공지되어 있다. 상기 담체는 제제 중의 다른 성분들과의 친화성의 의미에서 약제학적으로 허용가능해야하며 그 수용자(recipient)에게 해롭지 않아야 한다.

본 명세서에서 사용되는, "약제학적으로 허용가능한", "생리적으로 허용가능한" 및 그 문법적인 변형 어구는, 그들이 조성물, 담체, 희석제 및 시약에 관한 것일 때, 호환하여 사용할 수 있으며, 그 물질들을 바람직하지 못한 생리학적 효과의 발생없이 포유동물에 투여할 수 있음을 나타낸다.

비경구 투여에 적합한 제제로는 바람직하게는 수용자의 혈액과 등장인 활성 화합물의 멸균된 수성 제제를 적합하게 들 수 있다. 따라서, 이러한 제제는 증류수, 5% 덱스트로스를 함유한 증류수 또는 식염액(saline)을 적합하게 함유할 수 있다. 또한 유용한 제제로는 적당한 용제로 희석했을 때 비경구 투여에 적합한 용액으로 되는, 상기 화합물을 함유하는 농축 용액 또는 고형물을 들 수 있다.

소화관내 투여용으로는, 화합물을 캡슐, 교갑(chachet), 정제 또는 마름모꼴 정제 등의 개별 단위의 불활성 담체에 삽입할 수 있으며, 각각의 단위는 소정량의 활성 화합물을 분말 또는 과립으로; 또는 수성 또는 비수성 액체인 용액 또는 현탁액, 예를 들면, 시럽, 엘릭시르(elixir), 에멀션 또는 드래프트(draught)로서 함유한다. 적합한 담체는 전분류 또는 당류일 수 있으며 윤활제, 향미료, 바인더 및 동일한 특성의 다른 재료를 포함할 수 있다.

정제는, 필요에 따라 하나 이상의 보조성분과 함께, 압축 또는 성형에 의해 제조할 수 있다. 압축된 정제는 자유롭게 흐르는 형태(예, 분말 또는 과립)의 활성 화합물을, 필요에 따라 보조 성분(예, 바인더, 윤활제, 불활성 희석제, 표면 활성제 또는 분산제)과 혼합하여, 적합한 기계 중에서 압축함에 의해 제조할 수 있다. 성형한 정제는 분말상의 활성 화합물과 어떠한 적합한 담체의 혼합물을 적합한 기기에서 성형하여 제조할 수 있다.

시럽 또는 현탁액은 농축된 수성 당(예, 슈크로스) 용액에 활성 화합물을 첨가하여 제조할 수 있으며, 어떠한 보조 성분을 첨가할 수도 있다. 상기의 보조 성분으로는 향미료, 당의 결정화를 방지하는 약제, 또는 다가알콜(예, 글리세롤 또는 소르비톨)과 같은 어떠한 다른 성분의 용해도를 증가시키는 약제를 들 수 있다.

직장 투여용 제제는, 코코아 버터 또는 Witepsol S55(Dynamite Nobel Chemical, Germany의 상품명) 등의, 종래의 담체와 함께 좌약으로서 제공될 수 있다.

경구 투여용 제제는 증강제와 함께 제공될 수 있다. 경구적으로 허용가능한 흡수 증강제로는 소디움라우릴설페이트, 팔미토일카르니틴, 라우레쓰-9, 포스파티딜콜린, 시클로덱스티린 및 그들의 유도체 등의 계면활성제류; 소디움데옥시콜레이트, 소디움타우로콜레이트, 소디움글리코콜레이트, 및 소디움푸시데이트 등의 담즙염류; EDTA, 시트르산 및 살리실레이트 등의 킬레이트제류; 및 지방산류(예, 올레산, 라우르산, 아실카르니틴류, 모노 및 디글리세라이드류)를 들 수 있다. 기타 경구 흡수 증강제로는 벤잘코니움 클로라이드, 벤제토니움 클로라이드, CHAPS(3-(3-콜아미도프로필)-디메틸암모니오-1-프로판설포네이트), Big-CHAPS(N,N-비스(3-D-글루코아미도프로필)-콜라미드), 클로로부타놀, 옥톡시놀-9, 벤질알콜, 페놀류, 크레졸류, 및 알킬알콜류를 들 수 있다. 본 발명에 특히 바람직한 경구 흡수 증강제는 소디움라우릴설페이트이다.

필요에 따라, 상기 화합물은 리포솜 또는 마이크로스피어(또는 미세입자)에 넣어 투여될 수 있다. 환자 투여용 리포솜 및 마이크로스피어 제조 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그 내용이 본 명세서에 참고로서 편입된, 미국 특허 No.4,789,734에는 리포좀내에 생물학적 물질을 캡슐화하는 방법을 기재하고 있다. 특히, 그 물질은 수성 용액에 용해되며, 필요할 경우 계면활성제와 함께, 적합한 인지질 및 지질이 첨가되고, 필요에 따라, 상기 물질이 투석 또는 초음파처리된다. G. Gregoriadis, Chapter 14, "리포좀", Drug Carriers in Biology and Medicine, pp. 287-341(Academic Press, 1979)에, 공지의 방법들이 검토되어 있다.

폴리머 또는 단백질로 형성된 마이크로스피어는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 위장관을 통해서 직접 혈류로 통과하도록 맞춰질 수 있다. 필요에 따라, 상기 화합물은 마이크로스피어, 또는 마이크로스피어의 복합물에 삽입되어, 수일∼수개월간에 걸쳐 서서히 방출되도록 이식할 수 있다. 예를 들면, 미국특허 Nos. 4,906,474, 4,925,673 및 3,625,214, 및 Jein, TIPS 19:155-157(1998)을 참고할 수 있으며, 그 내용은 본 명세서에 참고로서 편입한다.

하나의 태양에서, 본 발명의 티로신 키나제 저해제는, 정맥 투여 후 모세혈관상(capillary bed)에 도달하기(lodge)에 적합한 크기로 만든 리포솜 또는 마이크로입자 내로 제제화시킬 수 있다. 상기 리포솜 또는 마이크로입자가 허혈 조직 주변의 모세혈관상에 도달했을 때, 상기 약제는 그들이 가장 효과적일 수 있는 부위에 국소적으로 투여될 수 있다. 허혈 조직을 표적으로 하기에 적합한 리포좀은 일반적으로 약 200나노미터 보다 작으며, 또한, 예를 들면, 그 내용이 본 명세서에 참고로 편입되어 있는 Baldescliweiler에 의한 미국특허 No.5,593,688(발명의 명칭:Liposomal targeting of ischemic tissue)에 개시되어 있는 바와 같이, 일반적으로 단층상의 소포(vesicle)이다.

바람직한 마이크로입자는 폴리글리콜라이드, 폴리락티드 및 그들의 공중합체 등의 생분해성 폴리머로 제조한 것들이다. 당 기술분야의 숙련자는 원하는 약물 방출 속도 및 원하는 투여량 등의 각종 요소에 따라 적합한 담체 시스템을 쉽게 결정할 수 있다.

하나의 태양에서, 상기 제제는 카테터를 통하여 직접 혈관 내부에 투여된다. 상기 투여는, 예를 들면, 카테터의 구멍을 통하여 일어날 수 있다. 활성화합물이 비교적 긴 반감기(약 1일∼1주일 이상)를 갖는 태양에서는, 상기 제제는, Hubbell et al.에 의해 미국특허 No.5,410,016에 개시된 것들과 같은, 생분해성 고분자 히드로겔내에 포함될 수 있다. 이들 고분자 히드로겔은 조직 루멘 내부에 전달될 수 있으며 상기 활성화합물은 상기 폴리머가 분해됨에 따라 경시적으로 방출된다. 원한다면, 상기 고분자 히드로겔은, 활성 화합물이 그 안에 분산되어 있는 마이크로입자 또는 리포솜을 가질 수 있으며, 이는 상기 활성 화합물의 제어 방출을 위한 또 다른 메카니즘을 제공한다.

상기 제제는 단위 투여량 형태로 적합하게 제공될 수 있으며, 약학 분야에 잘 알려진 어떠한 방법에 의해서라도 제조할 수 있다. 모든 방법은 활성 화합물을 하나 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 상기 제제는 상기 활성 화합물과 액상 담체 또는 미세하게 분리된 고형 담체와 균일하고 치밀하게 접촉시킨 다음, 필요에 따라, 그 생성물을 원하는 단위 투여 형태로 성형(shaping)하여 제조할 수 있다.

상기 제제는 제약 분야에서 이용되는 하나 이상의 임의의 보조 성분, 예를 들면, 희석제, 완충액, 향미료, 바인더, 표면 활성제, 점증제, 윤활제, 현탁화제, 보존제(산화방지제 등) 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 방법의 화합물(즉, 비가역적 EGFR 저해제)은, 호흡기관에 투여하기 위해, 스너프(snuff) 또는 에어로졸 또는 흡입기용 용액으로서 또는 흡입치료용 초미립자 분말로서, 단독으로 또는 락토스 등의 불활성 담체와 조합하여 제공될 수 있다. 이러한 경우에, 활성 화합물의 입자는 50마이크론 미만, 바람직하게는 10마이크론 미만, 더욱 바람직하게는 2∼5마이크론의 직경을 갖는 것이 적합하다.

일반적으로 비강 투여를 위해서는 약산성 pH가 바람직하다. 본 발명의 조성물의 pH는 약 3∼5가 바람직하고, 3.5∼3.9가 더욱 바람직하고, 3.7이 가장 바람직하다. 상기 pH는 염산 등의 적합한 산을 첨가하여 조정한다.

용해 또는 분산된 활성 성분을 그 안에 함유하는 약리 조성물 제제는 당 기술분야에 잘 알려져 있으며 제제화에 의거하여 제한할 필요는 없다. 통상 이러한 조성물은 주사가능한 액체 용액 또는 현탁액 중의 어느 하나로 제조되지만, 사용하기 전에 액상의 용액 또는 현탁액용으로 하기에 적합한 고체 형태로 제조할 수도 있다. 상기 제제는 에멀션화시킬 수도 있다.

상기 활성 성분은 약제학적으로 허용가능하고 활성 성분과 병용할 수 있는 부형제와, 본 명세서에 기재된 치료 방법에 사용하기 적합한 양으로 혼합할 수 있다. 적합한 부형제로는, 예를 들면, 물, 식염액, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 그들의 조합물이 있다. 또한, 필요에 따라, 상기 조성물은 활성 성분의 유효성을 증강시키는 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 등의 소량의 보조 성분을 함유할 수 있다.

본 발명의 비가역적 키나제 저해제는 그 중에 상기 성분의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염은 염산 또는 인산 등의 무기산, 또는 아세트산, 타르타르산, 만델산 등의 유기산으로 형성된(폴리펩티드의 자유 아미노기로 형성된) 산 부가염을 들 수 있다. 자유 카르복시기로 형성한 염은 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화철 등의 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인 등의 유기 염기로부터 유도할 수 있다.

생리학적으로 허용가능한 담체는 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 액상 담체의 예로는 활성성분과 물 이외의 물질은 함유하지 않거나, 또는 생리 pH 값의 인산나트륨, 생리식염액 또는 둘 다(인산염 완충 식염수 등)와 같은 완충액을 함유하는 멸균된 수성 용액이 있다. 더욱이, 수성 담체는 하나 이상의 완충염은 물론, 염화나트륨 및 염화칼륨 등의 염, 덱스트로스, 폴리에틸렌글리콜 및 기타 용질(solute)을 함유할 수 있다.

액체 조성물은 물에 부가하여 및 물을 배제하고 액상을 함유할 수도 있다. 이러한 부가적인 액상의 예로는 글리세린, 면화씨유 등의 식물성 오일, 및 물-오일(water-oil) 에멀션이 있다.

정의:

"ErbB1", "표피성장인자 수용체" 및 "EGFR"은 본 명세서에서 호환하여 사용할 수 있으며, 예를 들면, Carpenter et al. Ann. Rev. Biochem. 56:881-914(1987)에 개시된 바와 같은 고유 서열의 EGFR과, 그 변이체(예, Humphrey et al. PNAS(USA) 87:4207-4211(1990)에서와 같은 EGFR의 결실 돌연변이)를 포함한다. erbB1은 EGFR 단백질 산물을 코딩하는 유전자이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, EGFR 단백질은 erbB1 유전자인 GenBank 고유번호 NM_005228(서열번호 2)에 의해 코딩되는 GenBank 고유번호 NP_005219(서열번호 1)로서 개시되어 있다. erbB1/EGFR의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 5a-5d에 나타낸다.

본 명세서에서 "키나제 활성이 증가하는 핵산 변이"는 키나제 활성을 증가시키는, 유전자의 뉴클레오티드 서열에서의 변이(즉, 돌연변이)를 말한다. 상기 증가된 키나제 활성은 핵산 변이의 직접적인 결과이며 그 유전자가 코딩하는 단백질과 관련된다.

본 명세서에서 "약물" 또는 "화합물"은 질병 또는 이상상태를 치료 또는 예방 또는 제어하기 위해 사람에게 투여되는 화학물질(chemical entity) 또는 생물학적 생성물, 또는 화학물질들 또는 생물학적 생성물들의 조합물을 말한다. 상기 화학물질 또는 생물학적 생성물은 저분자량 화합물이 바람직하나, 반드시 그러할 필요는 없으며, 더 큰 분자, 예를 들면, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 리보자임, DNA자임, 당단백질, siRNA, 지질단백질, 엡테이머 및 그들의 변형물 및 조합물을 제한없이 포함하며, 핵산, 아미노산, 또는 탄수화물의 올리고머일 수 있다.

본 명세서에서, "유효한" 및 "유효성"은 약제학적 유효성과 생리학적 안전성 둘 다를 포함한다. 약제학적 유효성은 환자에게 원하는 생물학적 효과를 나타내는 치료 능력을 말한다. 생리학적 안전성은 치료제 투여 결과 나타나는 세포, 기관 및/또는 생체(organism) 수준에서의 독성의 레벨, 또는 기타 생리학적인 역효과(종종 "부작용"이라 함)의 레벨을 말한다. "덜 유효한"은 그 치료가 치료학적으로 현저하게 낮은 수준의 약리 유효성을 나타내고 및/또는 치료학적으로 더 높은 수준의 생리학적인 역효과를 나타냄을 의미한다.

핵산 분자는 특정한 생물학적 시료로부터, 당 기술분야에 잘 알려진 다수의 과정을 이용하여 단리할 수 있으며, 그 선택된 특정한 단리 과정은 특정한 생물학적 시료에 적합한 것이다. 예를 들면, 동결-해동(freeze-thaw) 및 알칼리 분해(alkaline lysis) 과정은 고형 재료로부터 핵산 분자를 얻는데 유용할 수 있으며; 가열 및 알칼리 분해(heat and alkaline lysis) 과정은 오줌으로부터 핵산 분자를 얻는데 유용할 수 있으며; 프로테이나제 K 추출법은 혈액으로부터 핵산을 얻기 위해 사용할 수 있다(Rolff, A et al. PCR:Clinical Diagnostics and Research, Springer(1994)).

본 명세서에서, 개체 또는 환자의 "암"은 억제되지 않는 증식, 불멸성, 전이 잠재성, 빠른 성장 및 증식률, 및 어떠한 특징적인 형태학적 특성과 같은 암 유발 세포의 대표적인 특징을 가지고 있는 세포의 존재를 말한다. 어떤 상황에서, 암세포는 종양의 형태일 수 있으며, 또는 그러한 세포가 동물내에 국소적으로 존재하거나 또는 독립 세포로서 혈류 중에 순환할 수 있다.

화합물

본 명세서에서는, 미국특허번호 6,002,008; Greenberger et al, Proc. 11th NCIEORTC-AACR Symposium on New Drugs in Cancer Therapy, Clinical Cancer Res. Vol. 6 Supplement, Nov. 2000, ISSN 1078-0432; Rabindran et al., Cancer Res. 64:3958-3965(2004); Holbro and Hynes, Ann. Rev. Pharm. Tox. 44:195-217(2004); 및 Tejpar et al., J. Clin. Oncol. ASCO Annual Meeting Proc. Vol. 22, No. 14S:3579(2004).에 기재된 바와 같은, EKB-569, HK1-357, 및 HK1-272를 포함한 화합물들을 사용하였다.

재발 NSCLC 및 제피티니브 내성 NCI - H1650 세포의 분석

재발 NSCLC의 임상 표본은 적절한 승인을 받은 후, 검시(autopsy)하여 얻었다. 클로닝되지 않은 PCR 산물을 분석한 후, EGFR의 전체 키나제 도메인을 서열분석하였다. 코돈 790을 조사하기 위해 엑손 20의 다중 클론을 서열분석하였다. NCI-H1650 모세포주는 물론 제피티니브 내성 클론의 EGFR(엑손 1-28), ERBB2(엑손 1-24), PTEN(Qxons 1-9), Kras(코돈 12, 13 및 61), andp53(엑손 5-8)의 돌연변이 분석은 염료 종결인자 화학(dye terminator chemistry)(BIGDYE version 1.1, Applied Biosystems)을 사용하여 양방향 서열분석에 의한 개개의 엑손 및 이웃하는 인트론 서열의 자동서열분석에 의해 수행하였다(PCR 조건은 요청에 따라 이용가능). 서열분석 반응은 ABI3100 서열분석기(Applied Biosystems) 상에서 행하였으며, 전기영동도(electropherogram)는 SEQUENCE NAVIGATOR 및 FACTURA 소프트웨어 (Applied Biosystems)를 사용하여 분석하였다.

NCI-H1650 세포의 내성 서브클론을 생성하기 위해서, 이들에 에틸메탄설포네이트를 처리하고(EMS; 600㎍/ml), 72시간 동안 회복시킨(recover) 다음, 20μM의 제피티니브를 함유하는 10-㎠ 디쉬당 6×10⁴세포 밀도로 접종하였다. 비가역적 저해제와 비교하여, 이들 세포의 제피티니브에 대한 상대적인 내성은, 다양한 농도의 약물의 존재 하에, 5% FCS 및 100ng/ml EGF(Sigma)를 함유하는 6-웰 플레이트에 5×10⁴세포를 접종함으로써 획득하였으며, 72시간 후에, 4% 포름알데히드로 세포를 고정하고, 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 염색한 뒤, Odyssey Infrared Imaging System(LI-COR Biosciences, Lincoln, NE)을 사용하여 세포괴(cell mass)를 정량하였다. 소간섭 RNA(small interfering RNA: siRNA) 녹다운(knockdown) 시험을 위해, 세포를, X-treme GENE 트랜스펙션 시약(Roche Applied Science)을 사용하여, EGFR, ERBB2(둘다 Dharmacon, Lafayette, CO.제 SMARTpool) 또는 비특이적 대조구(LRTlB)를 표적으로 하는 이중가닥 RNA 올리고뉴클레오티드로 트랜스펙션시켰다. 72시간 후, 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색한 다음 Odyssey Infrared scanner 상에서 분석하였다.

면역블로팅 및 신호전달 연구

제피티니브 또는 비가역적 저해제의 농도 증가에 따른 EGFR 신호전달 저해는, 24-웰 플레이트에 9×10⁴세포를 접종하고, 15분 동안 5% FCS를 함유하는 배지에 약물을 첨가한 다음, 100ng/ml EGF로 2시간 펄스한 후, 용해물(lysate)을 얻어서 결정하였다. 용해물은 2×겔 로딩 버퍼 중에 준비하여, 초음파처리하고, 끓인 다음, 10% SDS/PAGE로 분리한 뒤, 폴리비닐리덴 플로라이드(PVDF) 막으로 전기이동(electrotransfer)시켜, 면역블로팅하였다. 항체로는 포스포-EGFR Y1068 및 포스포-미토겐 활성화 단백질 키나제(MAPK)(Cell Signaling Technology, Beverly, MA), 포스포-AKT(BioSource International, Camarillo, CA), 및 총 EGFR, MAPK, AKT, 및 튜불린(Santa Cruz Biotechnology)을 사용하였다.

EGFR 내재화 분석

형광 현미경에 의해 EGFR의 내재화를 증명하기 위해서, 세포를 커버슬립상에서 성장시켜 1ng/ml 재조합 인간(rh) EGF(Molecular Probes, Eugene, OR)와 함께 다양한 간격으로 배양한 다음 10분 동안 4% 파라포름알데히드에 고정시켰다. 커버슬립을 PBS로 세정하고 ProLong Gold 안티페이드 시약(Molecular Probes)을 올려놓았다. 세포 표면 비오틴화(biotinylation)에 의해 EGFR 내재화를 정량화하기 위해 서, 세포가 합류할 때(confluency)까지 성장시킨 다음, 시클로헥사미드로 전처리하고, 설포석신이미딜-2-(비오틴아미도)에틸-1,3-디티오프로피오네이트(설포-NHS-SS-비오틴; Pierce) 1.5mg/ml를 첨가하여 1시간 동안 얼음 중에서 배양한 다음, 블로킹 버퍼(50mM NH₄Cl/1mM MgCl₂A, 1mM CaCl₂(PBS 중))로 세정하여 유리 설포-NHS-SS-비오틴을 제거한(quench) 후, PBS로 수회 더 세정하였다. 그 다음, 상기 세포를 37℃의 배양 배지에서 다양한 간격(interval)으로 배양하여 비오틴화된 분자를 내재화시키고, 얼음 중에서 글루타치오닌 용액(50mM 글루타치온/75mM NaCl/75mM NaOH/1% BSA)에 20분 동안 2번 세정하여 세포 표면으로부터 모든 비오티닐기를 떼어낸 다음, 긁어모아서, NaF, Na-오르토바나데이트, 및 프로테아제 저해제가 추가된, 500μM의 방사면역침전법(radioimmunoprecipitation assay:RIPA) 버퍼(25mM Tris-HCl, pH 7.4, 150mM NaCl/0.1% SDS/1% Triton X-100) 중에 용해시켰다(lyse). 세포 추출물을 원심분리하고, 그 상징액을 스트랩타비딘 비즈(Sigma)를 사용하여 배양하여 비오틴화 단백질을 수집한 다음, SDS/PAGE, 및 항-EGFR 항체(SC-03, Santa Cruz Biotechnology) 또는 트랜스페린 수용체에 대한 항체(Santa Cruz Biotechnology)에 의한 면역블로팅에 의해 분석하였다.

결과 및 토의

제피티니브에 대한 후천적 내성을 가진 재발 폐암 분석

진단시 EGFR 키나제의 활성화 돌연변이를 보유하고 초기에 약물에 대한 극적 인 임상적 반응을 나타내었던 2명의 환자에서 재발 제피티니브 내성 NSCLC이 발병하였다(1). 두 사례에서, 간에서의 진행성 전이성 질병에 의해, 치료 개시 1∼2년 후에 환자가 사망하였다. 사례 1에서, 부검시에 얻어진 주요 간 전이를 분석한 결과, 민감화 EGFR 돌연변이(L858R)의 존속은 물론, 새롭게 획득된 T790M 돌연변이가 존재를 나타내었다(도 1a). 흥미롭게도, 클로닝되지 않은 PCR 산물은, 초기의 L858R 돌연변이가 모든 종양 세포에서 존재하는 이형접합성 돌연변이와 일치하는 존재도(abundance)로 존재함이 확인된 반면, 2차 T790M 돌연변이는 대응하는 야생형 대립유전자의 대략 1/5의 존재도를 보였다. 따라서, 이 내성 관련 돌연변이는 재발 종양내의 세포 부분에만 존재하는 것으로 보인다.

사례 2는 제피티니브 치료 실패 후에 간에 8개의 별개의 재발 전이를 포함하였다. 이들 독립된 병변 모두에서, 민감화 L861Q EGFR 돌연변이가 이형접합성 돌연변이에 대한 기대비로 존재하였다. 이들 전이 중 어느 것으로부터의 클로닝되지 않은 PCT 산물의 분석에 의해서도, 2차 EGFR 돌연변이가 검출되지 않았다. 그러나, 상기 PCR 산물의 서브클로닝 후, T790M 돌연변이는 분석된 4개의 전이성 종양 중 2개(T790M, 병변 1로부터 서열분석한 50개의 클론 중 2개, 병변 2로부터는 56개 클론 중 1개)에서 매우 낮은 비율로 존재하였으나, 나머지 2개의 재발 전이(병변 3으로부터의 55개의 클론 중 0개, 및 병변 4로부터의 59개 클론 중 0개) 또는 원발성 종양(75개의 클론 중 0개)에서는 존재하지 않았다(도 1b 및 표 1). 종합해보면, 이 결과들은 T790M 돌연변이가 후천적 제피티니브 내성을 가진 모든 사례가 아니라 몇몇 사례에서만 존재한다는 이전 보고와 일치한다(7개의 종양 중 3개; 참고 문헌 17, 18 및 21 참조.). 게다가, 앞서 언급한 바와 같이(18), 이러한 내성 관련 돌연변이를 가진 몇몇 사례에서조차, 그 돌연변이가 재발 병변내의 작은 분율의 종양 세포에만 존재하는 것으로 보인다. 이 관찰들은 부가적인 내성 메카니즘이 2차 EGFR 돌연변이가 없는 사례에 관련됨과, 그러한 메카니즘이 다른 사례에서는 T790M 돌연변이와 공존함을 시사한다.

비가역적 저해제에 대한 감수성을 가진 제피티니브 내성 세포주의 생성

본 발명자들은, EGFR 돌연변이 NSCLC의 임상적 반응과 이러한 돌연변이를 가진 NSCLC 세포주의 증강된 제피티니브 감수성 간의 상호관련이 뛰어나고(2, 6, 22, 23), 재발 환자로부터의 임상 표본의 입수가능성이 제한됨을 감안하여, 시험관내에서(in vitro) 제피티니브 내성을 만들었다(model). 돌연변이원인 에틸메탄설포네이트에 사전 노출하거나 또는 하지 않고, 20μM 제피티니브 중에서, EGFR 키나제의 인프레임 결실(in-frame deletion)(delE746-A750)을 가진 기관지폐포암 세포주 NCI-H1650을 배양하였다. 이 세포주는 야생형 EGFR을 발현하는 몇몇 NSCLC 세포주와 비교하여, 제피티니브에 대해 100배 증가된 감수성을 나타내었다(6). 이 세포들 대다수는 20μM 제피티니브에 의해 효율적으로 사멸되는 반면, 돌연변이원 처리와 관계없이, 약물 내성 콜로니가 ∼10^~5의 빈도로 쉽게 관찰되었다. 49개의 독립적인 약물내성 클론이 단리되었으며, 평균 50배의 제피티니브 감수성 감소를 나타내었다(도 2a). 이들 모두 EGFR 발현의 변화없이 민감화 돌연변이의 유지를 나타내 었으며, 2차 EGFR 돌연변이나 ERBB2 , p53 , Kras , 또는 PTEN에서의 새로운 돌연변이는 획득되지 않았다. 제피티니브 내성 클론은 아닐리노퀴나졸린 클래스의 관련 저해제에 대해 유사한 내성을 나타내었다. 그러나, 그들은 ERBB 패밀리의 3개의 저해제에 대해 지속적인 감수성을 현저하게 나타내었다(도 2a): EGFR 및 ERBB2의 이중 저해제인 HKI-272(24) 및 HKI-357(참고문헌 25의 화합물 7f)(EGFR에 대하여 IC₅₀ 값이 각각 92 및 34nM이고, ERBB2에 대한 IC₅₀ 값은 각각 59 및 33nM임), EGFR의 선택적 저해제인 EKB-569(26)(EGFR에 대한 IC₅₀ 값은 39nM이고 ERBB2에 대한 IC₅₀ 값은 1.3μM임)(Wyeth)(도 2b). 3개의 약물 모두 비가역적 저해제로서, 대부분 아마도 EGFR 촉매 도메인내의 cys773 잔기와의 공유 결합 또는 ERBB2의 cys805 잔기와의 공유 결합을 통한 것일 것이다. 제피티니브와 같이, 이들 화합물은, 야생형 수용체를 발현하는 세포와 비교하여, EGFR 돌연변이를 보유하고 있는 NSCLC 세포의 증가된 사멸을 나타내었다(도 2a). 그러나, 내성 클론이 쉽게 생성되는 제피티니브와 대조적으로, 매우 높은 약물 농도에서조차도, 10μM을 넘는 농도의 비가역적 저해제에 대해 내성을 나타내는 세포 클론을 확립할 수 없었으며, 에틸메탄설포네이트 돌연변이유발 후에조차도 불가능하였다(도 2c).

제피티니브 내성 세포의 EGFR 및 ERBB2 발현에 대한 의존성

본 발명자들은 제피티니브 내성 획득과 비가역적 저해제에 대한 지속적인 감수성의 근거가 되는 메카니즘을 통찰하기 위해서, 우선 내성 세포주가 그들의 생육 성에 대하여 EGFR에 의존적인지 여부를 결정하였다. 본 발명자들은 EGFR의 siRNA 매개 녹다운이 돌연변이 EGFR을 보유하고 있는 세포에서의 세포자멸(apoptosis)을 유발하지만, 야생형 대립유전자를 가진 세포에서는 그렇지 않음을 앞서 나타내었다(6). 중요하게도, NCI-H1650 모세포는 물론 그들의 제피티니브 내성 유도체는 EGFR을 표적으로 하는 siRNA에 의한 트랜스펙션 후에 세포 생육성에서 유사한 감소를 나타내었다(도 3a). 따라서, 제피티니브 내성의 획득이 하류 작동자의 EGFR 독립적 활성화를 뜻하지는 않는다. HKI-272 및 HKI-357은 EGFR과 ERBB2 둘다를 표적으로 하기 때문에, 본 발명자들은 이러한 관련 수용체의 억제(suppression)도 시험하였다. NCI-H1650 및 제피티니브 내성 유도체에서의 ERBB2의 녹다운은 생육성의 소실을 유발하였으며(도 3a), 이는 EGFR 돌연변이를 보유하고 있는 종양 세포에서의 필수적인 생존 신호 전달에 있어서의 EGFR-ERBB2 헤테로다이머의 역할을 시사한다. EGFR을 일차적으로 표적으로 하는 EKB-569의 유효성에 의해 나타나는 바와 같이(26), 비가역적 저해제에 의한 EGFR 단독 저해는 제피티니브 내성 세포의 세포자멸을 유도하기에 충분한 것으로 여겨진다. 하지만, siRNA를 사용하여 EGFR과 ERBB2 둘다를 표적으로 하는 것의 잠재적인 상보적인 효과와, 이들 패밀리 구성원 둘 다를 표적으로 하는 비가역적 저해제의 유용성(availability)을 감안할 때, 이중 저해(dual inhibition)의 잠재적인 이점이 중요하게 고려된다.

본 발명자들은 그 증식 및 생존 경로를 매개하는 EGFR의 하류 작동자를 통한 신호전달을 억제하는, 제피티니브와 비가역적 ERBB 패밀리 저해제의 능력을 비교하였다. HKI-357은, EGFR 자동인산화 억제(Y1068 잔기에서 측정) 및 delE746-A750 EGFR 돌연변이를 보유하고 있는 NCI-H1650 모세포의 AKT 및 MAPK 인산화의 억제에 있어서, 제피티니브보다 10배 더 효과적이었다(도 3b). 제피티니브 내성 유도체 NCI-H1650(G7)에서, 제피티니브는 AKT 인산화 억제에 상당히 감소된 유효성을 나타내었으며, 주요한 EGFR 신호전달 작동자는 제피티니브 반응성에 관련되어 있는 반면(6), HKI-357은 지속적인 활성을 나타내었다(도 3b).

제피티니브 내성 클론에서의 EGFR 내재화의 변화

본 발명자들은, EGFR에 2차 돌연변이가 없고 제피티니브 내성 세포가 EGFR의 siRNA 매개 억제에 대해 지속적인 감수성을 나타내는 경우, 가역적 및 비가역적 저해제에 의한 제피티니브 내성 세포의 EGFR 신호전달의 특이적(differential) 저해의 근거가 되는 메카니즘이 수용체 트래피킹의 변이, 즉 EGFR 의존적 신호전달의 잘 알려진 조절자의 변이와 상호관련이 있는지의 여부를 시험하였다(20). 실제로, NCI-H1650 유래 내성 세포에서의 EGFR 트래피킹을 분석한 결과, 약물 감수성 모세포와 비교하여, 플루오레센 표지 EGF의 내재화(도 3c) 및 세포질 비오틴화 EGFR의 정량화(도 3d) 둘 다에 의해 측정된 바와 같이, EGFR 내재화의 일관된 증가를 나타내었다. 이러한 결과는 트랜스페린(transferrin) 수용체에서는 관찰되지 않았으며, 이는 모든 수용체 프로세싱에서의 일반화된 변화로부터 나오는 결과가 아님을 시사한다. 이러한 EGFR 트래피킹의 변이에 대한 정확한 메카니즘, 즉 다수의 조절 단백질이 관련되어 있는 복잡한 과정을 규명하기 위해 더 많은 연구가 필요하지만, 이 결과들은 EGFR 활성화를 저해하는 제피티니브의 능력이 이들 세포에서 손상되어 있는 반면, 비가역적 저해제의 작용은 검출가능한 영향을 받지 않음을 시사한다.

비가역적 저해제에 의한 T790M EGFR 신호전달의 저해 및 세포사멸 증가

비가역적 ERBB 저해제에 의한 EGFR 신호전달 억제의 증가는 이 약물들이 EGFR의 T790M 2차 돌연변이를 보유하는 세포에서 지속적인 활성을 나타낼 수 있는 가능성을 높였다. 따라서, 본 발명자들은 EGFR에 L858R 및 T790M 돌연변이 둘 다를 보유하고 있는 NCI-H1975 기관지폐포암 세포주에 대한 이들 저해제의 효과를 시험하였다(18). 의미심장하게도, 이 세포주는 EGFR 저해제로 치료하지 않은 환자로부터 유래하였으며, 이는 이 돌연변이가 후천적인 약물 내성과 특별히 관련되지 않음을 나타낸다. HKI-357과 HKI-272는 둘다, AKT 및 MAPK 인산화에 의해 측정된 바와 같이, 리간드 유도 EGFR 자동인산화와 그의 하류 신호전달을 억제함에 있어서 제피티니브보다 훨씬 더 효과적이었다(도 4a). 마찬가지로, 3개의 비가역적 저해제 모두, 제피티니브에 내성이 있는 조건 하에서, 이 세포주의 증식을 억제하였다(도 4b). 따라서, 비가역적 ERBB 저해제는 T790M EGFR을 보유하고 있는 세포는 물론 야생형 수용체의 변이된 트래피킹을 가진 세포에서 효과적인 것으로 보인다.

본 발명의 결과는, 후천적인 내성의 출현과 관련하여, 사전에 활성화 돌연변이를 보유하는 감수성 NSCLC에서 발생하는 2차 돌연변이로서의 EGFR의 T790M 돌연변이의 보고를 확인한 것이다(17, 18). 그러나, 이 돌연변이는 일부 사례에서만 존재하며, 심지어 T790M 돌연변이를 보유하는 종양도 세포 중의 일부분만이 이 돌연변이를 포함할 수 있다. 이 관찰들은 제피티니브 또는 유사한 가역적 EGFR 저해 제에 대한 초기 응답 후 재발한 종양에 다중 내성 메카니즘이 공존할 수 있음을 함축한다. 또한, 이러한 소견들은, T790M-비의존성 내성 메카니즘이 약물 내성을 부여함에 있어서 T790M 치환 그자체보다 더 효과적이지는 않더라도, 동등하게 효과적일 수 있음을 시사하고, 재발 종양이 T790M에 대한 클론형성능(clonality)을 거의 나타내지 않는 이유를 설명할 수 있다(17, 18). 후천적인 제피티니브 내성의 시험관내 메카니즘은 유의한 빈도의 2차 EGFR 돌연변이를 포함하지는 않지만, 대신에 변이된 수용체 트래피킹과 상호관련된다. 하지만, 본 발명자들이 시험관내에서 확립했던 모든 내성 클론의 EGFR 트래피킹을 시험한 것은 아니며, 부가적인 메카니즘이 몇몇 클론의 제피티니브 내성에 기여할 수 있을 가능성이 여전히 남아있음을 인지해야 한다. 그럼에도 불구하고, 실질적으로 모든 제피티니브 내성 클론은 비가역적 ERBB 저해제에 대해 유사한 감수성을 나타내었다.

본 발명의 결과는, 시험관내에서의 약물 내성의 빠른 발생에 의해 그 유효성이 제한되는 제피티니브 등의 경쟁적 EGFR 저해제와, 후천적 내성이 드물게 나타나는 비가역적 저해제 사이에 현저한 차이를 나타낸다(도 2c). 본 발명자들은 내성 세포에서의 리간드 결합 EGFR의 증가된 내재화는 세포내 소포의 낮은 pH에서의 제피티니브-EGFR 복합체 해리와 관련될 수도 있다고 생각한다. 반대로, 상기 수용체의 비가역적 가교는 이러한 수용체 트래피킹의 변이에 의해 영향을 받지 않을 것이다. 제피티니브에 대한 후천적 내성은 약물 부재시 20세대까지 세포 계대(cell passage) 후에 안정적으로 유지되며, 이는 EGFR 턴오버를 조정하는 유전자에서의 유전적 또는 후생학적(epigenetic) 변이가 이 현상의 원인이 될 수 있음을 시사한 다. 수용체 트래피킹은 이용가능한 임상 표본을 사용하여 쉽게 연구할 수 없기 때문에, 이러한 게놈 변이의 동정은 임상적으로 상호관련시키기 전에 요구될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이러한 메카니즘은 EGFR의 2차 돌연변이를 갖지 않은 재발 질병에 걸린 환자에 있어서 생체내(in vivo) 후천적 제피티니브 내성의 원인이 될 수 있다.

또한, 비가역적 ERBB 저해제는 T790M 돌연변이에 의해 매개되는 제피티니브 내성을 극복하는데 효과적인 것으로 보이며, 그 효과는 아마도 이 결정적인 잔기의 변이에도 불구하고 저해제 결합이 보존됨에 의한 것이다. 이 연구가 진행되는 동안, EGFR의 또 다른 비가역적 저해제[CL-387, 785, Calbiochem(27)]가 T790M EGFR 돌연변이의 키나제 활성을 저해함이 확인되었다(17). T790M의 관점에서 CL-387, 785의 유효성은, 제피티니브에는 존재하는 아닐린기의 3위치의 염소가 부재임에 기인하는 것으로 제안되었으며, 코돈 790의 돌연변이 메티오닌에의 결합이 입체적으로 방해되는 것으로 가정되었다. 그러나, EKB-569, HKI-272, 및 HKI-357 모두, 상기 아닐링 환의 그 위치에 염소 부분(moiety)을 가지고 있으며, 이는 T790M과의 특이적 입체 상호작용의 부재보다는 오히려, EGFR에 비가역적으로 결합하는 그들의 공통된 능력이 그 유효성을 설명할 수 있음을 시사한다(24-26). 따라서, 이 비가역적 저해제들이, 상기 T790M 돌연변이 외에, 다양한 내성 메카니즘을 우회하는데 널리 효과적임을 입증할 수 있다.

[표 1] 사례 2의 재발 종양에서의 매우 낮은 빈도의 EGFR T790M 돌연변이의 존재

	클론 수
종양	T790M 돌연변이	야생형
원발성	0	75
재발 1	2	48
재발 2	1	55
재발 3	0	55
재발 4	0	59

다수의 클로닝된 PCR 산물의 서열분석 결과, 4개의 간 병변 중의 2개에 있어서 소수의 대립유전자가 T790M 돌연변이를 포함함이 드러났다.

본 출원을 통해 인용된 참조문헌은 본 명세서에 그 전체 내용을 참고로서 편입한다.

[참고문헌]

<110> THE GENERAL HOSPITAL CORPORATION WYETH <120> METHOD FOR TREATING GEFITINIB RESISTANT CANCER <130> 030258-57642-PCT <140> PCT/US06/003717 <141> 2006-02-02 <150> 60/649,483 <151> 2005-02-03 <150> 60/671,989 <151> 2005-04-15 <160> 5 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 3878 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (246)..(3875) <400> 1 cccggcgcag cgcggccgca gcagcctccg ccccccgcac ggtgtgagcg cccgacgcgg 60 ccgaggcggc cggagtcccg agctagcccc ggcggccgcc gccgcccaga ccggacgaca 120 ggccacctcg tcggcgtccg cccgagtccc cgcctcgccg ccaacgccac aaccaccgcg 180 cacggccccc tgactccgtc cagtattgat cgggagagcc ggagcgagct cttcggggag 240 cagcg atg cga ccc tcc ggg acg gcc ggg gca gcg ctc ctg gcg ctg ctg 290 Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 10 15 gct gcg ctc tgc ccg gcg agt cgg gct ctg gag gaa aag aaa gtt tgc 338 Ala Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys 20 25 30 caa ggc acg agt aac aag ctc acg cag ttg ggc act ttt gaa gat cat 386 Gln Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His 35 40 45 ttt ctc agc ctc cag agg atg ttc aat aac tgt gag gtg gtc ctt ggg 434 Phe Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly 50 55 60 aat ttg gaa att acc tat gtg cag agg aat tat gat ctt tcc ttc tta 482 Asn Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu 65 70 75 aag acc atc cag gag gtg gct ggt tat gtc ctc att gcc ctc aac aca 530 Lys Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr 80 85 90 95 gtg gag cga att cct ttg gaa aac ctg cag atc atc aga gga aat atg 578 Val Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met 100 105 110 tac tac gaa aat tcc tat gcc tta gca gtc tta tct aac tat gat gca 626 Tyr Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala 115 120 125 aat aaa acc gga ctg aag gag ctg ccc atg aga aat tta cag gaa atc 674 Asn Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile 130 135 140 ctg cat ggc gcc gtg cgg ttc agc aac aac cct gcc ctg tgc aac gtg 722 Leu His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val 145 150 155 gag agc atc cag tgg cgg gac ata gtc agc agt gac ttt ctc agc aac 770 Glu Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn 160 165 170 175 atg tcg atg gac ttc cag aac cac ctg ggc agc tgc caa aag tgt gat 818 Met Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp 180 185 190 cca agc tgt ccc aat ggg agc tgc tgg ggt gca gga gag gag aac tgc 866 Pro Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys 195 200 205 cag aaa ctg acc aaa atc atc tgt gcc cag cag tgc tcc ggg cgc tgc 914 Gln Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys 210 215 220 cgt ggc aag tcc ccc agt gac tgc tgc cac aac cag tgt gct gca ggc 962 Arg Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly 225 230 235 tgc aca ggc ccc cgg gag agc gac tgc ctg gtc tgc cgc aaa ttc cga 1010 Cys Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg 240 245 250 255 gac gaa gcc acg tgc aag gac acc tgc ccc cca ctc atg ctc tac aac 1058 Asp Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn 260 265 270 ccc acc acg tac cag atg gat gtg aac ccc gag ggc aaa tac agc ttt 1106 Pro Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe 275 280 285 ggt gcc acc tgc gtg aag aag tgt ccc cgt aat tat gtg gtg aca gat 1154 Gly Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp 290 295 300 cac ggc tcg tgc gtc cga gcc tgt ggg gcc gac agc tat gag atg gag 1202 His Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu 305 310 315 gaa gac ggc gtc cgc aag tgt aag aag tgc gaa ggg cct tgc cgc aaa 1250 Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys 320 325 330 335 gtg tgt aac gga ata ggt att ggt gaa ttt aaa gac tca ctc tcc ata 1298 Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile 340 345 350 aat gct acg aat att aaa cac ttc aaa aac tgc acc tcc atc agt ggc 1346 Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly 355 360 365 gat ctc cac atc ctg ccg gtg gca ttt agg ggt gac tcc ttc aca cat 1394 Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His 370 375 380 act cct cct ctg gat cca cag gaa ctg gat att ctg aaa acc gta aag 1442 Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys 385 390 395 gaa atc aca ggg ttt ttg ctg att cag gct tgg cct gaa aac agg acg 1490 Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr 400 405 410 415 gac ctc cat gcc ttt gag aac cta gaa atc ata cgc ggc agg acc aag 1538 Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys 420 425 430 caa cat ggt cag ttt tct ctt gca gtc gtc agc ctg aac ata aca tcc 1586 Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser 435 440 445 ttg gga tta cgc tcc ctc aag gag ata agt gat gga gat gtg ata att 1634 Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile 450 455 460 tca gga aac aaa aat ttg tgc tat gca aat aca ata aac tgg aaa aaa 1682 Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys 465 470 475 ctg ttt ggg acc tcc ggt cag aaa acc aaa att ata agc aac aga ggt 1730 Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly 480 485 490 495 gaa aac agc tgc aag gcc aca ggc cag gtc tgc cat gcc ttg tgc tcc 1778 Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser 500 505 510 ccc gag ggc tgc tgg ggc ccg gag ccc agg gac tgc gtc tct tgc cgg 1826 Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg 515 520 525 aat gtc agc cga ggc agg gaa tgc gtg gac aag tgc aac ctt ctg gag 1874 Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu 530 535 540 ggt gag cca agg gag ttt gtg gag aac tct gag tgc ata cag tgc cac 1922 Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His 545 550 555 cca gag tgc ctg cct cag gcc atg aac atc acc tgc aca gga cgg gga 1970 Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly 560 565 570 575 cca gac aac tgt atc cag tgt gcc cac tac att gac ggc ccc cac tgc 2018 Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys 580 585 590 gtc aag acc tgc ccg gca gga gtc atg gga gaa aac aac acc ctg gtc 2066 Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val 595 600 605 tgg aag tac gca gac gcc ggc cat gtg tgc cac ctg tgc cat cca aac 2114 Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn 610 615 620 tgc acc tac gga tgc act ggg cca ggt ctt gaa ggc tgt cca acg aat 2162 Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn 625 630 635 ggg cct aag atc ccg tcc atc gcc act ggg atg gtg ggg gcc ctc ctc 2210 Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu 640 645 650 655 ttg ctg ctg gtg gtg gcc ctg ggg atc ggc ctc ttc atg cga agg cgc 2258 Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg 660 665 670 cac atc gtt cgg aag cgc acg ctg cgg agg ctg ctg cag gag agg gag 2306 His Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu 675 680 685 ctt gtg gag cct ctt aca ccc agt gga gaa gct ccc aac caa gct ctc 2354 Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu 690 695 700 ttg agg atc ttg aag gaa act gaa ttc aaa aag atc aaa gtg ctg ggc 2402 Leu Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly 705 710 715 tcc ggt gcg ttc ggc acg gtg tat aag gga ctc tgg atc cca gaa ggt 2450 Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly 720 725 730 735 gag aaa gtt aaa att ccc gtc gct atc aag gaa tta aga gaa gca aca 2498 Glu Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr 740 745 750 tct ccg aaa gcc aac aag gaa atc ctc gat gaa gcc tac gtg atg gcc 2546 Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala 755 760 765 agc gtg gac aac ccc cac gtg tgc cgc ctg ctg ggc atc tgc ctc acc 2594 Ser Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr 770 775 780 tcc acc gtg cag ctc atc acg cag ctc atg ccc ttc ggc tgc ctc ctg 2642 Ser Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu 785 790 795 gac tat gtc cgg gaa cac aaa gac aat att ggc tcc cag tac ctg ctc 2690 Asp Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu 800 805 810 815 aac tgg tgt gtg cag atc gca aag ggc atg aac tac ttg gag gac cgt 2738 Asn Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg 820 825 830 cgc ttg gtg cac cgc gac ctg gca gcc agg aac gta ctg gtg aaa aca 2786 Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr 835 840 845 ccg cag cat gtc aag atc aca gat ttt ggg ctg gcc aaa ctg ctg ggt 2834 Pro Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly 850 855 860 gcg gaa gag aaa gaa tac cat gca gaa gga ggc aaa gtg cct atc aag 2882 Ala Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys 865 870 875 tgg atg gca ttg gaa tca att tta cac aga atc tat acc cac cag agt 2930 Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser 880 885 890 895 gat gtc tgg agc tac ggg gtg acc gtt tgg gag ttg atg acc ttt gga 2978 Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly 900 905 910 tcc aag cca tat gac gga atc cct gcc agc gag atc tcc tcc atc ctg 3026 Ser Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu 915 920 925 gag aaa gga gaa cgc ctc cct cag cca ccc ata tgt acc atc gat gtc 3074 Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val 930 935 940 tac atg atc atg gtc aag tgc tgg atg ata gac gca gat agt cgc cca 3122 Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro 945 950 955 aag ttc cgt gag ttg atc atc gaa ttc tcc aaa atg gcc cga gac ccc 3170 Lys Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro 960 965 970 975 cag cgc tac ctt gtc att cag ggg gat gaa aga atg cat ttg cca agt 3218 Gln Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser 980 985 990 cct aca gac tcc aac ttc tac cgt gcc ctg atg gat gaa gaa gac atg 3266 Pro Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met 995 1000 1005 gac gac gtg gtg gat gcc gac gag tac ctc atc cca cag cag ggc ttc 3314 Asp Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe 1010 1015 1020 ttc agc agc ccc tcc acg tca cgg act ccc ctc ctg agc tct ctg agt 3362 Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu Ser 1025 1030 1035 gca acc agc aac aat tcc acc gtg gct tgc att gat aga aat ggg ctg 3410 Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn Gly Leu 1040 1045 1050 1055 caa agc tgt ccc atc aag gaa gac agc ttc ttg cag cga tac agc tca 3458 Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser 1060 1065 1070 gac ccc aca ggc gcc ttg act gag gac agc ata gac gac acc ttc ctc 3506 Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp Asp Thr Phe Leu 1075 1080 1085 cca gtg cct gaa tac ata aac cag tcc gtt ccc aaa agg ccc gct ggc 3554 Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly 1090 1095 1100 tct gtg cag aat cct gtc tat cac aat cag cct ctg aac ccc gcg ccc 3602 Ser Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro 1105 1110 1115 agc aga gac cca cac tac cag gac ccc cac agc act gca gtg ggc aac 3650 Ser Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr Ala Val Gly Asn 1120 1125 1130 1135 ccc gag tat ctc aac act gtc cag ccc acc tgt gtc aac agc aca ttc 3698 Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe 1140 1145 1150 gac agc cct gcc cac tgg gcc cag aaa ggc agc cac caa att agc ctg 3746 Asp Ser Pro Ala His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu 1155 1160 1165 gac aac cct gac tac cag cag gac ttc ttt ccc aag gaa gcc aag cca 3794 Asp Asn Pro Asp Tyr Gln Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro 1170 1175 1180 aat ggc atc ttt aag ggc tcc aca gct gaa aat gca gaa tac cta agg 3842 Asn Gly Ile Phe Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg 1185 1190 1195 gtc gcg cca caa agc agt gaa ttt att gga gca tga 3878 Val Ala Pro Gln Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala 1200 1205 1210 <210> 2 <211> 1210 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln 20 25 30 Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe 35 40 45 Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn 50 55 60 Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys 65 70 75 80 Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val 85 90 95 Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr 100 105 110 Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn 115 120 125 Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu 130 135 140 His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu 145 150 155 160 Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met 165 170 175 Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro 180 185 190 Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln 195 200 205 Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg 210 215 220 Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys 225 230 235 240 Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp 245 250 255 Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro 260 265 270 Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly 275 280 285 Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His 290 295 300 Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu 305 310 315 320 Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val 325 330 335 Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn 340 345 350 Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp 355 360 365 Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr 370 375 380 Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu 385 390 395 400 Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp 405 410 415 Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln 420 425 430 His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu 435 440 445 Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser 450 455 460 Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu 465 470 475 480 Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu 485 490 495 Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro 500 505 510 Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn 515 520 525 Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly 530 535 540 Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro 545 550 555 560 Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro 565 570 575 Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val 580 585 590 Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp 595 600 605 Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys 610 615 620 Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly 625 630 635 640 Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu 645 650 655 Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His 660 665 670 Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu 675 680 685 Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu 690 695 700 Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser 705 710 715 720 Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu 725 730 735 Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser 740 745 750 Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser 755 760 765 Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser 770 775 780 Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp 785 790 795 800 Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn 805 810 815 Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg 820 825 830 Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro 835 840 845 Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala 850 855 860 Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp 865 870 875 880 Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp 885 890 895 Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser 900 905 910 Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu 915 920 925 Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr 930 935 940 Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys 945 950 955 960 Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln 965 970 975 Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro 980 985 990 Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp 995 1000 1005 Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe Phe 1010 1015 1020 Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu Ser Ala 1025 1030 1035 1040 Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn Gly Leu Gln 1045 1050 1055 Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser Asp 1060 1065 1070 Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp Asp Thr Phe Leu Pro 1075 1080 1085 Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly Ser 1090 1095 1100 Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser 1105 1110 1115 1120 Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro 1125 1130 1135 Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp 1140 1145 1150 Ser Pro Ala His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp 1155 1160 1165 Asn Pro Asp Tyr Gln Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn 1170 1175 1180 Gly Ile Phe Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val 1185 1190 1195 1200 Ala Pro Gln Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala 1205 1210 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 tgcarctcat cacgca 16 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 tgcarctcat caygca 16 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 5 tgcaactcat catgca 16

Claims

a. 개체의 제피티니브(gefitinib) 및/또는 에를로티니브(erlotinib) 치료 개시 이후 시점에 개체의 암 진행을 모니터링하는 단계로서, 상기 암 진행은 그 암이 제피티니브 및/또는 에를로티니브 치료에 대한 내성암임을 나타내는 단계; 및

b. 제피티니브 및/또는 에를로티니브 치료에 대한 내성암을 가진 개체에, 비가역적 표피성장인자 수용체(EGFR) 저해제를 포함한 약제학적 조성물을 투여하는 단계

를 포함하는 제피티니브 및/또는 에를로티니브 내성암 치료방법.
제1항에 있어서,

상기 비가역적 EGFR 저해제가 EKB-569, HKI-272 및 HKI-357로 이루어지는 군에서 선택되는, 제피티니브 및/또는 에를로티니브 내성암 치료방법.
제1항에 있어서,

상기 비가역적 EGFR 저해제가 EGFR(서열번호 1)의 시스테인 773에 결합하는, 제피티니브 및/또는 에를로티니브 내성암 치료방법.
제1항에 있어서,

상기 암 진행이 암의 외관검사(visual inspection)를 통해 모니터링되는, 제 피티니브 및/또는 에를로티니브 내성암 치료방법.
제4항에 있어서,

상기 암의 외관검사가 X-ray, CT 스캔 또는 MRI에 의한 것인, 제피티니브 및/또는 에를로티니브 내성암 치료방법.
제1항에 있어서,

상기 암 진행이 종양 바이오마커 검출(tumor biomarker detection)을 통해 모니터링되는, 제피티니브 및/또는 에를로티니브 내성암 치료방법.
제1항에 있어서,

상기 암 진행의 모니터링은 두번째 시점의 암과 첫번째 시점의 암을 비교하는 단계를 포함하며, 상기 두번째 시점은 첫번째 시점 후이고, 상기 첫번째 시점은 제피티니브 및/또는 에를로티니브 치료 개시 전 또는 후이고, 증가된 암 성장은 암 진행을 나타내는, 제피티니브 및/또는 에를로티니브 내성암 치료방법.
제7항에 있어서,

추가 시점의 암을 이전 시점과 비교하는, 제피티니브 및/또는 에를로티니브 내성암 치료방법.
제1항에 있어서,

상기 암이 상피세포암인, 제피티니브 및/또는 에를로티니브 내성암 치료방법.
제1항에 있어서,

상기 암이 위장암, 전립선암, 난소암, 유방암, 두경부암, 식도암, 폐암, 비소세포 폐암, 신경계암, 신장암, 망막암, 피부암, 간암, 췌장암, 생식기-비뇨기암 및 방광암인, 제피티니브 및/또는 에를로티니브 내성암 치료방법.
a. 제피티니브 및/또는 에를로티니브를 암에 걸린 개체에 투여하는 단계;

b. 상기 개체의 암 진행을 모니터링하는 단계; 및

c. 암 진행으로 표시될 때 상기 개체에게 비가역적 EGFR 저해제를 투여하는 단계

를 포함하는 암 치료방법.
제11항에 있어서,

상기 비가역적 EGFR 저해제가 EKB-569, HKI-272 및 HKI-357로 이루어지는 군에서 선택되는, 암 치료방법.
제11항에 있어서,

상기 비가역적 EGFR 저해제가 EGFR(서열번호 1)의 시스테인 773에 결합하는, 암 치료방법.
제11항에 있어서,

상기 암 진행이 암의 외관검사를 통해 모니터링되는, 암 치료방법.
제14항에 있어서,

상기 암의 외관검사가 X-ray, CT 스캔 또는 MRI에 의한 것인, 암 치료방법.
제11항에 있어서,

상기 암 진행이 종양 바이오마커 검출을 통해 모니터링되는, 암 치료방법.
제11항에 있어서,

상기 암 진행의 모니터링은 두번째 시점의 암과 첫번째 시점의 암을 비교하는 단계를 포함하며, 상기 두번째 시점은 첫번째 시점 후이고, 상기 첫번째 시점은 제피티니브 및/또는 에를로티니브 치료 개시 전 또는 후이고, 증가된 암 성장은 암 진행을 나타내는, 암 치료방법.
제17항에 있어서,

추가 시점의 암을 이전 시점과 비교하는, 암 치료방법.
제11항에 있어서,

상기 암이 상피세포암인, 암 치료방법.
제11항에 있어서,

상기 암이 위장암, 전립선암, 난소암, 유방암, 두경부암, 식도암, 폐암, 비소세포 폐암, 신경계암, 신장암, 망막암, 피부암, 간암, 췌장암, 생식기-비뇨기암 및 방광암인, 암 치료방법.
제11항에 있어서,

상기 비가역적 EGFR 저해제를 가역적 EGFR 저해제와 동시에 투여하는, 암 치료방법.
제21항에 있어서,

상기 가역적 EGFR 저해제가 제피티니브 또는 에를로티니브인, 암 치료방법.
EGFR(서열번호 1)의 790 위치의 트레오닌이 메티오닌으로 치환된 돌연변이를 가진 암에 걸린 개체에, 비가역적 EGFR 저해제를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법.
제23항에 있어서,

상기 EGFR 저해제가 EKB-569, HKI-272 및 HKI-357로 이루어지는 군에서 선택되는, 암 치료방법.
제23항에 있어서,

상기 비가역적 EGFR 저해제가 EGFR(서열번호 1)의 시스테인 773에 결합하는, 암 치료방법.
제23항에 있어서,

상기 암이 상피세포암인, 암 치료방법.
제23항에 있어서,

상기 암이 위장암, 전립선암, 난소암, 유방암, 두경부암, 식도암, 폐암, 비소세포 폐암, 신경계암, 신장암, 망막암, 피부암, 간암, 췌장암, 생식기-비뇨기암 및 방광암인, 암 치료방법.