CN113234832B - 人类egfr基因错义突变分子标志物及其在预测靶向抑制剂抗药性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学及基因检测领域，具体涉及一种人类EGFR基因错义突变分子标志物及其在预测靶向抑制剂抗药性中的应用。本发明提供的分子标志物中包含242种与厄洛替尼、吉非替尼和埃克替尼抗药性相关的EGFR错义突变体，和另外15种与阿法替尼和奥希替尼抗药性相关的EGFR错义突变体，这些突变体可以用于预测非小细胞肺癌患者对靶向抑制剂治疗产生的耐药性。本发明利用合成生物学方法构建了EGFR基因酪氨酸激酶功能区的突变体文库，上述EGFR突变体在药物筛选中高度富集；在临床上可以作为预测肺癌患者经靶向抑制剂治疗产生抗药性的潜在分子标志物。
Description
技术领域
本发明属于生物医学及基因检测领域，具体涉及人类EGFR基因错义突变分子标志物及其在预测靶向抑制剂抗药性中的应用。
背景技术
EGFR是肺癌组织中高频变异基因，EGFR变异解读对肺癌早筛、精准用药和预后监测十分重要。2020年世界癌症统计结果表明，肺癌在世界范围内的发生率和死亡率都排在前两位。其中，在东亚、女性、非吸烟的肺癌患者中EGFR变异比例高达～50％。EGFR蛋白定位在细胞膜上，是细胞中负责传递生长增殖信号的重要一环。EGFR蛋白在细胞膜内区段存在酪氨酸激酶结构域，该结构域的变异常常导致下游信号通路异常激活，进而引发癌症。EGFR基因的酪氨酸激酶区段(尤其是18～21号外显子区段)是致病变异集中的热点区段，该区段也是现阶段基因检测的重点区域。针对EGFR的靶向抑制剂已经有多种(例如，阿法替尼、厄洛替尼、吉非替尼、埃克替尼和奥希替尼)被批准用于一线非小细胞肺癌患者的临床治疗。对EGFR变异的精准检测和解读，对肺癌患者精准用药和预后监测具有十分重要的意义。
目前发现了大量EGFR罕见变异，这些罕见变异对于靶向药敏感性缺乏功能注释。COSMIC(Catalogue of Somatic Mutations in Cancer)数据库中关于EGFR突变记录的统计表明，排除T790M和C797S等次级突变后，L858R(约占41％)和exon-19缺失变异(约占47％)共同占所有记录数量的88％，而EGFR罕见突变约占所有记录数量的12％。EGFR罕见突变主要由EGFR错义突变(占比大于63％)和exon-20***变异(～17％)组成。尽管单一的EGFR罕见变异的发生率较低，但考虑到庞大的肺癌发病基数，这导致临床上发现越来越多的EGFR罕见突变；将所有的EGFR罕见变异汇总起来，其数量规模大到使我们无法忽视。此外，随着EGFR靶向治疗的持续，病人通常会发生EGFR次级变异(通常为罕见错义变异)。然而，这些数量众多的EGFR罕见变异对靶向药物的敏感性，都缺乏功能研究。目前，市场上基因检测公司针对EGFR开发的伴随诊断产品，主要涵盖极少数的EGFR高频变异，包括L858R、G719X、L861X、S768I/V、E709X、T790M、C797S，exon 19deletion。除了exon 19deletion外，通常涵盖的EGFR高频错义突变体种类合计少于20种。而EGFR的突变热点区间(18～21号外显子区段)理论上存在3572种错义突变体，这其中的绝大部分的罕见变异的药物敏感性亟待进行功能注释。
发明内容
由于目前EGFR错义变异突变体有靶向药敏感性功能注释的突变体数量稀少，大量的EGFR罕见变异对靶向药的敏感性缺乏功能注释。基于此，本发明提供了一种***性的EGFR突变体药物敏感性筛选结果，并公布了具有潜在靶向药抗药性的EGFR错义突变体分子标志物。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种人类EGFR基因耐药变异分子标志物，包含242种对可逆结合靶向抑制剂耐受力强的突变位点和另外15种对非可逆结合靶向抑制剂耐受力强的突变位点。
优选地，所述可逆结合靶向抑制剂包括厄洛替尼、吉非替尼和埃克替尼；所述非可逆结合靶向抑制剂包括阿法替尼和奥希替尼。
优选地，所述242种可逆结合靶向抑制剂耐受力强的突变位点包括：
L688P、V689G、E690Q、P691S、P691H、L692P、T693P、T693K、P694R、G696E、A698G、N700I、N700Y、Q701E、A702P、R705K、I706T、I706M、L707S、K708E、E709V、E711G、E711V、E711K、E711Q、F712S、F712C、K713I、K713Q、K713R、K714M、K714N、K714Q、I715M、I715N、K716E、V717G、L718M、L718R、S720F、S720C、S720Y、G721D、F723L、F723I、G724D、T725A、Y727C、K728M、G729E、L730V、L730I、L730R、W731R、I732M、I732N、E734A、K737I、V738L、V738D、K739N、P741A、V742A、V742I、A743T、I744M、E746G、E746D、A750G、A750E、S752A、S752F、S752C、P753A、P753S、K754I、A755D、N756S、N756T、N756H、K757M、K757Q、E758V、E758D、I759V、L760V、L760I、L760H、D761G、D761H、D761N、E762K、E762Q、Y764H、Y764D、V765A、V765E、V765M、M766T、M766R、A767P、V769A、V769L、D770H、P772A、P772L、P772T、H773P、H773Q、V774G、V774A、V774M、C775F、C775Y、R776L、R776H、L777P、L777M、L778R、G779S、G779C、G779R、I780M、C781G、T783I、T783N、S784P、S784T、V786L、Q787L、Q787E、L788V、L788I、I789L、I789M、I789N、T790M、Q791L、L792F、M793V、M793I、P794H、G796C、C797W、L798F、Y801H、V802A、E804D、H805P、H805Y、K806T、K806E、N808S、I809V、I809S、I809T、G810V、G810D、S811F、L815H、N816D、W817L、W817C、C818W、C818R、V819A、V819M、Q820L、I821V、I821S、A822E、K823T、K823E、K823R、G824R、N826I、N826H、N826D、Y827D、L828F、E829G、D830E、R831G、R831L、R831P、R831H、R831C、R832G、R832P、R832S、L833V、L833S、H835P、H835Y、R836G、D837Y、L838P、L838M、A839P、A839T、R841T、V843A、L844P、V845G、V845A、V845L、V845E、V845M、Q849K、H850Y、K852E、T854P、D855V、G857V、L858V、L858Q、A859D、K860I、K860Q、L861M、L861Q、G863A、A864P、A864T、E865A、E865K、E866K、K867E、E868G、E868D、E868K、Y869D、H870L、H870D、E872D、E872K、G873A、G873R、G874C、K875T、K875N、K875Q；
所述15种非可逆结合靶向抑制剂耐受力强的突变位点包括：
T693K、Q701E、I715M、S720C、I744M、C775Y、I789N、C818W、Q820L、N826H、D830E、A839T、K860Q、A864T、E868G。
优选地，所述突变位点在细胞内单独存在，或相互之间任意组合存在，或与野生型EGFR或者其他EGFR变异位点组合存在。
即以组合形式存在时，有两种方式：一种方式是上述分子标志物与其他EGFR变异位点(一个或多个)处于同一个DNA分子上或mRNA转录本上(in cis)；另一种方式是上述分子标志物与其他EGFR变异位点(一个或多个)处于不同的DNA分子或mRNA转录本上(intrans)；所述的变异位点可由野生型基因中对应的密码子经过单个碱基变异获得。
在检测变异位点时，可采用的方法有CRISPR/Cas基因编辑技术检测、荧光原位杂交检测、基因芯片检测、PCR检测、荧光定量PCR检测、数字PCR检测、Sanger测序、高通量测序检测等；检测时选择的样本可以为基因组DNA、肿瘤组织来源的DNA、外周血中游离DNA，肿瘤组织来源的RNA、外周血中的游离RNA。
本发明还提供了一种利用所述的分子标志物在构建重组基因、mRNA、蛋白质、细胞系、类器官、动物模型中的应用。
本发明还提供了一种所述的分子标志物在制定与EGFR变异相关的靶向药使用方案、评估与EGFR变异相关的癌症的进展、预测耐药变异的产生、新药开发中的应用。
本发明还提供了一种所述的分子标志物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、构建EGFR错义突变体文库；
S2、将EGFR突变体文库包装到慢病毒载体中；
S3、使用慢病毒感染宿主细胞系，并通过抗生素筛选或荧光筛选获取稳转细胞系；
S4、添加靶向抑制剂药物处理，并持续培养2周；
S5、将药筛后存活的细胞用来抽提基因组DNA，并通过PCR扩增突变体序列或者标签序列；
S6、通过生物信息分析，确定在药筛前后各种突变体对应的富集系数。
需要进一步说明的是，步骤S1中的突变体文库，并不限定于错义突变体文库，也可以是***突变体(insertion)文库，缺失突变体(deletion)文库，复杂突变文库，混合突变体文库；步骤S2并不限定于慢病毒载体，也可以是其他类型的病毒载体，或者使用非病毒介导的转化、转染或感染方式将外源突变体导入到宿主细胞中；步骤S3中，宿主细胞可以预先经过基因编辑方法将内源性的目标基因及其突变体基因敲除，也可以不敲除；步骤S4中添加靶向抑制剂后，培养时间可以根据需求而定，并不限定于两周；步骤S6中突变体富集系数计算方法为：药物筛选后突变体对应细胞数与筛选前该突变体对应细胞数的比值；富集系数越大表明突变体越耐药，反之表明越敏感。此外，上述提供的方法流程，并不限定于研究EGFR基因的突变体，也可以用于研究其他基因的突变体对于靶向抑制剂的敏感性，或者使用其他功能assay方法研究基因突变体功能。
完成突变体功能注释是开发各种基因检测应用的前提条件。肺癌作为世界范围内发生率和死亡率都居高的癌种，每年有大量的新发病例。非小细胞肺癌是肺癌的主要类别，在亚裔非小细胞肺癌患者中，有大约50％的人携带EGFR变异。对于这些携带EGFR激活型变异的患者，可以使用EGFR靶向抑制剂来治疗；但在治疗前需要预先做基因检测确定患者是否携带EGFR变异，以及携带何种变异。目前，通过基因检测能够给出用药建议的EGFR错义突变体主要有：L858R、G719X、L861X、S768I/V、E709X、T790M。由于缺乏功能注释，针对大量的EGFR罕见型错义变异突变体尚无法给出用药指导建议。
本发明使用了由合成生物学方法构建的EGFR基因错义突变体文库(3572种，参照申请公布号为CN112725331A的发明专利)，通过***性药物敏感性筛选，找到了242种突变体对可逆结合的靶向抑制剂(厄洛替尼、吉非替尼和埃克替尼)具有抗药性，同时还找到了15种突变体对非可逆结合的靶向抑制剂(阿法替尼和奥希替尼)具有抗药性。这些突变体可以作为分子标志物，预测临床抗药性的发生。
与现有技术相比，本发明的技术优势为：
(1)本发明通过对EGFR基因突变热点区域的3572种突变体进行***性筛选，将上述突变体对临床上5种常用靶向抑制剂的敏感性进行定量评估，确定了每一种突变体对于测试的5种靶向抑制剂的敏感性系数，将有实际药物敏感性功能注释的EGFR错义突变体的数量比例，大幅提升至超过98％；
(2)本发明通过***性筛选，找到了242种突变体对厄洛替尼、吉非替尼和埃克替尼具有较高耐受力，15种突变体对阿法替尼、和奥希替尼具有较高耐受力，这些突变体均为潜在的抗药分子标志物；
(3)本发明找到的潜在的耐药分子标志物，可以用于指导临床用药，也可以用于监测临床耐药事件的发生，而且，本发明提供的筛选突变体方法可用于评估EGFR突变体对于其他靶向药物的敏感性，例如，评估对达克替尼的药物敏感性，并进一步用于评估其他具有重要临床价值的突变体对于靶向药物的敏感性，从而大大拓展伴随诊断的适用范围和精准度。
附图说明：
图1为药物敏感性筛选实验流程示意图；
图2为EGFR突变体和Cas9两种蛋白表达载体的结构示意图；
图3为测序数据生物信息分析流程示意图；
图4为使用厄洛替尼对EGFR突变体文库进行敏感性筛选的结果图；
图5为使用吉非替尼对EGFR突变体文库进行敏感性筛选的结果图；
图6为使用埃克替尼对EGFR突变体文库进行敏感性筛选的结果图；
图7为使用阿法替尼对EGFR突变体文库进行敏感性筛选的结果图；
图8为使用奥希替尼对EGFR突变体文库进行敏感性筛选的结果图；
图9为厄洛替尼、吉非替尼和埃克替尼潜在的抗药变异的交集结果图；
图10为阿法替尼和奥希替尼潜在的抗药变异的交集结果展示图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。本实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域常规技术方法和仪器说明书内容进行操作；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例一种抗药变异分子标志物的筛选方法
所述分子标志物的筛选方法，包括以下过程(图1)：
S1、EGFR突变体文库构建
EGFR错义突变体文库的构建方法，可以参看申请公布号为CN112725331A(一种高通量突变体文库的构建方法)的专利申请。为了敲除细胞内源性EGFR，需要将预先检测过的靶向EGFR的两个sgRNA表达模块克隆到突变体文库载体上。方法如下：
内源性EGFR敲除：使用在线软件(http://chopchop.cbu.uib.no/)设计2条靶向EGFR基因的sgRNA。相关靶点序列如下：
靶点1：GTTCACATCCATCTGGTACGTGG(TGG为PAM序列)
sgRNA1-oligo-F:CACCGTTCACATCCATCTGGTACG
sgRNA1-oligo-R:AAAACGTACCAGATGGATGTGAAC
靶点2：GTGGAGATCGCCACTGATGGAGG(AGG为PAM序列)
sgRNA2-oligo-F:CACCGTGGAGATCGCCACTGATGG
sgRNA2-oligo-R:AAAACCATCAGTGGCGATCTCCAC
采用Zhang Feng实验室的pLenti-CRISPR v2载体构建sgRNA，使用BsmBI限制性内切酶将载体线性化，通过T4-DNA连接酶将退火复性的上述的靶点Oligo引物连接入载体，获得所需的sgRNA。相关克隆方法，可以参考Zhang Feng实验室提供的克隆方法(Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.Shalem O*,Sanjana NE*,Hartenian E,Shi X,Scott DA,Mikkelsen T,Heckl D,Ebert BL,Root DE,Doench JG,Zhang F(2014).Science,343,83-7.DOI:10.1126/science.1247005)。
对sgRNA基因编辑效能进行测定：将CRISPR/Cas9载体包装为慢病毒后感染A549细胞。病毒包装和感染过程如下：在10cm平皿中种500万个HEK293细胞，使用李记生物公司的EZ Trans阳离子聚合物转染试剂将sgRNA载体和慢病毒包装载体(psPAX和pMD2G)质粒组合共同转染到HEK293细胞中。24小时后更换培养基并开始计时,每隔24小时收取病毒一次，共收集2次。收取的病毒使用0.45μm滤膜过滤。将包装好的病毒按照多重感染系数(MOI)为0.25的量添加到A549细胞培养基中，并在3天后更换新鲜培养基。随后使用嘌呤霉素进行筛选，筛选7天后可以进行基因编辑效能测定。
使用BioLegend公司的Anti-EGFR-PE(352904)流式抗体对实施了EGFR基因编辑的A549细胞和对照细胞进行染色，而后通过流式细胞术进行分析检验EGFR敲除效率。随后，通过第一轮亚克隆(双酶切连接，酶切位点为Kpn-I和EcoR-I)将sgRNA-1接入到突变体文库载体中。再通过第二轮亚克隆(单酶切连接，酶切位点为EcoR-I)将sgRNA-2接入到突变体文库载体中(图2)。
S2、突变体文库包装为慢病毒
慢病毒包装：在10cm平皿中种500万个HEK293细胞，使用EZ Trans阳离子聚合物转染试剂(李记生物)将突变体文库载体和慢病毒包装载体(psPAX和pMD2G)质粒按照摩尔比为1：1：1组合共同转染到HEK293细胞中。24小时后更换培养基，并开始计时。此后，每隔24小时收取病毒一次，收取的病毒使用0.45μm滤膜过滤，并冻存到-80℃冰箱保存。
病毒滴度测定：在6个6cm平皿中分别铺100万个PC9细胞，分别加入6个梯度的病毒，72小时后加入抗稻瘟菌素(Blasticidin S)进行筛选。一周后，待细胞稳定生长时计数并计算病毒滴度。
S3、使用慢病毒感染PC9-Cas9细胞系
PC9-Cas9稳转细胞系构建:以Zhang Feng实验室的pLenti-CRISPR v2载体为基础，使用KpnI/EcoRI双酶切方法，将sgRNA表达模块卸载，酶切反应体系如下：
酶切条件：37℃，3个小时。随后，使用Klenow酶(NEB公司)将载体平端化，并使用T4-DNA连接酶(NEB公司)使载体自连接，自连接的载体即为Cas9表达载体(图2)。
构建好的Cas9表达载体具有嘌呤霉素抗性筛选基因，包装为慢病毒(病毒包装方法同上)，随后感染PC9细胞。使用嘌呤霉素进行筛选，连续筛选四周获得Cas9稳定感染细胞系。
使用突变体文库慢病毒感染PC9-Cas9稳转细胞系：第一天晚上，在6个15cm平皿中，各自种1500万个PC9-Cas9细胞。第二天早上，按照感染系数(Multiplicity ofinfection，MOI<0.3)添加突变体文库病毒，病毒感染24小时后，更换培养基。连续培养3天后，加入嘌呤霉素和抗稻瘟菌素进行筛选。使用抗生素连续筛选2周，以确保：(1)内源性EGFR被敲除；(2)外源性EGFR突变体文库稳定整合到PC9-Cas9细胞基因组中，并正常表达EGFR突变体。通过上述操作，实现在PC9-Cas9细胞中，用外源性的EGFR突变体替换内源性的EGFR基因(WT和exon 19deletion)。
S4.添加靶向抑制剂药物处理
在内源性的EGFR被CRISPR/Cas9基因编辑完全敲除后，且外源性的EGFR突变体充分表达以后，可以进行药物敏感性筛选。
需要说明的是，是否敲除内源性的靶标基因(例如，此处的EGFR)取决于实验目的。此外，基因组中一些基因的蛋白产物以同源二聚体或同源多聚体形式发挥功能或者被调控功能。此时，当同一细胞中存在两种或更多种该基因不同类型的突变体时，不同突变体之间可能存在复杂的相互作用，对其实施功能注释需要考虑其复杂的相互作用关系。例如，本发明阐释的EGFR基因，在细胞膜上会形成同源二聚体，从而实施信号转导功能。当细胞内只有一种EGFR蛋白类别(野生型WT或单一类型的突变体)，此时形成的EGFR蛋白二聚体只有唯一组合形态；当细胞中存在两种或更多种突变体类型时，此时不同的EGFR突变体会形成多种不同的EGFR蛋白二聚体组合形态。本发明是在敲除了PC9细胞内源性的EGFR蛋白(野生型WT和exon 19deletion突变体)的情况下，且细胞中理论上仅存在单一一种外源导入的EGFR突变体的情形，从而对EGFR突变体的药物敏感性进行评估。此种情形下，适宜评估EGFR突变体对药物处理的耐受性，即通过药筛实验找到可能的抗药突变体类型。
下面结合可逆抑制剂与非可逆抑制剂的药物筛选实验，来进一步说明如何通过***性药物敏感性筛选来寻找潜在的抗药分子标志物。
筛选对可逆结合靶向抑制剂有潜在抗药性的突变体
设置两个筛选组，一组为靶向抑制剂筛选组，添加适当浓度的靶向抑制剂，用于评估EGFR突变体在有靶向抑制剂存在时对细胞增殖的影响；另一组为实验对照组，添加同等体积的二甲基亚砜(DMSO)，用于评估突变体自身在无抑制剂的情况下对细胞增殖的影响。理论上，当有外界靶向抑制剂存在时，含有突变体的细胞的增殖受到的影响越小，则表明该细胞所携带的突变体对药物敏感性越小。使用靶向抑制剂进行药物敏感性筛选时，药物浓度的设定可以参考临床病人血药浓度来设定，本发明中厄洛替尼、吉非替尼和埃克替尼的药物浓度都设定为600nM。
本发明评估的EGFR靶向抑制剂中，厄洛替尼、吉非替尼和埃克替尼对于EGFR突变体进行抑制的机理相同，都为药物通过可逆方式与ATP竞争性结合EGFR突变体，从而抑制EGFR突变体功能。
实验对照组操作方法：在3个15cm平皿中，分别种上1500万个整合了EGFR突变体的细胞(S3步骤获得的细胞)，同时取500万个细胞作为零点未处理样本，留作后续步骤使用。在3个平皿中，分别加入200μL的DMSO。连续培养2周，中间阶段当细胞数量过多时，细胞计数后留下1500万进行传代，传代时使用含有同等比例的DMSO的新鲜RPMI 1640培养基(含10％胎牛血清、青链霉素抗生素、嘌呤霉素、抗稻瘟菌素、GlutaMAX，均采购于ThermoFisher公司)进行连续培养。每隔48小时进行传代一次，直至实验结束。2周后，进行细胞计数，并且按照500万细胞一份将细胞收集以备后续实验使用。
示例一使用厄洛替尼对突变体文库进行药物敏感性筛选
厄洛替尼药筛组操作方法：在3个15cm平皿中，分别种上1500万个整合了EGFR突变体的细胞(S3步骤获得的细胞)，同时取500万个细胞作为零点未处理样本，留作后续步骤使用。在3个平皿中，分别加入200μL使用DMSO溶解的厄洛替尼，使RPMI 1640培养基(含10％胎牛血清、青链霉素抗生素、嘌呤霉素、抗稻瘟菌素、GlutaMAX，均采购于ThermoFisher公司；下同)中的厄洛替尼的终浓度为600nM。连续培养2周，每隔48小时进行传代一次，直至实验结束。在传代时进行细胞计数，并根据细胞数量多少来选择合适尺寸(15cm，10cm，或者6cm)的培养皿进行培养，以保障细胞培养密度不至于过高或者过低。在筛选初期，细胞大量死亡，每次传代保留所有细胞。随着筛选时间的持续，细胞逐步增殖，当增殖后总量超过1500万时，每次传代仅留存1500万个细胞。每次传代后使用含有600nM厄洛替尼的新鲜培养基进行连续培养。2周后，进行细胞计数，并且按照500万细胞一份将细胞收集以备后续实验使用。
示例二使用吉非替尼对突变体文库进行药物敏感性筛选
吉非替尼药筛组操作方法：在3个15cm平皿中，分别种上1500万个整合了EGFR突变体的细胞(S3步骤获得的细胞)，同时取500万个细胞作为零点未处理样本，留作后续步骤使用。在3个平皿中，分别加入200μL使用DMSO溶解的吉非替尼，使培养基中的吉非替尼的终浓度为600nM。连续培养2周，每隔48小时进行传代一次，直至实验结束。在传代时进行细胞计数，并根据细胞数量多少来选择合适尺寸(15cm，10cm，或者6cm)的培养皿进行培养，以保障细胞培养密度不至于过高或者过低。在筛选初期，细胞大量死亡，每次传代保留所有细胞。随着筛选时间的持续，细胞逐步增殖，当增殖后总量超过1500万时，每次传代仅留存1500万个细胞。每次传代后使用含有600nM吉非替尼的新鲜培养基进行连续培养。2周后，进行细胞计数，并且按照500万细胞一份将细胞收集以备后续实验使用。
示例三使用埃克替尼对突变体文库进行药物敏感性筛选
埃克替尼药筛组操作方法：在3个15cm平皿中，分别种上1500万个整合了EGFR突变体的细胞(S3步骤获得的细胞)，同时取500万个细胞作为零点未处理样本，留作后续步骤使用。在3个平皿中，分别加入200μL使用DMSO溶解的埃克替尼，使培养基中的埃克替尼的终浓度为600nM。连续培养2周，每隔48小时进行传代一次，直至实验结束。在传代时进行细胞计数，并根据细胞数量多少来选择合适尺寸(15cm，10cm，或者6cm)的培养皿进行培养，以保障细胞培养密度不至于过高或者过低。在筛选初期，细胞大量死亡，每次传代保留所有细胞。随着筛选时间的持续，细胞逐步增殖，当增殖后总量超过1500万时，每次传代仅留存1500万个细胞。每次传代后使用含有600nM埃克替尼的新鲜培养基进行连续培养。2周后，进行细胞计数，并且按照500万细胞一份将细胞收集以备后续实验使用。
筛选对非可逆结合靶向抑制剂有潜在抗药性的突变体
设置两个筛选组，一组为靶向抑制剂筛选组，添加适当浓度的靶向抑制剂，用于评估EGFR突变体在有靶向抑制剂存在时对细胞增殖的影响；另一组为实验对照组，添加同等体积的二甲基亚砜(DMSO)，用于评估突变体自身在无抑制剂的情况下对细胞增殖的影响。理论上，当有外界靶向抑制剂存在时，含有突变体的细胞的增殖受到的影响越小，则表明该细胞所携带的突变体对药物敏感性越小。使用靶向抑制剂进行药物敏感性筛选时，药物浓度的设定可以参考临床病人血药浓度来设定，本发明中阿法替尼的药物浓度设定为50nM，奥希替尼的药物浓度设定为200nM。
本发明评估的EGFR靶向抑制剂中，阿法替尼和奥希替尼对于EGFR突变体进行抑制的机理相同，都为药物通过共价结合方式不可逆地与EGFR蛋白797位的半胱氨酸结合，从而阻碍ATP与EGFR突变体的结合，达到抑制EGFR功能的目的。
实验对照组操作方法：在3个15cm平皿中，分别种上1500万个整合了EGFR突变体的细胞(S3步骤获得的细胞)，同时取500万个细胞作为零点未处理样本，留作后续步骤使用。在3个平皿中，分别加入200μl的DMSO。连续培养2周，中间阶段当细胞数量过多时，细胞计数后留下1500万进行传代，传代时使用含有同等比例的DMSO的新鲜RPMI 1640培养基(含10％胎牛血清、青链霉素抗生素、嘌呤霉素、抗稻瘟菌素、GlutaMAX，均采购于ThermoFisher公司)。每隔48小时进行传代一次，直至实验结束。2周后，进行细胞计数，并且按照500万细胞一份将细胞收集以备后续实验使用。
示例一使用阿法替尼对突变体文库进行药物敏感性筛选
阿法替尼药筛组操作方法：在3个15cm平皿中，分别种上1500万个整合了EGFR突变体的细胞(S3步骤获得的细胞)，同时取500万个细胞作为零点未处理样本，留作后续步骤使用。在3个平皿中，分别加入200μL使用DMSO溶解的阿法替尼，使RPMI 1640培养基(含10％胎牛血清、青链霉素抗生素、嘌呤霉素、抗稻瘟菌素、GlutaMAX，均采购于ThermoFisher公司；下同)中的阿法替尼的终浓度为50nM。连续培养2周，每隔48小时进行传代一次，直至实验结束。在传代时进行细胞计数，并根据细胞数量多少来选择合适尺寸(15cm，10cm，或者6cm)的培养皿进行培养，以保障细胞培养密度不至于过高或者过低。在筛选过程总，每次传代保留所有的细胞进行传代，根据细胞数量的多少选择合适的培养皿。每次传代后使用含有50nM阿法替尼的新鲜培养基进行连续培养。2周后，进行细胞计数，并且按照500万细胞一份将细胞收集以备后续实验使用。
示例二使用奥希替尼对突变体文库进行药物敏感性筛选
奥希替尼药筛组操作方法：在3个15cm平皿中，分别种上1500万个整合了EGFR突变体的细胞(S3步骤获得的细胞)，同时取500万个细胞作为零点未处理样本，留作后续步骤使用。在3个平皿中，分别加入200μL使用DMSO溶解的奥希替尼，使培养基中的奥希替尼的终浓度为200nM。连续培养2周，每隔48小时进行传代一次，直至实验结束。在传代时进行细胞计数，并根据细胞数量多少来选择合适尺寸(15cm，10cm，或者6cm)的培养皿进行培养，以保障细胞培养密度不至于过高或者过低。在筛选过程中，每次传代保留所有的细胞进行传代，根据细胞数量的多少选择合适的培养皿。每次传代后使用含有200nM奥希替尼的新鲜培养基进行连续培养。2周后，进行细胞计数，并且按照500万细胞一份将细胞收集以备后续实验使用。
S5、抽提细胞基因组DNA并通过PCR扩增提取标签序列
基因组DNA(gDNA)制备及标签序列扩增。使用QIAGEN基因组DNA中量抽提试剂盒抽提各组样本中的细胞的基因组DNA。使用NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶，从基因组中扩增含有标签序列的DNA片段(标签序列位于扩增的DNA片段中间，每个标签序列对应唯一的突变体，在建库时即确定了标签序列与突变体的对应关系)，扩增引物序列为：
Tag-F：5’-GCTGCCCTCTGGTTATGTGTG-3’
Tag-R：5’-GTAATCCAGAGGTTGATTACCG-3’
根据基因组DNA的总量，确定PCR反应的数量，保障所有的基因组DNA都被用于扩增提取Tag标签序列，以保障有最大的代表性。具体地，每个PCR反应中加入100ng基因组DNA。PCR反应体系如下：
PCR扩增条件如下：95℃，3分钟；(98℃，20秒；55℃，30秒；72℃，30秒)×35个循环；72℃，5分钟；10℃，保存。
将同一基因组DNA的PCR产物合并后，充分混合均匀。此处需要说明的是，一个样本的DNA要尽可能全部用于进行PCR扩增，这样可以更加完整地从细胞基因组中提取突变体信息，假设一个样板DNA有2000ng，每个PCR反应加100ng，则这个样本DNA理论上需要做20管PCR扩增。使用天根公司DNA纯化试剂盒纯化扩增的Tag标签DNA片段。将Tag标签DNA送交商业高通量测序公司进行测序，使用Illumina HiSeq 4000测序平台或其他高通量测序平台进行PE150(Paired-End 150)高通量测序。
S6、通过生物信息分析确定富集的突变体
图3展示了对测序数据进行分析的流程。测序数据分析流程如下：
(1)将成对的raw reads(read1和read2)合并为单条read；
(2)将每个样本对应的测序数据拆分开为3个重复；
(3)根据突变体文库建库时确定的“突变体-标签序列”对应关系，将测序得到的标签序列转换为对应的突变体；
(4)计算各个药物筛选实验中，各个重复组中，各种突变体的富集系数。富集系数计算方法如下：
(a)计算药筛前，各个突变体对应的理论细胞数。根据测序结果，计算出每种突变体在所有合格reads中的占比，并乘以起点时的细胞数量，即可获得每种突变体对应的理论细胞数n；
(b)计算药筛后，各个突变体对应的理论细胞数。根据测序结果，计算出每种突变体在所有合格reads中的占比，并乘以药筛结束时的细胞数量，即可获得每种突变体对应的理论细胞数n’；
(c)计算富集系数：富集系数＝n’/n。
图4-图8中的矩阵点图分别展示了使用厄洛替尼、吉非替尼、埃克替尼、阿法替尼、及奥希替尼对3572种EGFR变异进行敏感性筛选的结果。纵轴代表氨基酸位置(688-875)，横轴代表20种氨基酸变异类型。图中的点展示了每一个氨基酸位置上每一种变异(或野生型WT)在药筛实验中的富集系数(Log2)。圆点表示该突变体的富集系数小于0，三角形表示该点的富集系数大于0。
由于作用机理相同，我们将厄洛替尼、吉非替尼和埃克替尼的药筛结果分别排序，并提取出富集系数(log2)大于0的突变体，分别有841种、1802种和2102种。我们对三种可逆结合TKI药筛实验结果中大于0的突变体取交集，获得813种突变体。类似的，我们将阿法替尼和奥希替尼的药筛结果分别排序，并提取出富集系数(log2)大于0的突变体，分别有280种271种。我们对两种非可逆结合TKI药筛实验结果中大于0的突变体取交集，获得51种突变体。
此处，我们将突变体分为两种类别：(1)复杂错义突变体(ComplexSubstitution)。这种类型的错义突变体，在野生型基因序列对应的密码子，需要经历2个或3个碱基变异才能获得。(2)简单错义突变体(Simple Substitution)。这种类型的错义突变体，在野生型基因序列对应的密码子，需要经历1个碱基变异就能获得。由于基因变异具有随机性，在同一密码子中出现多次点突变的概率很低(大约为2.2×10-9/(碱基×年))，因此复杂错义突变体的发生频率比简单错义突变体低10-9至10-18。事实上，临床上发现的错义突变体大多数为简单错义突变体，极少数为复杂错义突变体。
基于上述规则，进一步地，我们将813种可逆TKI药筛实验中富集的突变体分为两组：571种复杂错义突变体和242种简单错义突变体。图9中的点图展示了可逆TKI药筛实验中富集的242种简单错义突变体的富集系数(log2)。类似地，我们将51种非可逆TKI药筛实验中富集的突变体分为两组：36种复杂错义突变体和15种简单错义突变体。图10中的点图展示了非可逆TKI药筛实验中富集的15种简单错义突变体的富集系数(log2)。
需要说明的是，尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。
序列表
<110> 深圳市狂风生命科技有限公司
<120> 人类EGFR基因错义突变分子标志物及其在预测靶向抑制剂抗药性中的应用
<130> 2021.6.30
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 靶点1(Target 1)
<400> 1
gttcacatcc atctggtacg tgg 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> sgRNA1-oligo-F
<400> 2
caccgttcac atccatctgg tacg 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> sgRNA1-oligo-R
<400> 3
aaaacgtacc agatggatgt gaac 24
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 靶点2(Target 2)
<400> 4
gtggagatcg ccactgatgg agg 23
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> sgRNA2-oligo-F
<400> 5
caccgtggag atcgccactg atgg 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> sgRNA2-oligo-R
<400> 6
aaaaccatca gtggcgatct ccac 24
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Tag-F
<400> 7
gctgccctct ggttatgtgt g 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Tag-R
<400> 8
gtaatccaga ggttgattac cg 22
Claims (2)
1.一种与肺癌患者抗药性相关的EGFR基因耐药变异的分子标志物，其特征在于，所述标志物为242种对可逆结合靶向抑制剂耐受的突变和15种对非可逆结合靶向抑制剂耐受的突变的组合；所述可逆结合靶向抑制剂为厄洛替尼、吉非替尼和埃克替尼；所述非可逆结合靶向抑制剂为阿法替尼和奥希替尼；所述242种对可逆结合靶向抑制剂的耐受的突变的位点为：L688P、V689G、E690Q、P691S、P691H、L692P、T693P、T693K、P694R、G696E、A698G、N700I、N700Y、Q701E、A702P、R705K、I706T、I706M、L707S、K708E、E709V、E711G、E711V、E711K、E711Q、F712S、F712C、K713I、K713Q、K713R、K714M、K714N、K714Q、I715M、I715N、K716E、V717G、L718M、L718R、S720F、S720C、S720Y、G721D、F723L、F723I、G724D、T725A、Y727C、K728M、G729E、L730V、L730I、L730R、W731R、I732M、I732N、E734A、K737I、V738L、V738D、K739N、P741A、V742A、V742I、A743T、I744M、E746G、E746D、A750G、A750E、S752A、S752F、S752C、P753A、P753S、K754I、A755D、N756S、N756T、N756H、K757M、K757Q、E758V、E758D、I759V、L760V、L760I、L760H、D761G、D761H、D761N、E762K、E762Q、Y764H、Y764D、V765A、V765E、V765M、M766T、M766R、A767P、V769A、V769L、D770H、P772A、P772L、P772T、H773P、H773Q、V774G、V774A、V774M、C775F、C775Y、R776L、R776H、L777P、L777M、L778R、G779S、G779C、G779R、I780M、C781G、T783I、T783N、S784P、S784T、V786L、Q787L、Q787E、L788V、L788I、I789L、I789M、I789N、T790M、Q791L、L792F、M793V、M793I、P794H、G796C、C797W、L798F、Y801H、V802A、E804D、H805P、H805Y、K806T、K806E、N808S、I809V、I809S、I809T、G810V、G810D、S811F、L815H、N816D、W817L、W817C、C818W、C818R、V819A、V819M、Q820L、I821V、I821S、A822E、K823T、K823E、K823R、G824R、N826I、N826H、N826D、Y827D、L828F、E829G、D830E、R831G、R831L、R831P、R831H、R831C、R832G、R832P、R832S、L833V、L833S、H835P、H835Y、R836G、D837Y、L838P、L838M、A839P、A839T、R841T、V843A、L844P、V845G、V845A、V845L、V845E、V845M、Q849K、H850Y、K852E、T854P、D855V、G857V、L858V、L858Q、A859D、K860I、K860Q、L861M、L861Q、G863A、A864P、A864T、E865A、E865K、E866K、K867E、E868G、E868D、E868K、Y869D、H870L、H870D、E872D、E872K、G873A、G873R、G874C、K875T、K875N和K875Q；
所述15种对非可逆结合靶向抑制剂耐受的突变的位点为：T693K、Q701E、I715M、S720C、I744M、C775Y、I789N、C818W、Q820L、N826H、D830E、A839T、K860Q、A864T和E868G。
2.一种筛选如权利要求1所述的分子标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、构建EGFR错义突变体文库；将靶向EGFR的两个sgRNA表达模块克隆到突变体文库载体上，使用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除细胞内源性EGFR；
S2、将EGFR突变体文库包装到慢病毒载体中；所述两个sgRNA的第一个sgRNA的序列为GTTCACATCCATCTGGTACGTGG ，所述两个sgRNA的第二个sgRNA的序列为GTGGAGATCGCCACTGATGGAGG ；
S3、使用慢病毒感染宿主细胞系，并通过抗生素筛选或荧光筛选获取稳转细胞系；
S4、添加靶向抑制剂药物处理稳转细胞系，并持续培养2周；所述抑制剂药物为厄洛替尼、吉非替尼、埃克替尼、阿法替尼和奥希替尼；在内源性的EGFR被CRISPR/Cas9基因编辑完全敲除后，且外源性的EGFR突变体充分表达以后，使用所述抑制剂药物对突变体文库进行药物敏感性筛选；
S5、将药物敏感性选筛后存活的细胞用来抽提基因组DNA，从基因组中扩增含有标签序列的DNA片段，每个标签序列对应唯一的突变体，在建库时即确定了标签 序列与突变体的对应关系，
S6、通过生物信息分析确定富集的突变体；具体分析流程如下：
（1）将成对的read1和read2合并为单条read；
（2）将每个样本对应的测序数据拆分开为3个重复；
（3）根据突变体文库建库时确定的“突变体-标签序列”对应关系，将测序得到的标签序列转换为对应的突变体；
（4）计算各个药物筛选实验的各个重复组中各种突变体的富集系数；富集系数计算方法如下：
（a）计算药筛前，各个突变体对应的细胞数，根据测序结果，计算出每种突变体在所有合格reads中的占比，并乘以起点时的细胞数量，即可获得每种突变体对应的理论细胞数n0；
（b）计算药筛后，各个突变体对应的细胞数，根据测序结果，计算出每种突变体在所有合格reads中的占比，并乘以药筛结束时的细胞数量，即可获得每种突变体对应的理论细胞数n1；
（c）计算富集系数：富集系数= n1/n0；然后将厄洛替尼、吉非替尼、埃克替尼、阿法替尼和奥希替尼的药筛结果分别排序，并提取出富集系数log2大于0 的突变体；对厄洛替尼、吉非替尼和埃克替尼药筛实验结果中富集系数log2大于0的突变体取交集，再取交集中的简单错义突变体；对阿法替尼和奥希替尼的药筛实验结果中富集系数log2大于0的突变体取交集，再取交集中的简单错义突变体；所述标志物为对可逆结合靶向抑制剂耐受的简单错义突变和对非可逆结合靶向抑制剂耐受的简单错义突变的组合。
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