KR102482937B1

KR102482937B1 - CRISPR/Cas9 리보핵산단백질 기반 현사시나무 유전자 교정용 조성물 및 이의 이용

Info

Publication number: KR102482937B1
Application number: KR1020200148300A
Authority: KR
Inventors: 배은경; 최영임; 이효신; 박수진; 장현아
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2020-11-09
Filing date: 2020-11-09
Publication date: 2023-01-02
Also published as: KR20220062746A

Abstract

본 발명에서는 현사시나무 SAP1 유전자의 교정 유도 가이드 RNA과 Cas9 단백질로 구성되는 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 포함하는 현사시나무의 유전체 교정용 조성물 및 이를 이용한 현사시나무의 유전체 교정 방법이 개시된다.
본 발명에 따른 조성물 및 방법에 의하면 외래 DNA 도입 없이 원하는 현사시나무의 표적 유전자를 정확하게 선택적으로 교정할 수 있고, 비표적 효과도 감소시키며, 현사시나무의 내염성 향상 등 다양한 산림분야에서 요구되는 현사시나무 품종 개량에 효과적으로 적용될 수 있다.

Description

CRISPR/Cas9 리보핵산단백질 기반 현사시나무 유전자 교정용 조성물 및 이의 이용{Composition for gene editing of Populus alba × Populus glandulosa based on CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins and its use}

본 발명은 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질 기반 현사시나무 유전자 교정용 조성물 및 이의 이용에 관한 것으로, 더 상세하게는 현사시나무 SAP1 (STRESS-ASSOCIATED PROTEIN 1, PagSAP1) 유전자의 교정 유도 가이드 RNA과 Cas9 단백질로 구성되는 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 포함하는 현사시나무의 유전체 교정용 조성물 및 이를 이용한 현사시나무의 유전체 교정 방법에 관한 것이다.

외래 유전자를 도입하거나 식물이 보유하고 있는 유전자의 발현을 인위적으로 조정하는 방식이 개발되어, 척박한 토지에서도 잘 자라는 식물, 내병성 식물, 및 생산성이 높은 식물 등이 개발되었다. 외래 DNA를 도입하여 새로운 기능을 갖는 식물은 유전자 변형 생물 (Genetically-modified Organism; GMO)이라 하여, 엄격한 규제 하에 몇몇 작물 (면화, 옥수수, 면화 등)만이 제한적으로 생산 및 소비되고 있다.

이러한 단점을 개선하기 위하여 외래 DNA 잔존 없이 식물의 목표 형질을 개량하기 위한 새로운 육종기술들이 개발되었다. 경제개발 협력기구 (Organization for Economic Cooperation and Development, OECD)는 GMO 안전성 규제를 적용받지 않을 가능성이 있는 새로운 육종기술 7 가지를 선정하여 신육종기술(new plant breeding technique; NPBT)이라고 명명하였다(Lusser et al. EUR 24760 EN, JRC European Commission, 2011). 이들 7가지 기술은 SDN (site-directed nucleases), ODM (oligonucleotide directed mutagenesis), 동종기원 (cisgenesis/intragenesis), 역육종 (reverse breeding; RB), RdDM (RNA-directed DNA methylation), 접목 (grafting on GM-rootstock)과 아그로인필트레이션 (agro-infiltration)이다. 이들 기술 중 SDN 기술이 현재 가장 널리 활용되고 있고, 이 기술로 개발된 유전자 교정 식물체 (대두, 카놀라)가 미 농무부의 승인을 얻어 시판되고 있다.

그러나 SDN 기술을 이용하는 경우도, 아그로박테리움 (Agrobacterium tumefaciens)을 사용하여 유전자 가위를 도입한 유전자 교정 식물체는 유전자변형생물로 분류될 수 있다. 아그로박테리움 도입 방법을 이용해 만든 유전자 교정 식물체는 유전체 상에 유전자 교정에 필요한 유전자 서열을 포함한 외래 DNA를 포함하고 있기 때문이다. 이러한 외래 DNA 서열은 유성 생식을 하는 식물의 경우 자손 세대에서 표지 선발을 통해 제거할 수 있으나, 나무와 같은 생활주기 (life cycle)가 긴 식물에서는 외래 DNA 서열을 제거하는데 더 많은 시간이 필요하다.

최근 Cas9 단백질과 가이드 RNA (gRNA)로 구성된 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질 (RNP; ribonucleoproteins)을 이용하여 유전체 교정 연구가 시도되고 있다. CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 이용할 경우 숙주의 유전체에 외래 DNA가 삽입될 가능성을 줄일 수 있다. 그리고 형질전환 후 유전체 표적 위치를 절단하고, 세포 내에서 내인적 단백질 분해효소에 의해 분해되므로 비표적 효과 (off-target effect)의 가능성 또한 줄일 수 있다. 또한 Cas9 단백질과 가이드 RNA만 필요하므로 사전에 ORF (open-reading frame)을 맞추는 과정 및 프로모터 설계 과정이 필요하지 않는 이점도 있다.

현재까지는 밀, 옥수수 및 양배추과의 작물과 바나나 나무 및 포도나무와 같은 과일나무에서 원형질체에 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 도입하여 유전체 교정 여부를 확인한 결과가 보고된 정도이다.

현사시나무 (Populus alba × Populus glandulosa)는 은백양 (P. alba)과 수원사시나무 (P. glandulosa)의 교잡종 포플러로서, 국내에 자라는 주요한 포플러 중의 하나로 널리 분포하고 있다. 따라서 현사시나무의 품종 개량에 활용할 수 있는 유전자 교정 기술의 개발이 요구되고 있는 실정이다. 지금까지 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 이용하여 현사시나무의 유전체 교정이 성공된 예는 보고된바 없다.

이에 본 발명자들은 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질 기반 현사시나무의 유전자 교정 기술에 관한 연구를 지속한 결과, 현사시나무 SAP1 유전자에 특이적인 가이드 RNA (guide RNA, gRNA)를 개발하고 이 가이드 RNA와 Cas9 단백질로 구성되는 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질이 현사시나무 유전체의 표적 유전자를 효율적으로 교정할 수 있음을 확인하고 본 발명은 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 현사시나무 SAP1 유전자의 교정 유도 가이드 RNA과 Cas9 단백질로 구성되는 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 포함하는 현사시나무의 유전체 교정용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용한 현사시나무의 유전체 교정 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된, 현사시나무 SAP1 유전자에 변이가 유도되어 내염성이 증진된 현사시나무 변이체를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 현사시나무 SAP1 유전자의 교정 유도 가이드 RNA과 Cas9 단백질로 구성되는 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 포함하는 현사시나무의 유전체 교정용 조성물을 제공한다.

현사시나무의 SAP1 유전자는 스트레스 연관 단백질 1 (Stress Associated Protein 1; SAP1)을 암호화하여 염 스트레스 내성을 조절하는 기능을 하며, 이 유전자에 변이가 일어나서 발현이 낮아지면 현사시나무는 내염성을 갖게 된다.

본 발명에서 '유전자 교정'은 유전자의 전부 또는 특정 부위가 제거 및/또는 임의의 뉴클레오타이드의 삽입에 의하여 변이가 유발된 것을 의미한다.

본 발명에서 현사시나무 SAP1 유전자의 교정 유도 가이드 RNA (gRNA)는 PagSAP1 유전자에서 프로토스페이서 인접 모티프 (protospacer-adjacent motif; PAM) 인접 표적 부위 (도 1의 붉은색 표기 부분)에 상보적인 20개의 연속 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 즉 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기서열 또는 서열번호 2의 염기서열에서 5' 말단으로부터 147 내지 166번째 연속 염기서열 (서열번호 3; 표적 부위)과 상보적인 20개의 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.

PAM을 포함한 표적 부위는 서열번호 1의 염기서열 중에서 5' 말단으로부터 144 내지 166번째 연속 염기를 포함하는 것이다. PAM(볼드체)을 포함한 표적 부위는 서열번호 3의 염기서열 (CAATGGATGATGCTGCCAGTTGG)을 갖는다.

상기 표적 부위는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)을 포함한다. PAM은 구아닌 (guanine : G)이 많은 영역으로서, 유전자 편집이 일어나는 표적 서열을 타깃하는 역할을 한다. 즉 가이드 RNA는 PAM과 인접한 절단된 표적 서열(프로토스페이서)을 찾아 결합한다. 상기 PAM은 5'-AGG-3', 5'-GGG-3', 5'-CGG-3' 및 5'-TGG-3'로 이루어진 군으로부터 선택된 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 가이드 RNA는 표적 부위의 염기서열에 특이적인 RNA로서, Cas9 효소와 결합하여 Cas9 효소를 표적 부위로 인도할 수 있는 폴리뉴클레오티드이다.

상기 폴리뉴클레오티드는 단일-사슬 가이드 RNA(single-chain guide RNA : sgRNA)일 수 있다. 가장 바람직하게는 가이드 RNA는 서열번호 4의 염기서열인 5'-ACUGGCAGCAUCAUCCAUUG-3' 이다.

Cas9(CRISPR associated protein 9) 단백질은 스트렙토코커스 sp. (Streptococcus sp.), 예컨대, 스트렙토코커스 피요게네스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 것(SwissProt Accession number Q99ZW2)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 Cas9 단백질은 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법으로 비자연적 생산된 것(nonnaturally occurring)일 수 있다. 상기 Cas9 단백질은 진핵세포의 핵 내 전달을 위하여 통상적으로 사용되는 요소(예컨대, 핵위치신호 (nuclear localization signal; NLS) 등)를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 가이드 RNA는 Cas9 단백질과 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 형성하여 유전자 가위를 구성할 수 있다. 유전자 가위는 유전체 상의 특정 위치를 인식하여 절단할 수 있는 형태의 뉴클레아제를 말한다.

상기 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질은, 아그로박테리움과 같은 매개체 없이도, 현사시나무 원형질체에 도입되어 표적 유전자를 교정할 수 있다 (도 5).

본 발명에 따른 현사시나무 SAP1 유전자의 교정 유도 가이드 RNA과 Cas9 단백질로 구성되는 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 포함하는 조성물은 현사시나무의 SAP1 유전자의 표적 부위를 절단케 하여 교정을 유도할 수 있다 (도 5, 도 6).

본 발명의 또 다른 목적에 따라서, 상기 조성물을 이용하여 현사시나무의 유전체 교정 방법을 제공한다.

상기 방법은

i) 현사시나무 잎에서 현사시나무 원형질체를 분리하는 단계;

ii) 상기 현사시나무 SAP1 유전자의 교정 유도 가이드 RNA와 Cas9 단백질을 혼합 배양하여 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 형성하는 단계; 및

iii) 현사시나무 원형질체와 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 혼합 배양하는 단계;를 포함한다.

본 발명의 방법을, 필요에 따라서, 단계 iii) 후에, iv) 현사시나무 원형질체를 회수하여 유전자 교정 여부를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

단계 i) 원형질체 분리

현사시나무 잎에서 현사시나무 원형질체를 분리한다.

본 발명에서 '원형질체'는 현사시나무 세포에서 세포벽이 제거된 것을 의미한다.

원형질체는 현사시나무 세포에 셀룰라아제 (cellulase), 펙티나아제 (pectinase), 헤미셀룰라제 (Hemicellulase), 자일라나아제 (xylanase) 등의 혼합 효소 용액을 처리하여 제조할 수 있다.

구체적으로는 현사시나무 원형질체는 현사시나무 잎을 절단하여 혼합 효소 용액으로 처리하여 세포벽을 분해하여 제조할 수 있다. 혼합 효소 용액으로는 가장 바람직하게는 셀룰라아제 3%(w/v) 및 마세로자임 (펙티나아제, 셀룰라아제 및 헤미셀룰라제의 혼합물) 0.8%(w/v)를 포함할 수 있다.

단계 ii) CRISPR/Cas9 리보핵산단백질(RNP) 형성

현사시나무 SAP1 유전자의 교정 유도 가이드 RNA와 Cas9 단백질을 혼합 배양하여 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 형성한다.

상기 가이드 RNA와 Cas9 단백질의 혼합 중량비는 1 : 1 내지 3 : 1일 수 있으며, 바람직하게는 3 : 1 이다.

상기 배양은 가이드 RNA와 Cas9 단백질을 혼합하여 상온에서 30분~60분, 바람직하게는 30분 수행될 수 있다.

본 단계에서와 같이, 가이드 RNA와 Cas9 단백질을 일정시간 배양할 경우 최종적으로 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질의 원형질체 도입 후 유전자 교정 효율(형질전환 효율)을 현저히 증진시킨다 (도 4).

단계 iii) CRISPR/Cas9 리보핵산단백질 도입 및 교정

현사시나무 원형질체와 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 혼합 배양하여 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 현사시나무 원형질체에 도입하여 표적 유전자를 교정케 한다.

본 단계에서 2×10⁴~ 2×10⁶개의 현사시나무 원형질체에 50 ~ 200 ㎍의 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 혼합하여 배양할 수 있으며, 가장 바람직하게는 2×10⁵개의 현사시나무 원형질체에 120 ㎍의 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 혼합하여 배양한다.

본 단계에서 배양은 상온에서 48시간 ~ 72시간, 바람직하게는 48시간 ~ 53시간, 가장 바람직하게는 48시간 수행한다.

본 단계에서와 같이, 일정시간 배양할 경우 최종적으로 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질의 원형질체 도입 후 유전자 교정 효율을 현저히 증진시킨다 (도 5).

단계 iv) 유전자 교정 확인

현사시나무 원형질체를 회수하여 유전자 교정 여부를 확인한다.

구체적으로는 현사시나무 원형질체로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 표적 부위의 PCR 증폭을 수행한 후 시퀀싱을 통하여 유전자 교정 여부를 확인한다.

본 발명에서 현사시나무 SAP1 (PagSAP1)의 표적 부위의 증폭에 최적의 프라이머를 설계하였다: PagSAP1-Forward primer: 5'-GAACGGGTTGTGGTGTTTGC-3' (서열번호 5), PagSAP1-Reverse primer: 5'-GAGCAGCAGTCCGATAATCAAAG-3'(서열번호 6).

또한 본 발명에서 인덱스와 시퀀싱 어뎁터가 결합된 서열을 부가할 수 있는 프라이머 서열을 설계하였다:

PagSAP1-sg1-Forward primer: 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGATTCCTTGCAGGACTTTTG-3' (서열번호 7)

PagSAP1-sg1-Reverse primer: 5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTCCTTGTGGCACTTGGAAC-3' (서열번호 8).

PagSAP1-sg4/5-Forward primer: 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTGTGGCTTCTTTGGAAGTG-3' (서열번호 9)

PagSAP1-sg4/5-Reverse primer: 5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCACCAGCAACCACAGGTTC-3' (서열번호 10).

본 발명의 유전체 교정 방법에 의하여 현사시나무 유전체를 교정할 경우 평균 약 2.61% 이상의 성공률로 원하는 유전자 변이를 얻을 수 있는 것으로 나타났으며, 가장 바람직한 실시예에서는 약 2.86% 이상의 성공률로 원하는 유전자 변이를 얻을 수 있는 것으로 나타났다. 상기 성공률은 종래 임목에서 리보핵산단백질을 이용해 유전자 교정에 성공한 사례가 없었던 것과 과일나무에서 리보핵산단백질을 이용한 유전자 교정 사례 (바나나 나무에서 성공률 0.2~1.0%, 포도나무에서 성공률 0.1%)에 비추어 볼 때, 현저히 높은 수치라고 할 수 있다.

본 발명의 유전체 교정 방법에 의하면 아그로박테리움과 같은 DNA 매개체(운반체)를 사용하지 않으므로 GMO (유전자 변형 생물)의 위험성에 대한 우려가 없다는 이점이 있다.

본 발명의 또 다른 목적에 따라서, 상기 방법에 의해 제조된 현사시나무 SAP1 유전자에 변이가 유도되어 내염성이 증진된 현사시나무 변이체를 제공한다.

본 발명에 따른 현사시나무 SAP1 유전자의 교정 유도 가이드 RNA과 Cas9 단백질로 구성되는 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 포함하는 현사시나무의 유전체 교정용 조성물은 외래 DNA 도입 없이 원하는 현사시나무의 표적 유전자를 정확하게 선택적으로 교정할 수 있다는 이점을 갖는다.

본 발명에 따른 현사시나무의 유전체 교정 방법에서는 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질은 현사시나무 유전체 표적 위치를 절단하고, 세포 내에서 내인적 단백질 분해효소에 의해 분해되므로 비표적 효과(off-target effect)도 감소시킨다. 그리고 Cas9 단백질과 가이드 RNA만 필요하므로 사전에 ORF (open-reading frame)을 맞추는 과정 및 프로모터 설계 과정이 필요하지 않은 이점도 있다.

또한 본 발명의 교정 방법은 현사시나무의 내염성 향상 등 다양한 산림분야에서 요구되는 현사시나무 품종 개량에 효과적으로 적용될 수 있다. 특히, 본 발명의 방법은 외래 DNA가 표적 서열 또는 표적외 서열 내에 삽입될 가능성이 없기 때문에 이 방법으로 생산된 현사시나무 변이체는 GMO로 규제되지 않을 것이므로 경제적 효과도 크다.

도 1은 표적 유전자인 현사시나무 (Populus alba × Populus glandulosa)의 내염성 인자 (Stress-Associated Protein 1; PagSAP1)의 전체 유전자 염기서열과 가이드 RNA의 표적 서열을 나타낸 것이다. 도 1a는 은백양 (Populus alba) 유래 SAP1 유전자 서열을 나타낸 것이고, 도 1b는 수원사시나무 (Populus glandulosa) 유래 SAP1 유전자 서열을 나타낸 것이다.
Protospacer-adjacent motif (PAM) 서열은 파란색으로, 가이드 RNA 서열의 설계를 위한 3가지 표적 부위들은 붉은색으로 표시하였다. 2종의 표적 부위가 겹치는 부분은 볼드체로 나타내었고, 본 발명에 따른 가이드 RNA의 표적 서열은 밑줄을 그어 표시하였다. 은백양과 수원사시나무 사이의 단일염기변형 (Single Nucelotide Polymorphism)은 초록색으로 표시하였다.
도 2는 현사시나무 잎에서 원형질체를 분리하는 과정을 나타낸 것이다. A. 사각 조직 배양 박스에서 배양한지 4주된 현사시나무, B. 현사시나무 잎 절단, C. 잘게 절단하여 효소 용액에 띄운 현사시나무 잎, D. W5 용액으로 세척, E. 고농도 수크로스 용액을 이용한 원형질체 정제, F. 분리한 원형질체, 스케일바 = 20 ㎛.
도 3은 시험관 내 (in vitro)에서 가이드 RNA와 Cas9 단백질의 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질에 의한 목표 유전자 절단 여부를 확인한 결과 사진이다.
도 4는 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질 (Cas9-gRNA)의 혼합 배양 시간에 따른 현사시나무 원형질체에서 표적 유전자의 변이 빈도의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 현사시나무 원형질체와 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질의 배양 시간에 따른 표적 유전자 교정 효과 (변이 빈도)를 표적화 딥시퀀싱을 통해 확인한 결과 그래프이다.
도 6은 현사시나무 원형질체와 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질의 배양 72시간 후 표적화 딥시퀀싱으로 분석된 표적 유전자의 변이된 서열을 나타낸다. 도 6a는 비교예 1의 가이드 RNA와 복합된 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 사용한 경우, 도 6b는 비교예 2의 가이드 RNA와 복합된 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 사용한 경우, 및 도 6c는 실시예 1의 가이드 RNA와 복합된 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 사용한 경우이다.

다음의 실시예들에 의해 본 발명이 더 상세히 설명된다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되어서는 안 된다.

시험예 1. 현사시나무에서 원형질체 분리

현사시나무에서 원형질체를 분리하기 위해, 6주간 기내 배양한 현사시나무의 정단부를 잘라 3% 수크로스가 함유된 1/2× MS 고형 배지를 담은 사각 조직 배양 박스 (tissue culture box)에 넣어 4주간 배양하였다 (도 2).

배양은 생장실에서 16시간 명 조건 (150 μmol/m²s)과 8시간 암 조건으로 24±1℃에서 수행하였다. 배양 4주째 정단부에서 3~4번째 현사시나무 잎을 0.5~1 ㎜ 간격으로 메스를 이용하여 그은 뒤 하기 표 1과 같은 조성의 효소 용액에 띄우고, 어두운 상태에서 회전교반기의 속도를 30 rpm로 하여 4시간 동안 분해하였다.

분해한 현사시나무 잎은 항생제인 세포탁심 (cefotaxime)을 10 ㎍/㎖ 농도로 첨가한 동량의 W5 용액 (154 mM NaCl, 125 mM CaCl_2,5 mM KCl, 5 mM Glucose, 1.5 mM MES, pH 5.6)으로 희석하였다. 이 희석된 혼합물을 2번 여과한 후 원형바닥 튜브를 120×g의 속도로 5분 동안 원심분리하여 원형질체를 회수하였다. W5 용액에 재현탁된 원형질체를 21% 수크로스 용액에 띄워 정제하고 120×g 속도로 5분 동안 원심분리하였다. 정제된 원형질체를 W5 용액으로 세척한 뒤 120×g 속도로 5분 동안 원심분리하여 펠렛을 만들었다. 상층액을 제거하고 원형질체를 W5 용액에 재현탁한 뒤 헤마사이토미터(hemacytometer)를 이용하여 현미경으로 세포수를 세었고, 원형질체 수득율을 표 1에 나타냈다.

구분	효소 용액 1	효소 용액 2	효소 용액 3	효소 용액 4
0.4 M Mannitol
3 mM MES (pH 5.6)
1x CPW
0.1 M CaCl₂
0.1% BSA
Cellulase (w/v)	3%	3%	3%	3%
Macerozyme (w/v)	0.8%	0.8%	1.2%	1.2%
Hemicellulase (w/v)	-	1.2%	1.2%	1.8%
수득률 (개/㎖)	4.8×10⁵	2.4×10⁵	2.3×10⁵	3.5×10⁵

표 1에 의하면, 효소 용액 1 (셀룰라제 3%(w/v)와 마세로자임 0.8%(w/v)의 조합)을 사용한 경우 현사시나무 원형질체 수득률이 가장 높았다.

시험예 2. 현사시나무 SAP1 유전자의 표적 부위 선발 및 가이드 RNA 설계

현사시나무에서 염 스트레스 내성을 조절하는 현사시나무 SAP1 유전자를 표적으로 하여 가이드 RNA 표적 부위를 선발하고 가이드 RNA를 설계하였다 (도 1).

가이드 RNA 설계에는 CRISPR RGEN tools 중 Cas-Designer 웹페이지(rgenome.net/cas-designer)를 사용하였고, 설계 조건은 가이드 RNA 길이가 PAM (protospacer-adajacent motif) 제외하고 20 bp (base-pair)가 되도록 하였고, Cas9 효소는 Streptococcus pyogenes에서 유래한 것으로 선택하여 사용하였고, 타겟 게놈은 현사시나무 Populus alba×Populus tremula var. glandulosa (Poplar 84K)로 설정하였다. 최종적으로 현사시나무 SAP1 유전자 서열을 입력하고 프로그램을 실행하여, 하기 표 2와 같이 가이드 RNA 표적 서열의 후보군을 얻었다.

번호	PAM 포함 표적서열(5'-3') (PAM in bold)	위치	방향	Out-of- frame Score	Mismatch
번호	PAM 포함 표적서열(5'-3') (PAM in bold)	위치	방향	Out-of- frame Score	0	1	2
1	GACTGGATGCCAAGCTCCAGAGG	18	+	73.2	2	2	0
2	ACTGGATGCCAAGCTCCAGAGGG	19	+	71.5	2	2	0
3	GGATGGGGCCCTCTGGAGCTTGG	27	-	68.2	1	3	2
4	ATGCAGAGGATGGGGCCCTCTGG	34	-	73.6	3	1	0
5	GTTGGGCTTGTTGCTGGTTCAGG	126	-	73.2	2	0	0
6	CTGCCAGTTGGGCTTGTTGCTGG	132	-	72.1	2	0	0
7	AATGGATGATGCTGCCAGTTGGG	143	-	75	2	0	1
8	CAATGGATGATGCTGCCAGTTGG (서열번호 3)	144	-	77.1	2	0	0
9	TCCATTCACAATGCTTTCAATGG	161	-	70.4	2	0	3
10	TTCTGAGATGAAGGCAAATGAGG	297	+	68.4	1	3	0
11	TCTGAGATGAAGGCAAATGAGGG	298	+	68.1	1	3	0
12	AGGCAAATGAGGGACCCAGTAGG	308	+	78	1	1	2
13	ACCGCTTGCCGAAAGCGTGTTGG	334	+	68.1	2	2	0
14	ACCAACACGCTTTCGGCAAGCGG	335	-	74.3	4	0	0
15	AACGATGAATTGCACAGAACAGG	387	-	71.2	2	0	2

표 2의 가이드 RNA 표적 서열의 후보군에서 예상되는 off-target 개수가 적고 out of frame score가 높은 표적 서열인 1번 (비교예 1), 6번 (비교예 2) 및 8번 (실시예 1)의 표적서열을 선발하여 가이드 RNA를 합성하고 하기 유전체 교정 시험에 사용하였다.

실시예 1의 표적서열에 기초하여 합성된 가이드 RNA 서열은 5'-ACUGGCAGCAUCAUCCAUUG-3' 이었다 (서열번호 4).

비교예 1의 표적서열에 기초하여 합성된 가이드 RNA 서열은 5'-CUGGAGCUUGGCAUCCAGUC-3'이었고, 비교예 2의 표적서열에 기초하여 합성된 가이드 RNA 서열은 5'-GCAACAAGCCCAACUGGCAG-3'이었다.

시험예 3. 인비트로 절단 분석( in vitro cleavage assay)

PowerPlant Pro DNA isolation kit (Qiagen)를 이용하여 현사시나무 잎에서 게놈 DNA를 분리하였다. 표적 DNA 영역 (현사시나무 SAP1 유전자)을 표 3의 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머쌍을 사용하여 증폭시킨 후 증폭된 PCR 산물을 정제하였다. Cas9 단백질 (Enzynomics) 0.5 ㎍과 시험예 2에서 합성한 각각의 가이드 RNA 1 ㎍을 혼합한 뒤 5분 동안 37℃에서 배양하여 리보핵산단백질을 준비하였다. 여기에 상기에서 정제된 PCR 산물 0.3 ㎍을 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 1 ㎕ 프로테나아제 K (Invitrogen)를 첨가한 후 25℃에서 10분 동안 배양하고 2% 아가로스 겔에서 전기영동을 통해 밴드를 확인하였고, 그 결과를 도 3에 나타냈다.

도 3에 도시된 바와 같이, 3종의 가이드 RNA를 각각 사용하여 제조된 비교예 1, 비교예 2 및 실시예 1의 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질은 현사시나무 SAP1 유전자의 각각의 표적 위치에서 절단을 수행하였음을 확인할 수 있다. 즉 3종의 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질은 모두 제대로 형성되었음을 알 수 있다.

시험예 4: 현사시나무 원형질체의 유전체 교정

저장완충액 (10 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50% glycerol, pH 7.4)에 녹아있는 Cas9 단백질 (Enzynomics) 90 ㎍과 시험예 2에서 합성한 각각의 가이드 RNA 30 ㎍을 혼합하고 상온에서 30분 동안 배양한 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 준비하였다. 비교를 위하여 상기 Cas9 단백질과 상기 가이드 RNA를 혼합한 (배양없이) CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 준비하였다.

시험예 1에서 준비된 2×10⁵개의 현사시나무 원형질체를 200 ㎕ MMG 용액 (0.4 M Mannitol, 15 mM MgCl₂, 4 mM MES, pH 5.6)에 재현탁시키고 상기에서 준비된 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 각각 첨가하였다. 그리고 동일 부피의 새로 제조한 PEG 용액 (40%[w/v] PEG 4000, 0.2 M mannitol, 0.1 M CaCl₂)과 잘 혼합한 뒤, 상온에서 10분 동안 배양하였다. 배양 후 800 ㎕의 W5 용액을 첨가하고 상기 용액을 잘 혼합하였다. 준비된 혼합액은 1,000 rpm의 속도로 1분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한 뒤, 1 ㎖의 MS 용액 (1x MS[-NH₄OH], 1x vitamin, 0.2 M mannitol, 0.4 M glucose, 2.0 ㎎/ℓ 2,4-D, 0.5 ㎎/ℓ 6-benzylaminopurine)에 재현탁하였다. 현탁한 원형질체를 어두운 조건으로 24℃에서 72시간 동안 배양하였다. 배양 개시 후 24시간 간격으로 300 ㎕씩 재현탁한 원형질체를 회수하여 하기 실시예 5에서 유전체 교정 여부를 분석하였다.

실시예 5: 현사시나무 원형질체의 유전체 교정 분석

표적화 딥시퀀싱을 통하여 유전체 교정 여부 분석을 수행하였다.

구체적으로는 실시예 4로부터 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질 (Cas9-gRNA)이 도입된 현사시나무 원형질체에서 PowerPlant Pro DNA isolation kit (Qiagen)을 이용하여 게놈 DNA (gDNA)을 분리하였다. 분리한 게놈 DNA에서 표적 위치(on-target site)를 하기 표 3의 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍을 이용해 PCR 증폭시켰다. 증폭된 PCR 산물을 1% 아가로스 겔에서 전기영동으로 확인한 후, 표 3의 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍과 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍을 사용하여 인덱스와 시퀀싱 어댑터가 결합할 서열을 2차 PCR을 통해 부가하였다. 2차 PCR 산물은 1% 아가로스 겔에서 전기영동 후 예상 사이즈 크기와 일치하는 밴드만을 절단하여 Gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel)를 이용해 분리 및 정제하였다. 정제한 산물에 인덱스와 시퀀싱 어댑터를 추가 PCR를 통해 부가하였다. Illumina Miseq (v2, 300-cycle)을 이용하여 고처리량 시퀀싱 (high-throughtput sequencing)을 수행하였다. 모든 실험은 3번 반복 수행하여 그 결과를 평균내어 도 4, 도 5 및 도 6에 나타냈다.

프라이머	염기서열 (5' → 3')
PagSAP1-Forward	GAACGGGTTGTGGTGTTTGC (서열번호 5)
PagSAP1-Reverse	GAGCAGCAGTCCGATAATCAAAG (서열번호 6)
PagSAP1-sg1-Forward	ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGATTTCCTTGCAGGACTTTTG (서열번호 7)
PagSAP1-sg1-Reverse	GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTCCTTGTGGCACTTGGAAC (서열번호 8)
PagSAP1-sg4/5-Forward	ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTGTGGCTTCTTTGGAAGTG (서열번호 9)
PagSAP1-sg4/5-Reverse	GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCACCAGCAACCACAGGTTC (서열번호 10)

도 4는 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질 (Cas9-gRNA)의 혼합 배양 시간에 따른 현사시나무 원형질체에서 표적 유전자의 변이 빈도의 결과를 나타낸 그래프이다. 현사시나무 원형질체에 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 도입한 후 배양 24시간째 측정한 결과이다.

도 4에 도시된 바에 의하면, Cas9 단백질과 가이드 RNA를 혼합 후 30분 동안 배양하여 형성한 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 현사시나무 원형질체에 도입한 경우, 실시예 1 (서열번호 4의 가이드 RNA를 사용한 본 발명의 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질)는 표적 유전자의 변이 빈도가 1.97±0.5%로 현저하게 높게 나타났다. 이에 비하여 Cas9 단백질과 가이드 RNA를 혼합 후 바로 형성한 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 현사시나무 원형질체에 도입한 경우는 표적 유전자의 변이 빈도가 미미하게 (0.03±0.02%) 나타났다.

한편 비교예 1 (1번의 표적 부위로 합성된 가이드 RNA를 사용한 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질) 및 비교예 2 (6번의 표적 부위로 합성된 가이드 RNA를 사용한 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질)를 사용한 경우는 Cas9 단백질과 가이드 RNA를 혼합 후 30분 동안 배양하여 사용하여도 표적 유전자의 변이 빈도가 미미하게 (각각 0.17±0.07%, 0.13±0.1%) 나타났다.

위와 같은 결과로부터 Cas9 단백질과 가이드 RNA를 혼합 후 일정 기간 실온에서 배양하면 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질이 안정화되어 변이 빈도를 증가시키는 것으로 추측된다.

도 5는 현사시나무 원형질체와 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질의 배양 시간에 따른 표적 유전자 교정 효과 (변이 빈도)를 표적화 딥시퀀싱을 통해 확인한 결과 그래프이다.

도 5에 도시된 바와 같이, 비교예 1 및 비교예 2의 경우는 24 ~ 72 시간 배양에도 표적 유전자의 변이 빈도가 미미하게 나타났다 (비교예 1: 24시간 배양 시 0.17±0.07%, 48시간 배양 시 0.27±0.1%, 72시간 배양 시 0.3±0.14% ; 비교예 2: 24시간 배양 시 0.13±0.1%, 48시간 배양 시 0.2±0.1%, 72시간 배양 시 0.13±0.02%).

이에 비하여 본 발명에 따른 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 사용한 실시예 1의 경우는 변이 (Indel; insertion and deletion, indel)는 예상된 위치, 즉 PAM (protospacer-adajacent motif)의 상류 3 nt(nucleotide) 위치에서 24시간 배양 시 1.97±0.5%, 48시간 배양 시 2.87±0.5%, 72시간 배양 시 2.37±0.35%의 빈도로 나타나 현저히 높음을 알 수 있다.

또한 상기와 같은 결과로부터 배양 시간은 48~72시간이 바람직하고 (변이 빈도 2.62% 이상), 가장 바람직하게는 배양 시간은 48시간임을 알 수 있다.

도 6a ~ 도 6c은 현사시나무 원형질체와 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질의 배양 72시간 후 표적화 딥시퀀싱으로 분석된 표적 유전자의 변이된 서열을 나타낸다.

도 6a ~ 도 6c에 도시된 결과에 의하면, 비교예 1의 경우는 표적 부위에 변이가 발생한 비율이 약 0.58%였고, 비교예 2의 경우는 표적 부위에 변이가 발생한 비율이 약 0.13%이었고, 실시예 1의 경우는 표적 부위에 변이가 발생한 비율이 약 2.8%인바, 도 5의 결과와 부합함을 확인할 수 있다.

상기와 같은 분석결과를 종합해 보면, 본 발명에 따른 유전체 교정 방법에 의하면 현사시나무에서 외래 DNA의 삽입 없이 유전체 교정을 효과적으로 수행할 수 있다는 것을 알 수 있다.

<110> National Institute of Forest Science <120> Composition for gene editing of Populus alba x Populus glandulosa based on CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein and its use <130> P-10442 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 513 <212> DNA <213> Populus alba <400> 1 atggagtctc atgatgagac tggatgccaa gctccagagg gccccatcct ctgcattaac 60 aactgtggct tctttggaag tgctgctaca atgaacatgt gttccaagtg ccacaaggac 120 atcatcctga accagcaaca agcccaactg gcagcatcat ccattgaaag cattgtgaat 180 ggaaactcta gcgggaatgg aaaagaacct gtggttgctg gtgccgttga tgtacaagct 240 gcacctgtag aggtgaaaat catctccaca gaaccatcca ctgcttcaag caagccttct 300 gagatgaagg caaatgaggg acccagtagg tgtaccgctt gccgaaagcg tgttggttta 360 acagggttcg gttgtagatg tggagacctg ttctgtgcaa ttcatcgtta ctctgacaag 420 catgactgcc cctttgatta tcggactgct gctcgtgatg ctattgctaa agccaaccct 480 gttgtcacgg cagagaagct tgataagatc taa 513 <210> 2 <211> 513 <212> DNA <213> Populus glandulosa <400> 2 atggagtctc atgatgagac tggatgccaa gctccagagg gccccatact ctgcattaac 60 aactgtggct tctttggaag tgctgctaca atgaacatgt gttccaagtg ccacaaggac 120 atcatcctga accagcaaca agcccaactg gcagcatcat ccattgaaag cattgtgaat 180 ggaaactcta gcggtaatgg aaaagaacct gtggttgctg gtgccgttga tgtacaacct 240 gcacctgtag aggtgaaaat catctccaca gaaccatcca ttgcttcaag caagccttct 300 gagatgaagg caaaagaggg acccagtagg tgtaccgctt gccgaaagcg tgttggttta 360 acagggttcg gttgtcgatg tggagacctg ttctgtgcaa ttcatcgtta ctctgacaag 420 catgactgcc cctttgatta tcggactgct gctcgtgatg ctattgctaa agccaaccca 480 gttgtcaagg cagagaagct tgataagatc taa 513 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target site with PAM <400> 3 caatggatga tgctgccagt tgg 23 <210> 4 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> guide RNA <400> 4 acuggcagca ucauccauug 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 5 gaacgggttg tggtgtttgc 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 6 gagcagcagt ccgataatca aag 23 <210> 7 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 7 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgatttcc ttgcaggact tttg 54 <210> 8 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 8 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtcctt gtggcacttg gaac 54 <210> 9 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 9 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctctgtggc ttctttggaa gtg 53 <210> 10 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 10 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcaccag caaccacagg ttc 53

Claims

현사시나무 SAP1 유전자의 교정 유도 가이드 RNA과 Cas9 단백질로 구성되는 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 포함하는 현사시나무의 유전체 교정용 조성물로,
상기 가이드 RNA는 서열번호 1의 염기서열에서 5'말단으로부터 147 내지 166번째 연속염기인 표적부위와 상보적인 20 bp의 염기를 포함하고,
현사시나무 SAP1 유전자를 변이시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, PAM 포함 표적부위는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 현사시나무의 유전체 교정용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 현사시나무의 유전체 교정용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 단일-사슬 가이드 RNA (single-chain guide RNA)인 것을 특징으로 하는 현사시나무의 유전체 교정용 조성물.
현사시나무의 유전체 교정 방법으로, 상기 방법은
i) 현사시나무 잎에서 현사시나무 원형질체를 분리하는 단계;
ii) 상기 현사시나무 SAP1 유전자의 교정 유도 가이드 RNA와 Cas9 단백질을 혼합 배양하여 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 형성하는 단계; 및
iii) 현사시나무 원형질체와 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질을 혼합 배양하는 단계;를 포함하고,
상기 가이드 RNA는 서열번호 1의 염기서열에서 5'말단으로부터 147 내지 166번째 연속염기인 표적부위와 상보적인 20 bp의 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 현사시나무의 유전체 교정 방법.
제 5항에 있어서, 상기 가이드 RNA와 Cas9 단백질의 혼합 배양은 상온에서 30분 ~ 60분 수행하는 것을 특징으로 하는 현사시나무의 유전체 교정 방법.
제 5항에 있어서, 현사시나무 원형질체와 CRISPR/Cas9 리보핵산단백질의 혼합 배양은 상온에서 48시간 ~ 72시간 수행하는 것을 특징으로 하는 현사시나무의 유전체 교정 방법.
제 5항에 있어서, 단계 iii) 후에, iv) 현사시나무 원형질체를 회수하여 유전자 교정 여부를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 현사시나무의 유전체 교정 방법.
제 9항에 있어서, 유전자 교정 여부의 확인은 서열번호 5 내지 10의 프라이머 쌍을 이용하는 딥시퀀싱으로 수행하는 것을 특징으로 하는 현사시나무의 유전체 교정 방법.
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