CN110066824B

CN110066824B - 一套用于水稻的碱基编辑人工***

Info

Publication number: CN110066824B
Application number: CN201810069129.6A
Authority: CN
Inventors: 周焕斌; 严芳; 旷永洁
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-01-24
Filing date: 2018-01-24
Publication date: 2021-06-08
Anticipated expiration: 2038-01-24
Also published as: CN110066824A

Abstract

本申请涉及一套用于水稻的碱基编辑人工***，其包括：第I调节元件，其包括能够编码如氨基酸序列I的核苷酸序列；其中所述氨基酸序列I包括如SEQ ID No.1所示的氨基酸序；第II调节元件，其包括依次从5’端到3’端的第II‑1核苷酸序列和第II‑2核苷酸序列；所述第II‑1核苷酸序列包括靶核苷酸序列；所述第II‑2核苷酸序列包括来源于化脓链球菌的sgRNA核酸序列；所述第II‑1核苷酸序列和所述第II‑2核苷酸序列转录融合。

Description

一套用于水稻的碱基编辑人工***

技术领域

本申请涉及一套用于水稻的碱基编辑人工***。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是世界主要粮食作物之一，养活了世界上近一半人口，包括几乎整个东亚和东南亚的人口。中国是世界上水稻总产量最高的国家，水稻产量占全球总量的30％左右。在生产过程中，以稻瘟病、稻曲病和纹枯病为主的水稻三大病害严重制约着水稻的生长发育，导致水稻产量和品质降低，威胁着全球的粮食安全。因此，提高产量，改善稻米品质，增加水稻植株抗病、抗逆性等研究以保证粮食的稳定供给是人类社会可持续性发展的重大课题。水稻作为单子叶植物的模式植物，其研究技术、方法、理论和成果对其它禾本科植物，如小麦、玉米、高粱等具有重要指导作用。

随着全基因组测序等现代生物技术的发展，基因编辑在农业上的应用也逐渐受到研究者的青睐，但是伴随产生的大量植物基因组序列的解读，基因的挖掘和应用严重滞后以及转基因生物安全生产问题严重制约着其在农业应用上的发展。近年来，以ZFN、TALEN和CRISPR为主的人工核酸酶技术陆续开发成功。尤其CRISPR/Cas9技术，因其易操作、效率高以及普适性受到了研究人员的广泛关注。目前，CRISPR/Cas9技术已广泛应用于拟南芥、烟草、水稻、大豆、番茄、玉米、大麦、小麦、马铃薯、蘑菇等模式植物和农作物上，获得了大量基因功能丧失性突变体。

相对于目前广泛的基因功能缺失突变体材料的定制应用，基因功能获得性突变体材料的创制的意义更为重大。迄今为止，研究人员主要利用同源重组机制等传统的方法获得基因功能获得性突变体，而在包含水稻在内的大部分高等生物体内，非同源末端连接修复机制在外源DNA片段的***过程中占主导地位，同源重组定制突变体的效率仅有千分之一到百分之二。

发明内容

由于现有技术中的碱基编辑***对水稻基因组中碱基A的编辑具有不敏感性，为了解决这一技术难题，本申请提供了一套人工***，所述人工***包括

第I调节元件，其包括能够编码如氨基酸序列I的核苷酸序列；其中所述氨基酸序列I包括如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；

第II调节元件，其包括依次从5’端到3’端的第II-1核苷酸序列和第II-2核苷酸序列；所述第II-1核苷酸序列包括靶核苷酸序列；所述第II-2核苷酸序列包括来源于化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的sgRNA核酸序列；所述第II-1核苷酸序列和所述第II-2核苷酸序列转录融合，其产物能引导第I调控元件编码的蛋白至目标生物基因组中待突变的靶位点处，并将所述靶核苷酸序列中的靶位点处的A突变为G，或将所述靶核苷酸序列中的靶位点处的T突变为C；

当所述第II调节元件为多个时，包含在其中的多个第II-1核苷酸序列两两不相同。另外，当所述第II调节元件为多个时，它们可以串联的形成连接在一起。

在一个具体实施方式中，所述靶核苷酸序列中的靶位点处于所述靶核苷酸序列的从5′端到3′端方向的4至7位置。

通过利用本申请的人工***，可以将水稻基因组内源位点的特定的A定点突变为G，筛选得到水稻基因功能获得性突变体；或T定点突变为C，筛选得到水稻基因功能获得性突变体，此时，使用的靶核苷酸序列为靶位点处为A那条链上的核苷酸序列。

在一个具体实施方式中，所述第I调节元件的核苷酸序列为能够适于在水稻中表达的核苷酸序列，所述第II调节元件的核苷酸序列为能够适于在水稻中发生转录的核苷酸序列。

在一个具体实施方式中，能够编码如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的核苷酸编码序列如SEQ ID No.2所示。如SEQ ID No.2所示核苷酸编码序列能够较优的在水稻中使用。

在一个具体实施方式中，所述第II-2核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

在一个具体实施方式中，所述第II-1核苷酸序列还包括含有IIS型限制性内切酶的酶切位点的克隆位点，所述靶核苷酸序列通过所述第II-1核苷酸序列上的所述克隆位点而被克隆到其中(例如通过酶切-连接的方式将所述靶核苷酸序列连接到所述克隆位点上)，以使所述第II-1核苷酸序列与第II-2序列转录融合；当所述第II调节元件为多个时，用于克隆不同靶核苷酸序列的所述IIS型限制性内切酶的酶切位点两两不相同。

其中，由于所述靶核苷酸序列是根据碱基编辑位点而变化的，因此可以将其他元件构建好，包括事先克隆到相关位置的限制性内切酶的酶切位点。在使用的之前，再根据碱基编辑目的将所述靶核苷酸序列通过限制性内切酶的酶切位点的切割而被克隆。当所述第II调节元件为多个时，包含在其中的多个第II-1核苷酸序列中的限制性内切酶的酶切位点两两不相同，如此，可以有效的保障不同的靶核苷酸顺利的被克隆到目标位置。多个靶核苷酸序列可用于目标生物基因组上的多个待突变的靶位点的碱基替换。

在一个具体实施方式中，优选所述克隆位点的核苷酸序列包括SEQ ID No.4和/或SEQID No.5。

在一个具体实施方式中，通过如下方式确定所述靶核苷酸序列：

1)确定水稻基因组上需要被改造的核苷酸序列；

2)判断步骤1)中确定的需要被改造的核苷酸序列或其反向互补序列中是否携带有待突变的核苷酸A，并判断所述待突变的核苷酸A突变为G、或所述待突变的核苷酸T突变为C后引起的改变是否符合预期；

3)在需要被改造的核苷酸序列或其反向互补序列中筛选靶标序列：向所述待突变的核苷酸A的3′端方向搜索以确认存在能够被氨基酸序列I识别的识别模序，且所述待突变的核苷酸A处在所述识别模序5′端上游的-19至-13的位置，由此确定的所述识别模序5′端上游17至21个核苷酸序列(不含识别模序)为所述靶核苷酸序列。

在一个具体实施方式中，所识别模序为5′-NGG-3′、5′-NGA-3′、5′-GAGN-3′、5′-AAGN-3′中的一种，所述靶核苷酸序列上游的17至21个核苷酸序列，淘汰含有连续五个T的核苷酸序列；其中，所述N为A、G、C和T中的一种。

在一个具体实施方式中，所述靶核苷酸序列如SEQ ID No.14、SEQ ID No.17和SEQID No.24中所示的至少一种。

在一个具体实施方式中，所述人工***还包括在所述第I调节元件的5’端的能够用于水稻中的，且能够启动所述第I调节元件转录的第一启动子；和/或所述人工***还包括在所述第II调节元件的5’端的能够用于水稻中的，且能够启动所述第II调节元件转录的第二启动子。

在一个具体实施方式中，所述第一启动子为RNA聚合酶II型启动子；和/或第二启动子为RNA聚合酶III型启动子。

在一个具体实施方式中，第一启动子为SEQ ID No.6；和/或第二启动子为SEQ IDNo.7。

在一个具体实施方式中，所述人工***还包括在所述第I调节元件的3’端的能够终止所述第I调节元件转录的第一终止子；和/或所述人工***还包括在所述第II调节元件的3’端的能够终止所述第II调节元件转录的第二终止子。

在一个具体实施方式中，第一终止子为SEQ ID No.8；和/或第二终止子为SEQ IDNo.9。

在一个具体实施方式中，所述第I调节元件和所述第II元件能够被克隆到至少一个载体上。例如，所述第I调节元件表达框架和所述第II调节元件转录框架能够被克隆或整合到同一个载体上，或第I调节元件表达框架和第II调节元件转录框架分别位于不同的载体上时，可以采用基因枪法、农杆菌侵染法或PEG介导转化法将两个框架或含有两个框架的载体导入到水稻的愈伤组织或水稻原生质体中。

在一个具体实施方式中，所述第I调节元件能够被克隆到pCAMBIA1300上；所述第II调节元件被克隆到入门载体pENTR4上。pCAMBIA1300为基于Gateway反应并用于水稻遗传转化的双元载体，也可以使用其他类似的双元载体。

在一个具体实施方式中，所述第一启动子、第I调节元件和第一终止子能够被克隆到pCAMBIA1300载体上。

在一个具体实施方式中，第二启动子、第II调节元件和第二终止子被克隆到pENTR4载体上。当所述第II调节元件为多个时，其5’端的第二启动子和其3’端的终止子也为多个。即第二启动子、第II调节元件和第二终止子形成一组，成套出现。含有不同第II调节元件的多个组可以串联的形成连接在一起。其中，第II调节元件的不同，主要指的是第II-1核苷酸序列的不同。

在一个具体实施方式中，所述第I调节元件和所述第II调节元件能够被整合到同一个载体上，或被分布在多个载体上一起使用。

本申请之二提供了一种如本申请之一中任意一人工***在用于将水稻基因组中的A定点突变为G，或将水稻基因组中的T定点突变为C中的一种的应用。

本申请之三提供了一种将水稻基因组上的A定点突变为G的方法，其包括如下步骤：

1)将本申请之一中任意一人工***通过农杆菌介导的方法导入到水稻愈伤组织，然后培养以获得水稻植株；

2)筛选获得含有定点突变的水稻植株。

进一步地，所述水稻植株能够产生含有定点替换碱基的种子，水稻获得了新的经济性状。

在进行所述的人工***导入时，可以采用农杆菌侵染法，也可以采用基因枪法或PEG介导转化的方法中的一种将所述的人工***导入到水稻愈伤组织或水稻原生质体中，这是本领域技术人员容易理解的。

本领域的技术人员公知，水稻基因组DNA由两条链组成，因此，所述靶核苷酸序列可以在其中的任意一条链上，并且靶位点处为A。例如，当所述靶核苷酸序列位于某一功能基因的一条链中时，该功能基因的特定位点上的A被定点突变为G后，如果其中的一种突变能够获得预期的其对应的功能蛋白中的氨基酸，则可以采用此***来实现，即可以通过直接的碱基替换三联体密码子中的A为G，得到水稻基因功能获得性突变体；或当所述靶核苷酸序列位于某一功能基因的另一条链中时，该功能基因的特定位点上的T被定点突变为C后，如果其中的一种突变能够获得预期的其对应的功能蛋白中的氨基酸，也可以采用此***来实现，即可以通过将该链中的T替换为C来改变该链中的所述三联体密码子编码氨基酸，得到水稻基因功能获得性突变体。

本申请的有益效果在于：

a)第II调节元件可以为多个，这样可以同时编辑水稻细胞内多个基因靶位点。

b)本申请的人工***不但实现了对水稻基因组中碱基A的编辑，而且该人工***的碱基编辑效率非常高，可达32-62％。

c)该全新碱基编辑工具盒，其能广泛地应用于水稻基因组中靶标基因单碱基定向突变，以此创制基因功能获得性突变体材料。此碱基编辑器在植物中的应用比通过HR的基因替换或通过NHEJ的基因***更加有效和经济；通过农杆菌介导的植物转化也容易分离到携带有预期遗传变异的植物材料。该碱基编辑工具盒的成功开发，为植物研究领域科研人员提供一个重要的基因功能研究工具，并在水稻基因功能研究和分子育种方向上为培育水稻新品种提供了新的策略。

附图说明

图1显示rBE14在OsWRKY45基因靶位点处的编辑效果图。

图2显示rBE14在OsSERK2基因靶位点处的编辑效果图。

图3显示rBE14和rBE17在OsMPK6基因靶位点处的编辑效果图。

具体实施方式

以下通过优选的实施例的形式对本申请的上述内容作进一步的详细说明，但不构成对本发明的限制。

如无特别说明，本申请的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。

pCAMBIA1300来源于BioVector NTCC典型培养物保藏中心。在pCAMBIA1300中***了attR1-ccdB-attR2模块，用于gateway反应接受来自于入门载体的attL1-靶向序列转录模块-attL2模块。

pENTR4载体的来源：购自美国Invitrogen公司。

实施例1

1.1pUbi:rBE14和pUbi:rBE17的构建

首先，将SEQ ID No.2分段进行人工合成，然后将其克隆到克隆载体pUC57(该载体可商业获得)上，得到pUC57-2。其中SEQ ID No.2编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。将SEQ ID No.10分段进行人工合成，然后将其克隆到克隆载体pUC57上，得到pUC57-10。其中SEQ ID No.10编码的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示。

然后，将SEQ ID No.6(玉米的泛素启动子UbiP)、SEQ ID No.2、SEQ ID No.8(Nos终止子)按照从5’到3’的方向克隆到pCAMBIA 1300载体，命名为pUbi:rBE14。将SEQ IDNo.6(玉米的泛素启动子UbiP)、SEQ ID No.10、SEQ ID No.8(Nos终止子)按照从5’到3’的方向克隆到pCAMBIA 1300载体，命名为pUbi:rBE17。

1.2pENTR4:sgRNA的构建

按照从5’端到3’端的方向，将依次连接的U6启动子序列(SEQ ID No.7)、含有两个BtgZI酶切位点的核苷酸序列(SEQ ID No.4)、sgRNA序列(SEQ ID No.3)、(T)8终止序列(SEQ ID No.9)、U6启动子序列(SEQ ID No.7)、含有两个BsaI酶切位点的核苷酸序列(SEQID No.5)、sgRNA序列(SEQ ID No.3)、(T)8终止序列(SEQ ID No.9)进行人工合成，将序列克隆到pENTR4载体中，命名为pENTR4:sgRNA。其中的两个BtgZI或两个BsaI酶切位点用于克隆中特定基因的识别序列(靶核苷酸序列)。

实施例2

使用pUbi:rBE14对OsWRKY45和OsSERK2进行碱基编辑

2.1针对OsWRKY45、OsSERK2基因的识别序列设计和克隆

每个基因的转录序列和基因组序列从MSU/TIGR水稻基因组数据库中获得(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。设计靶序列的原则：1)判断编辑位点是否含有核苷酸碱基A或T，以及相应碱基A突变为G或相应碱基T突变为C后引起的氨基酸改变是否符合预期；对于含有T的核苷酸序列，作为靶核苷酸序列使用时，使用其反向互补序列进行碱基编辑；2)在3′端方向搜索PAM motif序列，使突变碱基A或T处在靶核苷酸序列5′端方向的4至7位置。其中，pUbi:rBE14***识别的PAM motif为NGG、NAG、GAGN和AAGN等，所述N是A或G或C或T；3)合成18-20bp的靶核苷酸序列，将其克隆到pENTR4:sgRNA相应的酶切位点处完成载体的构建。

对于OsWRKY45基因，设计含有与BtgZI酶切位点末端连接匹配的靶核苷酸序列引物如下：gOsWRKY45-F8(SEQ ID No.12)和gOsWRKY45-R8(SEQ ID No.13)。

合成引物后，使用T4多聚核苷酸激酶将引物对gWRKY45-F8和gWRKY45-R8进行磷酸化处理，退火形成双链，再将gOsWRKY45-F8/R8克隆到pENTR4:sgRNA载体上的BtgZI位点，测序确认***完全正确。其中以正向引物表示***pENTR4:sgRNA载体上的BtgZI位点的靶核苷酸序列，如SEQ ID No.14所示。将克隆好的载体用AatII酶切进行线性化，再通过Gateway的LR反应分别转移到pUbi:rBE14中。其中，在靶核苷酸序列中从5’端到3’端方向的第4位和第7位均含有碱基A。

对于OsSERK2基因，设计含有与BsaI酶切位点末端连接匹配的靶核苷酸序列引物如下：gOsSERK2-F4(SEQ ID No.15)和gOsSERK2-R4(SEQ ID No.16)

合成引物后，使用T4多聚核苷酸激酶将引物进行磷酸化处理，退火形成双链，将gOsSERK2-F4/R4克隆到pENTR4:sgRNA载体的BsaI酶切位点中，测序确认***片段完全正确。其中以正向引物表示***pENTR4:sgRNA载体上的BsaI位点的靶核苷酸序列，如SEQ IDNo.17所示。将克隆好的载体用AatII酶切进行线性化，再通过Gateway的LR反应克隆至pUbi:rBE14中。其中，在靶核苷酸序列中从5’端到3’端方向的第6位含有碱基A。

2.2rBE***转化粳稻品种Kitaake

1)水稻愈伤诱导：

去壳的未成熟的水稻种子用50％的市售消毒液处理25分钟；无菌水清洗3-5次，然后将种子转移至无菌的培养皿中，吸出多余的水份；将种子放置于MSD平板上(4.43g/L MS粉；30g/L蔗糖；2ml/L 2,4-D；8g/L植物凝胶；pH5.7)，于光照培养室培养10天，诱导愈伤组织形成；去除种子的胚和芽，将愈伤组织转移至一个新的MSD培养皿上，培养5天，直至能够用于农杆菌的转化

2)农杆菌转化：

将最终载体通过电击法转入到农杆菌菌株EHA105中，在LB培养基中过夜培养12小时；收集农杆菌，用MSD溶液重悬，使其OD₆₀₀＝0.1，待用。

3)水稻愈伤的农杆菌侵染：

将愈伤组织置于上述农杆菌悬浮液中30分钟；除去农杆菌悬浮液，将愈伤组织转移至无菌的吸水纸上；将愈伤组织转移至新的含有100μM乙酰丁香酮的MSD培养基上，室温避光培养3天。

4)水稻抗性愈伤筛选：

将暗培养后的愈伤组织转移至MSD培养基(200mg/L特美汀；50mg/L潮霉素B)上培养2周至2个月，直至愈伤组织的表面出现抗性愈伤，转移抗性愈伤到新的MSD培养基(200mg/L特美汀，50mg/L潮霉素B)上，每2周换一次培养基。

5)抗性愈伤分化与生根

将抗性愈伤组织转移至再生培养基上(4.43g/L MS粉；30g/L蔗糖；25g/L山梨醇；0.5mg/L NAA；3mg/L BA；100mg/L特美汀；50mg/L潮霉素B；12g/L琼脂粉；pH＝5.7)，直至长成植株幼苗，每7-10天转移一次；转移幼苗至1/2MS培养基(2.21g/L MS粉；15g/L蔗糖；8g/L植物凝胶；pH5.7)中生根。

2.3对T0代转基因水稻中OsWRKY45、OsSERK2基因靶位点进行鉴定

用CTAB法提取抗性愈伤的基因组DNA。

根据OsWRKY45基因的靶位点DNA序列设计用于鉴定的特异性的PCR引物：OsWRKY45-F1(SEQ ID No.18)，OsWRKY45-R1(SEQ ID No.19)，利用I-5高保真酶混合液(MACLAB)进行PCR扩增目的片段500bp，PCR产物直接测序。分析测序后的OsWRKY45靶核苷酸序列正向引物可知，在其第4位和7位都含有碱基A，通过对53个水稻抗性愈伤检测发现，第4位和第7位碱基A都能突变为G，33个抗性愈伤的第7位碱基A突变为T，13个抗性愈伤的第4位碱基A突变为G。pUbi:rBE14***对OsWRKY45的靶位点总编辑效率高达62％。

根据OsSERK2基因的靶位点DNA序列设计用于鉴定的特异性的PCR引物：OsSERK2-F2(SEQ ID No.20)，OsSERK2-R2(SEQ ID No.21)，利用I-5高保真酶混合液(MACLAB)进行PCR扩增目的片段498bp，PCR产物直接测序。分析测序后的OsSERK2靶核苷酸序列正向引物可知，在其第6位含有碱基A，通过对78株水稻幼苗检测发现有25株水稻第6位碱基A突变为G，结果显示pUbi:rBE14***对OsSERK2靶位点编辑效率高达33.25％。

实施例3

使用pUbi:rBE14和pUbi:rBE17分别对OsMPK6进行碱基编辑

pUbi:rBE14***和pUbi:rBE17***识别的PAM motif为NGG、NAG、GAGN和AAGN等，所述N是A或G或C或T。

按照实施例2中靶核苷酸序列引物设计原则设计OsMPK6的靶核苷酸序列的含有与BsaI酶切位点末端连接匹配的引物：gOsMPK6-F1(SEQ ID No.22)和gOsMPK6-R1(SEQIDNo.23)。

合成引物后，使用T4多聚核苷酸激酶将引物进行磷酸化处理，退火形成双链，将gOsMPK6-F1/R1克隆到pENTR4:sgRNA载体的BsaI酶切位点中，测序确认***片段完全正确。其中以正向引物表示***pENTR4:sgRNA载体上的BsaI位点的靶核苷酸序列，如SEQIDNo.24所示。其中，在靶核苷酸序列中从5’端到3’端方向的第2位、第4位和第7位均含有碱基A。

其他操作同实施例2。

根据OsMPK6基因的靶位点DNA序列设计用于鉴定的特异性的PCR引物：OsMPK6-F3(SEQ ID No.25)，OsMPK6-R3(SEQ ID No.26)，利用I-5高保真酶混合液(MACLAB)进行PCR扩增目的片段467bp，PCR产物直接测序。分析测序后的OsMPK6靶核苷酸序列正向引物可知：对于pUbi:rBE14***，通过对68株水稻幼苗检测发现有12株水稻第6位碱基A突变为G，结果显示pUbi:rBE14***对OsMPK6靶位点编辑效率位16.67％；对于pUbi:rBE17***，通过对60株水稻幼苗检测没有发现第2位、第4位和第7位碱基A突变位G，结果显示pUbi:rBE17***对OsMPK6靶位点编辑效率位0％。这表明pUbi:rBE14高效特异性的编辑靶序列第4至7位碱基A，而pUbi:rBE17在此编辑框内并不发挥作用。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 一套用于水稻的碱基编辑人工***

<130> LHA1860032

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1775

<212> PRT

<213> 人工序列(non)

<400> 1

Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu

1 5 10 15

Thr Leu Ala Lys Arg Ala Trp Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala

20 25 30

Val Leu Val His Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Pro

35 40 45

Ile Gly Arg His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg

50 55 60

Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu

65 70 75 80

Tyr Val Thr Leu Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His

85 90 95

Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Ala Arg Asp Ala Lys Thr Gly

100 105 110

Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His

115 120 125

Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu

130 135 140

Leu Ser Asp Phe Phe Arg Met Arg Arg Gln Glu Ile Lys Ala Gln Lys

145 150 155 160

Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser

165 170 175

Gly Gly Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser

180 185 190

Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr

195 200 205

Trp Met Arg His Ala Leu Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg

210 215 220

Glu Val Pro Val Gly Ala Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly

225 230 235 240

Glu Gly Trp Asn Arg Ala Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala

245 250 255

Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg

260 265 270

Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys

275 280 285

Ala Gly Ala Met Ile His Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val

290 295 300

Arg Asn Ala Lys Thr Gly Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His

305 310 315 320

Tyr Pro Gly Met Asn His Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala

325 330 335

Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Phe Phe Arg Met Asn Arg Gln

340 345 350

Val Phe Asn Ala Gln Lys Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp Ser Gly Gly

355 360 365

Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

370 375 380

Ala Thr Pro Glu Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Asp Lys Lys

385 390 395 400

Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val

405 410 415

Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly

420 425 430

Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu

435 440 445

Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala

450 455 460

Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu

465 470 475 480

Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg

485 490 495

Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His

500 505 510

Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr

515 520 525

Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys

530 535 540

Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe

545 550 555 560

Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp

565 570 575

Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe

580 585 590

Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu

595 600 605

Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln

610 615 620

Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu

625 630 635 640

Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu

645 650 655

Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp

660 665 670

Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala

675 680 685

Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val

690 695 700

Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg

705 710 715 720

Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg

725 730 735

Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys

740 745 750

Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe

755 760 765

Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu

770 775 780

Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr

785 790 795 800

Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His

805 810 815

Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn

820 825 830

Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val

835 840 845

Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys

850 855 860

Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys

865 870 875 880

Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys

885 890 895

Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu

900 905 910

Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu

915 920 925

Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile

930 935 940

Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu

945 950 955 960

Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile

965 970 975

Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp

980 985 990

Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn

995 1000 1005

Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp

1010 1015 1020

Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp

1025 1030 1035 1040

Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly

1045 1050 1055

Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly

1060 1065 1070

Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn

1075 1080 1085

Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile

1090 1095 1100

Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile

1105 1110 1115 1120

Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr

1125 1130 1135

Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro

1140 1145 1150

Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys

1155 1160 1165

Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile

1170 1175 1180

Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr

1185 1190 1195 1200

Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg

1205 1210 1215

Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr

1220 1225 1230

Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile

1235 1240 1245

Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp

1250 1255 1260

Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg

1265 1270 1275 1280

Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu

1285 1290 1295

Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe

1300 1305 1310

Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala

1315 1320 1325

Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys

1330 1335 1340

Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser

1345 1350 1355 1360

Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn

1365 1370 1375

Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala

1380 1385 1390

Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp

1395 1400 1405

Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu

1410 1415 1420

Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn

1425 1430 1435 1440

Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg

1445 1450 1455

Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys

1460 1465 1470

Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val

1475 1480 1485

Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu

1490 1495 1500

Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys

1505 1510 1515 1520

Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala

1525 1530 1535

Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys

1540 1545 1550

Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser

1555 1560 1565

Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys

1570 1575 1580

Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe

1585 1590 1595 1600

Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu

1605 1610 1615

Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu

1620 1625 1630

Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn

1635 1640 1645

Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu

1650 1655 1660

Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp

1665 1670 1675 1680

Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys

1685 1690 1695

Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr

1700 1705 1710

Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp

1715 1720 1725

Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile

1730 1735 1740

His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln

1745 1750 1755 1760

Leu Gly Gly Asp Ser Gly Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1765 1770 1775

<210> 2

<211> 5298

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(non)

<400> 2

atgtccgaag tcgagttttc ccatgagtac tggatgagac acgcattgac tctcgcaaag 60

agggcttggg atgaacgcga ggtgcccgtg ggggcagtac tcgtgcataa caatcgcgta 120

atcggcgaag gttggaatag gccgatcgga cgccacgacc ccactgcaca tgcggaaatc 180

atggcccttc gacagggagg gcttgtgatg cagaattatc gacttatcga tgcgacgctg 240

tacgtcacgc ttgaaccttg cgtaatgtgc gcgggagcta tgattcactc ccgcattgga 300

cgagttgtat tcggtgcccg cgacgccaag acgggtgccg caggttcact gatggacgtg 360

ctgcatcacc caggcatgaa ccaccgggta gaaatcacag aaggcatatt ggcggacgaa 420

tgtgcggcgc tgttgtccga cttttttcgc atgcggaggc aggagatcaa ggcccagaaa 480

aaagcacaat cctctactga ctccggcggc tcctccggcg gctcctccgg cggcgaaact 540

ccaggcactt ccgaatccgc gactccagaa tcctccggcg gctcctccgg cggctcctcc 600

gaagtcgagt tttcccatga gtactggatg agacacgcat tgactctcgc aaagagggct 660

agagatgaac gcgaggtgcc cgtgggggca gtactcgtgc tcaacaatcg cgtaatcggc 720

gaaggttgga atagggctat cggactccac gaccccactg cacatgcgga aatcatggcc 780

cttcgacagg gagggcttgt gatgcagaat tatcgactta tcgatgcgac gctgtacgtc 840

acgtttgaac cttgcgtaat gtgcgcggga gctatgattc actcccgcat tggacgagtt 900

gtattcggtg ttcgcaatgc caagacgggt gccgcaggtt cactgatgga cgtgctgcat 960

tacccaggca tgaaccaccg ggtagaaatc acagaaggca tattggcgga cgaatgtgcc 1020

gcgctgttgt gttacttttt tcgcatgaat aggcaggtgt ttaatgccca gaaaaaagca 1080

caatcctcta ctgactccgg cggctcctcc ggcggctcct ccggcggcga aactccaggc 1140

acttccgaat ccgcgactcc agaatcctcc ggcggctcct ccggcggctc cattgggaca 1200

aactctgtgg gctgggcggt aattaccgac gagtacaagg tgcctagtaa gaaatttaaa 1260

gtgctcggaa acactgacag gcactctata aagaagaacc tgatcggggc actgcttttc 1320

gactccggag agacggcgga ggcgacgcgt ctcaagcgta ccgcgcgccg caggtacaca 1380

agaaggaaga ataggatctg ctacttgcag gaaatcttca gtaacgagat ggcgaaggtc 1440

gacgatagtt tctttcatcg gttggaagaa tcgttcctcg tagaggagga caaaaagcac 1500

gagcgtcacc caatattcgg gaatattgtt gacgaggttg cctaccatga gaaatatcct 1560

acaatatatc acctccgtaa gaagcttgtc gattcaactg ataaggctga tctcagactc 1620

atctatcttg ccctcgcaca tatgattaag tttcgtggcc acttcttgat tgaaggcgac 1680

ctcaacccgg acaactcaga tgttgacaag ctttttatac agctcgtcca gacatataac 1740

cagctgtttg aagagaatcc catcaatgcg agtggggttg atgctaacgc cattttgtcc 1800

gccaggttgt ccaaatctcg cagactggaa aacctgatcg cacagcttcc cggtgaaaag 1860

aaaaacgggc tcttcggcaa tctcatcgca ctgtccctcg gcctcacccc aaacttcaag 1920

tctaacttcg acctggccga ggatgcgaag ctccagctgt caaaagatac atacgacgac 1980

gatttggaca atctgcttgc gcaaataggc gaccagtatg cggacctgtt cctggctgcc 2040

aaaaatctgt cagatgcaat cctcctgtcc gatatattgc gtgtgaacac cgaaatcacg 2100

aaggcaccgc ttagcgcatc catgatcaag agatacgacg agcaccatca ggacctcaca 2160

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caaagcaaga atggatatgc tggctatatt gacggtggcg cttcgcagga ggagttctat 2280

aaattcatta agccgattct ggagaagatg gacggaacgg aggagctcct cgtcaagctt 2340

aaccgggaag acctgttgcg gaagcagagg acttttgata acggctctat tccgcaccaa 2400

atccatctgg gtgagttgca cgcaatcttg agaagacaag aggatttcta cccgttcctt 2460

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ccactggcgc gcggaaatag tcgtttcgca tggatgacta gaaagtccga agaaacgatc 2580

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aggatgacca attttgacaa aaatctgcct aacgaaaagg tgcttccgaa gcacagcctg 2700

ttgtatgaat acttcacagt ttataacgag ctcactaagg tcaagtacgt cacggagggc 2760

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aagacgaacc gtaaagttac tgtgaagcaa ctgaaagagg attactttaa gaaaattgag 2880

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tatcatgacc tgcttaaaat tatcaaggat aaagatttcc tggataatga agagaacgaa 3000

gatatactgg aggacattgt gttgactttg accctcttcg aggacagaga gatgattgag 3060

gaaagactga agacctacgc acaccttttt gatgacaagg tcatgaaaca actcaagcgc 3120

cggcgctata ctggctgggg ccggctttct cgcaagctca tcaatgggat tcgggataag 3180

caatcaggca agacaatttt ggacttcctc aaatccgacg gattcgcaaa taggaatttt 3240

atgcagctga tacatgacga ctctttgaca ttcaaagaag acatacagaa ggctcaggtc 3300

tccggccaag gagattcttt gcacgagcat atcgctaact tggcaggtag ccccgccata 3360

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cataagccgg aaaacattgt tattgaaatg gctagggaaa atcagacgac ccagaaggga 3480

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cagattctta aggagcaccc tgtggagaac acccaacttc agaatgaaaa gctctacctt 3600

tactaccttc aaaacggccg ggatatgtac gtcgatcagg aacttgacat taaccggttg 3660

agcgattatg acgttgacca tattgtgccc caatctttcc ttaaagacga ctctatcgac 3720

aataaagtgc tgacgcgcag cgataaaaat cgcggtaagt cggataatgt cccgtcggaa 3780

gaggtggtta aaaaaatgaa gaactattgg aggcaactcc tgaatgccaa gctgatcact 3840

cagaggaaat tcgacaatct caccaaggca gaaaggggtg gacttagcga gctcgacaag 3900

gccggtttta tcaaaagaca gctggtggag acacgccaaa tcaccaaaca cgttgcccag 3960

atcctggatt cgaggatgaa cacgaagtat gacgagaacg acaagttgat tagggaagtc 4020

aaggtcatca ctttgaagtc caagctggtg agcgactttc gcaaagactt ccagttttac 4080

aaagtcaggg aaattaataa ctaccaccac gcccacgacg cctaccttaa cgccgtggtt 4140

ggcacagcac tcatcaagaa ataccctaag ctcgaatctg agttcgtcta tggcgactat 4200

aaggtctacg acgttagaaa aatgatcgcg aaatctgagc aggaaatagg caaggcaact 4260

gccaagtact tcttctattc caatatcatg aactttttta agacggagat taccctggcg 4320

aatggtgaga tccgcaagcg ccctttgatt gagacaaacg gagaaacagg agagatcgta 4380

tgggacaaag ggcgggactt tgctactgtt aggaaggtgc tctctatgcc acaagttaac 4440

attgtcaaaa aaactgaagt gcagacaggt gggtttagca aggaatctat cctgccgaag 4500

aggaactctg acaagctgat cgcccgcaag aaagattggg atccgaaaaa gtacggagga 4560

ttcgactccc ccacagttgc gtactccgtg cttgtcgtgg ccaaagtgga gaagggcaag 4620

tctaagaagc tcaagagcgt caaagagttg ttggggatca cgattatgga gcggtcgtct 4680

ttcgaaaaga atccgataga ttttctcgag gccaagggtt ataaagaagt caagaaggat 4740

cttatcatca agctccctaa gtactccctc tttgagcttg aaaacggacg gaaaagaatg 4800

ctggcttcag cgggtgaact tcagaagggt aatgaactcg ctctgccctc aaaatatgtg 4860

aatttccttt acctggcatc acactatgag aagcttaagg ggtctccaga ggacaacgag 4920

cagaagcaac tgttcgttga acaacacaag cactaccttg acgagattat cgagcaaatc 4980

agcgagttta gcaagcgcgt tatactggca gacgcaaatc ttgataaggt ccttagcgcc 5040

tacaacaagc atagagacaa acccatccgg gagcaggccg agaacattat tcatctcttc 5100

accttgacga atcttggggc cccggccgcg ttcaagtact tcgatactac catagacaga 5160

aagcgctata catcgacaaa ggaagttctt gacgccacgc tgatccacca aagtataaca 5220

ggcctctatg agacacgcat cgacctttcg cagttgggcg gtgaccgccc caaaaagaag 5280

aggaaagttg gcgggtga 5298

<210> 3

<211> 76

<212> DNA/RNA

<213> 化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)

<400> 3

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgc 76

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 4

tgttggctag gatccatcgc agtcagcgat gagtacagca a 41

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 5

gtgtagagac caaaggaggt ctca 24

<210> 6

<211> 1765

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 6

gcagcgtgac ccggtcgtgc ccctctctag agataatgag cattgcatgt ctaagttata 60

aaaaattacc acatattttt tttgtcacac ttgtttgaag tgcagtttat ctatctttat 120

acatatattt aaactttact ctacgaataa tataatctat agtactacaa taatatcagt 180

gttttagaga atcatataaa tgaacagtta gacatggtct aaaggacaat tgagtatttt 240

gacaacagga ctctacagtt ttatcttttt agtgtgcatg tgttctcctt tttttttgca 300

aatagcttca cctatataat acttcatcca ttttattagt acatccattt agggtttagg 360

gttaatggtt tttatagact aattttttta gtacatctat tttattctat tttagcctct 420

aaattaagaa aactaaaact ctattttagt ttttttattt aataatttag atataaaata 480

gaataaaata aagtgactaa aaattaaaca aatacccttt aagaaattaa aaaaactaag 540

gaaacatttt tcttgtttcg agtagataat gccagcctgt taaacgccgt cgacgagtct 600

aacggacacc aaccagcgaa ccagcagcgt cgcgtcgggc caagcgaagc agacggcacg 660

gcatctctgt cgctgcctct ggacccctct cgagagttcc gctccaccgt tggacttgct 720

ccgctgtcgg catccagaaa ttgcgtggcg gagcggcaga cgtgagccgg cacggcaggc 780

ggcctcctcc tcctctcacg gcacggcagc tacgggggat tcctttccca ccgctccttc 840

gctttccctt cctcgcccgc cgtaataaat agacaccccc tccacaccct ctttccccaa 900

cctcgtgttg ttcggagcgc acacacacac aaccagatct cccccaaatc cacccgtcgg 960

cacctccgct tcaaggtacg ccgctcgtcc tccccccccc cccctctcta ccttctctag 1020

atcggcgttc cggtccatgg ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta 1080

gatccgtgtt tgtgttagat ccgtgctgct agcgttcgta cacggatgcg acctgtacgt 1140

cagacacgtt ctgattgcta acttgccagt gtttctcttt ggggaatcct gggatggctc 1200

tagccgttcc gcagacggga tcgatttcat gatttttttt gtttcgttgc atagggtttg 1260

gtttgccctt ttcctttatt tcaatatatg ccgtgcactt gtttgtcggg tcatcttttc 1320

atgctttttt tttgtcttgg ttgtgatgat gtggtgtggt tgggcggtcg ttcattcgtt 1380

ctagatcgga gtagaatact gtttcaaact acctggtgta tttattaatt ttggaactgt 1440

atgtgtgtgt catacatctt catagttacg agtttaagat ggatggaaat atcgatctag 1500

gataggtata catgttgatg tgggttttac tgatgcatat acatgatggc atatgcagca 1560

tctattcata tgctctaacc ttgagtacct atctattata ataaacaagt atgttttata 1620

attattttga tcttgatata cttggatgat ggcatatgca gcagctatat gtggattttt 1680

ttagccctgc cttcatacgc tatttatttg cttggtactg tttcttttgt cgatgctcac 1740

cctgttgttt ggtgttactt ctgca 1765

<210> 7

<211> 326

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 7

aagaacgaac taagccggac aaaaaaagga gcacatatac aaaccggttt tattcatgaa 60

tggtcacgat ggatgatggg gctcagactt gagctacgag gccgcaggcg agagaagcct 120

agtgtgctct ctgcttgttt gggccgtaac ggaggatacg gccgacgagc gtgtactacc 180

gcgcgggatg ccgctgggcg ctgcgggggc cgttggatgg ggatcggtgg gtcgcgggag 240

cgttgagggg agacaggttt agtaccacct cgcctaccga acaatgaaga acccacctta 300

taaccccgcg cgctgccgct tgtgtt 326

<210> 8

<211> 253

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 8

gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60

atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120

atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180

gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240

atgttactag atc 253

<210> 9

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 9

tttttttt 8

<210> 10

<211> 5298

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(non)

<400> 10

atgtccgaag tcgagttttc ccatgagtac tggatgagac acgcattgac tctcgcaaag 60

agggcttggg atgaacgcga ggtgcccgtg ggggcagtac tcgtgcataa caatcgcgta 120

atcggcgaag gttggaatag gccgatcgga cgccacgacc ccactgcaca tgcggaaatc 180

atggcccttc gacagggagg gcttgtgatg cagaattatc gacttatcga tgcgacgctg 240

tacgtcacgc ttgaaccttg cgtaatgtgc gcgggagcta tgattcactc ccgcattgga 300

cgagttgtat tcggtgcccg cgacgccaag acgggtgccg caggttcact gatggacgtg 360

ctgcatcacc caggcatgaa ccaccgggta gaaatcacag aaggcatatt ggcggacgaa 420

tgtgcggcgc tgttgtccga cttttttcgc atgcggaggc aggagatcaa ggcccagaaa 480

aaagcacaat cctctactga ctccggcggc tcctccggcg gctcctccgg cggcgaaact 540

ccaggcactt ccgaatccgc gactccagaa tcctccggcg gctcctccgg cggctcctca 600

gaagtcgagt tctcccatga gtattggatg aggcacgccc tcactcttgc gaagagggcc 660

agggacgaga gggaggtgcc ggtcggtgct gtcctggtct tgaataacag ggtgataggc 720

gaaggttgga acagggctat tggccttcat gaccctactg ctcatgcgga aatcatggca 780

cttagacagg ggggcctcgt tatgcaaaat taccgcctga tcgacgccac tctttatgtc 840

acatttgaac catgtgttat gtgtgcgggc gctatgatcc attcacgcat aggtcgcgtg 900

gtttttggag ttcgcaacgc gaaaacaggg gctgcaggct ctctgatgga cgttttgcac 960

tatccgggaa tgaaccatag agtcgaaatc acagaaggga ttttggcaga cgaatgccgc 1020

gctcttcttt gttatttttt cagaatgaac cgccaagtgt ttaatgctca aaagaaagcg 1080

cagagtagca cagactccgg cggctcctcc ggcggctcct ccggcggcga aactccaggc 1140

acttccgaat ccgcgactcc agaatcctcc ggcggctcct ccggcggctc cattgggaca 1200

aactctgtgg gctgggcggt aattaccgac gagtacaagg tgcctagtaa gaaatttaaa 1260

gtgctcggaa acactgacag gcactctata aagaagaacc tgatcggggc actgcttttc 1320

gactccggag agacggcgga ggcgacgcgt ctcaagcgta ccgcgcgccg caggtacaca 1380

agaaggaaga ataggatctg ctacttgcag gaaatcttca gtaacgagat ggcgaaggtc 1440

gacgatagtt tctttcatcg gttggaagaa tcgttcctcg tagaggagga caaaaagcac 1500

gagcgtcacc caatattcgg gaatattgtt gacgaggttg cctaccatga gaaatatcct 1560

acaatatatc acctccgtaa gaagcttgtc gattcaactg ataaggctga tctcagactc 1620

atctatcttg ccctcgcaca tatgattaag tttcgtggcc acttcttgat tgaaggcgac 1680

ctcaacccgg acaactcaga tgttgacaag ctttttatac agctcgtcca gacatataac 1740

cagctgtttg aagagaatcc catcaatgcg agtggggttg atgctaacgc cattttgtcc 1800

gccaggttgt ccaaatctcg cagactggaa aacctgatcg cacagcttcc cggtgaaaag 1860

aaaaacgggc tcttcggcaa tctcatcgca ctgtccctcg gcctcacccc aaacttcaag 1920

tctaacttcg acctggccga ggatgcgaag ctccagctgt caaaagatac atacgacgac 1980

gatttggaca atctgcttgc gcaaataggc gaccagtatg cggacctgtt cctggctgcc 2040

aaaaatctgt cagatgcaat cctcctgtcc gatatattgc gtgtgaacac cgaaatcacg 2100

aaggcaccgc ttagcgcatc catgatcaag agatacgacg agcaccatca ggacctcaca 2160

ctcctcaagg cgcttgttcg tcagcagctt cccgagaaat ataaggaaat ttttttcgat 2220

caaagcaaga atggatatgc tggctatatt gacggtggcg cttcgcagga ggagttctat 2280

aaattcatta agccgattct ggagaagatg gacggaacgg aggagctcct cgtcaagctt 2340

aaccgggaag acctgttgcg gaagcagagg acttttgata acggctctat tccgcaccaa 2400

atccatctgg gtgagttgca cgcaatcttg agaagacaag aggatttcta cccgttcctt 2460

aaggataaca gagagaagat agaaaaaata ctgaccttca ggataccata ctatgtgggc 2520

ccactggcgc gcggaaatag tcgtttcgca tggatgacta gaaagtccga agaaacgatc 2580

acgccatgga attttgagga agtggtcgac aagggcgcct ctgcccagag cttcatcgaa 2640

aggatgacca attttgacaa aaatctgcct aacgaaaagg tgcttccgaa gcacagcctg 2700

ttgtatgaat acttcacagt ttataacgag ctcactaagg tcaagtacgt cacggagggc 2760

atgcgtaagc ctgctttcct gtctggtgaa caaaaaaagg cgattgtgga cctccttttc 2820

aagacgaacc gtaaagttac tgtgaagcaa ctgaaagagg attactttaa gaaaattgag 2880

tgcttcgaca gtgtggagat ttccggtgtc gaggaccggt ttaacgccag cctgggtacg 2940

tatcatgacc tgcttaaaat tatcaaggat aaagatttcc tggataatga agagaacgaa 3000

gatatactgg aggacattgt gttgactttg accctcttcg aggacagaga gatgattgag 3060

gaaagactga agacctacgc acaccttttt gatgacaagg tcatgaaaca actcaagcgc 3120

cggcgctata ctggctgggg ccggctttct cgcaagctca tcaatgggat tcgggataag 3180

caatcaggca agacaatttt ggacttcctc aaatccgacg gattcgcaaa taggaatttt 3240

atgcagctga tacatgacga ctctttgaca ttcaaagaag acatacagaa ggctcaggtc 3300

tccggccaag gagattcttt gcacgagcat atcgctaact tggcaggtag ccccgccata 3360

aaaaagggca ttcttcaaac ggtaaaagtt gttgacgaac tcgtgaaggt tatgggccgt 3420

cataagccgg aaaacattgt tattgaaatg gctagggaaa atcagacgac ccagaaggga 3480

cagaaaaata gcagggagcg gatgaagaga attgaagagg gaattaagga gcttggatct 3540

cagattctta aggagcaccc tgtggagaac acccaacttc agaatgaaaa gctctacctt 3600

tactaccttc aaaacggccg ggatatgtac gtcgatcagg aacttgacat taaccggttg 3660

agcgattatg acgttgacca tattgtgccc caatctttcc ttaaagacga ctctatcgac 3720

aataaagtgc tgacgcgcag cgataaaaat cgcggtaagt cggataatgt cccgtcggaa 3780

gaggtggtta aaaaaatgaa gaactattgg aggcaactcc tgaatgccaa gctgatcact 3840

cagaggaaat tcgacaatct caccaaggca gaaaggggtg gacttagcga gctcgacaag 3900

gccggtttta tcaaaagaca gctggtggag acacgccaaa tcaccaaaca cgttgcccag 3960

atcctggatt cgaggatgaa cacgaagtat gacgagaacg acaagttgat tagggaagtc 4020

aaggtcatca ctttgaagtc caagctggtg agcgactttc gcaaagactt ccagttttac 4080

aaagtcaggg aaattaataa ctaccaccac gcccacgacg cctaccttaa cgccgtggtt 4140

ggcacagcac tcatcaagaa ataccctaag ctcgaatctg agttcgtcta tggcgactat 4200

aaggtctacg acgttagaaa aatgatcgcg aaatctgagc aggaaatagg caaggcaact 4260

gccaagtact tcttctattc caatatcatg aactttttta agacggagat taccctggcg 4320

aatggtgaga tccgcaagcg ccctttgatt gagacaaacg gagaaacagg agagatcgta 4380

tgggacaaag ggcgggactt tgctactgtt aggaaggtgc tctctatgcc acaagttaac 4440

attgtcaaaa aaactgaagt gcagacaggt gggtttagca aggaatctat cctgccgaag 4500

aggaactctg acaagctgat cgcccgcaag aaagattggg atccgaaaaa gtacggagga 4560

ttcgactccc ccacagttgc gtactccgtg cttgtcgtgg ccaaagtgga gaagggcaag 4620

tctaagaagc tcaagagcgt caaagagttg ttggggatca cgattatgga gcggtcgtct 4680

ttcgaaaaga atccgataga ttttctcgag gccaagggtt ataaagaagt caagaaggat 4740

cttatcatca agctccctaa gtactccctc tttgagcttg aaaacggacg gaaaagaatg 4800

ctggcttcag cgggtgaact tcagaagggt aatgaactcg ctctgccctc aaaatatgtg 4860

aatttccttt acctggcatc acactatgag aagcttaagg ggtctccaga ggacaacgag 4920

cagaagcaac tgttcgttga acaacacaag cactaccttg acgagattat cgagcaaatc 4980

agcgagttta gcaagcgcgt tatactggca gacgcaaatc ttgataaggt ccttagcgcc 5040

tacaacaagc atagagacaa acccatccgg gagcaggccg agaacattat tcatctcttc 5100

accttgacga atcttggggc cccggccgcg ttcaagtact tcgatactac catagacaga 5160

aagcgctata catcgacaaa ggaagttctt gacgccacgc tgatccacca aagtataaca 5220

ggcctctatg agacacgcat cgacctttcg cagttgggcg gtgaccgccc caaaaagaag 5280

aggaaagttg gcgggtga 5298

<210> 11

<211> 1769

<212> PRT

<213> 人工序列(non)

<400> 11

Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu

1 5 10 15

Thr Leu Ala Lys Arg Ala Trp Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala

20 25 30

Val Leu Val His Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Pro

35 40 45

Ile Gly Arg His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg

50 55 60

Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu

65 70 75 80

Tyr Val Thr Leu Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His

85 90 95

Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Ala Arg Asp Ala Lys Thr Gly

100 105 110

Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His

115 120 125

Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu

130 135 140

Leu Ser Asp Phe Phe Arg Met Arg Arg Gln Glu Ile Lys Ala Gln Lys

145 150 155 160

Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser

165 170 175

Gly Gly Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser

180 185 190

Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr

195 200 205

Trp Met Arg His Ala Leu Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg

210 215 220

Glu Val Pro Val Gly Ala Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly

225 230 235 240

Glu Gly Trp Asn Arg Ala Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala

245 250 255

Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg

260 265 270

Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys

275 280 285

Ala Gly Ala Met Ile His Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val

290 295 300

Arg Asn Ala Lys Thr Gly Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His

305 310 315 320

Tyr Pro Gly Met Asn His Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala

325 330 335

Asp Glu Cys Arg Ala Leu Leu Cys Tyr Phe Phe Arg Met Asn Arg Gln

340 345 350

Val Phe Asn Ala Gln Lys Lys Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser

355 360 365

Gly Gly Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser

370 375 380

Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala

385 390 395 400

Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys

405 410 415

Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser

420 425 430

Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr

435 440 445

Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg

450 455 460

Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met

465 470 475 480

Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu

485 490 495

Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile

500 505 510

Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu

515 520 525

Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile

530 535 540

Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile

545 550 555 560

Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile

565 570 575

Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn

580 585 590

Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys

595 600 605

Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys

610 615 620

Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro

625 630 635 640

Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu

645 650 655

Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile

660 665 670

Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp

675 680 685

Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys

690 695 700

Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln

705 710 715 720

Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys

725 730 735

Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr

740 745 750

Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro

755 760 765

Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn

770 775 780

Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile

785 790 795 800

Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln

805 810 815

Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys

820 825 830

Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly

835 840 845

Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr

850 855 860

Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser

865 870 875 880

Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys

885 890 895

Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn

900 905 910

Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala

915 920 925

Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys

930 935 940

Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys

945 950 955 960

Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg

965 970 975

Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys

980 985 990

Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp

995 1000 1005

Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu

1010 1015 1020

Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln

1025 1030 1035 1040

Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu

1045 1050 1055

Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe

1060 1065 1070

Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His

1075 1080 1085

Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser

1090 1095 1100

Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser

1105 1110 1115 1120

Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu

1125 1130 1135

Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu

1140 1145 1150

Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg

1155 1160 1165

Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln

1170 1175 1180

Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys

1185 1190 1195 1200

Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln

1205 1210 1215

Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val

1220 1225 1230

Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr

1235 1240 1245

Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu

1250 1255 1260

Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys

1265 1270 1275 1280

Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly

1285 1290 1295

Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val

1300 1305 1310

Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg

1315 1320 1325

Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys

1330 1335 1340

Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe

1345 1350 1355 1360

Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp

1365 1370 1375

Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro

1380 1385 1390

Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val

1395 1400 1405

Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala

1410 1415 1420

Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile

1425 1430 1435 1440

Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn

1445 1450 1455

Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr

1460 1465 1470

Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr

1475 1480 1485

Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg

1490 1495 1500

Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys

1505 1510 1515 1520

Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val

1525 1530 1535

Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu

1540 1545 1550

Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro

1555 1560 1565

Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu

1570 1575 1580

Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg

1585 1590 1595 1600

Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu

1605 1610 1615

Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr

1620 1625 1630

Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe

1635 1640 1645

Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser

1650 1655 1660

Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val

1665 1670 1675 1680

Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala

1685 1690 1695

Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala

1700 1705 1710

Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser

1715 1720 1725

Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly

1730 1735 1740

Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Ser Gly

1745 1750 1755 1760

Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1765

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 12

tgttgggagg acgtgacatc gccc 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 13

aaacgggcga tgtcacgtcc tccc 24

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 14

gggaggacgt gacatcgccc 20

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 15

gtgtgccgga cagctccatt gcc 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 16

aaacggcaat ggagctgtcc ggc 23

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 17

gccggacagc tccattgcc 19

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 18

acgaccagca cgatcacc 18

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 19

tgctagcatg tctgcagctt a 21

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 20

gcacgcatga cttagcaaaa 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 21

cctccagatt tgccagctat 20

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 22

gtgtgacata ctcagtcata aaat 24

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 23

aaacatttta tgactgagta tgtc 24

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 24

gacatactca gtcataaaat 20

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 25

ctctcccttt cttgagtgga a 21

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 26

ccaggaaaca aaggtttacg a 21

Claims

1.一套碱基编辑人工***，所述人工***包括：

第I调节元件，其为编码如氨基酸序列I的核苷酸序列；其中所述氨基酸序列I为如SEQID No. 1所示的氨基酸序列；编码如SEQ ID No. 1所示氨基酸序列的核苷酸编码序列如SEQ ID No. 2所示；

第II调节元件，其由依次从5’端到3’端的第II-1核苷酸序列和第II-2核苷酸序列组成；所述第II-1核苷酸序列包括靶核苷酸序列；所述第II-2核苷酸序列为来源于化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的sgRNA核酸序列；所述第II-1核苷酸序列和所述第II-2核苷酸序列转录融合，其产物能引导第I调控元件编码的蛋白至目标生物基因组中待突变的靶位点处，并将所述靶核苷酸序列中的靶位点处的A突变为G；或将所述靶核苷酸序列中的靶位点处的T突变为C；当所述第II调节元件为多个时，包含在其中的多个第II-1核苷酸序列两两不相同；所述第II-2核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；所述靶核苷酸序列中的靶位点处于所述靶核苷酸序列的从5ʹ端到3ʹ端方向的4至7位置；

通过如下方式确定所述靶核苷酸序列：

1）确定水稻基因组上需要被改造的核苷酸序列；

2）判断步骤1）中确定的需要被改造的核苷酸序列或其反向互补序列中是否携带有待突变的核苷酸A，并判断所述待突变的核苷酸A突变为G，或所述待突变的核苷酸T突变为C后引起的改变是否符合预期；

3）在需要被改造的核苷酸序列或其反向互补序列中筛选靶标序列：向所述待突变的核苷酸A的3ʹ端方向搜索以确认存在被氨基酸序列I识别的识别模序，且所述待突变的核苷酸A处在所述识别模序5ʹ端上游的-19至-13的位置，由此确定的所述识别模序5ʹ端上游17至21个核苷酸序列为所述靶核苷酸序列；

所述识别模序为5ʹ-NGG-3ʹ、5ʹ-NGA-3ʹ、5ʹ- GAGN-3ʹ、5ʹ-AAGN-3ʹ中的一种，所述靶核苷酸序列为所述识别模序5ʹ端上游的17至21个核苷酸序列，淘汰含有连续五个T的核苷酸序列；

其中，所述N为A、G、C和T中的一种。

2.根据权利要求1所述的人工***，其特征在于，所述第II-1核苷酸序列还包括含有IIS型限制性内切酶的酶切位点的克隆位点，所述靶核苷酸序列通过所述第II-1核苷酸序列上的所述克隆位点而被克隆到其中，以使所述第II-1核苷酸序列与第II-2序列转录融合；

当所述第II调节元件为多个时，用于克隆不同靶核苷酸序列的所述IIS型限制性内切酶的酶切位点两两不相同。

3.根据权利要求1所述的人工***，其特征在于，所述人工***还包括在所述第I调节元件的5ʹ端的用于水稻中的，且启动所述第I调节元件转录的第一启动子；所述人工***还包括在所述第II调节元件的5ʹ端的用于水稻中的，且启动所述第II调节元件转录的第二启动子；

所述人工***还包括在所述第I调节元件的3’端的终止所述第I调节元件转录的第一终止子；所述人工***还包括在所述第II调节元件的3’端的终止所述第II调节元件转录的第二终止子。

4.根据权利要求3所述的人工***，其特征在于，所述第一启动子为RNA聚合酶II型启动子；所述第二启动子为RNA聚合酶III型启动子。

5.根据权利要求3所述的人工***，其特征在于，所述第一启动子为SEQ ID No. 6；所述第二启动子为SEQ ID No. 7。

6.根据权利要求3所述的人工***，其特征在于，所述第一终止子为SEQ ID No. 8；第二终止子为SEQ ID No. 9。

7.根据权利要求1-6中任意一项所述的人工***，其特征在于，所述第I调节元件和所述第II元件被克隆到至少一个载体上。

8.根据权利要求7所述的人工***，其特征在于，所述第I调节元件被克隆到pCAMBIA1300上，所述第II调节元件被克隆到载体pENTR4上。

9.根据权利要求8所述的人工***，其特征在于，所述第一启动子、第I调节元件和第一终止子被克隆到pCAMBIA1300载体上。

10.根据权利要求8所述的人工***，其特征在于，所述第二启动子、第II调节元件和第二终止子被克隆到pENTR4载体上。

11.根据权利要求7所述的人工***，其特征在于，所述第I调节元件和所述第II调节元件被整合到同一个载体上，或被分布在多个载体上一起使用。

12.如权利要求1-11中任意一项所述的人工***在用于将水稻基因组中的A定点突变为G、或将水稻基因组中的T定点突变为C的应用。

13.一种将水稻基因组上的A定点突变为G，或将水稻基因组中的T定点突变为C的方法，其包括如下步骤：

1）将如权利要求1-11中任意一项所述的人工***通过农杆菌介导、基因枪轰击或PEG介导转化的方法中的一种导入到水稻愈伤组织或水稻原生质体中，然后培养获得水稻植株；

2）筛选获得含有定点突变的水稻植株。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述水稻植株产生含有定点替换碱基的水稻种子。