CN114540406A

CN114540406A - 基因组编辑表达框、载体及其应用

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Publication number: CN114540406A
Application number: CN202011345136.8A
Authority: CN
Inventors: 张勇; 任秋蓉; 郑雪莲; 黄兰; 唐旭
Original assignee: University of Electronic Science and Technology of China
Current assignee: University of Electronic Science and Technology of China
Priority date: 2020-11-26
Filing date: 2020-11-26
Publication date: 2022-05-27
Anticipated expiration: 2040-11-26
Also published as: CN114540406B

Abstract

本发明属于植物基因编辑领域，具体涉及基因组编辑表达框、包含该表达框的载体及其应用。本发明要解决的技术问题是在植物，特别是裸子植物目前没有适用的高效基因编辑***。本发明解决技术问题的技术方案是提供一种基因组编辑表达框，该基因组编辑表达框包括以下元件：启动子LarPE004、Cas9蛋白编码基因、sgRNA克隆及转录单元，由启动子LarPE004驱动Cas9蛋白编码基因和sgRNA克隆及转录单元表达。本发明表达框架及相应载体在植物中能实现高效的基因编辑。实验表明在落叶松原生质体中基因编辑效率可达72.5％，同时还能在PAM为NGG、NAG、NGT等多个PAM位点均有较高的基因编辑活性，具有广阔的应用前景。

Description

基因组编辑表达框、载体及其应用

技术领域

本发明属于植物基因编辑领域，具体涉及基因组编辑表达框、包含该表达框的载体及其应用。

背景技术

植物基因组编辑技术(PlantGenome Editing Technology)是指利用基因组编辑工具人为对植物的基因组DNA进行编辑，引入事先预定的碱基***、删除、替换等突变形式，使植物基因组DNA遵照人为意愿发生定向的改变。植物基因组编辑工具经过十余年探索进化，目前已经发明出了应用成簇的规律间隔的短回文重复序列-效应核酸酶(ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-associated Cas,CRISPR-Cas)***进行植物基因组编辑的第三代工具。CRISPR-Cas基因组编辑工具具有实验成本低、载体构建容易、检测速度快、可开发性强等优点，是目前在植物基因组编辑工作中所用最为广泛的工具。研究人员应用CRISPR-Cas***已成功在多种模型植物，如烟草、拟南芥中；多种农作物，如小麦、玉米、水稻、高粱中；多种木本植物，如苹果、葡萄、柑橘中；多种草本植物，如黄瓜、土豆、番茄中搭建了包括基因敲除、单碱基编辑、基因精准***在内的基因组编辑平台，并取得较大进展，在拟南芥、水稻等模式植物中部分基因位点也取得了较高的编辑效率。

落叶松(Larix kaempferi)是一种寒温带及温带落叶乔木，具有早期速生、抗逆抗病性强、适应性广、强涵养水源性、生态效益好的特点，是我国北方及南方亚高山地区十分重要的造林树种，其在固碳、保水及用材方面发挥着重要作用，对维护生态平衡、抗洪抗灾具有直接作用，被广泛应用于防护林及退耕还林建设，也是人工林树种的主要选择之一。目前，我国主要通过传统育种方式如良种选育、种间杂交等方式进行落叶松遗传改良，但由于落叶松育种周期长、无性扩繁技术复杂且效率低、传统育种方式耗时耗力，一定程度上制约了其遗传改良进程，不能满足现代林木遗传育种的需求。本发明旨在于落叶松体内建立出一套高效基因组编辑的工具，促进落叶松遗传性状定向改良研究进展。随着现代基因工程技术的日趋成熟及基于CRISPR-Cas基因组编辑技术的发展，为落叶松重要性状快速改良带来了机遇。

但是，由于不同植物物种的基因组结构及表达特性不同，因此不同基因组编辑工具于不同植物物种中工作效率不尽相同。在不同植物物种中需要选择不同启动子、Cas蛋白和设计不同的向导RNA来构建适应本物种的基因编辑表达调控体系。由于落叶松属于裸子植物，裸子植物中基因工程进展缓慢，目前尚未有成功于落叶松体内实现基因组编辑的报道，导致应用此新兴技术定向改良落叶松遗传性状的研究发展缓慢。因此建立一套可以进行落叶松高效基因组编辑的工具对落叶松及相关植物的基因组工程研究和开发具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是在植物，特别是裸子植物，尤其特别是松科植物目前没有适用的高效基因编辑***。

本发明解决技术问题的技术方案是提供一种基因组编辑表达框。该基因组编辑表达框包括以下元件：启动子LarPE004、Cas9蛋白编码基因、sgRNA克隆及转录单元，由启动子LarPE004驱动Cas9蛋白编码基因和sgRNA克隆及转录单元表达。

其中，上述的基因组编辑表达框中所述启动子LarPE004如下a)或b)或c)：

a)、核苷酸序列为Seq ID No.1所示；

b)、与a)限定的核苷酸序列具有99％以上、95％以上或者90％以上同源性，且具有启动子功能

c)、或者能在严格条件下与a)或b)限定的启动子杂交，且具有启动子功能的DNA片段。

其中，上述的基因组编辑表达框中所述的Cas9蛋白为Cas9(Lar_spRY)。Cas9(Lar_spRY)的氨基酸序列Seq ID No.2所示。

其中，上述的基因组编辑表达框中所述的Cas9蛋白编码基因后还连接有NLS蛋白的编码基因。

进一步的，上述基因组编辑表达框的结构为：LarPE004-Cas9-NLS-polyA-tRNA-CCDB-sgRNA scaffold-tRNA-HspT。

其中所述Cas9为Cas9编码基因，所述NLS为核定位信号；所述polyA为多聚腺苷酸尾巴；所述tRNA为转运RNA；所述CCDB为毒素蛋白CcdB的编码基因；所述sgRNA scaffold为sgRNA克隆及转录单元；所述的HspT为水稻HSP终止子，所述的sgRNA克隆及转录单元为1、2、3、4、5、或6个。

优选的，其中的Cas9蛋白为Cas9(Lar_spRY)。Cas9(Lar_spRY)的氨基酸序列SeqID No.2所示。

在具体构建表达框或骨架载体时，需注意每增加1个sgRNA克隆及转录单元，需用tRNA元件与相邻的sgRNA克隆及转录单元和表达框最后的HspT区隔开来。

其中，上述的基因组编辑表达框的核苷酸序列如Seq ID No.3中的9bp-7427bp所示。

本发明还提供了上述的基因组编辑表达框在制备基因组编辑载体中的用途。

本发明也还提供了上述含有上述基因组编辑表达框的基因组编辑载体。

进一步的，上述基因组编辑载体是可以基于本领域的基因编辑骨架载体构建。比如，可采用pTX171、pGEL031或pZHY988中的至少一种。

本发明也提供了上述基因组编辑表达框或基因组编辑载体在进行植物基因组编辑中的用途。进一步的，所述的植物为裸子植物或被子植物。优选的，所述的裸子植物为松科植物。更优选的，所述的松科植物为落叶松。

本发明还提供了一种对植物进行基因组编辑的方法。该方法包括以下步骤：

a)、针对待编辑的目标基因设计基因编辑位点及sgRNA；

b)、构建权利要求9任一项所述的基因组编辑载体，其中过构建入步骤a)所述的目的基因的sgRNA；

c)、使用步骤b)获得的基因组编辑载体转化植物细胞或组织，诱导再生得到基因编辑的植物植株。

进一步的，所述的植物为裸子植物或被子植物。优选的，所述的裸子植物为松科植物。更优选的，所述的松科植物为落叶松。

本发明的有益效果在于提供了一种高效的CRISPR-Cas9基因编辑***用表达框架以及相应的基因编辑表达载体。本发明表达框架及相应载体尤其适用于在落叶松中进行基因编辑。实验表明，本发明表达框架及相应载体在落叶松原生质体中基因编辑效率可达72.5％。同时还能在PAM为NGG、NAG、NGT等多个PAM位点均有较高的基因编辑活性，在落叶松遗传性状定向改良研究方向有广阔的应用前景。

附图说明

图1、基于落叶松原生质体瞬时转化体系的不同基因定向编辑***的示意图及编辑活性结果。

A、本发明中测试的落叶松基因定向编辑***的载体示意图。35S::STU Cas9_V01***：35S启动子启动Cas9蛋白及向导RNA单转录单元***；ZmUBQ1::STU Cas9_V01***：ZmUBQ1启动子启动Cas9蛋白及向导RNA单转录单元***；LarPE004::STU Cas9_V01***：LarPE004启动子启动Cas9蛋白及向导RNA单转录单元***；LarPE004::TTU Cas9_V01***：LarPE004启动子启动Cas9蛋白及OsU6启动子转录向导RNA的双转录单元***；LarPE004::STU Cas9_V02***：LarPE004启动子启动Cas9蛋白变体Lar_spRY及向导RNA单转录单元***；

35S Promoter：花椰菜病毒35S启动子；ZmUBQ1 Promoter：玉米Ubiquitin启动子；LarPE004 Promoter：落叶松启动子LarPE004；OsU6 Promoter：水稻U6启动子；Cas9(WT)：化脓链球菌来源的Cas9蛋白基因；Cas9(Lar_spRY)：Cas9(WT)的变体；NLS：核定位信号)；Hsp-T：终止子；

所述tRNA为转运RNA编码基因；图示的sgRNA包括了替换了ccdB元件的sgRNA以及sgRNA克隆及转录单元。

B、基于落叶松原生质体瞬时转化体系的不同基因定向编辑***剪切活性高通量测序结果。35S::STU Cas9_V01、ZmUBQ1::STU Cas9_V01、LarPE004::STU Cas9_V01、LarPE004::TTU Cas9_V01四个基因编辑***在LarbHLH03、LarMYB06、LarCKX01落叶松内源基因的编辑活性。

C、基于落叶松原生质体瞬时转化体系的改良版落叶松定向编辑***剪切活性高通量测序结果。ZmUBQ1::STU Cas9_V01、LarPE004::STU Cas9_V01、LarPE004::STU Cas9_V02在落叶松内源基因LarACT01-GGG-01、LarACT01-GAG-01、LarNAC02-TGT-01位点的编辑活性。

图2、基于落叶松原生质体瞬时转化体系的LarPE004::STU Cas9_V02定向编辑***在LarACT01-GGG-01、LarACT01-GAG-01、LarNAC02-TGT-01靶位点的编辑效率酶切检测结果。

A：LarACT01-GGG-01位点的编辑效率酶切检测结果，control：野生型植株扩增片段；control+：野生型植株扩增片段经MfeI酶切。B：LarACT01-GAG-01位点的编辑效率酶切检测结果，control：野生型植株扩增片段；control+：野生型植株扩增片段经MfeI酶切。C：LarNAC02-TGT-01位点的编辑效率酶切检测结果，control：野生型植株扩增片段；control+：野生型植株扩增片段经AclI酶切。

图3、基于落叶松原生质体瞬时转化体系的LarPE004::STU Cas9_V02定向编辑***在LarACT01-GGG-01、LarACT01-GAG-01、LarNAC02-TGT-01靶位点的Sanger测序结果。A：LarACT01-GGG-01位点的Sanger测序结果。B：LarACT01-GAG-01位点的Sanger测序结果。C：LarNAC02-TGT-01位点的Sanger测序结果。

具体实施方式

基因组编辑对植物遗传性状定向改良有巨大应用前景，如背景技术所述，由于不同基因组编辑工具于不同植物物种中工作效率不尽相同，且不同植物物种基因组编辑工具需要不同启动子来启动Cas蛋白和对应的sgRNA进行基因组编辑，故目前还未有报道可以用来进行落叶松基因组编辑的工具。本发明是在为裸子植物，尤其是松科植物特别是落叶松搭建可行适用的基于CRISPR-Cas9技术的基因组编辑体系的基础上建立的。

本发明测试不同来源的启动子启动Cas9蛋白及向导RNA，与单转录单元(STU)CRISPR-Cas9基因组编辑***，以组合出可以于落叶松内实现基因组编辑的工具，为落叶松提供切实可行的基因组编辑方案。发现了使用从落叶松中得到的新启动子LarPE004同时启动Cas9-NLS蛋白和向导RNA的表达能获得最佳效果。为了建立落叶松基因组编辑***，本发明主要利用落叶松原生质体瞬时表达技术，以快速检测基因组编辑***对落叶松内源基因的编辑效率。

同时，为了实现高效的落叶松基因组编辑活性，本发明还创造性地考虑从Cas9蛋白的优化及点突出发，筛选使用了特定的Cas9变体蛋白Cas9(Lar_spRY)。与Cas9野生型相比，Cas9(Lar_spRY)有11个氨基酸的替换(Walton,R.T,et al.Science 2020)。

在本发明的一个优选的实例中建立了启动子LarPE004与Cas9变体蛋白Cas9(Lar_spRY)配合作用的编辑体系LarPE004::STU Cas9_V02，在落叶松原生质体中实现了编辑活性最高达72.5％的编辑效率，远高于对照建立其它的落叶松基因组编辑***。同时，LarPE004::STU Cas9_V02突破了PAM的限制，在PAM为NGG、NAG、NGT处位点，均有较高基因编辑活性，这样意想不到的技术效果更赋予了本发明基因组编辑表达框更好的应用前景。

该实例中的载体具体有以下方式构建：

a、骨架载体构建：以pGEL031载体为基本骨架，将LarPE004替换玉米Ubi启动子，Cas9(Lar_spRY)-NLS蛋白编码基因替换其中的Cas9蛋白编码基因，构建CRISPR-Cas9骨架载体LarPE004-STU Cas9_V02；

b、定向基因编辑载体构建：针对待编辑的目标基因设计基因编辑位点及sgRNA，合成sgRNA的引物对，将引物对退火形成带粘性末端的双链DNA，将双链DNA替换pGEL031载体骨架中的ccdB元件，获得定向编辑表达载体；

然后使用步骤b得到定向编辑表达载体转化落叶松原生质体，检测原生质体的基因定向编辑情况。进一步的，步骤b中使用sgRNA的引物对双链DNA替换pGEL031载体骨架中的ccdB元件时，可用Golden Gate法克隆进行连接。

以下通过具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1落叶松基因定向修饰***的骨架载体构建和比较

1、35S::STU Cas9_V01、ZmUBQ1::STU Cas9_V01、LarPE004::STU Cas9_V01骨架载体构建

本发明的使用了已经报道的pGEL031(Tang,Single transcript unit CRISPR2.0systems for robust Cas9 and Cas12a mediated plant genome editing.2019,Plant Biotechnol J)载体作为起始的骨架载体，该载体由玉米强启动子Ubiquitin启动Cas9蛋白和sgRNA单元的共同转录，此骨架载体即为本实例中编号为ZmUBQ1::STU Cas9_V01的骨架载体。

以pGEL031为骨架，落叶松内源启动子LarPE004基因片段用LarPE004-F和LarPE004-R(表1)从落叶松基因组DNA中扩增得到，花椰菜病毒启动子35S用35S-F和35S-R从pTX171(Tang,A Single Transcript CRISPR-Cas9 System for Efficient GenomeEditing in Plants.2016,Molecular Plant)扩增得到，将扩增的LarPE004基因片段和35S启动子片段用FD-AscI和FD-SbfI限制性内切酶进行酶切，酶切体系如下：10×FastdigestGreen Buffer，3uL；FD-AscI，1uL；FD-SbfI，1uL；扩增基因片段(2ug)，1uL；ddH2O，24uL；37℃，1h～2h。将酶切产物直接用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收。

表1构建基因定向修饰***骨架载体的引物及用途

将pGEL031载体用FD-AscI和FD-SbfI限制性内切酶进行酶切，酶切体系如下：10×Fastdigest Green Buffer，3uL；FD-AscI，1uL；FD-SbfI，1uL；pGEL031质粒DNA(3ug)，1uL；ddH₂O，24uL；37℃，1h～2h。pGEL031酶切片段大小约为2008bp和13755bp，用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收约为13755bp片段。

将上述LarPE004和35S启动子基因片段酶切后回收产物分别与pGEL031载体酶切后回收产物用T4连接酶连接，连接体系为10×T4 ligase Buffer,2uL；T4 ligase,1uL；pGEL031酶切片段，2uL(50ng)；LarPE004或者35S酶切片段，6uL(摩尔量为载体的10倍)；ddH₂O,9uL；22℃，2h。反应结束后，取6uL连接产物转化大肠杆菌菌株DB3.1感受态细胞，涂布含Kan(50mg/L)抗生素的LB固体平板，37℃培养18～22h。将单克隆摇菌进行酶切及测序验证其正确性，从而构建得到LarPE004::STU Cas9_V01和35S::STU Cas9_V01。

2、LarPE004::TTU Cas9_V01双单元转录骨架载体构建

pZHY988为基本骨架，该载体由玉米强启动子Ubiquitin启动Cas9蛋白和水稻U6启动子向导RNA单元。落叶松内源启动子LarPE004基因片段用LarPE004-F和LarPE004-R(表1)从落叶松基因组DNA中扩增得到，将扩增的LarPE004基因片段和pZHY988用FD-AscI和FD-SbfI限制性内切酶进行酶切，酶切体系如下：10×Fastdigest Green Buffer，3uL；FD-AscI，1uL；FD-SbfI，1uL；扩增的基因片段或者pZHY988(2ug)，1uL；ddH2O，24uL；37℃，1h～2h。将扩增的LarPE004片段的酶切产物直接用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收。pZHY988酶切片段大小约为2010bp和13844bp，用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收约为13844bp片段。

将上述扩增片段酶切产物与pZHY988载体酶切产物用T4连接酶连接，连接体系为10×T4 ligase Buffer,2uL；T4 ligase,1uL；pZHY988酶切片段，2uL(50ng)；LarPE004基因片段酶切产物，6uL(摩尔量为载体的10倍)；ddH₂O,9uL；22℃，2h。反应结束后，取6uL连接产物转化大肠杆菌菌株DB3.1感受态细胞，涂布含Kan(50mg/L)抗生素的LB固体平板，37℃培养18～22h。将单克隆摇菌进行酶切及测序验证其正确性，从而构建得到LarPE004::TTUCas9_V01双单元转录骨架载体。

3、LarPE004::STU Cas9_V02骨架载体构建

以pGEL031为骨架，LarPE004 promoter-Cas9(Lar_spRY)-NLS-polyA-tRNA–CCDB-sgRNAscaffold-tRNA-HspT基因片段如Seq ID No.3所示(9bp-2010bp为LarPE004启动子，2035bp-6246bp为Cas9(Lar_spRY)-NLS，6253bp-6302bp为polyA,6303bp-6379bp、7095bp-7171bp为tRNA,6387bp-7011bp为CCDB区域，7019bp-7094bp为sgRNA克隆及转录单元，7178bp-7427bp为Hsp-T终止子，Seq ID No.3两端为AscI和SacI酶切位点，1-8bp为AscI,7428-7433为SacI)，合成Seq ID No.3序列的1bp-7234bp,将合成片段和pGEL031用FD-AscI和FD-AflII限制性内切酶进行酶切,酶切体系如下：10×Fastdigest Green Buffer，3uL；FD-AscI，1uL；FD-AflII，1uL；合成片段或者pGEL031(2ug)，1uL；ddH2O，24uL；37℃，1h～2h。将合成片段的酶切产物直接用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收。pGEL031酶切片段大小约为7149bp和8614bp，用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收约为8614bp片段。

将上述合成片段酶切产物与pGEL031载体酶切产物用T4连接酶连接，连接体系为10×T4 ligase Buffer,2uL；T4 ligase,1uL；pGEL031酶切片段，2uL(50ng)；合成片段酶切产物，6uL(摩尔量为载体的10倍)；ddH₂O,9uL；22℃，2h。反应结束后，取6uL连接产物转化大肠杆菌菌株DB3.1感受态细胞，涂布含Kan(50mg/L)抗生素的LB固体平板，37℃培养18～22h。将单克隆摇菌进行酶切及测序验证其正确性，从而构建得到LarPE004::STU Cas9_V02骨架载体。

实施例2不同落叶松基因定向编辑***的内源基因靶向位点定向突变载体构建

针对落叶松内源基因LarbHLH03、LarMYB06、LarCKX01、LarActin、LarNAC02设计靶位点，人工合成其上下游引物(见表2)。上下游引物各取20uL混匀，经95℃变性10min，自然冷却退火形成粘性末端的靶位点双链DNA。将退火片段和BsaI酶切的不同落叶松基因定向编辑***骨架载体产物利用Golden Gate法克隆连接。Golden Gate反应体系如下：10×T4ligase缓冲液，2uL；BsaI，1uL；T4 DNA连接酶，1uL；落叶松基因定向修饰***骨架载体酶切产物(100ng)，1uL；不同内源基因靶位点退火产物(10mM)，2uL；ddH2O，13uL。反应程序如下：(37℃，5min；16℃，10min)×10个循环；37℃，10min；80℃，10min。程序结束后，取6uLGolden Gate反应产物加入大肠杆菌DH5a感受态细胞中进行转化，涂布含Kan(50mg/L)LB固体培养基平板培养18-22h。经单克隆菌落PCR鉴定阳性菌落(体系如前所述)，对阳性菌落进行提取质粒、酶切、测序等验证，获得不同内源基因靶位点的定向编辑表达载体。

表2、构建LarHLH03、LarMYB06、LarCKX01、LarActin、LarNAC02靶位点定向突变载体的引物及用途

根据以上方法，构建获得了35S::STU Cas9_V01、ZmUBQ1::STU Cas9_V01、LarPE004::STU Cas9_V01、LarPE004::TTU Cas9_V01骨架载体靶向LarHLH03、LarMYB06、LarCKX01位点的表达载体，还获得了ZmUBQ1::STU Cas9_V01、LarPE004::STU Cas9_V01、LarPE004::STU Cas9_V02靶向LarACT-GGG-01、LarACT-GAG-01、LarNAC02-TGT-01位点的表达载体。

实施例3不同落叶松基因定向编辑***针对靶位点定向突变活性检测

1、检测不同落叶松基因定向编辑***针对内源基因位点编辑活性的测序方法

通过落叶松原生质体制备及瞬时转化体系，将不同落叶松基因定向编辑***的内源基因靶向位点定向突变载体导入落叶松原生质体细胞中，培养48h后提取原生质体基因组DNA，设计高通量测序引物分别对不同靶基因位点进行扩增(如表3)，扩增体系如下：10×Taq Buffer，2.5uL；Taq DNA Polymerase(2.5U/μL)，0.4uL；dNTPs(10mM)，0.5uL；上游检测引物F，0.5uL；下游检测引物R，0.5uL；gDNA(100ng/μL)，2uL；ddH2O，18.6uL。扩增程序如下：95℃，3min；(95℃，30s；56℃，20s；72℃，40s)×34个循环；72℃，5min；12℃，5min。随后将PCR产物进行扩增子nova-PE150高通量测序，每个扩增子测序read数高于40000reads。

表3、检测LarHLH03、LarMYB06、LarCKX01、LarActin、LarNAC02靶位点定向突变的引物及引物用途

如图1B所示，在高通量测序结果中，与control相比，35S::STU Cas9_V01、ZmUBQ1::STU Cas9_V01、LarPE004::STU Cas9_V01、LarPE004::TTU Cas9_V01四种基因定向修饰***在落叶松内源基因LarbHLH03、LarMYB06、LarCKX01上均有定向基因编辑的活性，而且LarPE004::STU Cas9_V01***的编辑活性高于其它基因定向修饰***。该结果表明LarPE004::STU Cas9_V01基因定向修饰***可针对落叶松基因组内源位点实现定向敲除的基因组编辑。同时，也说明单转录单元***比双单元***更适用于落叶松基因编辑，且落叶松内源启动子LarPE004在落叶松中启动Cas9和sgRNA的活性高于其它物种的启动子。

如图1C所示，在高通量测序结果中，改良版的LarPE004::STU Cas9_V02在落叶松内源位点LarACT-GGG-01、LarACT-GAG-01、LarNAC02-TGT-01中的编辑活性远高于ZmUBQ1::STU Cas9_V01、LarPE004::STU Cas9_V01***，其在落叶松原生质体中编辑活性达到了11.8％-72.5％左右。该结果表明LarPE004::STU Cas9_V02基因定向修饰***可针对落叶松基因组内源位点实现高效定向敲除的基因组编辑。

2、LarPE004::STU Cas9_V02基因定向编辑***针对落叶松内源基因位点编辑活性的PCR-RELP检测方法

通过落叶松原生质体制备及瞬时转化体系，将LarPE004::STU Cas9_V02基因定向编辑***的内源基因靶向LarACT-GGG-01、LarACT-GAG-01、LarNAC02-TGT-01位点的定向突变载体通过PGE转入落叶松原生质体细胞中，培养后提取原生质体基因组DNA，设计PCR扩增引物分别对不同靶基因位点进行扩增(如表3)，扩增体系如下：10×Taq Buffer，2.5uL；TaqDNA Polymerase(2.5U/μL)，0.4uL；dNTPs(10mM)，0.5uL；上游检测引物F，0.5uL；下游检测引物R，0.5uL；gDNA(100ng/μL)，2uL；ddH2O，18.6uL。扩增程序如下：95℃，3min；(95℃，30s；56℃，20s；72℃，40s)×34个循环；72℃，5min；12℃，5min。获得的PCR扩增产物分别用MfeI、MfeI、AclI限制性内切酶酶切，若为野生型会得到较小的两条带，若为突变体则有一条与control(-)大小相同的抗性条带。通过检测抗性条带与酶切条带的量，对LarPE004::STUCas9_V02编辑***的剪切活性进行初步评价。

如图2所示，LarPE004::STU Cas9_V02编辑***在落叶松内源位点LarACT-GGG-01、LarACT-GAG-01、LarNAC02-TGT-01活性可高达90.6％。而且，PAM不仅限于NGG，在PAM为NAG、NGT的位点活性可达到8.6％-20.5％。结果表明，LarPE004::STU Cas9_V02基因定向修饰***可针对落叶松基因组不限于NGG PAM位点可实现高效定向敲除的基因组编辑。

3、LarPE004::STU Cas9_V02基因定向编辑***针对落叶松内源基因位点编辑活性的Sanger测序检测方法

基于上述PCR-RELP检测方法，为了确定LarPE004::STU Cas9_V02编辑***的编辑起始位置，发明人切胶回收抗性带，使用引物LarACT01-GGG-01-F2、LarACT01-GAG-01-F2、LarNAC02-TGT-01-F2(表3)分别对LarACT-GGG-01、LarACT-GAG-01、LarNAC02-TGT-01位点的酶切抗性带进行Sanger测序。

测序如图3，图中在出现多峰的地方即为LarPE004::STU Cas9_V02定向编辑***开始产生碱基编辑处。实验结果表明：LarPE004::STU Cas9_V02基因定向编辑***在LarACT-GGG-01位点的PAM位置前3-4位开始产生编辑；在LarACT-GAG-01位点的PAM位置前3-4位开始产生编辑、在LarNAC02-TGT-01位点的PAM位置前4-8位开始产生编辑。这结果表明LarPE004::STU Cas9_V02基因定向编辑***开始编辑位置为3-8位，比Cas9的编辑起始位置向远离PAM方向移动。

综合上述各实施例结果可见：在原生质体中的活性检测结果表明LarPE004::STUCas9_V02基因定向编辑***在落叶松LarACT-GGG-01、LarACT-GAG-01、LarNAC02-TGT-01位点中均表现出高效的剪切活性，即大大提高了相应位点的编辑活性，也拓展了Cas9(WT)的编辑范围。本发明于落叶松内成功实现了高效的基于CRISPR-Cas9的基因组编辑，证明了落叶松基因组编辑的可行性，拓展了定向改良落叶松遗传性状可用的方法，有望推动相关植物基因组工程的研究。

序列表

<110> 电子科技大学

<120> 基因组编辑表达框、载体及其应用

<160> 34

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2002

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttcctttttt ggactatttt atcataaaag ttaatttcat tctagtcttc ctcttctttt 60

atacaatttt attaattgtc taactaaatt ctttaacaac aatatatttc atccatcgac 120

tttctcttat ctatcttaca atcttatatg ggtcacgaat gatagatgga gtgtccactt 180

gaaacattga atcatttcaa aacaaataaa aagtaaaatt ttagaaaatt ttattgcaaa 240

aaaattacaa aaatatacta gtaaaaaaga ttaaatttat ccatttatta actcactcca 300

ttcctcccta cctccttatg ggacctattc attttacctc cttatgggac cctctattca 360

ttttacacac cattattcat taggaagatt ggatgtatgc acattgaatc ccaaccatgg 420

tggtaaggca ggagggcaag tgtttataaa gaaaagacca ttcattttta ccatacctct 480

tatggactct attcatttta ccattattca ttagaagatt ggatgtatgc atgaatccca 540

tggtggaagg caggagcaag tgtttataaa aaagaaaatt tattaaatcg tggttatctt 600

gaatgactaa ggaaaaactc aaacattaaa ataatgaaag tactaccaca cccattcttg 660

atgccaatgc aagttagttc ctttctactt ggcatgccaa tacttacttg agaaaaaaag 720

taataaagtg atagaatgat caataatttt ggaacactaa aggctcccat aatttgtttt 780

tacttatagt taaaaaaaat aagaacataa cccctaaggc acataatttg ttttcctcat 840

catttaaaaa aaagagaaca taactcctaa agaatacctt atcacaactt gatagagata 900

tcaattgatg ataaagaagg tctaacctat ttatatctcc ctcaagtcct tgcctttgtg 960

ggctgctaaa aggctttgct gcaaggagct ttagaggccg gtgacttatt tattattata 1020

attattttaa atacctatta ttattattat aattatttta aaataattta tttaattatt 1080

aactatttgt ttgtgtggtt actttcaaca caatgtatct agacactttc ggtcaattat 1140

tgaccaaaat ttaagcttta agataattat ttgatgcaat tgatgtggta aatgatcatc 1200

agtttggcat ctgcccaacc actacagagc ccgcgggacc gcaaccttat cttttcttcg 1260

ttacggagcc agtcaaaatt ttagaaggag aatactttaa ggcggctcca ccgaccttat 1320

cccacttgca caagtggcct cctagaagct gacacctgtc ttaatatgaa tggacttcat 1380

tgggcggtcg tcgattggtg aatttaaata cggctccacc cctccttatt tttcattgtg 1440

atttcttgat ttggagagtt ttccacgacg gcaggcgaag caacagagag cgtctctatc 1500

gattgagttc aggtaacgtg ttcttctgtc tcgatttctt tctttgtatt tttaatgtct 1560

ctggttctca tttaactgtg gtaggccggc tcttcttgat cttgcttttc aatcccaaat 1620

cagaaggcta ttctctggat ctcgtttgaa ttccaaatca gaggttttat ttcgttattg 1680

tgatttattt tctggaatta ttgttttgat aaaaggtttt cgtttaattt catcggttat 1740

ggcttgatga ggaataccaa atcctatttg cttcttgtgt gatttgttgt tcctctattt 1800

ctgggtttta atggagttct tgccagtttg tgttttatag ggttttgaat ccgtgaatcc 1860

tcgacagctt gtagcctagg gtttttttgc atctgcgggt tattatcttt tattgttcag 1920

gttttcagac tatccttatt gtttcgacta tttcttatgg ttgtgcaggt ggtgggttat 1980

tctttattga aaacttcaat at 2002

<210> 2

<211> 1368

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val

1 5 10 15

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

20 25 30

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Arg Thr Arg Leu

50 55 60

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

85 90 95

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

100 105 110

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

115 120 125

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

130 135 140

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

145 150 155 160

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

165 170 175

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

180 185 190

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

195 200 205

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

210 215 220

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn

225 230 235 240

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

245 250 255

Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

260 265 270

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

290 295 300

Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

305 310 315 320

Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

325 330 335

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

340 345 350

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

355 360 365

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

385 390 395 400

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu

405 410 415

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

420 425 430

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile

435 440 445

Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

450 455 460

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

465 470 475 480

Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

485 490 495

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser

500 505 510

Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

515 520 525

Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln

530 535 540

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

545 550 555 560

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

565 570 575

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

580 585 590

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

595 600 605

Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr

610 615 620

Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

625 630 635 640

His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr

645 650 655

Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp

660 665 670

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

675 680 685

Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe

690 695 700

Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu

705 710 715 720

His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

725 730 735

Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly

740 745 750

Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln

755 760 765

Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile

770 775 780

Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro

785 790 795 800

Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu

805 810 815

Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg

820 825 830

Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys

835 840 845

Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg

850 855 860

Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys

865 870 875 880

Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys

885 890 895

Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

900 905 910

Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr

915 920 925

Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp

930 935 940

Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser

945 950 955 960

Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg

965 970 975

Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val

980 985 990

Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe

995 1000 1005

Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys

1010 1015 1020

Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser

1025 1030 1035 1040

Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu

1045 1050 1055

Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile

1060 1065 1070

Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser

1075 1080 1085

Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly

1090 1095 1100

Phe Ser Lys Glu Ser Ile Arg Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile

1105 1110 1115 1120

Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Leu Trp

1125 1130 1135

Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly

1140 1145 1150

Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile

1155 1160 1165

Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala

1170 1175 1180

Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys

1185 1190 1195 1200

Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser

1205 1210 1215

Ala Lys Gln Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr

1220 1225 1230

Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser

1235 1240 1245

Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His

1250 1255 1260

Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val

1265 1270 1275 1280

Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys

1285 1290 1295

His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu

1300 1305 1310

Phe Thr Leu Thr Arg Leu Gly Ala Pro Arg Ala Phe Lys Tyr Phe Asp

1315 1320 1325

Thr Thr Ile Asp Pro Lys Gln Tyr Arg Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp

1330 1335 1340

Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile

1345 1350 1355 1360

Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1365

<210> 3

<211> 7433

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggcgcgcctt ccttttttgg actattttat cataaaagtt aatttcattc tagtcttcct 60

cttcttttat acaattttat taattgtcta actaaattct ttaacaacaa tatatttcat 120

ccatcgactt tctcttatct atcttacaat cttatatggg tcacgaatga tagatggagt 180

gtccacttga aacattgaat catttcaaaa caaataaaaa gtaaaatttt agaaaatttt 240

attgcaaaaa aattacaaaa atatactagt aaaaaagatt aaatttatcc atttattaac 300

tcactccatt cctccctacc tccttatggg acctattcat tttacctcct tatgggaccc 360

tctattcatt ttacacacca ttattcatta ggaagattgg atgtatgcac attgaatccc 420

aaccatggtg gtaaggcagg agggcaagtg tttataaaga aaagaccatt catttttacc 480

atacctctta tggactctat tcattttacc attattcatt agaagattgg atgtatgcat 540

gaatcccatg gtggaaggca ggagcaagtg tttataaaaa agaaaattta ttaaatcgtg 600

gttatcttga atgactaagg aaaaactcaa acattaaaat aatgaaagta ctaccacacc 660

cattcttgat gccaatgcaa gttagttcct ttctacttgg catgccaata cttacttgag 720

aaaaaaagta ataaagtgat agaatgatca ataattttgg aacactaaag gctcccataa 780

tttgttttta cttatagtta aaaaaaataa gaacataacc cctaaggcac ataatttgtt 840

ttcctcatca tttaaaaaaa agagaacata actcctaaag aataccttat cacaacttga 900

tagagatatc aattgatgat aaagaaggtc taacctattt atatctccct caagtccttg 960

cctttgtggg ctgctaaaag gctttgctgc aaggagcttt agaggccggt gacttattta 1020

ttattataat tattttaaat acctattatt attattataa ttattttaaa ataatttatt 1080

taattattaa ctatttgttt gtgtggttac tttcaacaca atgtatctag acactttcgg 1140

tcaattattg accaaaattt aagctttaag ataattattt gatgcaattg atgtggtaaa 1200

tgatcatcag tttggcatct gcccaaccac tacagagccc gcgggaccgc aaccttatct 1260

tttcttcgtt acggagccag tcaaaatttt agaaggagaa tactttaagg cggctccacc 1320

gaccttatcc cacttgcaca agtggcctcc tagaagctga cacctgtctt aatatgaatg 1380

gacttcattg ggcggtcgtc gattggtgaa tttaaatacg gctccacccc tccttatttt 1440

tcattgtgat ttcttgattt ggagagtttt ccacgacggc aggcgaagca acagagagcg 1500

tctctatcga ttgagttcag gtaacgtgtt cttctgtctc gatttctttc tttgtatttt 1560

taatgtctct ggttctcatt taactgtggt aggccggctc ttcttgatct tgcttttcaa 1620

tcccaaatca gaaggctatt ctctggatct cgtttgaatt ccaaatcaga ggttttattt 1680

cgttattgtg atttattttc tggaattatt gttttgataa aaggttttcg tttaatttca 1740

tcggttatgg cttgatgagg aataccaaat cctatttgct tcttgtgtga tttgttgttc 1800

ctctatttct gggttttaat ggagttcttg ccagtttgtg ttttataggg ttttgaatcc 1860

gtgaatcctc gacagcttgt agcctagggt ttttttgcat ctgcgggtta ttatctttta 1920

ttgttcaggt tttcagacta tccttattgt ttcgactatt tcttatggtt gtgcaggtgg 1980

tgggttattc tttattgaaa acttcaatat cctgcaggta gatcgctcgt cgacatggac 2040

aagaagtact cgatcggcct cgatattggg actaactctg ttggctgggc cgtgatcacc 2100

gacgagtaca aggtgccctc aaagaagttc aaggtcctgg gcaacaccga tcggcattcc 2160

atcaagaaga atctcattgg cgctctcctg ttcgacagcg gcgagacggc tgagaggacg 2220

cggctcaagc gcaccgcccg caggcggtac acgcgcagga agaatcgcat ctgctacctg 2280

caggagattt tctccaacga gatggcgaag gttgacgatt ctttcttcca caggctggag 2340

gagtcattcc tcgtggagga ggataagaag cacgagcggc atccaatctt cggcaacatt 2400

gtcgacgagg ttgcctacca cgagaagtac cctacgatct accatctgcg gaagaagctc 2460

gtggactcca cagataaggc ggacctccgc ctgatctacc tcgctctggc ccacatgatt 2520

aagttcaggg gccatttcct gatcgagggg gatctcaacc cggacaatag cgatgttgac 2580

aagctgttca tccagctcgt gcagacgtac aaccagctct tcgaggagaa ccccattaat 2640

gcgtcaggcg tcgacgcgaa ggctatcctg tccgctaggc tctcgaagtc tcggcgcctc 2700

gagaacctga tcgcccagct gccgggcgag aagaagaacg gcctgttcgg gaatctcatt 2760

gcgctcagcc tggggctcac gcccaacttc aagtcgaatt tcgatctcgc tgaggacgcc 2820

aagctgcagc tctccaagga cacatacgac gatgacctgg ataacctcct ggcccagatc 2880

ggcgatcagt acgcggacct gttcctcgct gccaagaatc tgtcggacgc catcctcctg 2940

tctgatattc tcagggtgaa caccgagatt acgaaggctc cgctctcagc ctccatgatc 3000

aagcgctacg acgagcacca tcaggatctg accctcctga aggcgctggt caggcagcag 3060

ctccccgaga agtacaagga gatcttcttc gatcagtcga agaacggcta cgctgggtac 3120

attgacggcg gggcctctca ggaggagttc tacaagttca tcaagccgat tctggagaag 3180

atggacggca cggaggagct gctggtgaag ctcaatcgcg aggacctcct gaggaagcag 3240

cggacattcg ataacggcag catcccacac cagattcatc tcggggagct gcacgctatc 3300

ctgaggaggc aggaggactt ctaccctttc ctcaaggata accgcgagaa gatcgagaag 3360

attctgactt tcaggatccc gtactacgtc ggcccactcg ctaggggcaa ctcccgcttc 3420

gcttggatga cccgcaagtc agaggagacg atcacgccgt ggaacttcga ggaggtggtc 3480

gacaagggcg ctagcgctca gtcgttcatc gagaggatga cgaatttcga caagaacctg 3540

ccaaatgaga aggtgctccc taagcactcg ctcctgtacg agtacttcac agtctacaac 3600

gagctgacta aggtgaagta tgtgaccgag ggcatgagga agccggcttt cctgtctggg 3660

gagcagaaga aggccatcgt ggacctcctg ttcaagacca accggaaggt cacggttaag 3720

cagctcaagg aggactactt caagaagatt gagtgcttcg attcggtcga gatctctggc 3780

gttgaggacc gcttcaacgc ctccctgggg acctaccacg atctcctgaa gatcattaag 3840

gataaggact tcctggacaa cgaggagaat gaggatatcc tcgaggacat tgtgctgaca 3900

ctcactctgt tcgaggaccg ggagatgatc gaggagcgcc tgaagactta cgcccatctc 3960

ttcgatgaca aggtcatgaa gcagctcaag aggaggaggt acaccggctg ggggaggctg 4020

agcaggaagc tcatcaacgg cattcgggac aagcagtccg ggaagacgat cctcgacttc 4080

ctgaagagcg atggcttcgc gaaccgcaat ttcatgcagc tgattcacga tgacagcctc 4140

acattcaagg aggatatcca gaaggctcag gtgagcggcc agggggactc gctgcacgag 4200

catatcgcga acctcgctgg ctcgccagct atcaagaagg ggattctgca gaccgtgaag 4260

gttgtggacg agctggtgaa ggtcatgggc aggcacaagc ctgagaacat cgtcattgag 4320

atggcccggg agaatcagac cacgcagaag ggccagaaga actcacgcga gaggatgaag 4380

aggatcgagg agggcattaa ggagctgggg tcccagatcc tcaaggagca cccggtggag 4440

aacacgcagc tgcagaatga gaagctctac ctgtactacc tccagaatgg ccgcgatatg 4500

tatgtggacc aggagctgga tattaacagg ctcagcgatt acgacgtcga tcatatcgtt 4560

ccacagtcat tcctgaagga tgactccatt gacaacaagg tcctcaccag gtcggacaag 4620

aaccggggca agtctgataa tgttccttca gaggaggtcg ttaagaagat gaagaactac 4680

tggcgccagc tcctgaatgc caagctgatc acgcagcgga agttcgataa cctcacaaag 4740

gctgagaggg gcgggctctc tgagctggac aaggcgggct tcatcaagag gcagctggtc 4800

gagacacggc agatcactaa gcacgttgcg cagattctcg actcacggat gaacactaag 4860

tacgatgaga atgacaagct gatccgcgag gtgaaggtca tcaccctgaa gtcaaagctc 4920

gtctccgact tcaggaagga tttccagttc tacaaggttc gggagatcaa caattaccac 4980

catgcccatg acgcgtacct gaacgcggtg gtcggcacag ctctgatcaa gaagtaccca 5040

aagctcgaga gcgagttcgt gtacggggac tacaaggttt acgatgtgag gaagatgatc 5100

gccaagtcgg agcaggagat tggcaaggct accgccaagt acttcttcta ctctaacatt 5160

atgaatttct tcaagacaga gatcactctg gccaatggcg agatccggaa gcgccccctc 5220

atcgagacga acggcgagac gggggagatc gtgtgggaca agggcaggga tttcgcgacc 5280

gtcaggaagg ttctctccat gccacaagtg aatatcgtca agaagacaga ggtccagact 5340

ggcgggttct ctaaggagtc aattaggcct aagcggaaca gcgacaagct catcgcccgc 5400

aagaaggact gggatccgaa gaagtacggc gggttcctgt ggcccactgt ggcctactcg 5460

gtcctggttg tggcgaaggt tgagaagggc aagtccaaga agctcaagag cgtgaaggag 5520

ctgctgggga tcacgattat ggagcgctcc agcttcgaga agaacccgat cgatttcctg 5580

gaggcgaagg gctacaagga ggtgaagaag gacctgatca ttaagctccc caagtactca 5640

ctcttcgagc tggagaacgg caggaagcgg atgctggctt ccgctaagca gctgcagaag 5700

gggaacgagc tggctctgcc gtccaagtat gtgaacttcc tctacctggc ctcccactac 5760

gagaagctca agggcagccc cgaggacaac gagcagaagc agctgttcgt cgagcagcac 5820

aagcattacc tcgacgagat cattgagcag atttccgagt tctccaagcg cgtgatcctg 5880

gccgacgcga atctggataa ggtcctctcc gcgtacaaca agcaccgcga caagccaatc 5940

agggagcagg ctgagaatat cattcatctc ttcaccctga cgaggctcgg cgcccctagg 6000

gctttcaagt acttcgacac aactatcgat ccgaagcagt acaggagcac taaggaggtc 6060

ctggacgcga ccctcatcca ccagtcgatt accggcctct acgagacgcg catcgacctg 6120

tctcagctcg ggggcgacac tagttccggc ggcagcccaa agaagaagcg gaaggtgtct 6180

ggaggttctc ctaagaaaaa gagaaaagtg tccggcggct cccctaagaa gaagaggaag 6240

gtttgaggat ctaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 6300

aaaacaaagc accagtggtc tagtggtaga atagtaccct gccacggtac agacccgggt 6360

tcgattcccg gctggtgcag gagaccttat attccccaga acatcaggtt aatggcgttt 6420

ttgatgtcat tttcgcggtg gctgagatca gccacttctt ccccgataac ggaaaccggc 6480

acactggcca tatcggtggt catcatgcgc cagctttcat ccccgatatg caccaccggg 6540

taaagttcac gggagacttt atctgacagc agacgtgcac tggccagggg gatcaccatc 6600

cgtcgcccgg gcgtgtcaat aatatcactc tgtacatcca caaacagacg ataacggctc 6660

tctcttttat aggtgtaaac cttaaactgc atttcaccag cccctgttct cgtcagcaaa 6720

agagccgttc atttcaataa accgggcgac ctcagccatc ccttcctgat tttccgcttt 6780

ccagcgttcg gcacgcagac gacgggcttc attctgcatg gttgtgctta ccagaccgga 6840

gatattgaca tcatatatgc cttgagcaac tgatagctgt cgctgtcaac tgtcactgta 6900

atacgctgct tcatagcata cctctttttg acatacttcg ggtatacata tcagtatata 6960

ttcttatacc gcaaaaatca gcgcgcaaat acgcatactg ttatctggct tggtctcagt 7020

tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg 7080

caccgagtcg gtgcaacaaa gcaccagtgg tctagtggta gaatagtacc ctgccacggt 7140

acagacccgg gttcgattcc cggctggtgc aggatccata tgaagatgaa gatgaaatat 7200

ttggtgtgtc aaataaaaag cttgtgtgct taagtttgtg tttttttctt ggcttgttgt 7260

gttatgaatt tgtggctttt tctaatatta aatgaatgta agatcacatt ataatgaata 7320

aacaaatgtt tctataatcc attgtgaatg ttttgttgga tctcttctgc agcatataac 7380

tactgtatgt gctatggtat ggactatgga atatgattaa agataaggag ctc 7433

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagtgtcgtg ctccaccatg ggcgcgcctt ccttttttgg actattttat cataaaag 58

<210> 5

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtcgacgagc gatctacctg caggatattg aagttttcaa taaagaataa ccca 54

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgcattgtcc atcttcgaca catt 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaacaatgtg tcgaagatgg acaa 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtgtttgtcc atcttcgaca catt 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgcagctttt tctgtgtgtt gtat 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaacatacaa cacacagaaa aagc 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtgtgctttt tctgtgtgtt gtat 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgcaattata aaacggaatc tgat 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aaacatcaga ttccgtttta taat 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gtgtattata aaacggaatc tgat 24

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgcaacttcc tgtgaacaat tga 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cccatcaatt gttcacagga agt 23

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tgcaagcact tcctgtgaac aatt 24

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cccaaattgt tcacaggaag tgct 24

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tgcacggtat gaggaaaacg ttgg 24

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aaacccaacg ttttcctcat accg 24

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tgggagaaag cctgcaaatg g 21

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ctttacactg tcaatttgag tctgc 25

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

caccttctgg ctttttctgt ttg 23

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cgatgaaaca atgagtaact a 21

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ggtttagtgc accgtatcca actg 24

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cagtggacct ggaaaaaatc ctct 24

<210> 27

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gagcattgta tgttgtttat tggttc 26

<210> 28

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ttatatggag gactagcatt gtaaag 26

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ggttcttaat ttgatcacgg aaa 23

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

atcctctctt tacaatgcta gtcc 24

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ggataaaaag tatccaacgg gcac 24

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

tgaggaggag cgttctcgtt cgtt 24

<210> 33

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ggcgcgccag atttgccttt tcaatttcag aaag 34

<210> 34

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

cgatctacct gcaggagtcc cccgtgttct ctccaaatga aatg 44

Claims

1.基因组编辑表达框，其特征在于，包括以下元件：启动子LarPE004、Cas9蛋白编码基因基因、sgRNA克隆及转录单元，由启动子LarPE004驱动Cas9蛋白编码基因和sgRNA克隆及转录单元。

2.根据权利要求1所述的基因组编辑表达框，其特征在于：所述启动子LarPE004如下a)或b)或c)：

a)、核苷酸序列为Seq ID No.1所示；

b)、与a)限定的核苷酸序列具有99％以上、95％以上或者90％以上同源性，且具有启动子功能；

3.根据权利要求1所述的基因组编辑表达框，其特征在于：所述Cas9蛋白的氨基酸序列Seq ID No.2所示。

4.根据权利要求1所述的基因组编辑表达框，其特征在于：所述Cas9蛋白编码基因后还连接有NLS蛋白的编码基因。

5.根据权利要求1所述的基因组编辑表达框，其特征在于其结构为：启动子LarPE004-Cas9-NLS-polyA-tRNA-CCDB-sgRNA scaffold-tRNA-HspT；

所述Cas9为Cas9编码基因，所述NLS为核定位信号；所述polyA为多聚腺苷酸尾巴；所述tRNA为转运RNA；所述CCDB为毒素蛋白CcdB的编码基因；所述sgRNA scaffold为sgRNA克隆及转录单元；所述的HspT为水稻HSP终止子；所述的sgRNA克隆及转录单元为1、2、3、4、5或6个。

6.权利要求1～5任一项所述的基因组编辑表达框在制备基因组编辑载体中的用途。

7.含有权利要求1～5任一项所述的基因组编辑表达框的基因组编辑载体。

8.权利要求1～5任一项所述的基因组编辑表达框或权利要求8所述的表达载体在进行植物基因编辑中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于所述的植物为裸子植物或被子植物；优选的，所述的裸子植物为松科植物；更优的所述的松科植物为落叶松。

10.对植物进行基因组编辑的方法，其特征在于包括以下步骤：

a)、针对待编辑的目标基因设计基因编辑位点及sgRNA；

b)、构建权利要求1～5任一项所述的基因组编辑载体，其中过构建入步骤a)所述的目的基因的sgRNA；