KR102035654B1

KR102035654B1 - 항균 펩타이드를 생산하는 돌연변이 곤충 세포주 또는 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102035654B1
Application number: KR1020180085151A
Authority: KR
Inventors: 김성렬; 최광호; 권해용; 김성완; 박종우; 유정희
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2018-07-23
Filing date: 2018-07-23
Publication date: 2019-10-24

Abstract

본 발명은 항균 펩타이드를 생산하는 돌연변이 곤충 세포주 또는 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 가이드 RNA와 Cas9 단백질을 이용한 유전자 편집 기술을 통해 Bm 5 누에 난소 세포주의 칵투스(Cactus) 유전자를 잘라내어, 라이소자임(lysozyme), 모리신(moricin), 레보신 1(lebocin 1) 등의 항균펩타이드의 과발현을 유도함으로써 재조합 단백질 등과는 다른 천연 상태의 항균펩타이드를 대량생산할 수 있는 방법을 제공한다.

Description

항균 펩타이드를 생산하는 돌연변이 곤충 세포주 또는 이의 제조방법 {Novel mutant insect cell line producing antimicrobial peptide or a preparation method thereof}

본 발명은 항균 펩타이드를 생산하는 돌연변이 곤충 세포주 또는 이의 제조방법에 관한 것이다.

유전자 편집 기술은 미생물의 적응면역에서 비롯된 기술이다. 박테리오파지 감염에 박테리오파지의 단편을 DNA로 기억하고 있다가 재감염 되었을 때 유전자 가위 역할을 하는 누클레아제(nuclease)인 Cas9(CRISPR associated protein 9 : RNA-guided DNA endonuclease enzyme)으로 잘라 없애는 면역 시스템에서 시작되었다.

이는 유전체에서도 특정 염기 서열을 가이드 RNA(guide RNA, gRNA)에 의해서 인식 가능하면 원하는 부위를 잘라 고칠 수 있는 유전자 교정 기술로 발전하였고(Woo JW et al., 2015), 불치병으로 분리되었던 유전자 이상으로 유도된 질환에서 질병의 근본원인을 치료할 수 있는 방법 또는 영구적인 유전자 돌연변이를 일으키는 형질전환 세포 또는 동물을 제조하는 방법으로 각광받고 있다.

본 발명자들은 형질전환 및 면역반응 없이 유전자 편집을 통한 돌연변이 곤충세포로부터 항균물질을 생산할 수 있는 방법에 대해 연구하던 중 칵투스(Cactus) 유전자의 돌연변이로 인해 라이소자임(lysozyme), 모리신(moricin), 레보신 1(lebocin 1) 등의 항균펩타이드가 과발현함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제10-2015-0096064호 (발명의 명칭 : ＭＤＣＫ Ⅱ 세포의 크로모좀에서 ＡＡＶＳ1 위치를 인식하고 이곳에 외래 유전자를 도입하여 안정하게 발현시키는 방법, 출원인 : 서울대학교산학협력단, 공개일 : 2015년08월24일) 대한민국 공개특허 제10-2001-0074351호 (발명의 명칭 : 곤충 세포주 형질전환용 발현벡터 및 이를 함유한 항세균단백질 생산용 형질전환체, 출원인 : 대한민국, 공개일 : 2001년08월04일)

PLOS ONE, 2014, 9(7), e101210. Heritable Genome Editing with CRISPR/Cas9 in the Silkworm, Bombyx mori., PLOS ONE, 2014, 9(7), e101210.

본 발명의 목적은 항균 펩타이드를 생산하는 돌연변이 곤충 세포주 또는 이의 제조방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 칵투스(Cactus) 유전자의 돌연변이로 인해 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현이 억제된 것을 특징으로 하는 돌연변이 곤충 세포주에 관한 것이다.

상기 곤충 세포주는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 가이드 RNA와 Cas9 단백질을 삽입하여 얻은 것을 특징으로 한다.

서열번호 2 : CUCACUUUAGGUAAUGCCUA

상기 곤충 세포주는 라이소자임(lysozyme), 모리신(moricin) 및 레보신 1(lebocin 1)으로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택되는 항균 펩타이드가 과발현될 수 있다. 즉, 칵투스 유전자가 돌연변이를 일으키기 이전인 야생형 상태(wild type)와 비교하여 이들 항균 펩타이드의 발현이 증강될 수 있다.

상기 돌연변이 곤충 세포주는 누에 난소 세포주일 수 있다.

상기 누에 난소 세포주는 Bm 5 또는 BM-N 세포일 수 있다.

이에, 본 발명은 또한 서열번호 2의 가이드 RNA와 Cas9 단백질을 돌연변이 곤충 세포주에 삽입하여 칵투스(Cactus) 유전자가 손상된 돌연변이 곤충 세포주를 제조하는 방법에 관한 것일 수 있다.

서열번호 2의 가이드 RNA와 Cas9 단백질의 삽입은 200~350V에서 12~20ms 동안 전기천공법을 실시하여 수행될 수 있다. 보다 더 바람직하게는 250~350V에서 12~17ms 동안 전기천공법을 실시하여 수행될 수 있다. 가장 바람직하게는 300V에서 15ms 동안 전기청공법을 수행할 수 있다.

상기 전기청공법은 곤충 세포주를 수크로오즈 완충액에 넣어 수행되는 것이 바람직하다.

상기 수크로오즈 완충액은 200~300 mM의 수크로오즈가 포함된 5~20 mM HEPES(N-2-hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethanesulfonic acid) 완충액(pH 7.0~7.5)일 수 있다.

상기 가이드 RNA와 Cas9 단백질은 1:1 내지 1:2의 중량비로 혼합되어 곤충 세포주에 삽입될 수 있다.

선행기술로서 대한민국 공개특허 제10-2015-0096064호에 Cas9/가이드 RNA를 통한 유전자 변형 방법이 개시되어 있으나 이는 포유동물 세포에서 수행된 것일 뿐이며, Wei Wei et al.의 문헌에는 누에에서의 Cas9/가이드 RNA를 통한 유전자 돌연변이 유발 방법을 제시하기는 하지만, 이 문헌에서는 억제대상 타겟 유전자로서 Bm-ok, BmKMO, BmTH 및 Bmtan의 네 가지 유전자좌를 후보로 선택하고 있어, Cactus 유전자를 억제하는 것을 통해 누에 세포 자체에서 발현되는 다양한 항균 펩타이드의 발현 증가를 유도하는 기술은 아직 확인되지 않고 있다.

도 1은 돌연변이에 의한 누에의 체액성 면역반응 활성화 경로 변화를 나타내는 모식도이다.
도 2는 Bm 5세포의 Cactus 유전자 서열을 나타내는 그림이다.
도 3은 가이드 RNA의 Cactus 유전자 내 결합위치를 나타내는 그림이다.
도 4는 합성된 가이드 RNA(gRNA)의 DNA 주형(도 4A) 및 시험관에서 전사된 가이드 RNA(도 4B)를 나타내는 겔-전기영동 결과 사진이다.
도 5는 Cactus 기질 유전자가 삽입된 pGEM-T easy vector 플라스미드의 구조를 나타내는 그림(도 5A), 가이드 RNA 종류에 따른 DNA 절단효율을 나타내는 겔-전기영동 결과 사진(도 5B) 및 이를 수치화하여 나타낸 그래프(도 5C)를 나타낸다.
도 6은 Electroporation pulse에 따른 Bm 5 세포의 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 7은 Electroporation pulse에 따른 F10 가이드 RNA의 돌연변이 효율을 확인하기 위한 겔-전기영동 결과 사진(도 7A) 및 이를 수치화하여 나타낸 그래프(도 7B)이다.
도 8은 완충액의 종류(도 8A) 및 Cas 9/gRNA 혼합비(도 8B)에 따른 돌연변이 유발효율을 나타낸 그래프이다.
도 9는 Cactus 돌연변이가 유발된 Bm 5세포를 확인하기 위해 T7 endonuclease I 효소를 처리하여 이형 DNA 분자의 절단 양상을 확인한 겔-전기영동 결과 사진(도 9A) 및 상기 결과를 통해 돌연변이 유발된 세포의 염기서열을 분석한 결과를 나타내는 그림이다(도 9B).
도 10은 Cactus 돌연변이 Bm 5세포에서의 Cactus, Lysozyme, Moricin, Lebocin1에 대한 유전자 발현을 RT-PCR로 확인한 겔-전기영동 결과 사진(도 10A) 및 Real-time PCR 결과를 나타내는 그래프이다(도 10B).
도 11은 Cactus 돌연변이 Bm 5 세포의 lysozyme 활성을 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 돌연변이 유발표적 선정 및 가이드 RNA 제조>

실시예 1-1. 표적선정

누에의 체액성 면역반응 경로에 따르면 그람양성균 및 곰팡이의 감염에 따라 Myd 88 신호전달 경로가 활성화되어 전사인자(Dorsal)의 억제인자(Cactus)의 분해가 유발되어 Dorsal이 활성화되고 핵 내부에서 항균펩타이드의 발현이 촉진된다(도 1).

따라서 Cactus에 돌연변이가 유발되어 기능 이상이 발생하면, 외부의 자극이 없이도 Dorsal의 자동적인 활성화가 가능할 것으로 판단되어 Cactus 유전자를 본 발명에서 타겟 유전자로 선정하였다.

실시예 1-2. 표적(Cactus) 유전자 염기서열분석

Bm 5 세포에서 돌연변이 유발 표적인 Cactus(Protein ID: NP 001166191.1)의 서열을 확인하고자, NCBI에 등록된 Bombyx mori strain p50T (Dazao)의 전체유전자 서열(NW_004581774.1) 및 Cactus의 mRNA 서열(NM_001172720.1)을 바탕으로 Cactus F : 5'-TGTCAAAACATGGTTCCGTGTTC-3' 및 Cactus R 5'-CGTAAGTGGAAATTCCGAGTTTGTA-3' 서열을 가지는 PCR primer를 제작 후 누에 난소 세포주인 Bm 5 세포의 genomic DNA를 주형으로 PCR을 수행하였다. PCR을 통해 얻어진 3.3 kb의 DNA를 pGEM-T easy 벡터(Promega, Cat.No. A137A)에 클로닝 후, 벡터에 존재하는 한 쌍의 universal primer 서열을 이용하여 1차로 서열 분석하고, primer working을 통하여 3.3 kb의 유전자 서열을 분석하였다. 서열분석결과 Bm 5의 유전자 서열 중 NCBI에 등록된 Cactus 유전자의 Dazao의 염기서열(Gene ID: 100379185)과 99.62%의 유사성을 나타내었다(도 2).

실시예 1-3. 가이드 RNA 좌위 결정

Cactus 유전자 편집을 위한 및 가이드 RNA(gRNA)를 제작하고자, 동정된 Bm 5 세포의 Cactus 염기서열 중 exon 1과 exon 2의 염기서열에 존재하는 PAM 서열(NGG) 및 누에 전체유전자를 대상으로 PAM 서열에 인접한 20, 12, 및 8개의 염기에 대한 off-target 가능성을 CRISPRdirect Tool(http://crispr.dbcls.jp)을 이용하여 분석하였다. *PAM(protospacer adjacent motif : Cas9 단백질이 PAM 부위를 자르게 됨으로써, 잘려진 DNA가 스스로 회복(repair)되는 과정 중에 DNA 염기서열에 돌연변이가 일어남).

그 결과 exon 부위에서 특이성이 높은 목표부위 6종(F3, F10, F13, R4, R10, 및 R13)을 선발하였다(표 1). 각 가이드 RNA의 유전자 내 표적부위는 도 3과 같다.

Cactus 유전자의 가이드 RNA 표적 부위 및 게놈 내 off-target 가능성 분석

Locus	No	Target sequence (N₂₀NGG)	GC (%)	Possibility of off-target recognition
Locus	No	Target sequence (N₂₀NGG)	GC (%)	hit_20	hit_12	hit_8
Exon 1	F2	GAGGACGAGTACGCTGATTCCGG	55	1	1	219
	F10	GAGTGAAATCCATTACGGATAGG	40	1	1	509
	F13	TCTACTGTTCCAACAGGACGAGG	500	1	1	222
Exon 2	R4	CCTCATCAGGGTGTGCCCTGAGA	600	1	1	182
	R10	CCACTGCATCTAGCGGTGATGAG	550	1	1	251
	R13	CCTCGGAGAGACTCCGCTACACA	600	1	1	197

실시예 1-4. 가이드 RNA 합성

선발된 6종의 가이드 RNA를 합성하고자, 표 2의 primer를 제작하였다. 가이드 RNA의 합성은 DNA 중합효소와 각 가이드 RNA에 해당하는 한 쌍의 primer와 universal primer와 dNTP's를 혼합하여 PCR을 수행하였다. 얻어진 PCR 산물에 NTP's와 T7 RNA 중합효소를 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 반응하여 가이드 RNA를 합성한 후, DNase I을 처리하여 주형으로 사용된 DNA를 제거하고,　RNA 정제 컬럼을 이용하여 순수한 가이드 RNA만을 정제하였다. 정제된 가이드 RNA는 2% formaldehyde-agarose 겔에 전기 영동하여 농도 및 순도를 확인하였다(도 4). 표 1의 타겟 DNA와 결합하는 가이드 RNA의 서열(표 3)을 이용하여 합성된, 실제 Cas9 단백질에 복합체를 형성할 수 있는 6종 가이드 RNA의 서열은 표 4와 같다. 각 가이드 RNA는 표적 서열에 상보적인 20개의 뉴클레오티드; 및, Cas 9 단백질과 결합하기 위한 헤어핀 구조를 이루는 72개의 뉴클레오티드인 스캐폴드 염기서열(scaffold sequence);로 구성되어 있다. 이 스캐폴드 염기서열은 Cas9과 결합가능한 다른 서열로 대체 가능하다. 표 4의 밑줄친 부분이 타겟 유전자에 결합하는 서열이다. 표 3과 표 4의 타겟 유전자는 표 1에 개시된 것과 동일하다.

가이드 RNA 합성을 위한 primer 제작

가이드 RNA	Forward (5' to 3')	Reverse (5' to 3')
F2	TAATACGACTCACTATAGGAGGACGAGTACGCTGAT	TTCTAGCTCTAAAACGAATCAGCGTACTCGTCCTC
F10	TAATACGACTCACTATAGGAGTGAAATCCATTACGG	TTCTAGCTCTAAAACATCCGTAATGGATTTCACTC
F13	TAATACGACTCACTATAGTCTACTGTTCCAACAGGA	TTCTAGCTCTAAAACCGTCCTGTTGGAACAGTAGA
R4	TAATACGACTCACTATAGTCTCAGGGCACACCCTGA	TTCTAGCTCTAAAACCATCAGGGTGTGCCCTGAGA
R10	TAATACGACTCACTATAGCTCATCACCGCTAGATGC	TTCTAGCTCTAAAACCTGCATCTAGCGGTGATGAG
R13	TAATACGACTCACTATAGTGTGTAGCGGAGTCTCTC	TTCTAGCTCTAAAACCGGAGAGACTCCGCTACACA
Universal	TAATACGACTCACTATAG	GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTT

타겟 유전자에 대한 가이드 RNA 서열

서열번호	타겟 유전자	타겟 유전자에 대한 가이드 RNA 서열 (5' to 3')
서열번호 1	F2	CUCCUGCUCAUGCGACUAAG
서열번호 2	F10	CUCACUUUAGGUAAUGCCUA
서열번호 3	F13	AGAUGACAAGGUUGUCCUGC
서열번호 4	R4	AGAGUCCCGUGUGGGACUAC
서열번호 5	R10	GAGUAGUGGCGAUCUACGUC
서열번호 6	R13	ACACAUCGCCUCAGAGAGGC

Cas9 복합체 제조용으로 제작된 가이드 RNA 서열

서열번호	타겟 유전자	가이드 RNA 서열 (5' to 3')
서열번호 7	F2	CUCCUGCUCAUGCGACUAAGGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCGAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCUUUU
서열번호 8	F10	CUCACUUUAGGUAAUGCCUAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCGAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCUUUU
서열번호 9	F13	AGAUGACAAGGUUGUCCUGCGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCGAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCUUUU
서열번호 10	R4	AGAGUCCCGUGUGGGACUACGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCGAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCUUUU
서열번호 11	R10	GAGUAGUGGCGAUCUACGUCGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCGAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCUUUU
서열번호 12	R13	ACACAUCGCCUCAGAGAGGCGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCGAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCUUUU

실시예 1-5. 가이드 RNA의 활성분석

합성된 가이드 RNA의 작동 여부를 확인하고자, 각각 750 ng의 가이드 RNA와 250 ng Cas9 nucease(Invitrogen, Cat. No. B25640)의 혼합액을 25℃에서 10분간 반응시켜 복합체를 형성시킨 후, 실시예 2-1에서 사용하였던 Cactus 유전자 서열이 삽입된 pGEM-T easy vector 플라스미드 400 ng과 37℃에서 1시간 동안 반응시키고, 1% 한천 겔에 전기 영동하여 절단효율을 분석하였다. 그 결과 F10 gRNA의 절단효율이 약 60%로 가장 높게 나타났다(도 5)(이후 실험은 F10 서열 사용).

<실시예 2. 돌연변이 유발 조건 확립>

실시예 2-1. Cas9/gRNA 복합체 전달을 위한 electroporation 조건 확립

Bm 5 세포를 10% FBS(Gemini, Cat. No. 100-500)가 첨가된 TNM-FH 배지(Welgene, Cat. No. LM 506-01)를 이용하여 27℃에서 배양 용기의 70~80% 밀도까지 배양하고, 배양된 세포는 원심분리를 통하여 수집 후 Electroporation 완충액(Bio-rad, Cat. No. 165-2677)을 이용하여 5x10⁵ cell/㎖의 세포액을 준비하였다. 이 실험에 사용된 Bm 5 세포 또는 이 세포와 유사한 특성을 갖는 다른 곤충 세포인 BM-N 세포는 부착성 및 부유성을 모두 갖는 세포이지만, 부착성이 보다 강한 특성이 있다.

Electroporation의 전기충격에 의한 세포 생존율 분석은 Gene Pulser Xcell System (Bio-rad)과 0.4 큐벳(Bi0-rad, Cat. No. 165-2088)을 이용하여 400 ㎕의 세포액(2x10⁵ 세포)에 시험관에서 생성된 Cas9/gRNA (2.5 ㎍/ 2.5 ㎍) 복합체를 혼합 후, 100, 200, 및 300 V에서 5, 10, 15, 및 20 ms 동안의 전기충격을 가하였다. 각 반응에서 20 ㎕의 세포액(1x10⁴ 세포)을 96 well 플레이트에 옮긴 후, 10% FBS를 첨가한 TMN-FH 배지 80 ㎕와 50 ㎕의 XTT 용액(Applichem, Cat. No. A8088)을 첨가하고 27℃에서 24시간 동안 배양하며, 분광광도계를 이용하여 450 nm와 690 nm 흡광도의 차이를 측정하고, 전기충격을 가하지 않은 Bm 5 세포에 대한 백분율로 생존율을 분석하였다. 일반적으로 전기충격에서 물질전달 효율이 최대로 나타나는 세포 생존율은 20~50%이며, 분석 결과 Bm 5 세포의 생존율은 200V에서 20 ms와 300V에서 15 ms에서 약 50% 가량의 생존율을 나타내었다(도 6).

실시예 2-2. Cas9/gRNA에 의한 돌연변이 유발조건 최적화

실시예 2-1과 동일한 방법으로 배양된 Bm 5 세포를 수집 후 Bio-rad사의 Electroporation 완충액 0.4㎖을 처리하여 sing cell 상태가 된 2.5x10⁶ cell/ml의 세포액을 준비하고, 1x10⁶ 세포와 시험관에서 생성된 Cas9/gRNA (2.5 ㎍/ 2.5 ㎍) 복합체를 혼합 후, 50% 이하의 생존율이 나타나는 200V-20 ms와 300V-15 ms의 강도로 전기충격을 가하여 Cas9/gRNA 복합체의 도입을 유도하였다.

이후 Electroporation에 의하여 Cas9/gRNA 복합체의 도입이 유도된 400 ㎕의 세포액을 6 well plate로 옮기고, 2 ml의 10 %의 FBS가 포함된 TMN-FH를 각 well에 첨가하여 48~72 시간까지 배양하였다. 배양된 Bm 5 세포로부터 genomic DNA를 추출하고, 표적부위에 대한 primer(EX1 assay F: 5'-GGTTCCGTGTTCATAAACAATTGT 와 Ex1 assay R: 5'-TTTATACATACGTGTCTCCGTCCT)를 이용하여 400~500 b.p. 크기의 PCR 산물을 얻은 후 90℃에서 5 분간 가열하고 95℃에서 85℃까지 -2℃/sec의 속도로 냉각 후 이어서 85℃에서 25℃까지 -0.1℃/sec의 속도로 냉각하여 돌연변이 DNA와 원형 DNA의 재결합을 통하여 이형 DNA 분자를 형성시켰다. 이후 부정교합 서열을 인지하고 절단하는 T7 endonuclease I 효소를 처리하여 이형 DNA분자의 절단 양상을 2% 한천 겔에 전기영동 함으로서 분석한 결과, 돌연변이 유발 효율은 300V, 15 ms에서 더 높게 나타났다(도 7).

Cas9/gRNA 복합체 도입에 적합한 electroporation 완충액을 결정하기 위하여 Bio-rad사의 electroporation 완충액, Sucrose 완충액(10 mM HEPES pH 7.3, 272 mM Sucrose), 및 FBS를 첨가하지 않은 TMN-FH 배지를 이용하여 세포액을 준비하고 Cas9/gRNA (2.5 ㎍/ 2.5 ㎍) 복합체와 혼합하여 300V, 15 ms 조건의 전기 충격을 가한 후 세포를 배양하여 T7 endonuclease I 분석을 수행한 결과, Sucrose 완충액에서 가장 높은 돌연변이 유발 효율이 나타났다(도 8A).

Electroporation에 적합한 Cas 9과 F10 gRNA의 농도비를 결정하기 위하여, 2.5 ㎍의 Cas 9과 F10 gRNA를 0.5에서 5 ㎍까지 농도를 달리하여 복합체를 형성시킨 후 Sucrose 완충액에 준비된 세포액과 혼합 후 300 V, 15 ms의 전기충격을 가하여 세포를 배양하여 T7 endonuclease I 분석을 수행한 결과, 5 ㎍의 gRNA를 이용하였을 때 가장 높은 효율로 돌연변이가 유발됨에 따라 Cas9 핵산 분해효소와 가이드 RNA의 최적 혼합비는 1: 2로 확인되었다(도 8B).

<실시예 3. 돌연변이 검정 및 효과>

실시예 3-1. 돌연변이 Bm 5 세포의 Cactus 유전자 서열 분석

Cas 9/ F10 gRNA (2.5 : 5 ㎍)를 sucrose 완충액 상에서 electroporation을 통해 도입한 Bm 5 세포에 대해 돌연변이가 잘 일어났는지 T7 endonuclease I 분석을 통해 확인하였다. 돌연변이가 유발된 세포의 Genomic DNA로부터 Cactus 유전자의 표적부위에 대한 primer(Ex1 assay F and Ex1 assay R)를 이용하여 PCR을 수행했고, 이 결과물을 pJET 1.2 vector(Thermo, Cat, No. K1231)에 클로닝하였다. 이렇게 하여 얻은 클론의 플라스미드 DNA를 정제하여 염기서열을 분석하였다.

이렇게 하여 얻은 총 40개의 클론에 대하여 염기서열을 분석한 결과 5종의 결실 돌연변이와 삽입 돌연변이 1종이 확인되었다(도 9).

실시예 3-2. 돌연변이 Bm 5 세포의 항균펩타이드 유전자 발현 분석

실시예 3-1에서 다양한 형태의 돌연변이가 유발된 Bm 5 세포를 지속적으로 배양 후 세포로부터 total RNA를 추출하고, oligo dT primer를 이용하여 700 ng의 total RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 이후 cDNA와 표 5의 primer를 이용하여 RT-PCR 및 Real-time PCR을 통해 정상 Bm 5 세포와 Cactus 돌연변이 Bm 5 세포 사이에서의 항균펩타이드 유전자 발현을 비교분석하였다. 그 결과 돌연변이 세포에서 Cactus 유전자의 발현은 야생형의 정상 세포 대비 감소한 반면, lysozyme, moricin 및 lebocin의 유전자 발현이 큰 폭으로 증가하는 것이 확인된다(도 10).

RT-PCR 및 Real-time PCR primer

Gene	Forward primer (5' to 3')	Reverse primer (5' to 3')
GAPDH	GCTGGAATTTCTTTGAATGAC	CAATGACTCTGCTGGAATAACC
Rel A	TCCTGTTGCCTTAGAGAACATG	GGATAAGTTTTGTTCTCCGGAG
Rel B	AAGCGTGGTAATAGTCGAGCAA	TTGTTGACGCAGGACACGACT
Relish	ATGCTAGTGAAATGGCTGGAAC	TGCTCCTCAGGTGTCTTATGTT
Cactus	TGAAATCCATTACGGATAGGCTGT	GTGTACGGAGGCGATGTGTA
Moricin	ATGTCTCTGGTGTCATGTAGTA	TTGAAAACATCGTTGGCTGTAC
Lysozyme	AAGACTGCAACGTTAAGTGCTC	ACAGTTCTGTTTCGAGGAGATC
Lebocin1	TTATTATCGGACGCTGTGTT	TATTATCGGACGCTGTGTT

실시예 3-3. 돌연변이 Bm 5 세포의 lysozyme 활성 분석

돌연변이가 유발된 Bm 5 세포를 배양하면서 세포배양액을 수집 후 40-70% ammonium sulfate 분획을 통하여 단백질을 농축하였다. PD-10 컬럼을 이용하여 농축된 단백질로부터 염을 제거하고 동결건조 후 활성분석에 이용하였다. 형광색소가 결합된 Micrococcus lysodeikticus의 세포벽(Invitrogen, Cat. NO. E22013)을 기질로 이용하여 lysozyme의 활성을 분석한 결과 Cactus 유전자 돌연변이 세포에서는 정상 Bm 5 세포 배양액에 비하여 10배 이상 높은 lysozyme 활성을 나타내었다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Novel mutant insect cell line producing antimicrobial peptide or a preparation method thereof <130> 2018-0154 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Cactus <400> 1 cuccugcuca ugcgacuaag 20 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Cactus <400> 2 cucacuuuag guaaugccua 20 <210> 3 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Cactus <400> 3 agaugacaag guuguccugc 20 <210> 4 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Cactus <400> 4 agagucccgu gugggacuac 20 <210> 5 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Cactus <400> 5 gaguaguggc gaucuacguc 20 <210> 6 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Cactus <400> 6 acacaucgcc ucagagaggc 20 <210> 7 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Cactus <400> 7 cuccugcuca ugcgacuaag guuuuagagc uaugcuguuu uggaaacaaa acagcgauag 60 caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucuu uu 92 <210> 8 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Cactus <400> 8 cucacuuuag guaaugccua guuuuagagc uaugcuguuu uggaaacaaa acagcgauag 60 caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucuu uu 92 <210> 9 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Cactus <400> 9 agaugacaag guuguccugc guuuuagagc uaugcuguuu uggaaacaaa acagcgauag 60 caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucuu uu 92 <210> 10 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Cactus <400> 10 agagucccgu gugggacuac guuuuagagc uaugcuguuu uggaaacaaa acagcgauag 60 caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucuu uu 92 <210> 11 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Cactus <400> 11 gaguaguggc gaucuacguc guuuuagagc uaugcuguuu uggaaacaaa acagcgauag 60 caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucuu uu 92 <210> 12 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Cactus <400> 12 acacaucgcc ucagagaggc guuuuagagc uaugcuguuu uggaaacaaa acagcgauag 60 caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucuu uu 92

Claims

칵투스(Cactus) 유전자의 돌연변이로 인해 상기 유전자의 mRNA 또는 Cactus 단백질 발현이 억제된 것을 특징으로 하며, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 가이드 RNA와 Cas9 단백질이 삽입된 돌연변이 곤충 세포주.
삭제
제1항에 있어서,
상기 곤충 세포주는 라이소자임(lysozyme), 모리신(moricin) 및 레보신 1(lebocin 1)으로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택되는 항균 펩타이드가 과발현되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 곤충 세포주.
제1항에 있어서,
상기 돌연변이 곤충 세포주는 누에 난소 세포주인 것을 특징으로 하는 돌연변이 곤충 세포주.
제4항에 있어서,
상기 누에 난소 세포주는 Bm 5 세포인 것을 특징으로 하는 돌연변이 곤충 세포주.
서열번호 2의 가이드 RNA와 Cas9 단백질을 곤충 세포주에 삽입하여 칵투스(Cactus) 유전자가 손상된 돌연변이 곤충 세포주를 제조하는 방법.
제6항에 있어서,
서열번호 2의 가이드 RNA와 Cas9 단백질의 삽입은 200~350V에서 12~20ms 동안 전기천공법을 실시하여 수행되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 곤충 세포주를 제조하는 방법.
제7항에 있어서,
상기 전기천공법은 곤충 세포주를 수크로오즈 완충액에 넣어 수행되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 곤충 세포주를 제조하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 수크로오즈 완충액은 200~300 mM의 수크로오즈가 포함된 pH 7.0 내지 pH 7.5인 5~20 mM HEPES(N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid) 완충액인 것을 특징으로 하는 돌연변이 곤충 세포주를 제조하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 가이드 RNA와 Cas9 단백질은 1:1 내지 1:2의 중량비로 혼합되어 곤충 세포주에 삽입되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 곤충 세포주를 제조하는 방법.