PT1888074E - Agente para a prevenção e tratamento de doenças do fígado contendo um derivado de pirazolopirimidina - Google Patents

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DESCRIÇÃO "AGENTE PARA A PREVENÇÃO E TRATAMENTO DE DOENÇAS DO FÍGADO CONTENDO UM DERIVADO DE PIRAZOLOPIRIMIDINA" [Campo Técnico] A presente invenção relaciona-se com uma composição farmacêutica para a prevenção e tratamento de doenças do fígado contendo um derivado de pirazolopirimidina como princípio activo, mais precisamente, uma composição farmacêutica para a prevenção e tratamento da fibrose hepática, cirrose hepática causada pela fibrose hepática, hipertensão portal e várias complicações conduzidas pela hipertensão portal contendo um derivado de pirazolopirimidina como princípio activo.

[Técnica Anterior] 0 fígado tem mais funções bioquímicas do que qualquer outro órgão. É um órgão essencial através do qual passam alimentos, medicamentos e outros materiais estranhos absorvidos, e o fígado tem uma função de eliminar materiais tóxicos adquiridos ou naturais após transformar estes materiais tóxicos numa forma solúvel em água. E, está geralmente envolvido nas funções metabólicas de vários órgãos. Os tecidos do fígado sintetizam e fornecem 2 ΡΕ1888074 proteínas essenciais tais como a albumina para o organismo humano e, ao mesmo tempo, gera e liberta materiais activos in vivo. Como explicado acima, o fígado é um órgão crucial que controla as funções metabólicas humanas, nas quais tê lugar numerosos processos químicos. Tem sido confirmado até à actualidade que ocorrem aproximadamente 500 processos químicos no fígado num curto período de tempo. Os hepatócitos são as células funcionais principais do fígado, e cada hepatócito individual tem um diâmetro de 15-30 mícron. 0 fígado humano contém aproximadamente 250 mil milhões de hepatócitos.

As lesões nos hepatócitos resultam em necrose das células. Após a necrose, no entanto, os hepatócitos são regenerados devido á sua excelente capacidade de regeneração inata. Todavia, a repetição da necrose e da regeneração desencadeia a fibrose hepática, e como resultado, a cirrose hepática, hipertensão portal e as complicações que decorrem desse modo.

Uma série de doenças relacionadas desenvolvem-se todas após a fibrose hepática. A fibrose hepática é causada pela acumulação de colagénio, uma substância fibrogénica, no fígado. As células do fígado são compostas de hepatócitos, células endoteliais sinusoidais (SEC), células de Kupper, e células estreladas hepáticas (HSC), e de entre estes 4 tipos de células, as células estreladas hepáticas desempenham o papel mais importante na fibrose hepática (American Journal of Physiology. Gastrointestinal & Liver 3 ΡΕ1888074

Physiology, 279(1), G7, 2000). As células estreladas hepáticas constituem 15% da totalidade das células do figado e têm normalmente uma função de armazenarem retinóide o qual é um precursor da vitamina A. No entanto, uma vez os hepatócitos estarem danificados, as células de Kupper começam a consumir os hepatócitos danificados e segregam citoquinas (TGF-beta, PDGF, FGF, HGF, PAF e ET-1) para a proliferação de células estreladas hepáticas. As células estreladas hepáticas são diferenciadas em miofibroblastos. Os miofibroblastos sintetizam colagénio, o qual se acumula na matriz extracelular e conduz à fibrose hepática. Isto significa que a activação das células estreladas hepáticas desempenha um papel essencial no desenvolvimento da fibrose hepática.

Mais precisamente, a activação das células estreladas hepáticas é alcançada nos três estádios seguintes, estádio pré-inflamatório, estádio inflamatório, e estádio pós-inflamatório.

No estádio pré-inflamatório, a lesão dos hepatócitos induz a secreção da hormona do ferimento, um estimulador da proliferação das células estreladas hepáticas, ou a proliferação das células estreladas hepáticas pela redução da arginase, um inibidor da proliferação celular. Na maioria dos casos, o álcool origina a geração de acetaldeído ou peróxido lipidico, resultando na promoção da expressão de um gene de matriz. 4 ΡΕ1888074

No estádio inflamatório, as células estreladas hepáticas são feitas proliferar por citoquinas (TGF-beta, PDGF, FGF, HGF, PAF e ET-1) segregadas nas células de Kupper activadas e plaquetas, que são então diferenciadas em miofibroblastos capazes de gerar fibrócitos (Seminars in Liver Disease, 16(4), 357, 1996; Journal of Hepatology, 26(6), 1220, 1997) .

No estádio pós-inflamatório, as citoquinas e factores de crescimento são segregados em miofibroblastos completamente diferenciados para activar as células estreladas hepáticas não diferenciadas e para segregar matrizes extracelulares. Os miofibroblastos activados e diferenciados das células estreladas hepáticas sintetizam colagénio, o qual é então acumulado na matriz extracelular. 0 monómero de colagénio é muito instável e facilmente decomposto à temperatura corporal, e os monómeros decompostos são polimerizados para induzir a fibrose hepática (American Journal of Physiology, 264(4 Pt 1), G589, 1993) . A cirrose hepática é atribuída à fibrose hepática, a qual é desenvolvida pela polimerização do colagénio acumulado continuamente, alterando o colagénio acumulado em fibra insolúvel. A cirrose hepática pode também ser induzida pela inflamação contínua no fígado acompanhando a destruição dos hepatócitos, a regeneração e a cicatrização, causada pelo abuso do álcool de longa duração, hepatite, exposição a substâncias tóxicas, etc. 5 ΡΕ1888074

Como resultado, o tamanho do fígado é reduzida e a superfície do fígado torna-se irregular. A cirrose hepática grave é uma doença séria causadora de complicações letais tais como a hipertensão portal, hemorragia (especialmente no esófago e estômago), hepatoma, intoxicação pela acumulação de materiais residuais, coma, etc. (N. Engl. J. Med. 350:1646-1654). A hipertensão portal está relacionada proximamente com a activação das células estreladas hepáticas, com a fibrose hepática e com a cirrose hepática. Os miofibroblastos diferenciados pela activação das células estreladas hepáticas reduz a elasticidade dos hepatócitos, e, assim, aumenta a resistência intra-hepática e é desenvolvida a hipertensão portal (Semin. Liver Dis. 2001; 21:337-349).

Diferentemente de outros órgãos, o tecido do fígado tem caracteristicamente uma dupla via para o fluxo sanguíneo, que é o sangue arterial rico em oxigénio que flui para o tecido do figado através da artéria hepática, e o sangue venoso contendo nutrientes absorvidos a partir do estômago ou intestinos que flui através da veia porta hepática. A quantidade de sangue que entra através da artéria hepática é de cerca de 400 mL por minuto, e a quantidade de sangue que entra através da veia porta hepática é de cerca de 1300 mL por minuto, significando que 1/4 do fluxo total de sangue que entra no fígado toma a via da artéria hepática, enquanto os restantes 3/4 tomam a via da veia porta hepática. 6 ΡΕ1888074 A pressão sanguínea portal, similarmente a outras pressões venosas, é apenas cerca de 1/10 da pressão arterial, e isto pode facilmente conduzir a perturbações na circulação sanguínea. A repetição de danos a uma regeneração de hepatócitos pela inflamação contínua resulta na acumulação de materiais fibrosos e ao desenvolvimento de nodos de regeneração. Os nodos de regeneração colocam pressão nas vias sanguíneas no tecido do figado ou provocam a vasoconstrição no próprio vaso, causando perturbação na circulação sanguínea. Embora o sangue que flui através da veia porta não seja perturbado, o sangue que flui através do tecido do fígado é diminuído pela perturbação na circulação sanguínea. Como resultado, a pressão sanguínea portal fica aumentada, causando hipertensão portal. A veia porta é um tipo de veia sem válvula de anti-ref luxo, de forma que pode ocorrer o refluxo sanguíneo sempre que a pressão sanguínea portal esteja aumentada por perturbações na circulação, e então o sangue procura um desvio na circulação. Como resultado, são desenvolvidos vasos colaterais no trato digestivo (em particular no esófago e estômago), causando dessa forma o hiperplenismo. Os vasos colaterais são desenvolvidos geralmente em áreas de baixa pressão tais como na submucosa do esófago, na parede anterolateral do abdómen, recto, etc., com consequentes sintomas de varizes esofágicas, fluído ascítico, hemorróides e alargamento esplénico. A complicação mais comum da hipertensão portal 7 ΡΕ1888074 são as varizes esofágicas que necessitam de apenas 12 mmHg de pressão para se formarem. Aproximadamente um terço dos pacientes com cirrose hepática apresenta varizes no esófago e no estômago, o que dá conta de cerca de 30% das causas de morte (American Family Physician, 55(5), 1851, 1997). Até agora, os factores envolvidos no sangramento por varizes esofágicas e varizes gástricas não estão completamente compreendidos, mas acredita-se que a dimensão das varizes esteja associada à gravidade da hipertensão portal (Pharmacotherapy: a phathophysiologic approach, 1996).

Para tratar a hipertensão portal, têm sido realizadas operações cirúrgicas tais como esplenectomia ou a derivação portacaval, para reduzir o fluxo no leito portal. Os medicamentos para a hipertensão portal são exemplificados pela vasopressina utilizada geralmente para a hemorragia aguda das varizes, somatostatina, bloqueador beta-adrenérgico não especifico, bloqueadores alfa-adrenér-gicos, e preparações de nitratos. Estes medicamentos diminuem a pressão na veia porta pela redução do fluxo arterial na direcção do figado. Como resultado, a totalidade da corrente sanguinea portal para o figado, que está já afectada negativamente, deteriora-se ainda mais. Portanto, há muitos anos que tem havido uma necessidade do desenvolvimento de substâncias que diminuam selectivamente a pressão na veia porta.

Tem sido provado que o inibidor da fosfodies-terase do tipo 5 (daqui em diante referida como "PDE 5"), ΡΕ1888074 já conhecido como um ingrediente activo na medicação para a disfunção eréctil, é também eficaz no tratamento da hipertensão portal e de doenças com ela relacionadas.

Por exemplo, a utilização de inibidores do PDE 5 para a prevenção e tratamento da hipertensão portal está descrita nas Patentes PCT/EP2004/006014, WO-A-2004/037183 e Kang et al, Archives of Pharmacal Research, vol. 26, n°. 8, 2003, pp. 612-619. Precisamente, os inibidores do PDE 5, sildenafil e vardenafil, têm efeitos preventivos e terapêuticos sobre a hipertensão portal e as suas complicações, pelo abaixamento da pressão sanguínea portal através do aumento do diâmetro dos vasos sanguíneos portais e do fluxo sanguíneo portal. NO entanto, a relaxação da veia porta não significa automaticamente um aumento do fluxo sanguíneo através do fígado e a diminuição da pressão sanguínea portal, e de facto, o efeito de um inibidor específico da PDE 5 sobre o fluxo sanguíneo através do fígado e sobre a pressão sanguínea portal são imprevisíveis. A Patente WO-A-2006/074872 divulga a utilização de inibidores da PDE-5 para o tratamento de doenças relacionadas com a actividade da PDE-5. Não há divulgação da utilização do composto da presente invenção para o tratamento da cirrose hepática ou para a inibição da hipertensão portal. 9 ΡΕ1888074

De acordo com um relatório anterior investigando o efeito do sildenafil sobre a hemodinâmica sistémica e visceral em modelos experimentais da cirrose, o sildenafil reduz a pressão arterial média, causando hipotensão sistémica, e aumenta o fluxo sanguíneo através do mesentério e a pressão sanguínea portal de uma forma dependente da dosagem (Liver International, 24(1), 63, 2004; Digestive Disease Week, Abs S1553, 2003). Desta forma os investigadores que realizaram as experiências acima concluíram que são necessários estudos adicionais para prescrever o sildenafil a um paciente com cirrose, porque o aumento da pressão sanguínea portal pelo sildenafil pode trazer complicações por hemorragia.

No caso da cirrose hepática, é observada a relaxação vascular esplâncnica pela sobre-produção de NO local. De acordo com um relatório, o sildenafil aumenta o efeito do NO, resultando na diminuição da tonicidade angiomesentérica e no aumento do fluxo sanguíneo portal (Liver International, 24(1):63, 2004; Digestive Disease Week, Abs S1553, 2003). A Patente EP-A-1336602 divulga compostos com a fórmula "F-(X)q" que pode libertar NO in vivo. Eles são ditos como sendo úteis no tratamento de doenças inflamatórias, isquémicas, degenerativas e proliferativas, incluindo as do sistema gastrointestinal. O significado de F pode ser DA-8159 (udenafilo). No entanto, é um requisito essencial desta divulgação que a espécie F deverá estar ligada a de um a cinco substituintes X como definido nas Reivindicações. Desta forma, o composto 10 ΡΕ1888074 referido neste documento não é o mesmo do composto da Figura 1 na presente invenção. A função metabólica do fígado está mais ou menos reduzida em pacientes com doenças do fígado tais como a cirrose hepática, hipertensão portal, etc., de forma que a área sob a curva concentração-tempo (AUC) e a semi-vida do medicamento é aumentada (Alimentary Pharmacology Thera-peutics, 20(1), 29, 2004; Methods and Findings in Experimental and Clinicai Pharmacology, 25(8), 625, 2003).

De qualquer forma, um paciente com doença crónica do fígado necessita da administração a longo prazo e de múltiplas prescrições. Se é prescrito ao paciente um medicamento tendo uma semi-vida curta, isto baixa a taxa da adesão do doente e dificulta um tratamento eficaz.

Portanto, têm sido realizados estudos para preparar um medicamento para o tratamento de doenças crónicas do fígado que mantenha continuamente o seu efeito terapêutico, e que aumente a taxa da adesão do paciente. E foi relatado que quando foi administrado um octreótido semelhante à somatostatina sintético uma vez ao dia na forma de uma preparação de libertação prolongada, o efeito da redução da pressão sanguínea portal foi de longa duração (Hepatology Research, 19(2), 108, 2001). Além disso, quando foi administrado lanreótido na forma de libertação prolongada uma vez ao dia por injecção intramuscular a um 11 ΡΕ1888074 rato com hipertensão portal induzida pela esclerose hepatoportal, a vasodilatação periférica e a excessiva circulação sanguínea foram proteladas e a hipertensão portal e a congestão visceral, adicionalmente a derivação sistémica portal, foram prevenidas (Journal of Hepatology, 31(3), 482, 999).

Considerando os problemas acima, existe uma necessidade de desenvolver um novo medicamento que possa aumentar o fluxo sanguíneo hepático sem efeitos secundários, reduza a pressão sanguínea portal, e aumente a adesão com uma longa semi-vida.

Os presentes inventores sintetizaram um novo composto, o derivado de pirazolopirimidinona 5-[2-propilo-xi-5-(1-meti1-2-pirolidiniletilamidossulfonil)fenil]-1-metil-propil-1,6-di-hidro-7H-pirazolo(4,3-d)pirimidin-7-ona, e relataram o seu efeito inibidor da PDE 5 num estudo anterior (Patente Coreana N.° 377 782). Depois, os presentes inventores mantiveram o estudo sobre o derivado de pirazolopirimidinona, como um inibidor da PDE 5, e completaram esta invenção confirmando que o derivado de pirazolopirimidinona tem excelente efeito inibidor da síntese de colagénio, e pode melhorar a adesão medicinal de pacientes com doença crónica do fígado dado que o derivado de pirazolopirimidinona tem uma longa semi-vida e reduz a pressão sanguínea portal. 12 ΡΕ1888074 [Divulgação] [Problema Técnico] É um objectivo da presente invenção proporcionar uma composição farmacêutica para a prevenção e tratamento de doença do fígado contendo um derivado de pirazolopi-rimidinona como um princípio activo. É um outro objectivo da presente invenção proporcionar um inibidor da fibrose hepática. É um objectivo adicional da presente invenção proporcionar uma composição farmacêutica para a prevenção e tratamento da cirrose hepática pela inibição da fibrose hepática. E também um objectivo da presente invenção proporcionar um inibidor da hipertensão portal. É um outro objectivo da presente invenção proporcionar uma composição farmacêutica para a prevenção e tratamento de complicações geradas pela progressão da hipertensão portal.

[Solução Técnica]

Para alcançar os objectivos acima, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica para a 13 ΡΕ1888074 prevenção e tratamento da fibrose hepática, da cirrose do fígado, da hipertensão portal, e das complicações por ela causadas, contendo um derivado de pirazolopirimidinona como um princípio activo. A presente invenção está descrita em detalhe mais abaixo. A presente invenção proporciona um derivado de pirazolopirimidinona (5-[2-propiloxi-5(1-meti1-2-pirolidi-niletilamidossulfonil)fenil]-1-metil-propil-1,6-di-hidro-7H-pirazolo(4,3-d)pirimidin-7-ona) representado pela seguinte figura química 1 para utilização na inibição, prevenção ou tratamento da fibrose hepática, da cirrose do fígado, da hipertensão portal, e das complicações por ela causadas. <Figura Química 1>

rCH3 3 0 derivado de pirazolopirimidinona é um tipo de inibidor da PDE 5. Ele tem excelente actividade inibidora da PDE 5 e selectividade. 0 derivado de pirazolopirimi dinona é absorvido rapidamente devido à sua solubilidade melhorada, e tem elevada biodisponibilidade e formidável 14 ΡΕ1888074 biodistribuição. Além disso, ele é caracterizado por uma semi-vida pelo menos três vezes maior do que a do sildenafil e do vardenafil.

As propriedades fisico-quimicas do derivado de pirazolopirimidinona são como se segue; é insolúvel em água mas solúvel em ácido acético, metanol e clorofórmio. 0 seu ponto de fusão é a 158-161°C e tem valores de pKai e pKa2 de 6,5 e 12,5 respectivamente. É um pó branco ou amarelo claro que não é nem hidrato nem solvato. 0 derivado de pirazolopirimidinona pode ser sintetizado pelos seguintes três passos, como particularizado abaixo:

No passo 1, é preparado 4-[2-propiloxi-5-(clorossulfonil)benzamido1-1-meti1-3-propil-5-carbamoil pirazole. Precisamente, é adicionada a quantidade adequada de 4-[2-propil-oxi-benzamidol-l-metil-3-propil-5-carbamoil pirazole à solução da quantidade adequada de ácido clorossulfónico arrefecida a 0°C. A mistura é agitada, filtrada, lavada e secada, para dar 4-[2-propiloxi-5-(clorossulfonil)benzamidol-l-metil-3-propil-5-carbamoil pirazole.

No passo 2, é preparado 4-[2-propiloxi-5-(1-metil)-2-pirrolidiniletil)amidossulfonil)benzamido]-1-metil-3-propil-5-carbamoil pirazole a partir do composto de pirazole produzido no passo 1 acima. Precisamente, a 15 ΡΕ1888074 quantidade adequada de 2-(2-aminoetil)-1-metil-pirrolidina é adicionada a 0°C a uma solução de diclorometano contendo a quantidade adequada de 4-[ 2-propiloxi-5-(clorossul-fonil)benzamido]-1-metil-3-propil-5-carbamoil pirazole do passo 1, seguido de agitação. Após a reacção estar completada, a solução reaccional é diluída com diclorometano. A fase orgânica é lavada, secada, concentrada e filtrada para dar 4-[2-propiloxi-5-(1-meti1-2-pirrolidiniletil-amidos- sulfonil)benzamido]-1-meti1-3-propil-5-carbamoil pirazole.

No passo 3, 5-[2-propiloxi-5-(l-metil-2-pirroli- diniletil-amidossulfonil)fenil]-1-metil-3-propil-l,6-di-hidro-7H-pirazolo(4,3-d)pirimidin-7-ona, o qual é o derivado de pirazolopirimidinona da presente invenção, é preparado a partir do composto obtido no passo 2. Precisamente, a quantidade adequada do composto de pirazole sintetizado no passo 2 é dissolvida em t-butanol, ao qual é adicionada a quantidade adequada de t-butóxido de potássio, seguida de refluxo durante um tempo necessário. Após a reacção estar completada, a solução reaccional é de novo arrefecida, diluída, lavada e secada. Depois, são realizadas a destilação a pressão reduzida, a eliminação de um solvente e a cromatografia em coluna de gel de sílica, para dar o novo derivado de pirazolopirimidinona da invenção. A presente invenção relaciona-se com uma composição farmacêutica para a prevenção e tratamento de doença do fígado, e é descrita como se segue: 16 ΡΕ1888074 1) A presente invenção proporciona um inibidor da fibrose hepática. 2) A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica para a prevenção e tratamento da cirrose hepática, inibindo a fibrose hepática. 3) A presente invenção proporciona ainda um inibidor da hipertensão portal. 4) A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica para a prevenção e tratamento de complicações causadas pela hipertensão portal.

Com o aumento do depósito de colagénio nas células estreladas hepáticas no figado, é desenvolvida a fibrose hepática. Então, as células do figado que permanecem entre as fibras começam a proliferar para manterem as funções do figado, pelo que são formados nodos de regeneração. A veia central do lóbulo hepático é pressionada por tal fibrose e nodos de regeneração, resultando no bloqueio do fluxo sanguíneo através da veia porta para o fígado, causando a hipertensão portal.

Desta forma, a pressão sanguínea portal pode ser reduzida com a inibição da fibrose hepática. 0 fluxo sanguíneo através do fígado pode ser melhorado com a diminuição da pressão sanguínea portal e o aumento do fluxo sanguíneo portal, conduzindo à protecção do figado.

Como aqui mencionado anteriormente, o controlo da fibrose hepática e da pressão sanguínea portal está proximamente relacionado com a protecção do fígado. A 17 ΡΕ1888074 presente invenção utiliza o referido derivado de pirazolo-pirimidinona como um principio activo para prevenir a progressão da fibrose hepática pela inibição da síntese de colagénio nas células estreladas hepáticas, tem um efeito protector sobre o fígado, pode reduzir a pressão sanguínea portal trabalhando directamente em direcção da veia porta, e aumenta o fluxo sanguíneo através da veia porta, tudo isto sugerindo que a presente invenção tem um excelente efeito terapêutico sobre a doença crónica do fígado relacionada com a fibrose hepática e a hipertensão portal. 0 derivado de pirazolopirimidinona da presente invenção tem um excelente efeito inibidor da síntese de colagénio 10-16 vezes o de outros inibidores convencionais da PDE 5. Foi confirmado por tal excelente efeito que o derivado de pirazolopirimidinona da invenção pode inibir a fibrose hepática causada pelo depósito de colagénio nas células estreladas hepáticas no fígado, e protege o fígado (veja-se o Quadro 1). Adicionalmente, o derivado de pirazolopirimidinona da invenção reduz a pressão sanguínea portal de uma forma dependente da dosagem, mas aumenta o diâmetro portal e o fluxo sanguíneo portal. Diferentemente do sildenafil que foi relatado como aumentando a pressão sanguínea portal, o derivado de pirazolopirimidinona da invenção pode ser utilizado eficazmente para o tratamento da hipertensão portal e de várias complicações por ela induzidas (veja-se o Quadro 2).

As doenças crónicas do fígado incluem várias 18 ΡΕ1888074 complicações causadas pela cirrose do figado resultantes da fibrose hepática e da hipertensão portal (Rubin Farber Pathology, 1999). Tais complicações são exemplificadas pelas varizes esofágicas (American Family Physician, 55(5), 1851, 1997), alargamento esplénico e hiperplenismo, ascite, sindrome hepato-renal (Gastroenterology Vol. 120, N.° 3), peritonite bacteriana espontânea (Curr Opinion In Gastroenterology 2004, 20:254-263), sindrome hepato-pul-monar (Dig Dis Sei. 2003, 48: 556-560), encefalopatia hepática (Neuroreport 2003, 14:2379-2382), etc.. Tais complicações são descritas aqui abaixo em detalhe.

Varizes esofágicas, refere-se à geração de veias anormais no esófago ou estômago. Quando a condição piora torna-se pior, estas veias rebentam e sangram. Pressão sanguínea portal elevada causa distúrbios no fluxo sanguíneo, aumentando o tamanho das células do baço, através do qual o alargamento esplénico, outra causa de hemorragias internas, se desenvolve. A ascite indica hidropisia abdominal. Pressão portal elevada aumenta a pressão hidrostática no plasma sanguíneo e linfa, resultando em estase linfática induzindo a descarga de humidade para a cavidade abdominal. A ascite pressiona o pulmão, causando respiração penosa, e a pressão a longo prazo sobre o pulmão até origina a septicemia fatal. A peritonite bacteriana idiopática (autogénea), também desencadeada pela pressão sanguínea portal elevada, é observada frequentemente em pacientes com ascite, diferentemente de outras peritonites (peritonite secundária) que tem uma causa antecipatória tal 19 ΡΕ1888074 como uma ruptura de vaso sanguíneo interno e ruptura de vaso sanguíneo gástrico ou traumatismo. A síndrome hepato-renal indica uma depressão grave do rim pela cirrose hepática, despoletada por um desequilíbrio no fluido corporal. A síndrome hepato-pulmonar é uma doença de hipoxia, observada em pacientes com doença crónica do fígado, embora estes pacientes não tenham uma doenças cardíaca ou dos pulmões específica. Tal como a cirrose hepática, a encefalopatia hepática é uma outra complicação grave que se desenvolve a partir de um mal funcionamento na conversão do amoníaco, um material interno tóxico, em ureia como uma das funções do fígado, afectando dessa forma o sistema neuronal e conduzindo até ao coma fatal.

Como aqui anteriormente explicado, a perturbação na circulação sanguínea pressiona as veias porta e então ocorre o refluxo sanguíneo nas veias porta, de forma que o fluxo sanguíneo encontra um desvio sem passar através do fígado. Como resultado, são gerados vasos colaterais particularmente em áreas de baixa pressão do trato alimentar tais como sob a camada da mucosa do esófago, sobre as paredes abdominais anterolaterais e no recto, etc. Desta forma, o derivado de pirazolopirimidinona da presente invenção pode ser utilizado eficazmente como uma composição farmacêutica para a prevenção e tratamento das acima mencionadas complicações, fundamentalmente pela supressão da crescente pressão portal.

Uma composição farmacêutica para a prevenção e tratamento de doença do fígado, contendo o derivado de 20 ΡΕ1888074 pirazolopirimidinona como um princípio activo da presente invenção, pode ser administrada oralmente ou parenteri-camente e ser utilizada nas formas gerais da formulação farmacêutica. Nesta invenção, é preferida a administração oral. A composição farmacêutica da presente invenção pode ser preparada para administração oral ou parentérica pela mistura com enchimentos, cargas, aglutinantes, agentes humectantes, agentes desintegrantes, diluentes tais como surfactantes, ou excipientes utilizados geralmente.

As formulações sólidas para administração oral são comprimidos, pílulas, pós para polvilhamento, grânulos e cápsulas. Estas formulações sólidas são preparadas pela mistura com um ou mais excipientes adequados tais como amido, carbonato de cálcio, sacarose, lactose, gelatina, etc.. Para além dos excipientes mais simples, podem ser utilizados lubrificantes, por exemplo estearato de magnésio, talco, etc..

As formulações líquidas para administração oral são suspensões, soluções, emulsões e xaropes, e as formulações acima mencionadas podem conter vários excipientes tais como agentes humectantes, adoçantes, aromatizantes e conservantes, para além dos diluentes simples utilizados geralmente, tais como água e parafina líquida. As formulações para administração parentérica são soluções aquosas esterilizadas, excipientes insolúveis em água, suspensões, emulsões, e supositórios. Os excipientes insolúveis em água e suspensões podem conter, para além do composto ou compostos activos, propilenoglicol, polietile- 21 ΡΕ1888074 noglicol, óleo vegetal tal como azeite, éster injectável tal como oleato de etilo, etc.. Os supositórios podem conter, para além do composto ou compostos activos, Witepsol®, macrogol, Tween 61, manteiga de cacau, manteiga de "laurin", glicerogelatina, etc. A dosagem eficaz da composição contendo o derivado de pirazolopirimidinona como um principio activo da presente invenção pode ser administrada de acordo com o peso, idade, género, condição de saúde, dieta, frequência de administração, método de administração, excreção e gravidade de uma doença. A dosagem e frequência de administração preferida para um adulto é de 50 mg - 200 mg por dia e de uma a três ou quatro vezes ao dia.

[Breve Descrição dos Desenhos]

As Figuras 1-4 são um conjunto de microfo-tografias mostrando os efeitos inibidores da síntese de colagénio, de acordo com o Exemplo 2 da invenção, do controlo do tipo natural (Fig. 1), do controlo com solvente (Fig. 2), do grupo tratado com sildenafil (Fig. 3) e do grupo tratado com o derivado de pirazolopirimidinona (Fig. 4).

[Melhor Método para Levar a Cabo a Invenção]

As formas de realização práticas e actualmente mais preferidas da presente invenção são ilustrativas como se mostra nos Exemplos seguintes. 22 ΡΕ1888074

No entanto, será entendido que os peritos na arte, ponderando esta divulgação, podem fazer modificações e melhorias dentro do espirito e objectivo da presente invenção. <Exemplo 1> Investigação sobre o efeito inibidor do derivado de pirazolopirimidinona sobre a síntese de colagénio, utilizando células estreladas hepáticas

As experiências seguintes foram realizadas para investigar o efeito inibidor do derivado de pirazolopirimidinona da presente invenção sobre a síntese de colagénio.

Isolaram-se células estreladas hepáticas a partir de ratos macho brancos Sprague Dawley (cerca de 300 g em peso, n = 10). Primeiro, foi injectada cetamina na cavidade abdominal para anestesiar os ratos. 0 abdómen foi aberto e foi injectada heparina na veia porta. Então, foi aplicada por perfusão solução tampão de Hank contendo 0,02% de pronase e 0,015% de colagenase através do fígado durante um tempo necessário para se preparar o fígado em camadas. 0 fígado extraído foi esmagado numa caixa de Petri esterilizada, depois posto numa solução tampão contendo pronase e DNase, e o fígado esmagado foi então homogeneizado numa caixa de Petri esterilizada. A amostra preparada foi filtrada com uma rede de nylon de 100 μπι num tubo de 50 mL. Foi realizada a 23 ΡΕ1888074 centrifugação de novo com 50 g durante 2 minutos para separar as células não parenquimais no sobrenadante. A centrifugação foi realizada de novo com 450 g a 4°C durante 10 minutos. 0 precipitado foi posto a flutuar numa solução tampão contendo 25 pg/mL de DNase, seguido de centrifugação com 450 g a 4°C durante 10 minutos, o que foi repetido duas vezes. O precipitado final foi posto a flutuar em 21 mL de solução tampão, a qual foi depois misturada com 17 mL de OptiPrep a 25% para se preparar a solução final de OptiPrep a 11,2% (1,058 g/cm3) . A solução com a suspensão celular misturada com OptiPrep foi cuidadosamente distribuída por quatro tubos de 15 mL contendo 3 mL de OptiPrep a 17%, aos quais foi adicionado 1 mL de solução tampão. Foi realizada a centrifugação com 1400 g a 4°C durante 17 minutos, e, como resultado, foram obtidas células estreladas hepáticas puras a partir da camada opaca entre a solução tampão e a OptiPrep a 11,8%.

As células estreladas hepáticas separadas foram suspensas em DMEM (Meio de Eagle modificado por Dulbecco), seguido de lavagem. As células foram suspensas de novo em DMEM suplementado com 10% de SBF (Soro Fetal de Bovino) e antibióticos, depois foram inoculadas num balão de cultura, que foi cultivado num incubador a 37°C com 5% de C02. 0 meio de cultura foi primeiro substituído 24 horas mais tarde, e depois substituído a cada 48 horas para sub-cultura.

As células estreladas hepáticas sub-cultuvadas 8 - 24 - ΡΕ1888074 vezes, foram agrupadas em 2 x 105, que foram pré-tratadas com 25 ng/mL de PDGF (Factor de Crescimento Derivado de Plaquetas) durante 24 horas. Nesse momento, foram adicionados derivado de pirazolopirimidinona, sildenafil e vardenafil a concentrações diferentes de 0, 3, 5, e 10 ng/mL para reacção. O ARN total foi extraído e foi realizada uma RT-PCR (Reacção em cadeia da polimerase com transcrição reversa) para o colagénio.

Com base na concentração relativa da beta-actina, foi comparado um material alvo com outras amostras de teste. De forma a determinar o efeito inibidor de uma amostra alvo sobre a síntese do colagénio, foi investigada a concentração inibidora a 50% (IC5o) , e o resultado está apresentado no Quadro 1.

[Quadro 1] Efeito inibidor dos inibidores da PDE 5 sobre a sintese de colagénio

Pirazolopirimidinona Derivado de pirazolopirimidinona Sildenafil Vardenafil IC50 (nM) 0, 8 ± 0,2a 13,1 ± 2,3 7,8 ± 1,7 a Média ± Desvio Padrão

Como se mostra no Quadro 1, o IC50 do derivado de pirazolopirimidinona foi de 0,8 ± 0,2 nM, o que é um efeito inibidor da síntese de colagénio 16 vezes e 10 vezes maior do que o do sildenafil e do vardenafil, respectivamente. Portanto, foi confirmado que o derivado de pirazolo- 25 ΡΕ1888074 pirimidinona da presente invenção tem um efeito mais excelente de inibição da síntese de colagénio do que outros inibidores da PDE 5, sildenafil e vardenafil, e, concordantemente, tem também excelente efeito inibidor sobre a fibrose hepática resultante do excessivo depósito de colagénio, e excelente efeito protector do fígado por isso.

[Exemplo 2] Investigação do efeito protector do fígado do derivado de pirazolopirimidinona utilizando vim modelo animal da fibrose hepática A experiência seguinte foi realizada para investigar in vivo o efeito inibidor da síntese de colagénio do derivado de pirazolopirimidinona da presente invenção.

Ratos fêmeas brancos Sprague Dawley (tendo aproximadamente 300 g em peso) foram divididos em 4 grupos (5 ratos por grupo), e foi induzida a fibrose hepática nos grupos experimentais excepto no grupo de controlo do tipo natural (ToxicologY, 2001). Foi injectada DMN (dimetilni-trosamina) na cavidade abdominal numa dose de 10 mg/kg serialmente durante 2 semanas com uma frequência de dosagem de três vezes por semana. Foram administrados o derivado de pirazolopirimidinona e sildenafil em tampão triazole (Merch) oralmente a 10 mg/kg/dia durante 2 semanas (período de indução da DMN). Apenas o tampão de triazole foi administrado ao grupo de controlo de solvente. Duas semanas mais tarde, foi extraído o fígado, foi fixado em formalina neutra a 10%, embebido em parafina e cortado em 4 m. Cada 26 ΡΕ1888074 secção foi tratada com xileno para eliminar a parafina, seguido do tratamento com álcool e peróxido de hidrogénio (H202) a 0,1%. Após o tratamento com PBS, as secções foram tratadas com antissoro policlonal (Chemicon) contra o colagénio de tipo I diluído a 1:500 e antissoro policlonal (BioGenesis) contra o colagénio de tipo III diluído a 1:100, a 37°C durante uma hora. Após lavagem, as amostras foram tratadas com IgG anti-coelho produzido em cabra conjugado com biotina diluído a 1:200. Foi realizada a coloração imuno-histológica fazendo reagir as amostras com o complexo avidina-biotina (Vector Laboratories), depois o complexo antigénio-anticorpo foi marcado com 3-amino-9-etilcarbazole (AEC), cuja imagem foi tomada por microscópio óptico apresentada agora nas Figuras 1-4. O grupo de controlo foi tratado com soro de cavalo não imunizado em vez de com anticorpo primário.

Como se mostra nas Figuras 1-4, foi observado um nível elevado de síntese de colagénio nas veias porta hepáticas e em volta das veias porta do grupo de controlo de solvente, em comparação com os animais do tipo natural, indicando que a síntese de colagénio foi notavelmente inibida pelo derivado de pirazolopirimidinona e pelo sildenafil. A inibição da síntese de colagénio no grupo tratado com o derivado de pirazolopirimidinona foi maior do que a do grupo tratado com sildenafil.

[Exemplo 3] Investigação do efeito do derivado de pirazolopirimidinona com modelos animais da hipertensão portal 27 ΡΕ1888074

As experiências seguintes foram realizadas para investigar o efeito do derivado de pirazolopirimidinona sobre a hipertensão portal.

Doze cães beagle pesando cerca de 10 kg foram divididos em quatro grupos (foram escolhidos aleatoriamente 3 cães por grupo), e foi-lhes realizada a ligadura do dueto biliar. Durante duas semanas após a operação, foram administrados o derivado de pirazolopirimidinona, sildenafil e vardenafil, oralmente em doses de 10 mg/kg/dia e 3 deles foram administrados apenas com solvente. Os animais foram sujeitos a jejum durante 4 horas, depois foi-lhes injectado pentobarbital intravenosamente para os anestesiar. Foi inserido um tubo através da veia mesentérica até à veia porta para medir a pressão sanguínea portal.

Foi também realizada a ecografia Doppler para medir o diâmetro da veia porta. Foi medido o fluxo sanguíneo através da veia porta, utilizando a seguinte Fórmula Químico-Matemática 1, e o resultado está apresentado no Quadro 2.

[Figura Matemática 1]

Taxa do Fluxo Sanguíneo = nR2 x V x 60 diâmetro da veia porta (R : -, V : media da velocidade do fluxo sanguíneo) 2 28 ΡΕ1888074 [Quadro 2] O efeito do derivado de pirazolopirimidinona sobre a hipertensão portal.

Grupo tratado ccm solvente Grupo tratado ccm derivado de pirazolopirimidinona Grupo tratado ccm sildenafil Grupo tratado ccm vardenafil Pressão sanguínea portal (kPa) 3,13 ± 0,31a 2,50 ± 0,20* 2,93 ± 0,25 2,87 ± 0,25 Diâmetro da veia porta (nm) 7,07 ± 0,15 7,70 ± 0,26 7,47 ± 0,21 7,43 ± 0,21 Taxa de fluxo sanguíneo (mL/min) 584,26 ± 159,97 932,31 ± 89,83* 754,47 ± 80,24 729,29 ± 83,23 a Media ± Desvio Padrão, * Estatisticamente significativo (p<0,05)

Como se mostra no Quadro 2, a pressão sanguínea portal foi diminuída em 21% no grupo tratado com o derivado de pirazolopirimidinona, diminuída em 7% no grupo tratado com sildenafil e diminuída em 9% no grupo tratado com vardenafil, em comparação com a do grupo de controlo tratado com solvente. A partir da comparação do diâmetro da veia porta, foi confirmado que os diâmetros das veias porta de cada um dos grupos tratados com o derivado de pirazolopirimidinona, com sildenafil e com vardenafil, estavam aumentados em 6-9%, o que foi considerado não significativo estatisticamente. Foram também comparadas as taxas de fluxo sanguíneo através das veias porta. Como resultado, a taxa de fluxo sanguíneo no grupo tratado com o derivado de pirazolopirimidinona foi aumentado em 59,9%, em comparação com a do grupo tratado com solvente, e as taxas de fluxo 29 ΡΕ1888074 sanguíneo nos grupos tratados com sildenafil e com varde-nafil estava aumentada em 29,1% e 24,8%, respectivamente. A partir dos resultados acima, foi confirmado que o derivado de pirazolopirimidinona da presente invenção, diferentemente do sildenafil que é conhecido por aumentar a pressão sanguínea portal, reduz marcadamente a pressão sanguínea portal mas aumenta significativamente o fluxo sanguíneo através da veia porta, tornando-o um candidato muito eficaz para uma composição farmacêutica terapêutica para a hipertensão portal e as suas complicações, sem efeitos secundários incluindo as hemorragias por varizes esofágicas, etc.. <Exemplo 4> Investigação da farmacocinética in vivo do derivado de pirazolopirimidinona.

Participaram nas experiências nove voluntários de entre pacientes com hipertensão portal que estavam dentro do critério de idade entre 19-45 e pesando acima de 45 kg (dentro de um desvio de 15% em relação ao peso corporal ideal). Eles foram todos voluntários que concordaram em se inscreverem para se juntar às experiências e eram fidedignos, cooperantes e dispostos a seguir as regras. Eles foram divididos aleatoriamente em três grupos; três deles foram administrados com derivado de pirazolopirimidinona, três com sildenafil e os restantes foram administrados com vardenafil a diferentes concentrações de 100 mg, 50 mg, e 10 mg, respectivamente. 30 ΡΕ1888074

Foi utilizado para as experiências um método em dupla cegueira. Às 8-9 da manhã no dia de teste, foram dados aos voluntários os medicamentos de teste com 240 mL de água. Durante 4 horas após a administração, eles foram sujeitos a jejum, e foi-lhes proporcionado o almoço 4 horas mais tarde e o jantar foi proporcionado 9 horas mais tarde. Foram tomadas amostras de sangue antes da administração no dia do teste e às 0,5a, Ia, 1,5a, 2a, 2,5a, 3a, 4a, 5a, 6a, 8a, 12a, 24a e 32a horas após a administração. Foi isolado o plasma sanguíneo, seguido de HPLC. Foram adicionados 100 pL de carbonato de sódio a 0,1 M e 1,0 nL de éter etilico a 0,5 mL de plasma sanguíneo, depois misturou-se bem durante 1 minuto, seguido de centrifugação a 12 000 rpm durante 3 minutos. Foi obtido o sobrenadante e o solvente orgânico foi volatilizado utilizando vácuo. Depois, foram adicionados 100 pL de fase móvel, seguidos de agitação. O produto resultante foi injectado num injector para HPLC, e o resultado está apresentado no Quadro 3.

[Quadro 3] Comparação das semi-vidas do derivado de pirazolopirimidinona, do sildenafil e do vardenafil em pacientes com hipertensão portal.

Derivado de pira- Sildenafil Vardenafil zolopirimidinona (50 mg) (10 mg) (100 mg) Semi-vida (horas) 15,1 ± 3,5a 4-5 ± 1,2 6,3 ± 2,1 a Média ± Desvio Padrao 31 ΡΕ1888074

Como se mostra no Quadro 3, a semi-vida do derivado de pirazolopirimidinona foi de 15,1 ±3,5 horas, o que foi três vezes e duas vezes mais longo do que os do sildenafil (4,5 ± 1,2) e do vardenafil (6,3 ± 2,1), respectivamente.

Assim, o derivado de pirazolopirimidinona da presente invenção não apenas tem um excelente efeito terapêutico sobre a fibrose hepática e a hipertensão portal, mas também reduz a frequência de administração devido à sua semi-vida mais longa que a de outros inibidores da PDE-5, sujerindo que o derivado de pirazolopirimidinona pode melhorar a adesão dos pacientes com doença crónica do fígado. São aqui descritos abaixo exemplos preparativos da composição da presente invenção. <Exemplo Preparativo» Preparação de composições farmacêuticas para administração oral. 1. Preparação de pós.

Derivado de pirazolopirimidinona 2 g

Lactose 1 g

Os ingredientes mencionados acima foram misturados conjuntamente, e foi cheio um saco impermeável ao ar com a mistura para se preparar pós. ΡΕ1888074 32 2. Preparação de comprimidos.

Derivado de pirazolopirimidinona 100 mg Amido de milho 100 mg Lactose 100 mg Estearato de magnésio 2 mg

Os ingredientes acima mencionados foram misturados conjuntamente, e foram preparados comprimidos por compressão de acordo com o método convencional de produção de comprimidos. 3. Preparação de cápsulas.

Derivado de pirazolopirimidinona 100 mg Amido de milho 100 mg Lactose 100 mg Estearato de magnésio 2 mg

Os ingredientes acima mencionados foram misturados conjuntamente, e encheram-se cápsulas de gelatina com a mistura para se prepararem cápsulas de acordo com o método convencional de produção de cápsulas.

[Aplicabilidade Industrial]

Como aqui explicado anteriormente, o derivado de pirazolopirimidinona da presente invenção tem excelente efeito inibidor sobre a síntese de colagénio nas células 33 ΡΕ1888074 estreladas hepáticas, aumenta o fluxo sanguíneo através da veia porta e expande o diâmetro da veia porta afectando directamente a veia porta, e reduz a pressão sanguínea portal. Desta forma, o derivado de pirazolopirimidinona pode ser eficazmente utilizado para a prevenção e tratamento da fibrose hepática, da cirrose do fígado resultando de fibrose hepática de longa duração, da hipertensão portal e de várias complicações causadas por ela. Adicionalmente, o derivado de pirazolopirimidinona da presente invenção tem uma semi-vida mais longa in vivo, sugerindo que ele pode melhorar a adesão em pacientes com doença crónica do fígado pela redução da frequência de administração.

Lisboa, 17 de Fevereiro de 2012

Claims (8)

1. ΡΕ1888074 1 REIVINDICAÇÕES 1. Derivado de pirazolopirimidinona para utilização na inibição da fibrose hepática, em que o derivado de pirazolopirimidinona tem a seguinte figura química I. <figura química I>
2. 2. Utilização de um derivado de pirazolopirimidinona para o fabrico de um medicamento para a inibição da fibrose hepática, em que o derivado de pirazolopirimidinona tem a seguinte figura química I. <figura química I>

   2 ΡΕ1888074
3. 3. Derivado de pirazolopirimidinona para utilização na prevenção ou tratamento da cirrose do figado, em que o derivado de pirazolopirimidinona tem a seguinte figura química I. <figura química I>
4. 4. Utilização do derivado de pirazolopirimidinona para o fabrico de um medicamento para a prevenção e tratamento da cissore do fígado, em que o derivado de pirazolopirimidinona tem a seguinte figura química I. <figura química I>
5. 5. Derivado de pirazolopirimidinona para utilização na inibição da hipertensão portal, em que o derivado de pirazolopirimidinona tem a seguinte figura química I. ΡΕ1888074 3 <figura química I>
6. 6. Utilização de um derivado de pirazolopirimi-dinona para o fabrico de um medicamento para a inibição da hipertensão portal, em que o derivado de pirazolopirimidi-nona tem a seguinte figura química I. <figura química I>
7. 7. Derivado de pirazolopirimidinona para a prevenção ou tratamento de complicações causadas pela hipertensão portal, em que o derivado de pirazolopirimidinona tem a seguinte figura química I e em que a complicação é seleccionada a partir de um grupo consistindo de varizes esofágicas, alargamento esplénico, hiperplenismo, ascite, peritonite bacteriana espontânea, síndrome hepato-renal, síndrome hepato-pulmonar e encefalopatia hepática. 4 ΡΕ1888074 <figura química I>
8. 8. Utilização de um derivado de pirazolopirimi-dinona no fabrico de um medicamento para a prevenção ou tratamento de complicações causadas pela hipertensão portal, em que o derivado de pirazolopirimidinona tem a seguinte figura química I e em que a complicação é seleccionada a partir de um grupo consistindo de varizes esofágicas, alargamento esplénico, hiperplenismo, ascite, peritonite bacteriana espontânea, síndrome hepato-renal, síndrome hepato-pulmonar e encefalopatia hepática. <figura química I>

   Lisboa, 17 de Fevereiro de 2012