CN116445463B - 新型植物碱基编辑器pAYBEs - Google Patents

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Abstract

本发明公开了新型植物碱基编辑器pAYBEs。本发明通过将腺嘌呤碱基编辑器与hMPG融合，在植物中建立了第一代A‑to‑Y单碱基编辑***pAYBEv1，进一步通过将hMPG替换为mhMPG建立了第二代A‑to‑Y单碱基编辑***pAYBEv2，在此基础上，又通过将反式激活因子Vp64分别融合在pAYBEv1和pAYBEv2中的TadA8e‑nCas9(D10A)的N端，建立了第三代单碱基编辑***pAYBEv3和***单碱基编辑***pAYBEv4。本发明构建的植物AYBE单碱基编辑***不仅丰富了植物单碱基编辑工具箱，也为水稻和其它农作物重要基因功能分析和遗传改良提供重要技术支撑。

Description

新型植物碱基编辑器pAYBEs
技术领域
本发明属于分子育种领域，具体涉及新型植物碱基编辑器pAYBEs，特别涉及可实现植物基因组中单个碱基由腺嘌呤(A)颠换为胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)的植物A-to-Y单碱基编辑器pAYBEs及其应用。
背景技术
在植物中许多重要的农艺性状是由基因组序列的一个或少数几个碱基的变化引起的。胞嘧啶碱基编辑器(CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE)分别可以在编辑窗口内实现由胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)到鸟嘌呤(G)的单个碱基转换。目前，胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器已经广泛应用于农作物重要基因功能验证和农作物改良。此外，使用尿嘧啶DNA糖基化酶替换尿嘧啶糖基化酶抑制剂基因，还开发出了可以实现胞嘧啶(C)颠换为鸟嘌呤(G)的CGBE技术，并在植物中进行了应用。
近期，在腺嘌呤碱基编辑器基础之上，添加人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hMPG)，开发了适宜动物细胞使用的AYBE***，在动物细胞系中可以实现靶标序列中腺嘌呤(A)到Y(Y＝胞嘧啶C或胸腺嘧啶T)的单碱基颠换。具体地，将人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hMPG)与腺嘌呤编辑器融合，在靶点处诱导腺嘌呤脱氨形成肌苷，然后在糖基化酶作用下，移除肌苷产生AP位点(Apurinic site)，经基因组错配修复后，可实现腺嘌呤(A)到胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)的颠换(图1)。研发植物AYBE***(pAYBE)将极大地拓展碱基编辑在农作物基因功能分析和遗传改良中的应用范围和潜力。然而，目前在植物中还没有关于植物AYBE***的报道和文献记载。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何在植物中实现靶标序列中腺嘌呤(A)到Y(Y＝胞嘧啶C或胸腺嘧啶T)的单碱基颠换。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了成套***。
所述成套***为如下M1)-M4)中任一种：
M1)所述成套***包括腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG和gRNA；
M2)所述成套***包括腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶七突突变体mhMPG和gRNA；
M3)所述成套***包括反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG和gRNA；
M4)所述成套***包括反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶七突突变体mhMPG和gRNA；
所述人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶七突突变体mhMPG为将所述人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG氨基酸序列的第163位由甘氨酸突变为精氨酸，且将第169位由天冬酰胺突变为丝氨酸，且将第198位由丝氨酸突变为丙氨酸，且将第202位由赖氨酸突变为丙氨酸，且将第203位由甘氨酸突变为丙氨酸，且将第206位由丝氨酸突变为丙氨酸，且将第210位由赖氨酸突变为丙氨酸后得到的蛋白质。
上述成套***中，所述腺嘌呤脱氨酶TadA8e为A1)或A2)：
A1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
A2)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
所述腺嘌呤脱氨酶TadA8e的编码基因为a1)或a2)：
a1)序列1第2062-2559位所示的DNA分子；
a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述腺嘌呤脱氨酶TadA8e的DNA分子。
所述Cas9(D10A)缺刻酶为B1)或B2)：
B1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
B2)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
所述Cas9(D10A)缺刻酶的编码基因为b1)或b2)：
b1)序列1第2656-6756位所示的DNA分子；
b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述Cas9(D10A)缺刻酶的DNA分子。
所述人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG为C1)或C2)：
C1)氨基酸序列是序列6所示的蛋白质；
C2)将序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
所述人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG的编码基因为c1)或c2)：
c1)序列7所示的DNA分子；
c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG的DNA分子。
所述反式激活因子Vp64为D1)或D2)：
D1)氨基酸序列是序列9所示的蛋白质；
D2)将序列9所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
所述反式激活因子Vp64的编码基因为d1)或d2)：
d1)序列8第1-150位所示的DNA分子；
d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述反式激活因子Vp64的DNA分子。
所述gRNA靶向靶点序列；所述gRNA依次由所述靶点序列转录的RNA和gRNA骨架组成，所述gRNA骨架为将序列1第7854-7929位中的T替换为U后得到的RNA分子。
上述成套***中，所述M1)的成套***包括依次由腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶和人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG融合而成的融合蛋白和gRNA；
所述M2)中的成套***包括依次由腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶和人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶七突突变体mhMPG融合而成的融合蛋白和gRNA；
所述M3)中的成套***包括依次由反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶和人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG融合而成的融合蛋白和gRNA；
所述M4)中的成套***包括依次由反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶和人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶七突突变体mhMPG融合而成的融合蛋白和gRNA。
进一步的，所述M1)的成套***包括依次由核定位信号、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG和核定位信号融合而成的融合蛋白和gRNA；
所述M2)中的成套***包括依次由核定位信号、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶七突突变体mhMPG和核定位信号融合而成的融合蛋白和gRNA；
所述M3)中的成套***包括依次由核定位信号、反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG和核定位信号融合而成的融合蛋白和gRNA；
所述M4)中的成套***包括依次由核定位信号、反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶七突突变体mhMPG和核定位信号融合而成的融合蛋白和gRNA。
更进一步的，所述成套***还包括筛选剂抗性蛋白。所述筛选剂抗性蛋白可为本技术领域中公知的各种抗性蛋白，如卡那霉素抗性蛋白、除草剂抗性蛋白、磷酸甘露糖异构酶等。
所述M1)的成套***包括依次由核定位信号、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG和核定位信号融合而成的融合蛋白、gRNA和筛选剂抗性蛋白；
所述M2)中的成套***包括依次由核定位信号、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶七突突变体mhMPG和核定位信号融合而成的融合蛋白、gRNA和筛选剂抗性蛋白；
所述M3)中的成套***包括依次由核定位信号、反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG和核定位信号融合而成的融合蛋白、gRNA和筛选剂抗性蛋白；
所述M4)中的成套***包括依次由核定位信号、反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶七突突变体mhMPG和核定位信号融合而成的融合蛋白、gRNA和筛选剂抗性蛋白。
在本发明的一个具体实施例中，所述筛选剂抗性蛋白为潮霉素磷酸转移酶；所述潮霉素磷酸转移酶为E1)或E2)：
E1)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；
E2)将序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
所述潮霉素磷酸转移酶的编码基因为e1)或e2)：
e1)序列1第9018-10043位所示的DNA分子；
e2)与e1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述潮霉素磷酸转移酶的DNA分子。
所述核定位信号为核定位信号NLS。所述核定位信号NLS为F1)或F2)：
F1)氨基酸序列是序列10所示的蛋白质；
F2)将序列10所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
所述核定位信号NLS的编码基因为f1)或f2)：
f1)序列1第2017-2037位所示的DNA分子；
f2)与f1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述核定位信号NLS的DNA分子。
上述任一所述蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过9个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过8个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过7个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过6个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过4个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过3个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过2个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过1个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述任一所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述任一所述编码基因中的同一性是指与天然核酸序列的序列相似性。所述同一性包括与本发明的编码序列2、序列3、序列4、序列6、序列9所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或91％或更高，或92％或更高，或93％或更高，或94％或更高，或95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述成套***中，所述M1)的成套***包括依次由核定位信号、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG和核定位信号融合而成的融合蛋白表达盒、gRNA表达盒和筛选剂抗性蛋白表达盒；
所述M2)中的成套***包括依次由核定位信号、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶七突突变体mhMPG和核定位信号融合而成的融合蛋白表达盒、gRNA表达盒和筛选剂抗性蛋白表达盒；
所述M3)中的成套***包括依次由核定位信号、反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG和核定位信号融合而成的融合蛋白表达盒、gRNA表达盒和筛选剂抗性蛋白表达盒；
所述M4)中的成套***包括依次由核定位信号、反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶七突突变体mhMPG和核定位信号融合而成的融合蛋白表达盒、gRNA表达盒和筛选剂抗性蛋白表达盒。
进一步的，在所述成套***的融合蛋白表达盒中，所述融合蛋白由Ubi启动子驱动表达。所述Ubi启动子的核苷酸序列如序列1第1-1992位所示。
在所述成套***的gRNA表达盒中，所述gRNA由OsU3启动子驱动表达。所述OsU3启动子的核苷酸序列如序列1第7453-7833位所示。
在所述成套***的筛选标记蛋白表达盒中，所述筛选标记蛋白由35S启动子驱动表达。所述35S启动子的核苷酸序列如序列1第8296-8973位所示。
更进一步的，所述成套***由重组载体进行表达。所述成套***包括的各个元件或各个表达盒可通过同一个载体进行表达，也可以通过多个载体进行表达。
在本发明的一个具体实施例中，所述M1)的成套***通过下文中的重组载体pAYBEv1-hMPG-OsDEP1、重组载体pAYBEv1-hMPG-OsEPSPS、重组载体pAYBEv1-hMPG-OsNRT1.1B、重组载体pAYBEv1-hMPG-OsWaxy-T1、重组载体pAYBEv1-hMPG-OsWaxy-T2或重组载体pAYBEv1-hMPG-OsWaxy-T3进行表达。
所述M2)的成套***通过下文中的重组载体pAYBEv2-mhMPG-OsDEP1、重组载体pAYBEv2-mhMPG-OsEPSPS、重组载体pAYBEv2-mhMPG-OsNRT1.1B、重组载体pAYBEv2-mhMPG-OsWaxy-T1、重组载体pAYBEv2-mhMPG-OsWaxy-T2或重组载体pAYBEv2-mhMPG-OsWaxy-T3进行表达。
所述M3)的成套***通过下文中的重组载体pAYBEv3-hMPG-VP64-OsDEP1、重组载体pAYBEv3-hMPG-VP64-OsEPSPS、重组载体pAYBEv3-hMPG-VP64-OsNRT1.1B、重组载体pAYBEv3-hMPG-VP64-OsWaxy-T1、重组载体pAYBEv3-hMPG-VP64-OsWaxy-T2或重组载体pAYBEv3-hMPG-VP64-OsWaxy-T3进行表达。
所述M4)的成套***通过下文中的重组载体pAYBEv4-mhMPG-VP64-OsDEP1、重组载体pAYBEv4-mhMPG-VP64-OsEPSPS、重组载体pAYBEv4-mhMPG-VP64-OsNRT1.1B、重组载体pAYBEv4-mhMPG-VP64-OsWaxy-T1、重组载体pAYBEv4-mhMPG-VP64-OsWaxy-T2或重组载体pAYBEv4-mhMPG-VP64-OsWaxy-T3进行表达。
为了解决上述技术问题，本发明又提供了上述成套***的新用途。
本发明提供了上述成套***在如下S1)-S9)任一种中的应用：
S1)植物基因组序列的编辑；
S2)制备植物基因组序列的编辑的产品；
S3)提高植物基因组序列的编辑效率；
S4)制备提高植物基因组序列的编辑效率的产品；
S5)拓展植物基因组序列的编辑窗口；
S6)制备拓展植物基因组序列的编辑窗口的产品；
S7)制备植物突变体；
S8)植物育种；
S9)制备植物育种的产品。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了如下T1)-T4)任一所述的方法：
T1)植物基因组序列的编辑方法，包括如下步骤：使植物表达上述成套***，以实现植物基因组序列的编辑；
T2)提高植物基因组序列的编辑效率的方法，包括如下步骤：使植物表达上述成套***，以实现提高植物基因组序列的编辑效率；
T3)拓展植物基因组序列的编辑窗口的方法，包括如下步骤：使植物表达上述成套***，以实现拓展植物基因组序列的编辑窗口；
T4)植物突变体的制备方法，包括如下步骤：使植物表达上述成套***，以获得植物突变体。
上述任一所述方法中，所述使植物表达上述成套***的方法为将上述成套***包括的各个元件或各个表达盒导入植物中。
进一步的，所述成套***包括的各个元件或各个表达盒可通过同一个载体导入植物中，也可以通过多个载体导入植物中。
更进一步的，所述成套***通过同一个重组载体导入植物中。
在本发明的具体实施例中，所述成套***通过下文中的重组载体pAYBEv1-hMPG-OsDEP1、重组载体pAYBEv1-hMPG-OsEPSPS、重组载体pAYBEv1-hMPG-OsNRT1.1B、重组载体pAYBEv1-hMPG-OsWaxy-T1、重组载体pAYBEv1-hMPG-OsWaxy-T2、重组载体pAYBEv1-hMPG-OsWaxy-T3、重组载体pAYBEv2-mhMPG-OsDEP1、重组载体pAYBEv2-mhMPG-OsEPSPS、重组载体pAYBEv2-mhMPG-OsNRT1.1B、重组载体pAYBEv2-mhMPG-OsWaxy-T1、重组载体pAYBEv2-mhMPG-OsWaxy-T2、重组载体pAYBEv2-mhMPG-OsWaxy-T3、重组载体pAYBEv3-hMPG-VP64-OsDEP1、重组载体pAYBEv3-hMPG-VP64-OsEPSPS、重组载体pAYBEv3-hMPG-VP64-OsNRT1.1B、重组载体pAYBEv3-hMPG-VP64-OsWaxy-T1、重组载体pAYBEv3-hMPG-VP64-OsWaxy-T2、重组载体pAYBEv3-hMPG-VP64-OsWaxy-T3、重组载体pAYBEv4-mhMPG-VP64-OsDEP1、重组载体pAYBEv4-mhMPG-VP64-OsEPSPS、重组载体pAYBEv4-mhMPG-VP64-OsNRT1.1B、重组载体pAYBEv4-mhMPG-VP64-OsWaxy-T1、重组载体pAYBEv4-mhMPG-VP64-OsWaxy-T2或重组载体pAYBEv4-mhMPG-VP64-OsWaxy-T3导入植物中。
上述任一所述成套***或应用或方法中，所述植物基因组序列的编辑包括植物基因组序列的碱基替换(如单碱基替换和小片段替换)、碱基***(如单碱基***和小片段***)和碱基缺失(如单碱基缺失和小片段缺失)。所述单碱基替换包括单碱基转换(如碱基A转换为碱基G)和单碱基颠换(如碱基A颠换为碱基C或碱基T)。
上述任一所述成套***或应用或方法中，所述植物为X1)或X2)或X3)：
X1)单子叶植物或双子叶植物；
X2)禾本科植物；
X3)水稻(如中花11)。
本发明设计并研发了一系列新型植物单碱基编辑器pAYBEs。首先通过将腺嘌呤碱基编辑器TadA8e-nCas9(D10A)与水稻密码子优化的hMPG融合，在植物中建立了第一代A-to-Y单碱基编辑***pAYBEv1，该***由腺嘌呤脱氨酶TadA8e、nCas9(D10A)、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hMPG)以及基因组靶向引导RNA(gRNA)组成，腺嘌呤脱氨酶将腺嘌呤(A)催化脱氨产生次黄嘌呤(I)，MPG蛋白可以移除次黄嘌呤形成无碱基位点AP site(Apurinicsite)并通过DNA聚合酶错配修复DNA双链，实现碱基A-to-Y的碱基颠换。此外，本发明又将hMPG替换为mhMPG突变体建立了第二代A-to-Y单碱基编辑***pAYBEv2，测试了mhMPG介导的A-to-Y的单碱基编辑效率。在此基础上，本发明还将反式激活因子Vp64融合在第一代pAYBEv1***的TadA8e-nCas9(D10A)-hMPG的N端，建立了第三代A-to-Y单碱基编辑***pAYBEv3，提高了A-to-Y的单碱基编辑效率。进一步，通过Vp64耦合mhMPG突变体建立了***A-to-Y单碱基编辑***pAYBEv4，进一步提高了A-to-Y碱基编辑效率。
本发明还利用了水稻6个不同的内源靶点测试了4代不同版本的植物pAYBE编辑器的A-to-Y编辑效率。原生质体测试结果表明，除了pAYBEv1只在一个靶点发生了A-to-C外，pAYBEv2、pAYBEv3、pAYBEv4在6个靶点处均实现了A-to-Y碱基颠换。与pAYBEv1相比，pAYBEv2、pAYBEv3、pAYBEv4编辑效率分别得到显著提高，其中，pAYBEv4载体介导的植物A-to-Y碱基编辑效率最高。与pAYBEv1、pAYBEv2、pAYBEv3相比，pAYBEv4介导的植物A-to-C碱基编辑效率可分别提高9.78倍、3.06-5.15倍、1.27-5.67倍，最高A-to-C编辑效率可达4.40％。与pAYBEv2和pAYBEv3相比，A-to-T碱基编辑效率分别提高1.97-3.18倍和1.57-6.57倍，最高A-to-T编辑效率可达2.79％(表3-表5)。此外，pAYBEv1、pAYBEv2编辑窗口主要发生在A5-A6位点(图5)，pAYBEv3、pAYBEv4编辑窗口除了主要发生在A5-A6外，在A4和A8位也发生了不同程度的A-to-Y编辑(图5)，表明耦合VP64后，可扩展pAYBE的编辑窗口。另外，pAYBEv1、pAYBEv2、pAYBEv3、pAYBEv4均可产生精准indel事件。此外，和对照pABE8e相比，四个不同版本的pAYBEs均显著提高了的A-to-G编辑效率(图4、表3-表6)。以上结果表明，除了进行A-to-Y单碱基编辑外，pAYBEs尤其是pAYBEv4-mhMPG-VP64，可用于农作物重要基因编码区或启动区的定向进化。
进一步稳定遗传转化结果表明，pAYBEv1仅在OsWaxy-T2靶点处实现了A-to-Y碱基颠换，效率为2.02％(表9、表10)。pAYBEv3在OsWaxy-T2靶点处实现了A-to-T碱基颠换，效率为2.53％(表9、表10)。同时，在OsNRT1.1B、OsWaxy-T1、OsWaxy-T3等靶点处实现了A-to-T碱基编辑，碱基编辑效率依次是1.32％、1.54％、9.46％。相比pAYBEv1，pAYBEv3在OsWaxy-T2靶点的A-to-T效率提高了1.25倍(2.53％/2.02％)，同时在其他三个靶点，首次实现了A-to-T碱基编辑。与原生质体测试结果相似，pAYBEv4在稳定转化中A-to-T编辑效率优于其他三种碱基编码器(图7、图8、图9、图10、表9、表10)。除OsEPSPS靶点外，pAYBEv4在OsDEP1、OsNRT1.1B、OsWaxy-T1、OsWaxy-T2、OsWaxy-T3等靶点处均实现了碱基A-to-T的编辑，碱基编辑效率依次是10.98％(9/82)、2.22％(2/90)、4.23％(3/71)、8.54％(7/82)、17.24％(10/58)。相比pAYBEv3，pAYBEv4在OsDEP1靶点首次实现A-to-T碱基编辑，在OsNRT1.1B靶点的A-to-T效率提高了1.68倍(2.22％/1.32％)，在OsWaxy-T1靶点的A-to-T效率提高了2.75倍(4.23％/1.54％)，在OsWaxy-T2靶点的A-to-T效率提高了3.38倍(8.54％/2.53％)，在OsWaxy-T3靶点的A-to-T效率提高了1.82倍(17.24％/9.46％)。根据幼苗基因型A-to-T的结果，确认A-to-T碱基编辑主要发生在A5和A6位。
由上述结果可知，本发明成功地设计了四个用于水稻A-to-Y碱基编辑的pAYBEs编辑器，并在水稻原生质体和稳定转化中对不同版本的pAYBEs的编辑活性进行了测试，结果表明，带有hMPG的pAYBEv1具有极低的A-to-Y碱基编辑活性，与mhMPG结合的pAYBEv2或与VP64偶联的pAYBEv3均能显著提高A-to-Y编辑效率；含有反式激活因子VP64的pAYBEv3诱导A-to-Y编辑的效果优于含有mhMPG的pAYBEv2。此外，mhMPG和VP64在增强A-to-Y编辑活性方面表现出协同效应。含有mhMPG和VP64的pAYBEv4在A-to-Y编辑方面优于其他版本的pAYBEs，在水稻稳定系中实现了一些不可编辑的目标位点的A-to-Y碱基颠换，A-to-Y编辑效率最高达到17.24％。通过与ABEs、CBEs和CGBEs的结合，具有更高的A-to-Y颠换效率的pAYBEs将允许所有类型的碱基转换，从而极大地丰富植物单碱基编辑工具箱，为水稻和其它农作物重要基因功能分析和遗传改良提供了重要技术支撑。
附图说明
图1为AYBE***A-to-Y单碱基颠换原理示意图。AYBE***由腺嘌呤脱氨酶TadA8e、CRISPR/nCas9(D10A)、烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(MPG)以及基因组靶向引导RNA(gRNA)组成。腺嘌呤脱氨酶将腺嘌呤(A)催化脱氨产生次黄嘌呤(I)，MPG蛋白可以移除次黄嘌呤形成无碱基位点AP site(Apurinic site)并通过DNA聚合酶错配修复DNA双链，实现碱基A-to-Y的碱基颠换；因nCas9(D10A)切割靶标链，同时与非靶标链上AP site有机会形成双链断裂(double strand break，DSB)，在靶标位点形成Indel编辑事件。TLS(translesionsynthesis)表示跨损伤修复与复制。
图2为人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶七突突变体mhMPG和人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG氨基酸序列的序列比对图。其中，红色方框内标注为mhMPG突变的7个氨基酸，分别是G163R、N169S、S198A、K202A、G203A、S206A、K210A。
图3为植物pAYBEs载体的结构示意图。其中，TadA8e为腺嘌呤脱氨酶；nCas9(D10A)为Cas9(D10A)缺刻酶；NLS为核定位信号；Vp64为反式激活因子；hMPG为人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶；mhMPG为人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶七突突变体。
图4为水稻原生质体中测试pAYBE单碱基编辑器效率的统计图。图A为pABE8e在水稻原生质体中测试A-to-G编辑效率统计图。图B为pAYBEv1-hMPG在水稻原生质体中测试A-to-C、A-to-T、A-to-G以及靶点处indel编辑效率的统计图。图C为pAYBEv2-mhMPG在水稻原生质体中测试A-to-C、A-to-T、A-to-G以及靶点处indel编辑效率的统计图。图D为pAYBEv3-hMPG-VP64在水稻原生质体中测试A-to-C、A-to-T、A-to-G以及靶点处indel编辑效率的统计图。图E为pAYBEv4-mhMPG-VP64在水稻原生质体中测试A-to-C、A-to-T、A-to-G以及靶点处indel编辑效率的统计图。以上所有载体在测试时，每个靶点均在原生质体中进行了三次独立重复实验。
图5为pAYBE在水稻原生质体中测试pAYBEs靶点编辑窗口的偏好性。其中，靶点序列以1-20位置排列，21-23位为PAM序列；箱式图跨越25％-75％四分位数，其中水平线表示中位数，误差线延伸至最小值与最大值。图A为pAYBEv1-hMPG靶点编辑窗口偏好性的统计图。图B为pAYBEv2-mhMPG靶点编辑窗口偏好性的统计图。图C为pAYBEv3-hMPG-VP64靶点编辑窗口偏好性的统计图。图D为pAYBEv4-mhMPG-VP64靶点编辑窗口偏好性的统计图。
图6为水稻原生质体中pAYBEv4-mhMPG-VP64产生的indel基因型。其中，绿色标注为PAM位点，PAM位点下方比值表示indel基因型在所有基因型事件的占比，黑色部分代表删除核酸片段，红色表示***碱基片段。图A为pAYBEv4-mhMPG-VP64在OsNRT1.1B靶点编辑后深度测序所得的indel基因型。图B为pAYBEv4-mhMPG-VP64在OsWaxy-T1靶点编辑后深度测序所得的indel基因型。图C为pAYBEv4-mhMPG-VP64在OsWaxy-T2靶点编辑后深度测序所得的indel基因型。
图7为pAYBEv1-hMPG介导稳定转化幼苗OsWaxy-T2靶点A-to-Y编辑的Sanger测序结果。其中，箭头表示碱基编辑发生位点。
图8为pAYBEv3-hMPG-VP64介导稳定转化幼苗A-to-Y编辑的Sanger测序结果。其中，箭头表示碱基编辑发生位点。图A为pAYBEv3-hMPG-VP64在OsNRT1.1B靶点编辑后各株系Sanger测序峰图。图B为pAYBEv3-hMPG-VP64在OsWaxy-T1靶点编辑后各株系Sanger测序峰图。图C为pAYBEv3-hMPG-VP64在OsWaxy-T2靶点编辑后各株系Sanger测序峰图。图D为pAYBEv3-hMPG-VP64在OsWaxy-T3靶点编辑后各株系Sanger测序峰图。
图9为pAYBEv4-mhMPG-VP64介导稳定转化幼苗A-to-Y编辑的Sanger测序结果。其中，箭头表示碱基编辑发生位点。图A为pAYBEv3-hMPG-VP64在OsDEP1靶点编辑后各株系Sanger测序峰图。图B为pAYBEv3-hMPG-VP64在OsNRT1.1B靶点编辑后各株系Sanger测序峰图。图C为pAYBEv3-hMPG-VP64在OsWaxy-T1靶点编辑后各株系Sanger测序峰图。图D为pAYBEv3-hMPG-VP64在OsWaxy-T2靶点编辑后各株系Sanger测序峰图。图E为pAYBEv3-hMPG-VP64在OsWaxy-T3靶点编辑后各株系Sanger测序峰图。
图10为pAYBEv4-mhMPG-VP64介导indel编辑水稻植株的基因型分析。其中，绿色标注为PAM位点，PAM位点下方表示删除和***基因型与所有转化事件的比例，黑色部分代表删除核酸片段，红色表示***碱基片段，深灰色表示A-to-G编辑事件。图A为pAYBEv4-mhMPG-VP64在OsDEP1靶点编辑后的indel基因型。图B为pAYBEv4-mhMPG-VP64在OsEPSPS靶点编辑后的indel基因型。图C为pAYBEv4-mhMPG-VP64在OsNRT1.1B靶点编辑后的indel基因型。图D为pAYBEv4-mhMPG-VP64在OsWaxy-T1靶点编辑后的indel基因型。图E为pAYBEv4-mhMPG-VP64在OsWaxy-T2靶点编辑后的indel基因型。图F为pAYBEv4-mhMPG-VP64在OsWaxy-T3靶点编辑后的indel基因型。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的1/2MS培养基(pH 5.8)是将MS&Vitamins盐、蔗糖、植物凝胶和水混匀得到的培养基，其中各溶质在1/2MS培养基中的浓度分别为：2.15g/L MS&Vitamins盐、15g/L蔗糖、2g/L植物凝胶。
下述实施例中的0.6M Mannitol溶液(pH 5.8)是将Mannitol和水混匀得到的溶液，其中Mannitol浓度为：2.186g/20ml。
下述实施例中的酶解液(pH 5.8)是将Cellulase RS、Macerozyme R-10、Mannitol、pH 5.7的MES、CaCl2、BSA和水混匀得到的溶液，其中各溶质在酶解液中的浓度分别为：1.5％Cellulase RS、0.75％ Macerozyme R-10、0.6M Mannitol、pH 5.7的MES、10mMCaCl2、0.1％BSA。
下述实施例中的W5溶液(pH 5.8)是将NaCl、CaCl2、KCl、pH 5.7的MES和水混匀得到的溶液，其中各溶质在W5溶液中的浓度分别为：0.9％ NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl、2mMMES。
下述实施例中的MMG溶液(pH 5.8)是将Mannitol、MgCl2、MES和水混匀得到的溶液，其中各溶质在MMG溶液中的浓度分别为：0.6M Mannitol、15mM MgCl2、4mM MES。
下述实施例中的PEG-4000溶液(pH 5.8)是将PEG4000、Mannitol、CaCl2和水混匀得到的溶液，其中各溶质在PEG-4000溶液中的浓度分别为：40％(W/V)PEG4000、0.6MMannitol、0.1M CaCl2。
下述实施例中的LB液体培养基是将酵母粉、胰蛋白胨、NaCl和水混匀得到的溶液，其中各溶质在LB液体培养基中的浓度分别为：0.5％(W/V)酵母粉、1％(W/V)胰蛋白胨、1％(W/V)NaCl。
下述实施例中的AAM培养基(pH 5.2)是将MS salts&vitamins盐、蔗糖、MES、葡萄糖、酪蛋白氨基酸、乙酰丁香酮和100mL 10x AA amino acids混匀得到的培养基，其中各溶质在AAM培养基中的浓度分别为4.3g/L MS salts&vitamins盐、68.5g/L蔗糖、0.5g/L MES、36g/L葡萄糖、500mg/L酪蛋白氨基酸、40mg/L乙酰丁香酮。上述10x AA amino acids溶液为将L-谷氨酰胺、L-天(门)冬氨酸、L-精氨酸、甘氨酸和水混匀得到的溶液，其中各溶质在10xAA amino acids溶液中的浓度为：8.76g/L L-谷氨酰胺、2.66g/L L-天(门)冬氨酸、1.74g/L L-精氨酸和75mg/L甘氨酸。
下述实施例中的R1培养基(pH 5.8)是将MS&Vitamins盐、蔗糖、MES、酪蛋白氨基酸、L-脯氨酸、2，4-D、植物凝胶和水混匀得到的培养基，其中各溶质在R1培养基中的浓度分别为：4.3g/L MS&Vitamins盐、30g/L蔗糖、0.5g/L MES、300mg/L酪蛋白氨基酸、2.8g/L L-脯氨酸、2mg/L 2，4-D、4g/L植物凝胶。
下述实施例中的R2培养基(pH 5.2)是将MS&Vitamins盐、蔗糖、MES、酪蛋白氨基酸、2，4-D、植物凝胶、乙酰丁香酮和水混匀得到的培养基，其中各溶质在R2培养基中的浓度分别为：4.3g/L MS&Vitamins盐、30g/L蔗糖、0.5g/L MES、300mg/L酪蛋白氨基酸、2mg/L 2，4-D、4g/L植物凝胶、20mg/mL乙酰丁香酮。
下述实施例中的R1筛选培养基(pH 5.8)是将MS&Vitamins盐、蔗糖、MES、酪蛋白氨基酸、L-脯氨酸、2，4-D、植物凝胶和水混匀得到的培养基，其中各溶质在R1筛选培养基中的浓度为：4.3g/L MS&Vitamins盐、30g/L蔗糖、0.5g/L MES、300mg/L酪蛋白氨基酸、2.8g/LL-脯氨酸、2mg/L 2，4-D、4g/L植物凝胶。
下述实施例中的R4分化培养基(pH 5.8)是将MS&Vitamins盐、蔗糖、MES、酪蛋白氨基酸、山梨醇、激动素、NAA、植物凝胶和水混匀得到的培养基，其中各溶质在R4分化培养基中的浓度分别为：4.3g/L MS&Vitamins盐、30g/L蔗糖、0.5g/L MES、2g/L酪蛋白氨基酸、30g/L山梨醇、2mg/L激动素、1mg/L NAA、4g/L植物凝胶。
下述实施例中的R5生根培养基(pH 5.8)是将MS&Vitamins盐、蔗糖、MES、植物凝胶和水混匀得到的培养基，其中各溶质在R5培养基中的浓度分别为：2.15g/L MS&Vitamins盐、15g/L蔗糖、0.5g/L MES、2g/L植物凝胶。
实施例1、不同植物A-to-Y单碱基编辑器pAYBEs的主要元件设计及其表达载体设计一、不同植物A-to-Y单碱基编辑器pAYBEs的主要元件设计
本发明中的植物A-to-Y单碱基编辑器pAYBEs有如下五种：pABE8e、pAYBEv1-hMPG、pAYBEv2-mhMPG、pAYBEv3-hMPG-VP64和pAYBEv4-mhMPG-VP64。各个植物A-to-Y单碱基编辑器的主要元件分别如下：
单碱基编辑器pABE8e的主要元件如下：腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、gRNA和筛选标记蛋白(如HPT)。
单碱基编辑器pAYBEv1-hMPG的主要元件如下：腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG、gRNA和筛选标记蛋白(如HPT)。
单碱基编辑器pAYBEv2-mhMPG的主要元件如下：腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶七突突变体mhMPG、gRNA和筛选标记蛋白(如HPT)。
单碱基编辑器pAYBEv3-hMPG-VP64的主要元件如下：反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG、gRNA和筛选标记蛋白(如HPT)。
单碱基编辑器pAYBEv4-mhMPG-VP64的主要元件如下：反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶七突突变体mhMPG、gRNA和筛选标记蛋白(如HPT)。
上述人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶七突突变体mhMPG为将人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG氨基酸序列的第163位由甘氨酸(G)突变为精氨酸(R)，且将第169位由天冬酰胺(N)突变为丝氨酸(S)，且将第198位由丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)，且将第202位由赖氨酸(K)突变为丙氨酸(A)，且将第203位由甘氨酸(G)突变为丙氨酸(A)，且将第206位由丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)，且将第210位由赖氨酸(K)突变为丙氨酸(A)后得到的蛋白质。
人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶七突突变体mhMPG和人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG的氨基酸序列比对图如图2所示。
二、不同植物A-to-Y单碱基编辑器pAYBEs的表达载体设计
上述各植物A-to-Y单碱基编辑器pAYBEs表达载体的结构示意图如图3所示。
单碱基编辑器pABE8e的表达载体包括融合蛋白TadA8e&Cas9(D10A)的表达盒、gRNA表达盒和筛选标记蛋白HPT表达盒。其中，融合蛋白TadA8e&Cas9(D10A)的表达盒依次包括Ubi启动子、核定位信号NLS、腺嘌呤脱氨酶TadA8e的编码基因、Cas9(D10A)缺刻酶的编码基因、核定位信号NLS和E9t终止子。
单碱基编辑器pAYBEv1-hMPG的表达载体包括融合蛋白TadA8e&Cas9(D10A)&hMPG的表达盒、gRNA表达盒和筛选标记蛋白HPT表达盒。其中，融合蛋白TadA8e&Cas9(D10A)&hMPG的表达盒依次包括Ubi启动子、核定位信号NLS、腺嘌呤脱氨酶TadA8e的编码基因、Cas9(D10A)缺刻酶的编码基因、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG的编码基因、核定位信号NLS和E9t终止子。
单碱基编辑器pAYBEv2-mhMPG的表达载体包括融合蛋白TadA8e&Cas9(D10A)&mhMPG的表达盒、gRNA表达盒和筛选标记蛋白HPT表达盒。其中，融合蛋白TadA8e&Cas9(D10A)&mhMPG的表达盒依次包括Ubi启动子、核定位信号NLS、腺嘌呤脱氨酶TadA8e的编码基因、Cas9(D10A)缺刻酶的编码基因、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶七突突变体mhMPG的编码基因、核定位信号NLS和E9t终止子。
单碱基编辑器pAYBEv3-hMPG-VP64的表达载体包括融合蛋白Vp64&TadA8e&Cas9(D10A)&hMPG的表达盒、gRNA表达盒和筛选标记蛋白HPT表达盒。其中，融合蛋白Vp64&TadA8e&Cas9(D10A)&hMPG的表达盒依次包括Ubi启动子、核定位信号NLS、反式激活因子Vp64的编码基因、腺嘌呤脱氨酶TadA8e的编码基因、Cas9(D10A)缺刻酶的编码基因、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG的编码基因、核定位信号NLS和E9t终止子。
单碱基编辑器pAYBEv4-mhMPG-VP64的表达载体包括融合蛋白Vp64&TadA8e&Cas9(D10A)&mhMPG的表达盒、gRNA表达盒和筛选标记蛋白HPT表达盒。其中，融合蛋白Vp64&TadA8e&Cas9(D10A)&hMPG的表达盒依次包括Ubi启动子、核定位信号NLS、反式激活因子Vp64的编码基因、腺嘌呤脱氨酶TadA8e的编码基因、Cas9(D10A)缺刻酶的编码基因、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶七突突变体mhMPG的编码基因、核定位信号NLS和E9t终止子。
上述各单碱基编辑器中的gRNA表达盒均依次包括OsU3启动子、gRNA的编码基因和SUP4终止子。
上述各单碱基编辑器中的筛选标记蛋白HPT表达盒均依次包括35S启动子、筛选标记蛋白HPT的编码基因和Nos终止子。
实施例2、不同植物A-to-Y单碱基编辑器pAYBEs表达载体的构建及其在对水稻基因组进行碱基编辑中的应用
一、不同植物A-to-Y单碱基编辑器pAYBEs表达载体的构建
人工构建如下重组载体，各载体均为环状质粒：
单碱基编辑器pABE8e的表达载体共计6个，分别是pABE8e-OsDEP1、pABE8e-OsEPSPS、pABE8e-OsNRT1.1B、pABE8e-OsWaxy-T1、pABE8e-OsWaxy-T2、pABE8e-OsWaxy-T3重组载体。
单碱基编辑器pAYBEv1-hMPG的表达载体共计6个，分别是pAYBEv1-hMPG-OsDEP1、pAYBEv1-hMPG-OsEPSPS、pAYBEv1-hMPG-OsNRT1.1B、pAYBEv1-hMPG-OsWaxy-T1、pAYBEv1-hMPG-OsWaxy-T2、pAYBEv1-hMPG-OsWaxy-T3重组载体。
单碱基编辑器pAYBEv2-mhMPG的表达载体共计6个，分别是pAYBEv2-mhMPG-OsDEP1、pAYBEv2-mhMPG-OsEPSPS、pAYBEv2-mhMPG-OsNRT1.1B、pAYBEv2-mhMPG-OsWaxy-T1、pAYBEv2-mhMPG-OsWaxy-T2、pAYBEv2-mhMPG-OsWaxy-T3重组载体。
单碱基编辑器pAYBEv3-hMPG-VP64的表达载体共计6个，分别是pAYBEv3-hMPG-VP64-OsDEP1 、 pAYBEv3-hMPG-VP64-OsEPSPS、pAYBEv3-hMPG-VP64-OsNRT1.1B 、pAYBEv3-hMPG-VP64-OsWaxy-T1 、pAYBEv3-hMPG-VP64-OsWaxy-T2、pAYBEv3-hMPG-VP64-OsWaxy-T3重组载体。
单碱基编辑器pAYBEv4-mhMPG-VP64的表达载体共计6个，分别是pAYBEv4-mhMPG-VP64-OsDEP1、 pAYBEv4-mhMPG-VP64-OsEPSPS、pAYBEv4-mhMPG-VP64-OsNRT1.1B、pAYBEv4-mhMPG-VP64-OsWaxy-T1、pAYBEv4-mhMPG-VP64-OsWaxy-T2、pAYBEv4-mhMPG-VP64-OsWaxy-T3重组载体。
pABE8e-OsDEP1重组载体的核苷酸序列如序列表中序列1所示，其中，第1-1992位为Ubi启动子序列，第2017-2037位为核定位信号NLS的编码序列，编码序列10所示的核定位信号NLS，第2062-2559位为腺嘌呤脱氨酶TadA8e的编码基因序列，编码序列2所示的腺嘌呤脱氨酶TadA8e，第2656-6756位为Cas9(D10A)缺刻酶的编码基因序列，编码序列3所示的Cas9(D10A)缺刻酶，第6757-6804位为核定位信号NLS的编码序列，第6812-7446位为E9t终止子序列；第7453-7833位为OsU3启动子序列、第7834-7853位为gRNA靶点序列，第7854-7929位为gRNA骨架的编码序列，第7930-7949位为SUP4终止子序列；第8296-8973位为35S启动子序列，第9018-10043位为筛选标记蛋白HPT的编码基因序列，编码序列4所示的筛选标记蛋白HPT，第10090-10264位为Nos终止子序列。
pABE8e-OsEPSPS、pABE8e-OsNRT1.1B、pABE8e-OsWaxy-T1、pABE8e-OsWaxy-T2、pABE8e-OsWaxy-T3重组载体的核苷酸序列为将pABE8e-OsDEP1重组载体序列中的gRNA靶点序列分别替换为表1中OsEPSPS、OsNRT1.1B、OsWaxy-T1、OsWaxy-T2、OsWaxy-T3对应的靶点序列，且保持其它序列不变后得到的序列。
pAYBEv1-hMPG-OsDEP1、pAYBEv1-hMPG-OsEPSPS、pAYBEv1-hMPG-OsNRT1.1B、pAYBEv1-hMPG-OsWaxy-T1、pAYBEv1-hMPG-OsWaxy-T2、pAYBEv1-hMPG-OsWaxy-T3重组载体的核苷酸序列分别为将pABE8e-OsDEP1、pABE8e-OsEPSPS、pABE8e-OsNRT1.1B、pABE8e-OsWaxy-T1、pABE8e-OsWaxy-T2、pABE8e-OsWaxy-T3重组载体序列中的第6756位和第6757位之间***序列5所示的DNA分子，且保持其它序列不变后得到的序列。其中，序列5第40-930位为人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG的编码序列，编码序列6所示的人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG。
pAYBEv2-mhMPG-OsDEP1 、 pAYBEv2-mhMPG-OsEPSPS 、pAYBEv2-mhMPG-OsNRT1.1B、 pAYBEv2-mhMPG-OsWaxy-T1 、pAYBEv2-mhMPG-OsWaxy-T2、pAYBEv2-mhMPG-OsWaxy-T3重组载体的核苷酸序列分别为将pAYBEv1-hMPG-OsDEP1、pAYBEv1-hMPG-OsEPSPS、pAYBEv1-hMPG-OsNRT1.1B、pAYBEv1-hMPG-OsWaxy-T1、pAYBEv1-hMPG-OsWaxy-T2、pAYBEv1-hMPG-OsWaxy-T3重组载体序列中的人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG的编码序列替换为序列7所示的人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶七突突变体mhMPG的编码序列，且保持其它序列不变后得到的序列。
pAYBEv3-hMPG-VP64-OsDEP1、 pAYBEv3-hMPG-VP64-OsEPSPS、pAYBEv3-hMPG-VP64-OsNRT1.1B 、 pAYBEv3-hMPG-VP64-OsWaxy-T1 、pAYBEv3-hMPG-VP64-OsWaxy-T2、pAYBEv3-hMPG-VP64-OsWaxy-T3重组载体分别为将pAYBEv1-hMPG-OsDEP1、pAYBEv1-hMPG-OsEPSPS、pAYBEv1-hMPG-OsNRT1.1B、pAYBEv1-hMPG-OsWaxy-T1、pAYBEv1-hMPG-OsWaxy-T2、pAYBEv1-hMPG-OsWaxy-T3重组载体序列中的第2038位和第2061位之间的DNA分子替换为序列8所示的DNA分子，且保持其它序列不变后得到的序列。其中，序列8第1-150位为反式激活因子Vp64的编码序列，编码序列9所示的反式激活因子Vp64。
pAYBEv4-mhMPG-VP64-OsDEP1、 pAYBEv4-mhMPG-VP64-OsEPSPS、pAYBEv4-mhMPG-VP64-OsNRT1.1B、 pAYBEv4-mhMPG-VP64-OsWaxy-T1、pAYBEv4-mhMPG-VP64-OsWaxy-T2、pAYBEv4-mhMPG-VP64-OsWaxy-T3重组载体的核苷酸序列分别为将pAYBEv2-mhMPG-OsDEP1、pAYBEv2-mhMPG-OsEPSPS、pAYBEv2-mhMPG-OsNRT1.1B、pAYBEv2-mhMPG-OsWaxy-T1、pAYBEv2-mhMPG-OsWaxy-T2、pAYBEv2-mhMPG-OsWaxy-T3重组载体序列中的第2038位和第2061位之间的DNA分子替换为序列8所示的DNA分子，且保持其它序列不变后得到的序列。其中，序列8第1-150位为反式激活因子Vp64的编码序列，编码序列9所示的反式激活因子Vp64。
表1、靶点序列
基因 靶点序列(5′to 3′)
OsWaxy-T1 CCTGACACTGGAGTTGATTACAA
OsWaxy-T2 CGCCAAGTACGACGCAACCACGG
OsWaxy-T3 CCATACTTCAAAGGAACTTATGG
OsNRT1.1B ACTAGATATCTAAACCATTAAGG
OsDEP1 AGACAAGCTTGGCCCTCTTT GGG
OsEPSPS ATGATATCCTCCTACATGTCAGG
二、水稻原生质体的分离、转化以及精准编辑效率、编辑窗口的分析
将步骤一中构建的各个植物A-to-Y单碱基编辑器pAYBEs的重组表达载体(所有载体在测试时，每个靶点均在原生质体中进行了三次独立重复实验)分别按照如下步骤进行操作：
1、水稻原生质体的分离
将脱壳的水稻品种中花11种子先用75％的乙醇漂洗10分钟，再用20％的次氯酸钠处理20分钟，无菌水洗涤5次以上，得到消毒后种子。然后将消毒后种子放在1/2MS培养基上培养2周左右，在26℃，12h光照(150μmol·m-2·s-1)条件下培养，得到水稻幼苗。每个组培瓶可放30粒种子，60～90株幼苗可以做一次实验，分离出的原生质体量可以转化大约6个载体，每个质粒的转化设置3个重复。
选取水稻幼苗的茎干和叶鞘部分分离原生质体，具体步骤如下：用锋利的刀片切成大约0.5mm宽的细丝，可以20～30个放在一起切。将细丝放入0.6M Mannitol溶液中，锡箔纸包裹避光处理10分钟。用75μm尼龙布过滤，将细丝放入50mL酶解液中，避光，真空泵抽真空30min，压强约50kpa，取出后放在室温摇床上消化5～6小时，转速10～20rpm。加等体积W5溶液稀释酶解产物，终止酶解反应后用尼龙布过滤酶解液于50mL离心管收集原生质体，28℃，150g水平离心，升降速调至3，离心5min，弃上清；用10mL W5溶液轻轻悬起，28℃，150g水平离心，升降速为3，离心5min，弃上清；加适量MMG溶液重悬，调整原生质体浓度为2×106/mL，血球细胞计数器计数后备用。
2、水稻原生质体的转化
加入约20μg无内毒素的高浓度AYBE测试质粒(步骤一中构建的各个植物A-to-Y单碱基编辑器pAYBEs的重组表达载体)于2mL离心管，用剪刀剪去枪尖的枪头吸取200μL步骤1获得的原生质体沿管壁缓慢加入离心管中，轻轻吸打混匀，再加入约220μL PEG-4000溶液，轻轻颠倒混匀，避光诱导转化10～20min；加入800μL W5溶液(室温)颠倒混匀，28℃，150g水平离心，升降速为3，离心5min，弃上清；加入1mL W5溶液，颠倒混匀，置28℃暗处培养。
转化后48h后，收集原生质体，弃上清。用枪吸打悬起原生质体于2mL离心管中，12000rpm离心1min后弃上清；提取原生质体基因组，具体方法同植物基因组提取方法，PCR扩增所选靶基因的目的片段进行Hi-tom高通量测序，Hi-tom测序使用引物如表2所示。
PCR扩增体系：10μL 2×Taq酶，1μL正向引物，1μL反向引物，1μL基因组DNA模板(60ng/μL)，7μL ddH2O。
PCR扩增程序：98℃，3min；98℃，15s；60℃，15s；72℃，15s；35个循环；72℃，5min；16℃保持。
表2、深度测序所用引物列表
3、pAYBEs在原生质体中编辑效率的统计分析结果
本发明在水稻基因组中选定了6个内源靶点，以快速测试各个单碱基编辑器表达载体(下文简称载体)在水稻原生质体中的有效性。具体检测结果如图4、表3-表7所示。
pABE8e载体的深度测序与预期结果一致，在6个靶点处均没有检测到有A-to-Y碱基编辑事件，只检测到A-to-G碱基转换。其中，在OsDEP1靶点处，A-to-G碱基编辑效率最高为6.06％，最低为5.49％；在OsEPSPS靶点处，A-to-G碱基编辑效率最高为3.29％，最低为1.46％；在OsNRT1.1B靶点处，A-to-G碱基编辑最为有效，效率最高为6.56％，最低为5.71％；在OsWaxy-T1靶点处，A-to-G碱基编辑效率最高为3.77％，最低为2.58％；在OsWaxy-T2靶点处，A-to-G碱基编辑效率最高为1.34％，最低为1.28％；在OsWaxy-T3靶点处，A-to-G碱基编辑效率最高为5.35％，最低为3.57％。
pAYBEv1-hMPG载体在OsDEP1靶点处没有检测到A-to-Y碱基编辑事件的发生，A-to-G碱基编辑效率最高为4.05％，最低为3.64％；在OsEPSPS靶点处没有检测到A-to-Y碱基编辑事件的发生，A-to-G碱基编辑效率最高为3.28％，最低为1.92％；在OsNRT1.1B靶点处深度测序首次在原生质体中检测到了A-to-C编辑事件，平均效率为0.44％，编辑效率最高为0.45％，最低为0.43％。A-to-G碱基编辑效率最高为6.65％，最低为5.80％；在OsWaxy-T1靶点处没有检测到A-to-Y碱基编辑事件的发生，A-to-G碱基编辑效率最高为2.98％，最低为2.31％；在OsWaxy-T2靶点处没有检测到A-to-Y碱基编辑事件的发生，A-to-G碱基编辑效率最高为1.67％，最低为1.09％；在OsWaxy-T3靶点处没有检测到A-to-Y碱基编辑事件的发生，A-to-G碱基编辑效率最高为4.80％，最低为2.38％。综上所述，植物A-to-Y单碱基编辑载体pAYBEv1-hMPG在6个靶点处深度测序的结果显示，在OsNRT1.1B靶点处检测到了A-to-C编辑事件，在其他靶点处没有检测到有A-to-Y碱基编辑事件的出现。
pAYBEv2-mhMPG载体在6个靶点处均检测到了不同程度的A-to-Y/A-to-G及靶点附近的indel。其中，在OsDEP1靶点处A-to-C碱基编辑效率最高为0.72％，最低为0.53％，平均效率为0.63％，靶点处A-to-T碱基编辑效率最高为0.90％，最低为0.49％，平均效率为0.63％，靶点处A-to-Y碱基编辑效率最高为1.54％，最低为1.02％，平均效率为1.26％，靶点处indel事件效率最高为0.41％，最低为0.34％，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为25.50％，最低为14.31％；在OsEPSPS检测到靶点处indel事件最高效率为1.95％，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为3.71％，最低为3.29％；在OsNRT1.1B靶点处，A-to-C碱基编辑效率最高为1.44％，最低为0.62％，平均效率为0.94％，相比pAYBEv1-hMPG载体，pAYBEv2-mhMPG载体的A-to-C碱基编辑效率提高约3.20倍(1.44％/0.45％)，靶点处indel事件效率最高为0.91％，最低为0.78％，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为9.34％，最低为9.08％；在OsWaxy-T1靶点处A-to-T碱基编辑效率最高为0.62％，最低为0.35％，平均效率为0.48％，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为4.49％，最低为4.15％；在OsWaxy-T2仅一个重复检测到靶点处A-to-T碱基编辑效率为0.61％，靶点处indel事件效率最高为2.53％，最低为1.98％，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为4.76％，最低为3.79％；在OsWaxy-T3靶点处A-to-T碱基编辑效率最高为1.31％，最低为0.62％，平均效率为0.89％，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为6.12％，最低为4.18％。综上所述，pAYBEv2-mhMPG相比pAYBEv1-hMPG，在6个靶点处，实现了A-to-Y碱基颠换效率的提高，尤其是OsNRT1.1B靶点处，A-to-C碱基编辑效率提高约3.2倍，并且在靶点处实现了小片段的碱基***和缺失。
相比pAYBEv1-hMPG载体，pAYBEv3-hMPG-VP64载体在6个靶点处均检测到了不同程度的A-to-Y/A-to-G，与pAYBEv2-mhMPG载体相比，A-to-Y碱基编辑效率有不同程度的提升。其中，在OsDEP1靶点处A-to-C碱基编辑效率最高为2.92％，最低为2.27％，平均效率为2.49％，相比pAYBEv2-mhMPG载体，A-to-C碱基编辑效率提高约4.06倍(2.92％/0.72％)，靶点处A-to-T碱基编辑效率最高为0.75％，最低为0.60％，平均效率为0.66％，相比pAYBEv2-mhMPG载体，A-to-T碱基编辑效率略微有所下降(0.75％/0.9％)，靶点处A-to-Y碱基编辑效率最高为3.52％，最低为2.89％，平均效率为3.15％，相比pAYBEv2-mhMPG载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约2.29倍(3.52％/1.54％)，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为10.59％，最低为6.40％；在OsEPSPS靶点处A-to-C碱基编辑效率最高为0.54％，最低为0.37％，平均效率为0.44％，仅一个重复检测到靶点处A-to-T碱基编辑效率为0.31％，靶点处A-to-Y碱基编辑效率最高为0.71％，最低为0.37％，平均效率为0.54％，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为1.01％，最低为0.67％；在OsNRT1.1B靶点处A-to-C碱基编辑效率最高为2.06％，最低为1.93％，平均效率为1.99％，相比pAYBEv1-hMPG载体，A-to-C碱基编辑效率提高约4.58倍(2.06％/0.45％)，相比pAYBEv2-mhMPG载体，A-to-C碱基编辑效率提高约1.43倍(2.06％/1.44％)，靶点处A-to-T碱基编辑效率最高为0.48％，最低为0.45％，平均效率为0.47％，靶点处A-to-Y碱基编辑效率最高为2.51％，最低为2.40％，平均效率为2.46％，相比pAYBEv1-hMPG载体，A-to-Y碱基编辑效率约提高约5.58倍(2.51％/0.45％)，相比pAYBEv2-mhMPG载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约1.74倍(2.51％/1.44％)，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为5.57％，最低为4.29％；在OsWaxy-T1靶点处A-to-C碱基编辑效率最高为1.44％，最低为0.34％，平均效率为0.78％，靶点处A-to-T碱基编辑效率最高为0.30％，最低为0.24％，平均效率为0.27％，相比pAYBEv2-mhMPG载体，A-to-T碱基编辑效率略微有所下降(0.30％/0.62％)，靶点处A-to-Y碱基编辑效率最高为1.74％，最低为0.34％，平均效率为0.96％，相比pAYBEv2-mhMPG载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约2.81倍(1.74％/0.62％)，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为3.18％，最低为1.81％；在OsWaxy-T2靶点处A-to-C碱基编辑效率最高为1.53％，最低为0.95％，平均效率为1.30％，靶点处A-to-T碱基编辑效率最高为1.40％，最低为0.48％，平均效率为0.82％，相比pAYBEv2-mhMPG载体，A-to-T碱基编辑效率提高约2.30倍(1.40％/0.61％)，靶点处A-to-Y碱基编辑效率最高为2.83％，最低为1.43％，平均效率为2.12％，相比pAYBEv2-mhMPG载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约4.64倍(2.83％/0.61％)，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为5.03％，最低为3.68％；在OsWaxy-T3靶点处A-to-C碱基编辑效率最高为0.75％，最低为0.65％，平均效率为0.69％，靶点处A-to-T碱基编辑效率最高为0.49％，最低为0.38％，平均效率为0.44％，相比pAYBEv2-mhMPG载体，A-to-T碱基编辑效率略微有所下降(0.49％/1.31％)，靶点处A-to-Y碱基编辑效率最高为1.21％，最低为1.04％，平均效率为1.13％，相比pAYBEv2-mhMPG载体，A-to-Y碱基编辑效率略微有所下降(1.24％/1.31％)，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为2.92％，最低为2.28％。综上所述，pAYBEv3-hMPG-VP64载体相比pAYBEv1-hMPG载体与pAYBEv2-mhMPG载体，显著提高了A-to-Y碱基颠换的效率，并且在靶点处出现了小片段的碱基***和缺失。
相比pAYBEv1-hMPG载体、pAYBEv2-mhMPG载体与pAYBEv3-hMPG-VP64载体，pAYBEv4-mhMPG-VP64载体在6个靶点处均显著提高了A-to-Y的编辑效率。其中，在OsDEP1靶点处A-to-C碱基编辑效率最高为3.71％，最低为2.73％，平均效率为3.28％，相比pAYBEv2-mhMPG载体，A-to-C碱基编辑效率提高约5.15倍(3.71％/0.72％)，相比pAYBEv3-hMPG-VP64载体，A-to-C碱基编辑效率提高约1.27倍(3.71％/2.92％)，A-to-T碱基编辑效率最高为1.77％，最低为1.12％，平均效率为1.44％，相比pAYBEv2-mhMPG载体，A-to-T碱基编辑效率提高约1.97倍(1.77％/0.90％)，相比pAYBEv3-hMPG-VP64载体，A-to-T碱基编辑效率提高约2.36倍(1.77％/0.75％)，靶点处A-to-Y碱基编辑效率最高为5.13％，最低为4.50％，平均效率为4.72％，相比pAYBEv2-mhMPG载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约3.33倍(5.13％/1.54％)，相比pAYBEv3-hMPG-VP64载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约1.46倍(5.13％/3.52％)，A-to-G碱基编辑效率最高为9.61％，最低为6.08％；在OsEPSPS靶点处A-to-C碱基编辑效率最高为3.06％，最低为1.58％，平均效率为2.26％，相比pAYBEv3-hMPG-VP64载体，A-to-C碱基编辑效率提高约5.67倍(3.06％/0.54％)，A-to-T碱基编辑效率最高为1.37％，最低为0.64％，平均效率为1.09％，相比pAYBEv3-hMPG-VP64载体，A-to-T碱基编辑效率提高约4.42倍(1.37％/0.31％)，靶点处A-to-Y碱基编辑效率最高为3.70％，最低为2.84％，平均效率为3.35％，相比pAYBEv3-hMPG-VP64载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约5.21倍(3.70％/0.71％)，A-to-G碱基编辑效率最高为7.00％，最低为5.01％；在OsNRT1.1B靶点处A-to-C碱基编辑效率最高为4.40％，最低为3.09％，平均效率为3.66％，相比pAYBEv1-hMPG载体，A-to-C碱基编辑效率提高约9.78倍(4.40％/0.45％)，相比pAYBEv2-mhMPG载体，A-to-C碱基编辑效率提高约3.06倍(4.40％/1.44％)，相比pAYBEv3-hMPG-VP64载体，A-to-C碱基编辑效率约提高约2.14倍(4.40％/2.06％)，A-to-T碱基编辑效率最高为2.42％，最低为0.82％，平均效率为1.47％，相比pAYBEv3-hMPG-VP64载体，A-to-T碱基编辑效率提高约5.04倍(2.42％/0.48％)，靶点处A-to-Y碱基编辑效率最高为6.82％，最低为4.25％，平均效率为5.13％，相比pAYBEv1-mhMPG载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约15.16倍(6.82％/0.45％)，相比pAYBEv2-mhMPG载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约4.74倍(6.82％/1.44％)，相比pAYBEv3-hMPG-VP64载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约2.72倍(6.82％/2.51％)，靶点处indel事件效率最高为1.09％，最低为0.47％，A-to-G碱基编辑效率最高为15.27％，最低为13.08％；在OsWaxy-T1靶点处A-to-C碱基编辑效率最高为3.22％，最低为2.43％，平均效率为2.84％，相比pAYBEv3-hMPG-VP64载体，A-to-C碱基编辑效率约提高约2.24倍(3.22％/1.44％)，靶点处A-to-T碱基编辑效率最高为1.97％，最低为1.29％，平均效率为1.53％，相比pAYBEv2-mhMPG载体，A-to-T碱基编辑效率提高约3.18倍(1.97％/0.62％)，相比pAYBEv3-hMPG-VP64载体，A-to-T碱基编辑效率提高约6.57倍(1.97％/0.30％)，靶点处A-to-Y碱基编辑效率最高为4.55％，最低为4.17％，平均效率为4.37％，相比pAYBEv2-mhMPG载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约7.34倍(4.55％/0.62％)，相比pAYBEv3-hMPG-VP64载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约2.61倍(4.55％/1.74％)，靶点处indel事件效率最高为1.10％，最低为0.62％，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为8.18％，最低为6.15％；在OsWaxy-T2靶点处A-to-C碱基编辑效率最高为3.69％，最低为2.30％，平均效率为3.00％，相比pAYBEv3-hMPG-VP64载体，A-to-C碱基编辑效率约提高约2.41倍(3.69％/1.53％)，靶点处A-to-T碱基编辑效率最高为2.20％，最低为1.11％，平均效率为1.58％，相比pAYBEv2-hMPG-VP64载体，A-to-T碱基编辑效率提高约3.61倍(2.20％/0.61％)，相比pAYBEv3-hMPG-VP64载体，A-to-T碱基编辑效率提高约1.57倍(2.20％/1.40％)，靶点处A-to-Y碱基编辑效率最高为5.89％，最低为3.41％，平均效率为4.58％，相比pAYBEv2-mhMPG载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约9.66倍(5.89％/0.61％)；相比pAYBEv3-hMPG-VP64载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约2.08倍(5.89％/2.83％)，靶点处indel事件效率最高为1.31％，最低为0.66％，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为12.34％，最低为7.74％；在OsWaxy-T3靶点处A-to-C碱基编辑效率最高为1.41％，最低为1.21％，平均效率为1.34％，相比pAYBEv3-hMPG-VP64载体，A-to-C碱基编辑效率提高约1.88倍(1.41％/0.75％)，靶点处A-to-T碱基编辑效率最高为2.79％，最低为1.84％，平均效率为2.25％，相比pAYBEv2-mhMPG载体，A-to-T碱基编辑效率提高约2.13倍(2.79％/1.31％)，相比pAYBEv3-hMPG-VP64载体，A-to-T碱基编辑效率提高约5.69倍(2.79％/0.49％)，靶点处A-to-Y碱基编辑效率最高为4.20％，最低为3.05％，平均效率为3.59％，相比pAYBEv2-mhMPG载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约3.21倍(4.20％/1.31％)，相比pAYBEv3-hMPG-VP64载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约3.39倍(4.20％/1.24％)，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为5.09％，最低为3.90％。综上所述，与pAYBEv2-mhMPG载体相比，pAYBEv4-mhMPG-VP64载体的A-to-C编辑效率提高约3.06-5.15倍，A-to-T编辑效率提高约1.97-3.18倍，A-to-Y编辑效率提高约3.21-7.43倍；相比pAYBEv3-hMPG-VP64载体，pAYBEv4-mhMPG-VP64载体的A-to-C编辑效率提高约1.27-5.67倍，A-to-T编辑效率提高约1.57-6.57倍，A-to-Y编辑效率提高约1.46-5.21倍。
表3、水稻原生质体中pAYBEs在不同靶点A-to-C碱基编辑效率
表4、水稻原生质体中pAYBEs在不同靶点A-to-T碱基编辑效率
表5、水稻原生质体中pAYBEs在不同靶点A-to-Y碱基编辑效率
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表6、水稻原生质体中pAYBEs在不同靶点A-to-G碱基编辑效率
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表7、水稻原生质体中pAYBEs在不同靶点indel碱基编辑效率
3、pAYBEs在原生质体中编辑窗口的统计分析结果
在原生质体测试结果中，pAYBEs载体在OsDEP1、OsEPSPS、OsNRT1.1B、OsWaxy-T1、OsWaxy-T2、OsWaxy-T3等靶点处均实现了碱基A-to-Y的颠换。pAYBEv2-mhMPG载体与pAYBEv3-hMPG-VP64载体介导的碱基A-to-Y的颠换主要发生在A5、A6位(图5)，其中，pAYBEv3-hMPG-VP64载体在A5、A6位的A-to-C编辑效率大约是pAYBEv2-mhMPG载体的2倍，A-to-T编辑效率没有明显差别。相比pAYBEv2-mhMPG载体与pAYBEv3-hMPG-VP64载体，pAYBEv4-mhMPG-VP64载体在A5、A6位的A-to-Y的颠换编辑效率显著提高，同时拓展了编辑窗口，表现为在A4、A8位的A-to-Y编辑效率也有显著提高(图5)。
4、pAYBEs在原生质体中Indel事件基因型的统计分析结果
CRISPR/nCas9(D10A)在gRNA引导下只切割靶标链，从而导致DNA在靶标链处造成缺口。植物pAYBE的腺嘌呤脱氨酶将腺嘌呤(A)催化脱氨产生次黄嘌呤(I)，MPG蛋白可以移除次黄嘌呤形成无碱基位点AP site(Apurinic site)并通过DNA聚合酶错配修复DNA双链，实现碱基A-to-Y的碱基颠换；同时，因nCas9(D10A)切割靶标链，同时与非靶标链上的APsite有机会形成交错的双链断裂(double strand break，DSB)，通过跨损伤修复与复制在靶标位点产生精准Indel编辑事件(图1)。
在原生质体测试结果中，pAYBEs载体在OsDEP1、OsEPSPS、OsNRT1.1B、OsWaxy-T1、OsWaxy-T2等靶点均检测到小片段精准缺失事件。以pAYBEv4-mhMPG-VP64载体为例(图6)，在OsDEP1靶点中，缺失片段从7bp到10bp不等，其中A8至A14位点之间片段缺失效率为0.81％，A8位点至nCas9(D10A)切割位点之间缺失片段事件出现效率为0.47％。在OsEPSPS靶点中，缺失片段从6bp到13bp不等，其中A5位点至nCas9(D10A)切割位点之间缺失片段事件出现效率为0.62％，A6至C14位点之间片段缺失效率为0.97％，A9至C14位点之间片段缺失效率为1.10％。在OsNRT1.1B靶点中，缺失片段从4bp到12bp，其中G7位点至nCas9(D10A)切割位点之间缺失片段事件出现效率为0.87％，A9至A12位点之间片段缺失效率为0.92％，G7至C18位点之间片段缺失效率为0.66％，同时，在A16与A17位点之间，有着9bp的小片段***，效率为0.44％。
三、农杆菌介导的水稻稳定遗传转化及基因型与表型分析
1、农杆菌介导的水稻稳定遗传转化
选取饱满的水稻品种中花11种子，剥去种皮，灭菌洗涤浸泡后，均匀的点在灭菌R1固体培养基上，28℃黑暗处培养4～6周诱导愈伤形成；挑取状态较为紧实的愈伤颗粒至于新的R1继代培养基上，培养约1周后，用于农杆菌介导水稻愈伤遗传转化。
已制备好的农杆菌(EHA105感受态，购买于庄盟国际有限公司，货号为ZC142)的单克隆接种于10mL含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养12小时；当培养至对数期时，收集农杆菌菌体，并用AAM侵染液重悬农杆菌，将已培养好的水稻愈伤组织浸泡到此农杆菌重悬液中侵染30分钟；将侵染完的愈伤组织转入R2培养基上进行共培养3天；共培养结束后转至带有50mg/L潮霉素的R1筛选培养基上进行筛选培养，28℃培养4～6周；选取生长良好呈淡黄色的愈伤组织，用无菌镊子移至R4分化培养基，28℃持续光照培养；待分化出来的幼苗长至2-5厘米，转入R5生根培养基培养2～3周，获得抗性T0代植株(再生植株)，之后移入土中置于温室生长(温度28～30℃，16小时光照/8小时黑暗)。
2、再生植株的基因型检测
对步骤1中筛选获得的再生植株进行基因型检测及分析，使用CTAB提取方法，提取T0代植株的基因组DNA，以T0代植株基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得靶标基因片段，对筛选获得的再生植株进行基因型检测及分析。基因型检测所用引物如表8所示。
表8、基因型检测所用引物列表
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PCR扩增体系：15μL 2×Taq酶，1μL正向引物，1μL反向引物，1μL基因组DNA模板(100ng/μL)，12μL ddH2O。
PCR扩增程序：98℃，3min；98℃，15s；60℃，15s；72℃，30s；35个循环；72℃，5min；16℃保持。
对PCR扩增产物进行Sanger测序，与野生型基因组序列进行比对，鉴定编辑类型。
3、pAYBEs介导的水稻植株的基因型分析
本发明在水稻植株中对不同pAYBEs的编辑活性进行了测试。具体检测情况如图7、图8、图9、图10、表9、表10所示。
pAYBEv1-hMPG载体在OsDEP1靶点共得到86簇转基因T0代苗，其中有3簇幼苗(#12、#25、#55)基因型在靶点处检测到了indel事件的出现，indel事件发生效率为3.49％，81簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件的出现，A-to-G编辑效率为94.19％。在OsEPSPS靶点共得到52簇转基因T0代苗，未检测到A-to-Y编辑或indel事件，其中19簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件的出现，A-to-G编辑效率为36.54％。在OsNRT1.1B靶点共得到88簇转基因T0代苗，其中有3簇幼苗(#12、#15、#34)基因型在靶点处检测到了indel事件的出现，indel事件发生效率为3.41％，剩下的79簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件的出现，A-to-G编辑效率为89.77％。在OsWaxy-T1靶点共得到53簇转基因T0代苗，未检测到A-to-Y编辑或indel事件，其中34簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件的出现，A-to-G编辑效率为64.15％。在OsWaxy-T2靶点共得到99簇转基因T0代苗，其中有3簇幼苗(#31、#29、#48)在靶点处检测到了基因型为双等位状态的A-to-T的编辑事件，A-to-T编辑效率为2.02％，其中，#31有4株单株，#48和#29基因型相同，为同一愈伤来源，分别含有3株和1株单株。此外，有8簇幼苗(#23、#25、#27、#38、#48、#77、#78、#92)基因型在靶点处检测到了indel事件的出现，indel事件发生效率为8.08％，其中9bp的***小片段在靶点处是发生了复制，93簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件，A-to-G编辑效率为93.94％。在OsWaxy-T3靶点共得到71簇转基因T0代苗，未检测到A-to-Y编辑或indel事件，61簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件，A-to-G编辑效率为85.92％。同时由深度测序结果分析可知，精准删除与***片段发生窗口集中在A4-A6至nCas9(D10A)切割位点，最多可以造成14bp的缺失与9bp的***。这些结果表明，pAYBEv1-hMPG载体可以实现A-to-Y的碱基编辑，同时也能够造成小片段的精准***和缺失。
pAYBEv3-hMPG-VP64载体在OsDEP1靶点共得到56簇转基因T0代苗，在靶点处未检测到A-to-Y编辑事件的出现，其中有14簇幼苗(#49、#3、#12、#25、#32、#33、#34、#36、#38、#39、#52、#31、#37、#40)在靶点处检测到了indel事件的出现，indel事件发生效率为25.00％，有51簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件的出现，A-to-G编辑效率为91.07％。pAYBEv3-hMPG-VP64载体在OsEPSPS靶点共得到76簇转基因T0代苗，在靶点处未检测到A-to-Y编辑事件的出现，其中有1簇幼苗(#23)基因型在靶点处检测到了indel事件的出现，indel事件发生效率为1.32％，有44簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件的出现，A-to-G编辑效率为57.89％。pAYBEv3-hMPG-VP64载体在OsNRT1.1B靶点共得到76簇转基因T0代苗，其中有1簇幼苗(#5)基因型在靶点处检测到了A-to-T编辑事件，A-to-T编辑效率为1.32％，#5株系有3株单株，为双等位状态A6>T6编辑事件，有1簇幼苗(#3)在靶点处检测到了indel事件的出现，indel事件发生效率为1.32％，有64簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件的出现，A-to-G编辑效率为84.21％。pAYBEv3-hMPG-VP64载体在OsWaxy-T1靶点共得到65簇转基因T0代苗，有1簇幼苗(#14)在靶点处检测到了基因型为A-to-T的编辑事件，A-to-T编辑效率为1.54％，#14株系含有单株2株，为A5>T5、A6>T6杂合状态编辑事件，此外，有13簇幼苗(#2、#25、#28、#30、#32、#55、#58、#49、#13、#20、#3、#7、#63)基因型在靶点处检测到了indel事件的出现，indel事件发生效率为20.00％，有42簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件，A-to-G编辑效率为64.62％。pAYBEv3-hMPG-VP64载体在OsWaxy-T2靶点共得到79簇转基因T0代苗，有3簇幼苗(#12、#3、#42)在靶点处检测到了基因型为A-to-T的编辑事件，A-to-T编辑效率为2.53％，相比pAYBEv1-hMPG载体，在OsWaxy-T2靶点A-to-T编辑效率提高1.25倍(2.53％/2.02％)。其中，#12株系为双等位状态A5>T5编辑事件，含有单株3株，#3与#42株系基因型相同视为同一个转化事件，为A5>T5的杂合编辑植株，分别含有单株1株、2株。此外，有15簇幼苗基因型在靶点处检测到了indel事件的出现，indel事件发生效率为18.99％，有66簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件，A-to-G编辑效率为83.54％。pAYBEv3-hMPG-VP64载体在OsWaxy-T3靶点共得到74簇转基因T0代苗，有7簇幼苗(#33、#40、#70、#43、#53、#54、#55)在靶点处检测到了基因型为A-to-T的编辑事件，A-to-T编辑效率为9.46％。其中，#33株系为含有T5>A5编辑事件的双等位编辑植株，含有单株2株，#40株系为含有T6>A6编辑事件的双等位编辑植株，含有单株2株，#70株系为含有T5>A5编辑事件的杂合编辑植株，含有单株2株，#43、#53、#54、#55等株系为嵌合状态的编辑植株，分别含有单株1株、2株、2株、1株单株；此外，有4簇幼苗基因型在靶点处检测到了indel事件的出现，indel事件发生效率为5.41％，有54簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件，A-to-G编辑效率为72.97％。
pAYBEv4-mhMPG-VP64载体在OsDEP1靶点共得到82簇转基因T0代苗，有9簇幼苗(#34-1、#35、#40-1、#42、#44-1、#44-2、#44-3、#65、#99)在靶点处检测到了A-to-T的编辑事件，A-to-T编辑效率为10.98％，相比pAYBEv3-hMPG-VP64载体，在OsDEP1靶点首次实现稳定株系的编辑。其中，#42株系有1株单株，为含有A5>T5编辑事件的纯合编辑植株，#35株系有3株单株，与#44-1、#44-2、#44-3等株系为含有A5>T5编辑事件的杂合编辑植株，#65株系与#99株系分别含有3株与1株单株，#65与#34-1、#40-1等株系皆为含有A6>T6编辑事件的嵌合编辑植株。此外，有28簇幼苗(#1、#2、#3、#7、#8、#9、#11、#20、#22、#25、#31、#36、#38、#40、#41、#44、#45、#46、#47、#48、#55、#56、#57、#58、#63、#65、#71、#74)在靶点处检测到了indel事件的出现，indel事件发生效率为34.15％，其中多种类型的小片段***是在靶点处发生了复制，删除片段多是集中在A5位点至nCas9切口处，有64簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件，A-to-G编辑效率为78.05％。pAYBEv4-mhMPG-VP64载体在OsEPSPS靶点共得到65簇转基因T0代苗，在靶点处未检测到A-to-Y编辑事件的出现。其中有1簇幼苗(#23)基因型在靶点处检测到了indel事件的出现，indel事件发生效率为1.54％，有33簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件的出现，A-to-G编辑效率为50.77％。pAYBEv4-mhMPG-VP64载体在OsNRT1.1B靶点共得到90簇转基因T0代苗，有2簇幼苗(#61、#89)在靶点处检测到了基因型为A-to-T的编辑事件，A-to-T编辑效率为2.22％，相比pAYBEv3-hMPG-VP64载体，在OsNRT1.1B靶点A-to-T编辑效率提高1.68倍(2.22％/1.32％)。其中，#61株系有4株单株，为含有A4>T4编辑事件的双等位编辑植株，#89株系有1株单株，为含有A4>T4编辑事件的嵌合编辑植株。此外，有5簇幼苗基因型在靶点处检测到了indel事件的出现，indel事件发生效率为5.56％，有74簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件，A-to-G编辑效率为82.22％。pAYBEv4-mhMPG-VP64载体在OsWaxy-T1靶点共得到71簇转基因T0代苗，有5簇幼苗(#64、#51、#2、#49、#50)在靶点处检测到了基因型为A-to-T的编辑事件，其中#2、#49、#50株系基因型一致，视为同一个转化事件，A-to-T编辑效率为4.23％，相比pAYBEv3-hMPG-VP64载体，在OsWaxy-T1靶点A-to-T编辑效率提高2.75倍(4.23％/1.54％)。#2、#49、#50株系分别含有单株3株、1株、2株，为含有T5>A5、T6>A6编辑事件的杂合编辑植株，#64株系有4株单株，为含有双T5>A5、T6>A6编辑事件的双等位编辑植株，#51株系有2株单株，为含有T5>A5、T6>A6编辑事件的嵌合编辑植株。此外，有10簇幼苗(#2、#3、#7、#13、#20、#25、#28、#58、#59、#63)基因型在靶点处检测到了indel事件的出现，indel事件发生效率为14.08％，有45簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件，A-to-G编辑效率为63.38％。pAYBEv4-mhMPG-VP64载体在OsWaxy-T2靶点共得到82簇转基因T0代苗，有7簇幼苗(#6、#20、#27、#32、#56、#39、#74)在靶点处检测到了基因型为A-to-T的编辑事件，A-to-T编辑效率为8.54％，相比pAYBEv3-hMPG-VP64载体，在OsWaxy-T2靶点A-to-T编辑效率提高3.38倍(8.54％/2.53％)。其中，#6、#20、#27、#32、#56为含有A5>T5编辑事件的双等位编辑植株，分别含有3株、1株、4株、3株、5株单株，#39、#74为含有A5>T5编辑事件的嵌合编辑植株，分别含有单株2株、1株。此外，有21簇幼苗(#2、#3、#4、#5、#7、#8、#10、#13、#15、#16、#20、#21、#25、#27、#28、#29、#81、#82)基因型在靶点处检测到了indel事件的出现，indel事件发生效率为25.61％。有62簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件，A-to-G编辑效率为75.61％。pAYBEv4-mhMPG-VP64载体在OsWaxy-T3靶点共得到58簇转基因T0代苗，有10簇幼苗(#34、#6、#15、#37、#3、#4、#31、#36、#47、#51)在靶点处检测到了基因型为A-to-T的编辑事件，A-to-T编辑效率为17.24％，相比pAYBEv3-hMPG-VP64载体，在OsWaxy-T3靶点A-to-T编辑效率提高1.82倍(17.24％/9.46％)。其中，#34株系含有T6>A6编辑事件的双等位编辑植株，含有单株3株；#6、#15、#37等株系为含有T5>A5编辑事件的杂合编辑植株，分别含有2株、2株、3株单株；#3、#4、#31、#36、#47、#51株系含有T5>A5编辑事件的嵌合编辑植株，分别含有单株2株、1株、3株、2株、2株、1株。此外，有6簇幼苗(#15、#16、#25、#31、#47、#54)基因型在靶点处检测到了indel事件的出现，indel事件发生效率为10.34％，有37簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件，A-to-G编辑效率为63.79％。
表9、水稻稳定转化株系pAYBEs效率统计
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注：下划线处为PAM序列。
表10、A-to-Y水稻稳定转化株系基因型列表
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/>
/>
注：下划线处为PAM序列；括号内为每个株系含有单株数目；A-to-Y碱基编辑标注为加粗；
Ho表示纯合；He表示杂合；Bi表示双等位；Chi表示嵌合。
4、植物单碱基编辑A to Y脱靶检测
根据CRISPR-GE(http://skl.scau.edu.cn/)网站预测脱靶靶点，寻找序列并设计相应的引物对A-to-Y编辑株系进行扩增鉴定，与OsDEP1、OsEPSPS、OsNRT1.1B、OsWaxy-T1、OsWaxy-T2、OsWaxy-T3等靶点相似的脱靶位点，PCR扩增经Sanger测序后，结果显示在预测的脱靶位点处并没有编辑事件的出现。详细脱靶位点序列信息见表11。
表11、脱靶位点分析
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注：下划线处为PAM序列；加粗碱基为脱靶位点与靶点错配碱基。

Claims (6)

1.成套***在如下S1）-S9）任一种中的应用：
S1）植物基因组序列的编辑；
S2）制备植物基因组序列的编辑的产品；
S3）提高植物基因组序列的编辑效率；
S4）制备提高植物基因组序列的编辑效率的产品；
S5）拓展植物基因组序列的编辑窗口；
S6）制备拓展植物基因组序列的编辑窗口的产品；
S7）制备植物突变体；
S8）植物育种；
S9）制备植物育种的产品；
所述成套***为如下M1）-M2）中任一种：
M1）所述成套***包括依次由核定位信号、反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG和核定位信号融合而成的融合蛋白、gRNA和筛选剂抗性蛋白；
M2）所述成套***包括依次由核定位信号、反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶七突突变体mhMPG和核定位信号融合而成的融合蛋白、gRNA和筛选剂抗性蛋白；
所述人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶七突突变体mhMPG为将所述人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG氨基酸序列的第163位由甘氨酸突变为精氨酸，且将第169位由天冬酰胺突变为丝氨酸，且将第198位由丝氨酸突变为丙氨酸，且将第202位由赖氨酸突变为丙氨酸，且将第203位由甘氨酸突变为丙氨酸，且将第206位由丝氨酸突变为丙氨酸，且将第210位由赖氨酸突变为丙氨酸后得到的蛋白质；
所述腺嘌呤脱氨酶TadA8e为氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
所述Cas9(D10A)缺刻酶为氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
所述人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG为氨基酸序列是序列6所示的蛋白质；
所述反式激活因子Vp64为氨基酸序列是序列9所示的蛋白质；
所述核定位信号为氨基酸序列是序列10所示的蛋白质；
所述植物为水稻。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述筛选剂抗性蛋白为潮霉素磷酸转移酶。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述潮霉素磷酸转移酶为氨基酸序列是序列4所示的蛋白质。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：所述植物基因组序列的编辑包括将植物基因组序列中的碱基A颠换为碱基C或碱基T。
5.如下T1）-T4）任一所述的方法：
T1）植物基因组序列的编辑方法，包括如下步骤：使植物表达权利要求1中所述的成套***，以实现植物基因组序列的编辑；
T2）提高植物基因组序列的编辑效率的方法，包括如下步骤：使植物表达权利要求1中所述的成套***，以实现提高植物基因组序列的编辑效率；
T3）拓展植物基因组序列的编辑窗口的方法，包括如下步骤：使植物表达权利要求1中所述的成套***，以实现拓展植物基因组序列的编辑窗口；
T4）植物突变体的制备方法，包括如下步骤：使植物表达权利要求1中所述的成套***，以获得植物突变体；
所述植物为水稻。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述植物基因组序列的编辑包括将植物基因组序列中的碱基A颠换为碱基C或碱基T。
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