JP7452884B2 - Ｄｎａが編集された植物細胞を製造する方法、及びそれに用いるためのキット - Google Patents
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Description
本発明は、ＤＮＡが編集された植物細胞を製造する方法、及びそれに用いるためのキットに関する。
ＤＮＡの編集技術としては、放射線やＤＮＡ損傷薬剤を利用し、遺伝子に変異を導入する突然変異育種技術の開発が１００年近く前から進められてきている。しかしながら、この方法によって標的とする遺伝子に特異的に変異を導入することは、現在の技術では困難である。したがって、例えば、作物育種の場合、突然変異処理を施した大量のサンプルを準備し、それらを個別に調査していくことで、目的の形質を示す系統を選抜する必要がある。
また、ＤＮＡの編集技術としては、他に、鋳型となる外来ＤＮＡを用いて標的ＤＮＡの配列を書き換える標的組換え（ジーンターゲッティング）がある。標的組換えは、標的ＤＮＡに対して、塩基レベルから遺伝子レベルまでの欠失・挿入・置換等の様々な改変が可能な技術である。例えば、酵素活性を制御する領域にアミノ酸置換を導入し、酵素活性を改変することも可能である。特に、２種類の選抜マーカーを利用したポジティブ・ネガティブ選抜法は汎用的であり、理論上は、標的塩基配列に制限はない。また、ポジティブ・ネガティブ選抜法と足跡を残さないマーカー除去法とを組み合わせることにより、標的ＤＮＡの配列にどのような種類の塩基置換でも導入することが可能である（特許文献１：特開２０１５－１７７７８８号公報、特許文献２：特開２０１５－１７１３５８号公報）。しかしながら、植物においては、一般に、標的組換えの効率が低い傾向にある。
また、ＤＮＡの編集技術としては、さらに、制限酵素によって標的ＤＮＡを切断し、それが修復される際の修復機構を利用する標的変異技術がある。標的変異技術としては、２０塩基前後の配列を特異的に認識するメガヌクレアーゼ（ＭＮｓ）の認識配列をタンパク質工学等の手法によって改良した改変型ＭＮｓ、既存のＤＮＡ結合モチーフとＤＮＡ切断モチーフとを組み合わせた酵素ＺＦＮｓやＴＡＬＥＮｓ、原核生物の獲得免疫システムを応用したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム等が開発されている（非特許文献１：Ｋｉｍ ａｎｄ Ｋｉｍ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．）。
特に、２０１２年にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムが制限酵素として利用可能であることが報告されて以来、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、植物を含む様々な生物種において機能することが明らかとなり、世界中の研究者が利用する汎用的な遺伝子改変ツールとなっている。しかしながら、現在の技術では、この方法によって生じさせることができる変異は主に数塩基程度の欠失や挿入であるため、その多くがフレームシフトによる遺伝子破壊をもたらす。そのため、例えば、アミノ酸置換による酵素タンパク質の機能改変や新機能付与など、塩基の置換を要する高精度なＤＮＡ編集には不向きである。
また、Ｃａｓ９タンパク質と塩基の脱アミノ化酵素とを組み合わせることにより、標的ＤＮＡの目的の塩基を置換できることが知られており、これまでに、ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅを利用することでＣからＴ（ＧからＡ）への置換を、ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅを利用することでＡからＧ（ＴからＣ）への置換を、それぞれ誘導できることが報告されている（非特許文献２：Ｋｉｍ（２０１８）Ｎａｔ．Ｐｌａｎｔｓ）。しかしながら、ＣからＴ（ＧからＡ）、又はＡからＧ（ＴからＣ）以外の塩基置換導入技術は未だ確立されておらず、また、置換できる塩基の位置も限られている。さらに、現在の技術では、脱アミノ化酵素が作用する塩基を厳密に決定することができないこと、Ｃａｓ９タンパク質が必ずしも任意の配列を認識できないこと、等により、導入できる塩基置換の場所や置換の種類が限られている。
また、標的変異技術としては、塩基の脱塩基反応を触媒する脱塩基酵素や校正機能が低下したＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを利用することにより、ランダムな位置に様々な塩基置換を導入する技術も開発されている（非特許文献３：Ｈａｌｐｅｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ）。しかしながら、この方法によって置換を導入する塩基の位置や導入できる塩基置換の種類を制御することは、現在の技術では困難である。
また、制限酵素を利用し、ＤＮＡ修復機構の一部を改変することによって変異導入効率を向上させ、導入される変異の種類を改変できる（欠失長を長くできる等）ことが報告されている。例えば、ＤＮＡ修復経路の一つである非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を抑制することにより、ＴＡＬＥＮｓによる標的変異効率を高められることが報告されている（非特許文献４：Ｎｉｓｈｉｚａｗａ－Ｙｏｋｏｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．）。しかしながら、ＳｐＣａｓ９タンパク質を利用した場合、切断部位には１～数塩基程度の欠失や挿入が導入されるが、切断部位でどのような修復機構が働くか、また、その結果としてどのような変異が導入されるかは、標的ＤＮＡの配列や細胞の状態にも依存するため、高頻度で１塩基を挿入するといった、高精度なＤＮＡ編集が可能な技術は未だ開発されていない。
また、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、これまでに様々な目的での利用が検討されており、例えば、特表２０１７－５０２６８３号公報（特許文献３）には、細胞内のゲノム遺伝子座の１つ又は複数の対立遺伝子を修飾する（例えば、変異導入する）方法として、ヌクレアーゼ相互作用ＲＮＡセグメントにスプライシングされた、転写されたエクソンを含む、キメラスプライシングＲＮＡ分子を生成することを伴う方法が記載されており、同文献には、キメラスプライシングＲＮＡが、ＤＮＡ修飾酵素（例えば、ヌクレアーゼ）を細胞におけるゲノム遺伝子座にガイドし、その結果、該遺伝子座の修飾をもたらすことが記載され、前記ヌクレアーゼとしてＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼが挙げられている。
さらに、例えば、特表２０１７－５３８４２５号公報（特許文献４）には、糸状真菌細胞のゲノム中における標的部位でのゲノム改変用の組成物及び方法において、標的部位を改変するための又は変更するためのガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムが記載されており、特表２０１７－５３８４２４号公報（特許文献５）には、真菌宿主細胞（例えば糸状真菌宿主細胞）中での遺伝子変更を促進するためにヘルパー株システムを用いる組成物及び方法において、Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ複合体を異核共存体に導入することが記載されている。
さらに、例えば、特表２０１７－５３７６４７号公報（特許文献６）及び特表２０１８－５０４８９５号公報（特許文献７）には、真菌細胞や糸状真菌細胞のゲノム中の標的部位でのゲノム改変用の組成物及び方法において、真菌宿主細胞や糸状真菌細胞ゲノム中の標的部位でのドナーＤＮＡの挿入を促進するためのガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムが記載されている。
Ｋｉｍ ａｎｄ Ｋｉｍ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．
Ｋｉｍ（２０１８）Ｎａｔ．Ｐｌａｎｔｓ
Ｈａｌｐｅｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ
Ｎｉｓｈｉｚａｗａ－Ｙｏｋｏｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．
本発明は上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、高頻度で１塩基を挿入することができ、高精度のＤＮＡ編集が可能な、ＤＮＡが編集された植物細胞を製造する方法、及びそれに用いるキットを提供することを目的とする。
本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、植物細胞の標的変異において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ９）システムのＣａｓ９タンパク質としてＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＮｍＣａｓ９タンパク質を用いることにより、従来から利用されていたＳｐＣａｓ９タンパク質を用いた標的変異と比較して、１塩基挿入を高頻度に生じさせることができ、特に、Ｔ又はＡを挿入しやすい傾向にあることを見出した。このような報告は他のＣａｓ９タンパク質ではこれまでになされていない。さらに、本発明者らは、このように高頻度で１塩基挿入を可能とするＮｍＣａｓ９タンパク質による標的変異を利用することで、標的ＤＮＡ領域に目的どおりの複数個の塩基（例えば３塩基）を挿入したり、目的どおりの塩基を置換したりすることが可能であることも見出し、本発明を完成するに至った。
かかる知見により得られた本発明の態様は次のとおりである。
［１］
ＤＮＡが編集された植物細胞を製造する方法であり、植物細胞に、Ｃａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを導入する工程を含み、かつ、前記Ｃａｓ９タンパク質がＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来である、方法。
［２］
植物細胞のＤＮＡに連続するｎ個の塩基を挿入する方法であり、植物細胞に、Ｃａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを導入する工程を含み、
前記Ｃａｓ９タンパク質がＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来であり、
前記ガイドＲＮＡがｎ個のガイドＲＮＡの組み合わせであり、
ｎが２以上の自然数であり、
１番目のガイドＲＮＡが、塩基を挿入する標的塩基配列１に対して相同な標的化塩基配列１を含むものであり、かつ、ｎ番目のガイドＲＮＡが、標的塩基配列１にｎ－１個の塩基が挿入された標的塩基配列ｎに対して相同な標的化塩基配列ｎを含むものである、
方法。
［３］
植物細胞のＤＮＡの塩基を置換する方法であり、植物細胞に、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質以外の他のＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと、を導入する工程を含み、
前記Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡが、塩基を挿入する標的塩基配列１に対して相同な標的化塩基配列１を含むものであり、かつ、前記他のＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡが、標的塩基配列１に１個の塩基が挿入された標的塩基配列２に対して相同な標的化塩基配列２を含むものである、
方法。
［４］
前記植物細胞がイネ細胞である、［１］～［３］のうちのいずれか一項に記載の方法。
［５］
ＤＮＡが編集された植物細胞の製造に用いるためのキットであり、
以下の（Ａ）及び（Ｂ）：
（Ａ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、
（Ｂ）前記Ｃａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡ、該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、
を含む、キット。
［６］
前記ガイドＲＮＡがｎ個のガイドＲＮＡの組み合わせであり、
ｎが２以上の自然数であり、
１番目のガイドＲＮＡが、塩基を挿入する標的塩基配列１に対して相同な標的化塩基配列１を含むものであり、かつ、ｎ番目のガイドＲＮＡが、標的塩基配列１にｎ－１個の塩基が挿入された標的塩基配列ｎに対して相同な標的化塩基配列ｎを含むものである、
［５］に記載のキット。
［７］
以下の（Ｃ）及び（Ｄ）：
（Ｃ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質以外の他のＣａｓ９タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、
（Ｄ）前記他のＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡ、該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、
をさらに含み、
前記Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡが、塩基を挿入する標的塩基配列１に対して相同な標的化塩基配列１を含むものであり、かつ、前記他のＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡが、標的塩基配列１に１個の塩基が挿入された標的塩基配列２に対して相同な標的化塩基配列２を含むものである、
［５］に記載のキット。
［８］
前記植物細胞がイネ細胞である、［５］～［７］のうちのいずれか一項に記載のキット。
［１］
ＤＮＡが編集された植物細胞を製造する方法であり、植物細胞に、Ｃａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを導入する工程を含み、かつ、前記Ｃａｓ９タンパク質がＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来である、方法。
［２］
植物細胞のＤＮＡに連続するｎ個の塩基を挿入する方法であり、植物細胞に、Ｃａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを導入する工程を含み、
前記Ｃａｓ９タンパク質がＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来であり、
前記ガイドＲＮＡがｎ個のガイドＲＮＡの組み合わせであり、
ｎが２以上の自然数であり、
１番目のガイドＲＮＡが、塩基を挿入する標的塩基配列１に対して相同な標的化塩基配列１を含むものであり、かつ、ｎ番目のガイドＲＮＡが、標的塩基配列１にｎ－１個の塩基が挿入された標的塩基配列ｎに対して相同な標的化塩基配列ｎを含むものである、
方法。
［３］
植物細胞のＤＮＡの塩基を置換する方法であり、植物細胞に、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質以外の他のＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと、を導入する工程を含み、
前記Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡが、塩基を挿入する標的塩基配列１に対して相同な標的化塩基配列１を含むものであり、かつ、前記他のＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡが、標的塩基配列１に１個の塩基が挿入された標的塩基配列２に対して相同な標的化塩基配列２を含むものである、
方法。
［４］
前記植物細胞がイネ細胞である、［１］～［３］のうちのいずれか一項に記載の方法。
［５］
ＤＮＡが編集された植物細胞の製造に用いるためのキットであり、
以下の（Ａ）及び（Ｂ）：
（Ａ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、
（Ｂ）前記Ｃａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡ、該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、
を含む、キット。
［６］
前記ガイドＲＮＡがｎ個のガイドＲＮＡの組み合わせであり、
ｎが２以上の自然数であり、
１番目のガイドＲＮＡが、塩基を挿入する標的塩基配列１に対して相同な標的化塩基配列１を含むものであり、かつ、ｎ番目のガイドＲＮＡが、標的塩基配列１にｎ－１個の塩基が挿入された標的塩基配列ｎに対して相同な標的化塩基配列ｎを含むものである、
［５］に記載のキット。
［７］
以下の（Ｃ）及び（Ｄ）：
（Ｃ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質以外の他のＣａｓ９タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、
（Ｄ）前記他のＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡ、該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、
をさらに含み、
前記Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡが、塩基を挿入する標的塩基配列１に対して相同な標的化塩基配列１を含むものであり、かつ、前記他のＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡが、標的塩基配列１に１個の塩基が挿入された標的塩基配列２に対して相同な標的化塩基配列２を含むものである、
［５］に記載のキット。
［８］
前記植物細胞がイネ細胞である、［５］～［７］のうちのいずれか一項に記載のキット。
本発明によれば、高頻度で１塩基を挿入することができ、高精度のＤＮＡ編集が可能な、ＤＮＡが編集された植物細胞を製造する方法、及びそれに用いるキットを提供することが可能となる。
また、本発明によれば、特に１塩基欠失を起こしやすいＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを併用して、標的塩基配列への１塩基挿入後に、同標的塩基配列に存在した１塩基を欠失させることにより、効率よく塩基を置換することも可能となる。
以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。
＜ＤＮＡが編集された植物細胞を製造する方法＞
本発明は、植物細胞に、Ｃａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを導入する工程を含み、かつ、前記Ｃａｓ９タンパク質がＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来である、ＤＮＡが編集された植物細胞を製造する方法（以下、場合により、「ＤＮＡ編集植物細胞製造方法」という）を提供する。
本発明は、植物細胞に、Ｃａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを導入する工程を含み、かつ、前記Ｃａｓ９タンパク質がＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来である、ＤＮＡが編集された植物細胞を製造する方法（以下、場合により、「ＤＮＡ編集植物細胞製造方法」という）を提供する。
（植物細胞）
本発明においてＤＮＡを編集する、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを導入する「植物細胞」としては、例えば、穀物類、油料作物、飼料作物、果物、野菜類の細胞が挙げられる。「植物細胞」には、例えば、植物の個体を構成している細胞、植物から分離した器官や組織を構成する細胞、植物の組織に由来する培養細胞が含まれる。植物の器官や組織としては、例えば、葉、茎、茎頂（生長点）、根、塊茎、塊根、種子、カルスが挙げられる。植物の例としては、イネ、オオムギ、コムギ、ライムギ、ヒエ、モロコシ、トウモロコシ、バナナ、ピーナツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ、タバコ、ジャガイモ、ダイズ、ワタ、カーネーションが挙げられる。これらの中でも、好ましくは、イネ、オオムギ、コムギ、ライムギ、ヒエ、モロコシ、トウモロコシ等のイネ科植物であり、特に好ましくは、イネである。
本発明においてＤＮＡを編集する、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを導入する「植物細胞」としては、例えば、穀物類、油料作物、飼料作物、果物、野菜類の細胞が挙げられる。「植物細胞」には、例えば、植物の個体を構成している細胞、植物から分離した器官や組織を構成する細胞、植物の組織に由来する培養細胞が含まれる。植物の器官や組織としては、例えば、葉、茎、茎頂（生長点）、根、塊茎、塊根、種子、カルスが挙げられる。植物の例としては、イネ、オオムギ、コムギ、ライムギ、ヒエ、モロコシ、トウモロコシ、バナナ、ピーナツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ、タバコ、ジャガイモ、ダイズ、ワタ、カーネーションが挙げられる。これらの中でも、好ましくは、イネ、オオムギ、コムギ、ライムギ、ヒエ、モロコシ、トウモロコシ等のイネ科植物であり、特に好ましくは、イネである。
本発明によって編集されるＤＮＡ（標的ＤＮＡ）としては、特に制限されず、下記のＮｍＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列を含むものであればよい。なお、後述するように、Ｃａｓ９タンパク質を改変すること（例えば、変異の導入）により、標的ＤＮＡの塩基配列に応じて、ＰＡＭの認識特異性を改変することも可能である。
（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム）
本発明に係るＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、構成要素として、少なくともＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを含む。ガイドＲＮＡは、標的塩基配列（例えば、欠損させる遺伝子上の配列であり、ＰＡＭ配列を含む鎖（センス鎖）上にある配列）の相補配列（前記センス鎖のアンチセンス鎖上にある配列）に相補的な塩基配列（すなわち、前記標的塩基配列に対して相同な配列）を有するｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）とｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ）とからなる。一般に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムでは、Ｃａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを細胞内に導入することによって、ガイドＲＮＡが、ゲノムＤＮＡの標的塩基配列の相補配列に結合し、当該ガイドＲＮＡと複合体を形成するＣａｓ９タンパク質による標的ＤＮＡの切断を誘導する。切断された標的ＤＮＡでは、その修復過程で当該塩基配列における塩基の欠失・挿入が引き起こされ、その結果、遺伝子を編集することが可能となる。
本発明に係るＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、構成要素として、少なくともＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを含む。ガイドＲＮＡは、標的塩基配列（例えば、欠損させる遺伝子上の配列であり、ＰＡＭ配列を含む鎖（センス鎖）上にある配列）の相補配列（前記センス鎖のアンチセンス鎖上にある配列）に相補的な塩基配列（すなわち、前記標的塩基配列に対して相同な配列）を有するｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）とｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ）とからなる。一般に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムでは、Ｃａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを細胞内に導入することによって、ガイドＲＮＡが、ゲノムＤＮＡの標的塩基配列の相補配列に結合し、当該ガイドＲＮＡと複合体を形成するＣａｓ９タンパク質による標的ＤＮＡの切断を誘導する。切断された標的ＤＮＡでは、その修復過程で当該塩基配列における塩基の欠失・挿入が引き起こされ、その結果、遺伝子を編集することが可能となる。
〔ＮｍＣａｓ９タンパク質〕
本発明においては、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムとして、少なくともＣａｓ９タンパク質がＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来であるものを用いる。以下、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質を「ＮｍＣａｓ９タンパク質」という。
本発明においては、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムとして、少なくともＣａｓ９タンパク質がＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来であるものを用いる。以下、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質を「ＮｍＣａｓ９タンパク質」という。
本発明に用いられる「ＮｍＣａｓ９タンパク質」の典型的なアミノ酸配列（野生型ＮｍＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列）を配列番号：１に、当該タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号：２に、それぞれ示す。また、下記の表１に、野生型ＮｍＣａｓ９タンパク質（ＮｍＣａｓ９）のサイズ（アミノ酸数）、ＰＡＭ（ｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）配列、及びＤＮＡの切断末端（ＤＮＡ末端）を示す。典型的なＮｍＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列は、「５′－ＮＮＮＮＧＡＴＴ」である。ただし、後述するように、Ｃａｓ９タンパク質を改変すること（例えば、変異の導入）によって、ＰＡＭの認識特異性を改変することも可能である。
表１には、参照として、従来から制限酵素としてよく利用されているＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質（ＳｐＣａｓ９）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣｐｆ１タンパク質（ＦｎＣｐｆ１）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（ＳａＣａｓ９）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９タンパク質（ＣｊＣａｓ９）についても、典型的な、サイズ（アミノ酸数）、ＰＡＭ配列、ＤＮＡの切断末端（ＤＮＡ末端）、及びある場合には参照文献名を併せて示す。
本発明に係る「ＮｍＣａｓ９タンパク質」としては、ガイドＲＮＡと複合体を形成して標的ＤＮＡを切断する活性（ヌクレアーゼ活性）を有している限り、上記の典型的ＮｍＣａｓ９タンパク質のホモログ、変異体、又は部分ペプチドであってもよい。
ホモログとしては、例えば、ＮｍＣａｓ９タンパク質の典型的なアミノ酸配列（例えば、配列番号：１のアミノ酸配列）と、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときの数値で評価することができる。
また、変異体としては、ＮｍＣａｓ９タンパク質の典型的なアミノ酸配列（例えば、配列番号：１のアミノ酸配列）に対して１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、ガイドＲＮＡと複合体を形成して標的ＤＮＡを切断する活性を有するタンパク質が含まれる。ここで、「複数個」とは、例えば、２～１５０個、好ましくは２～１００個、より好ましくは２～５０個（例えば、２～３０個、２～１０個、２～５個、２～３個、２個）である。変異体の例としては、例えば、特定のアミノ酸残基に変異を導入することによりＰＡＭの認識特異性を改変したＮｍＣａｓ９タンパク質が挙げられる。Ｃａｓ９タンパク質におけるＰＡＭの認識特異性を改変する技術は公知である（例えば、Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ５２３，４８１－４８５（２０１５）、Ｈｉｒａｎｏ，Ｓ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６１， ８８６－８９４（２０１６）等）。ＰＡＭの認識特異性を改変したＮｍＣａｓ９タンパク質を利用することにより、植物のゲノムＤＮＡ上に、より多くの標的ＤＮＡ領域を設定することが可能となる。
本発明に係るＮｍＣａｓ９タンパク質としては、核移行シグナルを付加したものであることが好ましい。これにより、細胞内で核への局在が促進され、その結果、ＤＮＡの編集が効率的に行われる。
〔ガイドＲＮＡ〕
本発明に係るＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにおいて、「ガイドＲＮＡ」は、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）とｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ）との組み合わせである。本発明に係るＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡに、標的ＤＮＡ領域の塩基配列（標的塩基配列の相補配列）に対して相補的な塩基配列（以下、場合により「標的化塩基配列」という）を含む。すなわち、本発明に係るＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡは、標的塩基配列に対して相同な標的化塩基配列を含む。
本発明に係るＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにおいて、「ガイドＲＮＡ」は、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）とｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ）との組み合わせである。本発明に係るＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡに、標的ＤＮＡ領域の塩基配列（標的塩基配列の相補配列）に対して相補的な塩基配列（以下、場合により「標的化塩基配列」という）を含む。すなわち、本発明に係るＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡは、標的塩基配列に対して相同な標的化塩基配列を含む。
なお、本発明において、第１の塩基配列に対して第２の塩基配列が「相同」とは、第１の塩基配列の相補配列に対して、第２の塩基配列が相補的であることをいい、第１の塩基配列及び第２の塩基配列がいずれもＤＮＡ又はＲＮＡである場合には、それらの塩基配列は互いに同一の関係にあり、第１の塩基配列及び第２の塩基配列のいずれかがＤＮＡであって他方がＲＮＡである場合には、ＤＮＡにおいてチミン（Ｔ）である塩基がＲＮＡにおいてウラシル（Ｕ）である以外、それらの塩基配列が互いに同一の関係にあることをいう。
ここで、「標的ＤＮＡ領域」とは、植物細胞の標的ＤＮＡ上、標的塩基配列及び目的の遺伝子改変（塩基の挿入・置換）を生じさせる部位を含む領域を意味する。標的ＤＮＡ領域は、その３’側にてＰＡＭ配列と隣接する。ｃｒＲＮＡ中の標的化塩基配列は、通常、１２～５０塩基、好ましくは、１７～３０塩基、より好ましくは１７～２５塩基からなる塩基配列である。
前記ｃｒＲＮＡは、さらに、ｔｒａｃｒＲＮＡと相互作用（ハイブリダイズ）が可能な塩基配列を３’側に含む。一方、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの一部の塩基配列と相互作用（ハイブリダイズ）が可能な塩基配列を５’側に含むため、前記ガイドＲＮＡは、これら塩基配列の相互作用により、ＮｍＣａｓ９タンパク質と相互作用する二重鎖ＲＮＡを形成する。このため、本発明に係るＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ領域の標的塩基配列の相補配列に結合し、ＮｍＣａｓ９タンパク質と複合体を形成することで、ＮｍＣａｓ９タンパク質を当該標的ＤＮＡ領域に誘導し、誘導されたＮｍＣａｓ９タンパク質が、そのエンドヌクレアーゼ活性によって標的ＤＮＡを切断する。
標的ＤＮＡ領域において、目的の遺伝子改変を生じさせる部位（すなわち、標的ＤＮＡの切断部位）は、前記標的塩基配列中に含まれていなくともよいが、当該標的塩基配列中に含まれていることが好ましい。典型的には、標的ＤＮＡの切断は、前記ガイドＲＮＡと標的塩基配列の相補配列との間の塩基対形成の相補性と、その標的塩基配列の３’側に存在するＰＡＭ配列との両方によって決定される位置で生じる。ＮｍＣａｓ９タンパク質は、一般に、標的ＤＮＡ領域において、ＰＡＭ配列の上流３塩基目と４塩基目との間を切断する。
本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムのガイドＲＮＡとしては、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であっても、ｃｒＲＮＡ断片とｔｒａｃｒＲＮＡ断片とからなる二分子ガイドＲＮＡであってもよい。
一般に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにおいては、Ｃａｓ９タンパク質による標的ＤＮＡの切断が細胞内で修復されると、塩基の挿入や欠失が主に生じるが、本発明においては、植物細胞のＤＮＡ編集でＣａｓ９タンパク質としてＮｍＣａｓ９タンパク質を用いることにより、従来よりも驚くべき高頻度で１塩基挿入が生じる。例えば、本発明のＤＮＡ編集植物細胞製造方法によれば、イネの内在遺伝子の配列を標的ＤＮＡとした場合、一例として、１塩基挿入以外の変異が起こった頻度（全変異（塩基の挿入・欠失）の起こったサンプル数に対する１塩基挿入以外の変異が起こったサンプル数の割合）はおよそ１．１～２５％と、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムのＣａｓ９タンパク質として従来から利用されているＳｐＣａｓ９タンパク質を同じ標的ＤＮＡに用いた場合と比べて、１／８．７～１／２．３にまで減少し、１塩基挿入頻度を著しく高くすることができた。特に、Ｔ又はＡの１塩基挿入以外の変異が起こった頻度は、１／３．４～１／２．３にまで減少し、Ｔ又はＡの１塩基挿入頻度を特に高くすることができた（実施例１～２、比較例１～２）。
（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの植物細胞への導入）
本発明において、植物細胞に導入されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムとしては、Ｃａｓ９タンパク質（ＮｍＣａｓ９タンパク質及び必要に応じてそれ以外の他のＣａｓ９タンパク質）が、タンパク質の形態であっても、当該タンパク質をコードするＲＮＡやＤＮＡ（ポリヌクレオチド）の形態であっても、当該ポリヌクレオチドを発現するベクター（発現ベクター）の形態であってもよい。また、これと独立して、ガイドＲＮＡが、ＲＮＡの形態であっても、当該ＲＮＡをコードするＤＮＡ（ポリヌクレオチド）の形態であっても、当該ポリヌクレオチドを発現するベクター（発現ベクター）の形態であってもよい。
本発明において、植物細胞に導入されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムとしては、Ｃａｓ９タンパク質（ＮｍＣａｓ９タンパク質及び必要に応じてそれ以外の他のＣａｓ９タンパク質）が、タンパク質の形態であっても、当該タンパク質をコードするＲＮＡやＤＮＡ（ポリヌクレオチド）の形態であっても、当該ポリヌクレオチドを発現するベクター（発現ベクター）の形態であってもよい。また、これと独立して、ガイドＲＮＡが、ＲＮＡの形態であっても、当該ＲＮＡをコードするＤＮＡ（ポリヌクレオチド）の形態であっても、当該ポリヌクレオチドを発現するベクター（発現ベクター）の形態であってもよい。
発現ベクターの形態を採用する場合には、例えば、Ｃａｓ９タンパク質を発現するベクターとそのガイドＲＮＡを発現するベクターとをそれぞれ細胞内に導入してもよく、また、Ｃａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡの双方を発現するベクターを細胞内に導入してもよい。また、複数のガイドＲＮＡを利用する場合には、これらガイドＲＮＡは、同一の発現ベクターに搭載されていても、別々の発現ベクターに搭載されていてもよい。さらに、ＮｍＣａｓ９タンパク質に他のＣａｓ９タンパク質を組み合わせる場合には、ＮｍＣａｓ９タンパク質と他のＣａｓ９タンパク質とは、同一の発現ベクターに搭載されていても、別々の発現ベクターに搭載されていてもよい。
また、発現ベクターの形態を採用する場合、前記Ｃａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、植物細胞用に、適宜コドン最適化されたものであってもよい。
さらに、発現ベクターの形態を採用する場合、当該発現ベクターとしては、発現させるべきポリヌクレオチドに作動可能に結合している１つ以上の調節エレメントを含むことが好ましい。ここで、「作動可能に結合している」とは、調節エレメントに上記ポリヌクレオチドが発現可能に結合していることを意味する。「調節エレメント」としては、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御エレメント（例えば、転写終結シグナル（ポリアデニル化シグナル、ポリＵ配列等））が挙げられる。また、当該発現ベクターとしては、宿主ゲノムに組み込まれることなく、コードするタンパク質を安定して発現することができるものであることが好ましい。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの植物細胞への導入は、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、細胞膜透過性ペプチドを利用する方法、プラズマ法等の公知の方法を適宜選択して行うことができる。
本発明のＤＮＡ編集植物細胞製造方法においては、植物細胞に、ＮｍＣａｓ９タンパク質を構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを導入することにより、高頻度で１塩基の挿入が起こるため、上記の標的ＤＮＡ領域に１塩基が挿入される編集がなされた植物細胞を得ることができる。また、本発明のＤＮＡ編集植物細胞製造方法においては、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムが導入された植物細胞から植物体を再生させることにより、ＤＮＡが編集された植物を生産することができる。組織培養により植物の組織を再分化させて個体を得る方法としては、本技術分野において確立された方法を利用することができる（例えば、形質転換プロトコール［植物編］ 田部井豊・編 化学同人 ｐｐ．３４０－３４７（２０１２））。こうして一旦、植物体が得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫又はクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、株、カルス、プロトプラスト）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。
＜植物細胞のＤＮＡに連続するｎ個の塩基を挿入する方法＞
本発明のＤＮＡ編集植物細胞製造方法によれば、ＮｍＣａｓ９タンパク質を利用するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにより、従来よりも高頻度で、植物細胞の標的塩基配列に１塩基を挿入することができる。そのため、本発明に係るＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにおいて、複数のガイドＲＮＡの組み合わせを用いることにより、植物細胞の標的塩基配列に連続する複数の塩基を挿入することも可能である。
本発明のＤＮＡ編集植物細胞製造方法によれば、ＮｍＣａｓ９タンパク質を利用するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにより、従来よりも高頻度で、植物細胞の標的塩基配列に１塩基を挿入することができる。そのため、本発明に係るＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにおいて、複数のガイドＲＮＡの組み合わせを用いることにより、植物細胞の標的塩基配列に連続する複数の塩基を挿入することも可能である。
したがって、本発明は、ＤＮＡ編集植物細胞製造方法を利用した方法として、植物細胞に、Ｃａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを導入する工程を含み、
前記Ｃａｓ９タンパク質がＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来であり、
前記ガイドＲＮＡがｎ個のガイドＲＮＡの組み合わせであり、
ｎが２以上の自然数であり、
１番目のガイドＲＮＡが、塩基を挿入する標的塩基配列１に対して相同な標的化塩基配列１を含むものであり、かつ、ｎ番目のガイドＲＮＡが、標的塩基配列１にｎ－１個の塩基が挿入された標的塩基配列ｎに対して相同な標的化塩基配列ｎを含むものである、
植物細胞のＤＮＡに連続するｎ個の塩基を挿入する方法（以下、場合により、「連続塩基挿入方法」という）も提供する。
前記Ｃａｓ９タンパク質がＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来であり、
前記ガイドＲＮＡがｎ個のガイドＲＮＡの組み合わせであり、
ｎが２以上の自然数であり、
１番目のガイドＲＮＡが、塩基を挿入する標的塩基配列１に対して相同な標的化塩基配列１を含むものであり、かつ、ｎ番目のガイドＲＮＡが、標的塩基配列１にｎ－１個の塩基が挿入された標的塩基配列ｎに対して相同な標的化塩基配列ｎを含むものである、
植物細胞のＤＮＡに連続するｎ個の塩基を挿入する方法（以下、場合により、「連続塩基挿入方法」という）も提供する。
本発明の連続塩基挿入方法において、植物細胞、ＮｍＣａｓ９タンパク質、そのガイドＲＮＡ、及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム、並びに、植物細胞へのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの導入としては、それぞれ独立に、それらの好ましい態様も含めて、ＤＮＡ編集植物細胞製造方法において述べたとおりである。
本発明の連続塩基挿入方法においては、ＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡとして、ｎ個のガイドＲＮＡの組み合わせを用いる。ｎは、２以上の自然数であり、アミノ酸に対応するコドン単位での塩基挿入を行う場合には、３の倍数である。
図１に、本発明の連続塩基挿入方法の態様の一例の概略図を示す。例えば、図１に示す態様においては、３個のＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ１、ｓｇＲＮＡ２、ｓｇＲＮＡ３）を、ＮｍＣａｓ９タンパク質（ＮｍＣａｓ９）と同一の発現ベクター（図１の（ａ））によって植物細胞に導入する。
本発明の連続塩基挿入方法においては、１番目のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ１）が、塩基を挿入する標的塩基配列１（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に対して相同（すなわち、標的塩基配列１の相補配列に対して相補的）な標的化塩基配列１を含む。つまり、本発明の連続塩基挿入方法において、１番目のガイドＲＮＡの標的化塩基配列１は、塩基を挿入する目的の部位（すなわち、標的ＤＮＡの切断部位）を含む塩基配列（標的塩基配列１）に対して相同な塩基配列である。１番目のガイドＲＮＡとＮｍＣａｓ９タンパク質とを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを植物細胞に導入することにより、ＤＮＡ編集植物細胞製造方法において述べたように、標的塩基配列１のＮｍＣａｓ９タンパク質による切断箇所に高頻度で１塩基が挿入されるため、標的塩基配列１に１塩基が挿入された標的塩基配列２を得ることができる。例えば、図１の（ｂ）では、標的ＤＮＡ（配列番号：７、図１の（ｂ）の一段目）上のＰＡＭ配列の上流３塩基目と４塩基目の間が切断され、当該切断箇所に１塩基、特にＴ又はＡが高頻度で挿入されるため、標的塩基配列１の３’末から３塩基目と４塩基目との間にＴが挿入された標的塩基配列２（配列番号：８）を得ることができる（図１の（ｂ）の二段目）。
さらに、本発明の連続塩基挿入方法において、２番目のガイドＲＮＡは、標的塩基配列１に１塩基が挿入された標的塩基配列２に対して相同な標的化塩基配列２を含む。そのため、１番目のガイドＲＮＡによって上記の標的塩基配列２が得られた場合、２番目のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ２）は、標的塩基配列２の相補配列に結合し、かつ、ＮｍＣａｓ９タンパク質と複合体を形成することで、ＮｍＣａｓ９タンパク質を標的塩基配列２に誘導し、誘導されたＮｍＣａｓ９タンパク質が、そのエンドヌクレアーゼ活性によって標的塩基配列２を切断し、当該切断箇所に高頻度で１塩基が挿入される。その結果、標的塩基配列２に１塩基が挿入された標的塩基配列３（すなわち、標的塩基配列１に２塩基が挿入された標的塩基配列３）を得ることができる。例えば、図１では、ＰＡＭ配列の上流３塩基目と４塩基目との間が切断され、当該切断箇所に１塩基、特にＴ又はＡが高頻度で挿入されるため、標的塩基配列２の３’末から３塩基目と４塩基目との間にＡが挿入された標的塩基配列３（配列番号：９）を得ることができる（図１の（ｂ）の三段目）。
さらに、本発明の連続塩基挿入方法において、３番目のガイドＲＮＡは、標的塩基配列２に１塩基が挿入された標的塩基配列３に対して相同な標的化塩基配列３を含む。そのため、２番目のガイドＲＮＡによって上記の標的塩基配列３が得られた場合、３番目のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ３）は、標的塩基配列３の相補配列に結合し、かつ、ＮｍＣａｓ９タンパク質と複合体を形成することで、ＮｍＣａｓ９タンパク質を標的塩基配列３に誘導し、誘導されたＮｍＣａｓ９タンパク質が、そのエンドヌクレアーゼ活性によって標的塩基配列３を切断し、当該切断箇所に高頻度で１塩基が挿入される。その結果、標的塩基配列３に１塩基が挿入された塩基配列（すなわち、標的塩基配列１に３塩基が挿入された塩基配列）を得ることができる。例えば、図１では、ＰＡＭ配列の上流３塩基目と４塩基目との間が切断され、当該切断箇所に１塩基、特にＴ又はＡが高頻度で挿入されるため、標的塩基配列３の３’末から３塩基目と４塩基目との間にＡが挿入された塩基配列（配列番号：１０）を得ることができ、結果として、終始コドンであるＴＡＡを効率的に標的ＤＮＡに挿入することができる（図１の（ｂ）の四段目）。
このように、本発明の連続塩基挿入方法においては、ＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡとして、ｎ個のガイドＲＮＡの組み合わせを用い、ｎ番目のガイドＲＮＡが、標的塩基配列１にｎ－１個の塩基が挿入された標的塩基配列ｎに対して相同（すなわち、標的塩基配列ｎの相補配列に対して相補的）な標的化塩基配列ｎを含むことにより、上記の１塩基挿入をｎ回連続させることで、植物細胞の標的ＤＮＡ領域に、連続するｎ個の塩基を挿入することが可能となる。特に、本発明に係るＮｍＣａｓ９タンパク質を構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを植物細胞に導入した場合には、Ｔ又はＡの１塩基挿入頻度が高いため、終始コドンであるＴＡＡを挿入することが容易となる。
なお、図１において、ｎは３であり、３個のガイドＲＮＡは、いずれもｓｇＲＮＡとして、ＮｍＣａｓ９タンパク質と同一の発現ベクター（図１の（ａ））により植物細胞に導入されるが、本発明の連続塩基挿入方法の態様はこれに限定されるものではなく、例えば、ｎ個のガイドＲＮＡはそれぞれ別々に順次植物細胞に導入されてもよく、このときの導入と導入との間にはクローニング工程等を含んでいてもよい。ただし、本発明によれば、標的塩基配列１に対して高頻度で１塩基の挿入が起き、高頻度でｎ－１個の塩基（特に、Ｔ又はＡ）が挿入された標的塩基配列ｎを得ることができるため、これに合わせて設計したｎ個のガイドＲＮＡを同時に植物細胞に導入することによって、１回の導入操作で容易に、連続するｎ個の塩基を挿入することが可能である。
＜植物細胞のＤＮＡの塩基を置換する方法＞
本発明のＤＮＡ編集植物細胞製造方法は、他のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと組み合わせてもよい。例えば、本発明に係るＮｍＣａｓ９タンパク質を用いたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、それ以外の他のＣａｓ９タンパク質（例えば、他の細菌に由来するＣａｓ９タンパク質等）を用いたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと組み合わせて用いてもよい。
本発明のＤＮＡ編集植物細胞製造方法は、他のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと組み合わせてもよい。例えば、本発明に係るＮｍＣａｓ９タンパク質を用いたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、それ以外の他のＣａｓ９タンパク質（例えば、他の細菌に由来するＣａｓ９タンパク質等）を用いたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと組み合わせて用いてもよい。
したがって、本発明は、ＤＮＡ編集植物細胞製造方法を利用した方法として、ＮｍＣａｓ９タンパク質を用いたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムに、他のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを併用することにより、植物細胞のＤＮＡの塩基を置換する方法、例えば、
植物細胞に、ＮｍＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと、ＮｍＣａｓ９タンパク質以外の他のＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと、を導入する工程を含み、
ＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡが、塩基を挿入する標的塩基配列１に対して相同な標的化塩基配列１を含むものであり、かつ、前記他のＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡが、標的塩基配列１に１個の塩基が挿入された標的塩基配列２に対して相同な標的化塩基配列２を含むものである、
植物細胞のＤＮＡの塩基を置換する方法（以下、場合により、「塩基置換方法」という）も提供する。
植物細胞に、ＮｍＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと、ＮｍＣａｓ９タンパク質以外の他のＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと、を導入する工程を含み、
ＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡが、塩基を挿入する標的塩基配列１に対して相同な標的化塩基配列１を含むものであり、かつ、前記他のＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡが、標的塩基配列１に１個の塩基が挿入された標的塩基配列２に対して相同な標的化塩基配列２を含むものである、
植物細胞のＤＮＡの塩基を置換する方法（以下、場合により、「塩基置換方法」という）も提供する。
ＮｍＣａｓ９タンパク質以外の他のＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムとしては、１塩基欠失を起こしやすいＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムであることが好ましく、このようなＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの構成要素としての他のＣａｓ９タンパク質としては、例えば、上記表１に示すＳｐＣａｓ９タンパク質、ＳａＣａｓ９タンパク質等が挙げられ、ＳｐＣａｓ９タンパク質が好ましいが、これらに限定されるものではない。
本発明の塩基置換方法において、植物細胞、ＮｍＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム、並びに、その植物細胞への導入としては、それぞれ独立に、それらの好ましい態様も含めて、ＤＮＡ編集植物細胞製造方法において述べたとおりである。
また、本発明の塩基置換方法において、前記他のＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム、並びに、その植物細胞への導入としては、本発明に係るＮｍＣａｓ９タンパク質を用いたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにおいて、上記の典型的なＮｍＣａｓ９タンパク質を、前記他のＣａｓ９タンパク質、例えば、典型的なアミノ酸配列がＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号：Ｑ９９ＺＷ２．１で示されるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質（ＳｐＣａｓ９）に置き換え、これに対応するガイドＲＮＡを用いること以外は、ＮｍＣａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと同様であり、公知の技術によって適宜実施可能である。
図２に、本発明の塩基置換方法の態様の一例の概略図を示す。例えば、図２に示す態様においては、ＮｍＣａｓ９タンパク質（ＮｍＣａｓ９）及びそのガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ ｆｏｒ ＮｍＣａｓ９）と、ＳｐＣａｓ９タンパク質（ＳｐＣａｓ９）及びそのガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ ｆｏｒ ＳｐＣａｓ９）と、を各発現ベクター（図２の（ａ））によってそれぞれ植物細胞に導入する。
本発明の塩基置換方法においては、ＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡが、塩基を挿入する標的塩基配列１（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に対して相同（すなわち、標的塩基配列１の相補配列に対して相補的）な標的化塩基配列１を含む。つまり、本発明の塩基置換方法において、ＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡの標的化塩基配列１は、塩基を挿入する目的の部位（すなわち、標的ＤＮＡの切断部位）を含む塩基配列（標的塩基配列１）に対して相同な塩基配列である。かかるガイドＲＮＡとＮｍＣａｓ９タンパク質とを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを植物細胞に導入することにより、ＤＮＡ編集植物細胞製造方法において述べたように、標的塩基配列１のＮｍＣａｓ９タンパク質による切断箇所に高頻度で１塩基が挿入されるため、標的塩基配列１に１塩基が挿入された標的塩基配列２を得ることができる。例えば、図２の（ｂ）では、標的ＤＮＡ（配列番号：１１、図２の（ｂ）の一段目）上の、ＮｍＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列の上流３塩基目と４塩基目との間が切断され、当該切断箇所に１塩基、特にＴ又はＡが高頻度で挿入されるため、標的塩基配列１の３’末から３塩基目と４塩基目との間にＡが挿入された標的塩基配列２（配列番号：１２）を得ることができる（図２の（ｂ）の二段目）。
さらに、本発明の塩基置換方法においては、他のＣａｓ９タンパク質（図２では、ＳｐＣａｓ９タンパク質）のガイドＲＮＡが、標的塩基配列１に１塩基が挿入された標的塩基配列２に対して相同（すなわち、標的塩基配列２の相補配列に対して相補的）な標的化塩基配列２を含む。そのため、ＮｍＣａｓ９タンパク質とそのガイドＲＮＡとによって上記の標的塩基配列２が得られた場合、ＳｐＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡは、標的塩基配列２の相補配列に結合し、かつ、ＳｐＣａｓ９タンパク質と複合体を形成することで、ＳｐＣａｓ９タンパク質を標的塩基配列２に誘導し、誘導されたＳｐＣａｓ９タンパク質が、そのエンドヌクレアーゼ活性によって標的塩基配列２を切断し、当該切断箇所では比較的高頻度で１塩基が欠失する。その結果、標的塩基配列２から１塩基が欠失した塩基配列（すなわち、標的塩基配列１の１塩基が置換された塩基配列）を得ることができる。例えば、図２では、ＳｐＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列の上流３塩基目と４塩基目との間が切断され、当該切断箇所において１塩基の欠失が高頻度で起こるため、標的塩基配列２の３’末から３塩基目のＣが欠失した塩基配列（配列番号：１３）を得ることができ、結果として、標的塩基配列１の３’末から３塩基目の塩基をＣからＡに置換することができる（図２の（ｂ）の三段目）。
このように、本発明の塩基置換方法においては、ＮｍＣａｓ９タンパク質を用いたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムに、特に１塩基欠失を起こしやすいＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを組み合わせることにより、標的塩基配列への１塩基挿入後に、同標的塩基配列に存在した１塩基を欠失させることができ、効率よく塩基を置換することが可能となる。特に、本発明に係るＮｍＣａｓ９タンパク質を用いたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを植物細胞に導入した場合には、Ｔ又はＡの１塩基挿入頻度が高いため、標的塩基配列へのＴ又はＡの１塩基挿入後に、同標的塩基配列に存在した１塩基を欠失させることにより、Ａ／Ｃ／ＧからＴへ、又は、Ｃ／Ｇ／ＴからＡへ、効率よく塩基を置換することが可能となる。
なお、図２において、各ガイドＲＮＡは、いずれもｓｇＲＮＡとして、各Ｃａｓ９タンパク質とそれぞれ同一の発現ベクター（図２の（ａ））により植物細胞に導入されるが、本発明の塩基置換方法の態様はこれに限定されるものではなく、例えば、これらは全て同一の発現ベクターにより植物細胞に導入されても、ＮｍＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを植物細胞に導入した後、ＳｐＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを当該植物細胞に導入してもよく、このときの導入と導入との間にはクローニング工程等を含んでいてもよい。ただし、本発明によれば、標的塩基配列１に対して高頻度で１塩基（特に、Ｔ又はＡ）が挿入された標的塩基配列２を得ることができるため、これらを同時に植物細胞に導入することによって、１回の導入操作で容易に、塩基を置換することが可能である。
＜キット＞
また、本発明は、上記本発明の方法に用いるためのキットを提供する。本発明のキットは、（Ａ）ＮｍＣａｓ９タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、及び（Ｂ）ＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡ、該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクターを含む。前記ベクター（Ａ）と（Ｂ）とは、互いに別のベクターであっても、同一のベクターであってもよい。
また、本発明は、上記本発明の方法に用いるためのキットを提供する。本発明のキットは、（Ａ）ＮｍＣａｓ９タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、及び（Ｂ）ＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡ、該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクターを含む。前記ベクター（Ａ）と（Ｂ）とは、互いに別のベクターであっても、同一のベクターであってもよい。
植物細胞のＤＮＡに連続するｎ個の塩基を挿入する目的においては、ＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡとして、ｎ個のガイドＲＮＡの組み合わせを用いる。ここで、ｎは２以上の自然数であり、１番目のガイドＲＮＡは、塩基を挿入する標的塩基配列１に対して相同な標的化塩基配列１を含むものであり、かつ、ｎ番目のガイドＲＮＡは、標的塩基配列１にｎ－１個の塩基が挿入された標的塩基配列ｎに対して相同な標的化塩基配列ｎを含むものである。
植物細胞のＤＮＡの塩基を置換する目的において、本発明のキットは、（Ｃ）ＮｍＣａｓ９タンパク質以外の他のＣａｓ９タンパク質（例えば、ＳｐＣａｓ９タンパク質）、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、及び（Ｄ）前記他のＣａｓ９タンパク質（例えば、ＳｐＣａｓ９タンパク質）のガイドＲＮＡ、該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクターをさらに含むことが好ましい。ここで、前記ＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡは、塩基を挿入する標的塩基配列１に対して相同な標的化塩基配列１を含むものであり、前記他のＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡは、標的塩基配列１に１個の塩基が挿入された標的塩基配列２に対して相同な標的化塩基配列２を含むものである。前記ベクター（Ｃ）と（Ｄ）とは、互いに別のベクターであっても、同一のベクターであってもよい。さらに、前記ベクター（Ｃ）及び／又は（Ｄ）としては、前記ベクター（Ａ）及び／又は（Ｂ）と同一のベクターであってもよい。
また、本発明のキットは、一つ又は複数の追加の試薬をさらに含んでいてもよい。このような追加の試薬としては、例えば、希釈緩衝液、再構成溶液、洗浄緩衝液、核酸導入試薬、タンパク質導入試薬、対照試薬（例えば、対照のガイドＲＮＡ）が挙げられるが、これらに制限されるものではない。また、当該キットは、本発明の方法を実施するための使用説明書をさらに含んでいてもよい。
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
［プラスミド構築］
先ず、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）により、シロイヌナズナのコドンに最適化し、Ｎ末端側にＦＬＡＧタグ及びＳｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ４０（ＳＶ４０）由来核移行シグナルを付加したＮｍＣａｓ９タンパク質遺伝子のＤＮＡ（配列番号：３に記載のアミノ酸配列をコードする、配列番号：４に記載の塩基配列）を合成した。次いで、バイナリーベクターｐＲＩ－ＳｐＣａｓ９（Ｋａｙａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．６：２６８７１）をバックボーンとして、ＮｍＣａｓ９タンパク質（ＮｍＣａｓ９）の発現ベクターの構築を行った。すなわち、ｐＲＩ－ＳｐＣａｓ９内のカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターとシロイヌナズナのアルコール脱水素酵素遺伝子の５’－ＵＴＲ部分とを、パセリのユビキチン４－２遺伝子のプロモーター（ＰｃＵＢＩ）とイネのアルコール脱水素酵素遺伝子の５’－ＵＴＲとに、それぞれ置き換えた。また、ｐＲＩ－ＳｐＣａｓ９内のカナマイシン耐性遺伝子発現カセット（アグロバクテリウムのＮＯＳ遺伝子のプロモーターとネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）を、ハイグロマイシン耐性遺伝子発現カセット（カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターとハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）と置換して、ｐＲＩ－ＰｃＵＢＩ－ｐｒｏ：：ＳｐＣａｓ９ベクターを構築した。次いで、ｐＲＩ－ＰｃＵＢＩ－ｐｒｏ：：ＳｐＣａｓ９ベクターをＳｍａＩとＳａｃＩとで切断し、ベクター内のＳｐＣａｓ９タンパク質遺伝子のＤＮＡを上記で合成したＮｍＣａｓ９タンパク質遺伝子のＤＮＡに置き換え、ＮｍＣａｓ９発現ベクターを構築した。
［プラスミド構築］
先ず、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）により、シロイヌナズナのコドンに最適化し、Ｎ末端側にＦＬＡＧタグ及びＳｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ４０（ＳＶ４０）由来核移行シグナルを付加したＮｍＣａｓ９タンパク質遺伝子のＤＮＡ（配列番号：３に記載のアミノ酸配列をコードする、配列番号：４に記載の塩基配列）を合成した。次いで、バイナリーベクターｐＲＩ－ＳｐＣａｓ９（Ｋａｙａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．６：２６８７１）をバックボーンとして、ＮｍＣａｓ９タンパク質（ＮｍＣａｓ９）の発現ベクターの構築を行った。すなわち、ｐＲＩ－ＳｐＣａｓ９内のカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターとシロイヌナズナのアルコール脱水素酵素遺伝子の５’－ＵＴＲ部分とを、パセリのユビキチン４－２遺伝子のプロモーター（ＰｃＵＢＩ）とイネのアルコール脱水素酵素遺伝子の５’－ＵＴＲとに、それぞれ置き換えた。また、ｐＲＩ－ＳｐＣａｓ９内のカナマイシン耐性遺伝子発現カセット（アグロバクテリウムのＮＯＳ遺伝子のプロモーターとネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）を、ハイグロマイシン耐性遺伝子発現カセット（カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターとハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）と置換して、ｐＲＩ－ＰｃＵＢＩ－ｐｒｏ：：ＳｐＣａｓ９ベクターを構築した。次いで、ｐＲＩ－ＰｃＵＢＩ－ｐｒｏ：：ＳｐＣａｓ９ベクターをＳｍａＩとＳａｃＩとで切断し、ベクター内のＳｐＣａｓ９タンパク質遺伝子のＤＮＡを上記で合成したＮｍＣａｓ９タンパク質遺伝子のＤＮＡに置き換え、ＮｍＣａｓ９発現ベクターを構築した。
また、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）により、ＮｍＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列（５′－ＮＮＮＮＧＡＴＴ）及びＳｐＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列（５′－ＮＧＧ）をいずれも含むイネ内在遺伝子配列（配列番号：５に記載の塩基配列を含む配列、遺伝子ＩＤ（「ＲＡＰ－ＤＢ」、ｈｔｔｐｓ：／／ｒａｐｄｂ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／）：Ｏｓ０１ｇ０８９９２００（イネ標的ＤＮＡ＿Ａ））における、ＮｍＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列の上流の２２ヌクレオチドの標的塩基配列Ａ（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅＡ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｓｇＲＮＡ ｏｆ ＮｍＣａｓ９）に対して相同な塩基配列（標的化塩基配列）を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を合成し、ｐＯｓＵ６－ｓｇＲＮＡ＿ＳａＣａｓ９（Ｋａｙａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．６：２６８７１）内のＳａＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡと置換して、ガイドＲＮＡ発現カセットを構築した。次いで、ガイドＲＮＡ発現カセットをＢｂｓＩで切断してクローニングした。ＰａｃＩとＡｓｃＩとを利用して、クローニングしたガイドＲＮＡ発現カセットを上記のＮｍＣａｓ９発現ベクターに組み込み、ｓｇＲＮＡ－ＮｍＣａｓ９発現ベクターを構築した。
［イネカルスへの形質転換］
上記のｓｇＲＮＡ－ＮｍＣａｓ９発現ベクターを用いて、土岐らの方法（Ｔｏｋｉ（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１５：１６－２１、Ｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｐｌａｎｔ Ｊ ４７：９６９－９７６）に従い、アグロバクテリウムによるイネカルスの形質転換を行った。先ず、ｓｇＲＮＡ－ＮｍＣａｓ９発現ベクターをアグロバクテリウム（菌株：ＥＨＡ１０５）に導入し、また、胚盤由来のイネカルス（イネ：Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ． 品種：日本晴）を１か月間培養した。次いで、これらアグロバクテリウム及びイネカルスを３日間共存培養した後、２５ｍｇ／Ｌ ｍｅｒｏｐｅｎｅｍ（富士フイルム和光純薬株式会社製）溶液でカルスを洗い、５０ｍｇ／Ｌ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂと２５ｍｇ／Ｌ ｍｅｒｏｐｅｎｅｍとを含む培地で４～５週間培養した。
上記のｓｇＲＮＡ－ＮｍＣａｓ９発現ベクターを用いて、土岐らの方法（Ｔｏｋｉ（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１５：１６－２１、Ｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｐｌａｎｔ Ｊ ４７：９６９－９７６）に従い、アグロバクテリウムによるイネカルスの形質転換を行った。先ず、ｓｇＲＮＡ－ＮｍＣａｓ９発現ベクターをアグロバクテリウム（菌株：ＥＨＡ１０５）に導入し、また、胚盤由来のイネカルス（イネ：Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ． 品種：日本晴）を１か月間培養した。次いで、これらアグロバクテリウム及びイネカルスを３日間共存培養した後、２５ｍｇ／Ｌ ｍｅｒｏｐｅｎｅｍ（富士フイルム和光純薬株式会社製）溶液でカルスを洗い、５０ｍｇ／Ｌ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂと２５ｍｇ／Ｌ ｍｅｒｏｐｅｎｅｍとを含む培地で４～５週間培養した。
［ＣＡＰＳ解析］
形質転換後、４～５週間培養したイネカルス、２４個のサンプルについて、簡易ＤＮＡ抽出法（Ｋａｓａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．２２：４９－５２）によりゲノムＤＮＡを抽出した。ＫＯＤ－ＦＸ ｎｅｏ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡株式会社製）を用いて、標的塩基配列（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅＡ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｓｇＲＮＡ ｏｆ ＮｍＣａｓ９）をＰＣＲ法により増幅した。得られたＰＣＲ産物を、ＳａｃＩによる制限酵素処理で一晩切断し、ＭＣＥ－２０２ ＭｕｌｔｉＮＡ ｗｉｔｈ ａ ＤＮＡ－５００ ｋｉｔ（株式会社島津製作所製）を用いて、ＣＡＰＳ（Ｃｌｅａｖｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）法により、前記標的塩基配列に変異が導入されているかを調べた。
形質転換後、４～５週間培養したイネカルス、２４個のサンプルについて、簡易ＤＮＡ抽出法（Ｋａｓａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．２２：４９－５２）によりゲノムＤＮＡを抽出した。ＫＯＤ－ＦＸ ｎｅｏ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡株式会社製）を用いて、標的塩基配列（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅＡ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｓｇＲＮＡ ｏｆ ＮｍＣａｓ９）をＰＣＲ法により増幅した。得られたＰＣＲ産物を、ＳａｃＩによる制限酵素処理で一晩切断し、ＭＣＥ－２０２ ＭｕｌｔｉＮＡ ｗｉｔｈ ａ ＤＮＡ－５００ ｋｉｔ（株式会社島津製作所製）を用いて、ＣＡＰＳ（Ｃｌｅａｖｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）法により、前記標的塩基配列に変異が導入されているかを調べた。
［シークエンス解析］
ＣＡＰＳ解析で変異導入が確認された系統について、上記のＣＡＰＳ解析と同様にして得られた標的塩基配列Ａ（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅＡ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｓｇＲＮＡ ｏｆ ＮｍＣａｓ９）のＰＣＲ産物をｐＣＲ－ｂｌｕｎｔＩＩ－ＴＯＰＯ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にクローニングした。このプラスミドはＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を利用して塩基配列を解読した。シークエンスデータはＳｎａｐＧｅｎｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＳＬ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＬＬＣ社製）を用いて解析した。
ＣＡＰＳ解析で変異導入が確認された系統について、上記のＣＡＰＳ解析と同様にして得られた標的塩基配列Ａ（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅＡ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｓｇＲＮＡ ｏｆ ＮｍＣａｓ９）のＰＣＲ産物をｐＣＲ－ｂｌｕｎｔＩＩ－ＴＯＰＯ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にクローニングした。このプラスミドはＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を利用して塩基配列を解読した。シークエンスデータはＳｎａｐＧｅｎｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＳＬ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＬＬＣ社製）を用いて解析した。
（比較例１）
賀屋らの方法（Ｋａｙａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．６：２６８７１）に従い、ｓｇＲＮＡ－ＳｐＣａｓ９発現ベクターを構築した。ｓｇＲＮＡにおいて、標的化塩基配列は、イネ標的ＤＮＡ＿Ａにおける、ＳｐＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列の上流の２０ヌクレオチドの標的塩基配列Ａ（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅＡ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｓｇＲＮＡ ｏｆ ＳｐＣａｓ９）に対して相同な塩基配列を含む配列とした。また、かかるｓｇＲＮＡ－ＳｐＣａｓ９発現ベクターを用いたこと以外は実施例１と同様にしてイネカルスへの形質転換を行い、２４個のサンプルについて、ＣＡＰＳ解析及びシークエンス解析を行った。
賀屋らの方法（Ｋａｙａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．６：２６８７１）に従い、ｓｇＲＮＡ－ＳｐＣａｓ９発現ベクターを構築した。ｓｇＲＮＡにおいて、標的化塩基配列は、イネ標的ＤＮＡ＿Ａにおける、ＳｐＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列の上流の２０ヌクレオチドの標的塩基配列Ａ（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅＡ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｓｇＲＮＡ ｏｆ ＳｐＣａｓ９）に対して相同な塩基配列を含む配列とした。また、かかるｓｇＲＮＡ－ＳｐＣａｓ９発現ベクターを用いたこと以外は実施例１と同様にしてイネカルスへの形質転換を行い、２４個のサンプルについて、ＣＡＰＳ解析及びシークエンス解析を行った。
（実施例２）
ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の標的化塩基配列を、ＮｍＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列及びＳｐＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列を含むイネ内在遺伝子配列（配列番号：６に記載の塩基配列を含む配列、遺伝子ＩＤ（「ＲＡＰ－ＤＢ」、ｈｔｔｐｓ：／／ｒａｐｄｂ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／）：Ｏｓ０７ｇ０５８３８００のプロモーター配列（イネ標的ＤＮＡ＿Ｂ））における、ＮｍＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列の上流の２２ヌクレオチドの標的塩基配列Ｂ（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅＢ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｓｇＲＮＡ ｏｆ ＮｍＣａｓ９）に対して相同な塩基配列としたこと以外は実施例１と同様にして、ｓｇＲＮＡ－ＮｍＣａｓ９発現ベクターを構築した。
ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の標的化塩基配列を、ＮｍＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列及びＳｐＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列を含むイネ内在遺伝子配列（配列番号：６に記載の塩基配列を含む配列、遺伝子ＩＤ（「ＲＡＰ－ＤＢ」、ｈｔｔｐｓ：／／ｒａｐｄｂ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／）：Ｏｓ０７ｇ０５８３８００のプロモーター配列（イネ標的ＤＮＡ＿Ｂ））における、ＮｍＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列の上流の２２ヌクレオチドの標的塩基配列Ｂ（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅＢ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｓｇＲＮＡ ｏｆ ＮｍＣａｓ９）に対して相同な塩基配列としたこと以外は実施例１と同様にして、ｓｇＲＮＡ－ＮｍＣａｓ９発現ベクターを構築した。
また、かかるｓｇＲＮＡ－ＮｍＣａｓ９発現ベクターを用いたこと以外は実施例１と同様にしてイネカルスへの形質転換を行い、２４個のサンプルについて、ＣＡＰＳ解析及びシークエンス解析を行った。なお、ＣＡＰＳ解析において、イネ標的ＤＮＡ＿Ｂの切断には、ＳａｃＩに代えてＸｈｏＩを用いた。
（比較例２）
ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の標的化塩基配列を、イネ標的ＤＮＡ＿Ｂにおける、ＳｐＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列の上流の２０ヌクレオチドの標的塩基配列Ｂ（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅＢ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｓｇＲＮＡ ｏｆ ＳｐＣａｓ９）に対して相同な塩基配列としたこと以外は比較例１と同様にして、ｓｇＲＮＡ－ＳｐＣａｓ９発現ベクターを構築した。また、かかるｓｇＲＮＡ－ＳｐＣａｓ９発現ベクターを用いたこと以外は実施例２と同様にしてイネカルスへの形質転換を行い、２４個のサンプルについて、ＣＡＰＳ解析及びシークエンス解析を行った。
ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の標的化塩基配列を、イネ標的ＤＮＡ＿Ｂにおける、ＳｐＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列の上流の２０ヌクレオチドの標的塩基配列Ｂ（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅＢ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｓｇＲＮＡ ｏｆ ＳｐＣａｓ９）に対して相同な塩基配列としたこと以外は比較例１と同様にして、ｓｇＲＮＡ－ＳｐＣａｓ９発現ベクターを構築した。また、かかるｓｇＲＮＡ－ＳｐＣａｓ９発現ベクターを用いたこと以外は実施例２と同様にしてイネカルスへの形質転換を行い、２４個のサンプルについて、ＣＡＰＳ解析及びシークエンス解析を行った。
実施例１～２及び比較例１～２においてＣＡＰＳ解析を行った結果、イネ標的ＤＮＡ＿Ａ及びイネ標的ＤＮＡ＿Ｂのいずれにおいても、ＳｐＣａｓ９タンパク質とＮｍＣａｓ９タンパク質とでは、変異導入効率には大きな差は見られなかった。
他方、シークエンス解析を行った結果を図３～４に示す。図３～４に示すように、イネ標的ＤＮＡ＿Ａ及びイネ標的ＤＮＡ＿Ｂのいずれにおいても、ＳｐＣａｓ９タンパク質を導入した場合（比較例１、２）と比較して、ＮｍＣａｓ９タンパク質を導入した場合（実施例１、２）では、１塩基、特に、Ａ又はＴの挿入が高頻度で生じたことが確認された。
図３～４には、それぞれ、イネ標的ＤＮＡ＿Ａの配列の一部（図３のＷＴ、配列番号：５）又はイネ標的ＤＮＡ＿Ｂの一部（図４のＷＴ、配列番号：６）の配列と、当該ＷＴの配列に塩基の挿入／欠失（ｉｎｄｅｌ）が起きた配列とをそれぞれ示し、また、かかる塩基の挿入／欠失が起きた頻度（当該変異の起きたサンプル数＊１００／全サンプル数（％））をそれぞれ示す。なお、図３～４中、太字で示す塩基配列は、それぞれ、各標的塩基配列（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅＡ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｓｇＲＮＡ ｏｆ ＮｍＣａｓ９、ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅＡ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｓｇＲＮＡ ｏｆ ＳｐＣａｓ９、ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅＢ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｓｇＲＮＡ ｏｆ ＮｍＣａｓ９、又はｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅＢ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｓｇＲＮＡ ｏｆ ＳｐＣａｓ９（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ））を示し、下線で示す塩基配列は、それぞれ、各Ｃａｓ９タンパク質（ＮｍＣａｓ９タンパク質又はＳｐＣａｓ９タンパク質）のＰＡＭ配列を示し、小文字で示す塩基は、挿入のあった塩基を示す。
（実施例３ ３塩基挿入による終止コドンの挿入）
ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の標的化塩基配列を、ＮｍＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列を含むイネ内在遺伝子配列（配列番号：７に記載の塩基配列を含む配列、遺伝子ＩＤ（「ＲＡＰ－ＤＢ」、ｈｔｔｐｓ：／／ｒａｐｄｂ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／）：Ｏｓ１２ｇ０２２４０００のイントロン（イネ標的ＤＮＡ＿Ｃ））における、ＮｍＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列の上流の２２ヌクレオチドの標的塩基配列１（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ１ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｓｇＲＮＡ１ ｏｆ ＮｍＣａｓ９）に対して相同な塩基配列としたこと以外は実施例１と同様にして、ガイドＲＮＡ１（ｓｇＲＮＡ１）発現カセットを構築した。また、ガイドＲＮＡの標的化塩基配列を、標的塩基配列１の２～２２ヌクレオチドの配列の３’末から３塩基目と４塩基目との間にＴが挿入された標的塩基配列２（配列番号：８に記載の塩基配列）に対して相同な塩基配列としたこと以外は実施例１と同様にして、ガイドＲＮＡ２（ｓｇＲＮＡ２）発現カセットを構築した。さらに、ガイドＲＮＡの標的化塩基配列を、標的塩基配列２の２～２２ヌクレオチドの配列の３’末から３塩基目と４塩基目との間にＡが挿入された標的塩基配列３（配列番号：９に記載の塩基配列）に対して相同な塩基配列としたこと以外は実施例１と同様にして、ガイドＲＮＡ３（ｓｇＲＮＡ３）発現カセットを構築した。次いで、これらをいずれも用いたこと以外は実施例１と同様にして、ｓｇＲＮＡ１－ｓｇＲＮＡ２－ｓｇＲＮＡ３－ＮｍＣａｓ９発現ベクターを構築した。
ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の標的化塩基配列を、ＮｍＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列を含むイネ内在遺伝子配列（配列番号：７に記載の塩基配列を含む配列、遺伝子ＩＤ（「ＲＡＰ－ＤＢ」、ｈｔｔｐｓ：／／ｒａｐｄｂ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／）：Ｏｓ１２ｇ０２２４０００のイントロン（イネ標的ＤＮＡ＿Ｃ））における、ＮｍＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列の上流の２２ヌクレオチドの標的塩基配列１（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ１ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｓｇＲＮＡ１ ｏｆ ＮｍＣａｓ９）に対して相同な塩基配列としたこと以外は実施例１と同様にして、ガイドＲＮＡ１（ｓｇＲＮＡ１）発現カセットを構築した。また、ガイドＲＮＡの標的化塩基配列を、標的塩基配列１の２～２２ヌクレオチドの配列の３’末から３塩基目と４塩基目との間にＴが挿入された標的塩基配列２（配列番号：８に記載の塩基配列）に対して相同な塩基配列としたこと以外は実施例１と同様にして、ガイドＲＮＡ２（ｓｇＲＮＡ２）発現カセットを構築した。さらに、ガイドＲＮＡの標的化塩基配列を、標的塩基配列２の２～２２ヌクレオチドの配列の３’末から３塩基目と４塩基目との間にＡが挿入された標的塩基配列３（配列番号：９に記載の塩基配列）に対して相同な塩基配列としたこと以外は実施例１と同様にして、ガイドＲＮＡ３（ｓｇＲＮＡ３）発現カセットを構築した。次いで、これらをいずれも用いたこと以外は実施例１と同様にして、ｓｇＲＮＡ１－ｓｇＲＮＡ２－ｓｇＲＮＡ３－ＮｍＣａｓ９発現ベクターを構築した。
また、上記のｓｇＲＮＡ１－ｓｇＲＮＡ２－ｓｇＲＮＡ３－ＮｍＣａｓ９発現ベクターを用いたこと以外は実施例１と同様にしてイネカルスへの形質転換を行い、３４４個のサンプルについて、ＣＡＰＳ解析及びシークエンス解析を行った。なお、ＣＡＰＳ解析において、イネ標的ＤＮＡ＿Ｃの切断には、ＳａｃＩに代えてＨｐａＩを用いた。
シークエンス解析を行った結果を下記の表２に示す。表２には、イネ標的ＤＮＡ＿Ｃ（ＷＴ、変異なし）の配列に塩基の挿入／欠失（ｉｎｄｅｌ）が起きた頻度（当該変異の起きたサンプル数＊１００／全サンプル数（％））もそれぞれ示す。表２に示すように、３塩基が導入された頻度は合計で２６．２％であり、また、それらのうち、目的の３塩基（ＴＡＡ又はＴＡＴ）が導入された頻度は８８．９％と、高いものであった。そのため、ＮｍＣａｓ９タンパク質と、標的塩基配列を１塩基ずつずらした３種類のガイドＲＮＡとを組み合わせて用いることにより、図１に示した系によって高精度で３塩基の導入ができ、終止コドンを導入できることが確認された。
（実施例４ １塩基の挿入と隣接する１塩基の欠失による塩基置換）
［プラスミド構築］
・ＮｍＣａｓ９発現ベクター：実施例１で構築したｓｇＲＮＡ－ＮｍＣａｓ９発現ベクター［ｓｇＲＮＡ ｆｏｒ ＮｍＣａｓ９（標的化塩基配列：イネ標的ＤＮＡ＿Ａにおける標的塩基配列Ａ（図２では標的塩基配列１）に対して相同な塩基配列）＋ＮｍＣａｓ９］を用いた。
［プラスミド構築］
・ＮｍＣａｓ９発現ベクター：実施例１で構築したｓｇＲＮＡ－ＮｍＣａｓ９発現ベクター［ｓｇＲＮＡ ｆｏｒ ＮｍＣａｓ９（標的化塩基配列：イネ標的ＤＮＡ＿Ａにおける標的塩基配列Ａ（図２では標的塩基配列１）に対して相同な塩基配列）＋ＮｍＣａｓ９］を用いた。
・ＳｐＣａｓ９発現ベクター：先ず、ｐＺＨ＿ＭＭＣａｓ９（Ｍｉｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８８－５６１）をバックボーンとして、トウモロコシのユビキチン遺伝子のプロモーターでＳｐＣａｓ９を発現させ、植物の選抜用抗生物質マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子発現カセット（カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターとネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）を有するバイナリーベクターを構築した。また、ガイドＲＮＡの標的化塩基配列を、イネ標的ＤＮＡ＿Ａにおける、ＳｐＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列の上流の１９ヌクレオチドの３’末から３塩基目と４塩基目との間にＡが挿入された、２０ヌクレオチドの標的塩基配列２（配列番号：１２に記載の塩基配列）に対して相同な塩基配列としたこと以外は実施例１と同様にして、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ ｆｏｒ ＳｐＣａｓ９）発現カセットを構築した。これを鋳型として、Ｆ－プライマー（配列番号：１４に記載の塩基配列）及びＲ－プライマー（配列番号：１５に記載の塩基配列）を用いて、ＰＣＲにより、前記ガイドＲＮＡ発現カセットを増幅した。上記で構築したバイナリーベクターをＡｓｃＩで切断後、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（クロンテック社）を用いて前記ガイドＲＮＡ発現カセットのＰＣＲ産物をクローニングし、ＳｐＣａｓ９発現ベクターを構築した。
［イネカルスへの形質転換］
上記のＮｍＣａｓ９発現ベクター及びＳｐＣａｓ９発現ベクターを用い、カルス選抜のための培養を、３５ｍｇ／Ｌ Ｇ４１８と２５ｍｇ／Ｌ ｍｅｒｏｐｅｎｅｍとを含む培地において２週間培養としたこと以外は実施例１と同様にして、イネカルスの形質転換を行った。
上記のＮｍＣａｓ９発現ベクター及びＳｐＣａｓ９発現ベクターを用い、カルス選抜のための培養を、３５ｍｇ／Ｌ Ｇ４１８と２５ｍｇ／Ｌ ｍｅｒｏｐｅｎｅｍとを含む培地において２週間培養としたこと以外は実施例１と同様にして、イネカルスの形質転換を行った。
［シークエンス解析］
形質転換後、２週間培養したイネカルス２４個のサンプルについて、実施例１と同様にして標的塩基配列をＰＣＲ法により増幅した。得られたＰＣＲ産物について、ダイレクトシークエンス法によって直接シークエンス解析を行った。
形質転換後、２週間培養したイネカルス２４個のサンプルについて、実施例１と同様にして標的塩基配列をＰＣＲ法により増幅した。得られたＰＣＲ産物について、ダイレクトシークエンス法によって直接シークエンス解析を行った。
ダイレクトシークエンス解析で塩基置換が確認された系統について、シークエンス解析を行った結果を下記の表３に示す。表３に示すように、イネ標的ＤＮＡ＿Ａ（ＷＴ、変異なし）の配列にＡ又はＣの塩基の挿入が起きた頻度（当該変異の起きたサンプル数＊１００／全サンプル数（％））は、合計で４４．２％であった。他方、目的とした、ＣからＡへの塩基置換が起きた頻度は３７．２％であった。このことから、ＮｍＣａｓ９による１塩基挿入とＳｐＣａｓ９による１塩基欠失とを組み合わせることで目的とする塩基置換を高精度で導入できることが確認された。
以上説明したように、本発明によれば、高頻度で１塩基を挿入することができ、高精度のＤＮＡ編集が可能な、ＤＮＡが編集された植物細胞を製造する方法、及びそれに用いるキットを提供することが可能となる。
また、本発明によれば、特に１塩基欠失を起こしやすいＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを併用して、標的塩基配列への１塩基挿入後に、同標的塩基配列に存在した１塩基を欠失させることにより、効率よく塩基を置換することも可能となる。
本発明は、基礎から応用まで様々な研究で利用され得る。特に、３塩基の導入を制御可能な塩基置換技術は、従来の遺伝子を破壊する標的変異と比べて、遺伝子の破壊のみならず遺伝子機能を改変することが可能であり、ニーズが極めて高いと考えられる。よって、新しい形質を付与した農林水産物の開発や、遺伝子治療等、現在、ＤＮＡの編集技術が積極的に利用されている研究開発分野における新しい方法として広く利用することができる。
配列番号：３
＜２２３＞ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９の改変配列
配列番号：４
＜２２３＞ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９の改変配列
配列番号：５
＜２２３＞ ＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡに対応する標的塩基配列Ａ
＜２２３＞ ＳｐＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡに対応する標的塩基配列Ａ
配列番号：６
＜２２３＞ ＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡに対応する標的塩基配列Ｂ
＜２２３＞ ＳｐＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡに対応する標的塩基配列Ｂ
配列番号：７
＜２２３＞ ＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡ１に対応する標的塩基配列１
配列番号：８
＜２２３＞ ＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡ２に対応する標的塩基配列２
配列番号：９
＜２２３＞ ＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡ３に対応する標的塩基配列３
配列番号：１０
＜２２３＞ ＴＡＡが挿入された標的ＤＮＡ
配列番号：１１
＜２２３＞ ＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡに対応する標的塩基配列１
配列番号：１２
＜２２３＞ ＳｐＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡに対応する標的塩基配列２
配列番号：１３
＜２２３＞ ＣがＡに置換された標的ＤＮＡ
配列番号：１４
＜２２３＞ Ｆ－プライマー
配列番号：１５
＜２２４＞ Ｒ－プライマー
＜２２３＞ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９の改変配列
配列番号：４
＜２２３＞ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９の改変配列
配列番号：５
＜２２３＞ ＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡに対応する標的塩基配列Ａ
＜２２３＞ ＳｐＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡに対応する標的塩基配列Ａ
配列番号：６
＜２２３＞ ＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡに対応する標的塩基配列Ｂ
＜２２３＞ ＳｐＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡに対応する標的塩基配列Ｂ
配列番号：７
＜２２３＞ ＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡ１に対応する標的塩基配列１
配列番号：８
＜２２３＞ ＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡ２に対応する標的塩基配列２
配列番号：９
＜２２３＞ ＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡ３に対応する標的塩基配列３
配列番号：１０
＜２２３＞ ＴＡＡが挿入された標的ＤＮＡ
配列番号：１１
＜２２３＞ ＮｍＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡに対応する標的塩基配列１
配列番号：１２
＜２２３＞ ＳｐＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡに対応する標的塩基配列２
配列番号：１３
＜２２３＞ ＣがＡに置換された標的ＤＮＡ
配列番号：１４
＜２２３＞ Ｆ－プライマー
配列番号：１５
＜２２４＞ Ｒ－プライマー
Claims (8)
- ＤＮＡに連続するｎ個の塩基が挿入された植物細胞を製造する方法であり、植物細胞に、Ｃａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを導入する工程を含み、
前記Ｃａｓ９タンパク質がＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来であり、
前記ガイドＲＮＡがｎ個のガイドＲＮＡの組み合わせであり、
ｎが２以上の自然数であり、
１番目のガイドＲＮＡが、塩基を挿入する標的塩基配列１に対して相同な標的化塩基配列１を含むものであり、かつ、ｎ番目のガイドＲＮＡが、標的塩基配列１にｎ－１個の塩基が挿入された標的塩基配列ｎに対して相同な標的化塩基配列ｎを含むものである、
方法。 - ＤＮＡの塩基が置換された植物細胞を製造する方法であり、植物細胞に、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質以外の他のＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと、を導入する工程を含み、
前記Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡが、塩基を挿入する標的塩基配列１に対して相同な標的化塩基配列１を含むものであり、かつ、前記他のＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡが、標的塩基配列１に１個の塩基が挿入された標的塩基配列２に対して相同な標的化塩基配列２を含むものである、
方法。 - 植物細胞のＤＮＡに連続するｎ個の塩基を挿入する方法であり、植物細胞に、Ｃａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを導入する工程を含み、
前記Ｃａｓ９タンパク質がＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来であり、
前記ガイドＲＮＡがｎ個のガイドＲＮＡの組み合わせであり、
ｎが２以上の自然数であり、
１番目のガイドＲＮＡが、塩基を挿入する標的塩基配列１に対して相同な標的化塩基配列１を含むものであり、かつ、ｎ番目のガイドＲＮＡが、標的塩基配列１にｎ－１個の塩基が挿入された標的塩基配列ｎに対して相同な標的化塩基配列ｎを含むものである、
方法。 - 植物細胞のＤＮＡの塩基を置換する方法であり、植物細胞に、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質以外の他のＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと、を導入する工程を含み、
前記Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡが、塩基を挿入する標的塩基配列１に対して相同な標的化塩基配列１を含むものであり、かつ、前記他のＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡが、標的塩基配列１に１個の塩基が挿入された標的塩基配列２に対して相同な標的化塩基配列２を含むものである、
方法。 - 前記植物細胞がイネ細胞である、請求項１～４のうちのいずれか一項に記載の方法。
- ＤＮＡに連続するｎ個の塩基が挿入された植物細胞の製造に用いるためのキットであり、
以下の（Ａ）及び（Ｂ）：
（Ａ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、
（Ｂ）前記Ｃａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡ、該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、
を含み、
前記ガイドＲＮＡがｎ個のガイドＲＮＡの組み合わせであり、
ｎが２以上の自然数であり、
１番目のガイドＲＮＡが、塩基を挿入する標的塩基配列１に対して相同な標的化塩基配列１を含むものであり、かつ、ｎ番目のガイドＲＮＡが、標的塩基配列１にｎ－１個の塩基が挿入された標的塩基配列ｎに対して相同な標的化塩基配列ｎを含むものである、
キット。 - ＤＮＡの塩基が置換された植物細胞の製造に用いるためのキットであり、
以下の（Ａ）及び（Ｂ）：
（Ａ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、
（Ｂ）前記Ｃａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡ、該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、
を含み、
以下の（Ｃ）及び（Ｄ）：
（Ｃ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質以外の他のＣａｓ９タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、
（Ｄ）前記他のＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡ、該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、
をさらに含み、
前記Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡが、塩基を挿入する標的塩基配列１に対して相同な標的化塩基配列１を含むものであり、かつ、前記他のＣａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡが、標的塩基配列１に１個の塩基が挿入された標的塩基配列２に対して相同な標的化塩基配列２を含むものである、
キット。 - 前記植物細胞がイネ細胞である、請求項６又は７に記載のキット。
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| JAGANATHAN D.et al.，Frontiers in Plant Science，2018年，doi:10.3389/fpls.2018.00985 |
| Molecular Cell，2019年02月，Vol.73，p.714-726 |
| 刑部 敬史，人工制限酵素を用いた高効率イネ葉緑体ゲノム編集の確立，科学研究費助成事業 研究成果報告書，2016年 |
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