CN117045642A - 双香豆素在制备预防或治疗纤维化疾病的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了双香豆素在制备预防或治疗纤维化疾病的药物中的应用，涉及生物医药技术领域。本发明创造性地利用双香豆素用于治疗预防或治疗纤维化疾病，可以发挥强大的抗纤维化作用，且毒副作用小、使用安全，其预防以及治疗纤维化方面应用前景诱人，具备很好的市场应用价值。

Description

双香豆素在制备预防或治疗纤维化疾病的药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及双香豆素在制备预防或治疗纤维化疾病的药物中的应用。
背景技术
纤维化(Fibrosis)是由各种因素导致的组织损伤后过度的和失控的修复反应。细胞分泌过量的细胞外基质蛋白引起器官组织内纤维***增生，胶原沉积等。增生的纤维***虽然修复了缺损，但却不具备原来器官实质细胞的结构和功能，以致引发器官形变及功能下降甚至衰竭。器官纤维化是多种急性慢性疾病的共同病理过程，也是类风湿性关节炎、***性红斑狼疮、骨髓纤维变性、硬皮病、慢性抑制排斥等慢性自身免疫性疾病的主要病理变化。肺、肝、肾、心等实质脏器纤维化导致的脏器功能衰竭是患者致残、死亡的重要原因。
临床上对纤维化疾病的治疗方案和手段主要基于免疫反应、炎症反应在纤维化过程中的作用，联合使用抗炎药物、免疫抑制药物，以延缓纤维化进程。然而，这些治疗因其疗效的不确定性以及不良反应多而未能广泛应用。器官移植虽然是纤维化末期唯一有效的治疗手段，但它同样面临器官供体缺乏、手术成活率低、术后难恢复等诸多问题。特异性强、疗效确切且无明显不良反应的抗纤维化药物的临床应用价值极大，但目前已经批准的以抗纤维化为适应症的药物十分有限。
纤维化的病理生理过程十分复杂，至今尚未明确。研究表明，在纤维化进展过程中，许多细胞因子和信号通路参与其中。转化生长因子β1(TGF-β1)是细胞因子转化生长因子β超家族的多肽成员，可由单核巨噬细胞、中性粒细胞、成骨细胞、内皮细胞、淋巴细胞、成纤维细胞等多种细胞产生。作为是一种分泌蛋白，TGF-β1的生物学功能及其广泛，调控细胞生长、增殖、细胞分化和凋亡。众多研究表明，TGF-β1及其信号通路是已知的最重要诱导纤维化的机制，也是研究和防治各种器官纤维化的主要信号通路和靶点。
上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮细胞在各种因素作用下，失去上皮特征，向***转变的过程。EMT发生时，形态上，鹅卵石样或多边形的上皮细胞变为细长条状；分子水平上，上皮细胞的标志蛋白E-cadherin表达明显下降，***标志蛋白N-cadherin、Vimentin等明显上升，肌成纤维细胞标志α-SMA表达明显上升。EMT有三种类型，其中2型EMT与组织再生和器官纤维化密切相关。大量研究表明，EMT是导致器官纤维化的重要生理病理过程，是防治纤维化的重要关注点和药物开发热点，抑制EMT可有效防治器官纤维化。TGF-β1是诱导EMT的关键细胞因子，它可通过刺激上皮细胞、内皮细胞等诱导EMT，刺激细胞外基质的沉积，同时抑制其降解，促进组织中的胶原沉积、***形成。抑制TGF-β1通路以及TGF-β1诱导的EMT对于纤维化病具有明显保护作用，是抗纤维化药物研发的热点。
内皮细胞是上皮细胞的一种，在TGF-β1的刺激下，内皮细胞可向***转变，被称为内皮-间质转化(Endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT)。EndMT发生时，细胞形态变化与EMT类似，分子标志物VE-cadherin表达明显降低。EndMT是包括纤维化疾病、心血管疾病在内的重要介导因素。
大量研究证实，TGF-β及其诱导的EMT信号通路在特发性肺纤维化(idiopathicpulmonary fibrosis,IPF)、药物性肺纤维化(如博来霉素诱导)、农药(如百草枯)诱导的肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、心脏纤维化、胰腺纤维化等发生发展中起重要作用。抑制TGF-β1及其诱导的EMT信号通路是多种化合物防治上述纤维化的主要机制。然而，目前尚未有直接通过调控EMT的预防和治疗器官纤维化的药物被批准上市。
组织损伤时，纤维细胞、间充质细胞、循环成纤维细胞等在TGF-β、炎症因子等刺激下可分化为肌成纤维细胞，后者通过重塑细胞外环境来启动伤口愈合反应，维持组织内稳态。然而，持续的损伤和损害会导致肌成纤维细胞活性持续上调，并分泌大量的肌球蛋白和α-SMA，导致ECM蛋白的过度沉积，诱导纤维化的发生和发展。肌成纤维细胞的形成是促进纤维化疾病的重要过程，抑制纤维细胞等分化为肌成纤维细胞是抗纤维化药物研发的重要策略。
目前，仅有数个药物被FDA批准用于治疗器官纤维化。其中，尼达尼布、吡非尼酮被批准用于治疗特发性肺纤维化，鲁索替尼、菲卓替尼(fedratinib)用于治疗骨髓纤维化等。尼达尼布是一个小分子的酪氨酸激酶抑制剂，可抑制血小板源性生长因子受体(PDGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)以及血管内皮生长因子受体(VEGFR)等受体酪氨酸激酶，抑制成纤维细胞的增殖、迁移和分化。吡非尼酮的作用机制尚不完全清楚，可能通过抑制细胞生长因子如TGF-β和血小板衍生生长因子(PDGF)刺激成纤维细胞后引起的增殖、纤维化相关蛋白和细胞因子产生以及细胞外基质的合成和积聚有关。鲁索利替尼是一种选择性激酶抑制剂，通过抑制JAK1和JAK2，通过阻断JAK信号转导及转录激活因子(signal transducerand activator of transcription，STAT)通路而发挥作用。
但是，尼达尼布、吡非尼酮、鲁索利替尼、菲卓替尼均具有毒副作用：尼达尼布可引起腹泻、恶心、呕吐、皮肤溃疡、腹痛、肝酶升高、体重下降等。吡非尼酮可引起光过敏症、食欲不振、胃部不适、恶心以及严重的肝功能损伤等。鲁索利替尼的毒副作用有血小板计数减低、贫血、瘀斑、眩晕和头痛。菲卓替尼的毒副作用有脑病(包括韦尼克氏脑病)、血小板计数减低、贫血、恶心、呕吐和腹泻等。
除了上述几个药物以外，其他器官纤维化尚缺乏有效治疗药物。因此，针对临床上各类的纤维化及其相关疾病亟待高效低毒的抗纤维化药物。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供双香豆素在制备预防或治疗纤维化疾病的药物中的应用，旨在提高纤维化疾病的疗效，同时降低毒副作用。
本发明的目的还在于提供双香豆素在制备用于分析测试EMT、EndMT、成纤维性向肌成纤维细胞转化的试剂中的应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供双香豆素在制备预防或治疗纤维化疾病的药物中的应用。
在可选的实施方式中，纤维化疾病包括肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、心纤维化、胰腺纤维化和器官纤维化所诱发的疾病；
优选地，纤维化疾病选自肺纤维化、肝纤维化和肾纤维化中的至少一种；
更优选地，纤维化疾病选自肾纤维化。
在可选的实施方式中，药物预防和治疗纤维化疾病的机制包括以下(a)～(h)中的至少一种；
(a)通过抑制EMT；
(b)通过抑制EndMT；
(c)通过抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化；
(d)通过逆转TGF-β1、TGF-β2诱导的上皮细胞E-cadherin和内皮细胞VE-cadherin表达的降低；
(e)通过逆转***标志蛋白N-cadherin、Vimentin表达的升高；
(f)通过抑制纤维连接蛋白的表达；
(g)通过逆转TGF-β1诱导的肌成纤维细胞标志物α-SMA的表达；
(h)通过抑制TGF-β1和TGF-β2诱导的上皮细胞、内皮细胞和心肌细胞的形态的变化。
在可选的实施方式中，肺纤维化包括特发性肺纤维化、诱导型肺纤维化和其他病因未明的肺纤维化；其中，诱导型肺纤维化包括结节病诱发的肺纤维化、尘肺诱发的肺纤维化、过敏性肺炎诱发的肺纤维化、放射线诱发的肺纤维化、药物诱发的肺纤维化和农药诱发的肺纤维化。
在可选的实施方式中，肝纤维化包括病毒性肝炎诱发的肝纤维化、酒精性肝炎诱发的肝纤维化、自身免疫性疾病诱发的肝纤维化、脂肪肝诱发的肝纤维化、药物诱发的肝纤维化和其他病因未明的肝脏纤维化。
在可选的实施方式中，肾纤维化包括高血压诱发的肾纤维化、肾小球肾炎诱发的肾纤维化、***性红斑狼疮诱发的肾纤维化、硬皮病诱发的肾纤维化、肾移植排斥诱发的肾纤维化、肾盂肾炎诱发的肾纤维化、肾结石诱发的肾纤维化、高血脂诱发的肾纤维化、糖尿病诱发的肾纤维化、高尿酸血症诱发的肾纤维化、高钙尿症诱发的肾纤维化和其他病因未明的肾脏纤维化。
在可选的实施方式中，心纤维化包括缺血性心脏疾病诱发的心纤维化、高血压诱发的心纤维化、病毒性心肌炎诱发的心纤维化、代谢性心肌病诱发的心纤维化、克山病诱发的心纤维化、扩张性心肌病诱发的心纤维化、限制性心肌病诱发的心纤维化、心脏重构诱发的心纤维化、心肌肥厚诱发的心纤维化和其他病因未明的心纤维化。
在可选的实施方式中，胰腺纤维化包括慢性胰腺炎诱发的胰腺纤维化和其他病因未明的胰腺纤维化。
在可选的实施方式中，药物为药物组合物，药物组合物还包括药用载体或其他功效药物；
优选地，药物组合物中的双香豆素为双香豆素或其药用衍生物。
优选地，药物组合物的剂型选自溶液、悬浮液、片剂、胶囊、颗粒剂和注射剂中的至少一种。
第二方面，本发明还提供双香豆素在制备用于分析测试EMT、EndMT、成纤维性向肌成纤维细胞转化的试剂中的应用，其中，试剂选自分析试剂、生化试剂或检测试剂。
本发明具有以下有益效果：本发明创造性地利用双香豆素用于治疗预防或治疗纤维化疾病，可以发挥强大的抗纤维化作用，且毒副作用小，其预防以及治疗纤维化方面应用前景诱人，具备很好的市场应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为双香豆素(DIC)抑制TGF-β1诱导的人肺上皮A549细胞EMT的测试结果图；DIC抑制TGF-β1诱导的细胞形态(A-D)变化、逆转EMT生物标志物的表达(E-H)；A，正常对照组；B，TGF-β1(5ng/mL)组；C，TGF-β1+DIC(2μM)组；D，TGF-β1+DIC(4μM)组；E，Western blotting检测DIC浓度依赖性地逆转TGF-β1诱导的EMT信号通路和生物标志物的表达；F，Westernblotting检测DIC时间依赖性地逆转TGF-β1诱导的EMT信号通路和生物标志物的表达；G，免疫荧光检测DIC对TGF-β1诱导的EMT生物标志物E-cadherin的表达的影响；H，免疫荧光检测DIC对TGF-β1诱导的EMT生物标志物N-cadherin的表达的影响；
图2为双香豆素(DIC)抑制TGF-β1诱导的人肝上皮HepG2细胞的EMT的测试结果图；A，正常对照组；B，TGF-β1(5ng/mL)组；C，TGF-β1+DIC(2.5μM)组；D，TGF-β1+DIC(5.0μM)组；E，Western blotting检测不同浓度的DIC逆转TGF-β1诱导的EMT生物标志物的表达；
图3为双香豆素(DIC)抑制TGF-β1诱导的人胰腺上皮MIA PaCa-2细胞的EMT的测试结果图；A，正常对照组；B，TGF-β1(5ng/mL)组；C，TGF-β1+DIC(2.5μM)组；D，TGF-β1+DIC(5.0μM)组；E，Western blotting检测不同浓度的DIC逆转TGF-β1诱导的EMT生物标志物的表达；
图4为双香豆素(DIC)抑制TGF-β2诱导的血管内皮细胞EA.hy926细胞的EndMT的测试结果图；A，正常对照组；B，TGF-β2(5ng/mL)组；C，TGF-β2+DIC(5.0μM)；D，TGF-β2+DIC(10μM)；E，Western blotting检测不同浓度DIC对TGF-β2诱导的EMT生物标志物的表达的影响；
图5为双香豆素(DIC)对TGF-β1诱导的心肌细胞H9c2细胞的影响图；A，正常对照组；B，TGF-β1(5ng/mL)组；C，TGF-β1+DIC(5.0μM)组；D，TGF-β1+DIC(10μM)；E，Westernblotting检测不同浓度DIC对TGF-β1诱导的心肌纤维化相关蛋白的表达的影响；
图6为双香豆素抑制(DIC)TGF-β1诱导的人肾小管上皮HK-2细胞的EMT的测试结果图；A，正常对照组；B，TGF-β1(5ng/mL)；C，TGF-β1+DIC(5.0μM)；D，TGF-β1+DIC(10μM)；E-G,免疫荧光检测DIC对TGF-β1诱导的EMT蛋白N-cadherin表达的影响；E，正常对照，F，TGF-β1(5ng/mL)；G，TGF-β1+DIC(10μM)；H，Western blotting检测DIC对TGF-β1诱导的N-cadherin的表达的影响；
图7为双香豆素(DIC)抑制TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮NRK-52E细胞的EMT的测试结果图；A，正常对照组；B，TGF-β1(10ng/mL)；C，TGF-β1+DIC(2.5μM)；D，TGF-β1+DIC(5.0μM)；E，Western blotting检测不同浓度DIC对TGF-β1诱导的纤维化相关蛋白的表达的影响；
图8为双香豆素(DIC)抑制TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮NRK-52E细胞的EMT的测试结果图；A-C，免疫荧光检测DIC对TGF-β1诱导的α-SMA表达的影响；A，正常对照组；B，TGF-β1(10ng/mL)组；C，TGF-β1+DIC(2.5μM)；D-F，免疫荧光检测DIC对TGF-β1诱导的E-cadherin表达的影响；D，正常对照组；E，TGF-β1(10ng/mL)组；F，TGF-β1+DIC(2.5μM)组；
图9为双香豆素(DIC)抑制TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞MRC-5、WI-38细胞的肌成纤维细胞形成的测试结果图；
图10为香豆素类其他抗凝药物(包括华法林、3,3'-羰基双(7-二乙氨基香豆素)、醋硝香豆素)对TGF-β1诱导的EMT的作用测试结果图；A-E，华法林测试组；F-J，3,3'-羰基双(7-二乙氨基香豆素)测试组；K-O，醋硝香豆素测试组。其中，A、F、K，正常对照组；B、G、L，TGF-β1(5ng/mL)组；C,TGF-β1+华法林(2.0μM)；D，TGF-β1+华法林(4.0μM)；H，TGF-β1+3,3'-羰基双(7-二乙氨基香豆素)(2.0μM)；I,TGF-β1+3,3'-羰基双(7-二乙氨基香豆素)(4.0μM)；M,TGF-β1+醋硝香豆素(2.0μM)；N，TGF-β1+醋硝香豆素(4.0μM)；
图11为双香豆素(DIC)对大鼠UUO模型的肾脏的损伤的治疗作用(肾脏H&E染色)的测试结果图；A，对照组；B，模型组；C，双香豆素2.5mg/kg组；D，双香豆素5mg/kg组；
图12为双香豆素(DIC)对大鼠UUO模型肾纤维化的治疗作用(肾脏Masson染色)的测试结果图；A，对照组；B，模型组；C，双香豆素2.5mg/kg组；D，双香豆素5mg/kg组；
图13为双香豆素(DIC)对大鼠UUO模型肾纤维化的治疗作用(肾脏Sirius red染色)的测试结果图；A，对照组；B，模型组；C，双香豆素2.5mg/kg组；D，双香豆素5mg/kg组；
图14为双香豆素(DIC)对大鼠UUO模型肾纤维化的治疗作用(肾脏E-cadherin蛋白的免疫组化染色)的测试结果图；A，对照组；B，模型组；C，双香豆素2.5mg/kg组；D，双香豆素5mg/kg组；
图15为双香豆素(DIC)对大鼠UUO模型肾纤维化的治疗作用(肾脏α-SMA蛋白的免疫组化染色)的测试结果图；A，对照组；B，模型组；C，双香豆素2.5mg/kg组；D，双香豆素5mg/kg组；
图16为双香豆素(DIC)对大鼠UUO模型肾纤维化的治疗作用(肾脏Vimentin蛋白的免疫组化染色)的测试结果图；A，对照组；B，模型组；C，双香豆素2.5mg/kg组；D，双香豆素5mg/kg组；
图17为双香豆素(DIC)对大鼠UUO模型肾纤维化的治疗作用的测试结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
双香豆素(dicumarol，DIC)，又称双香豆精、紫苜蓿酚、败坏翘摇素等，是天然来源的香豆素化合物。双香豆素被批准在临床用作抗凝血药物已经多年，用于防治血栓形成及栓塞性静脉炎等血栓栓塞疾病。双香豆素来源丰富、安全性高，且已经是临床应用药物，具有良好的研究和开发价值。
双香豆素作为香豆素类抗凝药已经在临床应用数十年，是抗凝效果明确、安全性高的“老药”。尤其是，即便对于双香豆素类应用过量引起的出血的副作用，廉价的维生素K可进行有效的拮抗。
双香豆素(dicoumarol，DIC)(CAS号：66-76-2)的化学结构为：
香豆素类抗凝药还包括华法林、3,3'-羰基双(7-二乙氨基香豆素)、醋硝香豆素等。华法林的化学结构为：
3,3'-羰基双(7-二乙氨基香豆素)的化学结构为：
醋硝香豆素的化学结构为：
本发明实施例创造性地将双香豆素应用于制备预防或治疗纤维化疾病的药物中，并发现双香豆素在细胞水平对TGF-β诱导的EMT、EndMT以及成纤维细胞向肌成纤维细胞转变具有明显的抑制作用；在动物水平具有显著的抗纤维化活性，具有开发成抗纤维化药物的应用前景和价值。鉴于目前器官纤维化临床用药极为有限，双香豆素已经是临床应用多年的“老药”，口服有效，安全性好，口服用药即可发挥强大的抗纤维化作用，其预防以及治疗纤维化方面应用前景诱人，具有非常好的市场应用价值。
需要说明的是，发明人为了解决抗纤维化药物开发方面现有技术的缺陷和不足，经过大量的研究和实践，最终提供了双香豆素能够作为一种潜在抗纤维化药物，并通过实验进一步发现，双香豆素可调控各种纤维化疾病的关键信号通路-TGF-β1信号通路，明显抑制TGF-β1诱导的EMT、EndMT以及成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，并通过在体的大鼠纤维化模型予以确证。因此，通过研究发现双香豆素是一个很好的预防和治疗纤维化的药物，可为几乎无药可用的纤维化类疾病提供治疗选择。
值得提出的是，虽然其他的香豆素类，如华法林、3,3'-羰基双(7-二乙氨基香豆素)、醋硝香豆素等与双香豆素的化学结构类似，抗凝机制相同，但它们对TGF-β1诱导的EMT并无抑制作用。这提示双香豆素对纤维化疾病的防治作用独特，与其抗凝作用关系不大。
在一些实施例中，纤维化疾病包括肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、心纤维化、胰腺纤维化和器官纤维化所诱发的疾病，可以为以上任意一种或几种器官的纤维化，也可以是肺纤维化所诱发的疾病、肝纤维化所诱发的疾病、肾纤维化所诱发的疾病、心纤维化所诱发的疾病、胰腺纤维化所诱发的疾病等。优选地，纤维化疾病选自肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化中的任意一种；更优选地，纤维化疾病选自肾纤维化。
进一步地，肺纤维化包括特发性肺纤维化、诱导型肺纤维化和其他病因未明的肺纤维化，可以为以上任意一种或几种。其中，诱导型肺纤维化包括结节病诱发的肺纤维化、尘肺诱发的肺纤维化、过敏性肺炎诱发的肺纤维化、放射线诱发的肺纤维化、药物诱发的肺纤维化、农药诱发的肺纤维化、肺部感染诱导的肺纤维化等。具体地，药物诱发的肺纤维化所指的药物可以为博来霉素、丝裂霉素、胺碘酮、氨甲蝶呤、肼苯哒嗪、呋喃妥因、大仑丁、青霉胺、卡莫司汀，但不限于此；农药诱发的肺纤维化所指的农药可以为百草枯，但不限于此；肺部感染诱导的肺纤维化所指的感染可以是血行播散性肺结核、卡氏肺囊虫病、病毒性肺炎如传染性非典型肺炎(SARS)，但不限于此。
进一步地，肝纤维化包括病毒性肝炎诱发的肝纤维化、酒精性肝炎诱发的肝纤维化、自身免疫性疾病诱发的肝纤维化、脂肪肝诱发的肝纤维化、药物诱发的肝纤维化和其他病因未明的肝脏纤维化，可以为以上任意一种或几种。病毒性肝炎可以是指乙肝病毒，但不限于此；药物诱发的肝纤维化所指的药物可以为甲氨蝶呤、甲基多巴、胺碘酮、氯丙嗪、土三七，但不限于此。
进一步地，肾纤维化包括高血压诱发的肾纤维化、肾小球肾炎诱发的肾纤维化、***性红斑狼疮诱发的肾纤维化、硬皮病诱发的肾纤维化、肾移植排斥诱发的肾纤维化、肾盂肾炎诱发的肾纤维化、肾结石诱发的肾纤维化、高血脂诱发的肾纤维化、糖尿病诱发的肾纤维化、高尿酸血症诱发的肾纤维化、高钙尿症诱发的肾纤维化、药物诱导的肾纤维化和其他病因未明的肾脏纤维化，可以为以上任意一种或几种。药物诱导的肾纤维化所指的药物可以为马兜铃酸、顺铂、新霉素、卡那霉素、庆大霉素、阿霉素、柔红霉素，但不限于此。
进一步地，心纤维化包括缺血性心脏疾病诱发的心纤维化、高血压诱发的心纤维化、病毒性心肌炎诱发的心纤维化、代谢性心肌病诱发的心纤维化、克山病诱发的心纤维化、扩张性心肌病诱发的心纤维化、限制性心肌病诱发的心纤维化、心脏重构诱发的心纤维化、心肌肥厚诱发的心纤维化和其他病因未明的心纤维化，可以为以上任意一种或几种。
进一步地，胰腺纤维化包括慢性胰腺炎诱发的胰腺纤维化和其他病因未明的胰腺纤维化，可以为慢性胰腺炎诱发的胰腺纤维化，但不限于此。慢性胰腺炎可以是原发性、酒精性、阻塞性、自身免疫性、代谢性、特发性等。
在一些实施例中，药物预防和治疗纤维化疾病的机制包括以下(a)～(h)中的至少一种；
(a)通过抑制EMT；
(b)通过抑制EndMT；
(c)通过抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化；
(d)通过逆转TGF-β1、TGF-β2诱导的上皮细胞E-cadherin和内皮细胞VE-cadherin表达的降低；
(e)通过逆转***标志蛋白N-cadherin、Vimentin表达的升高；
(f)通过抑制纤维连接蛋白(fibronectin)的表达；
(g)通过逆转TGF-β1诱导的肌成纤维细胞标志物α-SMA的表达；
(h)通过抑制TGF-β1和TGF-β2诱导的上皮细胞、内皮细胞和心肌细胞的形态的变化。
需要说明的是，双香豆素能够预防或治疗纤维化疾病的机理可以是基于以上任意一种或几种，主要是通过调控EMT、EndMT，抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞转化、胶原沉积和***的形成等。除此之外，双香豆素还可以抑制TβRI，Smad2/3的磷酸化，抑制fibronectin的表达。
在分子水平，双香豆素可以明显上调上皮细胞E-cadherin蛋白表达，下调N-cadherin、Vimentin、α-SMA蛋白的表达；双香豆素可以逆转TGF-β1、TGF-β2诱导的上皮细胞E-cadherin、内皮细胞VE-cadherin表达的降低和N-cadherin、Vimentin表达的升高；逆转TGF-β1诱导的α-SMA的表达。
在细胞水平，双香豆素可以明显抑制TGF-β1和TGF-β2诱导的上皮细胞、内皮细胞和心肌细胞的形态的变化；双香豆素可以明显抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化。
在动物水平，双香豆素可以明显抑制大鼠单侧输尿管梗阻(unilateral ureteralobstruction，UUO)所致的肾小管间质纤维化模型的肾脏损伤；双香豆素可以明显抑制大鼠UUO模型中肾间质胶原的沉积；双香豆素还可以明显抑制大鼠UUO模型的肾脏α-SMA、Vimentin和纤维连接蛋白(fibronectin)的表达。
在一些实施例中，本发明实施例所提供的药物以双香豆素为活性成分，还可以包括其他功效药物或药用载体，以组合物的形式应用，其他功效药物或药用载体的具体种类不限。药物组合物中的双香豆素为双香豆素或其药用衍生物，具体可以为药用的盐或酯、其衍生物以及其衍生物在药学上可接受的盐中的至少一种。
进一步地，本发明实施例所提供的药物还可以含有药学上可以接受的辅料，制成药学上可以接受的剂型。具体地，辅料为液体、固体或半固体辅料。药物组合物的剂型选自溶液、悬浮液、片剂、胶囊、颗粒剂和注射剂中的至少一种，溶液可以为水溶液或非水溶液。
基于双香豆素的上述技术效果和机理，双香豆素还可以在制备用于分析测试EMT、EndMT、成纤维性向肌成纤维细胞转化的分析试剂、生化试剂或检测试剂中的应用。
同样，上述应用中的双香豆素包括双香豆素、其可药用的盐或酯、其衍生物以及其衍生物在药学上可接受的盐中的至少一种，优选为双香豆素。
需要说明的是，本发明实施例中的双香豆素能够用其可药用的盐或酯、其衍生物、其衍生物在药学上可接受的盐、其衍生物的纳米级物质中的一种或几种的组合来进行替代，达到相同或相近的治疗效果，其均应当属于本发明保护的范围。
本发明实施例还提供了一种抗纤维化的产品，其包括双香豆素，其可药用的盐或酯、其衍生物以及其衍生物在药学上可接受的盐中的至少一种，可以为以上任意一种或几种。
具体地，产品为药物、试剂盒、保健药品等。
一些实施方式中，药物可为口服制剂或注射制剂。该抗纤维化的产品还可包括可接受的药用载体和/或药学上可接受的赋形剂，可制成各种药学上可接受的制剂，包括片剂(控释片、缓释片)、颗粒剂、胶囊剂(硬胶囊、软胶囊)、丸剂、汤剂等口服制剂，冻干粉针制剂等注射剂。
具体地，药用载体包括但并不限于以下的一种或多种：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、低分子量右旋糖酐、聚乙二醇400、聚乙二醇6000、环糊精、甘露醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、氯化钠、山梨醇。
需要说明的是，双香豆素药物的制备方法不做严格限制。在无菌条件下，可制成针剂，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法制备得到；可制成片剂和胶囊剂，通过常规方法制备得到。双香豆素也可以为市购产品，具体厂家和型号不限。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
细胞水平实验(实施例1-实施例10)：
实验材料：
1实验细胞株：
A549细胞、HepG2细胞购自美国ATCC细胞库。HK-2人肾小管上皮细胞、NRK-52E大鼠肾小管上皮细胞、EAhy926人内皮细胞细胞、H9c2人心肌细胞、人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞和WI-38细胞购自北京协和细胞资源中心。MIA PaCa-2细胞株获赠于澳门大学健康科学学院陈强教授。
2细胞培养：
A549细胞用完全培养基(含10％FBS和1％双抗的RPMI-1640培养基)进行常规细胞培养；HepG2细胞、HK-2细胞、NRK-52E细胞、H9c2细胞和EA.hy926细胞用完全培养基(含10％FBS和1％双抗的DMEM培养基)；MIA PaCa-2细胞用完全培养基(含10％FBS，2.5％马血清及1％双抗的DMEM培养基)，MRC-5细胞和WI-38细胞用MEM培养基(含10％FBS)，培养时采用37℃恒温、5％CO2的条件进行。
3药物母液配制实验：
取双香豆素(购自麦克林，纯度>99％)粉末，称重，并用DMSO溶液溶解制备10mM浓度的母液。
实验例1
探究双香豆素抑制A549细胞EMT的作用。
实验方法：利用TGF-β1刺激A549细胞，给予或不给予双香豆素处理，显微镜观察细胞形态变化，Western blotting和免疫荧光检测EMT生物标志物表达。
测试步骤：取对数生长期A549细胞，培养于96孔板或6孔板，5％ CO2，37℃过夜生长。在含1％ FBS的培养基中，用TGF-β1(5ng/mL)联合不同浓度的双香豆素(0μM，1.0μM，2.0μM，4.0μM)，处理48h后，显微镜拍照观察细胞形态变化，常规Western blotting和免疫荧光测定EMT生物标志物的表达。
检测结果参见图1。其中，图1中A-D为双香豆素对TGF-β1诱导的细胞形态变化的作用；E为不同浓度双香豆素对TGF-β1诱导的EMT生物标志物的变化；F为双香豆素对TGF-β1激活的信号通路蛋白的影响，包括TGF-β受体I和II以及Smad的磷酸化激活的影响；G和H分别为双香豆素对TGF-β1诱导的EMT生物标志物E-cadherin和N-cadherin的免疫荧光结果。
根据图1可知，A549细胞经TGF-β1刺激后，显微镜结果显示细胞形态变为细长条状；Western blotting蛋白测试显示，E-cadherin表达明显降低，N-cadherin明显升高；免疫荧光显示，E-cadherin和N-cadherin均表达于细胞膜。这些变化与EMT完全相符，提示TGF-β1诱导EMT。给予双香豆素共同处理后，上述变化具有明显改变，提示双香豆素可明显抑制TGF-β1诱导的A549细胞EMT。此外，双香豆素可明显抑制TGF-β1诱导的TGF-β受体I表达，对受体II则无明显影响，亦明显抑制Smad2和Smad3的磷酸化激活，提示双香豆素可明显抑制TGF-β通路。可见，DIC可以逆转TGF-β1诱导的E-cadherin的降低和N-cadherin的升高。
实验例2
探究双香豆素抑制HepG2细胞EMT的作用。
实验方法：利用TGF-β1刺激HepG2细胞，给予或不给予双香豆素处理，显微镜观察细胞形态变化，Western blotting和免疫荧光检测EMT生物标志物表达。
测试步骤：取对数生长期HepG2细胞，培养于96孔板或6孔板，5％ CO2，37℃过夜生长。在含1％ FBS的培养基中，用TGF-β1(5ng/mL)联合不同浓度的双香豆素(0μM，2.5μM，5.0μM，10.0μM)，处理48h后，显微镜拍照观察细胞形态变化，常规Western blotting测定EMT生物标志物的表达。
检测结果参见图2。其中，图2中A-D为双香豆素对TGF-β1诱导的细胞形态变化的作用；E为双香豆素对TGF-β1诱导的EMT生物标志物的作用。
根据图2可知，HepG2细胞经TGF-β1刺激后，显微镜结果显示细胞形态略有变长；Western blotting蛋白测试显示，E-cadherin表达明显降低，Vimentin、α-SMA、N-cadherin明显升高。给予双香豆素共同处理后，上述变化具有明显改变，提示双香豆素可明显抑制HepG2细胞的EMT。
实验例3
探究双香豆素抑制MIA PaCa-2细胞EMT的作用。
实验方法：利用TGF-β1刺激MIA PaCa-2细胞，给予或不给予双香豆素处理，显微镜观察细胞形态变化，Western blotting和免疫荧光检测EMT生物标志物表达。
测试步骤：取对数生长期MIA PaCa-2细胞，培养于96孔板或6孔板，5％ CO2，37℃过夜生长。在含1％ FBS的培养基中，用TGF-β1(5ng/mL)联合不同浓度的双香豆素(0μM，2.5μM，5.0μM，10.0μM)，处理48h后，显微镜拍照观察细胞形态变化，常规Western blotting测定EMT生物标志物的表达。
检测结果参见图3。其中，图3中A-D为双香豆素对TGF-β1诱导的细胞形态变化的作用；E为双香豆素对TGF-β1诱导的细胞EMT生物标志物的作用。
根据图3可知，MIA PaCa-2细胞经TGF-β1刺激后，显微镜结果显示细胞形态有所变长；Western blotting蛋白测试显示，E-cadherin表达明显降低，Vimentin、α-SMA、N-cadherin明显升高。给予双香豆素共同处理后，上述变化具有明显改变，提示双香豆素可明显抑制MIA PaCa-2细胞的EMT。
实验例4
探究双香豆素抑制血管内皮细胞EndMT的作用。
实验方法：利用TGF-β2刺激人内皮EA.hy926细胞，给予或不给予双香豆素处理，显微镜观察细胞形态变化，Western blotting检测EMT生物标志物表达。
测试步骤：取对数生长期EA.hy926细胞，培养于96孔板或6孔板，5％ CO2，37℃过夜生长。用TGF-β2(5ng/mL)联合不同浓度的双香豆素(0μM，2.5μM，5.0μM，10.0μM)，处理48h后，显微镜拍照观察细胞形态变化，常规Western blotting测定EMT生物标志物的表达。
检测结果参见图4。其中，图4中A-D为双香豆素对TGF-β2诱导的细胞形态变化的作用；E为双香豆素对TGF-β2诱导的细胞EMT生物标志物的作用。
根据图4可知，EA.hy926细胞经TGF-β2刺激后，显微镜结果显示，细胞形态变为细长条状；Western blotting蛋白测试显示，VE-cadherin表达明显降低，N-cadherin和Vimentin明显升高，α-SMA无明显变化。给予双香豆素共同处理后，上述变化具有明显改变，提示双香豆素可明显抑制EA.hy926细胞的EndMT。
实验例5
探究双香豆素对TGF-β1刺激的H9c2细胞的作用。
实验方法：利用TGF-β1刺激H9c2细胞，给予或不给予双香豆素处理，显微镜观察细胞形态变化，Western blotting和免疫荧光检测纤维化生物标志物表达。
测试步骤：取对数生长期H9c2细胞，培养于96孔板或6孔板，5％ CO2，37℃过夜生长。用TGF-β1(5ng/mL)联合不同浓度的双香豆素(0μM，2.5μM，5.0μM，10.0μM)，处理48h后，显微镜拍照观察细胞形态变化，常规Western blotting测定EMT生物标志物的表达。
检测结果参见图5。其中，图5中A-D为双香豆素对TGF-β1诱导的细胞形态变化的作用；E为双香豆素对TGF-β1诱导的细胞EMT生物标志物的作用。
根据图5可知，H9c2细胞经TGF-β1刺激后，显微镜结果显示细胞形态变长；Westernblotting蛋白测试显示，E-cadherin表达明显降低，N-cadherin、Vimentin和α-SMA明显升高。给予双香豆素共同处理后，上述变化具有明显改变，提示双香豆素可明显抑制H9c2细胞的EMT及纤维化相关蛋白的表达。
实验例6
探究双香豆素对TGF-β1刺激的HK-2细胞EMT的作用。
实验方法：利用TGF-β1刺激HK-2细胞，给予或不给予双香豆素处理，显微镜观察细胞形态变化，Western blotting检测EMT生物标志物表达。
测试步骤：取对数生长期HK-2细胞，培养于96孔板或6孔板，5％ CO2，37℃过夜生长。用TGF-β1(5ng/mL)联合不同浓度的双香豆素(0μM，2.5μM，5.0μM，10.0μM)，处理48h后，显微镜拍照观察细胞形态变化，常规Western blotting测定EMT生物标志物的表达。
检测结果参见图6。其中，图6中A-D为双香豆素对TGF-β1诱导的细胞形态变化的作用；E-G为双香豆素对TGF-β1诱导的N-cadherin表达的免疫荧光染色。H为双香豆素对TGF-β1诱导的N-cadherin表达的Western blotting结果。
根据图6可知，HK-2细胞经TGF-β1刺激后，显微镜结果显示细胞形态变细长；免疫荧光显示，N-cadherin均表达于细胞膜。Western blotting蛋白测试显示，N-cadherin明显升高。给予双香豆素共同处理后，上述变化具有明显改变，提示双香豆素可明显抑制HK-2细胞的EMT。
实验例7
探究双香豆素对TGF-β1刺激的NRK-52E细胞EMT的作用。
实验方法：利用TGF-β1刺激NRK-52E细胞，给予或不给予双香豆素处理，显微镜观察细胞形态变化，Western blotting检测EMT生物标志物表达。
测试步骤：取对数生长期NRK-52E细胞，培养于96孔板或6孔板，5％ CO2，37℃过夜生长。用TGF-β1(10ng/mL)联合不同浓度的双香豆素(0μM，1.25μM，2.5μM，5.0μM)，处理6天后，显微镜拍照观察细胞形态变化，常规Western blotting测定EMT生物标志物的表达。
检测结果参见图7。其中，图7中A-D为双香豆素对TGF-β1诱导的细胞形态变化的作用；E为双香豆素对TGF-β1诱导的EMT生物标志物的表达。
根据图7可知，NRK-52E细胞经TGF-β1刺激后，显微镜结果显示细胞形态变得更大；Western blotting蛋白测试显示，E-cadherin表达明显降低，N-cadherin、Vimentin和α-SMA明显升高。给予双香豆素共同处理后，上述变化具有明显改变，提示双香豆素可明显抑制TGF-β1诱导的NRK-52E细胞EMT和纤维化相关蛋白的表达。
实验例8
探究双香豆素对TGF-β1刺激的NRK-52E细胞EMT的作用。
实验方法：利用TGF-β1刺激NRK-52E细胞，给予或不给予双香豆素处理，免疫荧光检测EMT生物标志物表达。
测试步骤：取对数生长期NRK-52E细胞，培养于96孔板，5％ CO2，37℃过夜生长。用TGF-β1(10ng/mL)联合不同浓度的双香豆素(0μM，1.25μM)，处理6天后，免疫荧光测定纤维化标志物的表达。
检测结果参见图8。其中，图8中A-C为双香豆素对TGF-β1诱导的α-SMA表达的免疫荧光染色；D-F为双香豆素对TGF-β1诱导E-cadherin表达的免疫荧光染色。
根据图8可知，免疫荧光显示，空白对照组α-SMA低表达而E-cadherin高表达，经过TGF-β1处理后，α-SMA表达明显增加而E-cadherin表达明显降低。给予双香豆素共同处理可明显抑制TGF-β1诱导的这些变化，提示双香豆素可明显抑制TGF-β1诱导的NRK-52E细胞的EMT。
实验例9
探究双香豆素对TGF-β1刺激的人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞和WI-38细胞向肌成纤维细胞转化的作用。
实验方法：利用TGF-β1刺激MRC-5细胞和WI-38细胞，给予或不给予双香豆素处理，Western blotting检测肌成纤维细胞生物标志物表达。
测试步骤：取对数生长期MRC-5细胞或WI-38细胞，培养于6孔板，5％ CO2，37℃过夜生长。用TGF-β1(5ng/mL)联合不同浓度的双香豆素(0μM，4.0μM)，处理48h后，常规Western blotting测定α-SMA、E-cadherin的表达。
检测结果参见图9，可以看出，DIC(4μM)可以逆转TGF-β1(5ng/mL)诱导的E-cadherin降低，还可以抑制TGF-β1(5ng/mL)诱导的α-SMA的增加。
实验例10
探究双香豆素类其他药物对A549细胞EMT的作用。
实验方法：利用TGF-β1刺激A549细胞，分别给予或不给予双香豆素类的其他药物(华法林、3,3'-羰基双(7-二乙氨基香豆素)、醋硝香豆素)处理，显微镜观察细胞形态变化，Western blotting检测EMT生物标志物表达。
测试步骤：取对数生长期A549细胞，培养于96孔板或6孔板，5％ CO2，37℃过夜生长。在含1％ FBS的培养基中，用TGF-β1(5ng/mL)联合不同浓度的华法林、3,3'-羰基双(7-二乙氨基香豆素)或醋硝香豆素(0μM，2.0μM，4.0μM)，处理48h后，显微镜拍照观察细胞形态变化，常规Western blotting测定EMT生物标志物的表达。
检测结果参见图10。其中，图10中A-D为华法林对TGF-β1诱导的细胞形态变化的作用；E为不同浓度华法林对TGF-β1诱导的EMT生物标志物的变化；F-I为3,3'-羰基双(7-二乙氨基香豆素)对TGF-β1诱导的细胞形态变化的作用；J为不同浓度3,3'-羰基双(7-二乙氨基香豆素)对TGF-β1诱导的EMT生物标志物的变化；K-N为醋硝香豆素对TGF-β1诱导的细胞形态变化的作用；O为不同浓度醋硝香豆素对TGF-β1诱导的EMT生物标志物的变化。
根据图10可知，A549细胞经TGF-β1刺激后，显微镜结果显示细胞形态变为细长条状；Western blotting蛋白测试显示，E-cadherin表达明显降低，N-cadherin明显升高。这些变化与EMT完全相符，提示TGF-β1诱导EMT。而分别给予华法林、3,3'-羰基双(7-二乙氨基香豆素)或醋硝香豆素共同处理后，上述变化没有明显改变，提示华法林、3,3'-羰基双(7-二乙氨基香豆素)或醋硝香豆素对TGF-β1诱导的A549细胞EMT无作用。因此，与同类的其他抗凝药物相比，双香豆素显示出对EMT的独特抑制作用。
动物水平实验
双香豆素对大鼠UUO肾间质纤维化模型的作用。
1实验材料
双香豆素，来源如前述。SPF级Wistar大鼠(8-10周龄)，来源于澳门大学健康科学学院。
2主要实验试剂
多聚甲醛、二甲苯、H&E染液、Masson染液套装、中性树胶均购自北京索莱宝生物；DAB显色试剂盒购自南京中山金桥；α-SMA抗体(19245s)、Vimentin抗体(5741s)和E-cadherin抗体(3195s)购自Cell Signaling(CST)；Fibronectin抗体(ab2413)购自Abcam。
3实验方法
3.1动物分组、造模及给药
Wistar大鼠(250g±20g)适应环境饲养一周后，随机分为对照组、模型组和给药组四组，每组6只。将大鼠用水合氯醛(35mg/kg)麻醉后固定，剪掉腹部毛发，消毒腹部皮肤，腹部正中切口1.5-2.5cm，分离左侧输尿管，双重结扎，缝合切口，消毒。其中，模型组和给药组进行单侧输尿管结扎手术(UUO)，对照组仅造成手术创口，不进行结扎。药物治疗组于造模后第7天开始灌胃给予双香豆素，剂量分别为2.5mg/kg和5mg/kg，每日1次，对照组和模型组给予等量溶媒。
3.2动物处死、取样及样品处理
大鼠持续给药7天后，麻醉处死，迅速摘取双侧肾脏于生理盐水中洗涤，剥去表面脂肪组织及黏膜，取1/3固定于4％多聚甲醛，用于组织病理学检查；其余部分标记后放入-80℃冰箱，用于其他相关检测。
3.3组织病理检测
肾脏组织置于4％***固定后，常规石蜡包埋，切为4μm厚度的切片，进行常规H&E染色、Masson染色和Sirius Red染色，在光镜下观察、拍照并进行分析；常规免疫组织化学染色检测E-cadherin、α-SMA和Vimentin的表达。
切取肾脏组织，提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量，常规Western blotting检测肾脏组织中纤维化相关蛋白Vimentin、α-SMA和Fibronectin的表达。
4实验结果
4.1双香豆素减轻UUO模型大鼠结扎侧肾脏的损伤作用
检测结果参见图11。肾脏切片的H&E染色，其中，图11中A-D分别为对照组、模型组、双香豆素2.5和5.0mg/kg组。
从图11中H&E染色结果可以看出，与对照组相比，模型组的大鼠肾脏组织中肾小管中度萎缩，管腔扩大，局部炎症明显，上皮细胞有坏死或变性；肾小球中度萎缩；肾间质有明显的炎细胞浸润。双香豆素给药后能明显改善上述病理变化，肾小管的萎缩和管腔扩程度较模型组明显降低，上皮轻微细胞坏死，轻度的炎细胞浸润。
4.2双香豆素降低UUO模型大鼠结扎侧肾脏的胶原纤维沉积
检测结果参见图12和图13。
其中，图12为Masson三色染色结果，A-D分别为对照组、模型组、双香豆素2.5和5.0mg/kg组。Masson三色染色又称马松染色，是胶原纤维染色权威而经典的技术方法。Masson染色后肌纤维呈红色，胶原纤维呈绿色(淡绿)或蓝色(苯胺蓝)。
从图12中Masson染色结果可以看出，模型组的大鼠肾间质中主要的髓质部肾盂粘膜下组织见大量蓝染的胶原纤维沉积，有的融合成粗条索状；给药组的大鼠肾组织中胶原沉积明显减少，只见少量蓝染的胶原纤维沉积，未见明显的索状融合。
图13为Sirius Red染色结果。Sirius Red染色即天狼星红染色，是检测组织切片中的胶原纤维网络一种简单和灵敏的方法。
从图13中天狼星染色结果可以看出，模型组的大鼠肾间质中组织见多量红染的胶原纤维沉积，而给药组的大鼠肾组织中红色胶原明显减少。
上述的组织切片染色结果说明双香豆素可改善UUO模型肾脏组织的纤维化病变，抑制胶原纤维的沉积，保护肾脏。
4.3双香豆素降低UUO模型大鼠肾脏组织EMT蛋白和纤维化蛋白表达
各组大鼠肾脏组织中EMT和纤维化相关蛋白的免疫组织化学染色和蛋白免疫印迹检测结果如图14-17所示。
图14为大鼠肾脏组织的E-cadherin蛋白的免疫组织化学染色结果。A-D分别为对照组、模型组、双香豆素2.5和5.0mg/kg组。
从图14中E-cadherin的免疫组织化学染色结果可以看出，对照组肾小管上皮细胞中可见大量E-cadherin表达；模型组肾小管上皮中E-cadherin表达明显下降，仅见片状的微弱表达；给药组在肾小管上皮中E-cadherin相比模型组表达明显升高。
图15为大鼠肾脏组织的α-SMA蛋白的免疫组织化学染色结果。A-D分别为对照组、模型组、双香豆素2.5和5.0mg/kg组。
从图15中α-SMA的免疫组织化学染色结果可以看出，在对照组的大鼠肾小球、肾小管以及肾间质均未见明显表达，仅表达于肾动脉血管平滑肌细胞；模型组的肾间质和肾小管上皮细胞α-SMA表达明显增加，给药组可见α-SMA，但表达量较模型组明显减少。
图16为大鼠肾脏组织的Vimentin蛋白的免疫组织化学染色结果。A-D分别为对照组、模型组、双香豆素2.5和5.0mg/kg组。
从图16中Vimentin的免疫组织化学染色结果可以看出，Vimentin作为细胞骨架之一，在对照组的肾组织中表达量很低，而模型组中的表达明显增加。给药组的肾组织中Vimentin表达较模型组明显减少。
图17是Western blotting检测大鼠UUO模型肾脏中EMT相关蛋白表达的结果。
从图17中肾脏EMT相关蛋白表达结果可以看出，与空白组相比，模型组的肾脏的Fibronectin、Vimentin和α-SMA的蛋白表达明显增加，而给予DIC处理后，三个蛋白的表达明显降低。
通过上述药理实验结果可以看出，抗凝老药双香豆素具有显著的抗纤维化活性，具有开发成抗肾纤维化药物的应用前景。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.双香豆素在制备预防或治疗纤维化疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纤维化疾病包括肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、心纤维化、胰腺纤维化和器官纤维化所诱发的疾病；
优选地，所述纤维化疾病选自肺纤维化、肝纤维化和肾纤维化中的至少一种；
更优选地，所述纤维化疾病选自肾纤维化。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物预防和治疗所述纤维化疾病的机制包括以下(a)～(h)中的至少一种；
(a)通过抑制EMT；
(b)通过抑制EndMT；
(c)通过抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化；
(d)通过逆转TGF-β1、TGF-β2诱导的上皮细胞E-cadherin和内皮细胞VE-cadherin表达的降低；
(e)通过逆转***标志蛋白N-cadherin、Vimentin表达的升高；
(f)通过抑制纤维连接蛋白的表达；
(g)通过逆转TGF-β1诱导的肌成纤维细胞标志物α-SMA的表达；
(h)通过抑制TGF-β1和TGF-β2诱导的上皮细胞、内皮细胞和心肌细胞的形态的变化。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肺纤维化包括特发性肺纤维化、诱导型肺纤维化和其他病因未明的肺纤维化；其中，所述诱导型肺纤维化包括结节病诱发的肺纤维化、尘肺诱发的肺纤维化、过敏性肺炎诱发的肺纤维化、放射线诱发的肺纤维化、药物诱发的肺纤维化和农药诱发的肺纤维化。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肝纤维化包括病毒性肝炎诱发的肝纤维化、酒精性肝炎诱发的肝纤维化、自身免疫性疾病诱发的肝纤维化、脂肪肝诱发的肝纤维化、药物诱发的肝纤维化和其他病因未明的肝脏纤维化。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肾纤维化包括高血压诱发的肾纤维化、肾小球肾炎诱发的肾纤维化、***性红斑狼疮诱发的肾纤维化、硬皮病诱发的肾纤维化、肾移植排斥诱发的肾纤维化、肾盂肾炎诱发的肾纤维化、肾结石诱发的肾纤维化、高血脂诱发的肾纤维化、糖尿病诱发的肾纤维化、高尿酸血症诱发的肾纤维化、高钙尿症诱发的肾纤维化和其他病因未明的肾脏纤维化。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述心纤维化包括缺血性心脏疾病诱发的心纤维化、高血压诱发的心纤维化、病毒性心肌炎诱发的心纤维化、代谢性心肌病诱发的心纤维化、克山病诱发的心纤维化、扩张性心肌病诱发的心纤维化、限制性心肌病诱发的心纤维化、心脏重构诱发的心纤维化、心肌肥厚诱发的心纤维化和其他病因未明的心纤维化。
8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述胰腺纤维化包括慢性胰腺炎诱发的胰腺纤维化和其他病因未明的胰腺纤维化。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为药物组合物，所述药物组合物还包括药用载体或其他功效药物；
优选地，所述药物组合物中的双香豆素为双香豆素或其药用衍生物；
优选地，所述药物组合物的剂型选自溶液、悬浮液、片剂、胶囊、颗粒剂和注射剂中的至少一种。
10.双香豆素在制备用于分析测试EMT、EndMT、成纤维性向肌成纤维细胞转化的试剂中的应用，其中，所述试剂选自分析试剂、生化试剂或检测试剂。
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