JP2022527788A - Ｅｇｆｒまたはｈｅｒ２エクソン２０挿入を有するがん細胞に対する抗腫瘍活性を有する化合物 - Google Patents

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Abstract

本開示は、ポジオチニブまたはアファチニブなどの第３世代チロシンキナーゼ阻害剤を投与することによって、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２エクソン２０変異、例えば挿入変異を有すると判定された患者においてがんを治療する方法を提供する。TIFF2022527788000013.tif58128

Description

本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、２０１９年３月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／８２６，８４３号の恩典を主張するものである。
配列表の組み込み
「ＵＴＦＣＰ１３８３ＷＯ．ｔｘｔ」という名称のファイル中に収容され、３．５９ＫＢ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓで計算された場合）であり、２０２０年３月２７日に作成された配列表が、本明細書と共に電子的に提出されており、参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈにより授与された認可番号ＣＡ１９０６２８の下、政府支援により行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
１．分野
本発明は全体として、分子生物学および医学の分野に関する。より具体的には、本発明は、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２エクソン２０変異、例えば挿入変異を有する患者を治療する方法に関する。
２．関連技術の説明
ＮＳＣＬＣのおよそ１０～１５％は、活性化ＥＧＦＲ変異を保有する。腫瘍が「古典的（ｃｌａｓｓｉｃａｌ）」感受性変異（Ｌ８５８Ｒおよびエクソン１９欠失）を有するこれらの患者の大部分では、ゲフィチニブおよびエルロチニブなどのＴＫＩは、劇的な臨床的有用性をもたらし、およそ７０％で、客観的奏効（ＯＲ）、化学療法単独と比較しての無増悪生存期間（ＰＦＳ）、および生活の質の改善を経験した（Ｍａｅｍｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。しかしながら、ＥＧＦＲ変異体ＮＳＣＬＣ腫瘍のおよそ１０～１２％は、ＥＧＦＲのエクソン２０内にインフレーム挿入を有し（Ａｒｃｉｌａ ｅｔ ａｌ，２０１２）、概してＥＧＦＲ ＴＫＩに対して耐性を有する。加えて、ＮＳＣＬＣにおけるＨＥＲ２変異の９０％はエクソン２０変異である（Ｍａｚｉｅｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。合わせると、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０変異はＮＳＣＬＣ患者のおよそ４％を構成する。これまでのデータは、使用可能なＨＥＲ２のＴＫＩ（アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、ダコミチニブ）は、ＨＥＲ２変異体腫瘍を有する患者では限定された活性を有し、多くの試験は４０％を下回るＯＲ率を報告している（Ｋｏｓａｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１７）が、いくらかの前臨床活性が、アファチニブで処置されたＨＥＲ２マウスモデルで観察される（Ｐｅｒｅｒａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。
ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のエクソン２０は、２つの主な領域である、ｃ－ヘリックス（ＥＧＦＲにおける残基７６２～７６６、およびＨＥＲ２における残基７７０～７７４）ならびにｃ－ヘリックスに続くループ（ＥＧＦＲにおける残基７６７～７７４、およびＨＥＲ２における残基７７５～７８３）を含む。ＥＧＦＲエクソン２０挿入Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧの結晶学により、残基７６４の後への挿入において第１世代ＴＫＩに対する耐性を誘導する安定化されかつ強固な活性立体構造が明らかにされている。一方で、ＥＧＦＲ Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡのモデリングは、残基７６４の前の挿入はこのような作用を示さず、薬物耐性を誘導しないことを示した（Ｙａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。さらに、ｃ－ヘリックスの後のループ中に挿入がある（ＥＧＦＲ Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ）、ＥＧＦＲエクソン２０誘発ＮＳＣＬＣの患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルでは、第３世代ＥＧＦＲ ＴＫＩ、オシメルチニブ（ＡＺＤ９２９１）およびロシレチニブ（ＣＯ－１６９６）は最小活性を有することが認められた（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。稀なＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０変異の最近の研究では、著者らは、ダコミチニブおよびアファチニブなどの共有結合型のキナゾリンベースの第２世代阻害剤に対する不均一な応答を見出したが；より多く見られるエクソン２０挿入変異を標的とするのに必要とされる濃度は、臨床で達成可能な濃度を上回っていた（Ｋｏｓａｋａ ｅｔ ａｌ，２０１７）。したがって、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２中にエクソン２０変異、特に挿入変異を保有するＮＳＣＬＣ腫瘍の自然薬物耐性（ｉｎｎａｔｅ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を克服する新たな治療を特定するという重大な臨床上のニーズが存在する。
概要
本開示の実施形態は、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２エクソン２０変異、例えばエクソン２０挿入変異を有する患者においてがんを治療するための方法および組成物を提供する。一実施形態では、対象においてがんを治療する方法であって、有効量のポジオチニブを対象に投与する工程を含み、対象が、１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異、例えば１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０挿入変異を有すると判定されている、方法が提供される。特定の態様では、対象はヒトである。
いくつかの態様では、ポジオチニブはポジオチニブ塩酸塩としてさらに定義される。ある特定の態様では、ポジオチニブ塩酸塩は錠剤として製剤化される。いくつかの態様では、１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異は、デノボＥＧＦＲ２０挿入変異としてさらに定義される。
ある特定の態様では、１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異は、アミノ酸７６３～７７８に１つ以上の点変異、挿入、および／または３～１８個のヌクレオチドの欠失を含む。いくつかの態様では、対象は、２つ、３つ、または４つのＥＧＦＲエクソン２０変異を有すると判定されている。いくつかの態様では、１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異は、Ａ７６３、Ａ７６７、Ｓ７６８、Ｖ７６９、Ｄ７７０、Ｎ７７１、Ｐ７７２、Ｈ７７３、Ｖ７７４、およびＲ７７６からなる群より選択される１つ以上の残基に存在する。
ある特定の態様では、対象は、残基Ｃ７９７および／またはＴ７９０にＥＧＦＲ変異、例えばＣ７９７Ｓおよび／またはＴ７９０Ｍを有さないと判定されている。いくつかの態様では、１つ以上のエクソン２０変異は、Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６３ｉｎｓＬＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｓ７６８Ｉ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＦＨ、Ｎ７７１ｄｕｐＮＰＨ、Ａ７６７ｉｎｓＴＬＡ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＶＶ、Ｖ７６９Ｌ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＳＶ、Ｖ７６９ｉｎｓ ＭＡＳＶＤ、Ｄ７７０ｄｅｌ ｉｎｓ ＧＹ、Ｄ７７０ｉｎｓＧ、Ｄ７７０ｉｎｓＹ Ｈ７７３Ｙ、Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤＮＲ、Ｎ７７１ｉｎｓＨＨ、Ｎ７７１ｄｕｐＮ、Ｐ７７２ｉｎｓＤＮＰ、Ｈ７７３ｉｎｓＡＨ、Ｈ７７３ｉｎｓＨ、Ｖ７７４Ｍ、Ｖ７７４ｉｎｓＨＶ、Ｒ７７６Ｈ、およびＲ７７６Ｃからなる群より選択される。特定の態様では、エクソン２０変異は、Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＦＨ、および／またはＮ７７１ｄｕｐＮＰＨである。
いくつかの態様では、対象は、以前に投与されたチロシンキナーゼ阻害剤に対して耐性を有するか、またはそれに対する耐性を示している。ある特定の態様では、チロシンキナーゼ阻害剤は、ラパチニブ、アファチニブ、ダコミチニブ、オシメルチニブ、イブルチニブ、ナザルチニブ、またはベラチニブ（ｂｅｒａｔｉｎｉｂ）である。
ある特定の態様では、ポジオチニブは経口的に投与される。いくつかの態様では、ポジオチニブは、５～２５ｍｇ、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２、２３、２４、または２５ｍｇの用量で投与される。ある特定の態様では、ポジオチニブは、８ｍｇ、１２ｍｇ、または１６ｍｇの用量で投与される。いくつかの態様では、ポジオチニブは毎日投与される。ある特定の態様では、ポジオチニブは継続的に投与される。いくつかの態様では、ポジオチニブは２８日サイクルで投与される。
ある特定の態様では、患者由来のゲノム試料を分析することにより対象がＥＧＦＲエクソン２０変異、例えば挿入変異を有すると判定された。いくつかの態様では、ゲノム試料は、唾液、血液、尿、正常組織、または腫瘍組織から単離される。特定の態様では、ＥＧＦＲエクソン２０変異の存在は、核酸配列決定（例えば、腫瘍組織のまたは血漿由来循環フリーＤＮＡのＤＮＡ配列決定）またはＰＣＲ分析によって判定される。
ある特定の態様では、方法は、さらなる抗がん療法を実施する工程をさらに含む。いくつかの態様では、抗がん療法は、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法、または免疫療法である。ある特定の態様では、ポジオチニブ投与および／または抗がん療法は、静脈内に、皮下に、骨内に、経口的に、経皮的に、持続型放出にて、制御型放出にて、遅延型放出にて、坐剤として、または舌下に、実施される。いくつかの態様では、ポジオチニブを投与することおよび／または抗がん療法を実施することは、局所的実施、局部的実施、または全身的実施を含む。特定の態様では、ポジオチニブ投与および／または抗がん療法は、２回以上、例えば、毎日、１日おきに、または毎週、実施される。
いくつかの態様では、がんは、口腔がん、中咽頭がん、上咽頭がん、呼吸器がん、泌尿生殖器がん、消化器がん、中枢神経系組織もしくは末梢神経系組織のがん、内分泌もしくは神経内分泌がんまたは造血系のがん、神経膠腫、肉腫、がん腫、リンパ腫、黒色腫、線維腫、髄膜腫、脳がん、中咽頭がん、上咽頭がん、腎臓がん、胆道がん、褐色細胞腫、膵島細胞がん、リー・フラウメニ腫瘍、甲状腺がん、副甲状腺がん、下垂体腫瘍、副腎腫瘍、骨肉腫、多発性神経内分泌腫瘍Ｉ型およびＩＩ型、乳がん、肺がん、頭頸部がん、前立腺がん、食道がん、気管がん、肝臓がん、膀胱がん、胃がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、精巣がん、結腸がん、直腸がん、または皮膚がんである。特定の態様では、がんは非小細胞肺がんである。
別の実施形態では、１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異、例えば１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０挿入変異を有すると判定された患者のための、ポジオチニブを含む薬学的組成物が提供される。ある特定の態様では、１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異は、アミノ酸７６３～７７８における、点変異、挿入、および／または３～１８個のヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の態様では、対象は、２つ、３つ、または４つのＥＧＦＲ２０変異を有すると判定されている。
いくつかの態様では、ポジオチニブはポジオチニブ塩酸塩としてさらに定義される。ある特定の態様では、ポジオチニブ塩酸塩は錠剤として製剤化される。いくつかの態様では、１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異はデノボＥＧＦＲ２０挿入変異としてさらに定義される。
いくつかの態様では、ポジオチニブは経口的に投与される。いくつかの態様では、ポジオチニブは、５～２５ｍｇ、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２、２３、２４、または２５ｍｇの用量で投与される。いくつかの態様では、ポジオチニブは、８ｍｇ、１２ｍｇ、または１６ｍｇの用量で投与される。ある特定の態様では、ポジオチニブは毎日投与される。いくつかの態様では、ポジオチニブは継続的に投与される。いくつかの態様では、ポジオチニブは２８日サイクルで投与される。
いくつかの態様では、対象は、以前に投与されたチロシンキナーゼ阻害剤に対して耐性を有するか、またはそれに対する耐性を示したことがある。ある特定の態様では、チロシンキナーゼ阻害剤は、ラパチニブ、アファチニブ、ダコミチニブ、オシメルチニブ、イブルチニブ、ナザルチニブ、またはベラチニブである。
いくつかの態様では、１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０挿入変異は、Ａ７６３、Ａ７６７、Ｓ７６８、Ｖ７６９、Ｄ７７０、Ｎ７７１、Ｐ７７２、およびＨ７７３からなる群より選択される１つ以上の残基に存在する。ある特定の態様では、対象は、残基Ｃ７９７および／またはＴ７９０にＥＧＦＲ変異、例えばＣ７９７Ｓおよび／またはＴ７９０Ｍを有さないと判定されている。特定の態様では、１つ以上のエクソン２０変異は、Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６３ｉｎｓＬＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｓ７６８Ｉ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＦＨ、Ｎ７７１ｄｕｐＮＰＨ、Ａ７６７ｉｎｓＴＬＡ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＶＶ、Ｖ７６９Ｌ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＳＶ、Ｖ７６９ｉｎｓ ＭＡＳＶＤ、Ｄ７７０ｄｅｌ ｉｎｓ ＧＹ、Ｄ７７０ｉｎｓＧ、Ｄ７７０ｉｎｓＹ Ｈ７７３Ｙ、Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤＮＲ、Ｎ７７１ｉｎｓＨＨ、Ｎ７７１ｄｕｐＮ、Ｐ７７２ｉｎｓＤＮＰ、Ｈ７７３ｉｎｓＡＨ、Ｈ７７３ｉｎｓＨ、Ｖ７７４Ｍ、Ｖ７７４ｉｎｓＨＶ、Ｒ７７６Ｈ、およびＲ７７６Ｃからなる群より選択される。いくつかの態様では、患者は抗がん療法によって治療中である。
さらに別の実施形態では、がんを有する対象におけるポジオチニブ単独または抗がん療法と組み合わせたポジオチニブに対する応答性を予測する方法であって、患者から得られたゲノム試料においてＥＧＦＲエクソン２０変異（例えば、ＥＧＦＲエクソン２０挿入変異）を検出する工程を含み、試料がＥＧＦＲエクソン２０変異の存在について陽性である場合に、患者が、ポジオチニブ単独または抗がん療法と組み合わせたポジオチニブに対して好ましい応答性を有すると予測される、方法が提供される。いくつかの態様では、ゲノム試料は、唾液、血液、尿、正常組織、または腫瘍組織から単離される。ある特定の態様では、ＥＧＦＲエクソン２０変異の存在は、核酸配列決定またはＰＣＲ分析によって判定される。ある特定の態様では、ＥＧＦＲエクソン２０変異は、アミノ酸７６３～７７８に１つ以上の点変異、挿入、および／または３～１８個のヌクレオチドの欠失を含む。いくつかの態様では、ＥＧＦＲエクソン２０変異は、残基Ａ７６３、Ｈ７７３、Ａ７６７、Ｓ７６８、Ｖ７６９、Ｄ７７０、Ｎ７７１、および／またはＤ７７３に存在する。いくつかの態様では、ＥＧＦＲエクソン２０変異は、Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＦＨ、およびＮ７７１ｄｕｐＮＰＨからなる群より選択される。
ある特定の態様では、ポジオチニブ阻害剤単独または抗がん療法と組み合わせたポジオチニブ阻害剤に対する好ましい応答性は、腫瘍の大きさもしくは腫瘍量の減少、腫瘍成長の阻止、腫瘍関連疼痛の軽減、がん関連病態の軽減、がん関連症状の軽減、がんの非進行、無病期間の延長、進行までの期間の延長、寛解の誘導、転移の減少、または患者の生存性の向上を含む。さらなる態様では、好ましい応答性を有すると予測された患者は、ポジオチニブを単独でまたは第２の抗がん療法と組み合わせて投与される。
いくつかの態様では、ポジオチニブはポジオチニブ塩酸塩としてさらに定義される。ある特定の態様では、ポジオチニブ塩酸塩は錠剤として製剤化される。いくつかの態様では、１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異はデノボＥＧＦＲ２０挿入変異としてさらに定義される。
いくつかの態様では、ポジオチニブは経口的に投与される。いくつかの態様では、ポジオチニブは、５～２５ｍｇ、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２、２３、２４、または２５ｍｇの用量で投与される。いくつかの態様では、ポジオチニブは、８ｍｇ、１２ｍｇ、または１６ｍｇの用量で投与される。ある特定の態様では、ポジオチニブは毎日投与される。いくつかの態様では、ポジオチニブは継続的に投与される。いくつかの態様では、ポジオチニブは２８日サイクルで投与される。
いくつかの態様では、対象は、以前に投与されたチロシンキナーゼ阻害剤に対して耐性を有するか、またはそれに対する耐性を示したことがある。ある特定の態様では、チロシンキナーゼ阻害剤は、ラパチニブ、アファチニブ、ダコミチニブ、オシメルチニブ、イブルチニブ、ナザルチニブ、またはベラチニブである。
さらなる実施形態は、患者においてがんを治療する方法であって、有効量のポジオチニブまたはアファチニブを対象に投与する工程を含み、対象が、Ａ７７５ｉｎｓＶ Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｖ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＶ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＣ、Ｐ７８０ｉｎｓＧＳＰ、Ｖ７７７Ｌ、Ｇ７７８ｉｎｓＬＰＳ、Ｖ７７３Ｍ、Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＬＣ、Ｇ７７８ｄｕｐＧＳＰ、Ｖ７７７ｉｎｓＣＧ、Ｇ７７６Ｖ／Ｓ、Ｖ７７７Ｍ、Ｍ７７４ｄｕｐＭ、Ａ７７５ｉｎｓＳＶＭＡ、Ａ７７５ｉｎｓＶＡ、およびＬ７８６Ｖからなる群より選択される１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異を有すると判定されている、方法を提供する。いくつかの態様では、１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異は、アミノ酸７７０～７８５に１つ以上の点変異、挿入、および／または３～１８個のヌクレオチドの欠失をさらに含む。いくつかの態様では、１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異は、残基Ｙ７７２、Ａ７７５、Ｍ７７４、Ｇ７７６、Ｇ７７８、Ｖ７７７、Ｓ７７９、Ｐ７８０、および／またはＬ７８６に存在する。いくつかの態様では、１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異は、Ａ７７５ｉｎｓＶ Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｖ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＶ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＣ、Ｐ７８０ｉｎｓＧＳＰ、Ｖ７７７Ｌ、Ｇ７７８ｉｎｓＬＰＳ、およびＶ７７３Ｍからなる群より選択される。いくつかの態様では、ＨＥＲ２エクソン２０変異は、残基Ｖ７７３、Ａ７７５、Ｇ７７６、Ｓ７７９、Ｇ７７８、および／またはＰ７８０に存在する。特定の態様では、対象はヒトである。
いくつかの態様では、ポジオチニブはポジオチニブ塩酸塩としてさらに定義される。ある特定の態様では、ポジオチニブ塩酸塩は錠剤として製剤化される。いくつかの態様では、１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異は、デノボＥＧＦＲ２０挿入変異としてさらに定義される。
いくつかの態様では、ポジオチニブは経口的に投与される。いくつかの態様では、ポジオチニブは、５～２５ｍｇ、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２、２３、２４、または２５ｍｇの用量で投与される。いくつかの態様では、ポジオチニブは、８ｍｇ、１２ｍｇ、または１６ｍｇの用量で投与される。ある特定の態様では、ポジオチニブは毎日投与される。いくつかの態様では、ポジオチニブは継続的に投与される。いくつかの態様では、ポジオチニブは２８日サイクルで投与される。
いくつかの態様では、対象は、以前に投与されたチロシンキナーゼ阻害剤に対して耐性を有するか、またはそれに対する耐性を示している。ある特定の態様では、チロシンキナーゼ阻害剤は、ラパチニブ、アファチニブ、ダコミチニブ、オシメルチニブ、イブルチニブ、ナザルチニブ、またはベラチニブである。
いくつかの態様では、方法は、ｍＴＯＲ阻害剤を投与する工程をさらに含む。ある特定の態様では、ｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、リダフォロリムス、またはＭＬＮ４９２４である。特定の態様では、ｍＴＯＲ阻害剤はエベロリムスである。
ある特定の態様では、ポジオチニブもしくはアファチニブおよび／またはｍＴＯＲ阻害剤は、静脈内に、皮下に、骨内に、経口的に、経皮的に、持続型放出にて、制御型放出にて、遅延型放出にて、坐剤として、または舌下に、投与される。いくつかの態様では、患者は、患者由来のゲノム試料を分析することにより、ＨＥＲ２エクソン２０変異を有すると判定された。ある特定の態様では、ゲノム試料は、唾液、血液、尿、正常組織、または腫瘍組織から単離される。いくつかの態様では、ＨＥＲ２エクソン２０変異の存在は、核酸配列決定またはＰＣＲ分析によって判定される。
追加の態様では、方法は、さらなる抗がん療法を実施する工程をさらに含む。いくつかの態様では、抗がん療法は、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法、または免疫療法である。
いくつかの態様では、がんは、口腔がん、中咽頭がん、上咽頭がん、呼吸器がん、泌尿生殖器がん、消化器がん、中枢神経系組織もしくは末梢神経系組織のがん、内分泌もしくは神経内分泌がんまたは造血系のがん、神経膠腫、肉腫、がん腫、リンパ腫、黒色腫、線維腫、髄膜腫、脳がん、中咽頭がん、上咽頭がん、腎臓がん、胆道がん、褐色細胞腫、膵島細胞がん、リー・フラウメニ腫瘍、甲状腺がん、副甲状腺がん、下垂体腫瘍、副腎腫瘍、骨肉腫、多発性神経内分泌腫瘍Ｉ型およびＩＩ型、乳がん、肺がん、頭頸部がん、前立腺がん、食道がん、気管がん、肝臓がん、膀胱がん、胃がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、精巣がん、結腸がん、直腸がん、または皮膚がんである。ある特定の態様では、がんは非小細胞肺がんである。
別の実施形態では、Ａ７７５ｉｎｓＶ Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｖ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＶ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＣ、Ｐ７８０ｉｎｓＧＳＰ、Ｖ７７７Ｌ、Ｇ７７８ｉｎｓＬＰＳ、Ｖ７７３Ｍ、Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＬＣ、Ｇ７７８ｄｕｐＧＳＰ、Ｖ７７７ｉｎｓＣＧ、Ｇ７７６Ｖ／Ｓ、Ｖ７７７Ｍ、Ｍ７７４ｄｕｐＭ、Ａ７７５ｉｎｓＳＶＭＡ、Ａ７７５ｉｎｓＶＡ、およびＬ７８６Ｖからなる群より選択される１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異を有すると判定された患者のための、ポジオチニブまたはアファチニブを含む薬学的組成物が提供される。いくつかの態様では、１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異は、アミノ酸７７０～７８５に１つ以上の点変異、挿入、および／または３～１８個のヌクレオチドの欠失をさらに含む。いくつかの態様では、１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異は、残基Ｙ７７２、Ａ７７５、Ｍ７７４、Ｇ７７６、Ｇ７７８、Ｖ７７７、Ｓ７７９、Ｐ７８０、および／またはＬ７８６に存在する。いくつかの態様では、１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異は、Ａ７７５ｉｎｓＶ Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｖ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＶ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＣ、Ｐ７８０ｉｎｓＧＳＰ、Ｖ７７７Ｌ、Ｇ７７８ｉｎｓＬＰＳ、およびＶ７７３Ｍからなる群より選択される。いくつかの態様では、ＨＥＲ２エクソン２０変異は、残基Ｖ７７３、Ａ７７５、Ｇ７７６、Ｓ７７９、Ｇ７７８、および／またはＰ７８０に存在する。いくつかの態様では、患者は抗がん療法によって治療中である。
いくつかの態様では、ポジオチニブはポジオチニブ塩酸塩としてさらに定義される。ある特定の態様では、ポジオチニブ塩酸塩は錠剤として製剤化される。いくつかの態様では、１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異は、デノボＥＧＦＲ２０挿入変異としてさらに定義される。
いくつかの態様では、ポジオチニブは、５～２５ｍｇ、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２、２３、２４、または２５ｍｇの用量で組成物中に含まれる。いくつかの態様では、ポジオチニブは、８ｍｇ、１２ｍｇ、または１６ｍｇの用量である。
いくつかの態様では、対象は、以前に投与されたチロシンキナーゼ阻害剤に対して耐性を有するか、またはそれに対する耐性を示している。ある特定の態様では、チロシンキナーゼ阻害剤は、ラパチニブ、アファチニブ、ダコミチニブ、オシメルチニブ、イブルチニブ、ナザルチニブ、またはベラチニブである。
さらに別の実施形態では、がんを有する患者においてポジオチニブ単独もしくはアファチニブ単独または抗がん療法と組み合わせたポジオチニブもしくはアファチニブに対する応答性を予測する方法であって、患者から得られたゲノム試料において、Ａ７７５ｉｎｓＶ Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｖ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＶ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＣ、Ｐ７８０ｉｎｓＧＳＰ、Ｖ７７７Ｌ、Ｇ７７８ｉｎｓＬＰＳ、Ｖ７７３Ｍ、Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＬＣ、Ｇ７７８ｄｕｐＧＳＰ、Ｖ７７７ｉｎｓＣＧ、Ｇ７７６Ｖ／Ｓ、Ｖ７７７Ｍ、Ｍ７７４ｄｕｐＭ、Ａ７７５ｉｎｓＳＶＭＡ、Ａ７７５ｉｎｓＶＡ、およびＬ７８６Ｖからなる群より選択されるＨＥＲ２エクソン２０変異（例えば、ＨＥＲ２エクソン２０挿入変異）を検出する工程を含み、試料がＨＥＲ２エクソン２０変異の存在について陽性である場合に、患者が、ポジオチニブ単独もしくはアファチニブ単独または抗がん療法と組み合わせたポジオチニブもしくはアファチニブに対して好ましい応答性を有すると予測される、方法が提供される。いくつかの態様では、１つ以上の変異は、Ａ７７５ｉｎｓＶ Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＣ、Ｐ７８０ｉｎｓＧＳＰ、Ｖ７７７Ｌ、Ｇ７７８ｉｎｓＬＰＳ、およびＶ７７３Ｍからなる群より選択される。いくつかの態様では、ＨＥＲ２エクソン２０変異は、アミノ酸７７０～７８５に１つ以上の点変異、挿入、および／または３～１８個のヌクレオチドの欠失をさらに含む。ある特定の態様では、ＨＥＲ２エクソン２０変異は、残基Ｖ７７３、Ａ７７５、Ｇ７７６、Ｖ７７７、Ｇ７７８、Ｓ７７９、および／またはＰ７８０に存在する。他の態様では、ＨＥＲ２エクソン２０変異は、残基Ａ７７５、Ｇ７７６、Ｓ７７９、および／またはＰ７８０に存在する。
いくつかの態様では、ゲノム試料は、唾液、血液、尿、正常組織、または腫瘍組織から単離される。ある特定の態様では、ＨＥＲ２エクソン２０変異の存在は、核酸配列決定またはＰＣＲ分析によって判定される。特定の態様では、抗がん療法はｍＴＯＲ阻害剤である。いくつかの態様では、ポジオチニブ阻害剤単独もしくはアファチニブ阻害剤単独または抗がん療法と組み合わせたポジオチニブ阻害剤もしくはアファチニブ阻害剤に対する好ましい応答性は、腫瘍の大きさもしくは腫瘍量の減少、腫瘍成長の阻止、腫瘍関連疼痛の軽減、がん関連病態の軽減、がん関連症状の軽減、がんの非進行、無病期間の延長、進行までの期間の延長、寛解の誘導、転移の減少、または患者の生存性の向上を含む。さらなる態様では、好ましい応答性を有すると予測された患者は、ポジオチニブを単独でまたは第２の抗がん療法と組み合わせて投与される。
本明細書では、ヒトがん細胞から単離された核酸；およびヒトＥＧＦＲまたはＨＥＲ２コード配列のエクソン２０の少なくとも第１の部分を増幅することができるプライマー対を含む組成物も提供される。いくつかの態様では、組成物は、ヒトＥＧＦＲまたはＨＥＲコード配列中に変異が存在する場合に該配列のエクソン２０の第１の部分に特異的にハイブリダイズすることができる、標識されたプローブ分子をさらに含む。ある特定の態様では、組成物は熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む。いくつかの態様では、組成物はｄＮＴＰＳをさらに含む。いくつかの態様では、標識されたプローブは、Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６３ｉｎｓＬＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｓ７６８Ｉ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＦＨ、Ｎ７７１ｄｕｐＮＰＨ、Ａ７６７ｉｎｓＴＬＡ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＶＶ、Ｖ７６９Ｌ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＳＶ、Ｖ７６９ｉｎｓ ＭＡＳＶＤ、Ｄ７７０ｄｅｌ ｉｎｓ ＧＹ、Ｄ７７０ｉｎｓＧ、Ｄ７７０ｉｎｓＹ Ｈ７７３Ｙ、Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤＮＲ、Ｎ７７１ｉｎｓＨＨ、Ｎ７７１ｄｕｐＮ、Ｐ７７２ｉｎｓＤＮＰ、Ｈ７７３ｉｎｓＡＨ、Ｈ７７３ｉｎｓＨ、Ｖ７７４Ｍ、Ｖ７７４ｉｎｓＨＶ、Ｒ７７６Ｈ、およびＲ７７６Ｃからなる群より選択される変異が存在する場合に、ヒトＥＧＦＲコード配列のエクソン２０の第１の部分にハイブリダイズする。
ある特定の態様では、標識されたプローブは、Ａ７７５ｉｎｓＶ Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｖ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＶ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＣ、およびＰ７８０ｉｎｓＧＳＰからなる群より選択される変異が存在する場合に、ヒトＨＥＲ２コード配列のエクソン２０の第１の部分にハイブリダイズする。
別の実施形態では、変異体ＥＧＦＲタンパク質をコードする単離された核酸であって、該変異体タンパク質が、アミノ酸７６３～７７８に点変異、挿入、および／または３～１８個のヌクレオチドの欠失を含む１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異だけ野生型ヒトＥＧＦＲと異なる、単離された核酸が提供される。いくつかの態様では、１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異は、Ａ７６３、Ａ７６７、Ｓ７６８、Ｖ７６９、Ｄ７７０、Ｎ７７１、Ｐ７７２、Ｈ７７３、Ｖ７７４、およびＲ７７６からなる群より選択される１つ以上の残基に存在する。ある特定の態様では、１つ以上のエクソン２０変異は、Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６３ｉｎｓＬＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｓ７６８Ｉ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＦＨ、Ｎ７７１ｄｕｐＮＰＨ、Ａ７６７ｉｎｓＴＬＡ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＶＶ、Ｖ７６９Ｌ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＳＶ、Ｖ７６９ｉｎｓ ＭＡＳＶＤ、Ｄ７７０ｄｅｌ ｉｎｓ ＧＹ、Ｄ７７０ｉｎｓＧ、Ｄ７７０ｉｎｓＹ Ｈ７７３Ｙ、Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤＮＲ、Ｎ７７１ｉｎｓＨＨ、Ｎ７７１ｄｕｐＮ、Ｐ７７２ｉｎｓＤＮＰ、Ｈ７７３ｉｎｓＡＨ、Ｈ７７３ｉｎｓＨ、Ｖ７７４Ｍ、Ｖ７７４ｉｎｓＨＶ、Ｒ７７６Ｈ、およびＲ７７６Ｃからなる群より選択される。特定の態様では、核酸はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、９、１０、１１、または１２の配列を含む。
さらに別の実施形態では、変異体ＨＥＲ２タンパク質をコードする単離された核酸であって、該変異体タンパク質が、アミノ酸７７０～７８５に１つ以上の点変異、挿入、および／または３～１８個のヌクレオチドの欠失を含む１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異だけ野生型ヒトＨＥＲ２と異なる、単離された核酸が提供される。いくつかの態様では、１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異は、残基Ｖ７７３、Ａ７７５、Ｇ７７６、Ｖ７７７、Ｇ７７８、Ｓ７７９、および／またはＰ７８０に存在する。ある特定の態様では、１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異は、Ａ７７５ｉｎｓＶ Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｖ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＶ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＣ、Ｐ７８０ｉｎｓＧＳＰ、Ｖ７７７Ｌ、Ｇ７７８ｉｎｓＬＰＳ、およびＶ７７３Ｍからなる群より選択される。特定の態様では、核酸はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、１５、１６、１７、または１８の配列を含む。
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるだろう。しかしながら、本明細書の詳細な説明から、本発明の精神および範囲の範囲内でのさまざまな変更および修飾が当業者には明らかとなることから、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものの、例示のみを目的としていることが理解されるべきである。
添付の図面は、本明細書の一部を形成するものであり、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書において提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つまたは複数を参照することによって、よりよく理解され得る。
図１Ａ～１Ｊ：エクソン２０挿入変異は、共有結合型および非共有結合型ＴＫＩに対してデノボ耐性を誘導する。（図１Ａ）古典的およびエクソン２０ＥＧＦＲ変異を有する患者の無増悪生存期間（ＰＦＳ）は、第一選択療法に対して抵抗性を示す。エクソン２０挿入を有する患者はパーセント生存率が低下している。（図１Ｂ）安定Ｂａ／Ｆ３モデルにおいて作製されたＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０挿入変異の概略図。第１世代、第２世代、および第３世代ＴＫＩで７２時間処理されたＥＧＦＲ（図１Ｃ～Ｅ）および（図１Ｆ～Ｈ）ＨＥＲ２エクソン２０挿入変異を発現するＢａ／Ｆ３細胞株の細胞生存率の用量反応曲線。（図１Ｃ～Ｈ）６つの細胞株の平均値±ＳＥＭを各濃度についてプロットする（ｎ＝３）。（図１Ｉ）ＥＧＦＲ Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧおよびＴ７９０Ｍの３－Ｄモデリング。Ｐ－ループおよびα－ｃ－ヘリックスの結合ポケット内へのシフトは、結合ポケットからＡＺＤ９２９１を押し出す立体障害をもたらす。（図１Ｊ）ＨＥＲ２ Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡおよびＷＴの３－Ｄモデリング。Ｐ－ループおよびα－ｃ－ヘリックスの結合ポケット内への全体的なシフトは、結合ポケットのサイズの全体的な低下をもたらす。 図２Ａ～２Ｇ：ポジオチニブは、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０挿入変異を強力に阻害する。ポジオチニブで７２時間処理したＥＧＦＲ（図２Ａ）およびＨＥＲ２（図２Ｂ）エクソン２０挿入変異を発現するＢａ／Ｆ３細胞株の細胞生存率の用量反応曲線。各個別の細胞株の平均値±ＳＥＭを各濃度についてプロットした（ｎ＝３）。（図２Ｃ）ウエスタンブロッティングは、ポジオチニブ処理の２時間後のＢａ／Ｆ３細胞株におけるｐ－ＥＧＦＲおよびｐ－ＨＥＲ２の阻害を確認する（ｎ＝２）。（図２Ｄ）Ｂａ／Ｆ３ ＥＧＦＲエクソン２０挿入位置のアミノ酸位置との相関性（ｎ＝２）。ピアソン相関係数およびｐ値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて決定した。（図２Ｅ）ポジオチニブまたはアファチニブで７２時間処理したＥＧＦＲ Ａ７６７ｄｕｐＡＳＶを発現する患者由来細胞株ＣＵＴＯ１４および（図２Ｆ）ＥＧＦＲ Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＦＨを発現するＹＵＬ００１９の細胞生存率の用量反応曲線（ｎ＝３）。（図２Ｆ）アファチニブ、オシメルチニブ、ロシレチニブ、またはポジオチニブとの７２時間のインキュベーション後のＢａ／Ｆ３ ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ細胞株のＩＣ５０値に対して正規化したＥＧＦＲ変異体Ｂａ／Ｆ３細胞のＩＣ５０値（ｎ＝３）。（図２Ｇ）バーは平均値±ＳＥＭを表す。１を超える値はＴ７９０Ｍと比較してより低い強度の阻害を表し、１未満の値は、Ｔ７９０Ｍと比較してエクソン２０挿入のより強い阻害を表す。 図３Ａ～３Ｈ：ポジオチニブは、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０挿入変異マウスモデルにおいて腫瘍量を低下させる。ＥＧＦＲ Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ（図３Ａ）またはＨＥＲ２ Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ（図３Ｂ）マウスを毎日、ビヒクル（ＥＧＦＲ ｎ＝５およびＨＥＲ２ ｎ＝４）、２０ｍｇ／ｋｇのアファチニブ（ＥＧＦＲ ｎ＝４）、または１０ｍｇ／ｋｇのポジオチニブ（ＥＧＦＲ ｎ＝５およびＨＥＲ２ ｎ＝６）で４週間処置した。ＭＲＩによって測定された腫瘍体積変化のウォーターフォールプロット（Ｗａｔｅｒｆａｌｌ ｐｌｏｔ）は、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２ ＧＥＭＭにおいて４週でポジオチニブによる８５％および６０％の腫瘍抑制をそれぞれ示す。（図３Ａ～Ｂ）両側スチューデントｔ－検定を用いてｐ値を計算した。４週間のポジオチニブ処置前および処置後のＥＧＦＲ（図３Ｃ）およびＨＥＲ２（図３Ｄ）ＧＥＭＭの代表的なＭＲＩ画像は、強い腫瘍退縮を示す。１０ｍｇ／ｋｇのポジオチニブ５日／週で１２週間処置したＥＧＦＲ Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ（図３Ｅ）（ｎ＝４）およびＨＥＲ２ Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ（図３Ｆ）（ｎ＝６）の腫瘍体積のプロットは、マウスがポジオチニブ処置に継続して反応することを示す。（図３Ｇ）アファチニブまたはポジオチニブで処置したＹＵＬ－００１９（ＥＧＦＲ Ｎ７７１ｄｅｌｉｎｓＦＨ）細胞。１０ｍｇ／ｋｇポジオチニブで処置した細胞は最も低い腫瘍体積を有し、５ｍｇ／ｋｇで処置した細胞は２番目に低い腫瘍体積を有した。（図３Ｈ）ＥＧＦＲ Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ ＰＤＸマウスを、ビヒクル対照（ｎ＝６）、５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝６）、または１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３）のポジオチニブで処置した。ポジオチニブで処置したマウスは腫瘍体積を低下させた。ウォーターフォールプロットは、腫瘍量が、全てのポジオチニブ処置マウスにおいて＞８５％減少し、９匹のポジオチニブ処置マウスのうち８匹では、異種移植片が残存塊（ｒｅｓｉｄｕａｌ ｂｏｌｕｓ）まで完全に縮小した。一元配置ＡＮＯＶＡ分析をＴｕｋｅｙ検定と組み合わせて用いて、統計学的有意性を判定した、＊＊＊、ｐ＜０．０００１。 図４Ａ～４Ｃ：ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０挿入変異は活性化変異である。（図４Ａ）ＥＧＦＲエクソン２０挿入を有する個々の患者のウォーターフォールプロットは、エルロチニブ、ゲフィチニブ、またはアファチニブに対するデノボ耐性を示す。患者の変異を各代表的なバーの下に列記する。（図４Ｂ）ＥＧＦＲエクソン２０挿入変異を発現する安定Ｂａ／Ｆ３細胞株は、空のベクターを発現するＢａ／Ｆ３細胞またはＥＧＦＲ ＷＴを発現するＢａ／Ｆ３細胞とは異なり、ＩＬ－３非依存性条件で生存可能であり、ＥＧＦＲエクソン２０挿入が活性化変異であることを示す。（図４Ｃ）異なるＨＥＲ２変異を発現する１１種類の安定Ｂａ／Ｆ３細胞株のＩＬ－３非依存性増殖は、ＨＥＲ２活性化変異の大多数がＨＥＲ２のエクソン２０内に存在することを示す。Ｌ７５５Ｐを除いて、全ての活性化変異はＨＥＲ２エクソン２０挿入変異であった。（図４Ｂ～Ｃ）細胞生存度をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイによって測定した。平均値±ＳＥＭを各細胞株についてプロットした（ｎ＝３）。 第１世代、第２世代、および第３世代ＴＫＩで７２時間処理したＥＧＦＲエクソン２０挿入変異を発現する個々のＢａ／Ｆ３細胞株の細胞生存率の用量反応曲線。平均値±ＳＥＭを各濃度についてプロットした（ｎ＝３）。 第１世代、第２世代、および第３世代ＴＫＩで７２時間処理したＨＥＲ２エクソン２０挿入変異を発現する個々のＢａ／Ｆ３細胞株の細胞生存率の用量反応曲線。平均値±ＳＥＭを各濃度についてプロットした（ｎ＝３）。 図７Ａ～７Ｄ：残基Ａ７６３後のＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０挿入変異は、第１世代および第３世代ＴＫＩに対して耐性を有する。ＥＧＦＲエクソン２０挿入を有するＢａ／Ｆ３細胞を１時間血清飢餓させ、次いで表示した用量の（図７Ａ）エルロチニブまたは（図７Ｃ）オシメルチニブで２時間処理した（Ｎ＝２）。（図７Ｂ）エルロチニブ処理および（図７Ｄ）オシメルチニブ処理後のｐ－ＥＧＦＲおよびｐ－ＨＥＲ２レベルを、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて定量化した。値をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍでプロットした、バーは平均値±ＳＥＭを表す。（Ｎ＝２）ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、またはｐ＜０．００１（＊＊＊）。 図８Ａ～８Ｅ：ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０挿入変異は、ポジオチニブに対してインビトロで感受性を有する。（図８Ａ）表示したＢａ／Ｆ３細胞株における２時間のポジオチニブ処理後のｐ－ＥＧＦＲおよびｐ－ＨＥＲ２のウエスタンブロットを、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて定量化した。値をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍでプロットした、バーは平均値±ＳＥＭを表す。（Ｎ＝２）（図８Ｂ）３時間の表示した用量のアファチニブまたはポジオチニブ後のＣＵＴＯ－１４患者由来細胞株のウエスタンブロット（Ｎ＝３）。（図８Ｃ）ＣＵＴＯ－１４細胞株における３時間の表示した用量のアファチニブまたはポジオチニブ後のウエスタンブロットからのｐ－ＥＧＦＲの定量化。ポジオチニブ処理は、減少したｐ－ＥＧＦＲをもたらした。（図８Ｄ）Ｂａ／Ｆ３細胞株の相対的発現に対するＩＣ５０値の線形回帰プロットは、発現とポジオチニブに対する感受性との間には相関性がなかったことを示した（ｎ＝２）。（図８Ｅ）ＨＥＲ２受容体内の変異の位置に対するＩＣ５０値の線形回帰プロットは、ＨＥＲ２変異体Ｂａ／Ｆ３細胞株において位置とポジオチニブに対する感受性との間には相関性がなかったことを示した（ｎ＝２）。ピアソン相関係数およびｐ値を、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍを用いて計算した。ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、またはｐ＜０．００１（＊＊＊）。 Ｃ７９７ＳおよびＥＭＴは、インビトロでのポジオチニブ耐性の２つの別個のメカニズムである。ポジオチニブで７２時間処理したＥＧＦＲ変異体Ｂａ／Ｆ３細胞株の細胞生存率の用量反応曲線。平均値±ＳＥＭを各濃度についてプロットした（ｎ＝３）。 表示したＴＫＩで処理したＭＣＦ１０Ａ ＨＥＲ２ Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＣ細胞株の細胞生存率の用量反応曲線。 ポジオチニブまたは表示したＴＫＩで７２時間処理したＥＧＦＲ変異体Ｂａ／Ｆ３細胞株の細胞生存率の用量反応曲線。 ポジオチニブまたは表示したＴＫＩで７２時間処理したＥＧＦＲ変異体Ｂａ／Ｆ３細胞株の細胞生存率の用量反応曲線。 ポジオチニブまたは表示したＴＫＩで７２時間処理した、耐性変異を含むＥＧＦＲ変異体Ｂａ／Ｆ３細胞株の細胞生存率の用量反応曲線。 ポジオチニブまたは表示したＴＫＩで７２時間処理した、耐性変異を含むＥＧＦＲ変異体Ｂａ／Ｆ３細胞株の細胞生存率の用量反応曲線。 ポジオチニブまたは表示したＴＫＩで７２時間処理したＨＥＲ２変異体Ｂａ／Ｆ３細胞株の細胞生存率の用量反応曲線。 図１３Ａ～１３Ｂ：ＨＥＲ２変異は、多種多様ながんの種類において生じ、受容体全体にわたって変異ホットスポットが生じる。がんごとのＨＥＲ２変異（Ａ）およびＨＥＲ２エクソン２０変異（Ｂ）の頻度の加重平均の棒グラフ。バーは加重平均±ＳＥＭを表す。ドットのサイズは、各データベースにおける患者の数を表す。Ｇｕａｒｄａｎｔ Ｈｅａｌｔｈによって報告されたｃｆＤＮＡにより検出されたＨＥＲ２変異の頻度は、Ｏｄｅｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ ２０１８において報告されるように臨床的感度について補正した。 図１４Ａ～１４Ｈ：ＨＥＲ２変異ホットスポットはがんの種類ごとに変化する。ｃＢｉｏｐｏｒｔａｌおよびＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎデータベースで報告された（Ａ）全てのがん（Ｎ＝２３３８）、（Ｂ）肺がん（Ｎ＝１７７）、（Ｃ）乳がん（Ｎ＝１４３）、および（Ｄ）結腸直腸がん（Ｎ＝２１９）でのＨＥＲ２変異位置の頻度の円グラフ。（Ｅ）ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌおよびＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎで報告された全てのがんで最も高い頻度でみられる１０種類のＨＥＲ２変異のロリポッププロット（Ｌｏｌｌｉｐｏｐ ｐｌｏｔ）（Ｎ＝２３３８ ＨＥＲ２変異）。バーの長さは変異の頻度と相関する。（Ｅ～Ｈ）ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌおよびＭＤ ＡｎｄｅｒｓｏｎデータベースにおけるＮＳＣＬＣ（Ｆ、Ｎ＝１７７）、乳がん（Ｇ、Ｎ＝１４３）、および結腸直腸がん（Ｈ、Ｎ＝２１９）で最も高い頻度でみられる１０種類のＨＥＲ２変異のロリポッププロット；バーの長さは、報告された変異の頻度と相関する。 図１５Ａ～１５Ｃ：チロシンキナーゼドメインで最も高い頻度でみられるＨＥＲ２バリアントは活性化変異である。ＩＬ－３を含まない条件下で１４日間増殖させた、ＨＥＲ２エクソン１９（Ａ）、ＨＥＲ２エクソン２０（Ｂ）、およびＨＥＲ２エクソン２１（Ｃ）変異を発現する安定Ｂａ／Ｆ３細胞株の細胞生存度。細胞生存度は、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイによって３日毎に測定された。平均値±ＳＥＭを各細胞についてプロットした（ｎ＝３、生物学的に独立した実験）。 図１６Ａ～１６Ｆ：ポジオチニブは、Ｂａ／Ｆ３細胞においてＨＥＲ２変異について試験した最も強力な阻害剤であった。（Ａ）薬物処理の７２時間後の表示した変異を安定的に発現するＢａ／Ｆ３細胞および薬物についての、ＧｒａｐｈＰａｄで計算したｌｏｇ ＩＣ５０値のヒートマップ。細胞生存度をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイによって測定した（Ｎ≧３）。アファチニブ，ネラチニブ、タルロキソチニブ（ｔａｒｌｏｘｏｔｉｎｉｂ）－ＴＫＩ、またはポジオチニブで７２時間の薬物処理後の、ＨＥＲ２変異を発現する全てのＢａ／Ｆ３細胞株（Ｂ）、ＨＥＲ２エクソン１９変異体細胞株（Ｃ）、ＨＥＲ２エクソン２０変異体細胞株（Ｄ）、またはＨＥＲ２エクソン２１変異体細胞株（Ｅ）についての平均ＩＣ５０値。バーは平均値±ＳＥＭ（Ｎ≧３）を表す。（Ｃ～Ｅ）Ｄｕｎｎの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡを用いて、群間の統計学的有意性を判定した。（Ｆ）表示した阻害剤によるＬ７５５ＳまたはＬ７５５Ｐを発現するＢａ／Ｆ３細胞の平均ＩＣ５０値。ドットは平均値±ＳＥＭ（Ｎ≧３）を表す。統計学的有意性を対応のあるｔ検定によって判定した。 図１７Ａ～１７Ｄ：ＨＥＲ２変異体の分子動力学シミュレーションは、Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡおよびＬ７５５Ｐ変異について薬物感受性が低下する推定メカニズムを示している。（Ａ）１５０ｎｓ加速分子動力学シミュレーション時のＨＥＲ２ Ｖ７７７ＬおよびＹ７７２ｄｕｐＹＶＭＡエクソン２０変異体についてのα－Ｃ－ヘリックス位置。（Ｂ）α－Ｃ－ヘリックスの「イン（ｉｎ）」の立体構造対「アウト（ｏｕｔ）」の立体構造でのＨＥＲ２エクソン２０変異体についての分子動力学スナップショットの部分分布。（Ｃ）Ｖ７７７ＬおよびＹ７７２ｄｕｐＹＶＭＡ変異体の分子動力学スナップショット。Ｐ－ループおよびキナーゼヒンジ立体構造においてわずかな差異が存在した一方で、α－Ｃ－ヘリックス位置では有意なシフトが存在した。（Ｄ）Ｌ７５５ＰおよびＬ７５５Ｓ ＨＥＲ２変異体の分子動力学スナップショット。Ｌ７５５Ｐ変異体は、Ｖ７９０による骨格水素結合を欠き、キナーゼヒンジの不安定化および結合部位に向けてのＰ－ループの収縮をもたらす。 図１８Ａ～１８Ｆ：ＨＥＲ２変異を発現するヒト細胞株もまた、ポジオチニブに対して最も高い感受性を有する。表示した阻害剤で７２時間処理した、エクソン２０挿入変異、ＨＥＲ２ Ｇ７７６ｄｅｌｉｎｓＶＣ（Ａ）、ＨＥＲ２ Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡ（Ｂ）、ＨＥＲ２ Ｇ７７８ｄｕｐＧＳＰ（Ｃ）を発現するＭＣＦ１０Ａ細胞の用量反応曲線。（Ｄ）ＭＣＦ１０Ａ ＨＥＲ２選択性インデックスの棒グラフ。変異体細胞株のＩＣ５０値を、各表示した薬物に対するＨＥＲ２ ＷＴ発現細胞株の平均ＩＣ５０値によって除算した。ドットは各細胞株の平均値±ＳＥＭを表し、バーは全３種類の細胞株の平均値±最小／最大（各細胞株ごとにＮ≧３）を表す。（Ｅ）表示した阻害剤で７２時間処理した、ＨＥＲ２エクソン１９変異Ｌ７５５Ｓを保有するＣＷ－２大腸細胞の用量反応曲線。（Ａ～Ｃ、Ｅ）曲線は中央値±ＳＥＭ、Ｎ＝３を表す。（Ｆ）２１日目でのＣＷ－２腫瘍体積の棒グラフ。マウスをビヒクル対照（Ｎ＝５）、３０ｍｇ／ｋｇネラチニブ（Ｎ＝５）、２０ｍｇ／ｋｇアファチニブ（Ｎ＝５）、または５ｍｇ／ｋｇポジオチニブ（Ｎ＝５）で５日／週で処置し、腫瘍を３５０ｍｍ３で無作為化し、点線によって表示した。ドットは個々の腫瘍を表し、バーは平均値±ＳＥＭを表す。統計学的有意性を一元配置ＡＮＯＶＡによって判定した。 図１９Ａ～１９Ｄ：ＨＥＲ２変異を有するＮＳＣＬＣ患者はポジオチニブに対して４２％の確定奏効率を有する。（Ａ）臨床試験ＮＣＴ０３０６６２０６での最初の１２名のＨＥＲ２エクソン２０患者の奏効のウォーターフォールプロット（Ｗａｔｅｒｆａｌｌ ｐｌｏｔ）。客観的部分奏効が示され（左から７、８、１０、１１、および１２番目のバー）、未確定の奏効が示され（９番目のバー）、安定が示され（３～６番目のバー）、かつ進行が示される（１～２番目のバー）。（Ｂ）最初の１２名のＨＥＲ２エクソン２０患者の無増悪生存期間のカプラン・マイヤープロットは、ｍＰＦＳが２０１８年１２月時点で５．６ヶ月であったことを示す。（Ｃ）ポジオチニブ処置の１日前および治療の８週後のＨＥＲ２ Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡ変異を有する患者のＣＴスキャン。（Ｄ）ポジオチニブ処置の１日前および４週後のＨＥＲ２ Ｌ７５５Ｐ変異体ＮＳＣＬＣを有する患者のＰＥＴスキャン。患者は、トラスツズマブ、ニボルマブ、および抗ＴＤＭ１との組み合わせでの白金ベースの化学療法で以前に処置されており、かつそれによって進行しているが、ポジオチニブ処置により標的病変において－１２％の減少を有した。 図２０Ａ～２０Ｇ：ポジオチニブ処置は細胞表面上でのＨＥＲ２の蓄積を誘導し、ポジオチニブとＴ－ＤＭ１処置との組み合わせは抗腫瘍活性を増強する。（Ａ）１０ｎＭポジオチニブ処置の２４時間後の、ＨＥＲ２ Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡ、ＨＥＲ２ Ｇ７７８ｄｕｐＧＳＰ、およびＨＥＲ２ Ｇ７７６ｄｅｌｉｎｓＶＣを発現するＭＣ１０Ａ細胞株上のＨＥＲ２受容体発現のＦＡＣＳ分析。バーは平均値±ＳＥＭを表し、有意差がＤＭＳＯ処置群とポジオチニブ処置群との間のスチューデントｔ－検定により判定された。（Ｂ）ポジオチニブ、Ｔ－ＤＭ１、またはポジオチニブと表示した用量のＴ－ＤＭ１で処置した、ＨＥＲ２ Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡ、ＨＥＲ２ Ｇ７７８ｄｕｐＧＳＰ、およびＨＥＲ２ Ｇ７７６ｄｅｌｉｎｓＶＣを発現するＭＣＦ１０Ａ細胞株のＩＣ５０値の棒グラフ。バーは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３、独立した実験）を表し、有意差が一元配置ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎの多重比較事後分析により判定された。（Ｃ）表示した阻害剤で処置したＨＥＲ２ Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡ ＮＳＣＬＣ ＰＤＸの腫瘍成長曲線。ポジオチニブ処置は１週間に５日実施され、Ｔ－ＤＭ１は処置の開始時に１回投与された。（Ｄ）ＰＦＳが最良効果からの腫瘍倍加として定義される、無増悪生存期間（ＰＦＳ）のカプラン・マイヤー曲線。マンテル・コックスのログランク検定を用いて、群間の有意差を判定した。マウスは安楽死の時点で打ち切られた。（Ｅ）１５日目での表示した阻害剤で処置したマウスの腫瘍体積のパーセント変化のドットプロット。（Ｆ）１５日目および４５日目での各群における担腫瘍マウスの数の図表。（Ｇ）表示した阻害剤で処置したＨＥＲ２ Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡマウスの腫瘍体積のスパイダープロット。赤色の点線は無作為化の点（３００ｍｍ３）を示す。 図２１Ａ～２１Ｄ：エクソン２０挿入変異の多様性は、Ｇｕａｒｄａｎｔ、ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌ、およびＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎのデータベースにおいてがんの種類ごとに異なる。（Ａ）全てのがんの種類、Ｎ＝５１７におけるＨＥＲ２エクソン２０挿入変異の頻度の円グラフ。エクソン２０挿入変異の頻度を、がんの種類ごとにさらに分析した：（Ｂ）肺がん、Ｎ＝３６２、（Ｃ）乳がん、Ｎ＝３０、および（Ｄ）その他のがん、Ｎ＝１２５。 図２２Ａ～２２Ｂ：よく見られるＨＥＲ２変異は恒常的にリン酸化されており、ｐ－ＨＥＲ２発現は薬物感受性と相関しない。（Ａ）相対的ｐ－ＨＥＲ２発現を、ＥＬＩＳＡにより決定された総ＨＥＲ２に対するｐ－ＨＥＲ２の比率を用いることによって測定した。バーは平均値±ＳＥＭ、およびｎ＝３を表す。ＮＤ＝検出限界未満。（Ｂ）相対的ＨＥＲ２の相関関係を、Ｂａ／Ｆ３ ＨＥＲ２変異体細胞株についてポジオチニブＩＣ５０値に対してプロットした。ピアソン相関係数およびｐ値をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｎ＝３）によって決定した。 図２３Ａ～２３Ｂ：分子モデリングにより、ＨＥＲ２変異体は結合ポケットサイズが異なることが明らかにされている。（Ａ）ＨＥＲ２キナーゼドメインエクソン１９、２０、および２１タンパク質骨格をそれぞれ、青色、ピンク色、およびオレンジ色に着色した。鋳型Ｘ線構造（ＰＤＢ ３ＰＰ０）由来のリガンドが緑色のバーで描かれ、ラベルが変異残基／挿入位置に与えられる。（Ｂ）加速分子動力学シミュレーションから得られたＨＥＲ２変異体についての結合ポケット体積のプロファイル。 ポジオチニブはＨＥＲ２変異体細胞株においてｐ－ＨＥＲ２を阻害する。表示した薬物および用量の処置の２時間後のＧ７７６ｄｅｌｉｎｓＶＣを発現するＭＣＦ１０Ａ細胞のウエスタンブロット。 ポジオチニブは、エクソン１９変異体結腸直腸がんの異種移植片における腫瘍成長を抑制する。ＨＥＲ２ Ｌ７５５Ｓ変異を保有するＣＷ－２細胞を、６週齢の雌のｎｕ／ｎｕヌードマウスの側腹部に注入した。腫瘍が３５０ｍｍ３に到達したときに、マウスを４群：２０ｍｇ／ｋｇアファチニブ、５ｍｇ／ｋｇポジオチニブ、３０ｍｇ／ｋｇネラチニブ、またはビヒクル対照に無作為化した。腫瘍体積を週に３回測定し、マウスは月曜日～金曜日（週に５日）に薬物を受けた。記号は各時点での平均値±ＳＥＭを表す。Ｔｕｋｅｙの多重比較検定による二元配置ＡＮＯＶＡを用いて、統計学的有意性を判定した。アスタリスクはビヒクルとポジオチニブまたはネラチニブとの間の有意性を示す。各比較でのＰ値は下段に列記され、有意差が最初に検出された１０日目から始めた。 ポジオチニブは、ＥＧＦＲ Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ ＰＤＸモデルにおいて、高用量オシメルチニブより効果的である。雌のＮＳＧマウス６～８週齢に、ＥＧＦＲ Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ変異を保有する患者ＮＳＣＬＣ腫瘍断片を移植し、腫瘍が３００ｍｍ３に到達したときに、マウスを以下の４群に無作為化した：ビヒクル対照、ポジオチニブ２．５ｍｇ／ｋｇ、オシメルチニブ５ｍｇ／ｋｇ、またはオシメルチニブ２５ｍｇ／ｋｇ。薬物を週に５日マウスに投与し、腫瘍体積を週に３回測定した。記号は各時点での平均値±ＳＥＭ腫瘍体積を表す。ドットプロットは、２１日目での平均腫瘍体積のパーセント変化を表し、各ドットは１匹のマウスを表す。 ポジオチニブは、Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡを保有するＮＳＣＬＣのＰＤＸモデルにおいてネラチニブより高い抗腫瘍活性を有する。雌のＮＳＧマウス６～８週齢に、ＨＥＲ２ Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡ変異を保有する患者ＮＳＣＬＣ腫瘍断片を移植し、腫瘍が３００ｍｍ３に到達したときに、マウスを以下の３群に無作為化した：ビヒクル対照、ポジオチニブ２．５ｍｇ／ｋｇ、またはネラチニブ３０ｍｇ／ｋｇ。薬物を週に５日マウスに投与し、腫瘍体積を週に３回測定した。記号は各時点での平均値±ＳＥＭ腫瘍体積を表す。ドットプロットは、２１日目での平均腫瘍体積のパーセント変化を表し、各ドットは１匹のマウスを表す。ＡＮＯＶＡを用いて、処置の最終時点での表示したバーに対するｐ値を決定した。 単剤ポジオチニブは、Ｖ７７７Ｌを保有する乳がんＰＤＸにおいてネラチニブより有効である。雌のＮＳＧマウス６～８週齢に、ＨＥＲ２ Ｖ７７７Ｌ変異を保有する患者乳がん腫瘍断片を移植し、腫瘍が３００ｍｍ３に到達したときに、マウスを以下の３群に無作為化した：ビヒクル対照、ポジオチニブ２．５ｍｇ／ｋｇ、またはネラチニブ３０ｍｇ／ｋｇ。薬物を週に５日マウスに投与し、腫瘍体積を週に３回測定した。記号は各時点での平均値±ＳＥＭ腫瘍体積を表す。ドットプロットは、３０日目での平均腫瘍体積のパーセント変化を表し、各ドットは１匹のマウスを表す。ＡＮＯＶＡを用いて、処置の最終時点での表示したバーに対するｐ値を決定した。 ポジオチニブは、種々のＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０変異体インビボモデルにおいて抗腫瘍活性を有する。ＰＤＸモデルでは、雌のＮＳＧマウス６～８週齢に、種々のＥＧＦＲまたはＨＥＲ２エクソン２０変異を保有する表示した腫瘍断片を移植し、腫瘍が３００ｍｍ３に到達したときに、マウスを以下の２群に無作為化した：ビヒクル対照またはポジオチニブ５ｍｇ／ｋｇ。薬物を週に５日マウスに投与し、腫瘍体積を週に３回測定した。バーは４週での平均腫瘍体積のパーセント変化を表し、各ドットは１匹のマウスを表す。ＧＥＭＭでは、腫瘍をドキシサイクリン食によって誘導し、ＭＲＩによる腫瘍立体構造によって、マウスをビヒクルまたはポジオチニブ１０ｍｇ／ｋｇで４週間毎日処置した。バーは４週での平均腫瘍体積のパーセント変化を表し、各ドットは１匹のマウスを表し、腫瘍体積はＭＲＩにより測定された。
例示的な実施形態の説明
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）変異体非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の活性化変異の大多数は、使用可能なＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）に対して感受性を有するが、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のエクソン２０に変化を有するサブセットは本質的に耐性を有する。本研究は、インシリコ、インビトロ、およびインビボ試験を用いて、これらのエクソン２０変異により誘導される構造変化をモデル化し、効果的な阻害剤を同定した。３－Ｄモデリングにより、薬物結合ポケットの大きさを制限し、大きく剛性の阻害剤の結合に制約を課す、重大な変化が明らかにされた。ポジオチニブは、その小さなサイズおよび柔軟性により、これらの立体的変化を回避することができ、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２エクソン２０変異体タンパク質の強力かつ相対的に選択的な阻害剤であることが見いだされた。ポジオチニブはまた、変異体エクソン２０ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２ ＮＳＣＬＣ患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルおよび遺伝子改変マウスモデルにおいて強力な活性を有する。したがって、これらのデータは、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２エクソン２０変異の強力で臨床的に活性のある阻害剤としてポジオチニブを同定し、これらの挿入により誘導された立体変化を回避し得るキナーゼ阻害剤の分子的特徴を解明する。
したがって、本開示のある特定の実施形態は、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２エクソン２０変異、例えばエクソン２０挿入を有するがん患者を治療するための方法を提供する。具体的には、本方法は、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲエクソン２０挿入変異を有すると同定された患者へのポジオチニブ（ＨＭ７８１－３６Ｂとしても知られる）またはアファチニブの投与を含む。ポジオチニブの大きさおよび柔軟性は、立体障害を克服し、低ナノモル濃度でＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０変異体を阻害する。したがって、ポジオチニブまたはアファチニブならびに構造的に類似する阻害剤は、不可逆的第２世代および第３世代ＴＫＩに対して耐性を有するＥＦＧＲおよびＨＥＲ２エクソン２０挿入の両方を標的とするために用いることができる、強力なＥＧＦＲまたはＨＥＲ２阻害剤である。
Ｉ．定義
本明細書において用いられるとき、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つまたは複数を含み得る。本明細書の請求項において用いられるとき、「含む」という語と併せて使用されるとき、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という語は、１つまたは複数を意味し得る。
本開示は代替物のみならびに「および／または」を指す定義を支持しているが、代替物のみを指すかまたは代替物が相互に排他的であると明確に示されていない限り、特許請求の範囲における用語「または」の使用は「および／または」を意味するために使用される。本明細書において用いられるとき、「別の」は、少なくとも第２のもの、またはそれ以上のものを意味し得る。
用語「約」は示された値±５％を意味する。
「治療」または「治療する」は、（１）疾患の病態もしくは総体症状を経験するもしくは示す対象もしくは患者において疾患を阻害すること（例えば、病態および／または総体症状のさらなる進行を阻止すること）、（２）疾患の病態もしくは総体症状を経験するもしくは示す対象もしくは患者において疾患を改善すること（例えば、病態および／または総体症状を後退させること）、および／または（３）疾患の病態もしくは総体症状を経験するもしくは示す対象もしくは患者において任意の測定可能な疾患の減少に作用すること、を含む。例えば、治療は、有効量のポジオチニブの投与を含み得る。
「予防的に処置する」は、（１）疾患の危険性を有し、かつ／または疾患に罹りやすい可能性があるが、まだ疾患の病態もしくは総体症状のいずれかもしくは全てを経験も示してもいない対象もしくは患者において疾患の発症の危険性を低減または緩和すること、および／または（２）疾患の危険性を有するか、および／または疾患に罹りやすい可能性があるが、まだ疾患の病態もしくは総体症状のいずれかもしくは全てを経験も示してもいない対象もしくは患者において、疾患の病態もしくは総体症状の開始を遅らせること、を含む。
本明細書において用いられるとき、用語「患者」または「対象」は、生存している哺乳類生物、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、またはそれらの遺伝子組み換え種を指す。特定の実施形態では、患者または対象は、霊長類である。ヒト患者の非限定的な例は、成人、未成年、幼児、および胎児である。
用語「有効な」は、この用語が本明細書および／または請求項で使用されるとき、所望の、期待された、または意図された結果を達成するために十分であることを意味する。化合物を用いて患者もしくは対象を治療するという文脈において使用されるとき、「有効量」、「治療有効量」、または「薬学的有効量」は、化合物の量が、疾患を治療もしくは予防するために対象もしくは患者に投与されたときに、疾患のかかる治療もしくは予防に作用するのに十分な量であることを意味する。
本明細書において用いられるとき、用語「ＩＣ５０」は、得られた最大応答の５０％である、阻害的用量を指す。この定量的測定は、特定の生物学的、生化学的、もしくは化学的プロセス（またはプロセスの構成要素、すなわち、酵素、細胞、細胞受容体、もしくは微生物）を半分阻害するのにどの程度の量の特定の薬物、または他の物質（阻害剤）が必要であるかを示す。
「抗がん」剤は、例えば、がん細胞の殺傷を促進し、がん細胞のアポトーシスを誘導し、がん細胞の増殖速度を低減し、転移の発生率もしくは数を低減し、腫瘍の大きさを縮小し、腫瘍の成長を阻害し、腫瘍もしくはがん細胞への血液供給を削減し、がん細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進し、がんの進行を予防もしくは阻害し、またはがんを有する対象の生存期間を延長することにより、対象におけるがん細胞／腫瘍に負の影響を与えることができる。
用語「挿入」または「挿入変異」は、ＤＮＡ配列への１個以上のヌクレオチド塩基対の付加を指す。例えば、ＥＧＦＲのエクソン２０の挿入変異は、アミノ酸７６７～７７４に約２～２１塩基対の挿入変異を生じ得る。別の例では、ＨＥＲ２エクソン２０挿入変異は、アミノ酸７７０～７８５に３～１８個のヌクレオチドの１つ以上の挿入を含む。例示的なＥＧＦＲおよびＨＥＲエクソン２０挿入変異を本開示の図１に図示する。
「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイゼーション」は、核酸同士の結合を指す。ハイブリダイゼーションの条件は、結合する核酸の配列相同性に応じて様々であり得る。よって、対象とする核酸間の配列相同性が高い場合、ストリンジェントな条件が用いられる。配列相同性が低い場合、中程度の条件が用いられる。ハイブリダイゼーション条件がストリンジェントである場合、ハイブリダイゼーション特異性は増大し、ハイブリダイゼーション特異性のこの増大は、非特異的ハイブリダイゼーション産物の産生を減少させる。しかしながら、中程度のハイブリダイゼーション条件下では、ハイブリダイゼーション特異性は低下し、ハイブリダイゼーション特異性のこの低下は、非特異的ハイブリダイゼーション産物の産生を増大させる。
「プローブ」は、少なくとも８個のヌクレオチドの長さを有し、かつプローブ中の少なくとも１つの配列と標的領域中の配列との相補性のために標的配列と共にハイブリッド構造を形成する、ポリヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡで構成され得る。プローブは、ある特定の実施形態では、検出可能に標識される。プローブの大きさは有意に異なり得る。一般的に、プローブの長さは、例えば、少なくとも８～１５個のヌクレオチドの長さである。他のプローブの長さは、例えば、少なくとも２０、３０、または４０ヌクレオチド長である。さらなる他のプローブの長さは、幾分かより長く、少なくとも、例えば、５０、６０、７０、８０、または９０ヌクレオチド長である。プローブはまた、前記範囲の範囲内にある任意の特定の長さのものであり得る。好ましくは、プローブは、ポリメラーゼ連鎖反応中に標的配列をプライミングするために用いられる配列に相補的な配列を含まない。
「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る、一本鎖または二本鎖デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す。
「修飾リボヌクレオチド」またはデオキシリボヌクレオチドは、核酸において天然塩基の代わりに使用することができる分子を指し、これらに限定されないが、修飾プリンおよびピリミジン、微量塩基、コンバーチブルヌクレオシド、プリンおよびピリミジンの構造的アナログ、標識された、誘導体化された、および修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチド、コンジュゲートされたヌクレオシドおよびヌクレオチド、配列修飾因子、末端修飾因子、スペーサー修飾因子、ならびに骨格修飾されたヌクレオチドを含み、これらに限定されないが、リボース修飾ヌクレオチド、ホスフォラミダート、ホスホロチオエート、ホスフォナミジト、メチルホスフォナート、メチルホスフォラミジト、メチルホスフォナミジト、５′－β－シアノエチルホスフォラミジト、メチレンホスフォナート、ホスフォロジチオエート、ペプチド核酸、光学不活性および中性ヌクレオチド間結合を含む。
「バリアント」は、それぞれ、１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の交換、欠失、または挿入によって、野生型または個々の集団において最も多くみられる形態と比較して異なる、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。交換、欠失、または挿入されるヌクレオチドまたはアミノ酸の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれより多い、例えば、２５、３０、３５、４０、４５、または５０個であり得る。
「プライマー」または「プライマー配列」は、核酸合成反応をプライミングするために標的核酸配列（例えば、増幅されるべきＤＮＡ鋳型）にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはキメラ配列であり得る。プライマーは、天然、合成、または修飾ヌクレオチドを含み得る。プライマーの長さの上限および下限はいずれも経験的に決定される。プライマーの長さの下限は、核酸増幅反応条件下での標的核酸とのハイブリダイゼーション時に安定な二本鎖を形成するのに必要とされる最低限の長さである。非常に短いプライマー（通常、３～４未満のヌクレオチド長）は、そのようなハイブリダイゼーション条件下で標的核酸と熱力学的に安定な二本鎖を形成しない。上限は、多くの場合、標的核酸中の予め決定された核酸配列以外の領域において二本鎖形成を有する可能性により決定される。一般的に、適切なプライマーの長さは、約１０～約４０ヌクレオチド長の範囲内である。ある特定の実施形態では、例えば、プライマーは、１０～４０、１５～３０、または１０～２０ヌクレオチド長であり得る。プライマーは、適切な条件下に置かれたときに、ポリヌクレオチド配列上の合成開始点として作用することができる。
「検出」、「検出可能な」、およびそれらの文法的等価物は、標的核酸配列の存在、および／または量、および／または相同性を決定する方法を指す。いくつかの実施形態では、検出は、標的核酸配列の増幅を生じる。他の実施形態では、標的核酸の配列決定は、標的核酸を「検出する」ことを特徴とすることができる。プローブに結合した標識は、例えば、化学的もしくは物理的手段により検出可能である、当技術分野において周知である多種多様な標識の任意のものを含み得る。プローブに結合させることが可能である標識は、例えば、蛍光および発光材料を含む。
「増幅する」、「増幅」、およびそれらの文法的等価物は、直線的もしくは指数関数的のいずれかで核酸配列を増幅するための広範な技法を含むがこれらに限定されない、鋳型依存的な様式で標的核酸配列の少なくとも一部を複製する任意の方法を指す。増幅工程を実施するための例示的な手段は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）、Ｑ－レプリカーゼ増幅が後に続くライゲーション、ＰＣＲ、プライマー伸長、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ハイパーブランチ鎖置換増幅、複数置換増幅（ＭＤＡ）、核酸鎖に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、２工程多重増幅、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、リコンビナーゼ－ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）（ＴｗｉｓｔＤｘ、Ｃａｍｂｒｉｄｇ、ＵＫ）、および自立配列複製（３ＳＲ）、ならびにそれらの多重バージョンまたは組み合わせ、例えば、ＯＬＡ／ＰＣＲ、ＰＣＲ／ＯＬＡ、ＬＤＲ／ＰＣＲ、ＰＣＲ／ＰＣＲ／ＬＤＲ、ＰＣＲ／ＬＤＲ、ＬＣＲ／ＰＣＲ、ＰＣＲ／ＬＣＲ（複合連鎖反応－ＣＣＲとしても知られる）を含むがこれらに限定されないもの、などを含む。かかる技法の説明は、他の場所、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）において見出され得る。
「ＥＧＦＲ」または「上皮増殖因子受容体」または「ＥＧＦＲ」は、チロシンキナーゼ細胞表面受容体を指し、かつＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５２２８．３、ＮＭ＿２０１２８２．１、ＮＭ＿２０１２８３．１、およびＮＭ＿２０１２８４．１として表される４種類の選択的転写産物の１つによってコードされる。ＥＧＦＲのバリアントには、エクソン２０における挿入が含まれる。
「ＨＥＲ２」または「ＥＲＢＢ２」は、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢファミリーのメンバーであり、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４４４８．２として表される。ＨＥＲ２のバリアントには、エクソン２０における挿入が含まれる。
一般的に本明細書にて使用されるとき、「薬学的に許容される」は、合理的な利益／リスクの比率を伴い、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴うことのない、健全な医学的判断の範疇において、ヒトおよび動物の組織、器官、および／または体液と接触させて使用するのに好適な化合物、材料、組成物、および／または投薬形態を指す。
「薬学的に許容される塩」は、上記のような薬学的に許容され、所望の薬理活性を有する、本発明の化合物の塩を意味する。かかる塩の非限定的な例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、およびリン酸などの無機酸を用いて形成された酸付加塩；または１，２－エタンジスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、３－フェニルプロピオン酸、４，４′－メチレンビス（３－ヒドロキシ－２－エン－１－カルボン酸）、４－メチルビシクロ［２．２．２］オクタ－２－エン－１－カルボン酸、酢酸、脂肪族モノ－およびジカルボン酸、脂肪族硫酸、芳香族硫酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファ－スルホン酸、炭酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクロペンタンプロピオン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、ヒドロキシナフトエ酸、乳酸、ラウリル硫酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムコン酸、ｏ－（４－ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、シュウ酸、ｐ－クロロベンゼンスルホン酸、フェニル－置換アルカン酸、プロピオン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、第３級ブチル酢酸、およびトリメチル酢酸などの有機酸を用いて形成された酸付加塩を含む。薬学的に許容される塩は、存在する酸性プロトンが無機または有機塩基と反応可能である場合に形成され得る塩基付加塩も含む。許容される無機塩基は、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アルミニウム、および水酸化カルシウムを含む。許容される有機塩基の非限定的な例は、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、およびＮ－メチルグルカミンを含む。本発明の任意の塩の一部を形成する特定のアニオンまたはカチオンは、その塩が全体として薬理学的に許容される限りは、危険ではない、ということが認識されるべきである。薬学的に許容される塩ならびにそれらの調製および使用方法のさらなる例は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ Ｕｓｅ（Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ＆Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ ｅｄｓ．、Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、２００２）において提供される。
ＩＩ．ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０変異
本開示の特定の実施形態は、対象が、１つ以上のＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２エクソン２０変異、例えば、挿入変異、特に図１に図示されている１つ以上の挿入変異を有するかどうかを判定することに関する。対象は、２つ、３つ、４つ、またはそれより多くのＥＧＦＲエクソン２０変異および／またはＨＥＲ２エクソン２０変異を有していてもよい。変異検出方法は、当技術分野において公知であり、ＰＣＲ分析および核酸配列決定ならびにＦＩＳＨおよびＣＧＨが含まれる。特定の態様では、エクソン２０変異は、例えば、腫瘍または血漿由来循環遊離ＤＮＡなどから、ＤＮＡ配列決定により検出される。
ＥＧＦＲエクソン２０変異は、アミノ酸７６３～７７８に１つ以上の点変異、挿入、および／または３～１８個のヌクレオチドの欠失を含み得る。１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異は、Ａ７６３、Ａ７６７、Ｓ７６８、Ｖ７６９、Ｄ７７０、Ｎ７７１、Ｐ７７２、Ｈ７７３、Ｖ７７４、およびＲ７７６からなる群より選択される１つ以上の残基に位置し得る。
ＥＧＦＲエクソン２０挿入には、Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＨ、Ａ７６７＿ｖ７６９ＡＳＶ、Ｎ７７１＿Ｐ７７２ｉｎｓＨ、Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＧ、Ｈ７７９＿Ｖ７７４ｉｎｓＨ、Ｎ７７１ｄｅｌｉｎｓＨＨ、Ｓ７６８＿Ｄ７７０ｄｕｐＤＶＤ、Ａ７６７＿Ｖ７６９ｄｕｐＡＳＶ、Ａ７６７＿Ｖ７６９ｄｕｐＡＳＶ、Ｐ７７２＿Ｈ７７３ｄｕｐ、Ｎ７７１＿Ｈ７７３ｄｕｐＮＰＨ、Ｓ７６８＿Ｄ７７０ｄｕｐＳＶＤ、Ｎ７７１ｄｅｌｉｎｓＧＹ、Ｓ７６８＿Ｄ７７０ｄｅｌｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０＿Ｄ７７０ｄｅｌｉｎｓＧＹ、Ａ７６７＿Ｖ７６９ｄｕｐＡＳＶ、Ｈ７７３ｄｕｐ、Ａ７６７ｉｎｓＴＬＡ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＶＶ、Ｖ７６９Ｌ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＳＶ、Ｖ７６９ｉｎｓ ＭＡＳＶＤ、Ｄ７７０ｄｅｌ ｉｎｓ ＧＹ、Ｄ７７０ｉｎｓＧ、Ｄ７７０ｉｎｓＹ Ｈ７７３Ｙ、Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤＮＲ、Ｎ７７１ｉｎｓＨＨ、Ｐ７７２ｉｎｓＤＮＰ、Ｈ７７３ｉｎｓＡＨ、Ｈ７７３ｉｎｓＨ、および／またはＶ７７４ｉｎｓＨＶが含まれ得る。特定の態様では、エクソン２０変異は、Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＦＨ、および／またはＮ７７１ｄｕｐＮＰＨである。
いくつかの態様では、対象は、ポジオチニブなどのＴＫＩに対して耐性をもたらし得る、ＥＧＦＲ残基Ｃ７９７での変異を有するか発生していてもよい。したがって、ある特定の態様では、対象は、ＥＧＦＲ Ｃ７９７および／またはＴ７９０に変異、例えばＣ７９７Ｓおよび／またはＴ７９０Ｍを有さないと判定される。いくつかの態様では、Ｔ７９０変異、例えばＴ７９０Ｍを有する対象はオシメルチニブを投与されてもよく、Ｃ７９７変異、例えばＣ７９７Ｓを有する対象は化学療法および／または放射線療法を実施されてもよい。
ＨＥＲ２エクソン２０変異は、アミノ酸７７０～７８５に１つ以上の点変異、挿入、および／または３～１８個のヌクレオチドの欠失を含んでもよい。１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異は、残基Ｙ７７２、Ａ７７５、Ｍ７７４、Ｇ７７６、Ｇ７７８、Ｖ７７７、Ｓ７７９、Ｐ７８０、および／またはＬ７８６に存在してもよい。１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異は、Ａ７７５ｉｎｓＶ Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｖ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＶ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＣ、Ｐ７８０ｉｎｓＧＳＰ、Ｖ７７７Ｌ、Ｇ７７８ｉｎｓＬＰＳ、Ｖ７７３Ｍ、Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＬＣ、Ｇ７７８ｄｕｐＧＳＰ、Ｖ７７７ｉｎｓＣＧ、Ｇ７７６Ｖ／Ｓ、Ｖ７７７Ｍ、Ｍ７７４ｄｕｐＭ、Ａ７７５ｉｎｓＳＶＭＡ、Ａ７７５ｉｎｓＶＡ、および／またはＬ７８６Ｖであってもよい。
患者試料は、対象における肺がんに由来する核酸を含む、任意の体の組織または液体であり得る。特定の実施形態では、試料は、循環腫瘍細胞または細胞フリーＤＮＡを含む血液試料である。他の実施形態では、試料は、組織、例えば、肺組織であり得る。肺組織は、腫瘍組織に由来することができ、新鮮凍結、またはホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）されてもよい。特定の実施形態では、肺腫瘍ＦＦＰＥ試料が得られる。
本明細書において記載される方法における使用に好適な試料には、遺伝子材料、例えば、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）が含まれる。ゲノムＤＮＡは典型的に、血液、または口腔粘膜の粘膜スクレーピングなどの生物試料から抽出されるが、尿、腫瘍、もしくは去痰薬を含む他の生物試料から抽出することもできる。試料それ自体は、典型的に、正常または腫瘍組織を含む、対象から取り出された有核細胞（例えば、血液もしくは頬側細胞）または組織を含む。試料を入手し、処理し、分析するための方法および試薬は、当技術分野において周知である。いくつかの実施形態では、試料は、医療機関の協力の下、例えば血液を採取することにより、得られる。いくつかの実施形態では、試料は、医療機関の協力を伴わずに得られ、例えば、試料は、頬側綿棒もしくはブラシを用いて得られる頬側細胞を含む試料、または口腔洗浄液試料のように、非侵襲的に得られる。
いくつかの場合において、生物試料は、ＤＮＡ単離のために処理することができる。例えば、細胞または組織試料中のＤＮＡは、試料の他の成分から分離することができる。細胞は、当技術分野において周知の技術を用いて、生物試料から回収することができる。例えば、細胞は、細胞試料を遠心分離し、ペレット化した細胞を再懸濁することにより、回収することができる。細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液中に再懸濁することができる。細胞懸濁液を遠心分離して、細胞ペレットを得た後、細胞を溶解して、ＤＮＡ、例えば、ｇＤＮＡを抽出することができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（２００３）を参照されたい。試料を濃縮および／または精製して、ＤＮＡを単離することができる。あらゆる種類のさらなる処理に供されるものを含む、対象から得られた全ての試料は、対象から得られたものと考えられる。例えば、フェノール抽出を含む、慣例的な方法を用いて、生物試料からゲノムＤＮＡを抽出することができる。あるいは、ゲノムＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）組織キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃａｌｉｆ．）、およびＷｉｚａｒｄ（登録商標）ゲノムＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）などのキットを用いて抽出することができる。試料の源の非限定的な例は、尿、血液、および組織を含む。
本明細書に記載されるようなＥＧＦＲまたはＨＥＲ２エクソン２０変異、例えばエクソン２０挿入変異の存在または不在は、当技術分野において周知の方法を用いて決定することができる。例えば、ゲル電気泳動、キャピラリ電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィ、配列決定、および／またはアレイを用いて、挿入変異の存在または不在を検出することができる。望ましい場合には、核酸の増幅は、当技術分野において周知の方法、例えば、ＰＣＲを用いて成し遂げることができる。一例において、試料（例えば、ゲノムＤＮＡを含む試料）は、対象から得られる。次いで、試料中のＤＮＡを試験して、本明細書に記載されるような挿入変異の特性を決定する。挿入変異は、本明細書に記載される任意の方法により、例えば、配列決定により、またはゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはｃＤＮＡ中の遺伝子の核酸プローブ、例えば、ＤＮＡプローブ（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドプローブを含む）もしくはＲＮＡプローブに対するハイブリダイゼーションにより、検出することができる。核酸プローブは、特定の変異体と特異的または優先的にハイブリダイズするように設計することができる。
プローブのセットは、典型的に、本開示の実施可能な推奨治療において用いられる標的遺伝子変異（例えば、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２エクソン２０変異）を検出するために用いられる、プライマーのセット（通常は、プライマー対）および／または検出可能に標識されたプローブを指す。プライマー対は、前記遺伝子のそれぞれについての標的遺伝子変異についての領域にわたるアンプリコンを定義するために、増幅反応において用いられる。アンプリコンのセットは、マッチしたプローブのセットにより検出される。例示的な実施形態では、本方法は、標的遺伝子変異のセット、例えばＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２エクソン２０変異を検出するために、ＴａｑＭａｎ（商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、Ｃａｌｉｆ．）アッセイを使用することができる。一実施形態では、プローブのセットは、次世代配列決定反応などの核酸配列決定反応により検出されるアンプリコンを産生するために用いられるプライマーのセットである。これらの実施形態では、例えば、ＡｍｐｌｉＳＥＱ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）またはＴｒｕＳＥＱ（商標）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）技術を用いることができる。
核酸マーカーの分析は、配列分析および電気泳動分析を含むがこれらに限定されない、当技術分野において周知の技術を用いて実施することができる。配列分析の非限定的な例は、Ｍａｘａｍ－Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定、Ｓａｎｇｅｒ配列決定、キャピラリアレイＤＮＡ配列決定、サーマルサイクル配列決定（Ｓｅａｒｓら、１９９２）、固相配列決定（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、１９９２）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ；Ｆｕら、１９９８）などの質量分析を伴う配列決定、ならびにハイブリダイゼーションによる配列決定（Ｃｈｅｅら、１９９６；Ｄｒｍａｎａｃら、１９９３；Ｄｒｍａｎａｃら、１９９８）を含む。電気泳動分析の非限定的な例は、スラブゲル電気泳動、例えば、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリ電気泳動、および変性勾配ゲル電気泳動を含む。さらに、次世代配列決定法は、ｔｈｅ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ ＰＧＭまたはＰｒｏｔｏｎ、ｔｈｅ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳＥＱまたはＭｉＳＥＱ、およびｔｈｅ Ｒｏｃｈｅ／４５４次世代配列決定システムなどの会社から商業的に入手可能なキットおよび装置を用いて実施することができる。
核酸分析の他の方法は、直接手動配列決定（ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ、１９８８；Ｓａｎｇｅｒら、１９７７；米国特許第５，２８８，６４４号）；自動化蛍光配列決定；一本鎖形態多型アッセイ（ＳＳＣＰ）（Ｓｃｈａｆｅｒら、１９９５）；クランプ変性ゲル電気泳動（ＣＤＧＥ）；二次元ゲル電気泳動（２ＤＧＥもしくはＴＤＧＥ）；形態感受性ゲル電気泳動（ＣＳＧＥ）；変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら、１９８９）；変性高速液体クロマトグラフィ（ＤＨＰＬＣ、Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌら、１９９７）赤外線マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＩＲ－ＭＡＬＤＩ）質量分析（ＷＯ９９／５７３１８）；移動度シフト分析（Ｏｒｉｔａら、１９８９）；制限酵素分析（Ｆｌａｖｅｌｌら、１９７８；Ｇｅｅｖｅｒら、１９８１）；定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｒａｃａら、２００４）；ヘテロ二本鎖分析；化学的ミスマッチ分解（ＣＭＣ）（Ｃｏｔｔｏｎら、１９８５）；ＲＮａｓｅ保護アッセイ（Ｍｙｅｒｓら、１９８５）；ヌクレオチドミスマッチを認識するポリペプチド、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ｍｕｔＳタンパク質の使用；アレル特異的ＰＣＲ、ならびにかかる方法の組み合わせを含み得る。例えば、米国特許出願公開第２００４／００１４０９５号を参照されたい。この特許は、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
一例において、試料におけるＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２変異を同定する方法は、かかる試料に由来する核酸を、変異したＥＧＦＲまたはＨＥＲ２タンパク質をコードする核酸、または変異を含むその断片に特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブと接触させること、およびそのハイブリダイゼーションを検出すること、を含む。特定の一実施形態では、かかるプローブは、例えば、放射性同位体（３Ｈ、３２Ｐ、もしくは３３Ｐ）、蛍光剤（ローダミン、もしくはフルオレセイン）、または発色剤を用いて、検出可能に標識される。特定の一実施形態では、プローブは、アンチセンスオリゴマー、例えば、ＰＮＡ、モルフォリノ－ホスフォラミダート、ＬＮＡ、または２′－アルコキシアルコキシである。プローブは、約８個のヌクレオチド～約１００個のヌクレオチド、または約１０～約７５個、または約１５～約５０個、または約２０～約３０個であり得る。別の態様では、本開示のかかるプローブは、試料におけるＥＧＦＲまたはＨＥＲ２変異を同定するためのキット中で提供され、かかるキットは、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２遺伝子における変異部位に特異的にハイブリダイズするか、またはそれらに隣接するオリゴヌクレオチドを含む。キットはさらに、キットを用いるハイブリダイゼーション試験の結果に基づいてポジオチニブまたはアファチニブを用いてＥＧＦＲまたはＨＥＲ２挿入変異を含む腫瘍を有する患者を治療するための指示を含む。
別の態様では、試料におけるエクソン２０変異を検出するための方法は、かかるＥＧＦＲ遺伝子またはＨＥＲ２のエクソン２０に対応するかかる核酸試料または変異を含むと考えられるその断片を増幅すること、および増幅した核酸の電気泳動移動度を、対応する野生型ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２遺伝子またはその断片の電気泳動移動度と比較すること、を含む。移動度における差異は、増幅した核酸配列における変異の存在を示す。電気泳動の移動度は、ポリアクリルアミドゲル上で測定できる。
あるいは、核酸は、酵素的変異検出（ＥＭＤ）（Ｄｅｌ Ｔｉｔｏら、１９９８）を用いて変異の検出について分析することができる。ＥＭＤは、点変異、挿入、および欠失に起因する塩基対ミスマッチにより引き起こされる構造ひずみを検出および分解するまで、二本鎖ＤＮＡに沿ってスキャンする、バクテリオファージリゾルバーゼＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩを使用する。リゾルバーゼ分解により、例えば、ゲル電気泳動により形成される２つの短い断片の検出は、変異の存在を示す。ＥＭＤ方法の利点は、ＰＣＲ反応から直接アッセイされ、試料精製の必要性を排除し、ハイブリダイゼーション時間を短縮し、シグナル対ノイズ比を増大させる、点変異、欠失、および挿入を同定するための単一のプロトコールである。通常のＤＮＡの最大２０倍の発現と最大４ｋｂの大きさの断片とを含む混合した試料をアッセイすることができる。しかし、ＥＭＤスキャニングは、変異陽性試料中に生じる特定の塩基変化を同定せず、必要な場合には、変異を同定するためにさらなる配列決定手順が必要となる。米国特許第５，８６９，２４５号において実証されているように、ＣＥＬ Ｉ酵素をリゾルバーゼＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩと同様に使用することができる。
ＩＩＩ．治療方法
本明細書では、個体におけるがんの進行を治療するまたは遅延させるための方法であって、有効量のポジオチニブ、アファチニブ、または構造的に同様の阻害剤を、その個体に、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２エクソン２０変異、例えばエクソン２０挿入を有すると判定された対象に投与する工程を含む、方法がさらに提供される。対象は、１つ以上のＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲエクソン２０変異を有し得る。
治療のために企図されるがんの例には、肺がん、頭頸部がん、乳がん、膵臓がん、前立腺がん、腎臓がん、骨がん、精巣がん、子宮頸がん、消化器がん、リンパ腫、肺の前腫瘍性病変、結腸がん、黒色腫、および膀胱がんが含まれる。特定の態様では、がんは、非小細胞肺がんである。
いくつかの実施形態では、対象は、哺乳類、例えば、霊長類、好ましくは、高等霊長類、例えば、ヒト（例えば、本明細書に記載された障害を有するか、またはそれらの障害を有する危険性のある患者）である。一実施形態では、対象は、免疫応答を強化する必要がある。特定の実施形態では、対象は、易感染性であるか、その危険性がある。例えば、対象は、化学療法的治療および／または放射線療法を受けているか、または受けたことがある。あるいは、または組み合わせて、対象は、感染の結果として、易感染性であるか、またはその危険性がある。
ある特定の実施形態は、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２エクソン２０変異、例えばエクソン２０挿入を有すると判定された対象へのポジオチニブ（ＨＭ７８１－３６Ｂ、ＨＭ７８１－３６、および１－［４－［４－（３，４－ジクロロ－２－フルオロアニリノ）－７－メトキシキナゾリン－６－イル］オキシピペリジン－１－イル］プロップ－２－エン－１－オンとしても知られている）の投与に関する。ポジオチニブは、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ４を含むチロシンキナーゼ受容体のＨＥＲファミリーを介するシグナル伝達を不可逆的に阻止する、キナゾリン系ｐａｎ－ＨＥＲ阻害剤である。ポジオチニブまたは構造的に類似する化合物（例えば、米国特許第８，１８８，１０２号および米国特許出願公開第２０１３／００７１４５２号；参照により本明細書に組み入れられる）が、本発明の方法において用いられてもよい。
ポジオチニブ、ポジオチニブ塩酸塩は、例えば錠剤で、経口的に投与されてもよい。ポジオチニブは、４～２５ｍｇの用量で、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４ｍｇの用量で投与されてもよい。投与は、毎日、１日おき、３日毎、または週に１回であってもよい。投与は、継続的なスケジュールで、例えば２８日サイクルであってもよい。
いくつかの態様では、Ｔ７９０変異、例えばＴ７９０Ｍを有する対象は、オシメルチニブを投与され得る、Ｃ７９７変異、例えばＣ７９７Ｓを有する対象は、本明細書において記載されるような化学療法および／または放射線療法を実施され得る。オシメルチニブ投与、化学療法、および／または放射線投与は、単独でまたはポジオチニブと組み合わせて実施され得る。オシメルチニブは、２５から１００ｍｇ、例えば、約４０または８０ｍｇの用量で投与され得る。投与は、毎日、１日おき、２日毎、３日毎、または週に１回であってもよい。オシメルチニブは、例えば錠剤で、経口的に投与され得る。
アファチニブは、１０～５０ｍｇ、例えば、１０、２０、３０、４０、または５０ｍｇの用量で投与され得る。アファチニブは投与され得る。
Ｂ．薬学的組成物
本明細書では、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２エクソン２０変異、例えばエクソン２０変異を有すると判定された対象のための、ポジオチニブまたはアファチニブと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物および製剤も提供される。
本明細書に記載される薬学的組成物および製剤は、所望の程度の純度を有する活性成分（例えば、抗体またはポリペプチド）を、凍結乾燥製剤または水溶液の形態の１つ以上の任意の薬学的に許容される担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、２０１２）と混合することにより、調製することができる。薬学的に許容される担体は、一般的に、使用される用量および濃度において受容者に対して非毒性であり、緩衝液、例えば、ホスフェート、シトレート、および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤、例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、亜鉛－タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むが、これらに限定されない。本明細書では、例示的な薬学的に許容される担体は、介在性（ｉｎｓｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ）薬剤分散剤、例えば、可溶性中性－活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．）をさらに含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある例示的なｓＨＡＳＥＧＰおよび使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号および同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、１つ以上のさらなるグルコサミノグリカナーゼ、例えば、コンドロイチナーゼと組み合わされる。
Ｃ．併用療法
特定の実施形態では、本実施形態の組成物および方法は、少なくとも１つのさらなる治療法と組み合わせたポジオチニブまたはアファチニブを含む。さらなる治療法は、放射線療法、手術（例えば、乳腺腫瘍摘出術および***切除術）、化学療法、遺伝子療法、ＤＮＡ療法、ウイルス療法、ＲＮＡ療法、免疫療法、骨髄移植、ナノセラピー、モノクローナル抗体療法、または前記の組み合わせであり得る。さらなる治療法は、アジュバントまたはネオアジュバント療法の形態であり得る。
いくつかの実施形態では、さらなる治療法は、小分子酵素阻害剤または転移抑制剤の投与である。いくつかの実施形態では、さらなる治療法は、副作用を減じた薬剤（例えば、治療の副作用の発生および／または重篤度を減少させることを意図した薬剤、例えば、制吐剤など）の投与である。いくつかの実施形態では、さらなる治療法は、放射線療法である。いくつかの実施形態では、さらなる治療法は、手術である。いくつかの実施形態では、さらなる治療法は、放射線療法と手術との組み合わせである。いくつかの実施形態では、さらなる治療法は、ガンマ照射である。いくつかの実施形態では、さらなる治療法は、ＰＢＫ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を標的とする治療法、ＨＳＰ９０阻害剤、チューブリン阻害剤、アポトーシス阻害剤、および／または化学予防剤である。さらなる治療法は、当技術分野において周知の１つ以上の化学療法剤であり得る。
ポジオチニブまたはアファチニブは、免疫チェックポイント療法などのさらなるがん治療法の前、その間、その後、またはそれらと種々に組み合わせて、投与され得る。投与は、同時投与から、数分間隔、数日間隔、数週間隔までの範囲であり得る。ポジオチニブまたはアファチニブがさらなる治療剤とは別々に患者に提供される実施形態では、２つの化合物が患者に対してなお有利な併用効果を与えることができるように、一般的に、各送達時間の間に有意期間が終了しないことを確実にする。かかる場合において、互いの約１２～２４または７２時間以内に、より特定的には、互いの約６～１２時間以内に、患者に抗体療法および抗がん療法を提供してもよいことが企図される。いくつかの状況において、それぞれの投与の間に数日間（２、３、４、５、６、または７日間）から数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８週間）の間隔をもたせ、治療のための期間を有意に延長することが望ましいこともある。
様々な組み合わせが用いられ得る。以下の例において、ポジオチニブまたはアファチニブは「Ａ」であり、抗がん療法は「Ｂ」である。
Figure 2022527788000002
患者に対する本実施形態の任意の化合物の投与または治療法の実施は、存在する場合には薬剤の毒性を考慮に入れて、かかる化合物の投与のための一般的なプロトコールに従う。したがって、いくつかの実施形態では、組み合わせ療法に起因する毒性をモニタリングする工程がある。
１．化学療法
本実施形態に従って、多様な化学療法剤を使用することができる。用語「化学療法」は、がんを治療するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、がんの治療において投与される化合物または組成物を示すために使用される。これらの薬剤または薬物は、細胞内のそれらの活性モード、例えば、それらが細胞周期に影響するかどうか、およびそれらが細胞周期のどの段階に影響するか、により分類される。あるいは、薬剤は、そのＤＮＡに直接架橋する能力、ＤＮＡ中に介入する能力、または核酸合成に作用することにより染色体および有糸***異常を誘導するための能力に基づいて特徴付けられてもよい。
化学療法剤の例には、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド：スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスフォラミド、トリエチレンチオホスフォラミド、およびトリメチロロメラミンを含む、エチレンイミンおよびメチラメラミン；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成アナログトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カチスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアゾゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成アナログを含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ－２１８９およびＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、およびウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムヌスチン；抗生剤、例えば、エンジイン抗生剤（例えば、カリチアマイシン、特に、カリチアマイシンガンマｌＩおよびカリチアマイシンオメガＩ１）；ダイネマイシンＡを含む、ダイネマイシン；ビスホスホネート、例えば、クロドロネート；エスペラマイシン；ならびにネオカルチノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生剤発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン（ａｕｔｈｒａｒｎｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（モルフォリノ－ドキソルビシン、シアノモルフォリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｒｎｙｃｉｎ）、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、およびゾルビシン；抗代謝物質、例えば、メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、プテロプテリン、およびトリメトレキサート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、およびチオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモファー、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフフリジン、エノシタビン、およびフロックスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオナート、エピチオスタノール、メピチオスタン、およびテストラクトン；抗副腎、例えば、ミトタンおよびトリロスタン；葉酸補充物質、例えば、フォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルミチン；エリプチニウムアセテート；エポチロン；エトグルシッド；ガリウムニトレート；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニンメイタンシノイド、例えば、メイタンシンおよびアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサトロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシンン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ－２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；プラチナ配位錯体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン；ビンブラスチン；プラチナ；エトプシド（ＶＰ－１６）；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼロダ；イバンドロナート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ－１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン、ゲムシタビエン、ナベルビン、ファネシル－タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナ、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含まれる。
２．放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし、かつ幅広く用いられている他の因子は、γ線、Ｘ線として知られているもの、および／または腫瘍細胞に対する放射性同位体の指向性送達を含む。ＤＮＡ損傷因子の他の形態も企図され、例えば、電子レンジ、陽子ビーム照射（米国特許第５，７６０，３９５号および同第４，８７０，２８７号）、ならびにＵＶ照射が挙げられる。これらの因子の全ては、ＤＮＡに対して、ＤＮＡの前駆体に対して、ＤＮＡの複製および修復に対して、ならびに染色体の集合および維持に対して、広範囲の損傷に影響を与える可能性が高い。Ｘ線についての線量範囲は、長期間（３～４週間）についての５０～２００レントゲンの１日線量から、２０００～６０００レントゲンの単一線量までの範囲にわたる。放射性同位体についての線量範囲は、広く異なり、同位体の半減期、放出された放射線の強度および種類、ならびに新生物細胞による取込みに依存する。
３．免疫療法
当業者は、さらなる免疫療法が、本実施形態の方法と組み合わせてまたは連動させて用いられ得ることを理解するだろう。がん治療の文脈において、免疫療法は、一般的に、がん細胞を標的とし、それを破壊するために、免疫エフェクター細胞および分子の使用に依存する。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））は、その一例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上にあるいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体単独を治療法のエフェクターとして使用することもでき、または、抗体が、細胞殺傷に実際に作用する他の細胞を動員してもよい。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）にコンジュゲートされ、分子標的剤として機能することができる。あるいは、エフェクターは、直接的または間接的に腫瘍細胞標的と相互作用する表面分子を有するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む。
抗体－薬物コンジュゲートは、がん治療の開発において画期的なアプローチとして出現した。がんは、世界中において、主な死因の一つである。抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、細胞を殺傷する薬物に共有結合したモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を含む。このアプローチは、Ｍａｂのそれらの抗原標的に対する高い特異性と、高度に強力な細胞傷害性薬物とを組み合わせており、ペイロード（薬物）を豊富なレベルの抗原と共に腫瘍細胞に送達する「武装した」ＭＡｂｓをもたらす。薬物の標的指向性送達はまた、正常組織中への薬物の曝露を最小限にし、毒性の軽減および治療指標の改善をもたらす。２つのＡＤＣ薬物の認可、ＦＤＡにより２０１１年に認可されたＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン）および２０１３年に認可されたＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）（トラスツズマブエムタンシンまたはＴ－ＤＭ１）は、このアプローチを確証している。現在、３０種類を超えるＡＤＣ薬物候補が、がん治療のための臨床試験の様々な段階にある（Ｌｅａｌら、２０１４）。抗体エンジニアリングおよびリンカー－ペイロード最適化が、益々成熟しているために、新規ＡＤＣの創薬および開発は、このアプローチと標的指向性ＭＡｂの生成とに好適な新規標的の同定および検証に大いに依存する。ＡＤＣの標的についての２つの基準は、腫瘍細胞および頑強な内部移行における、上方制御された／高レベルの発現である。
免疫療法の一態様では、腫瘍細胞は、標的指向化に適している（すなわち、他の細胞の大部分において存在しない）いくつかのマーカーを有する必要がある。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれもが、本実施形態の文脈における標的指向化に好適であり得る。一般的な腫瘍マーカーは、ＣＤ２０、がん胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ－７２、ＨＭＦＧ、Ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓ抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂ Ｂ、およびｐ１５５を含む。免疫療法の代替的な一態様は、抗がん効果と免疫刺激効果とを組み合わせることである。サイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、ガンマ－ＩＦＮ、ケモカイン、例えば、ＭＩＰ－１、ＭＣＰ－１、ＩＬ－８、および増殖因子、例えば、ＦＬＴ３リガンドを含む、免疫刺激分子も存在する。
免疫療法の例には、免疫アジュバント、例えば、マイコバクテリウムボビス、熱帯熱マラリア原虫、ジニトロクロロベンゼン、および芳香族化合物（米国特許第５，８０１，００５号および同第５，７３９，１６９号；ＨｕｉおよびＨａｓｈｉｍｏｔｏ、１９９８；Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓら、１９９８）；サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、β、およびγ、ＩＬ－１、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＴＮＦ（Ｂｕｋｏｗｓｋｉら、１９９８；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、１９９８；Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄら、１９９８）；遺伝子療法、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、およびｐ５３（Ｑｉｎら、１９９８；Ａｕｓｔｉｎ－ＷａｒｄおよびＶｉｌｌａｓｅｃａ、１９９８；米国特許第５，８３０，８８０号および同第５，８４６，９４５号）；ならびにモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２、および抗ｐ１８５（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ、２０１２；Ｈａｎｉｂｕｃｈｉら、１９９８；米国特許第５，８２４，３１１号）が含まれる。１つ以上の抗がん療法が本明細書に記載の抗体療法と共に使用され得ることが企図される。
いくつかの実施形態では、免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤であり得る。免疫チェックポイントは、シグナル（例えば、共刺激分子）を強くするか、またはシグナルを弱くする。免疫チェックポイント妨害により標的とされ得る阻害性免疫チェックポイントは、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６としても知られている）、ＢおよびＴリンパ球減衰剤（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔ－リンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１５２としても知られている）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）、プログラム死１（ＰＤ－１）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、ならびにＴ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制剤（ＶＩＳＴＡ）を含む。特に、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１系および／またはＣＴＬＡ－４を標的とする。
免疫チェックポイント阻害剤は、薬物、例えば、小分子、リガンドもしくは受容体の組換え形態であることができ、または特に、抗体、例えば、ヒト抗体（例えば、国際特許公報番号ＷＯ２０１５／０１６７１８；Ｐａｒｄｏｌｌ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ、１２（４）：２５２－６４、２０１２；両文献は参照により本明細書に取り込まれる）である。免疫チェックポイントタンパク質またはそのアナログの既知の阻害剤が用いられてもよく、特に、キメラ、ヒト化、またはヒト形態の抗体が用いられてもよい。当業者には、代替的および／または等価な名称が、本開示において言及された特定の抗体のために使用されてもよいことが分かるであろう。かかる代替的および／または等価な名称は、本明細書の文脈において互換的である。例えば、ランブロリズマブは、代替的および等価な名称としてＭＫ－３４７５およびペンブロリズマブとしても知られていることが知られている。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１のそのリガンド結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。特定の一態様では、ＰＤ－１リガンド結合パートナーは、ＰＤＬ１および／またはＰＤＬ２である。別の実施形態では、ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、ＰＤＬ１のその結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。特定の一態様では、ＰＤＬ１結合パートナーは、ＰＤ－１および／またはＢ７－１である。別の実施形態では、ＰＤＬ２結合アンタゴニストは、ＰＤＬ２のその結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。特定の一態様では、ＰＤＬ２結合パートナーは、ＰＤ－１である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドであり得る。例示的な抗体は、米国特許第８，７３５，５５３号、同第８，３５４，５０９号、および同第８，００８，４４９号に記載されており、これらの全ては参照により本明細書に組み込まれる。本明細書にて提供される方法において使用するための他のＰＤ－１系アンタゴニストは、当技術分野において周知であり、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０２９４８９８号、同第ＵＳ２０１４／０２２０２１号、および同第ＵＳ２０１１／０００８３６９号に記載されており、これらの全ては参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体）である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびＣＴ－０１１からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合したＰＤＬ１またはＰＤＬ２の細胞外またはＰＤ－１結合部分を含むイムノアドヘシン）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＡＭＰ－２２４である。ＭＤＸ－１１０６－０４、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８、ＢＭＳ－９３６５５８、およびＯＰＤＩＶＯ（登録商標）としても知られているニボルマブは、ＷＯ２００６／１２１１６８に記載されている抗ＰＤ－１抗体である。ＭＫ－３４７５、Ｍｅｒｃｋ３４７５、ランブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、およびＳＣＨ－９００４７５としても知られているペンブロリズマブは、ＷＯ２００９／１１４３３５に記載されている抗ＰＤ－１抗体である。ｈＢＡＴまたはｈＢＡＴ－１としても知られているＣＴ－０１１は、ＷＯ２００９／１０１６１１に記載されている抗ＰＤ－１抗体である。Ｂ７－ＤＣＩｇとしても知られているＡＭＰ－２２４は、ＷＯ２０１０／０２７８２７およびＷＯ２０１１／０６６３４２に記載されているＰＤＬ２－Ｆｃ融合可溶性受容体である。
本明細書において提供される方法において標的とされ得る別の免疫チェックポイントは、ＣＤ１５２としても知られている、細胞傷害性Ｔ－リンパ球－関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）である。ヒトＣＴＬＡ－４の完全なｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｌ１５００６を有する。ＣＴＬＡ－４は、Ｔ細胞の表面上で見出され、抗原－提示細胞の表面上のＣＤ８０またはＣＤ８６に結合されると、「オフ」スイッチとして作用する。ＣＴＬＡ４は、ヘルパーＴ細胞の表面上で発現され、阻害性シグナルをＴ細胞に伝達する、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞共刺激タンパク質、ＣＤ２８に類似しており、両分子は、抗原－提示細胞上のそれぞれＢ７－１およびＢ７－２とも呼ばれるＣＤ８０およびＣＤ８６に結合する。ＣＴＬＡ４は、阻害性シグナルをＴ細胞に伝達し、一方で、ＣＤ２８は、刺激性シグナルを伝達する。細胞内ＣＴＬＡ４は、調節性Ｔ細胞においても見出され、それらの機能にとって重要であり得る。Ｔ細胞受容体およびＣＤ２８を介するＴ細胞活性化は、ＣＴＬＡ－４、Ｂ７分子についての阻害性受容体の発現増大に至る。
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、もしくはキメラ抗体）、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドである。
本方法において使用するのに好適な抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体（またはそれらに由来するＶＨおよび／もしくはＶＬドメイン）は、当該分野において周知の方法を用いて作成することができる。あるいは、当該分野において認識される抗ＣＴＬＡ－４抗体を使用することができる。例えば、米国特許第８，１１９，１２９号；国際特許公報番号ＷＯ０１／１４４２４、同ＷＯ９８／４２７５２、および同ＷＯ００／３７５０４（ＣＰ６７５，２０６、トレメリムマブ；以前のチシリムマブとしても知られている）；米国特許第６，２０７，１５６号；Ｈｕｒｗｉｔｚら、１９９８；Ｃａｍａｃｈｏら、２００４；ならびにＭｏｋｙｒら、１９９８において開示された抗ＣＴＬＡ－４抗体を、本明細書において開示される方法において使用することができる。前記刊行物のそれぞれの教示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。ＣＴＬＡ－４に対する結合について当該分野において認識されるこれらの抗体と競合する抗体を使用することもできる。例えば、ヒト化ＣＴＬＡ－４抗体は、国際特許出願番号ＷＯ２００１／０１４４２４、および同ＷＯ２０００／０３７５０４、および米国特許第８，０１７，１１４号に記載されており、これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。
例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブ（１０Ｄ１、ＭＤＸ－０１０、ＭＤＸ－１０１、およびＹｅｒｖｏｙ（登録商標）としても知られている）またはその抗原結合断片およびバリアントである（例えば、ＷＯ０１／１４４２４を参照されたい）。他の実施形態では、抗体は、イピリムマブの重鎖および軽鎖ＣＤＲまたはＶＲを含む。したがって、一実施形態では、抗体は、イピリムマブのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメイン、ならびにイピリムマブのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態では、抗体は、上記の抗体と同じＣＴＬＡ－４上のエピトープとの結合および／またはそれらへの結合について競合する。別の実施形態では、抗体は、上記の抗体と少なくとも約９０％の可変領域アミノ酸配列相同性（例えば、イピリムマブと少なくとも約９０％、９５％、または９９％の可変領域相同性）を有する。
ＣＴＬＡ－４を調節するための他の分子は、ＣＴＬＡ－４リガンドおよび受容体、例えば、米国特許第５，８４４，９０５号、同第５，８８５，７９６号、および国際特許番号ＷＯ１９９５／００１９９４および同ＷＯ１９９８／０４２７５２に記載のもの；全て参照により本明細書に取り込まれる、ならびにイムノアドヘシン、例えば、米国特許第８，３２９，８６７号に記載のもの、参照により本明細書の取り込まれる、を含む。
４．手術
がんを有する人の約６０％は、予防的、診断的または病期分類的、治療的、および緩和的手術を含む、ある種の手術を受ける。治療的手術は、がん組織の全てまたは一部が物理的に除去されるか、切除されるか、および／または破壊される切除術を含み、また他の治療法、例えば、本実施形態の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、および／または代替的な治療法と併用することができる。腫瘍切除術は、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を指す。腫瘍切除術に加えて、手術による治療は、レーザー手術、冷凍外科手術、電気手術、および顕微鏡制御された手術（モース手術）を含む。
がん細胞、組織、または腫瘍の一部または全てを切除すると、体内に腔が形成される場合がある。治療は、さらなる抗がん療法を用いる領域の灌流、直接注入、または局所適用により成し遂げることができる。かかる治療は、例えば、１、２、３、４、５、６もしくは７日ごとに、または１、２、３、４および５週ごとに、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２ヶ月ごとに繰り返すことができる。これらの治療は、用量を変化させたものであってもよい。
５．他の薬剤
治療の治療効果を改善するために本実施形態の特定の態様と組み合わせて他の薬剤を用いてもよいことが企図される。これらのさらなる薬剤には、細胞表面受容体およびＧＡＰジャンクションの上方制御に作用する薬剤、細胞増殖抑制剤および分化剤、細胞接着の阻害剤、過剰増殖細胞のアポトーシス誘導剤への感受性を増大させる薬剤、または他の生物学的薬剤が含まれる。ＧＡＰジャンクションの数を高めることによる細胞内シグナリングの増大は、隣接する過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖効果を増大し得る。他の実施形態では、細胞増殖抑制剤または分化剤は、治療の抗過剰増殖効果を改善するために本実施形態の特定の態様と組み合わせて用いることができる。細胞接着の阻害剤は、本実施形態の効果を改善するために企図される。細胞接着阻害剤の例は、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンである。抗体ｃ２２５などの過剰増殖細胞のアポトーシスに対する感受性を増大させる他の薬剤が、治療効果を改善するために本実施形態の特定の態様と組み合わせて用いられ得ることがさらに企図される。
ＩＶ．キット
ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２エクソン２０変異、例えば、本明細書において開示されるもの等を検出するためのキットも、本開示の範囲の範囲内である。そのようなキットの一例は、エクソン２０変異に特異的なプライマーのセットを含み得る。キットはさらに、本明細書に記載される特定のＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２エクソン２０変異の存在または不在を検出するためにプライマーを使用するための指示書を含み得る。キットはさらに、がん患者由来の試料における本明細書に記載のＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２エクソン２０変異について陽性であると同定することが、チロシンキナーゼ阻害剤であるポジオチニブまたはアファチニブまたは構造的に類似する阻害剤に対する感受性の指標となることを示す、診断目的のための指示書を含み得る。キットはさらに、がん患者由来の試料における本明細書に記載のＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２エクソン２０変異について陽性であると同定することが、患者がポジオチニブ、アファチニブ、または構造的に類似する阻害剤を用いて治療されるべきであることを示すことを示す、指示書を含み得る。
Ｖ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。当業者であれば、後に続く本実施例において開示された技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者により見出された技術であり、それ故に、その実施のための好ましいモードを構成するものとして考慮することができる、ということを理解するべきである。しかし、当業者であれば、本開示に照らして、本明細書において開示された特定の実施形態において多数の変更を加えることができること、そして本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似する結果を依然として得ることができること、を理解するべきである。
実施例１－ＥＧＦＲまたはＨＥＲエクソン２０挿入を有するがん細胞に対する薬物の同定
ＴＫＩに対する臨床応答を、臨床データベースにおいてＥＧＦＲエクソン２０挿入を保有する腫瘍を有する患者において調べ；単剤エルロチニブ、ゲフィチニブまたはアファチニブで治療されたＥＧＦＲ変異体ＮＳＣＬＣを有する２８０名の患者のうち、１２９名の患者が古典的ＥＧＦＲ変異（エクソン１９欠失、Ｌ８５８Ｒ、およびＬ８６１Ｑ）を有すると特定され、９名の患者がＥＧＦＲエクソン２０挿入を有すると特定された。古典的ＥＧＦＲ変異を有するＮＳＣＬＣ患者は１４ヶ月の中央値ＰＦＳを有したのに対して、ＥＧＦＲエクソン２０挿入を有する患者は２ヶ月のみの中央値ＰＦＳを有した（ｐ＜０．０００１、ログランク検定；図１Ａ）。９名のＥＧＦＲエクソン２０挿入患者のうち、ＯＲが、アファチニブを受けたＳ７６８ｄｅｌ－ｉｎｓＩＬ変異を保有する１名の患者のみで観察された（図４Ａ）。この臨床データは、ＥＧＦＲエクソン２０挿入誘発ＮＳＣＬＣでは使用可能なＥＧＦＲ ＴＫＩの活性が限定されることを示し、代替治療戦略がこれらの特定の腫瘍では必要とされることを確認する。
薬物スクリーニングの最初の段階として、７種類のＥＧＦＲ変異および１１種類のＨＥＲ２変異をＢａ／Ｆ３細胞において発現させた。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０変異の位置を図１Ｂに要約する。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のどのエクソン２０変異が活性化しているかを評価するために、Ｂａ／Ｆ３細胞株をＩＬ－３非依存性生存についてスクリーニングを行った。試験した全てのＥＧＦＲエクソン２０挿入が活性化変異であり（図４Ｂ）、６種類のＨＥＲ２エクソン２０変異およびエクソン１９中に位置しているＬ７５５Ｐが活性化変異であった（図４Ｃ）ことが認められた。次に、可逆的ＴＫＩ（第１世代）、不可逆的ＴＫＩ（第２世代）、および不可逆的変異体特異的ＴＫＩ（第３世代）を含む、臨床評価を受けたことがあるＥＧＦＲおよびＨＥＲ２ ＴＫＩに対する感受性を、エクソン２０挿入について試験し、次いで、古典的感受性変異であるＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒに対する感受性と比較した。ＥＧＦＲ Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡを除いて、ＥＧＦＲエクソン２０挿入（ｎ＝６）は、第１世代（図１Ｃ、ＩＣ５０＝３．３～＞１０μＭ）、第２世代（図１ｄ、ＩＣ５０＝４０～１３５ｎＭ）、および第３世代（図ｌｅ、ＩＣ５０＝１０３～８５０ｎＭ）ＥＧＦＲ ＴＫＩに対して耐性を有した（図５、表１）。加えて、ＨＥＲ２エクソン２０変異体（ｎ＝６）は、第１世代（図１Ｆ、ＩＣ５０＝１．２～１３μＭ）および第３世代（図１Ｈ、ＩＣ５０＝１１４～５０５ｎＭ）ＴＫＩに対して耐性を有した。第２世代ＴＫＩは、Ｂａ／Ｆ３ ＨＥＲ２エクソン２０変異体細胞株に対していくらかの活性を有する（図１Ｇ、ＩＣ５０＝１０～１２ｎＭ、図６、表１）。より低い用量で部分的阻害を示したＥＧＦＲ Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡを除いて、薬物スクリーニングと一致して、ウエスタンブロッティングは、エルロチニブおよびオシメルチニブは、ＥＧＦＲエクソン２０挿入変異においてｐ－ＥＧＦＲ２を有意に阻害せず、５００ｎＭでのみＨＥＲ２エクソン２０挿入変異体においてｐ－ＨＥＲ２有意に阻害した（図７Ａ～Ｄ）。
（表１）ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ ＴＫＩによる、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０挿入のＩＣ５０値
Figure 2022527788000003
エクソン２０挿入が第１世代および第３世代ＥＧＦＲ ＴＫＩに対して耐性を有する理由を調べるために、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍの解析された結晶構造に対してＥＧＦＲ Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧおよびＥＧＦＲ ＷＴとの３－Ｄモデリングを行い、薬物結合ポケット内の変化を可視化した。モデリングにより、ＥＧＦＲエクソン２０挿入は、ゲートキーパー残基Ｔ７９０のアライメントにおけるＴ７９０Ｍ変異と類似しており、ＡＴＰに対する親和性の増大と第１世代阻害剤の結合の低下をもたらし、これらの変異を非共有結合型阻害剤に対して耐性とすることが明らかにされた。加えて、ＨＥＲ２エクソン２０挿入は、恒常的に活性な立体構造を誘導し、不活性な立体構造のＨＥＲ２に結合する非共有結合型ＨＥＲ２阻害剤ラパチニブの結合を妨げた。さらに、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０挿入は、薬物結合ポケットに対して劇的な作用を有する。ＥＧＦＲ（図１Ｉ）およびＨＥＲ２（図１Ｊ）エクソン２０挿入のインシリコモデリングにより、α－ｃ－ヘリックスのうね状の（ｒｉｄｇｅｄ）配置を内側の活性化位置に強制的に移動させる、α－ｃ－ヘリックスのＣ末端での挿入によるα－ｃ－ヘリックスの薬物結合ポケット内への有意なシフト（矢印）（図１Ｊ）が明らかにされた。加えて、３－Ｄモデリングは、両方の受容体の薬物結合ポケット（図１Ｉ、１Ｊ）内へのＰ－ループの有意なシフトも示した。これらのシフトは合わせて、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０変異体タンパク質の両方において２つの方向から薬物結合ポケットの立体障害をもたらす。上述のインビトロでの試験と一致して、３－Ｄモデリングは、アファチニブがオシメルチニブより効果的にエクソン２０挿入を阻害するという観察を裏付ける。オシメルチニブは、剛性のピリミジンコアに直接連結された大きな末端１－メチルインドール基を有する。この大きな柔軟性のない基は、ＥＧＦＲエクソン２０挿入においてアファチニブと同程度に効率的にＣ７９７残基に到達するオシメルチニブの能力を低下させる（図１Ｉ）。あるいは、アファチニブは、二級アミン基を介してキナゾリンコアに間接的に連結されるより小さな１－クロロ－２－フルオロベンゼン環末端基を有し、アファチニブが立体障害を有する結合ポケット内に適合できるようにする。さらに、立体障害は、オシメルチニブのＨＥＲ２ Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡへの結合を妨げる。まとめると、インビトロデータおよびインシリコモデリングは、小さく柔軟なキナゾリン誘導体はＥＧＦＲ／ＨＥＲ２エクソン２０挿入を標的とすることができる可能性があることを示す。
次に、エクソン２０挿入に対して活性が増強されているＴＫＩを同定するよう探索を行った。ポジオチニブは、アファチニブと同様に、小さな末端基および柔軟なキナゾリンコアを含む。一方で、ポジオチニブは、アファチニブと比較して、マイケルアクセプター基（Ｍｉｃｈａｅｌ Ａｃｃｅｐｔｏｒ ｇｒｏｕｐ）をキナゾリンコアに連結するより小さな置換基、およびアファチニブと比較して末端ベンゼン環の増加したハロゲン化を有する。この電子豊富な部分はまた、ＥＧＦＲの塩基性の残基、例えばＫ７４５と相互作用し、その結合をさらに安定化する。そのために、ポジオチニブをＢａ／Ｆ３系において試験した。インビトロで、ポジオチニブはＥＧＦＲエクソン２０変異体Ｂａ／Ｆ３細胞株（図２Ａ）およびＨＥＲ２エクソン２０変異体Ｂａ／Ｆ３細胞（図２Ｂ）の増殖を強力に阻害した。ポジオチニブは、ＥＧＦＲエクソン２０変異体Ｂａ／Ｆ３細胞株において１．０ｎＭの平均ＩＣ５０値を有し、ポジオチニブはインビトロで、オシメルチニブよりおよそ１００倍超強力でありかつアファチニブより４０倍超強力であった。さらに、ポジオチニブは、ＨＥＲ２エクソン２０変異体Ｂａ／Ｆ３細胞株において１．９ｎＭの平均ＩＣ５０値を有し、ポジオチニブはインビトロで、オシメルチニブより２００倍超強力でありかつアファチニブより６倍超強力であった。これらの結果は、ポジオチニブが５ｎＭの低濃度でＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のリン酸化を阻害したウエスタンブロッティングにより検証された（図２Ｃ、８Ａ）。さらに、ポジオチニブ感受性がＥＧＦＲまたはＨＥＲ２変異体の発現のレベルを原因としたものではないことを検証するために、各変異体の発現をＥＬＩＳＡにより測定し、次いで、ＩＣ５０値に対してプロットした（図８Ｄ）。ＩＣ５０と発現との間で相関性は認められなかった（Ｒ＝－０．０５６、ｐ＝０．８５６）が、ＥＧＦＲではポジオチニブ感受性とＥＧＦＲの変異の位置との間では相関性が認められ（Ｒ＝０．６８７，ｐ＝０．０４４）（図２Ｄ）、挿入がα－ｃ－ヘリックスからさらに遠ざかるとＩＣ５０がより高くなることが示唆された。興味深いことに、この相関性は、挿入位置よりもむしろ挿入の大きさがより大きく変化している、ＨＥＲ２エクソン２０変異では認められなかった（図８Ｅ）。この相関性は、変異の厳密な位置が薬物結合ポケットに対して様々な作用を有し、認められる薬物応答の不均一性に寄与することを示唆する。加えて、ポジオチニブは、患者由来の細胞株ＣＵＴＯ１４（ＥＧＦＲ Ａ７６７ｄｕｐＡＳＶ）およびＹＵＬ００１９（ＥＧＦＲ Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＦＨ）の増殖をそれぞれ１．８４ｎＭおよび０．３０ｎＭの平均ＩＣ５０値で効果的に阻害し、これは、ＣＵＴ０１４でのアファチニブより１５倍超強力であり、かつＹＵＬ００１９でのアファチニブより１００倍超強力であった（図２Ｅ、Ｆ）。ＣＵＴ０１４細胞株のウエスタンブロッティングは、１０ｎＭポジオチニブ処置でｐ－ＥＧＦＲの有意な阻害があったが、ｐ－ＥＧＦＲはアファチニブによって１０００ｎＭまで有意に阻害されなかったと判定した（図８Ｂ、Ｃ）。
Ｔ７９０Ｍ変異体と比較したエクソン２０変異体を阻害するポジオチニブの特異性を判定するために、エクソン２０変異体でのアファチニブ、オシメルチニブ、ロシレチニブ、およびポジオチニブのＩＣ５０値を、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ変異体Ｂａ／Ｆ３細胞株におけるアファチニブ、オシメルチニブ、ロシレチニブ、およびポジオチニブのＩＣ５０値と比較した。ＩＣ５０値を単一ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ変異に対して正規化して表示する、１未満の値はＴ７９０Ｍと比較してエクソン２０挿入に対する特異性を示す（図２Ｇ）。ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ変異体と比較して、ＥＧＦＲエクソン２０挿入はポジオチニブに対して６５倍超の感受性を有した。さらに、ＥＧＦＲエクソン２０挿入変異は、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ変異体よりアファチニブに対して１．４倍超の耐性、オシメルチニブに対して５．６倍超の耐性、およびロシレチニブに対して２４倍超の耐性を有した（図２Ｇ）。
ポジオチニブは、Ｔ７９０Ｍ変異と比較してエクソン２０変異体を選択的かつ強力に阻害するが、オシメルチニブなどの第３世代ＴＫＩはそうではない理由を調べるために、３－Ｄモデリングを実施し、薬物結合ポケットの変化がどのように薬物結合に影響を及ぼすかを判定した。オシメルチニブは、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ変異体受容体の薬物結合ポケットに適合し（図２Ｈ）、エクソン２０変異体では、結合ポケット内の大きな変化（図２Ｉ）が、第３世代阻害剤の結合を立体的に妨げた。一方で、ポジオチニブはより小さく、より優れた柔軟性を有し、ポジオチニブが立体障害を有するエクソン２０結合ポケット内に適合するのを可能にする（図２Ｉ）。さらに、ポジオチニブおよびアファチニブとのＥＧＦＲ Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧの３－Ｄモデリングは、薬物結合ポケット内にシフトしたＰ－ループが、ポジオチニブをアファチニブより強固に結合ポケット内に結合させることを示唆する。構造モデリングの計算は、ポジオチニブでの結合の自由エネルギー（Ｌｏｎｄｏｎ ΔＧ）がアファチニブより低いことを示し、ポジオチニブのより強い結合親和性を示す。オシメルチニブとのＷＴ ＨＥＲ２の３－Ｄモデリングは、ＷＴ ＨＥＲ２の結合ポケットがＨＥＲ２ Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡの結合ポケットより大きいことを示す。したがって、ポジオチニブは、ＨＥＲ２ Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡの立体障害を有する薬物結合ポケット内深くに強固に結合し、エクソン２０挿入により誘導される構造変化を克服する。
ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０挿入誘発ＮＳＣＬＣのＧＥＭモデルを用いて、ポジオチニブの有効性をインビボで試験した。肺腫瘍を、以前に記載されたＥＧＦＲ Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ，２０１３）およびＨＥＲ２ Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ（Ｐｅｒｅｒａ ｅｔ ａｌ，２００９）マウスにおいて誘導し、動物に、ポジオチニブ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル対照を毎日４週間にわたって受けさせた。ＭＲＩにより決定されたように、ポジオチニブは、ＥＧＦＲエクソン２０ ＧＥＭＭでは８５％（図３Ａ、Ｃ）、ＨＥＲ２エクソン２０ ＧＥＭＭでは６０％（図３Ｂ、Ｄ）、同じＧＥＭモデルにおいてアファチニブで以前に観察された３７％より高い阻害レベルで腫瘍量を低下させた。ポジオチニブの前および後の腫瘍の代表的なＭＲＩ画像を、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２ ＧＥＭＭ両方について示す（図３Ｃ、Ｄ）。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２ ＧＥＭモデル両方において、１０ｍｇ／ｋｇポジオチニブで処置したマウスは、１２週で進行の徴候なしに、持続的な退縮を示した（図３Ｅ、Ｆ）。加えて、ポジオチニブ処置（５または１０ｍｇ／ｋｇ）は、ＥＧＦＲエクソン２０挿入ＰＤＸモデルＬＵ０３８７（Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ）において１４日までに腫瘍を完全に減少させた（＞８５％阻害）（図３Ｇ）。
ポジオチニブが、他の不可逆阻害剤と同様に、Ｃ７９７で共有結合するかどうかを判定するために、オシメルチニブ耐性を有する患者の約３０％で観察される（Ｔｈｒｅｓｓ ｅｔ ａｌ，２０１５）Ｃ７９７Ｓ変異を有するＢａ／Ｆ３細胞株を作製した。Ｃ７９７Ｓ変異が＞１０μＭのＩＣ５０値でポジオチニブに対する耐性を誘導したことが認められた。これらの試験を合わせると、ポジオチニブが他の第３世代ＴＫＩと類似の獲得耐性のメカニズムの影響を受けやすい可能性があることが示唆された。
上記の知見を検証するために、ＨＥＲ２ Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＣを有する乳がん細胞株ＭＣＦ１０Ａを用いて、試験を行った。細胞をさまざまな用量での異なる阻害剤で処理し、乳がん細胞株が試験した他の細胞株で認められたようにポジオチニブに対して感受性を有することが認められた（図１０）。したがって、ポジオチニブは、エクソン２０変異を有する他のがんの処置で用いることができる。
このように、エクソン２０変異体は、第１世代、第２世代、および第３世代ＴＫＩに対してデノボ耐性を示すことが認められた。ＥＧＦＲ Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧおよびＨＥＲ２ Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡの３－Ｄモデリングを用いて、エクソン２０における挿入によって誘導される薬物結合ポケット内の変化を克服し得る構造的特徴を有するとして、ポジオチニブを特定した。さらに、ポジオチニブの予測活性が、これらの変異を有する細胞におけるポジオチニブの強力な抗腫瘍活性を実証する、インビトロおよびインビボモデルを用いて確認された。
ポジオチニブは、ＥＧＦＲエクソン２０変異体においてアファチニブよりおよそ４０倍超強力でありかつダコミチニブより６５倍超強力であることが認められた。さらに、ポジオチニブは、インビトロでＨＥＲ２エクソン２０変異体においてアファチニブおよびダコミチニブより６倍超強力であった。まとめると、これらのデータは、ポジオチニブは、アファチニブおよびダコミチニブと類似のキナゾリン骨格を共有するが、前記キナーゼ阻害剤のさらなる特徴が、より多く見られるＴ７９０Ｍ変異と比較してＥＧＦＲエクソン２０変異に対して増加した活性および相対的特異性をもたらすことを示す。
３－Ｄモデリングは、ポジオチニブのより小さなサイズ、ハロゲン化の増加、および柔軟性が、エクソン２０変異体ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２の立体障害を有する薬物結合ポケットにおいて前記阻害剤に競合的利点を与えることを示唆する。負の相関性が、α－ｃ－ヘリックスからの変異の距離と薬物感受性との間に観察された。この関連性は、変異の厳密な位置が、薬物結合ポケットおよび／またはＴＫＩの結合親和性に影響を及ぼすことを示唆する。さらに、データは、挿入のサイズもまた、薬物感受性に影響を及ぼすことを示した。さらに、１アミノ酸だけ純増していた患者由来細胞株、ＹＵＬ００１９（Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＦＨ）は、より大きなＥＧＦＲエクソン２０挿入を有する細胞よりキナゾリンベースの汎ＨＥＲ阻害剤に対してより高い感受性を有した。
実施例２－材料および方法
患者集団および統計解析：前向きに収集されたＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｏｏｎ Ｓｈｏｔ ＧＥＭＩＮＩデータベースに登録されているＥＧＦＲ変異体ＮＳＣＬＣを有する患者を特定した。日常的な臨床ケアで用いられる５０、１３４または４０９遺伝子のパネルのＰＣＲベースの次世代配列決定の１つを用いて、ＥＧＦＲ変異状態を判定した。カプラン・マイヤー法を用いて、ＰＦＳを計算した。ＰＦＳは、ＥＧＦＲ ＴＫＩの開始から放射線学的進行または死亡までの時間として定義される。病気再分類（Ｒｅｓｔａｇｉｎｇ）スキャンを処置中６～８週の間隔で得、固形がんの治療効果判定（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ）（ＲＥＣＩＳＴ）、バージョン１．１にしたがって遡及的に評価し、ＥＧＦＲエクソン２０挿入ＮＳＣＬＣを有する患者における奏効率を判定した。
細胞株作製およびＩＬ－３欠乏：Ｂａ／Ｆ３細胞株を、無菌条件下で、Ｌ－グルタミン、１０％熱失活ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、および１０ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ－３（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を追加した完全ＲＰＭＩ－１６４０（Ｒ８７５８；Ｓｉｇｍａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）培地中で培養した。１２時間のＢａ／Ｆ３細胞株のレトロウイルス形質導入により、安定細胞株を作製した。リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、表２に要約されているｐＢａｂｅ－Ｐｕｒｏベースのベクター（ＡｄｄｇｅｎｅおよびＢｉｏｉｎｎｏｖａｔｉｓｅ）をＰｈｏｅｎｉｘ ２９３Ｔ ａｍｐｈｏパッキング細胞株（Ｏｒｂｉｇｅｎ）にトランスフェクトすることにより、レトロウイルスを作製した。形質導入の７２時間後、２μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を培地に添加した。５日間の選択の後、ＦＩＴＣ－ＨＥＲ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）またはＰＥ－ＥＧＦＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて細胞を染色し、ＦＡＣＳにより選別した。次いで、ＩＬ－３の非存在下で細胞株を１５日間増殖させ、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｇｅｍａ）を用いて３日毎に細胞生存度を測定した。結果として得られた安定細胞株を、ＩＬ－３を含まない上記の完全ＲＰＭＩ－１６４０培地中で維持した。ＨＣＣ８２７およびＨＣＣ４００６肺がん細胞株をＡＴＣＣから入手し、無菌条件下で１０％ＲＰＭＩ培地中で維持した。ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ １．２キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いるショートタンデムリピートによるＤＮＡフィンガープリンティングにより、細胞株の同一性を確認した。フィンガープリンティングの結果を、細胞株の初代供給源によって維持される参照フィンガプリントと比較した。全ての細胞株はマイコプラズマ不含であった。エルロチニブ耐性細胞株を作製するために、ＨＣＣ８２７およびＨＣＣ４００６（両方ともＥＧＦＲ変異体）細胞を、耐性バリアントが出現するまで増加濃度のエルロチニブと培養した。
（表２）安定細胞株を作製するために用いられるベクター
Figure 2022527788000004
細胞生存度アッセイおよびＩＣ５０推定：Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、細胞生存度を測定した。細胞を懸濁培地から収集し、３００×ｇで５分間遠沈し、新鮮なＲＰＭＩ培地で再懸濁し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ自動細胞計数器およびトリパンブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて計数した。３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）に、１ウェルあたり１５００個の細胞を技術的に三連で播種した。細胞を、１ウェルあたり４０μＬの最終体積で段階３倍希釈したＴＫＩでの７種類の異なる濃度の阻害剤またはビヒクル単独で処理した。７２時間後、１１μＬのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏを各ウェルに添加した。プレートを１０分間振とうし、ＦＬＵＯｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡマルチモードマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）を用いて、生物発光を測定した。生物発光の値をＤＭＳＯ処理細胞に対して正規化し、正規化した値を、可変傾斜を用いる正規化データに対する非線形回帰フィットを用いてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでプロットした。ＩＣ５０値を、５０％阻害でＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにより計算した。明記されていない限り、各実験を３回反復した。
チロシンキナーゼ阻害剤：ラパチニブ、アファチニブ、ダコミチニブ、ＡＺＤ９２９１、ＣＯ－１６８６、ＥＧＦ８１６、イブルチニブ、およびＨＭ７８１－３６ＢをＳｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌから購入した。エルロチニブおよびゲフィチニブをＴｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒの施設内薬局から入手した。ＢＩ－６９４はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ－Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍによって提供された。全ての阻害剤を１０ｍＭの濃度でのＤＭＳＯで溶解し、－８０℃で保管した。
３－Ｄモデリング：ＥＧＦＲ Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧタンパク質の構造を検索し（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋエントリーコード：４ＬＲＭ）、それを鋳型として用いて、ＥＧＦＲ Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧの分子３－Ｄ構造モデルを構築した。ＨＥＲ２ Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡを、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌにおいて以前に発表されたモデルを用いて構築した。相同モデルを、ＭＯＤＥＬＬＥＲ ９ｖ６を用いて構築し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔソフトウェアパッケージ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）を用いてさらにエネルギー的に最小化した。ＴＫＩのエクソン２０変異体ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２への分子ドッキングを、他に記載のない限り、ＧＯＬＤソフトウェアを用いてデフォルトのパラメーターにより実施した。ドッキングプロセスにおいて早期終了は禁止された。拘束（ｒｅｓｔｒａｉｎｔ）を用いて、受容体と阻害剤との間の共有結合形成をモデル化した。結合ポケット内の残基の柔軟性に、ＧＯＬＤソフトウェアを用いて対応した。ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２と阻害剤との間の相関性を示す図を、ＰＹＭＯＬを用いて可視化した。
Ｂａ／Ｆ３変異体のウエスタンブロッティング：ウエスタンブロッティングでは、細胞をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、タンパク質溶解緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびプロテアーゼ阻害剤カクテル錠（Ｒｏｃｈｅ）で溶解した。タンパク質（３０～４０μｇ）をＢｉｏＲａｄから購入したゲルにロードした。ＢｉｏＲａｄセミドライトランスファーを用い、次いで、ｐＥＧＦＲ（＃２２３４）、ＥＧＦＲ（＃４２６７）、ｐＨＥＲ２（＃２２４７）、ＨＥＲ２（＃４２９０）（１：１０００；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に対する抗体によりプローブした。ブロットをローディング対照としてβ－アクチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ａ２２２８）またはビンクリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｖ４５０５）に対する抗体でプローブし、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍ ｏＦｉｓｈｅｒ）およびＢｉｏＲａｄのＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｔｏｕｃｈ Ｉｍａｇｉｎｇ ＳｙｓｔｅｍまたはＸ線撮影用フィルムを用いて曝露した。２つの異なるタンパク質単離の代表的な画像を示し、ブロットを二度繰り返して実行する。ウエスタンブロッティングの定量化をＰｈｏｔｏｓｈｏｐで完了し、（背景平均強度－試料平均強度）（ピクセルの数）＝バンド強度として計算した。試料を最初にローディング対照（β－アクチンまたはビンクリン）に対して正規化し、次いでＤＭＳＯに対して正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでグラフ化した。ＤＭＳＯからの有意性をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで計算した。
Ｂａ／Ｆ３変異体のＥＬＩＳＡおよび相関性：親Ｂａ／Ｆ３細胞株および上記に記載される活性化変異であることが認められるＢａ／Ｆ３エクソン２０変異体の各々から、タンパク質を回収した。総ＥＧＦＲ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃７２５０）および総ＨＥＲ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃７３１０）について製造元の指示書に記載されているようにＥＬＩＳＡを実施した。ＥＬＩＳＡにより測定された相対的発現を、上記に記載したように計算したＩＣ５０値に対してプロットした。ピアソン相関係数およびｐ値をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって決定した。
患者由来の細胞株の試験：ＣＵＴＯ１４細胞を、以前に記載された培養法（Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ，２０１３）を用いて、インフォームドコンセント後の肺腺がんを有する患者の胸水から作製した。細胞株を表示した用量のアファチニブまたはポジオチニブで７２時間処理し、細胞生存度をＭＴＳアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定した。ＩＣ５０を以前に記載されたように計算した（ｎ＝３）。患者由来の細胞株によるウエスタンブロッティングを、以前に記載されたように完了した（Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ，２００７）（ｎ＝３）。細胞を表示した用量のアファチニブまたはポジオチニブで２時間処理した。総ＥＧＦＲ（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＧＡＰＤＨ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を除いて、全ての抗体をＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。
ＹＵＬ００１９細胞株を、肺の進行した腺がんを有する患者から得た悪性心膜液から、ＩＲＢ承認プロトコール下で確立した。細胞株を、１０％熱失活ウシ胎仔血清（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を追加したＲＰＭＩ＋Ｌ－グルタミン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で培養した。ＥＧＦＲ変異の存在を確認するために、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ ＃７４１０４）を用いて製造元の指示書により、ＲＮＡを細胞ペレットから抽出した。ｃＤＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１８０８０－０５１）を用いて合成してＥＧＦＲを増幅させるための鋳型として用いた。ＰＣＲ産物を、以下のプライマー：
Figure 2022527788000005
を用いて、Ｓａｎｇｅｒ配列決定により配列決定した。フォワードおよびリバース配列トレースを手動で見直した。患者由来の細胞株で検出されたバリアントは、ＥＧＦＲのエクソン２０での複合挿入であり、７７１位のアミノ酸アスパラギンの２個のアミノ酸、フェニルアラニンおよびヒスチジンによる置換をもたらした（Ｎ７７１ｄｅｌｉｎｓＦＨ）。細胞生存度およびＩＣ５０推定を上記に記載のように実施した。
患者由来異種移植片（ＰＤＸ）の試験：ＬＵ０３８７ ＰＤＸ試験をＣｒｏｗｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓによって完了した。簡単に説明すると、ＥＧＦＲ Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ発現腫瘍からの腫瘍断片を、５～６週齢の雌のｎｕ／ｎｕヌードマウスに接種した。腫瘍が１００～２００ｍｍ３に到達したときに、マウスを以下の３群に無作為化した：５ｍｇ／ｋｇポジオチニブ、１０ｍｇ／ｋｇポジオチニブ、またはビヒクル対照（ｄＨ２Ｏ中に２０％ＰＥＧ－４００、３％Ｔｗｅｅｎ－８０）。腫瘍体積および体重を週に２回測定した。５ｍｇ／ｋｇポジオチニブを受けるマウスは、４～５日間にわたって薬物を受け、次いで４日間休薬し、次いでさらに４日の投与を受けた。次に、マウスを投与なしでさらに２日間観察した。１０ｍｇ／ｋｇポジオチニブを受けるマウスは３～４日間薬物を受け、次いで、投与なしで１０日間観察された。腫瘍量と無関係のイベントのために人道的に安楽死させたマウスは、最終分析から除いた。
遺伝子操作したマウスモデル（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ）（ＧＥＭＭ）の試験：ＥＧＦＲ Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧおよびＨＥＲ２ Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ ＧＥＭＭを以前に記載された（Ｐｅｒｅｒａ ｅｔ ａｌ，２００９；Ｃｈｏ ｅｌ ａｌ，２０１３）ように作製した。マウスは、Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅにより規定されたＧｏｏｄ Ａｎｉｍａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓに従って取り扱われ、Ｄａｎａ－Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）の承認下で行われた。マウスに、６週齢から連続的なドキシサイクリン食を与えた。腫瘍体積を、以前に記載されたようにＭＲＩにより決定した（Ｐｅｒｅｒａ ｅｔ ａｌ，２００９；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ，２０１３）。等しい初回腫瘍体積を有するマウスを、ＭＲＩにより決定された明白な腫瘍形成に基づいて、ビヒクルおよび一日あたり１０ｍｇ／ｋｇポジオチニブに非盲検的に無作為化した。腫瘍量と無関係のイベントのために人道的に安楽死させたマウスは、最終分析から除いた。
実施例３－ＨＥＲ２エクソン２１変異を有するがん細胞に対する薬物の同定
ＨＥＲ２変異は膀胱、胃、および胆管のがんにおいて最も高い頻度で生じる：がんの種類間でのＨＥＲ２変異の多様性を理解するために、ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌ、ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、およびＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅからのコホート、ならびにＧｕａｒｄａｎｔ ＨｅａｌｔｈからのｃｆＤＮＡコホートを含む、複数のデータベースを照会した。全データベースにわたって、全ての非同義ＨＥＲ２変異を２５種類の異なるがんの種類の範囲内で分析した（表４）。ＨＥＲ２変異についての加重平均頻度を計算した。ＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥデータベース（Ｍｅｒｉｃ－Ｂｅｒｎｓｔａｍ ｅｔ ａｌ，２０１８）で観察されたものと同様に、ＨＥＲ２変異は、膀胱（８．３％）、胆管（５．３％）、および胃（４．５％）のがんにおいて最も高い頻度で生じ（図１３Ａ）；かつＨＥＲ２エクソン２０変異は、小腸（１．８％）、肺（１．５％）、および***（０．９％）のがんにおいて最も高い頻度で生じた（図１３Ｂ）。
ＨＥＲ２変異はＨＥＲ２のチロシンキナーゼドメインにおいて最も高い頻度で生じ、かつ変異ホットスポットは悪性腫瘍ごとに異なる：次に、変異の頻度を、ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌおよびＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎで報告されたＨＥＲ２受容体のさまざま領域の範囲内で分析した。全てのがんの種類にわたって、ＨＥＲ２変異は、チロシンキナーゼドメイン（４６％）において最も高い頻度で生じ、それには、エクソン２０（２０％）、エクソン１９（１１％）、およびエクソン２１（９％）での変異が含まれた（図１４Ａ）。加えて、細胞外ドメイン変異は３７％がＨＥＲ２変異で構成された。照会した全てのがんにわたって、最もよく見られるＨＥＲ２変異は、ｐ．Ｓ３１０Ｆ／Ｙ（１１．０％）、ｐ．Ｙ７７２＿Ａ７７５ｄｕｐＹＶＭＡ（５．７％）、ｐ．Ｌ７５５Ｐ／Ｓ（４．６％）、ｐ．Ｖ８４２Ｉ（４．４％）、およびｐ．Ｖ７７７Ｌ／Ｍ（４．０％）であった（図１４Ｅ）。肺がんでは、ＨＥＲ２変異の大部分はエクソン２０内で生じ（４８％）、Ｙ７７２＿Ａ７７５ｄｕｐＹＶＭＡは全ＨＥＲ２変異の３４％を含んだ（図１４Ｂ、１４Ｆ）。乳がんでは、ＨＥＲ２変異の大部分はエクソン１９内で生じ（３７％）、Ｌ７５５変異がＨＥＲ２変異の２２％で最も高い保有率であった（図１４Ｃ）。一方で、１つのバリアントが優勢であった肺がんとは異なり、乳がんでは、エクソン１９変異内により多くの変異多様性が存在した（図１４Ｇ）。結腸直腸がんでは、ＨＥＲ２変異は、エクソン２１（２３％）および細胞外ドメイン（２３％）において最も高い頻度で生じ、エクソン２１におけるＶ８４２Ｉバリアントが最も高い保有率であった（１９％）（図１４Ｄ、１４Ｈ）。
Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡはがんの種類全てにわたって最もよく見られるＨＥＲ２エクソン２０挿入変異である：ＨＥＲ２エクソン２０変異は、ＨＥＲ２のチロシンキナーゼドメイン内で最もよく生じる変異であり（全ＨＥＲ２変異の１６％かつチロシンキナーゼドメイン変異の４３％）、ＨＥＲ２エクソン２０挿入変異は依然として臨床上の課題である。エクソン２０挿入の多様性および保有率を理解するために、ＨＥＲ２エクソン２０挿入配列の頻度を、ｃＢｉｏｐｏｒｔａｌデータベース、ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎデータベース、およびＧｕａｒｄａｎｔ Ｈｅａｌｔｈデータベースにおいてがんの種類ごとに分析した。Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡ挿入は、全ＨＥＲ２エクソン２０挿入の７０％を含む最もよく見られるＨＥＲ２エクソン２０挿入であり、ｐ．Ｇ７７８ｄｕｐＧＳＰ（１４％）およびｐ．Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＣ（９％）挿入は、２番目および３番目に高い頻度で生じた（図２１Ａ）。ＮＳＣＬＣ（Ｎ＝３６２）におけるエクソン２０挿入変異はエクソン２０挿入変異の最大の多様性を示し（図２１Ｂ）、乳がん（Ｎ＝３０）におけるエクソン２０挿入変異は、挿入配列の多様性はほとんど示さず、３種類の異なるバリアントのみが報告された（図２１Ｃ）。その他のがんの種類では、さらなる挿入変異はわずかにしか認められず、Ｙ７７２およびＧ７７８での重複が分析した全てのがんの種類において最も高い頻度で生じた（図２１Ｄ）。
頻繁に検出されるＨＥＲ２の変化は活性化変異である：よく見られるＨＥＲ２変異の機能的影響を評価するために、エクソン１９、２０、および２１間で最も頻繁に検出された１６個のＨＥＲ２変異をＢａ／Ｆ３細胞に安定して発現させた。試験した全１６個のＨＥＲ２変異は、Ｂａ／Ｆ３細胞のＩＬ－３非依存的な生存を誘導することが認められた（図１５Ａ～Ｃ）。さらに、これら１６個のＨＥＲ２変異の発現は、リン酸化ＨＥＲ２の発現をもたらし（図２２Ａ）、これらの変異が受容体活性化をもたらすことを示した。
ポジオチニブは、試験した最も強力なＴＫＩであり、かつ最もよく見られるＨＥＲ２変異をインビトロで阻害した：最近の報告は、ＨＥＲ２変異体疾患の前臨床モデルにおける共有結合型のキナゾリンアミンベースのＴＫＩ（すなわち、アファチニブ、ダコミチニブ、ポジオチニブ、ネラチニブ）の有効性を強調しているが、アファチニブ、ダコミチニブ、およびネラチニブの臨床試験は低いＯＲＲ、ならびに患者アウトカムにおいてがん特異的な差異およびバリアント特異的な差異を有している。最もよく検出されるＨＥＲ２バリアント間での薬物感受性を体系的に評価するために、ＨＥＲ２変異体Ｂａ／Ｆ３細胞のパネルを、１１種類の共有結合型および非共有結合型のＥＧＦＲおよびＨＥＲ２ ＴＫＩに対してスクリーニングを行った。ＨＥＲ２変異体は、非共有結合型阻害剤、ラパチニブおよびサパチニブ（ｓａｐａｔｉｎｉｂ）に対して強力な耐性を示した（図１６Ａ）。共有結合型ＴＫＩオシメルチニブ、イブルチニブ、およびナザルチニブは、エクソン２０変異を発現する細胞における細胞生存度を抑制するのに有効ではなかった；しかしながら、これらのＴＫＩは、Ｄ７６９バリアントを発現する細胞に対しては活性を示した（図１６Ａ）。比較して、共有結合型のキナゾリンアミンベースのＴＫＩ、アファチニブ、ネラチニブ、ダコミチニブ、タルロキソチニブ－ＴＫＩ、およびポジオチニブは、３つのエクソン全てにわたってＨＥＲ２変異体に対する阻害性の活性を有した（図１６Ａ）。試験した全てのＨＥＲ２変異バリアントおよびＴＫＩの間で、ポジオチニブが最も低い平均ＩＣ５０を有し、かつアファチニブ、ネラチニブ、またはタルロキソチニブ－ＴＫＩより細胞生存度を低下させるのに有意に効果的であった（図１６Ｂ）。加えて、ポジオチニブは、ＨＥＲ２エクソン１９および２０変異に対してアファチニブ、ネラチニブ、またはタルロキソチニブ－ＴＫＩのいずれかより有意に有効であったが、エクソン２１変異体に対する平均ＩＣ５０には有意差はなく（図１６Ｃ～Ｅ）、変異位置が薬物結合に影響を与えることを示唆した。さらに、エクソン１９内のＬ７５５ＳおよびＬ７５５Ｐバリアントは、試験したＴＫＩ全てにわたって薬物感受性において有意差を有し（図１６Ｆ）、この部位での特定のアミノ酸変化が薬物結合親和性に影響を与えたことを示した。
ＨＥＲ２変異の位置およびアミノ酸変化は薬物結合親和性に影響を及ぼす：変異の位置およびアミノ酸変化がどのように薬物結合親和性および抑制効果に影響を及ぼすことができるかをさらに理解するために、分子動力学シミュレーションを用いて、これらの変異がＨＥＲ２キナーゼドメインの構造およびダイナミクスにどのように影響を及ぼすかを調べた。Ｌ７５５Ｓ、Ｌ７５５Ｐ、Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡ、およびＶ７７７Ｌ ＨＥＲ２変異体の分子モデル（図２３Ａ）を、鋳型として公的に入手可能であるＸ線構造（ＰＤＢ ３ＰＰ０）を使用して構築し、加速分子動力学に供し、タンパク質立体構造サンプリングを増やした。特にＰ－ループおよびα－Ｃ－ヘリックス位置に関する、サンプリングしたタンパク質立体構造の範囲は、これらのＨＥＲ２変異体間で異なっていた。エクソン２０変異間ですら、特にα－Ｃ－ヘリックス領域において、差は明白であり、α－Ｃ－ヘリックスの立体構造の持続が「イン」（より小さな結合ポケットを有する活性な立体構造）と「アウト」（より大きな結合ポケットを有する不活性な立体構造）との間で異なっていた。Ｖ７７７Ｌ変異体は「アウト」の立体構造を多数サンプリングした一方で、Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡ変異体は「イン」と「アウト」の両方の立体構造をサンプリングした（図１７Ａ）。全体的に見て、これらの立体構造状態の差は、Ｖ７７７Ｌ変異体より１０倍を上回る頻度で「イン」の立体構造（図１７Ｂ）で存在するＹ７７２ｄｕｐＹＶＭＡ変異体、および平均して、Ｖ７７７Ｌと比較してＹ７７２ｄｕｐＹＶＭＡでのより小さな結合ポケット（図１７Ｃおよび２３Ｂ）をもたらした。加えて、ネラチニブはα－Ｃ－ヘリックスに向けて方向づけられたピリジル環を含むことから、Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡのより小さな結合ポケットは、Ｖ７７７Ｌと比較してＹ７７２ｄｕｐＹＶＭＡに対するネラチニブの効力を弱める原因になる可能性がある。
ＨＥＲ２変異体結合ポケット体積のさらなる分析（図２２Ｂ）は、同じ残基での変異がタンパク質立体構造に対して劇的に異なる作用を有し得ることを実証した。具体的には、Ｌ７５５Ｐ変異のプロリン残基は、水素結合ドナーを欠いており、それぞれＬ７５５とＶ７９０との間のβ３鎖とβ５鎖との間の骨格水素結合を破壊する。これらの２本のβ鎖間の安定化の欠如は、β－シートの不安定化およびキナーゼヒンジ領域における構造的再配列をもたらした（図１７Ｄ）。具体的には、Ｌ７５５ＰのＬ８００残基が活性部位内に突出し、ポケットサイズを大幅に低下させた。β３鎖立体構造の変化はまた、Ｐ－ループを内向きに崩壊させ、ポケット体積をさらに低下させ、多くのＴＫＩに対するこの変異体の感受性をより低下させた。さらに、ヒンジ可動性の変化はまた、キナーゼ活性化において役割を果たす可能性がある。Ｌ７５５Ｐ変異体立体構造のこれらの明らかな変化は、Ｌ７５５Ｓ変異体の挙動と対照的であり、野生型ＨＥＲ２により類似している立体構造とポケット体積プロファイルを有した（図２３Ｂ）。
ＨＥＲ２変異体ヒトがん細胞株はポジオチニブに対して増強された感受性を示した：ＨＥＲ２阻害剤を試験した臨床研究によって、がんの種類特異的な薬物感受性の差が明らかにされている（Ｈｙｍａｎ ｅｔ ａｌ，２０１８）。共有結合型のキナゾリンアミンベースのＴＫＩがＨＥＲ２変異体疾患のモデルにおいて活性を有するかどうかを判定するために、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ ＴＫＩのパネルをヒトがん細胞株において試験した。前腫瘍性ＭＣＦ１０Ａ乳腺上皮細胞にＨＥＲ２エクソン２０変異をトランスフェクトし、１２種類のＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ ＴＫＩに対する感受性をインビトロで評価した。Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＣ、Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡ、またはＧ７７８ｄｕｐＧＳＰ ＨＥＲ２変異を発現するＭＣＦ１０Ａ細胞はポジオチニブに対して最も感受性を有し、それぞれ１２ｎＭ、８．３ｎＭ、および４．５ｎＭのＩＣ５０値であった（１８６Ａ～Ｃ）。比較して、タルロキソチニブ－ＴＫＩおよびネラチニブはそれぞれ、２１ｎＭおよび１５０ｎＭの平均ＩＣ５０値を生じ（図１８Ａ～Ｃ）、ポジオチニブは、タルロキソチニブ－ＴＫＩおよびネラチニブよりそれぞれ２．６倍および１９倍超強力であることを示した（ｐ＜０．００１）。さらに、ポジオチニブおよびネラチニブによるＭＣＦ１０Ａ ＨＥＲ２ Ｇ７７６ｄｅｌｉｎｓＶＣ細胞のウエスタンブロッティングは、ポジオチニブは１０ｎＭでｐ－ＨＥＲ２を完全に抑制するが、ネラチニブはそうではないことを示した（図２４Ａ）。野生型（ＷＴ）ＨＥＲ２は、Ｂａ／Ｆ３細胞をＩＬ－３非依存的に成長するように形質転換しないことから、ＭＣＦ１０Ａ細胞を用いて、ＷＴ ＨＥＲ２と比較した変異体ＨＥＲ２についてのＴＫＩの選択性を判定した。この目的のために、選択性インデックス（ＳＩ、ＩＣ５０値 変異体／ ＩＣ５０値 ＷＴ）を各阻害剤について計算し、ポジオチニブがＭＣＦ１０Ａ細胞株において試験した最も変異体選択的なＴＫＩ（ＳＩ＝０．０２８）であり、ピロチニブ（ＳＩ＝０．０６３）およびタルロキソチニブ－ＴＫＩ（ＳＩ＝０．１１１）がそれに続くことが認められた（図１８Ｄ）。Ｂａ／Ｆ３細胞を用いて得られたデータ（図１５Ｃ）と一致して、ＨＥＲ２エクソン１９変異体結腸直腸がんのモデル（ＣＷ－２）において、ポジオチニブ、タルロキソチニブ－ＴＫＩ、およびネラチニブ間の感受性の差はあまり劇的ではないが、有意であり（ｐ＝０．０２およびｐ＝０．０００４）、それぞれ３．１９ｎＭ、４．２４ｎＭ、および６８．８ｎＭの平均ＩＣ５０値であった（図１８Ｅ）。さらに、ＣＷ－２結腸直腸細胞の異種移植片マウスモデルでは、２１日目に、ポジオチニブ（５ｍｇ／ｋｇ）で処置した動物は、ビヒクル処置群と比較して腫瘍体積で５８％の低減を示していた（ｐ＝０．０１１）。これと比較して、ネラチニブ（３０ｍｇ／ｋｇ）で処置した動物は、ビヒクル対照と比較して増加した腫瘍体積（２８％）を示し（ｐ＝０．０２３）、かつアファチニブ（２０ｍｇ／ｋｇ）処置は、ビヒクル対照と比較して腫瘍成長に有意な影響を及ぼさなかった（図１８Ｆ、２５）。
ポジオチニブはＨＥＲ２変異を有するＮＳＣＬＣ患者において抗腫瘍活性を有する：これらの前臨床データおよびエクソン２０変異に対する以前に発表された研究（Ｒｏｂｉｃｈａｕｘ ｅｔ ａｌ，２０１８）に基づき、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０変異体ＮＳＣＬＣにおけるポジオチニブの医師主導型第ＩＩ相臨床試験（ＮＣＴ０３０６６２０６）を開始した。進行、死亡、または脱落まで、患者を毎日経口でのポジオチニブ１６ｍｇにより処置した。客観的奏効をＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１に基づき８週毎に評価した。ＨＥＲ２エクソン２０挿入変異を保有する最初の１２名の評価可能な患者のうち、６／１２（５０％）の患者は部分奏効（ＰＲ）の最良効果を有した。この奏効は、２ヶ月後に連続スキャンによって５／１２で確認された（確定客観的奏効率、４２％）（図１９Ａ）。これらの１２名の患者のうち、２名の患者は、最初の効果判定時に進行（ＰＤ）を有し、８３％の病勢コントロール率（ＤＣＲ）が得られた。２０１８年１２月の時点で、１２名の患者のうち１０名が継続中であり、最初の１２名の患者の中央値ＰＦＳは５．６ヶ月であった（図１９Ｂ）。これまで、この試験に含まれる全ての患者は、２つの最もよく見られるＨＥＲ２エクソン２０挿入、Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡおよびＧ７７８ｄｕｐＧＳＰのうち一方を保有した（図１９Ａ）。Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡ変異を有する１名のＮＳＣＬＣ患者の処置前および処置後（８週）の代表的な画像は、右肺において強い腫瘍の縮小を示した（図１９Ｃ）。前治療歴の数を含む患者特性は表３に認められる。加えて、ＨＥＲ２エクソン１９点変異、Ｌ７５５を保有する１名の多数の前処置を受けたＮＳＣＬＣ患者は、コンパッショネートケア使用プロトコール（Ｃ－ＩＮＤ１８－００１４）で処置された。患者は毎日１６ｍｇポジオチニブで処置され、４週で腫瘍の縮小を有した（図１９Ｄ、白枠）。患者は、ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１に準拠する安定（ＳＤ）（標的病変での－１２％減少）を有した。患者は、明らかな疾患進行が画像化され、ポジオチニブが中止されるまで、７ヶ月超にわたり病勢コントロールを有しポジオチニブを続けた。患者は、ポジオチニブ処置の最後に臨床的に良好であり、続けてさらなる全身治療を受けた。
ポジオチニブとＴ－ＤＭ１処置との組み合わせは抗腫瘍活性を増強する：ＨＥＲ２陽性乳がんモデルにおけるＨＥＲ２ ＴＫＩラパチニブおよびＥＧＦＲ変異体ＮＳＣＬＣモデルにおけるＥＧＦＲ阻害剤の以前の試験は、ＴＫＩ処置が細胞表面上での受容体蓄積の増加をもたらすこと、および増加した細胞表面ＨＥＲ２／ＥＧＦＲが抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）に対する感受性を増加させることを示している。ポジオチニブ処置が細胞表面上の総ＨＥＲ２受容体発現を増加させるかどうかを判定するために、細胞表面ＨＥＲ２発現を、低用量ポジオチニブ処置の２４時間後にＦＡＣＳにより分析した。平均して、ポジオチニブ処置が細胞表面ＨＥＲ２発現を２倍増加させる（図２０Ａ、ｐ＜０．０００１）ことが認められた。次に、ポジオチニブとＴ－ＤＭ１との組み合わせが細胞生存度をインビトロで低減させ得るかどうかを試験した、Ｔ－ＤＭ１単独はＭＣＦ１０Ａ ＨＥＲ２変異体細胞株の生存度を抑制しなかったが、Ｔ－ＤＭ１とポジオチニブとの組み合わせは、用量依存的にいずれかの作用物質単独より有意に低いＩＣ５０値をもたらしたことが認められた（図２０Ｂ）。これらの知見をインビボで検証するために、低用量のポジオチニブと単回用量のＴ－ＤＭ１との組み合わせをＨＥＲ２変異体ＮＳＣＬＣ ＰＤＸモデル、ＨＥＲ２ Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡで試験した（図２０Ｃ）。治療に対する反応を評価するために、最良効果からの腫瘍倍加までの時間として定義される、無増悪生存期間（ＰＦＳ）を決定した。ビヒクル対照を受けたマウスは、３日の中央値ＰＦＳ（ｍＰＦＳ）を有したのに対して、低用量のポジオチニブまたはＴ－ＤＭ１を受けたマウスはそれぞれ、１５日および２７日のｍＰＦＳを有した。しかしながら、低用量ポジオチニブとの組み合わせでの単回用量のＴ－ＤＭ１を受けた（１４／２０）マウスは、４５日目に無腫瘍状態のままであった（図２０Ｄ）。さらに、最良効果の時点、１５日目に、低用量ポジオチニブ（２．５ｍｇ／ｋｇ）と単回用量のＴ－ＤＭ１（１０ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせは、Ｔ－ＤＭ１単独を受けた２／９マウスまたは低用量ポジオチニブを受けた０／１２マウスと比較して、２０／２０マウス（１００％）で完全な腫瘍の退縮をもたらした（図２０Ｃ～Ｆ）。３０日目までに、腫瘍成長はＴ－ＤＭ１単独を受けた全てのマウスで始まったが；しかしながら、組み合わせ処置を受けた１４／２０マウスでは、腫瘍再発生のエビデンスはなかった（図２０Ｆ、Ｇ）。
さらなる試験によって、他のＴＫＩと比較したポジオチニブの有効性を検証した。ポジオチニブが、ＥＧＦＲ Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ ＰＤＸモデルにおいて高用量のオシメルチニブより効果的であったことが認められた（図２６）。また、ポジオチニブが、Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡを保有するＮＳＣＬＣのＰＤＸモデルにおいてネラチニブより高い抗腫瘍活性を有したことも示された（図２７）。単剤ポジオチニブは、Ｖ７７７Ｌを保有する乳がんＰＤＸモデルにおいてネラチニブより有効であった（図２８）。さまざまなＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０変異体インビボモデルにおけるポジオチニブ抗腫瘍活性の有効性の概要を図２９に示す。
（表３）表示したＥＧＦＲエクソン２０変異を発現するＢａ／Ｆ３細胞についての平均ＩＣ５０値の表。ＩＣ５０値を決定するために、Ｂａ／Ｆ３細胞を作製した。細胞を、１ウェルあたり２，０００個の細胞で３８４ウェルプレート中に技術的に三連で播種した。２４時間後、細胞を、１５０ｎＭから０．０１ｎＭの範囲の７種類の異なる用量のポジオチニブで処理した。パーセント生存率を決定し、ＤＭＳＯ処理した対照に対して正規化した。各生物学的反復実験（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）についてのＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでの非線形回帰モデリングを用いて計算した。平均値およびＳＥＭは、３つの独立した実験の代表値である。
Figure 2022527788000006
本明細書において、ＨＥＲ２変異はさまざまな腫瘍型で生じるが、特異的変異ホットスポットは悪性腫瘍ごとに異なっていることを報告する。さらに、ＨＥＲ２ ＴＫＩに対する感受性は、変異位置間で不均一であり、ＨＥＲ２エクソン２０挿入およびＬ７５５Ｐ変異は、おそらく薬物結合ポケットの体積の低減のために、ＨＥＲ２ ＴＫＩの大部分に対して耐性を有する。さらに、ポジオチニブは、ＨＥＲ２エクソン２０挿入およびＬ７５５Ｐ変異を有するＮＳＣＬＣ患者において臨床的有効性を有する強力な汎ＨＥＲ２変異体選択的阻害剤として特定された。最後に、ポジオチニブ処置は細胞表面上でのＨＥＲ２の蓄積を誘導すること、およびポジオチニブとＴ－ＤＭ１処置との組み合わせがインビトロおよびインビボでの抗腫瘍活性を増強させることを確立した。
汎がん分析は、ＨＥＲ２変異ホットスポットは、がんの種類ごとに異なっており、かつインビトロでＨＥＲ２ ＴＫＩに対して異なる感受性を有し、臨床的有効性に影響を及ぼす可能性があることを示している。ＳＵＭＭＩＴ試験では、ネラチニブは、乳がん患者において最も高い有効性を生じ、応答者の大部分がＬ７５５Ｓ、Ｖ７７７Ｌ、またはＬ８６９Ｒ変異について陽性であった。インビトロでのＢａ／Ｆ３薬物スクリーニングでは、これらの変異は低ＩＣ５０値と相関した。これに対して、結腸直腸がんを有する患者はネラチニブに反応しなかった。この臨床的観察と一致して、Ｖ８４２Ｉ変異は結腸直腸がんの症例で最もよく見られるＨＥＲ２変異であり、この特異的変異は薬物スクリーニングアッセイにおいてネラチニブに対して感受性を有さなかったことが認められた。これらのデータは、悪性腫瘍間での異なるＴＫＩ感受性が、一部において、がん特異的変異ホットスポットによって説明され、薬物感受性に直接影響を及ぼす可能性があることを示唆する。しかしながら、ＨＥＲ２変異の分布が腫瘍型ごとに異なっている理由、およびある特定の変異が異なる腫瘍型でも類似の薬物応答を生じるかどうかについて、重大な問題が残っている。ＳＵＭＭＩＴ試験からのデータは、特定のエクソン２０挿入は乳がん患者におけるネラチニブ感受性と関連したものの、これらの同一の変異は、全ての他のがんの種類では耐性と関連していることを示し、さらなる調査に値する感受性のこれらの腫瘍型特異的な差の根底にある潜在的なメカニズムが存在し得ることを示した。
エクソン２０挿入変異およびエクソン１９ Ｌ７５５Ｐ変異は、ほとんどのＨＥＲ２ ＴＫＩに対して耐性を有する。インビトロでの薬物スクリーニングは、エクソン２０挿入変異およびＬ７５５Ｐ変異が、試験した各ＴＫＩで最も高いＩＣ５０値を有したことを示した。分子動力学シミュレーションによって、これらの変異が、薬物結合ポケットの全体のサイズおよび可動性に影響を及ぼす立体構造の変化を誘導することが明らかにされた。まとめると、これらのインビトロおよびインシリコでの知見は、ＨＥＲ２エクソン２０挿入変異を有する患者は歴史的にＴＫＩに対する反応が乏しかったという臨床的観察と一致する。エクソン２０挿入が高い頻度で生じる肺がんでは、ＨＥＲ２エクソン２０挿入変異を保有する患者は、ネラチニブ、ダコミチニブ、およびアファチニブに対してそれぞれ、０％、１１．５％、および１８．２％～１８．８％の奏効率を有した。さらに、Ｌ７５５Ｓ変異はネラチニブに対して反応することが示されている一方で、Ｌ７５５Ｐ変異は、ＴＫＩおよび抗体－薬物コンジュゲートの両方に対して強い耐性を有する。
実施例４－材料および方法
ＨＥＲ２変異保有率およびバリアント頻度の分析：ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌ、Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、またはＧｕａｒｄａｎｔ Ｈｅａｌｔｈからのデータベースで報告された各ＨＥＲ２変異の頻度を決定するために、各データベースを個別に照会し、次いで、頻度を各データベースにおける患者の総数によって加重し、加重平均として報告する。ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌにおけるがんの種類間でのＨＥＲ２変異の頻度を決定するために、全非重複（ａｌｌ ｎｏｎ－ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）試験を選択し、エクスポートした。重複（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）試験では、最大のデータセットのみを用いた。ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ ＣｅｎｔｅｒでのＨＥＲ２変異頻度を決定するために、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙデータベースを、がんの種類に非依存的に全てのＨＥＲ２変異について照会した。Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ＭｅｄｉｃｉｎｅからのＨＥＲ２エクソン２０変異の頻度を決定するために、ＨＥＲ２欠失、フレームシフト、挿入、および点変異を有する患者の数の非特定化されたデータを表にし、５つ未満の変異を有するがんの種類を除外した。最後に、Ｇｕａｒｄａｎｔ ＨｅａｌｔｈでのＨＥＲ２エクソン２０変異の頻度を決定するために、Ｇｕａｒｄａｎｔ３６０臨床データベースを、ＥＲＢＢ２エクソン２０変異を有する２０１５年１０月から２０１８年５月の間に試験した試料（７０から７３遺伝子パネル）について照会した。Ｇｕａｒｄａｎｔ３６０（登録商標）は、７３種類までの遺伝子におけるＳＮＶ、ｉｎｄｅｌ、融合、およびＳＮＶを報告する、ＣＬＩＡ認証を受けたＣＡＰ／ＮＹＳＤＯＨ認可の網羅的ｃｆＤＮＡ ＮＧＳ検査である。次いで、Ｏｄｅｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ ２０１８で報告されたように、Ｇｕａｒｄａｎｔ Ｈｅａｌｔｈから報告された頻度を正規化し、臨床的感度を補正した。具体的には、頻度をパーセント臨床的感度、８５．９％で除算した。
Ｂａ／Ｆ３細胞株作製およびＩＬ－３欠乏：Ｂａ／Ｆ３細胞株を以前に記載されているように確立した。簡単に説明すると、１２時間にわたるＢａ／Ｆ３細胞株のレトロウイルス形質導入によって、安定Ｂａ／Ｆ３細胞株を作製した。リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、表１に要約したｐＢａｂｅ－Ｐｕｒｏベースのベクター（ＡｄｄｇｅｎｅおよびＢｉｏｉｎｎｏｖａｔｉｓｅ）をＰｈｏｅｎｉｘ ２９３Ｔ－ａｍｐｈｏ細胞（Ｏｒｂｉｇｅｎ）にトランスフェクトすることによって、レトロウイルスを作製した。形質導入の３日後に、２μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＲＰＭＩ培地に添加した。５日間の選択の後、細胞をＦＩＴＣ－ＨＥＲ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、ＦＡＣＳにより選別した。次いで、ＩＬ－３の非存在下で細胞株を２週間増殖させ、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｇｅｍａ）を用いて３日毎に細胞生存度を評価した。結果として得られた安定細胞株を、ＩＬ－３を含まない１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地中で維持した。
細胞生存度アッセイおよびＩＣ５０推定：以前に記載された（Ｒｏｂｉｃｈａｕｘ ｅｔ ａｌ，２０１８）ように、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞生存度を測定した。簡単に説明すると、３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）に、１ウェルあたり２０００～３０００個の細胞を技術的に三連で播種した。細胞を、１ウェルあたり４０μＬの最終体積で７種類の異なる濃度のチロシンキナーゼ阻害剤またはビヒクル単独で処理した。３日後、１１μＬのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏを各ウェルに添加した。プレートを１５分間振とうし、ＦＬＵＯｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡマルチモードマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）を用いて、生物発光を測定した。生物発光の値をＤＭＳＯ処理細胞に対して正規化し、正規化した値を、可変傾斜を用いる正規化データに対する非線形回帰フィットを用いてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにてプロットした。ＩＣ５０値を５０％阻害でＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにより計算した。
リン酸化ＨＥＲ２および総ＨＥＲ２についてのＥＬＩＳＡならびにＩＣ５０値との相関関係：上記に記載される親Ｂａ／Ｆ３細胞株およびＨＥＲ２変異を発現するＢａ／Ｆ３細胞株の各々から、タンパク質を回収した。５μｇ／ｍｌのタンパク質を各ＥＬＩＳＡプレートに添加し、リン酸化ＨＥＲ２（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃７９６８）および総ＨＥＲ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃７３１０）について製造元の指示書に記載されているようにＥＳＬＩＳＡを実施した。ＥＬＩＳＡにより決定された総ＨＥＲ２に対するｐ－ＨＥＲ２の比率を得ることによって、相対的ｐ－ＨＥＲ２発現を測定した。相対的ｐ－ＨＥＲ２比率を、上記のように計算したポジオチニブＩＣ５０値に対してプロットした。ピアソン相関係数およびｐ値をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって決定した。
チロシンキナーゼ阻害剤およびＴ－ＤＭ１：ＭｅｄＣｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓから購入したＥＧＦ８１６およびピロチニブを除いて、全ての阻害剤をＳｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌから購入した。全ての阻害剤をＤＭＳＯで１０ｍＭの濃度にて溶解し、－８０℃で貯蔵した。阻害剤は、２回の凍結融解サイクルの後には廃棄されるように制限した。Ｔ－ＤＭ１は、Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒの施設内薬局から購入し、再構成した。
分子動力学シミュレーション：ＨＥＲ２変異体のタンパク質構造モデルを、ＭＯＥコンピュータプログラム（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ）を用いて、インシリコ変異をＰＤＢ ３ＰＰ０ Ｘ線構造に導入することによって構築した。ＮＡＭＤシミュレーションパッケージを用いて、古典および加速分子動力学シミュレーションを実施した。さらなる詳細を補足情報（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）欄において提供する。
ヒト細胞株：ＭＣＦ１０Ａ細胞をＡＴＣＣから購入し、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、５％ウマ血清（ｓｉｇｍａ）、２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、０．５ｍｇ／ｍｌヒドロコルチゾン、および１０μｇ／ｍｌインスリンを追加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養した。レトロウイルス形質導入によって、安定発現細胞株を作出し、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて表１に要約したｐＢａｂｅ－Ｐｕｒｏベースのベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｎｏｖａｔｉｓｅ）をＰｈｏｅｎｉｘ ２９３Ｔ－ａｍｐｈｏ細胞（Ｏｒｂｉｇｅｎ）にトランスフェクトすることによって、レトロウイルスを作製した。形質導入の２日後、０．５μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＲＰＭＩ培地に添加した。１４日間の選択の後、細胞を上記のような細胞生存度アッセイで試験した。ＣＷ－２細胞はＭＴＡ下でＲｉｋｅｎ細胞株データベースによって提供され、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ中で維持された。
インビボ異種移植片試験：ＣＷ－２細胞株異種移植片を、５０％マトリゲル中の１×１０６個の細胞を６週齢のメスｎｕ／ｎｕヌードマウスに注入することによって、作出した。腫瘍が３５０ｍｍ３に達したら、マウスを４群：２０ｍｇ／ｋｇアファチニブ、５ｍｇ／ｋｇポジオチニブ、３０ｍｇ／ｋｇネラチニブ、またはビヒクル対照（ｄＨ２Ｏ中に、０．５％メチルセルロール、２％Ｔｗｅｅｎ－８０）に無作為化した。腫瘍体積を週に３回測定した。マウスは月曜日～金曜日（週に５日）薬物を受けたが、水曜日に投与を始め、最初の３日の投与後に２日の休薬日を与えた。
Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡ ＰＤＸマウスをＪａｘ Ｌａｂｓから購入した（Ｍｏｄｅｌ＃ＴＭ０１４４６）。ＨＥＲ２ Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡを発現する腫瘍由来の断片を、５～６週齢のメスＮＳＧマウス（Ｊａｘ Ｌａｂｓ ＃００５５５７）に接種した。マウスを週に３回測定し、腫瘍が２００～３００ｍｍ３の体積に達したら、マウスを以下の４つの処置群に無作為化した：ビヒクル対照（ｄＨ２Ｏ中に、０．５％メチルセルロール、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－８０）、２．５ｍｇ／ｋｇポジオチニブ、１０ｍｇ／ｋｇ Ｔ－ＤＭ１、または２．５ｍｇ／ｋｇポジオチニブと１０ｍｇ／ｋｇ Ｔ－ＤＭ１との組み合わせ。腫瘍体積および体重を週に３回測定した。２．５ｍｇ／ｋｇポジオチニブで処置されるマウスは、薬物を月曜日～金曜日（週に５日）に経口で受けた。１０ｍｇ／ｋｇ Ｔ－ＤＭ１で処置されるマウスは、無作為化の日にＴ－ＤＭ１の１回の静脈内（ＩＶ）投与を受けた。ポジオチニブとＴ－ＤＭ１との組み合わせで処置されるマウスは、Ｔ－ＤＭ１の１回ＩＶ投与を受け、Ｔ－ＤＭ１の投与の３日後に、週に５日２．５ｍｇ／ｋｇポジオチニブを開始した。マウスの体重が１０％を上回って低下するか、または２０グラム未満に低下した場合には、マウスに投与の休みを与えた。無増悪生存期間は、２回の連続する測定での最良奏効から腫瘍倍加までとして定義された。完全退縮は、腫瘍量の９５％を上回る減少として定義され、完全退縮を伴うマウスでは、腫瘍倍加は、３回以上の連続する測定で７５ｍｍ３を上回ると定義された。実験は、Ｇｏｏｄ Ａｎｉｍａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓにしたがって、ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）の承認を得て、完了した。
（表３）安定細胞株を作製するために用いられるベクター
Figure 2022527788000007
（表４）データベース全体でのがんの種類ごとの患者の総数
Figure 2022527788000008
（表５）患者特性および前治療歴の数
Figure 2022527788000009
ＦＡＣＳ：ＨＥＲ２変異を過剰発現するＭＣＦ１０Ａ細胞を６ウェルプレート中に一晩播種し、次いで、１０ｎＭポジオチニブで処理した。２４時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン処理した。次いで、細胞をＰＢＳ中０．５％のＦＢＳで再懸濁し、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（＃３２４４０４）からの抗ＨＥＲ２－ＦＩＴＣ抗体により氷上で４５分間染色した。細胞をＰＢＳ中０．５％ＦＢＳで２回洗浄し、フローサイトメトリーにより分析した。ＩｇＧおよび未染色対照をゲーティングに用いた。
ウエスタンブロッティング：ウエスタンブロッティングのために、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＰＡ溶解バッファー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびプロテアーゼ阻害剤カクテル錠（Ｒｏｃｈｅ）で溶解した。タンパク質（３０～４０μｇ）を、ＢｉｏＲａｄから購入したゲルにロードした。ＢｉｏＲａｄセミドライトランスファーを用い、次いで、ｐＨＥＲ２、ＨＥＲ２、ｐＰＩ３Ｋ、ＰＩ３Ｋ、ｐ－ＡＫＴ、ＡＫＴ、ｐ－ＥＲＫ１／２、およびＥＲＫ１／２（１：１０００；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に対する抗体を用いてプローブした。ブロットを、ローディング対照としてビンクリンまたはβ－アクチンに対する抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でプローブし、ＥＣＬウエスタンブロッティング基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて曝露した。
ＨＥＲ２発現レベルおよびＢａ／Ｆ３変異体ＩＣ５０との相関性：タンパク質をＢａ／Ｆ細胞株から回収し、総ＨＥＲ２について製造元の指示書により記載されるようにＥＬＩＳＡを実施した（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃７３１０）。ＥＬＩＳＡにより測定された相対的発現を、上記のように計算されたＩＣ５０値に対してプロットした。ピアソン相関係数およびｐ値をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって決定した。
臨床試験およびＣＩＮＤ識別番号：患者は、コンパッショネート使用プロトコール（ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ ＣＩＮＤ－１８－００１４）または臨床試験ＮＣＴ０３０６６２０６のいずれかでのポジオチニブによる処置に対する書面でのインフォームドコンセントを提出した。プロトコールはＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ施設内審査委員会およびアメリカ食品医薬品局（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）の両方により認可を受けている。
本明細書において開示され、特許請求される方法の全ては、本開示に照らして、過度の実験を行うことなく、構築および実施することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関連して説明されてきたが、当業者には、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書において記載された方法および工程、または方法の工程の順序に変更が適用されてもよいことが、明らかであろう。より具体的には、化学的および生理的に関連する特定の薬剤が本明細書に記載の薬剤の代わりに用いられてもよく、それらが同じまたは同様の結果に到達し得ることは、明らかであろう。当業者には明らかである全てのかかる同様の置換および修飾は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲、および概念の範囲内であるとみなされる。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に示された参考文献を補足する例示的な手順的なまたは他の詳細を提供するものであり、参照により本明細書に具体的に取り込まれる。
Figure 2022527788000010
Figure 2022527788000011
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Claims (123)

  1. 対象においてがんを治療する方法であって、有効量のポジオチニブを該対象に投与する工程を含み、該対象が、１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異を有すると判定されている、該方法。
  2. 前記ポジオチニブがポジオチニブ塩酸塩としてさらに定義される、請求項１記載の方法。
  3. 前記ポジオチニブ塩酸塩が錠剤として製剤化される、請求項２記載の方法。
  4. 前記１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異が、ＥＧＦＲ２０挿入変異としてさらに定義される、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
  5. 前記１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異が、デノボＥＧＦＲ２０挿入変異としてさらに定義される、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
  6. 前記１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異が、アミノ酸７６３～７７８に点変異、挿入、および／または３～１８個のヌクレオチドの欠失を含む、請求項１～５のいずれか一項記載の方法。
  7. 前記対象が、２つ、３つ、または４つのＥＧＦＲエクソン２０変異を有すると判定されている、請求項１～６のいずれか一項記載の方法。
  8. 前記１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異がＴ７９０Ｍおよび／またはＣ７９７Ｓではない、請求項１～７のいずれか一項記載の方法。
  9. 前記対象がチロシンキナーゼ阻害剤を以前に投与されたことがある、請求項１～８のいずれか一項記載の方法。
  10. 前記対象が、以前に投与されたチロシンキナーゼ阻害剤に対して耐性を有する、請求項９記載の方法。
  11. 前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ラパチニブ、アファチニブ、ダコミチニブ、オシメルチニブ、イブルチニブ、ナザルチニブ、またはベラチニブ（ｂｅｒａｔｉｎｉｂ）である、請求項１０記載の方法。
  12. 前記１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異が、Ａ７６３、Ａ７６７、Ｓ７６８、Ｖ７６９、Ｄ７７０、Ｎ７７１、Ｐ７７２、Ｈ７７３、およびＶ７７４からなる群より選択される１つ以上の残基に存在する、請求項１～１１のいずれか一項記載の方法。
  13. 前記１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異が、Ａ７６３、Ａ７６７、Ｓ７６８、Ｖ７６９、Ｄ７７０、Ｎ７７１、Ｐ７７２、Ｈ７７３、Ｖ７７４、およびＲ７７６からなる群より選択される１つ以上の残基に存在する、請求項１～１２のいずれか一項記載の方法。
  14. 前記対象が、残基Ｃ７９７にＥＧＦＲ変異を有さないと判定されている、請求項１～１３のいずれか一項記載の方法。
  15. 前記１つ以上のエクソン２０変異が、Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＦＨ、Ｎ７７１ｄｕｐＮＰＨ、Ａ７６７ｉｎｓＴＬＡ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＶＶ、Ｖ７６９Ｌ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＳＶ、Ｖ７６９ｉｎｓ ＭＡＳＶＤ、Ｄ７７０ｄｅｌ ｉｎｓ ＧＹ、Ｄ７７０ｉｎｓＧ、Ｄ７７０ｉｎｓＹ Ｈ７７３Ｙ、Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤＮＲ、Ｎ７７１ｉｎｓＨＨ、Ｐ７７２ｉｎｓＤＮＰ、Ｈ７７３ｉｎｓＡＨ、Ｈ７７３ｉｎｓＨ、およびＶ７７４ｉｎｓＨＶからなる群より選択される、請求項１～１４のいずれか一項記載の方法。
  16. 前記１つ以上のエクソン２０変異が、Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６３ｉｎｓＬＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｓ７６８Ｉ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＦＨ、Ｎ７７１ｄｕｐＮＰＨ、Ａ７６７ｉｎｓＴＬＡ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＶＶ、Ｖ７６９Ｌ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＳＶ、Ｖ７６９ｉｎｓ ＭＡＳＶＤ、Ｄ７７０ｄｅｌ ｉｎｓ ＧＹ、Ｄ７７０ｉｎｓＧ、Ｄ７７０ｉｎｓＹ Ｈ７７３Ｙ、Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤＮＲ、Ｎ７７１ｉｎｓＨＨ、Ｎ７７１ｄｕｐＮ、Ｐ７７２ｉｎｓＤＮＰ、Ｈ７７３ｉｎｓＡＨ、Ｈ７７３ｉｎｓＨ、Ｖ７７４Ｍ、Ｖ７７４ｉｎｓＨＶ、Ｒ７７６Ｈ、およびＲ７７６Ｃからなる群より選択される、請求項１～１５のいずれか一項記載の方法。
  17. 前記エクソン２０変異がＤ７７０ｉｎｓＮＰＧである、請求項１～１６のいずれか一項記載の方法。
  18. 患者由来のゲノム試料を分析することにより、前記対象がＥＧＦＲエクソン２０変異を有すると判定された、請求項１～１７のいずれか一項記載の方法。
  19. 前記ゲノム試料が、唾液、血液、尿、正常組織、または腫瘍組織から単離される、請求項１９記載の方法。
  20. ＥＧＦＲエクソン２０変異の存在が、核酸配列決定またはＰＣＲ分析によって判定される、請求項１～１９のいずれか一項記載の方法。
  21. 前記ポジオチニブが経口的に投与される、請求項１～２０のいずれか一項記載の方法。
  22. 前記ポジオチニブが５～２５ｍｇの用量で投与される、請求項１～２１のいずれか一項記載の方法。
  23. 前記ポジオチニブが、８ｍｇ、１２ｍｇ、または１６ｍｇの用量で投与される、請求項１～２２のいずれか一項記載の方法。
  24. 前記ポジオチニブが毎日投与される、請求項１～２３のいずれか一項記載の方法。
  25. 前記ポジオチニブが継続的に投与される、請求項１～２４のいずれか一項記載の方法。
  26. 前記ポジオチニブが２８日サイクルで投与される、請求項１～２５のいずれか一項記載の方法。
  27. さらなる抗がん療法を実施する工程をさらに含む、請求項１～２６のいずれか一項記載の方法。
  28. 前記さらなる抗がん療法が、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法、または免疫療法である、請求項２７記載の方法。
  29. 前記ポジオチニブ投与および／または抗がん療法が、静脈内に、皮下に、骨内に、経口的に、経皮的に、持続型放出にて、制御型放出にて、遅延型放出にて、坐剤として、または舌下に、実施される、請求項２７または２８記載の方法。
  30. 前記ポジオチニブを投与することおよび／または抗がん療法を実施することが、局所的実施、局部的実施、または全身的実施を含む、請求項２７～３０のいずれか一項記載の方法。
  31. 前記ポジオチニブ投与および／または抗がん療法が２回以上実施される、請求項２７～３１のいずれか一項記載の方法。
  32. 前記がんが、口腔がん、中咽頭がん、上咽頭がん、呼吸器がん、泌尿生殖器がん、消化器がん、中枢神経系組織もしくは末梢神経系組織のがん、内分泌もしくは神経内分泌がんまたは造血系のがん、神経膠腫、肉腫、がん腫、リンパ腫、黒色腫、線維腫、髄膜腫、脳がん、中咽頭がん、上咽頭がん、腎臓がん、胆道がん、褐色細胞腫、膵島細胞がん、リー・フラウメニ腫瘍、甲状腺がん、副甲状腺がん、下垂体腫瘍、副腎腫瘍、骨肉腫、多発性神経内分泌腫瘍Ｉ型およびＩＩ型、乳がん、肺がん、頭頸部がん、前立腺がん、食道がん、気管がん、肝臓がん、膀胱がん、胃がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、精巣がん、結腸がん、直腸がん、または皮膚がんである、請求項１～３１のいずれか一項記載の方法。
  33. 前記がんが非小細胞肺がんである、請求項１～３２のいずれか一項記載の方法。
  34. 前記患者がヒトである、請求項１～３３のいずれか一項記載の方法。
  35. １つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異を有すると判定された対象において使用するための、ポジオチニブを含む薬学的組成物。
  36. 経口組成物としてさらに定義される、請求項３５記載の組成物。
  37. ５～２５ｍｇのポジオチニブを含む、請求項３５または３６記載の組成物。
  38. ８ｍｇ、１２ｍｇ、または１６ｍｇのポジオチニブを含む、請求項３５～３７のいずれか一項記載の組成物。
  39. 前記ポジオチニブがポジオチニブ塩酸塩としてさらに定義される、請求項３５～３８のいずれか一項記載の組成物。
  40. 錠剤として製剤化されている、請求項３５～３９のいずれか一項記載の組成物。
  41. 前記１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異が、ＥＧＦＲ２０挿入変異としてさらに定義される、請求項３５～４０のいずれか一項記載の組成物。
  42. 前記１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異が、デノボＥＧＦＲ２０挿入変異としてさらに定義される、請求項３５～４１のいずれか一項記載の組成物。
  43. 前記１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異が、アミノ酸７６３～７７８に点変異、挿入、および／または３～１８個のヌクレオチドの欠失を含む、請求項３５～４２のいずれか一項記載の組成物。
  44. 前記対象が、２つ、３つ、または４つのＥＧＦＲエクソン２０変異を有すると判定されている、請求項３５～４３のいずれか一項記載の組成物。
  45. 前記１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異がＴ７９０Ｍおよび／またはＣ７９７Ｓではない、請求項３５～４４のいずれか一項記載の組成物。
  46. １つ以上のＥＧＦＲエクソン２０挿入変異が、Ａ７６３、Ａ７６７、Ｓ７６８、Ｖ７６９、Ｄ７７０、Ｎ７７１、Ｐ７７２、Ｈ７７３、およびＶ７７４からなる群より選択される１つ以上の残基に存在する、請求項３５～４５のいずれか一項記載の組成物。
  47. 前記１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０挿入変異が、Ａ７６３、Ａ７６７、Ｓ７６８、Ｖ７６９、Ｄ７７０、Ｎ７７１、Ｐ７７２、Ｈ７７３、Ｖ７７４、およびＲ７７６からなる群より選択される１つ以上の残基に存在する、請求項３５～４６のいずれか一項記載の組成物。
  48. 前記対象が、残基Ｃ７９７にＥＧＦＲ変異を有さないと判定されている、請求項３５～４７のいずれか一項記載の組成物。
  49. 前記１つ以上のエクソン２０変異が、Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＦＨ、Ｎ７７１ｄｕｐＮＰＨ、Ａ７６７ｉｎｓＴＬＡ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＶＶ、Ｖ７６９Ｌ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＳＶ、Ｖ７６９ｉｎｓ ＭＡＳＶＤ、Ｄ７７０ｄｅｌ ｉｎｓ ＧＹ、Ｄ７７０ｉｎｓＧ、Ｄ７７０ｉｎｓＹ Ｈ７７３Ｙ、Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤＮＲ、Ｎ７７１ｉｎｓＨＨ、Ｐ７７２ｉｎｓＤＮＰ、Ｈ７７３ｉｎｓＡＨ、Ｈ７７３ｉｎｓＨ、およびＶ７７４ｉｎｓＨＶからなる群より選択される、請求項３５～４８のいずれか一項記載の組成物。
  50. 前記１つ以上のエクソン２０変異が、Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６３ｉｎｓＬＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｓ７６８Ｉ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＦＨ、Ｎ７７１ｄｕｐＮＰＨ、Ａ７６７ｉｎｓＴＬＡ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＶＶ、Ｖ７６９Ｌ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＳＶ、Ｖ７６９ｉｎｓ ＭＡＳＶＤ、Ｄ７７０ｄｅｌ ｉｎｓ ＧＹ、Ｄ７７０ｉｎｓＧ、Ｄ７７０ｉｎｓＹ Ｈ７７３Ｙ、Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤＮＲ、Ｎ７７１ｉｎｓＨＨ、Ｎ７７１ｄｕｐＮ、Ｐ７７２ｉｎｓＤＮＰ、Ｈ７７３ｉｎｓＡＨ、Ｈ７７３ｉｎｓＨ、Ｖ７７４Ｍ、Ｖ７７４ｉｎｓＨＶ、Ｒ７７６Ｈ、およびＲ７７６Ｃからなる群より選択される、請求項３５～４９のいずれか一項記載の組成物。
  51. 患者が抗がん療法によって治療中である、請求項３５～５０のいずれか一項記載の組成物。
  52. がんを有する対象において、ポジオチニブ単独または第２の抗がん療法と組み合わせたポジオチニブに対する応答性を予測する方法であって、患者から得られたゲノム試料においてＥＧＦＲエクソン２０変異を検出する工程を含み、該試料が該ＥＧＦＲエクソン２０変異の存在について陽性である場合に、該患者が、ポジオチニブ単独または抗がん療法と組み合わせたポジオチニブに対して好ましい応答性を有すると予測される、該方法。
  53. 前記ＥＧＦＲエクソン２０変異がエクソン２０挿入変異としてさらに定義される、請求項５２記載の方法。
  54. 前記ゲノム試料が、唾液、血液、尿、正常組織、または腫瘍組織から単離される、請求項５２または５３記載の方法。
  55. ＥＧＦＲエクソン２０変異の存在が、核酸配列決定またはＰＣＲ分析によって判定される、請求項５２～５４のいずれか一項記載の方法。
  56. 前記ＥＧＦＲエクソン２０変異が、アミノ酸７６３～７７８に点変異、挿入、および／または３～１８個のヌクレオチドの欠失を含む、請求項５２～５５のいずれか一項記載の方法。
  57. １つ以上の前記ＥＧＦＲエクソン２０変異がＴ７９０Ｍおよび／またはＣ７９７Ｓではない、請求項５２～５６のいずれか一項記載の方法。
  58. 前記ＥＧＦＲエクソン２０変異が、残基Ａ７６３、Ａ７６７、Ｓ７６８、Ｖ７６９、Ｄ７７０、Ｎ７７１、Ｐ７７２、Ｈ７７３、および／またはＶ７７４に存在する、請求項５２～５７のいずれか一項記載の方法。
  59. 前記ＥＧＦＲエクソン２０変異が、残基Ａ７６３、Ａ７６７、Ｓ７６８、Ｖ７６９、Ｄ７７０、Ｎ７７１、Ｐ７７２、Ｈ７７３、Ｖ７７４、および／またはＲ７７６に存在する、請求項５２～５８のいずれか一項記載の方法。
  60. 前記ＥＧＦＲエクソン２０変異が、Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＦＨ、Ｎ７７１ｄｕｐＮＰＨ、Ａ７６７ｉｎｓＴＬＡ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＶＶ、Ｖ７６９Ｌ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＳＶ、Ｖ７６９ｉｎｓ ＭＡＳＶＤ、Ｄ７７０ｄｅｌ ｉｎｓ ＧＹ、Ｄ７７０ｉｎｓＧ、Ｄ７７０ｉｎｓＹ Ｈ７７３Ｙ、Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤＮＲ、Ｎ７７１ｉｎｓＨＨ、Ｐ７７２ｉｎｓＤＮＰ、Ｈ７７３ｉｎｓＡＨ、Ｈ７７３ｉｎｓＨ、およびＶ７７４ｉｎｓＨＶからなる群より選択される、請求項５２～５９のいずれか一項記載の方法。
  61. 前記ＥＧＦＲエクソン２０変異が、Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６３ｉｎｓＬＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｓ７６８Ｉ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＦＨ、Ｎ７７１ｄｕｐＮＰＨ、Ａ７６７ｉｎｓＴＬＡ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＶＶ、Ｖ７６９Ｌ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＳＶ、Ｖ７６９ｉｎｓ ＭＡＳＶＤ、Ｄ７７０ｄｅｌ ｉｎｓ ＧＹ、Ｄ７７０ｉｎｓＧ、Ｄ７７０ｉｎｓＹ Ｈ７７３Ｙ、Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤＮＲ、Ｎ７７１ｉｎｓＨＨ、Ｎ７７１ｄｕｐＮ、Ｐ７７２ｉｎｓＤＮＰ、Ｈ７７３ｉｎｓＡＨ、Ｈ７７３ｉｎｓＨ、Ｖ７７４Ｍ、Ｖ７７４ｉｎｓＨＶ、Ｒ７７６Ｈ、およびＲ７７６Ｃからなる群より選択される、請求項５２～６０のいずれか一項記載の方法。
  62. ポジオチニブ単独または抗がん療法と組み合わせたポジオチニブに対する好ましい応答性が、腫瘍の大きさもしくは腫瘍量の減少、腫瘍成長の阻止、腫瘍関連疼痛の軽減、がん関連病態の軽減、がん関連症状の軽減、がんの非進行、無病期間の延長、進行までの期間の延長、寛解の誘導、転移の減少、または患者の生存性の向上を含む、請求項５２～６１のいずれか一項記載の方法。
  63. 好ましい応答性を有すると予測された前記患者に、ポジオチニブを単独でまたは第２の抗がん療法と組み合わせて投与する工程をさらに含む、請求項５２～６２のいずれか一項記載の方法。
  64. 前記ポジオチニブが経口的に投与される、請求項５２～６３のいずれか一項記載の方法。
  65. 前記ポジオチニブが５～２５ｍｇの用量で投与される、請求項５２～６４のいずれか一項記載の方法。
  66. 前記ポジオチニブが８ｍｇ、１２ｍｇ、または１６ｍｇの用量で投与される、請求項６２～６５のいずれか一項記載の方法。
  67. 前記ポジオチニブがポジオチニブ塩酸塩としてさらに定義される、請求項６２～６６のいずれか一項記載の方法。
  68. 前記ポジオチニブ塩酸塩が錠剤として製剤化される、請求項６２～６７のいずれか一項記載の方法。
  69. 対象においてがんを治療する方法であって、有効量のポジオチニブまたはアファチニブを該対象に投与する工程を含み、該対象が、Ａ７７５ｉｎｓＶ Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｖ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＶ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＣ、Ｐ７８０ｉｎｓＧＳＰ、Ｖ７７７Ｌ、Ｇ７７８ｉｎｓＬＰＳ、Ｖ７７３Ｍ、Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＬＣ、Ｇ７７８ｄｕｐＧＳＰ、Ｖ７７７ｉｎｓＣＧ、Ｇ７７６Ｖ／Ｓ、Ｖ７７７Ｍ、Ｍ７７４ｄｕｐＭ、Ａ７７５ｉｎｓＳＶＭＡ、Ａ７７５ｉｎｓＶＡ、およびＬ７８６Ｖからなる群より選択される１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異を有すると判定されている、該方法。
  70. 前記１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異が、Ａ７７５ｉｎｓＶ Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｖ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＶ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＣ、Ｐ７８０ｉｎｓＧＳＰ、Ｖ７７７Ｌ、Ｇ７７８ｉｎｓＬＰＳ、およびＶ７７３Ｍからなる群より選択される、請求項６９記載の方法。
  71. 前記ポジオチニブが経口的に投与される、請求項６９または７０記載の方法。
  72. 前記ポジオチニブが５～２５ｍｇの用量で投与される、請求項６９～７１のいずれか一項記載の方法。
  73. 前記ポジオチニブが、８ｍｇ、１２ｍｇ、または１６ｍｇの用量で投与される、請求項６９～７２のいずれか一項記載の方法。
  74. 前記ポジオチニブがポジオチニブ塩酸塩としてさらに定義される、請求項６９～７３のいずれか一項記載の方法。
  75. 前記ポジオチニブ塩酸塩が錠剤として製剤化される、請求項６９～７４のいずれか一項記載の方法。
  76. 前記１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異が、アミノ酸７７０～７８５に１つ以上の点変異、挿入、および／または３～１８個のヌクレオチドの欠失をさらに含む、請求項６９～７５のいずれか一項記載の方法。
  77. 前記１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異が、残基Ｙ７７２、Ａ７７５、Ｍ７７４、Ｇ７７６、Ｇ７７８、Ｖ７７７、Ｓ７７９、Ｐ７８０、および／またはＬ７８６に存在する、請求項６９～７６のいずれか一項記載の方法。
  78. 前記１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異が、残基Ｖ７７３、Ａ７７５、Ｇ７７６、Ｖ７７７、Ｇ７７８、Ｓ７７９、および／またはＰ７８０に存在する、請求項６９～７６のいずれか一項記載の方法。
  79. 前記ＨＥＲエクソン２０変異がＨＥＲ２エクソン２０挿入変異としてさらに定義される、請求項６９～７８のいずれか一項記載の方法。
  80. 前記ＨＥＲエクソン２０挿入変異がＡ７７５ｉｎｓＹＶＭＡである、請求項６９～７９のいずれか一項記載の方法。
  81. ｍＴＯＲ阻害剤を投与する工程をさらに含む、請求項６９～８０のいずれか一項記載の方法。
  82. 前記ｍＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、リダフォロリムス、またはＭＬＮ４９２４である、請求項８１記載の方法。
  83. 前記ｍＴＯＲ阻害剤がエベロリムスである、請求項８１記載の方法。
  84. 前記ポジオチニブもしくはアファチニブおよび／または前記ｍＴＯＲ阻害剤が、静脈内に、皮下に、骨内に、経口的に、経皮的に、持続型放出にて、制御型放出にて、遅延型放出にて、坐剤として、または舌下に、投与される、請求項８１記載の方法。
  85. 患者由来のゲノム試料を分析することにより、前記対象がＨＥＲ２エクソン２０変異を有すると判定された、請求項６９～８４のいずれか一項記載の方法。
  86. 前記ゲノム試料が、唾液、血液、尿、正常組織、または腫瘍組織から単離される、請求項８５記載の方法。
  87. ＨＥＲ２エクソン２０変異の存在が、核酸配列決定またはＰＣＲ分析によって判定される、請求項６９～８６のいずれか一項記載の方法。
  88. さらなる抗がん療法を実施する工程をさらに含む、請求項６９～８７のいずれか一項記載の方法。
  89. 前記さらなる抗がん療法が、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法、または免疫療法である、請求項６９～８８のいずれか一項記載の方法。
  90. 前記がんが、口腔がん、中咽頭がん、上咽頭がん、呼吸器がん、泌尿生殖器がん、消化器がん、中枢神経系組織もしくは末梢神経系組織のがん、内分泌もしくは神経内分泌がんまたは造血系のがん、神経膠腫、肉腫、がん腫、リンパ腫、黒色腫、線維腫、髄膜腫、脳がん、中咽頭がん、上咽頭がん、腎臓がん、胆道がん、褐色細胞腫、膵島細胞がん、リー・フラウメニ腫瘍、甲状腺がん、副甲状腺がん、下垂体腫瘍、副腎腫瘍、骨肉腫、多発性神経内分泌腫瘍Ｉ型およびＩＩ型、乳がん、肺がん、頭頸部がん、前立腺がん、食道がん、気管がん、肝臓がん、膀胱がん、胃がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、精巣がん、結腸がん、直腸がん、または皮膚がんである、請求項６９～８９のいずれか一項記載の方法。
  91. 前記がんが非小細胞肺がんである、請求項６９～９０のいずれか一項記載の方法。
  92. 前記対象がヒトである、請求項６９～９１のいずれか一項記載の方法。
  93. Ａ７７５ｉｎｓＶ Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｖ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＶ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＣ、Ｐ７８０ｉｎｓＧＳＰ、Ｖ７７７Ｌ、Ｇ７７８ｉｎｓＬＰＳ、Ｖ７７３Ｍ、Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＬＣ、Ｇ７７８ｄｕｐＧＳＰ、Ｖ７７７ｉｎｓＣＧ、Ｇ７７６Ｖ／Ｓ、Ｖ７７７Ｍ、Ｍ７７４ｄｕｐＭ、Ａ７７５ｉｎｓＳＶＭＡ、Ａ７７５ｉｎｓＶＡ、およびＬ７８６Ｖからなる群より選択される１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異を有すると判定された対象において使用するための、ポジオチニブまたはアファチニブを含む薬学的組成物。
  94. 前記１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異が、Ａ７７５ｉｎｓＶ Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｖ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＶ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＣ、Ｐ７８０ｉｎｓＧＳＰ、Ｖ７７７Ｌ、Ｇ７７８ｉｎｓＬＰＳ、およびＶ７７３Ｍからなる群より選択される、請求項９３記載の組成物。
  95. 前記ＨＥＲ２エクソン２０変異がＨＥＲ２エクソン２０挿入変異としてさらに定義される、請求項９３または９４記載の組成物。
  96. 前記ＨＥＲ２エクソン２０変異が、アミノ酸７７０～７８５に１つ以上の点変異、挿入、および／または３～１８個のヌクレオチドの欠失をさらに含む、請求項９３～９５のいずれか一項記載の組成物。
  97. 前記１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異が、残基Ｙ７７２、Ａ７７５、Ｍ７７４、Ｇ７７６、Ｇ７７８、Ｖ７７７、Ｓ７７９、Ｐ７８０、および／またはＬ７８６に存在する、請求項９３～９６のいずれか一項記載の組成物。
  98. 前記１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異が、残基Ｖ７７３、Ａ７７５、Ｇ７７６、Ｖ７７７、Ｇ７７８、Ｓ７７９、および／またはＰ７８０に存在する、請求項９３～９６のいずれか一項記載の組成物。
  99. 患者が抗がん療法によって治療中である、請求項９３～９８のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  100. がんを有する対象において、ポジオチニブ単独もしくはアファチニブ単独または抗がん療法と組み合わせたポジオチニブもしくはアファチニブに対する応答性を予測する方法であって、該対象から得られたゲノム試料において、Ａ７７５ｉｎｓＶ Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｖ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＶ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＣ、Ｐ７８０ｉｎｓＧＳＰ、Ｖ７７７Ｌ、Ｇ７７８ｉｎｓＬＰＳ、Ｖ７７３Ｍ、Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＬＣ、Ｇ７７８ｄｕｐＧＳＰ、Ｖ７７７ｉｎｓＣＧ、Ｇ７７６Ｖ／Ｓ、Ｖ７７７Ｍ、Ｍ７７４ｄｕｐＭ、Ａ７７５ｉｎｓＳＶＭＡ、Ａ７７５ｉｎｓＶＡ、およびＬ７８６Ｖからなる群より選択されるＨＥＲ２エクソン２０変異を検出する工程を含み、該試料がＨＥＲ２エクソン２０変異の存在について陽性である場合に、患者が、ポジオチニブ単独もしくはアファチニブ単独または抗がん療法と組み合わせたポジオチニブもしくはアファチニブに対して好ましい応答性を有すると予測される、該方法。
  101. 前記ＨＥＲ２エクソン２０変異がＨＥＲ２エクソン２０挿入変異としてさらに定義される、請求項１００記載の方法。
  102. 前記ゲノム試料が、唾液、血液、尿、正常組織、または腫瘍組織から単離される、請求項１００または１０１記載の方法。
  103. ＨＥＲ２エクソン２０変異の存在が、核酸配列決定またはＰＣＲ分析によって判定される、請求項１００～１０２のいずれか一項記載の方法。
  104. 前記抗がん療法がｍＴＯＲ阻害剤である、請求項１００～１０３のいずれか一項記載の方法。
  105. ポジオチニブ阻害剤単独もしくはアファチニブ阻害剤単独または抗がん療法と組み合わせたポジオチニブ阻害剤もしくはアファチニブ阻害剤に対する好ましい応答性が、腫瘍の大きさもしくは腫瘍量の減少、腫瘍成長の阻止、腫瘍関連疼痛の軽減、がん関連病態の軽減、がん関連症状の軽減、がんの非進行、無病期間の延長、進行までの期間の延長、寛解の誘導、転移の減少、または患者の生存性の向上を含む、請求項１００～１０４のいずれか一項記載の方法。
  106. 好ましい応答性を有すると予測された前記患者に、ポジオチニブもしくはアファチニブを単独でまたは第２の抗がん療法と組み合わせて投与する工程をさらに含む、請求項１００～１０５のいずれか一項記載の方法。
  107. （ａ）ヒトがん細胞から単離された核酸；および
    （ｂ）ヒトＥＧＦＲまたはＨＥＲ２コード配列のエクソン２０の少なくとも第１の部分を増幅することができるプライマー対
    を含む、組成物。
  108. 前記ヒトＥＧＦＲまたはＨＥＲコード配列中に変異が存在する場合に該配列のエクソン２０の前記第１の部分に特異的にハイブリダイズすることができる、標識されたプローブ分子
    をさらに含む、請求項１０７記載の組成物。
  109. 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項１０７または１０８記載の組成物。
  110. ｄＮＴＰＳをさらに含む、請求項１０７～１０９のいずれか一項記載の組成物。
  111. Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＦＨ、Ｎ７７１ｄｕｐＮＰＨ、Ａ７６７ｉｎｓＴＬＡ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＶＶ、Ｖ７６９Ｌ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＳＶ、Ｖ７６９ｉｎｓ ＭＡＳＶＤ、Ｄ７７０ｄｅｌ ｉｎｓ ＧＹ、Ｄ７７０ｉｎｓＧ、Ｄ７７０ｉｎｓＹ Ｈ７７３Ｙ、Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤＮＲ、Ｎ７７１ｉｎｓＨＨ、Ｐ７７２ｉｎｓＤＮＰ、Ｈ７７３ｉｎｓＡＨ、Ｈ７７３ｉｎｓＨ、およびＶ７７４ｉｎｓＨＶからなる群より選択される変異が存在する場合に、前記標識されたプローブが前記ヒトＥＧＦＲコード配列のエクソン２０の前記第１の部分にハイブリダイズする、請求項１０８～１１０のいずれか一項記載の組成物。
  112. Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６３ｉｎｓＬＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｓ７６８Ｉ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＦＨ、Ｎ７７１ｄｕｐＮＰＨ、Ａ７６７ｉｎｓＴＬＡ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＶＶ、Ｖ７６９Ｌ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＳＶ、Ｖ７６９ｉｎｓ ＭＡＳＶＤ、Ｄ７７０ｄｅｌ ｉｎｓ ＧＹ、Ｄ７７０ｉｎｓＧ、Ｄ７７０ｉｎｓＹ Ｈ７７３Ｙ、Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤＮＲ、Ｎ７７１ｉｎｓＨＨ、Ｎ７７１ｄｕｐＮ、Ｐ７７２ｉｎｓＤＮＰ、Ｈ７７３ｉｎｓＡＨ、Ｈ７７３ｉｎｓＨ、Ｖ７７４Ｍ、Ｖ７７４ｉｎｓＨＶ、Ｒ７７６Ｈ、およびＲ７７６Ｃからなる群より選択される変異が存在する場合に、前記標識されたプローブが前記ヒトＥＧＦＲコード配列のエクソン２０の前記第１の部分にハイブリダイズする、請求項１０８～１１１のいずれか一項記載の組成物。
  113. Ａ７７５ｉｎｓＶ Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｖ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＶ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＣ、Ｐ７８０ｉｎｓＧＳＰ、Ｖ７７７Ｌ、Ｇ７７８ｉｎｓＬＰＳ、Ｖ７７３Ｍ、Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＬＣ、Ｇ７７８ｄｕｐＧＳＰ、Ｖ７７７ｉｎｓＣＧ、Ｇ７７６Ｖ／Ｓ、Ｖ７７７Ｍ、Ｍ７７４ｄｕｐＭ、Ａ７７５ｉｎｓＳＶＭＡ、Ａ７７５ｉｎｓＶＡ、およびＬ７８６Ｖからなる群より選択される変異が存在する場合に、前記標識されたプローブが前記ヒトＨＥＲ２コード配列のエクソン２０の前記第１の部分にハイブリダイズする、請求項１０８～１１１のいずれか一項記載の組成物。
  114. 変異体ＥＧＦＲタンパク質をコードする単離された核酸であって、該変異体タンパク質が、アミノ酸７６３～７７８に点変異、挿入、および／または３～１８個のヌクレオチドの欠失を含む１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異だけ野生型ヒトＥＧＦＲと異なる、該単離された核酸。
  115. 前記１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異が、Ａ７６３、Ａ７６７、Ｓ７６８、Ｖ７６９、Ｄ７７０、Ｎ７７１、Ｐ７７２、Ｈ７７３、およびＶ７７４からなる群より選択される１つ以上の残基に存在する、請求項１１４記載の単離された核酸。
  116. 前記１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異が、Ａ７６３、Ａ７６７、Ｓ７６８、Ｖ７６９、Ｄ７７０、Ｎ７７１、Ｐ７７２、Ｈ７７３、Ｖ７７４、およびＲ７７６からなる群より選択される１つ以上の残基に存在する、請求項１１４または１１５記載の単離された核酸。
  117. 前記１つ以上のエクソン２０変異が、Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＦＨ、Ｎ７７１ｄｕｐＮＰＨ、Ａ７６７ｉｎｓＴＬＡ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＶＶ、Ｖ７６９Ｌ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＳＶ、Ｖ７６９ｉｎｓ ＭＡＳＶＤ、Ｄ７７０ｄｅｌ ｉｎｓ ＧＹ、Ｄ７７０ｉｎｓＧ、Ｄ７７０ｉｎｓＹ Ｈ７７３Ｙ、Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤＮＲ、Ｎ７７１ｉｎｓＨＨ、Ｐ７７２ｉｎｓＤＮＰ、Ｈ７７３ｉｎｓＡＨ、Ｈ７７３ｉｎｓＨ、およびＶ７７４ｉｎｓＨＶからなる群より選択される、請求項１１４～１１６のいずれか一項記載の単離された核酸。
  118. 前記１つ以上のエクソン２０変異が、Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６３ｉｎｓＬＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｓ７６８Ｉ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ ｉｎｓＦＨ、Ｎ７７１ｄｕｐＮＰＨ、Ａ７６７ｉｎｓＴＬＡ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＶＶ、Ｖ７６９Ｌ、Ｖ７６９ｉｎｓＧＳＶ、Ｖ７６９ｉｎｓ ＭＡＳＶＤ、Ｄ７７０ｄｅｌ ｉｎｓ ＧＹ、Ｄ７７０ｉｎｓＧ、Ｄ７７０ｉｎｓＹ Ｈ７７３Ｙ、Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤＮＲ、Ｎ７７１ｉｎｓＨＨ、Ｎ７７１ｄｕｐＮ、Ｐ７７２ｉｎｓＤＮＰ、Ｈ７７３ｉｎｓＡＨ、Ｈ７７３ｉｎｓＨ、Ｖ７７４Ｍ、Ｖ７７４ｉｎｓＨＶ、Ｒ７７６Ｈ、およびＲ７７６Ｃからなる群より選択される、請求項１１４～１１７のいずれか一項記載の単離された核酸。
  119. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、９、１０、１１、または１２の配列を含む、請求項１１４～１１８のいずれか一項記載の単離された核酸。
  120. 変異体ＨＥＲ２タンパク質をコードする単離された核酸であって、該変異体タンパク質が、アミノ酸７７０～７８５に１つ以上の点変異、挿入、および／または３～１８個のヌクレオチドの欠失を含む１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異だけ野生型ヒトＨＥＲ２と異なる、該単離された核酸。
  121. 前記１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異が、残基Ｙ７７２、Ａ７７５、Ｍ７７４、Ｇ７７６、Ｇ７７８、Ｖ７７７、Ｓ７７９、Ｐ７８０、および／またはＬ７８６に存在する、請求項１２０記載の単離された核酸。
  122. 前記１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異が、Ａ７７５ｉｎｓＶ Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｖ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＶ、Ｇ７７６Ｃ Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＶＣ、Ｐ７８０ｉｎｓＧＳＰ、Ｖ７７７Ｌ、Ｇ７７８ｉｎｓＬＰＳ、Ｖ７７３Ｍ、Ｙ７７２ｄｕｐＹＶＭＡ、Ｇ７７６ｄｅｌ ｉｎｓＬＣ、Ｇ７７８ｄｕｐＧＳＰ、Ｖ７７７ｉｎｓＣＧ、Ｇ７７６Ｖ／Ｓ、Ｖ７７７Ｍ、Ｍ７７４ｄｕｐＭ、Ａ７７５ｉｎｓＳＶＭＡ、Ａ７７５ｉｎｓＶＡ、およびＬ７８６Ｖからなる群より選択される、請求項１２０または１２１記載の単離された核酸。
  123. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、１５、１６、１７、または１８の配列を含む、請求項１２０～１２２のいずれか一項記載の単離された核酸。
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