KR20060128605A - 피라졸로피리미딘 유도체를 유효성분으로 함유하는간질환의 예방 및 치료제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 피라졸로피리미딘 유도체( 5-[2-propyloxy-5-(1-methyl-2- pyrollidinylethylamidosulphonyl)phenyl]-1-methyl-propyl-1,6-dihydro-7H-pyrazolo(4,3-d)pyrimidin-7-one)를 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 및 치료제에 관한 것이다. 본 발명의 피라졸로피리미딘 유도체는 간 성상세포에서의 콜라겐 합성 억제 효과가 우수하고, 동시에 간내 저항을 낮추어 문맥압을 감소시키며 문맥을 통한 간장내 혈액유입을 증가시키므로, 간섬유화(hepatic fibrosis), 간섬유화의 진행으로 인한 간경변(liver cirrhosis), 문맥압항진증(portal hypertension) 및 이로부터 유발되는 다양한 합병증의 예방 및 치료제로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 피라졸로피리미딘 유도체는 인체내 반감기가 길기 때문에 복용횟수를 줄일 수 있어 만성 간질환 환자에서의 복약 순응도를 크게 높일 수 있는 장점이 있다.
피라졸로피리미딘 유도체, 간질환

Description

피라졸로피리미딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 및 치료제{Agent for prevention and treatment of liver diseases comprising pyrazolopyrimidine derivative}
도 1은 본 발명의 실시예 2에 따라 정상 동물군(A)에 대해 콜라겐 합성 억제 효과를 촬영한 광학현미경 사진이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에 따라 용매 대조군(B)에 대해 콜라겐 합성 억제 효과를 촬영한 광학현미경 사진이다.
도 3은 본 발명의 실시예 2에 따라 실데나필 투여군(C)에 대해 콜라겐 합성 억제 효과를 촬영한 광학현미경 사진이다.
도 4는 본 발명의 실시예 2에 따라 피라졸로피리미딘 유도체 투여군(D)에 대해 콜라겐 합성 억제 효과를 촬영한 광학현미경 사진이다.
본 발명은 피라졸로피리미딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 및 치료제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 피라졸로피리미딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 간섬유화(hepatic fibrosis)를 억제하고, 문맥압(portal hypertension)을 감소시켜 간섬유화의 진행으로 인한 간경변(liver cirrhosis), 그리고 문맥압항진으로부터 유발되는 다양한 합병증의 예방 및 치료제에 대한 것이다.
간은 생체 내 어느 기관보다도 생화학적으로 다양한 기능을 가지고 있다. 생체 내로 흡수된 음식물, 약물 및 여러 외부 물질들이 반드시 거치게 되는 기관으로써, 모든 외부, 내부의 독성물질들을 수용성의 형태로 변화시켜서 체외로 배출시키는 역할을 한다. 여러 장기들의 대사기능과 관련하여 이를 총괄하여 주는 기능을 한다. 또한, 간 조직은 알부민 등 인체에 필수적인 단백질을 생합성하여 공급하기도 하며, 이들 생체활성물질들을 생성 및 처리하는 기능이 있다. 이와 같이 간은 대사기능을 총괄하는 역할을 수행하는 인체에 필수적인 기관으로서, 수 많은 화학공정이 일어나고 있으며, 현재 확인된 것만 해도 500 종류에 달하는 화학공정이 단시간에 수행되는 것으로 알려져 있다. 이러한 간기능의 대부분은 직경 15-30 미크론에 불과한 개개의 간세포(hepatocyte) 내에서 이루어지고 있으며, 사람의 간에는 이러한 간세포가 대략 2500억개가 존재하는 것으로 밝혀져 있다.
간기능의 중심 역할을 담당하는 간세포가 손상을 받게 되면 간세포의 괴사가 일어난다. 간세포는 재생능력이 뛰어나서 괴사 후 재생이 되나, 이러한 괴사와 재생이 반복되면 간섬유화(hepatic fibrosis)가 진행되고, 그 결과로서 간경변증(hepatic cirrhosis), 문맥압 항진증 (portal Hypertension) 또는 이로부터 유발 되는 여러 합병증 등의 질병이 유발된다.
이러한 일련의 과정은 상기에서 언급한 바와 같이 간섬유화 단계 후에 나타난다. 간섬유화란 간에 섬유화물질인 콜라겐이 많이 축적되어 일어나는 증상이다. 간은 간세포, 혈관상피세포(SEC, sinusoidal endothelial cell), 쿠퍼(Kupper)세포, 성상세포(HSC, hepatic stellate cell)의 4가지 세포로 이루어지고, 이들 중에서 간섬유화에 가장 큰 역할을 담당하는 것이 성상세포이다(American Journal of Physiology. Gastrointestinal & Liver Physiology, 279(1), G7 , 2000). 성상세포는 전체 간세포의 약 15%를 차지하며 정상상태에서는 비타민 A의 전구체인 레티노이드(retinoid)를 저장하는 기능을 담당한다. 그러나, 간세포가 손상을 받으면 쿠퍼세포가 손상된 간세포를 탐식하고 여러가지 사이토카인(TGF-beta, PDGF, FGF, HGF, PAF 및 ET-1)을 분비하여 성상세포를 증식시키고, 성상세포는 근섬유아세포로 분화하게 된다. 근섬유아세포는 콜라겐을 합성하고, 합성된 콜라겐이 세포외기질(extracellular matrix)에 축적되어 간장의 섬유화가 일어난다. 결국 성상세포의 활성화가 간섬유화 과정에 있어서 필수적이라고 할 수 있다.
더욱 구체적으로는, 상기 성상세포의 활성화는 전염증성(pre-inflammatory) 단계, 염증성(inflammatroy) 단계 및 후염증성(post-inflammatory) 단계로 설명될 수 있다.
전염증성 단계에서 간세포의 손상은 성상세포 증식의 자극자(stimulator)인 상처 호르몬(wound hormone)을 분비하거나 저해제(inhibitor)인 아르기나제(arginase)를 감소시켜 성상세포를 증식시키며, 알콜에 의한 아세트알데히드의 생성이나 과산화지질(lipid peroxide)의 생성은 기질 유전자 발현을 촉진시킨다.
염증성 단계에서는 활성화된 쿠퍼세포 및 혈소판(platelet) 등에서 분비된 사이토카인(TGF-beta, PDGF, FGF, HGF, PAF 및 ET-1) 등에 의해 성상세포가 증식되고 및 섬유세포 생성능력을 가진 근섬유아세포(myofibroblast)로 분화된다(Seminars in Liver Disease, 16(4), 357, 1996; Journal of Hepatology , 26(6), 1220, 1997).
후염증성 단계에서는 완전히 분화된 상기 근섬유아세포에서 여러가지 사이토카인과 성장인자(growth factor)를 분비하여 미분화된 성상세포를 활성화시키며, 분화된 근섬유아세포는 많은 세포외기질을 분비한다. 활성화 및 성상세포에서 분화된 근섬유아세포는 콜라겐을 합성하여 세포외기질에 축적한다. 콜라겐 모노머(monomer)는 매우 불안정하여 생체온도에서 분해되고 이들이 중합되어 간섬유화가 유발된다(American Journal of Physiology, 264(4 Pt 1), G589 , 1993).
간경변의 원인은 지속적으로 축적된 상기 콜라겐이 중합(polymerization)되어 비수용성 섬유로 변화되는 간섬유화에 기인한다. 그 밖에 장기간의 과도한 알콜 복용, 간염, 유독물질에의 노출 등으로 인하여 간세포의 파괴, 재생, 반흔 등을 수반하는 간 염증이 지속된 결과 간경변이 발생되며, 간의 크기는 줄어들고 표면이 우둘두둘해지게 된다. 간경변은 심할 경우 간문맥압 항진증을 비롯하여 출혈( 특히 식도와 위 출혈), 간암, 노폐물 축적으로 인한 중독, 혼수 등의 생명에 위협을 주는 합병증을 유발할 수 있는 심각한 질병 중의 하나이다. (N. Engl . J. Med. 350:1646-1654)
간문맥압 항진증은 성상세포의 활성화, 간섬유화 및 간경변과 밀접한 연관이 있다. 성상세포의 활성화에 따른 근섬유아세포화(myofibroblast)는 간세포의 신축성 저하를 유발하여 이로 인한 간내 혈류의 저항 (Intrahepatic Resistance)이 증가되므로 간문맥압 항진증(Portal Hypertension)이 발생하는 것으로 알려져 있다. (Semin Liver Dis 2001; 21:337-349)
간조직은 인체내 다른 장기와는 달리 이중으로 혈류 공급을 받는데, 문맥을 통해 이중으로 혈류 공급을 받게 되며, 간동맥을 통해서는 산소가 풍부한 동맥혈이 유입되고, 문맥을 통해서는 위나 장에서 흡수된 영양분을 포함하는 정맥혈이 유입된다. 간동맥을 통해 분당 400 ㎖ 정도, 문맥을 통해 분당 1200 ㎖ 정도가 유입되므로, 간 내부로 유입되는 총혈류량은 간동맥이 1/4, 문맥이 3/4을 담당한다.
이러한 문맥은 다른 정맥과 마찬가지로 압력이 동맥의 1/10 정도 밖에 되지 않기 때문에 쉽게 혈액순환에 장애를 일으킬 수 있다. 지속적인 염증으로 간세포가 손상되고 재생되는 과정의 반복에 의한 섬유성 물질이 축적되어 재생결절이 생성되고, 재생결절이 간조직 내의 혈액이 지나가는 통로를 압박하거나 혈관 자체를 옭아매면 혈액순환 장애가 발생한다. 혈액순환 장애로 인하여 문맥으로 유입되는 혈액 량은 일정한데 간을 통과하여 빠져나가는 혈액량이 감소하게 되면 문맥압이 증가되고 문맥압항진을 유발하게 되는 것이다. 또한, 문맥은 역류 차단밸브가 없는 정맥이기 때문에 혈액순환 장애로 압력이 증가되면 혈액의 역류가 가능하고, 상당량의 혈류가 간을 통과하지 못하고 우회하게 된다. 그 결과, 소화관(특히 식도 및 위장) 내에 측부혈관(collateral vessels)이 발달하게 되며 비장 기능의 항진을 유발하게 된다. 측부혈관은 식도의 점막하, 전측복벽, 직장 등 낮은 압력을 유지하는 곳에서 발달하여 위와 식도의 정맥류, 복수, 치질 및 비장종대(splenic enlargement) 등의 증상들이 수반된다.
상기 문맥압항진증으로 인한 가장 흔한 합병증은 파열된 식도정맥류(esophageal varices)인데, 이 정맥류를 형성하기 위해서는 최소한 12 mmHg 이상의 압력이 필요하다. 대략 간경변 환자의 1/3 정도가 식도와 위의 정맥류를 갖게 되는 데, 이것은 사망원인의 30% 정도를 차지하는 것으로 알려져 있다(American Family Physician, 55(5), 1851, 1997). 현재까지 식도와 위의 정맥류로 인한 출혈에 직접적으로 관여하는 인자들에 대해서 정확하게 알려진 바는 없으나, 문맥압항진증의 정도와 정맥류의 크기가 관여하는 것으로 알려져 있다.
종래, 문맥압항진증을 치료하기 위해서 문맥층(portal bed)으로의 흐름을 감소시키기 위해 비절제술(splenectomy)이나 문맥-대정맥문합술(portacaval shunt)과 같은 수술적 요법이 시도되었다. 또한, 문맥압항진증의 치료제로서 급성 정맥류 출 혈시 사용되는 바소프레신(vasopressin), 소마토스타틴(somatostatin), 비특이적 베타-아드레너직 차단제(beta-adrenergic blocker), 알파-아드레너직 차단제(alpha-adrenergic blocker) 및 질산염(nitrate) 제제 등이 있다. 이러한 약물들은 간 내부로의 동맥혈류의 흐름을 감소시킴으로써 문맥압을 감소시키는 작용을 한다. 그러나, 이들 약물은 간 내부로의 전체적인 문맥 혈액의 흐름이 더욱 악화되는 문제가 발생하기 때문에 문맥압을 선택적으로 감소시킬 수 있는 물질에 대한 개발이 요구되었다.
남성 발기부전 치료제의 유효성분으로 널리 알려진 포스포디에스트라제 5형(phosphodiesterase, 이하 'PDE 5'라함) 저해제는 최근 문맥압항진증 및 이와 관련된 질병에 대하여도 효능이 있는 것으로 밝혀졌다.
예를 들면, PCT/EP2004/006014에서는 PDE 5 저해제들의 문맥압항진증의 예방 및 치료제로서의 용도를 제시하고 있는데, PDE 5 저해제인 실데나필(sildenafil) 및 바데나필(vardenafil)이 간문맥 혈관의 직경의 확장 및 문맥혈액의 흐름을 증가시킴으로써 문맥혈관압력을 감소시켜 문맥압항진증 및 이와 관련된 합병증의 예방 및 치료에 효과를 가지고 있음을 밝히고 있다.
그러나, 문맥 이완 효과가 반드시 간 혈류량 증가 및 문맥압 저하와 연결되는 것은 아니며, 실제로 특정 PDE 5 저해제가 간 혈류 및 문맥압에 미치는 영향을 정확히 예측하기는 불가능하다.
일례로, 실험적 간경변 모델에서 실데나필이 전신 및 내장 혈류동력학(hemodynamics)에 미치는 영향을 실험한 결과, 평균 동맥압을 감소시켜서 전신 저혈압을 유발하면서 장간막 혈류 흐름 및 간 문맥압을 용량 의존적으로 증가시킨다고 보고되었다(Liver International, 24(1), 63, 2004; Digestive Disease Week, Abs S1553 , 2003). 따라서, 상기 연구들에서는 이러한 간문맥압의 증가가 출혈 합병증을 일으킬 수 있어서 간경변 환자에게 실데나필을 처방하기 위해서는 추가적인 연구가 필요하다고 결론내리고 있다.
또한, 간경변에서는 국소적인 NO 과다생성으로 인한 내장 혈관 이완을 수반하는데, 실데나필은 NO의 효과를 증대시키기 때문에 이는 장간막 혈관 긴장성을 더욱 감소시키므로 문맥 혈류량을 증가시킬 수 있다는 보고가 있다(Liver International, 24(1):63,2004; Digestive Disease Week, Abs S1553 , 2003).
한편, 약물에 따라서 다양하게 나타나지만 일반적으로 간경변, 간문맥압 항진증 등의 간질환 환자에서는 간의 대사능력이 감소되어 있기 때문에 곡선하면적(AUC) 및 반감기가 증가된다(Alimentary Pharmacology Therapeutics, 20(1), 29, 2004; Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 25(8), 625, 2003).
그럼에도 불구하고, 만성 간질환의 경우 장기간의 치료가 요구되고 다수의 약물이 복합 처방되기 때문에 반감기가 짧아서 자주 투여해 주어야 하는 약물의 경우 환자의 복약 순응도를 저하시켜서 효과적인 치료가 불가능하게 한다. 따라서, 환자의 복약 순응도를 높이기 위하여 만성 간질환 치료제를 지속성 제제화하는 연구들이 시도되어 왔다. 예를 들면, 식도정맥류 출혈의 예방 및 치료제로 사용되는 합성 소마토스타틴 유사체 옥트레오타이드(octreotide)를 지속정 제제로 1일 1회 투여하였을 때 간문맥 감소 효과가 장기간 유지되었다고 보고된 바 있으며(Hepatology Research, 19(2), 108, 2001), 문맥 경화증에 의해 유발된 문맥 고혈압 생쥐에서 지속 방출형 란레오타이드(lanreotide)를 1일 1회 근육 주사하면, 말초 혈관 이완 및 과도한 혈액 순환의 발생을 지연시키고 문맥 고혈압 및 내장 울혈의 발전을 방지하며, 또한 문맥-전신 우회혈관(shunt)의 발생도 예방할 수 있다고 보고되었다(Journal of Hepatology, 31(3), 482, 1999).
상기와 같은 문제점들을 고려할 때, 간혈류량을 증가시키면서 동시에 문맥압을 감소시킬 수 있고 나아가 반감기가 길어 복약 순응도가 높은 치료제의 필요성이 대두되었다.
본 발명자들은 피라졸로피리미딘 유도체(5-[2-propyloxy-5- (1-methyl-2-pyrollidinylethylamidosulphonyl)phenyl]-1-methyl-propyl-1,6-dihydro-7H-pyrazolo(4,3-d)pyrimidin-7-one)라는 새로운 물질을 합성하고 이것이 PDE 5 저해효과가 있음을 보고한 바 있다(대한민국 등록특허 제377,782호). 그 후, 본 발명자들은 PDE 5 저해제인 상기 피라졸로피리미딘 유도체에 대해 연구를 계속 수행하던 중, 상기 피라졸로피리미딘 유도체가 콜라겐 합성 억제 효과가 우수하고, 간문맥압을 감소시키면서 반감기가 길어서 만성 간질환 환자의 복약 순응도를 증가시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 피라졸로피리미딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 간질환 예방 및 치료제를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 간섬유화 억제제를 제공하는 데 있다.
나아가, 본 발명의 다른 목적은 간섬유화를 억제함으로써, 간경변 예방 및 치료제를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 문맥압 항진 억제제를 제공하는 데 있다.
나아가, 본 발명의 다른 목적은 문맥압이 항진됨으로써 발생하는 합병증의 예방 및 치료제를 제공하는 데 있다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 피라졸로피리미딘 유도체(5-[2-propyloxy-5-(1-methyl-2-pyrollidinylethylamidosulphonyl)phenyl]-1-methyl-propyl-1,6-dihydro-7H-pyrazolo(4,3-d)pyrimidin-7-one)를 유효성분으로 함유하는 간섬유화 억제제, 간경변 및 문맥압항진증 또는 이로부터 유발되는 합병증의 예방 및 치료제를 제공한다.
Figure 112005059910014-PAT00001
상기 피라졸로피리미딘 유도체는 PDE 5 저해제의 일종으로, PDE 5 저해활성이 강력하면서도 선택성이 우수하고, 용해도가 개선돼 흡수가 빠르며 생체이용율과 체내분포용적이 크고 동일기전의 약물인 실데나필 및 바데나필에 비하여 체내 반감기가 3배 정도 긴 특징이 있다.
상기 피라졸로피리미딘 유도체의 이화학적 성질을 살펴보면, 물에는 녹기 어려우나, 초산, 메탄올, 클로로포름에는 잘 녹고, 158~161 ℃의 융점, 각각 6.5 및 12.5 정도의 pKa1, pKa2 값을 가지며 수화물이나 용매화물이 아닌 백색 또는 미백색을 띠는 분말이다.
상기 피라졸로피리미딘 유도체는 크게 세 가지 단계의 합성과정을 거쳐 합성된다. 이를 개략적으로 살펴보면 다음과 같다.
먼저, 제1단계에서는 4-[2-프로필옥시-5-(클로로술포닐)벤즈아미도]-1-메틸-3-프로필-5-카바모일 피라졸을 제조한다. 이의 제조를 위해, 일정량의 4-[2-프로필옥시 벤즈아미도]-1-메틸-3-프로필-5-카바모일 피라졸을 0 ℃로 냉각한 일정량의 클로로술폰산에 가하고 이 혼합물을 교반, 여과, 세척 및 건조 등의 과정을 거쳐서 4-[2-프로필옥시-5-(클로로술포닐)벤즈아미도]-1-메틸-3-프로필-5-카바모일 피라졸을 얻는다.
제2단계에서는 상기 제1단계에서 얻어지는 피라졸 화합물로부터 4-[2-프로필옥시-5-(1-메틸-2-피롤리디닐에틸 아미도술포닐)벤즈아미도]-1-메틸-3-프로필-5-카바모일 피라졸을 제조한다. 이의 제조를 위해, 0℃에서 제1단계의 일정량의 4-[2-프로필옥시-5-(클로로술포닐)벤즈아미도]-1-메틸-3-프로필-5-카바모일 피라졸의 디클로로메탄 용액에 일정량의 2-(2-아미노에틸)-1-메틸 피롤리딘을 가하여 교반하고. 반응 종료 후 상기 반응용액을 디클로로메탄으로 희석하고, 이 유기층을 세척, 건조, 농축 및 여과 등의 과정을 거쳐서 4-[2-프로필옥시-5-(1-메틸-2-피롤리디닐에틸 아미도술포닐)벤즈아미도]-1-메틸-3-프로필-5-카바모일 피라졸을 얻는다.
마지막으로 제3단계에서는 상기 제2단계에서 얻은 화합물로부터 본 발명의 피라졸로피리미딘 유도체인 5-[2-프로필옥시-5-(1-메틸-2-피롤리디닐에틸 아미도술포닐)페닐]-1-메틸-3-프로필-1, 6-디히드로-7H-피라졸로(4,3-d)피리미딘-7-온을 제조한다. 이를 위해, 제2단계에서 합성된 일정량의 피라졸 화합물을 t-부탄올에 녹이고 이 용액에 일정량의 칼륨 t-부톡사이드를 가하여 일정시간 환류 교반한다. 반응완결 후 반응액을 냉각, 희석, 세척, 건조시킨 후, 감압 증류, 용매 제거 및 실 리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 일정량의 순수한 본 발명의 피라졸로피리미딘 유도체를 얻을 수 있다.
본 발명은 간질환 예방 및 치료제에 관한 것이며, 구체적으로는 다음과 같이 설명될 수 있다.
1) 본 발명은 간섬유화 억제제를 제공한다. 2) 또한, 본 발명은 간섬유화를 억제하는 간경변 예방 및 치료제를 제공한다. 3) 나아가, 본 발명은 문맥압 항진 억제제를 제공한다. 4) 또한, 문맥압이 항진됨으로써 유발되는 합병증의 예방 및 치료제를 제공한다.
간 성상세포에서 콜라겐 합성이 증가되어 간섬유화가 진행되면, 섬유질 사이에 남은 간세포가 간기능을 유지하기 위하여 증식하는데 이로 인하여 재생결절들이 형성된다. 이러한 섬유화와 재생결정에 의하여 간소엽의 중심정맥의 혈관이 압박되어 문맥에서 간으로 혈액 유입이 막히게 되면, 문맥압 항진증이 나타난다.
즉, 간섬유화를 억제하면 문맥압도 감소될 수 있으며, 문맥압을 감소시키고 문맥 내 혈류량을 증가시키면 간의 혈류 흐름이 개선되어 전체적으로 간보호 효과가 나타날 수 있다.
이와 같이, 간섬유화, 간보호 효과 및 문맥압 감소 효과가 서로 밀접하게 연관되어 있음을 고려할 때, 본 발명의 피라졸로피리미딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 조성물은 간 성상세포에서 콜라겐 합성을 억제하여 간섬유화의 진행을 방지 하고, 간장 보호작용을 나타내는 동시에, 문맥에 직접 작용하여 문맥압을 감소시키고 문맥내 혈류량을 증가시키므로, 간섬유화 및 문맥압 항진증과 관련된 다양한 만성 간질환에 탁월한 치료효과를 나타낸다.
실제로 본 발명의 피라졸로피리미딘 유도체는 종래의 다른 PDE 5 저해제와 비교할 때, 각각 16배 및 10배 정도 콜라겐 합성 억제 효과가 월등히 우수하여, 간 성상세포에서의 콜라겐 합성 과다로 인한 간섬유화 억제 효과 및 간보호 효과가 탁월함이 확인된다(표 1 참조). 또한, 본 발명의 피라졸로피리미딘 유도체는 농도 의존적으로 문맥압을 감소시키고, 문맥직경 및 문맥내 혈류량을 증가시킬 수 있다. 따라서, 예를 들면, 문맥압을 오히려 증가시킨다고 보고된 실데나필과는 달리, 문맥압항진증 및 이로 인해 유발되는 다양한 합병증의 치료에도 효과적으로 사용될 수 있다(표 2 참조).
상기 만성 간질환은 간섬유화의 진행에 의한 간경변 및 문맥압 항진증으로부터 유발되는 다양한 합병증들을 포함하는데(Rubin Farber Pathology, 1999) 이러한 합병증의 예로는 식도정맥류(esophageal varices)(American Family Physician, 55(5), 1851, 1997), 비장종대 및 기능 항진증(hypersplenism), 복수(ascites), 간신증후군(hepatorenal syndrome)(Gastroenterology Vol.120, No.3), 특발성 세균성 복막염(spontaneous bacterial peritonitis)( Curr Opinion In Gastroenterology 2004,20 :254-263) 간폐증후군(hepatopulmonary syndrome)(Dig Dis Sci 2003, 48: 556-560), 간성혼수(hepatic encephalopathy)( Neuroreport 2003, 14:2379-2382) 등을 들 수 있다. 이들 합병증을 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
식도정맥류는 식도나 위에 비정상적인 정맥들이 생기는 것으로, 심한 경우 이 정맥들이 터져 출혈을 일으키게 된다. 간문맥압의 증가로 인하여 혈액의 흐름이 비정상적으로 이루어지게 되면 비장세포의 크기가 증가하는 비장종대가 발생하며 이는 출혈을 초래하기도 한다. 복수는 위장 밖의 복강 내에 물이 차는 것으로, 문맥압의 증가는 혈장과 임파에 정수압 상승으로 임파성 정체가 일어나 복강 내로 수분의 유출을 유발하여, 환자의 폐가 복수에 눌려 호흡이 곤란하게 되고, 장기화되면 패혈증으로 사망할 수도 있다. 특발성(자발성) 세균성 복막염은 위나 장이 터져 내용물이 흘러나오거나 외상을 입은 경우와 같이 선행원인이 있는 복막염(이차성 복막염)과는 달리, 복수를 동반하는 환자에게서 발생될 수 있기 때문에 문맥압의 증가로 인해 유발된다. 간신증후군은 간경변으로 인해 신장 기능이 극단적으로 저하된 상태로서, 체내 수분 균형이 맞지 않아 신장 기능의 저하가 유발된다. 간폐증후군은 간경화와 같은 만성 간질환자에게서 특별한 심장과 폐질환이 없음에도 저산소증이 생기는 질병이다. 간성혼수는 간경변증과 같이 간기능이 저하된 경우 체내 유독 물질인 암모니아를 요소로 변환시키지 못하여 신경계에 영향을 미치고 심하면 혼수 상태에 빠져 사망하게 되는 질병이다.
앞에서 언급한 바와 같이, 문맥은 혈액순환 장애로 압력이 증가되면 혈액의 역류가 가능하고, 상당량의 혈류가 간을 통과하지 못하고 우회하게 된다. 그 결과, 소화관 내, 예를 들면 식도의 점막하, 전측복벽, 직장 등 낮은 압력을 유지하는 곳에 측부혈관이 발달하게 되고, 상기의 합병증을 유발하게 된다. 결국, 본 발명의 피라졸로피리미딘 유도체는 근본적으로 문맥압의 증가를 억제함으로써, 상기 합병증의 예방 및 치료제로도 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 피라졸로피리미딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 예방 및 치료제는 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 피라졸로피리미딘 유도체는 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 본 발명에서는 경구투여가 바람직하다. 또한, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형 제제는 피라졸로피리미딘 유도체에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
또한, 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴 리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
더불어, 본 발명의 피라졸로피리미딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 투여량 또는 복용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 복용하는 경우 성인을 기준으로 1일 50 ~ 200 ㎎을 1회 내지 수회에 나누어 복용하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 간성상세포를 이용한 피라졸로피리미딘 유도체 의 콜라겐 합성 억제 효과
본 발명의 피라졸로피리미딘 유도체의 콜라겐 합성 억제 효과를 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
Sprague Dawley 계통의 웅성 흰쥐(체중 300 g 내외, n=10)를 이용하여 간성상세포를 분리하였다. 먼저, 케타민(ketamin)을 복강 주사하여 전신 마취를 시킨 뒤, 복부를 절개하여 헤파린을 문맥에 주사한 후, 0.02% 프로나제(pronase), 0.015% 콜라제나제(collagenase)가 함유된 한크(Hank's) 완충액을 간에 일정시간 관류시켜 간을 분해하였다. 이후, 간을 적출하여 멸균된 페트리디쉬 위에서 분쇄하고 프로나제와 DNA 분해효소(DNase)가 함유된 완충액에 담아 다시 멸균된 페트리디쉬 위에서 잘게 갈았다.
50 ㎖ 튜브에 직경 100 ㎛의 나일론 망사(mesh)로 거른 뒤 50g에서 2분간 원심분리하여 상층액의 비실질 세포들을 분리한 뒤, 4 ℃, 450g에서 다시 10분간 원심분리하였다. 이후, 침전물을 25 ㎍/㎖ 농도의 DNA 분해효소가 포함된 완충액에 잘 부유하여 4 ℃, 450g에서 10분간 원심분리하는 과정을 2회 반복하였다. 마지막 침전물을 완충액 21 ㎖에 부유한 후, 25% OptiPrep 17 ㎖와 섞어 최종적으로 11.2% OptiPrep 용액(1.058 g/㎤)을 만들었다. OptiPrep과 섞인 세포 부유액을 17% OptiPrep 3 ㎖가 들어있는 15 ㎖ 튜브 4개에 조심스럽게 분리하고, 그 위에 완충액 1 ㎖를 첨가하고 4 ℃, 1400g에서 17분간 원심분리한 후, 완충액과 11.8% OptiPrep사이에 뿌옇게 보이는 부분에서 순수한 간성상세포를 얻었다.
분리된 간성상세포는 DEME(Dulbecco's Modified Eagle's Media)에 부유하여 세척한 후, 10% FBS(Fetal Bovine Serum), 항생제 처리된 DMEM에 다시 부유한 뒤 배양 용기에 접종하여 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였으며, 배양액은 24시간 후에 교체하고, 매 48시간 마다 교체하며 계대 배양을 실시하였다.
8차 계대한 간성상세포를 2×105개씩 분리한 후, PDGF(Platelet Derived Growth Factor) 25 ng/㎖을 24시간 동안 전처치하였다. 이때, 피라졸로피리미딘 유도체, 실데나필 및 바데나필을 각각 0, 3, 5 및 10 ng/㎖ 농도로 준비하여 함께 반응시킨 후, 전체 RNA를 수거하여 콜라겐에 대한 RT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)을 수행하였다.
베타-액틴(beta-actin)에 대한 상대적인 농도 값을 측정하여 시험물질과의 차이를 분석하였다. 콜라겐 합성에 대한 억제효과는 시험물질을 첨가하지 않았을 경우에 비하여 그 합성이 50% 감소되었을 때 시험약물의 농도(Inhibitory Concentration 50%, IC50 )를 비교하여 콜라겐 합성 억제 효과를 평가하고 그 결과를 표 1에 나타내었다.
PDE 5 저해제들의 콜라겐 합성 억제 효과
화합물 피라졸로피리미딘 유도체 실데나필 바데나필
IC50(nM) 0.8 ± 0.2a 13.1±2.3 7.8±1.7
a평균 ±표준편차
표 1에 나타난 바와 같이, 피라졸로피리미딘 유도체의 IC50 이 0.8±0.2 nM로 실데나필 및 바데나필에 비하여 각각 16배 및 10배 정도로 콜라겐 합성 억제 효과가 나타났다. 따라서, 본원 발명의 피라졸로피리미딘 유도체는 다른 PDE-5 저해제인 실데나필 및 바데나필보다 간 성상세포에서의 콜라겐 합성 억제 효과가 월등히 우수하여 콜라겐 합성 과다로 인한 간섬유화 억제 효과 및 간보호 효과가 탁월함을 확인할 수 있었다.
< 실시예 2> 간섬유화 동물 모델을 이용한 피라졸로피리미딘 유도체 의 간 보호 효과
본 발명의 피라졸로피리미딘 유도체의 콜라겐 합성 억제 효과를 생체내 실험을 통하여 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
Sprague Dawley 계통의 웅성 흰쥐(체중 300 g 내외)를 총 4개군 (5마리/군)으로 나누어 정상대조군을 제외한 나머지 동물에 다음과 같이 간섬유화를 유발하였다(Toxicology, 2001). DMN (dimethylnitrosamine)을 3회/주 연속하여 총 2주간 10mg/kg의 용량으로 복강 투여하였다. 피라졸로피리미딘 유도체 및 실데나필은 DMN 유발기간인 2주 동안 각각 10mg/kg/day의 용량으로 트리아졸 버퍼(Merch)에 용해하여 경구 투여하였으며, 용매 대조군에는 트리아졸 버퍼만을 투여하였다. 시험종료 후 간을 적출하여 10% 중성 포르말린으로 고정한 후 파라핀 포매하여 4μm 간격으로 절편을 제작하였다. 이후 절편에 자일렌(xylene)을 처리하여 파라핀을 제거하고, 알코올 및 0.1% 과산화수소(H2O2)로 처리하였다. 다시 PBS를 처리한 후 1:500으로 희석된 콜라겐형 I(collagen type I)에 대한 다클론성 항혈청(Chemicon)과 1:100으로 희석한 콜라겐형 III(collagen type III)에 대한 다클론성 항혈청 (BioGenesis)을 37 ℃에서 1시간 동안 처리하였다. 세척 후 표본은 1:200으로 희석한 biotin-conjugated goat anti-rabbit IgG에 처리하였다. 면역조직학적 염색은 애버딘-바이오틴 복합체(avidin-biotin complex Vector Laboratories)와 반응시킨 후, 항원-항체 복합체는 3-아미노-9-에틸카바졸 (AEC)로 나타내어 광학현미경을 이용해 촬영하고 이를 도 1에 나타냈다. 대조군은 일차 항체 대신에 비면역 말혈청을 이용하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 용매대조군의 간문맥역과 문맥주위역에서 정상동물에 비하여 현저한 콜라겐의 합성이 관찰되었으며, 피라졸로피리미딘 유도체 및 실데나필에 의하여 콜라겐의 합성이 저하되었음을 확인할 수 있었다. 그러나 피라졸로피리미딘 유도체 투여군이 실데나필 투여군에 비하여 콜라겐 합성의 감소가 뚜렷한 것으로 나타났다.
< 실시예 3> 문맥압항진 동물모델을 이용한 피라졸로피리미딘 유도체 의 효과측정
본 발명의 피라졸로피리미딘 유도체의 문맥압항진에 대한 효과를 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
체중 10 ㎏ 내외의 비글(beagle)개 12마리를 임의의 4개 군(군당 3마리)으로 나누어 담관결찰술(bile duct ligation)을 실시하였다. 수술 후 2주 동안 피라졸로피리미딘 유도체, 실데나필, 및 바데나필을 10 ㎎/㎏/day 용량으로 경구투여하고 3 마리는 부형제만을 투여하였다. 그 후 4시간 이상 절식상태에서 펜토바비탈(pentobarbital)을 정맥투여하여 마취시키고 장간막 정맥을 통하여 문맥까지 삽관하여 문맥압을 측정하였다.
또한, 도플러 울트라소노그래피(Doppler ultrasonography)를 이용하여 문맥의 직경을 측정하였으며, 문맥 내의 혈류를 하기의 수학식 1을 이용하여 계산하고 그 결과를 표 3에 나타내었다.
혈류량 = πR2×V×60 (R: 문맥직경/2, V:평균혈류속도)
유데나필의 문맥압항진에 대한 효력
화합물 용매 투여군 피라졸로피리미딘 유도체 투여군 실데나필 투여군 바데나필 투여군
문맥압(㎪) 3.13±0.31a 2.50±0.20* 2.93±0.25 2.87±0.25
문맥직경(mm) 7.07±0.15 7.70±0.26 7.47±0.21 7.43±0.21
문맥내 혈류량(㎖/분) 584.26± 159.97 932.31± 89.83* 754.47± 80.24 729.29± 83.23
a평균 ±표준편차, *통계학적 유의성을 보임(p<0.05)
표 2에 나타난 바와 같이, 문맥압의 경우 용매 투여군에 비하여 피라졸로피리미딘 유도체 투여군에서는 21%, 실데나필 투여군에서는 7%, 바데나필 투여군에서는 9%가량이 감소됨을 확인하였다. 문맥직경의 경우, 피라졸로피리미딘 유도체, 실데나필 및 바데나필 투여군에서 6~9% 가량 증가하였으나, 약물들간에 통계학적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 문맥내 혈류량의 경우, 용매 투여군에 비하여 피라졸로피리미딘 유도체투여군에서 약 59.5%의 현저한 증가를 나타내었으며, 실데나필 및 바데나필 투여군에서는 각각 29.1 및 24.8% 정도 증가하는 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명의 피라졸로피리미딘 유도체는 다른 약물과는 달리, 문맥압을 현저하게 감소시키면서 문맥내 혈류량도 증가시켜서 식도 정맥류 출혈 등의 합병증 없이 문맥압 항진증 및 이로 인한 다양한 합병증의 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하였다.
< 실시예 4> 피라졸로피리미딘 유도체 의 인체내 약동력학 시험
문맥압항진증 환자 중 19세에서 45세 사이의 연령에 속하는 지원자들을 대상으로 하여 체중이 45 ㎏ 이상이면서 이상체중(ideal body weight)의 15% 편차 이내인 사람, 자의로 참여를 결정하고 서면 동의한 사람, 신뢰할 수 있으며 기꺼이 협조하고 제한사항을 준수하는 사람을 선정하여 무작위로 배정하고 피라졸로피리미딘 유도체, 실데나필 및 바데나필을 각각 100, 50 및 10 ㎎의 용량으로 복용하게 하였다. 참가인원은 모두 9명이었으며, 그 중 3명은 피라졸로피리미딘 유도체, 다른 3명은 실데나필, 또 다른 3명에게는 바데나필을 복용하게 하였다.
시험은 이중맹검법으로 진행되었으며, 시험당일 오전 8~9시경 시험약물을 240 ㎖의 물과 함께 복용하도록 하였다. 복용 후 4시간 동안은 금식하게 하였고 4시간 후 점심, 9시간 후 저녁을 표준식으로 제공하였다. 채혈은 복용 당일 시험약물 복용 이전, 복용 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 24 및 32시간에 실시하였고, 혈장을 분리하여 고성능 액체 크로마토그래피법을 이용하여 분석하였다. 혈장 0.5 ㎖에 0.1M 탄산나트륨 100 ㎕와 에틸에테르 1.0 ㎖를 가하여 1분간 잘 혼합한 후 12,000 rpm에서 3분간 원심분리하였다. 이후 상층액을 취하고 유기용매를 스피드 백(speed vac)을 이용하여 휘발시킨 후 이동상 100 ㎕를 첨가하고 교반하여 고성능 액체 크로마토그래피의 주입기에 주입하였다. 그 결과는 표 3에 나타내었다.
문맥압항진증 환자에 있어서, 피라졸로피리미딘 유도체, 실데나필 및 바데나필의 반감기 비교
피라졸로피리미딘 유도체(100 mg) 실데나필(50 mg) 바데나필(10 mg)
반감기(시간) 15.1 ± 3.5a 4.5 ± 1.2 6.3 ± 2.1
a평균 ±표준편차
표 3에 나타난 바와 같이, 피라졸로피리미딘 유도체의 반감기는 15.1±3.5시간으로 실데나필 4.5±1.2 및 바데나필 6.3±2.1의 반감기에 비하여 각각 3 및 2배 이상 긴 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명의 피라졸로피리미딘 유도체는 간섬유화 억제 및 문맥압항진증 치료 효과가 우수할 뿐만 아니라, 다른 PDE-5 억제제들에 비하여 반감기가 길어서 투약횟수를 감소시킴으로써 만성 간질환 환자에서 복약 순응도를 크게 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.
< 제제예 > 경구투여를 위한 약학적 제제의 제조
1. 산제의 제조
피라졸로피리미딘 유도체 2g
유당 1g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
2. 정제의 제조
피라졸로피리미딘 유도체 100㎎
옥수수전분 100㎎
유 당 100㎎
스테아린산 마그네슘 2㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
3. 캡슐제의 제조
피라졸로피리미딘 유도체 100㎎
옥수수전분 100㎎
유 당 100㎎
스테아린산 마그네슘 2㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
본 발명의 피라졸로피리미딘 유도체는 간 성상세포에서의 콜라겐 합성 억제 효과가 우수하고, 동시에 문맥에 직접 작용하여 문맥직경 및 문맥내 혈류량을 증가시키고 문맥압을 감소시키므로, 간섬유화, 간섬유화의 진행으로 인한 간경변 및 문맥압항진증 및 이로부터 유발되는 다양한 합병증의 예방 및 치료제로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 피라졸로피리미딘 유도체는 인체내 반감기가 길기 때문에 복용횟수를 줄일 수 있어 만성 간질환 환자에서의 복약 순응도를 크게 높일 수 있는 장점이 있다.

Claims (5)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 피라졸로피리미딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 간섬유화 억제제.
    <화학식 1>
    Figure 112005059910014-PAT00002
  2. 하기 화학식 1로 표시되는 피라졸로피리미딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 간경변 예방 및 치료제.
    <화학식 1>
    Figure 112005059910014-PAT00003
  3. 하기 화학식 1로 표시되는 피라졸로피리미딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 문맥압항진 억제제.
    <화학식 1>
    Figure 112005059910014-PAT00004
  4. 하기 화학식 1로 표시되는 피라졸로피리미딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 문맥압이 항진됨으로써 유발되는 합병증의 예방 및 치료제.
    Figure 112005059910014-PAT00005
  5. 제 4항에 있어서, 상기 문맥압항진증으로부터 유발되는 합병증은 식도정맥류, 비장종대 및 기능 항진증, 복수, 특발성 세균성 복막염, 간신증후군, 간성혼수 또는 간폐증후군으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 문맥압항진증 또는 이로부터 유발되는 합병증의 예방 및 치료제.
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