KR20230030826A

KR20230030826A - CaMLO2 유전자 교정에 의해 병 저항성이 조절된 고추 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 병 저항성이 조절된 유전체 교정 고추 식물체

Info

Publication number: KR20230030826A
Application number: KR1020210112967A
Authority: KR
Inventors: 김혜란
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2021-08-26
Filing date: 2021-08-26
Publication date: 2023-03-07

Abstract

본 발명은 고추 유래 CaMLO2 (Capsicum annuum Mildew Locus O 2) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)와 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질의 복합체(ribonucleoprotein); 또는 고추 유래 CaMLO2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터;를 유효성분으로 함유하는, 고추 식물체의 병 저항성을 조절하기 위한 유전체 교정용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

CaMLO2 유전자 교정에 의해 병 저항성이 조절된 고추 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 병 저항성이 조절된 유전체 교정 고추 식물체{Method for producing genome-edited pepper plant with controlled disease resistance by CaMLO2 gene editing and genome-edited pepper plant with controlled disease resistance produced by the same method}

본 발명은 CaMLO2 (Capsicum annuum Mildew Locus O 2) 유전자 교정에 의해 병 저항성이 조절된 고추 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 병 저항성이 조절된 유전체 교정 고추 식물체에 관한 것이다.

CRISPR/Cas9은 2012년 프로그램 가능한 분자 가위(molecular bossiguard)로 보고된 후 모든 염기서열 게놈에 표적 돌연변이를 도입하는 최초의 RNA 유도 게놈 편집 도구로 부상했다. 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes)로부터 SpCas9 기반 CRISPR 도구를 획득한 이후, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Cas9, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) Cas9, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) Cas9, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) Cas9 등 다양한 변종에서 다양한 도구가 개발되었다. 개발된 CRISPR 기반 도구는 녹아웃 세포라인과 유기체 생성부터 동식물, 인간의 생명공학에 이르기까지 모든 종류의 연구 분야에 신속하게 적용됐다.

CRISPR/Cas12a(Cpf1)는 또 다른 유용한 RNA 유도 게놈 편집 도구로 활용되고 있으며, 단일 crRNA와 crRNA 처리, 표적 부위 인식, DNA 분열에서 기능하는 Cpf1 단백질로 구성되었다. 다수의 Cpf1 단백질이 다양한 균주로부터 얻어졌다(FnCpf1 from Francisella tularensis subsp. novicida U112, LbCpf1 from Lachnospiraceae bacterium ND 2006, and AsCpf1 from Acidaminococcus sp. BV3L6). LbCpf1과 AsCpf1은 모두 발현 플라스미드 또는 Cpf1-리보핵단백질(ribonucleoprotein, RNP)에 의한 인간 세포에서의 성공적인 편집 활성을 보였다. LbCpf1과 AsCpf1의 편집 효과는 Cpf1-RNP를 통해 콩과 담배에서도 성공적으로 검증되었으나, 식물 고유의 특성으로 인해 콩과 담배뿐 아니라 벼에서도 완성형 crRNA-harboring 플라스미드의 편집효율이 낮아졌다.

표적 외 돌연변이 없이 표적 유전자 편집을 성공적으로 개선하기 위해 단백질 공학을 활용한 Cas9 단백질의 고성능 버전이 고안되었다. 가이드-RNA 포맷은 Cas9의 경우 절단 가이드 RNA, Cpf1 단백질의 경우 화학적으로 합성된 가이드 RNA, Cas9와 Cpf1의 경우 모두 5'-하이드록시(hydroxyl) 가이드 RNA로서 해독 포맷을 사용하여 설계되었다. CRISPR 도구를 표적으로 하는 생물체에 전달하기 위해, 기계적 힘-, 화학적-, 생물학적-시스템 기반 방법을 포함하는 다양한 방법을 이용할 수 있다. 식물에서는 고안된 CRISPR 도구를 전달하기 위해 유전자총(particle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol, PEG) 매개 및 아그로박테리움(Agrobacterium) 매개 방법을 사용할 수 있다.

가지과(Solanaceae)의 고추(Capsicum)는 표적 유전자의 변형과 돌연변이 식물의 생성 등 유전자 조작에 저항력이 강한 것으로 알려져 있다. 유전자총 또는 아그로박테리움 매개 변환이 30년 이상 광범위하게 활용되었고, 토마토와 담배와 같은 가지과의 다른 속(Genus)에도 유사한 방법이 개발되었지만, 고추 속에서의 역유전학 연구에 대한 효율적인 방법은 아직 부족하다. 또한 CRISPR 기반의 게놈 편집 도구는 고추에서 보고된 바 없다.

캡시큠 안늄(C. annuum) 'CM334'와 'Dempsey'는 유전체 정보가 완성되어 각각 매운 고추(hot pepper)와 단고추(sweet pepper)의 특성을 연구하는 데 훌륭한 자원이다. 세포기반 연구에 광범위하게 사용되어 온 애기장대, 담배 및 벼와 같은 모델 작물의 원형질체 시스템과 달리, 고추 원형질체는 원형질체 분리 후 끈적거리는 성질로 인해 파괴되기 쉽다. 최근에 본 발명자는 'CM334'와 'Dempsey' 등 두 가지 고추의 토양에서 자란 잎에서 고추 유래 캘러스를 성공적으로 유도하고 유지시켰다. 상기 캘러스는 세포 기반의 기능적 유전자 연구를 위한 안정적인 고추 원형질체를 제공하였다.

흰가루병(Powdery mildew)은 토마토 및 고추와 같은 온실- 및 필드-재배 작물에 중요한 곰팡이 질병이다. 식물에서 mildew resistance locus O (MLO) 유전자 중, AtMLO2는 AtMLO6 및 AtMLO12와 함께 V 계통군에 속하며, 식물 병원균, 특히 흰가루병에 대한 무효 돌연변이에서 광범위한 내성을 주는 잘 알려진 감수성 유전자이다. 캡시큠 안늄(C. annuum) 'CM334'의 게놈 서열에서 CaMLO 18개 멤버가 추정되었고, CaMLO2가 AtMLO2의 오쏘로그(ortholog)로 보고된 바 있다. 고추에 표적 돌연변이 유발물질이 부족하기 때문에 천연 돌연변이 외에는 사용 가능한 고추 CaMLO 녹아웃 돌연변이가 없다.

한편, 한국공개특허 제2015-0048287호에는 '식물체의 건조 저항성 관련 단백질 MLO2 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1825596호에는 '식물체의 생장, 발달 및 병 저항성을 조절하는 고추 유래의 CaLOP 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 'CaMLO2 유전자 교정에 의해 병 저항성이 조절된 고추 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 병 저항성이 조절된 유전체 교정 고추 식물체'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 CM334와 Dempsey의 잎 유래 원형질체 및 CM334 캘러스 유래 원형질체를 대상으로 하여 흰가루병 감수성 유전자인 CaMLO2 (Capsicum annuum Mildew Locus O 2) 교정을 위한 후보 가이드 RNA를 디자인하고, Cas9 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제와 혼합하여 리보핵산-단백질(ribonucleoprotein) 복합체를 원형질체로 도입시켰다. 그 후, 원형질체에서 InDel 변이 효율을 분석하여 CaMLO2 교정에 효과적인 가이드 RNA를 선발함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 고추 유래 CaMLO2 (Capsicum annuum Mildew Locus O 2) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)와 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질의 복합체(ribonucleoprotein); 또는 고추 유래 CaMLO2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터;를 유효성분으로 함유하는, 고추 식물체의 병 저항성을 조절하기 위한 유전체 교정용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 고추 유래 CaMLO2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 고추 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 (b) 상기 유전체가 교정된 고추 식물세포로부터 고추 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 병 저항성이 조절된 유전체 교정 고추 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 병 저항성이 조절된 유전체 교정 고추 식물체 및 이의 유전체가 교정된 종자를 제공한다.

본 발명의 제조방법을 통해 제조된 유전체 교정 고추 식물체는 병 저항성을 조절할 수 있어 고추 생산성 증대 효과를 기대할 수 있다. 또한, 본 발명의 제조방법은 외부 유전자가 삽입되어 있지 않고 자연적 변이와 구별할 수 없는 작은 변이만 가지고 있어, 안전성과 환경 유해성 여부를 평가하기 위해 막대한 비용과 시간이 소모되는 GMO(Genetically Modified Organism) 작물과 달리 비용과 시간을 절약할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 고추 원형질체의 CRISPR 매개 유전체 교정에 관한 모식도이다.
도 2는 두 종의 고추(CM334 및 Dempsey)에서 CRISPR/Cas9 또는 CRISPR/Cpf1 RNP를 매개로 한 CaMLO2 유전자의 in vitro cleavage 검정 결과이다. (a) 및 (b)는 CaMLO2의 게노믹 서열에서 가이드 RNA의 표적 위치를 보여주는 것으로, 파란색은 SpCas9 적용을 위한 가이드 RNA 2가지의 위치이고, 빨간색은 LbCpf1 적용을 위한 가이드 RNA 4가지의 위치이며, 회색은 CaMLO2 유전자의 엑손 부위를 나타낸다. 도 2(c)와 (d)는 각각 Cas9와 LbCpf1을 이용한 in vitro cleavage 검정 결과이다.
도 3은 Dempsey 잎 원형질체에 대한 CRISPR/Cas9 RNP-매개 CaMLO2 교정 결과로, (a)는 원형질체에서 핵 표적 GFP:NLS가 발현되고 있는 것을 관찰한 것이고, (b)는 Cas9-sgRNA1 및 Cas9-sgRNA2의 InDel 효율을 분석한 것이며, (c)는 Cas9-sgRNA1 및 Cas9-sgRNA2의 CaMLO2 표적 위치의 InDel 경향을 표적 심층 서열분석(Targeted deep sequencing)으로 분석한 것이다.
도 4는 CM334 캘러스 유래 원형질체에 대한 CRISPR/Cas9 RNP-매개 CaMLO2 교정 결과로, (a)는 원형질체에서 핵 표적 GFP:NLS가 발현되고 있는 것을 관찰한 것이고, (b)는 Cas9-sgRNA1 및 Cas9-sgRNA2의 InDel 효율을 분석한 것이며, (c)는 Cas9-sgRNA1 및 Cas9-sgRNA2의 CaMLO2 표적 위치의 InDel 경향을 표적 심층 서열분석으로 분석한 것이다.
도 5는 Dempsey 잎 원형질체에 대한 CRISPR/LbCpf1 RNP-매개 CaMLO2 교정 결과로, (a)는 LbCpf1-crRNA1 및 LbCpf1-crRNA2의 InDel 효율을 분석한 것이며, (b)는 LbCpf1-crRNA1 및 LbCpf1-crRNA2의 CaMLO2 표적 위치의 InDel 경향을 표적 심층 서열분석으로 분석한 것이다.
도 6은 CM334 캘러스 유래 원형질체에 대한 CRISPR/LbCpf1 RNP-매개 CaMLO2 교정 결과로, (a)는 LbCpf1-crRNA1 및 LbCpf1-crRNA2의 InDel 효율을 분석한 것이며, (b)는 LbCpf1-crRNA1 및 LbCpf1-crRNA2의 CaMLO2 표적 위치의 InDel 경향을 표적 심층 서열분석으로 분석한 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고추 유래 CaMLO2 (Capsicum annuum Mildew Locus O 2) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)와 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질의 복합체(ribonucleoprotein); 또는 고추 유래 CaMLO2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터;를 유효성분으로 함유하는, 고추 식물체의 병 저항성을 조절하기 위한 유전체 교정용 조성물을 제공한다.

용어 '유전체/유전자 교정(genome/gene editing)'은, 인간 세포를 비롯한 동·식물 세포의 유전체 염기서열에 표적지향형 변이를 도입할 수 있는 기술로서, DNA 절단에 의한 하나 이상의 핵산 분자의 결실(deletion), 삽입(insertion), 치환(substitutions) 등에 의하여 특정 유전자를 녹-아웃(knock-out) 또는 녹-인(knock-in)하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코딩(non-coding) DNA 서열에도 변이를 도입할 수 있는 기술을 말한다. 본 발명의 목적상 상기 유전체 교정은 특히 엔도뉴클레아제(endonuclease) 예컨대, Cas9(CRISPR associated protein 9) 또는 LbCpf1 단백질 및 가이드 RNA를 이용하여 식물체에 변이를 도입하는 것일 수 있다.

용어 "표적 유전자"는 본 발명을 통해 교정하고자 하는 식물체의 유전체 내에 있는 일부 DNA를 의미하며, 그 유전자의 종류에 제한되지 않으며, 코딩 영역 및 비-코딩 영역을 모두 포함할 수 있다. 당업자는 그 목적에 따라, 제조하고자 하는 유전체 교정 식물체에 대하여 원하는 변이에 따라 상기 표적 유전자를 선별할 수 있다.

용어 "가이드 RNA(guide RNA)"는 표적 유전자의 염기서열을 암호화하는 DNA에 특이적인 RNA를 의미하며, 표적 DNA 염기서열과 전부 또는 일부가 상보적으로 결합하여 해당 표적 DNA 염기서열로 엔도뉴클레아제 단백질을 이끄는 역할을 하는 리보핵산을 의미한다. 상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA(dual RNA); 또는 표적 유전자 내 염기서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 RNA-가이드 뉴클레아제와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일 사슬 가이드 RNA(sgRNA) 형태를 말하나, RNA-가이드 뉴클레아제가 표적 염기서열에서 활성을 가질 수 있는 형태라면 제한없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있으며, 함께 사용된 엔도뉴클레아제의 종류 또는 엔도뉴클레아제의 유래 미생물 등을 고려하여 당업계의 공지된 기술에 따라서 적절히 선택할 수 있다.

또한, 상기 가이드 RNA는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것, 생체 외(in vitro)에서 전사된(transcribed) 것(예컨대, 올리고뉴클레오티드 이중가닥) 또는 합성한 가이드 RNA 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 가이드 RNA는 CaMLO2 유전자의 표적 염기서열에 특이적으로 고안된 것으로서, 바람직하게는 서열번호 2, 서열번호 8, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 2 또는 8의 염기서열은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaMLO2의 게노믹 서열에서 세 번째 엑손 부위를 표적으로 하는 가이드 RNA 서열이고, 서열번호 4의 염기서열은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaMLO2의 게노믹 서열에서 첫 번째 엑손 부위를 표적으로 하는 가이드 RNA 서열이며, 서열번호 5의 염기서열은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaMLO2의 게노믹 서열에서 세 번째 엑손 부위를 표적으로 하는 가이드 RNA 서열이다(표 1 및 도 2b 참고).

또한, 본 발명에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 단백질은 Cas9, Cpf1(CRISPR from Prevotella and Francisella 1), TALEN(Transcription activator-like effector nuclease), ZFN(Zinc Finger Nuclease) 또는 이의 기능적 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 Cas9 또는 Cpf1 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 또는 스트렙토코커스 아우레우스(Streptocuccus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이쎄리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 유래의 Cas9 단백질, 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida) 유래의 Cas9 단백질, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) 유래의 Cas9 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Cas9 단백질 또는 이의 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다.

Cas9 단백질은 RNA-guided DNA 엔도뉴클레아제 효소로, 이중 가닥 DNA 절단(double stranded DNA break)을 유도한다. Cas9 단백질이 정확하게 표적 염기서열에 결합하여 DNA 가닥을 잘라내기 위해서는 PAM(Protospacer Adjacent Motif)이라 알려진 3개의 염기로 이루어진 짧은 염기서열이 표적 염기서열 옆에 존재해야 하며, Cas9 단백질은 PAM 서열(NGG)로부터 3번째와 4번째 염기쌍 사이를 추정하여 절단한다.

Cpf1 단백질은 클래스 Ⅱ의 V형으로 분류되는 RNA-가이드 엔도뉴클레아제(RNA-guided endonuclease)로서, 프레보텔라(Prevotella)와 프란시셀라(Francisella) 속의 세균에서 발견되는 획득 면역 메커니즘의 구성요소이다. Cpf1은 Cas9보다 작고 더 단순한 엔도뉴클레아제로서, Cas9과 구분되는 몇 가지 장점을 가지고 있다. 첫째, Cpf1은 Cas9이 DNA 절단시 평활 말단(blunt ends)을 형성하는 것과 달리 4~5개의 오버행(overhangs)이 존재하는 점착성 말단(cohesive ends)을 만든다. 이러한 점착성 말단은 평활 말단에 비해 상동재조합(homology-directed repair; HDR)을 통한 유전자 재조합 가능성을 높여준다. 두 번째로, Cpf1은 tracrRNA 없이 단일 crRNA만으로도 활성을 나타낼 수 있어, crRNA와 tracrRNA 활성이 모두 필요한 Cas9에 비해 짧은 sgRNA를 이용함으로써 보다 경제적이다. 세 번째로 Cpf1은 T가 풍부한 PAM(protospacer adjacent motif)을 인식하기 때문에 Cas9이 인지하는 G가 풍부한 PAM과 다른 부위에서 DNA 편집을 할 수 있다는 장점을 가진다. 네 번째로 Cpf1은 이중가닥 절단을 유도하는 활성 외에 crRNA 전구체의 성숙을 위한 RNAase Ⅲ 활성을 가지고 있다. 마지막으로, Cas9의 가장 중요한 결점 중에 하나가 오프-타겟(off-target) 활성이 높다는 것인데 비해, Cpf1은 식물 세포에서 이러한 오프-타겟 활성이 매우 낮다는 장점이 존재한다. 오프-타겟 활성이 낮을수록 더욱 더 정확하게 원하는 유전자 부위만을 재조합할 수 있기 때문에, Cpf1의 매우 낮은 오프-타겟 활성은 매우 중요한 장점이라고 할 수 있다.

본 발명에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질은 리보핵산-단백질(ribonucleoprotein) 복합체를 형성하여 RNA 유전자 가위(RNA-Guided Engineered Nuclease, RGEN)로 작동할 수 있다.

본 발명은 또한,

(a) 고추 유래 CaMLO2 (Capsicum annuum Mildew Locus O 2) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 고추 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및

(b) 상기 유전체가 교정된 고추 식물세포로부터 고추 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 병 저항성이 조절된 유전체 교정 고추 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 CaMLO2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질은 전술한 것과 같다.

본 발명에서 사용된 CRISPR/Cas9 시스템은 교정하고자 하는 특정 유전자의 특정위치에 이중나선 절단을 도입하여 DNA 수선 과정에서 유도되는 불완전 수선에 의한 삽입-결실(insertion-deletion, InDel) 돌연변이를 유도시키는 NHEJ(non-homologous end joining) 기작에 의한 유전자 교정 방법이다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 고추 식물세포에 도입하는 것은, 고추 유래 CaMLO2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein); 또는 고추 유래 CaMLO2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터;를 이용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체를 식물세포에 형질도입하는 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296: 72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8:363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3:1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202:179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein et al., 1987, Nature 327:70), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다.

또한, 상기 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 도입하는 것은 형질전환 방법을 의미한다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질이 도입되는 "식물세포"는 어떤 식물세포도 된다. 식물세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 소포자, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 식물세포는 원형질체이다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 유전체가 교정된 식물세포로부터 유전체가 교정된 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 유전체가 교정된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).

또한, 본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 병은 흰가루병, 역병, 시들음병, 무름병 및 풋마름병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있고, 바람직하게는 흰가루병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 병 저항성이 조절된 유전체 교정 고추 식물체 및 이의 유전체가 교정된 종자를 제공한다.

본 발명에 따른 병 저항성이 조절된 유전체 교정 고추 식물체는 생물학적 스트레스에 대한 식물체 내부의 감수성 유전자인 CaMLO2 유전자를 CRISPR/Cas9 또는 CRISPR/LbCpf1 시스템을 이용하여 교정한 것으로, 고추 유래 CaMLO2 유전자가 녹-아웃되어 유전체를 교정하지 않은 고추 식물체에 비해 병 저항성이 조절된 형질을 가지는 유전체 교정 고추 식물체이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물 재료 및 원형질체 분리

캡시큠 안늄(C. annuum) 품종 CM334와 Dempsey는 채소육종연구센터(http://vbrc.snu.ac.kr/)에서 제공받았다. CM334와 Dempsey는 생장 챔버에서 25±1℃에서 16시간 명/8시간 암의 광주기의 토양에서 발아시키고 성장시켰다. CM334 캘러스는 완전히 뻗은 어린 잎을 캘러스 유도 배지(callus inducing media, CIM; MS media contained with B5 vitamins, 3% of sucrose, 1 mg/L 2,4-dichlorophenoxyacetic acid)에서 생산하였으며, 매 3주마다 정기적으로 계대배양하며 CIM에서 유지시켰다. 두 품종으로부터 획득한 고추 캘러스는 원형질체 분리를 위해 24±1℃에서 세포벽 분해 효소 용액(Jie E-Y et al., J Plant Biotechnol. 2011, 38;69-76)에 3~4시간 동안 반응시켰다. 세포벽이 분해된 고추 원형질체는 동량의 W5 용액(154 mM NaCl, 125 mM CaCl₂, 5 mM KCl, 5 mM glucose, 1.5 mM Mes-KOH, pH 5.6)으로 희석시켜 잔존하는 세포벽 분해 효소를 제거하였다. 고추 원형질체는 58g, 5분의 조건으로 원심분리하여 수득하고 W5 용액을 이용하여 2번 세척하였다. 순수하게 분리된 고추 원형질체는 혈구계(hemocytometer)를 사용하여 계수하고, 5×10⁴ 원형질체를 PEG 매개 CRISPR/RNP에 사용하였다. 간단하게, Cas9 또는 LbCpf1 단백질을 디자인된 가이드 RNA와 1:6 M 비율로 혼합하여 1시간 동안 상온에서 반응시킨 후, 미리결합된 RNP 혼합물을 300 ㎕의 MMG 용액(400 mM mannitol, 15 mM MgCl₂, 5 mM MES; pH 5.6)에 들어있는 원형질체와 조심스럽게 섞어주었다. 그 후, 신선하게 준비된 PEG 용액(200 mM mannitol, 100 mM CaCl₂, 40% PEG 4000) 동량을 넣어주었다. PEG가 혼합된 고추 원형질체를 동량의 W5 용액을 사용하여 3번 연이어 희석하였다. 58g, 5분의 조건으로 원심분리하여 고추 원형질체를 수거한 후 W5 용액에서 배양시켰다. 지시된 시간(24 또는 48시간)동안 배양한 후, CRISPR-RNPs-트랜스펙션된 원형질체를 게노믹 DNA 추출을 위해 준비하고, 최종적으로 표적 유전자 교정을 분석하였다.

2. 가이드 RNA의 디자인 및 준비

염기서열 확인 및 가이드 RNA 디자인을 위해, 생거 염기서열분석(Sanger sequencing)을 통해 두 품종의 CaMLO2 게노믹 부위를 시퀀싱하였다. Cas9를 위한 sgRNAs 및 LbCpf1을 위한 crRNAs의 후보들을 고안하기 위해서, Cas-Designer of RGEN tools (http://rgenome.net)을 사용하였다. 가이드 RNA는 이전의 방법(Kim H, et al., Nat Commun. (2017) 8:14406)에 따라 T7 RNA polymerase (New England Biolabs)를 사용하여 in vitro transcription으로 합성하였다.

CaMLO2 유전자 교정을 위한 가이드 RNAs

가이드 RNA 이름	가이드 RNA 서열 (5'→3')^*	서열번호^†	Endonuclease 종류
gRNA1 (sgRNA1)	CATCTTCATCTGCCTTACA (AGG or NGG)	2	SpCas9
gRNA1 (sgRNA1-1)	ACATCTTCATCTGCCTTACA (AGG or NGG)	8	SpCas9
gRNA2 (sgRNA2)	[T]GATGACCCTTGTTTACAAA (AGG or NGG)	3	SpCas9
gRNA3 (crRNA1)	(TTTA or TTTN) TTGAACAAATTATGCATCACCTT	4	LbCpf1
gRNA4 (crRNA2)	(TTTG or TTTN) GGGACACATAAGTTAGAAACTGG	5	LbCpf1
gRNA5 (crRNA3)	(TTTG or TTTN) TTCAATAAAAATGGAAATAGCCA	6	LbCpf1
gRNA6 (crRNA4)	(TTTG or TTTN) TAAACAAGGGTCATCATACTCAG	7	LbCpf1
^*: 괄호는 PAM 서열을 의미, []서열을 포함할 수 있음. ^†: PAM 서열을 제외한 가이드 RNA 서열을 의미함.

가이드 RNA 합성에 사용된 프라이머 정보

프라이머 이름	서열 (5'→3')
gRNA1-F	GAAATTAATACGACTCACTATAGCATCTTCATCTGCCTTACAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG (서열번호 9)
gRNA2-F	GAAATTAATACGACTCACTATAGGATGACCCTTGTTTACAAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG (서열번호 10)
gRNA(1,2)-R	AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC (서열번호 11)
gRNA3-F	AAGGTGATGCATAATTTGTTCAAATCTACACTTAGTAGAAATT (서열번호 12)
gRNA4-F	CCAGTTTCTAACTTATGTGTCCCATCTACACTTAGTAGAAATT (서열번호 13)
gRNA5-F	TGGCTATTTCCATTTTTATTGAAATCTACACTTAGTAGAAATT (서열번호 14)
gRNA6-F	CTGAGTATGATGACCCTTGTTTAATCTACACTTAGTAGAAATT (서열번호 15)
gRNA(3, 4, 5, 6)-R	GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAATTTCTACTAAGTGTAGAT (서열번호 16)
bold: guide-RNA sequences

3. CRISPR 도구를 이용한 in vitro cleavage assay

고추 게노믹 DNA는 Plant SV Mini kit (GeneAll)를 사용하여 추출하였으며, CaMLO2의 표적 DNA 부위 증폭을 위한 주형으로 사용하였다. 설계된 가이드 RNA의 활성은 in vitro cleavage assay을 통해 검정하였다(Kim H, et al., 2017). 간단하게, 240 ng의 표적 DNA 앰플리콘을 정제된 2㎍의 Cas9 또는 LbCpf1, 1.5㎍의 가이드 RNA 및 2㎕의 10X NEB 3.1 buffer와 섞어준 후 37℃에서 1.5시간 동안 반응시킨 후 RNase A를 첨가하고 동일온도에서 1시간 동안 추가 반응시켰다. 절단된 표적 DNA는 MG PCR purification SV kit (MGmed)를 사용하여 정제하였고, 아가로스 겔 전기영동을 통해 분석하였다.

4. Targeted deep sequencing

InDel 빈도 및 패턴은 targeted deep sequencing으로 분석하였다(Kim H, et al., 2017). 준비된 고추 게노믹 DNA를 표 3의 프라이머를 이용하여 증폭시킨 후, 표적 앰플리콘에 multiplexing indices를 부착시키고 PCR을 통해 특이적 시퀀싱 어댑터를 결합시킨 후 Illumina Miseq (V2, 300 cycles)를 사용하여 고성능 시퀀싱을 수행하였다. paired-end Miseq 원시 결과를 Cas-Analyzer (http://www.rgenome.net/cas-analyzer/#!)를 이용하여 분석하였다(Park J, et al., Bioinformatics. (2017) 33:286-8).

Targeted deep sequencing에 사용된 프라이머

Primers	서열 (5'→3')
CaMLO2 F	ATGGCTAAAGAACGGTCGAT (서열번호 17)
CaMLO2 R	ATGGAGCTGGTGTATTGCAT (서열번호 18)
Primary F for sgRNA1, sgRNA2, crRNA2	TGGGATTCATATCATTGTTGTTG (서열번호 19)
Primary R for sgRNA1, sgRNA2, crRNA2	CCGAATGTGTCTCAGCCTTT (서열번호 20)
Primary F for crRNA1	ATGGCTAAAGAACGGTCGAT (서열번호 21)
Primary R for crRNA1	GGCACTAAGGTTGGCTACTT (서열번호 22)
Secondary F for sgRNA1, sgRNA2, crRNA2	ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGGGATTCATATCATTGTTGTTG (서열번호 23)
Secondary R for sgRNA1, sgRNA2, crRNA2	ACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCGAATGTGTCTCAGCCTTT (서열번호 24)
Secondary F for crRNA1	ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATGGCTAAAGAACGGTCGAT (서열번호 25)
Secondary R for crRNA1	GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCACTAAGGTTGGCTACTT (서열번호 26)
Cas9-sgRNA1, Cas9-sgRNA2, LbCpf1-crRNA1, 또는 LbCpf1-crRNA2의 복합체에 의해 편집된 CaMLO2의 표적 영역은 3번의 연속적인 PCR에 의해 증폭되었다. 먼저, CaMLO2의 게놈 영역은 CaMLO2 F 및 CaMLO2 R의 프라이머 쌍으로 증폭되었다. 첫번째 PCR 앰플리콘은 primary ary F 및 R의 프라이머쌍을 이용한 primary PCR에 이용되었다. 두번째 PCR 앰플리콘은 secondary F 및 R의 프라이머쌍을 이용하여 Illumina 어댑터를 첨가함으로써 적용되었다. 마지막 앰플리콘은 Illumina Miseq을 이용한 NGS 분석에 대한 바코딩에 적용되었다.

5. 통계분석

모든 결과는 최소 3회 반복 수행의 평균값으로 표시하였으며, 표준편차를 함께 나타냈다. 유의성 수준(*, p<0.01)은 post-hoc Tukey HSD를 사용한 one-way ANOVA로 평가하였다.

실시예 1. 고추 원형질체에서 PEG-매개 CRISPR-RNP 전달

CRISPR-RNP가 CM334와 Dempsey의 원형질체에 전달될 수 있는지 여부를 평가하기 위해 토양에서 재배되는 두 개의 고추 재배 품종에서 원형질체를 분리하였다(도 1a 및 1b). Dempsey 잎 원형질체는 CRISPR-RNPs 적용에 충분할만큼 안정적이었으나, CM334의 분리된 잎 원형질체는 불안정하고, CRISPR-RNPs 전달 후 수득에 어려움이 있었다. 이전의 연구를 통해, 본 발명자는 토양에서 재배된 CM334와 Dempsey로부터 잎 유래 캘러스를 확립하였고, 이에 캘러스 유래 고추 원형질체를 유전자 교정 툴의 동정을 위한 플랫폼으로서 사용하기로 하였다(도 1c 및 1d).

실시예 2. Cas9 및 LbCpf1에 대한 고안된 CRISPR RNPs의 in vitro 검증

CM334와 Dempsey의 CaMLO2 게노믹 부위는 보존된(conserved) 엑손 서열을 확인하기 위해 생거 염기서열법으로부터 분석되었다. 그 후, Cas9 또는 LbCpf1에 대한 가이드 RNA를 디자인하였다(표 1 및 도 2a). 본 발명자는 RGEN 도구의 Cas-Designer를 사용하여 현재의 고추 참조 게놈에 대한 전체 유사성 검색을 바탕으로 최대 2개의 뉴클레오티드까지 불일치가 없는 특이성이 높은 가이드 RNA를 선택하였다. In vitro cleavage assay를 수행하여 두 개의 고추 품종에서 각각 재조합 Cas9 및 LbCpf1 단백질 단독 대비 Cas9-sgrRNA와 LbCpf1-crRNA의 CRISPR-RNP 복합체의 활성을 검증했다. CaMLO2의 표적 단편은 표 3에 표시된 프라이머 세트로 증폭하였다. Cas9-RNP와 LbCpf1-RNP는 예상대로 CM334와 Dempsey 모두에서 CaMLO2의 표적 부위를 효율적으로 분해하였다(도 2c와 d).

실시예 3. Dempsey 잎 원형질체에서 CRISPR/Cas9-RNP의 분석

CM334 및 Dempsey 잎에서 분리된 원형질체로 PEG 매개 CRISPR/Cas9 RNP 전달을 조사하였다. 먼저, 본 발명자는 고추 원형질체가 GFP:NLS 발현 카세트를 포함하는 기존의 플라스미드로 일시적으로 형질전환 여부를 테스트하였다. Dempsey 잎 원형질체를 형질전환 24시간 후 핵에서 GFP 형광 신호가 확인되었으나(도 3a), CM334 잎 원형질체에서는 형질도입된 플라스미드 또는 CRISPR/Cas9 RNP를 발현할 수 있을 정도로 안정적이지 않음을 알 수 있었다. 또한, Dempsey 잎 원형질체는 성공적으로 형질전환되어 GFP 플라스미드 또는 후속 유전자형 분석이 검출될 때까지 유지되는 것을 관찰할 수 있었다. CRISPR/Cas9-RNP을 형질도입한 Dempsey 잎 원형질체를 24시간 및 48시간 후에 수확하였고(도 3b), 이를 게노믹 DNA를 추출하고 CaMLO2의 표적 부위 Indel 빈도와 패턴을 분석하기 위한 targeted deep sequencing 수행에 사용하였다. CaMLO2에서 CRISPR/Cas9-RNP를 사용한 24시간 후의 InDel은 sgRNA1의 경우 1.23%, sgRNA2의 경우 0.02%의 빈도로 대상 위치에서 거의 확인되지 않았다(도 3b). 48시간 후에는 InDel 빈도가 현저하게 증가하여 sgRNA1의 경우 11.3%, sgRNA2의 경우 0.5%로 확인되었다. InDel의 대부분은 Cas9-sgRNA1을 사용한 CaMLO2에서 유도되었으며, PAM 서열의 3bp 상류의 위치에서 다수의 염기 결실이 나타났다(도 3c). 이러한 결과는 sgRNA2보다 sgRNA1을 포함하는 CRISPR/Cas9-RNP 복합체가 CaMLO2 교정에 보다 효과적인 것을 나타냈다.

실시예 4. CM334 캘러스 유래 원형질체에서 CRISPR/Cas9-RNP의 분석

CM334 캘러스 유래 원형질체에 GFP:NLS 발현 카세트를 포함하는 플라스미드를 형질전환하였다. 형질전환한 CM334 원형질체는 48시간 후에 핵에서 GFP 형광 신호가 뚜렸하게 확인되었다(도 4a). CM334 원형질체에 sgRNA1 또는 sgRNA2를 포함하는 CRISPR/Cas9-RNP 복합체를 도입시키고 48시간 동안 반응시켰다. 그 후 InDel 효율을 분석한 결과, 표적 위치에서 Cas9-sgRNA1 복합체에 의해 17.6%의 InDel 변이가 확인되었고, Cas9-sgRNA2 복합체에 의해서는 약 0.2%의 InDel 변이가 확인되었다(도 4b). Cas9-sgRNA1 복합체는 주로 다수의 염기 결실을 유도하는 것으로 나타났다(도 4c). 이상의 결과는 Dempsey에서와 같이 CM334에서도 sgRNA2보다 sgRNA1가 CaMLO2 교정에 보다 효과적인 것임을 의미하였다.

실시예 5. Dempsey 잎 원형질체에서 CRISPR/LbCpf1-RNP의 분석

본 발명자는 Dempsey 잎에서 분리된 원형질체로 LbCpf1-RNP의 활성을 분석하였다. 먼저, LbCpf1-crRNA1, LbCpf1-crRNA2, LbCpf1-crRNA3 및 LbCpf1-crRNA4가 형질도입된 원형질체의 InDel 효율을 분석한 결과, LbCpf1-crRNA1은 0.54%, LbCpf1-crRNA2는 0.61%, LbCpf1-crRNA3 및 LbCpf1-crRNA4는 각각 0.08% 및 0.07%로 확인되었다(도 5a). InDel 효율이 우수하였던 LbCpf1-crRNA1 및 LbCpf1-crRNA2 표적 부위의 InDel 패턴은 다수의 염기 결실 변이로 확인되었다(도 5b).

실시예 6. CM334 캘러스 원형질체에서 CRISPR/LbCpf1-RNP의 분석

본 발명자는 CM334의 캘러스 유래 원형질체에서 LbCpf1-RNP의 활성을 분석하였다. Dempsey에서 활성이 높았던 LbCpf1-crRNA1 및 LbCpf1-crRNA2는 PEG를 매개하여 원형질체로 효과적으로 전달되었으며, 형질전환된 캘러스 유래 원형질체는 잎 유래 원형질체와 달리 InDel 변이를 평가할 수 있을 정도로 안정적이었다. LbCpf1-crRNA 복합체를 이용한 형질전환 원형질체에서 InDel 효율을 분석한 결과, LbCpf1-crRNA1은 9.9%, LbCpf1-crRNA2는 19.3%로 확인되었다(도 6a). LbCpf1-crRNA1 표적 부위의 InDel 패턴은 다양하게 확인되었는데, 다수의 염기 결실(-6, -5, 및 -10)이 관찰되었다(도 6b). LbCpf1-crRNA2의 표적 부위 또한 다수의 염기 결실(-7, -6, -4, -12, 및 -2) 변이가 관찰되었다.

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> Method for producing genome-edited pepper plant with controlled disease resistance by CaMLO2 gene editing and genome-edited pepper plant with controlled disease resistance produced by the same method <130> PN21154 <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12803 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Capsicum annuum <400> 1 tcttttatct tcaatttcat aactaactat acaatcattg tgtaaaggaa tagcttatac 60 ttttatcttc aattgtgtaa agaaagaaac aacaaaatca tttttgttct tctcaaggaa 120 aattctctat cagaattaat tgatggctaa agaacggtcg atggaggcaa cccctacgtg 180 ggcggttgcc gtggtttgct tcatcttgct ggctatttcc atttttattg aacaaattat 240 gcatcacctt ggagaggtat atcgtttttt tttttgtttt tgggttgttg tgtgaaaatc 300 aaaattagct acttcacgat gtaattgcta cataagagta tcgtggaaca ttttaccgtt 360 aattgttgag aaaatactct attttcacgc gaaaaggcta aaataagtag ccaaccttag 420 tgcctacttg acacatacat ggcacaaggt tgtaaaaaat atgattttaa ttagtttaga 480 acctcttaat tgtttctgtc tttagttctc tgaatatgct tactaagtga 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gtctttcttt tttagactaa cataaaataa aagtgagtca tataaattag aacataaaaa 7320 ttactacata atattgctaa aagattgcaa cttaggaatt tcataataat ttttgttttg 7380 ttacagaatg cgtttcaagt tgctttcttt gtttggagtt gggtaaggag tcggattttc 7440 atttgaattt aagttttgtg catcgttagt gtataaaata ttctacacta ttaggtaaac 7500 ttgacttgct attccagata gcaggtcaag ttaactgata gtatagaata ttttgtgcac 7560 tgatgataca tagaacttaa actcttttca ttttccttta tttatttttt tcctttcgga 7620 gtgaaatttg aatatattgt cctttaactt tttccccttt aattttccag tggaaatttg 7680 gttttccatc ctgctttcat agaaatgctg cagacctagc cattaggcta accatggggt 7740 gagttttaat tggaaaagca tagtttagat tgccatatct atatatgata ttagttataa 7800 gtggccctaa attcggacgc aaactctaaa tttaaaaata ataatatttt aattaaaaag 7860 tttaatttat attatatttt ttattgtatt gttaataaaa cttaatgaca cgttaaatat 7920 gaattgttga taaattttta ttattagtaa attttgtcaa aaatttatta tgaaaaaaaa 7980 tacaaagagt aatctaattg attttctatc tgtagttatg atatttttag ttttaacaca 8040 ctacttaaaa tattattttc tgctataaaa taaaaaatga actgaacttc attgtcttaa 8100 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10620 tgcaaaggcc aagtggcaag aaagaaaatg tgaggaaaaa aagaaattta tcaactatat 10680 atcataattt tagaggaaaa aaagtaattt tagcaacaac atgtcacaat tttagaggga 10740 aaaaataatt taatatacta catatcacaa ttttaaagga aaaaataatt tatcaaccac 10800 aagtaacaat ttagaggatt taaaaaaaat aaaaattatc aaaataccat tatgaggact 10860 accaaatttt acatgtacag tattgatttt ttaaagatta ttttaattat tagaggataa 10920 ataaacatgc tagacatttt tttcccgaaa tttttttaaa ttttatcatc gaataagtat 10980 tgtcaaaatt atgtacatat aatgttattg caagattcat tcataaattc atgaaataca 11040 agtaatttaa tcgataaaat gaaatattaa atattttact tatacttctc aatggactta 11100 attaaataat atttaattta tctcaaagaa aatattataa tgaaactagt aagagaattt 11160 atcaattatt tcaacaatta aaactacaat ggcaaactca gtaaataaaa tagtttatca 11220 tattatttat accaagtgca aaggccaagt ggcaagagag aaaatgtgtg aaaaaagtaa 11280 ttttatcaat tacatatcac aattttaaag gaaaaaagta attttatcaa caaaatattg 11340 caattttaga ggggagaaag taatattatc aacttcatgt caattttaga gggaaaaaat 11400 aatttaccaa ccacatgtaa caattttaga gaattaaaat aaaataaaat gaccataatg 11460 ccattttgga gattatcaaa ttttaatatc ctctcttatg taagtgtaat aatatgctca 11520 caaattttga catatactct tccatctcat agggttcagg aaggatagtt aatgaatgcc 11580 cattttcctt ttataaaaca tgattttcta aaatatatgt tataataatt ggtcaatata 11640 tataatatat atatatatat atatatatat atatatatat ataaacacga ttttagaaaa 11700 tatatataat aagaaattaa agctttcctt ccacaagatg catatttttg tattgatgat 11760 ttcaattctt gtttcagagt aatcatacaa gtccattgca gctatgtaac tctccctcta 11820 tatgccttag ttactcaggt acttgatatt ttcttattga gaatattata caaattaata 11880 agcatgatta ctaatgtaga attgctatcg gttctaagcc gggggtctat cgaaaacaac 11940 ctctctactt catctgaggt agtggtatgg tctgcgtaca ctctaccctc tccagaccct 12000 actatgtggg aatacactgt atatgttgtt gttgagggat tactaatgta gagaaatttg 12060 tagatgggtt catcaatgaa gcctatcatc tttggtgata atgtggcaac agctcttaga 12120 agctggcaca atacagcgaa aaagcgggtg agacatgggc gggtatcaga aaacaccact 12180 ccgatatcta gcagaccggc cacaccattg cgtggtacct ccccagttca cttgctacgt 12240 ggctacccaa aatataacga ggacaatgtt caagcatatc ctcgaacatc gaatgtagaa 12300 aatgaaggct gggctaatga aacatccact gagaataaag atcatcagga ggagggacaa 12360 atcctgcagc atgcctccac ttctatgcaa catccgcata ctgatcaaca tcaaattgag 12420 attgcaatgt cagattttac ttttggaaac aaatagatca attgatcatc tagtctccat 12480 atgttaaaac ttccatcttc attgttttct ttgtctcgag ttcattactg tagagaatac 12540 catcttcatt gtttcctttg tttcgagttc tttactgtag agaatatatg tatatgtgtg 12600 tgtatatata tatatatatt tatatatatg tatgtatgta tgtatagata cacaatcaca 12660 taggattggc ctataattat gtaatccacg ttctatcata aggatagaat gtttaggcat 12720 gtatgcctaa cttataacct ataatcttac aatacaagtt ccattctaag aaggatagta 12780 tatagatata tatatatatg caa 12803 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA1 <400> 2 catcttcatc tgccttaca 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA2 <400> 3 tgatgaccct tgtttacaaa 20 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA3 <400> 4 ttgaacaaat tatgcatcac ctt 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA4 <400> 5 gggacacata agttagaaac tgg 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA5 <400> 6 ttcaataaaa atggaaatag cca 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA6 <400> 7 taaacaaggg tcatcatact cag 23 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA1-1 <400> 8 acatcttcat ctgccttaca 20 <210> 9 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gaaattaata cgactcacta tagcatcttc atctgcctta cagttttaga gctagaaata 60 gcaag 65 <210> 10 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gaaattaata cgactcacta taggatgacc cttgtttaca aagttttaga gctagaaata 60 gcaag 65 <210> 11 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 aaaaaagcac cgactcggtg ccactttttc aagttgataa cggactagcc ttattttaac 60 ttgctatttc tagctctaaa ac 82 <210> 12 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 aaggtgatgc ataatttgtt caaatctaca cttagtagaa att 43 <210> 13 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ccagtttcta acttatgtgt cccatctaca cttagtagaa att 43 <210> 14 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tggctatttc catttttatt gaaatctaca cttagtagaa att 43 <210> 15 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ctgagtatga tgacccttgt ttaatctaca cttagtagaa att 43 <210> 16 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gaaattaata cgactcacta tagggaattt ctactaagtg tagat 45 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 atggctaaag aacggtcgat 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 atggagctgg tgtattgcat 20 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 tgggattcat atcattgttg ttg 23 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ccgaatgtgt ctcagccttt 20 <210> 21 <211> 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Claims

고추 유래 CaMLO2 (Capsicum annuum Mildew Locus O 2) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)와 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질의 복합체(ribonucleoprotein); 또는 고추 유래 CaMLO2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터;를 유효성분으로 함유하는, 고추 식물체의 병 저항성을 조절하기 위한 유전체 교정용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 CaMLO2 유전자의 표적 염기서열은 서열번호 2, 서열번호 8, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 단백질은 Cas9 또는 Cpf1 단백질인 것을 특징으로 하는 조성물.
(a) 고추 유래 CaMLO2 (Capsicum annuum Mildew Locus O 2) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 고추 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및
(b) 상기 유전체가 교정된 고추 식물세포로부터 고추 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 병 저항성이 조절된 유전체 교정 고추 식물체의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 (a) 단계의 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 고추 식물세포에 도입하는 것은, 고추 유래 CaMLO2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein); 또는 고추 유래 CaMLO2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터;를 이용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 CaMLO2 유전자의 표적 염기서열은 서열번호 2, 서열번호 8, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 식물세포는 원형질체인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 병은 흰가루병, 역병, 시들음병, 무름병 및 풋마름병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제4항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 병 저항성이 조절된 유전체 교정 고추 식물체.
제9항에 따른 식물체의 유전체가 교정된 종자.