CN103981215B - 一种用于基因工程的骨干质粒载体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于基因工程的骨干质粒载体，所述骨干质粒载体中，向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框位于同一双元载体中，向导RNA表达框由水稻U6启动子，壮观霉素抗性基因、人工合成的sgRNA骨架序列和Poly-T终止子依次构成；Cas9核酸酶表达框由ZmUBI启动子，水稻偏好密码子改造后的Cas9编码序列和35s终止子依次构成。本发明还提供了利用所述质粒载体构建的含有靶标序列的重组载体，及其在水稻基因打靶中的应用。

Description

一种用于基因工程的骨干质粒载体及应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种用于植物基因打靶的基因工程载体及在水稻基因改造中的应用。

背景技术

水稻是世界上最主要的作物之一。水稻的生产与国民经济生活密切相关，持续不断的培育具有更加优良农艺形状的品种对于水稻生产至关重要。相对于传统育种方法，近十年内发展出的基因打靶技术为水稻产量、品质和抗性等关键形状的提升提供了便捷和高效的手段。传统的基因打靶方法包括同源重组技术、锌指核酸酶技术(ZFN)和类转录因子激活物技术(TALEN)，其中同源重组技术在植物中打靶效率极低，而ZFN和TALEN技术都存在基因工程载体构建复杂，周期长，成本高，不适于瞬时转化等技术问题，极大的限制了基因打靶技术在水稻育种改良过程中的实用性。

近2年发展出的CRISPR/Cas9技术为基因打靶提供了新手段。CRSIPR/Cas9***是存在于细菌中的一种先天性免疫***。CRSIPRRNA(crRNA)在与tracrRNA(trans-activationRNA)组装后，引导Cas9核酸酶切割与crRNA匹配的序列。利用这一原理，在真核生物细胞中，通过人工合成包含crRNA和tracrRNA的单链向导RNA(sgRNA)，同样可以引导Cas9切割基因组中的靶点序列，在细胞启动DNA修复机制后，切割位点会出现随机的碱基***或缺失，从而实现了位点特异性的基因打靶。目前，在酵母、人类细胞、小鼠、果蝇、大鼠、斑马鱼等物种中都已成功实现了基因组的CRISPR/Cas9定向基因打靶。

在植物中，也有利用CRISPR/Cas9***进行基因组编辑的研究。但是，目前有限的报道主要侧重于机理研究，尚没有对水稻基因工程载体进行优化，主要表现为现有载体使用的sgRNA和Cas9组合效率有限(Shan等，2013年NatureBiotechnology文章报道的通过稳定遗传转化法进行CRISPR/Cas9打靶效率仅为4.0％～9.4％)；操作繁琐，需要分别构建sgRNA和Cas9两个载体共转化(Xie等，2013年MolecularPlant)或进行两次克隆才能将sgRNA和Cas9表达框整合到一个质粒上(Miao等，2013年，CellResearch)；适用性单一，大多数现有植物CRISPR/Cas9***载体是分子量过大不适于瞬时转化的稳定表达载体(Miao等，2013年，CellResearch)，抑或是缺乏T-DNA边界不能用于农杆菌介导转化的瞬时载体；以及缺乏合适水稻内源启动子和适于水稻表达的编码方式等等问题(Mao等，2013年MolecularPlant)，极大的限制了CRISPR/Cas9介导基因打靶技术的优势在水稻品种改良中的发挥。

发明内容

本发明提供了一种用于水稻基因打靶的基因工程骨干载体。

具体而言，一方面，本发明提供了一种用于基因工程的骨干质粒载体，包含向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框，所述向导RNA表达框的核苷酸序列如SeqIDNo.1第107至1665位所示，所述Cas9核酸酶表达框的核苷酸序列如SeqIDNo.1第1708至8215位所示，

其特征在于，

a、所述向导RNA(sgRNA)表达框包括：水稻U6启动子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第107至352位所示；壮观霉素抗性基因(SpR)，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第412至1442位所示；人工合成的sgRNA骨架序列，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第1574至1657位所示；以及Poly-T终止子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第1658至1665位所示，

b、所述Cas9核酸酶表达框包括：玉米ZmUBI启动子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第1708至3739位所示；水稻偏好密码子改造后的Cas9编码序列，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第3758至7888位所示和35s终止子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第7889至8215位所示。

优选地，所述骨干质粒载体还包括：cT-DNA的左、右边界序列，其中，所述左边界序列的核苷酸序列如SeqIDNo.1第10464至10487位所示，所述右边界序列的核苷酸序列如SeqIDNo.1第1至25位所示，所述向导RNA表达框和所述Cas9表达框位于所述左边界序列和所述右边界序列之间。

优选地，在所述骨干质粒载体的骨架上具有卡那霉素抗性基因结构。

另一方面，本发明提供一种用于基因工程的骨干质粒载体，其特征在于，所述骨干质粒载体的核苷酸序列如SeqIDNo.1所示，文中称为pHUN4c16。

另一方面，本发明提供一种用于水稻目的基因打靶的重组载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

按照目的基因的编码序列，选择双链靶标片段，其中所述靶标片段位于所述目的基因上，所述双链靶标片段的一条链具有以下5’-(N)_X-NGG-3’结构，(N)_X表示数目为X的一条碱基序列{N₁,N₂……N_x}，N₁,N₂……N_x中的每一个表示碱基A、G、C、T中的任意一个，NGG中的N也代表碱基A、G、C、T中的任意一个(优选地，X为19或20)；

将所述靶标片段整合到上述的骨干质粒载体中，与sgRNA骨架序列连接形成带有所述标靶片段的向导RNA。

优选地，所述载体构建包括，

按照靶标序列的核酸排列顺序，分别合成具有5’-TGTG-(N)_X-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-AAAC-(N’)_X-3’特征的反向寡核苷酸链，其中正向寡核苷酸链中的(N)_X和反向寡核苷酸中的(N’)_X具有反向互补特征；用BsaI内切酶切开所述骨干质粒载体，将所述正向寡核苷酸链和所述反向寡核苷酸链退火后形成的双链核苷酸替换壮观霉素抗性基因，通过卡那霉素正向选择和壮观霉素负向选择，筛选形成用于水稻目的基因打靶的重组载体。

另一方面，本发明提供一种上述重组载体在水稻基因打靶中的应用，其特征在于，包括步骤如下，

将所述重组载体转入水稻细胞，使所述水稻细胞同时含有针对靶标基因的向导RNA和Cas9核酸酶；在向导RNA和Cas9核酸酶的共同作用下，剪切目的基因的双链靶标片段，诱发所述水稻细胞自身的DNA修复功能，实现目的基因中靶标片段的随机***和/或随机缺失。

优选地，所述转入水稻细胞是指将所述重组载体经原生质体瞬时转化或农杆菌介导稳定转化到水稻细胞或组织中。

优选地，所述应用用于获得在靶标片段上具有随机***和/或随机缺失的水稻植株。

另一方面，本发明提供一种宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含上述的重组载体。

本发明所述的基因工程骨干载体是包含T-DNA边界序列的双元载体，在T-DNA左右两个边界内，包含2个表达框：Cas9基因表达框和向导RNA表达框，还可以包括潮霉素抗性基因表达框。在T-DNA边界外的载体骨架序列中，可以包含卡那霉素抗性基因等结构(图1)。

在本发明中，SpR基因两端分别存在反向排列的BsaI内切酶识别位点(剪切位点如SeqIDNo.1第349位和1547位所示)，用于***靶标片段。

本发明还提供包含携带所述重组载体的转化子，其中，所用宿主为微生物，具体的为大肠杆菌和农杆菌。

本发明的一个目的是应用所述重组载体，实现目的基因靶标片段的随机***和/或随机缺失。具体而言，是通过重组载体转入水稻细胞，使细胞同时含有针对靶标基因的向导RNA和Cas9核酸酶；在向导RNA和Cas9核酸酶的共同作用下，目的基因的双链靶标片段被剪切，诱导水稻细胞自身的DNA修复功能，最终实现目的基因中靶标片段的随机***和/或随机缺失。

所述应用中，向导RNA由能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段和sgRNA骨架片段连接而成，所述sgRNA骨架片段可与Cas9核酸酶结合。所述向导RNA中能与所述靶标片段互补结合的RNA片段为能与所述5’-(N)_X-NGG-3’中(N)_X互补结合的RNA片段。

所述向导RNA中sgRNA骨架片段由SEQIDNo.1中第1574至1657位核苷酸所示DNA转录出来的RNA片段。所述Cas9核酸酶由SEQIDNo.1中第3758至7888位核苷酸所示DNA转录的RNA片段翻译而成的蛋白质。

所述重组载体转入水稻细胞的方法为：向植物细胞直接导入重组载体的DNA序列，具体如PEG介导的原生质体瞬时转化或农杆菌介导的愈伤组织稳定转化。

所述再生植株，由转化的水稻细胞或组织，如原生质体或愈伤组织分化再生而来。所述应用可获得带有目的基因中靶标片段上的随机***和/或随机缺失的水稻植株。

为了提高水稻的打靶效率，在本发明中，采用了水稻U6启动子表达sgRNA(采用该启动子，在水稻中的表达效率显著高于其它启动子)和ZmUBI启动子驱动水稻偏好密码子化改造的Cas9基因的组合，本申请的发明人发现，这种组合能够显著提高对靶标序列剪切的稳定性和效率，经实验证明，其达到了目前已知在水稻内最为稳定高效的对靶标序列的剪切的目的。同时，本发明预先将sgRNA表达框和Cas9表达框预置与同一质粒骨架上，同时在靶标序列***位置预置了壮观霉素抗性基因，在重组载体构建过程中，仅需一次酶切连接，在壮观霉素反向筛选和骨干质粒载体的骨架上的卡那霉素正向筛选的作用下，可以高效简洁的获得完整的打靶重组载体。从而，简化了针对某一基因构建重组打靶载体的流程，相对于目前部分采用两个分别转化包含sgRAN表达框和Cas9表达框载体的打靶方法，也具有能更高效向水稻细胞内导入完整CRISPR/Cas9***的特点。

在一种实现方式中，本发明的骨干质粒载体的核苷酸序列如下(与序列表中SEQIDNo.1相同)：

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附图说明

图1为本发明一个实施例中的骨干质粒载体pHUN4c16的载体示意图；

图2为应用pHUN4c16-BEL重组载体转入原生质体对水稻内源BEL基因定点突变测序检测的部分结果图，其中WT表示野生型基因，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了***突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或***的核苷酸数量；

图3为应用pHUN4c16-BEL重组载体通过PEG介导转入原生质体后再生植株中对水稻内源BEL基因定点突变测序检测的部分结果图，其中WT表示野生型基因，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了***突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或***的核苷酸数量；

图4为应用pHUN4c16-BEL重组载体通过农杆菌介导的稳定转化获得的转基因植株中对水稻内源BEL基因定点突变测序检测的部分结果图，其中WT表示野生型基因，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了***突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或***的核苷酸数量；

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限制本发明。

实施例

骨干质粒载体的设计

具体而言，本发明设计了这样的骨干质粒载体，其包括向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框，向导RNA表达框包括：水稻U6启动子、壮观霉素抗性基因、人工合成的sgRNA骨架序列和以及Poly-T终止子。Cas9核酸酶表达框包括：玉米ZmUBI启动子、水稻偏好密码子化改造(改造方式为现有技术)的Cas9编码序列和35s终止子。上述序列是该骨干质粒载体的特有部分，其还可以包括一些常规载体所具有的一般结构，这里不再累述。SeqIDNO.1中示出了本发明所设计的骨干质粒载体的一种实现方式。该载体可以采用现有技术中的常规方式来构建。

为了方便针对特定目的基因CRSIPR/Cas9打靶重组载体的构建，本骨干载体预先将向导RNA表达框和Cas9表达框整合在同一载体骨架上，同时在靶标序列***位置预置了壮观霉素抗性基因，采用这种构造，在后续重组载体构建过程中，仅需一次酶切连接，将靶标序列置换壮观霉素基因，重组载体可在壮观霉素反向筛选和骨干质粒载体的骨架上的自身卡那霉素正向筛选下得到快速有效筛选，因此，利用骨干载体中的这种设计策略，可以高效简洁的获得完整的打靶重组载体。同时，将向导RNA表达框和Cas9表达框整合在同一载体骨架上，相对于分别转化，可以提高转入完整CRSIPR/Cas9***的效率。

用于水稻BEL基因打靶的重组载体的制备。

1.1，选择水稻BEL基因(LOC_Os03g55240)中第505-526位的核苷酸序列CGAGGTCCGCGCCATGGTGCGG，(下划线部分为所述5’-(N)_X-NGG-3’结构中NGG部分)，作为打靶位点。

1.2，按所选择靶位点合成(华大基因公司)正向寡核苷酸链(BELKO1P1)和可与之互补的反向寡核苷酸链(BELKO1P2)，

具体序列为：

BELKO1P1:TGTGCGAGGTCCGCGCCATGGTG；

BELKO1P2:AAACCACCATGGCGCGGACCTCG。

其中未被下划线标注的部分为上述靶位点中去除NGG的序列或互补序列，下划线部分为用于连接载体的粘性末端。

1.3,经过退火程序，将BELKO1P1和BELKO1P2两链退火形成具有粘性末端的双链DNA，作为构建重组载体的***片段。

1.4，用BsaI内切酶(NEB公司)在37℃酶切pHUN4c16载体2小时，65℃失活酶切体系10分钟，作为构建重组载体的骨架片段。

1.5，用T4连接酶(NEB公司)将重组载体骨架片段和***片段相连，转入大肠杆菌中。通过选择具有卡那霉素抗性且不具壮观霉素抗性的菌斑，获得阳性转化子。经测序验证后，提取阳性质粒，构成用于水稻BEL基因CRISPR/Cas9打靶的重组载体质粒，命名为pHUN4c16-BEL。

实施例2、原生质体瞬时转化介导的水稻BEL基因打靶。

2.1,利用PEG法将pHUN4c16-BEL质粒转化至水稻日本晴原生质体，水稻原生质体转化具体过程参考了文献Zhang等Ahighlyefficientricegreentissueprotoplastsystemfortransientgeneexpressionandstudyinglight/chloroplast-relatedprocesses.PlantMethod(2011).中公开的实验方法。

2.2，利用植物基因组小量提取试剂盒(天根生化公司)，在水稻原生质体转化后48小时提取其基因组DNA。以该DNA为模板，用Phusion高保真DNA聚合酶(NEB公司)PCR扩增包含靶标区域的序列，其中PCR扩增所用的引物为：

BelKO1genomecheckFP:CAGAGTCACAGAAACACATCAC

BelKO1genomecheckRP:CTTCCTCCTGACGCCGAACACG

2.3，所获PCR扩增片段经电泳回收后，将其克隆至pEASY-T载体(全式金公司)，用M13F引物测序，分析靶标位点的突变。测序结果表明，在所测120个克隆中，82个克隆携带BEL基因靶标序列上的突变，突变效率为68.3％；突变的形式包括碱基的***和/或缺失。部分结果如图2所示。

2.4，利用PEG法将pHUN4c16-BEL质粒转化至水稻日本晴原生质体，并获得再生水稻植株。水稻原生质体转化和植株再生具体过程参考了文献Hayashimoto等APolyethyleneGlycol-MediatedProtoplastTransformationSystemforProductionofFertileTransgenicRicePlants.PlantPhysiology(1990).中公开的实验方法。

2.5，利用植物基因组小量提取试剂盒(天根生化公司)，提取所获62棵再生植株的基因组DNA。以该DNA为模板，用Phusion高保真DNA聚合酶(NEB公司)PCR扩增包含靶标区域的序列，其中PCR扩增所用的引物为上述BelKO1genomecheckFP和BelKO1genomecheckRP。

2.6，以BelKO1genomecheckFP为引物对所获PCR扩增片段直接测序，分析靶标位点的突变。测序结果表明，在所测62棵植株中，21棵植株带有BEL基因靶标序列上的突变，突变效率为33.9％；突变的形式包括碱基的***和/或缺失。部分结果如图3所示。

实施例3、农杆菌稳定转基因介导的水稻BEL基因打靶。

3.1，利用冻融法将pHUN4c16-BEL重组载体转入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)，获得阳性克隆。

3.2、成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀种子的沿糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、***旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。

3.3、采用上述转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照YongboDuan(YongboDuan，ChenguangZhai，etal.Anefficientandhigh-throughputprotocolforAgrobacteriummediatedtransformationbasedonphosphomannoseisomerasepositiveselectioninJaponicarice(OryzasativaL.)[J].PlantCellReport，2012.DOI10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。共获得36株pHUN4c16-BEL植株(pHUN4c16-BEL转基因水稻植株)。

3.4，利用植物基因组小量提取试剂盒(天根生化公司)，提取所获36株pHUN4c16-BEL转基因水稻植株的基因组DNA。以该DNA为模板，用Phusion高保真DNA聚合酶(NEB公司)PCR扩增包含靶标区域的序列，其中PCR扩增所用的引物为上述BelKO1genomecheckFP和BelKO1genomecheckRP。

3.5，以BelKO1genomecheckFP为引物对所获PCR扩增片段直接测序，分析靶标位点的突变。测序结果表明，在所测36株植株中，全部带有BEL基因靶标序列上的突变，突变效率为100％；突变的形式包括碱基的***和/或缺失。部分结果如图4所示。

显然，利用本发明的载体进行基因打靶所实现的突变效率显著高于常规方法。

Claims (8)

1.一种用于基因工程的骨干质粒载体，其特征在于，包含向导RNA表达框、Cas9核酸酶表达框和T-DNA的左、右边界序列，

所述向导RNA表达框的核苷酸序列如SeqIDNo.1第107至1665位所示，所述Cas9核酸酶表达框的核苷酸序列如SeqIDNo.1第1708至8215位所示，

a、所述向导RNA表达框包括：水稻U6启动子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第107至352位所示；壮观霉素抗性基因，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第412至1442位所示；人工合成的sgRNA骨架序列，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第1574至1657位所示；以及Poly-T终止子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第1658至1665位所示，

b、所述Cas9核酸酶表达框包括：玉米ZmUBI启动子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第1708至3739位所示；Cas9编码序列，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第3758至7888位所示和35s终止子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第7889至8215位所示，

c、所述左边界序列的核苷酸序列如SeqIDNo.1第10464至10487位所示，所述右边界序列的核苷酸序列如SeqIDNo.1第1至25位所示，所述向导RNA表达框和所述Cas9表达框位于所述左边界序列和所述右边界序列之间。

2.根据权利要求1所述的骨干质粒载体，其特征在于，所述骨干质粒载体还包括潮霉素抗性基因表达框。

3.一种用于基因工程的骨干质粒载体，其特征在于，所述骨干质粒载体的核苷酸序列如SeqIDNo.1所示。

4.一种用于水稻目的基因打靶的重组载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

按照目的基因的编码序列，选择双链靶标片段，其中所述双链靶标片段位于所述目的基因上，所述双链靶标片段的一条链具有5’-(N)_X-NGG-3’结构，(N)_X表示数目为X的一条碱基序列{N₁,N₂……N_x}，N₁,N₂……N_x中的每一个表示碱基A、G、C、T中的任意一个，NGG中的N也代表碱基A、G、C、T中的任意一个；

将所述靶标片段整合到权利要求1-3中任意一项所述的骨干质粒载体中，与sgRNA骨架序列连接形成带有所述标靶片段的向导RNA。

5.根据权利要求4所述的重组载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：按照靶标序列的核酸排列顺序，分别合成具有5’-TGTG-(N)_X-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-AAAC-(N’)_X-3’特征的反向寡核苷酸链，其中正向寡核苷酸链中的(N)_X和反向寡核苷酸中的(N’)_X具有反向互补特征；用BsaI内切酶切开所述骨干质粒载体，将所述正向寡核苷酸链和所述反向寡核苷酸链退火后形成的双链核苷酸替换壮观霉素抗性基因，通过卡那霉素正向选择和壮观霉素负向选择，筛选形成用于水稻目的基因打靶的重组载体。

6.一种权利要求5中所述的重组载体在水稻基因打靶中的应用，其特征在于，包括步骤如下，

将所述重组载体转入水稻细胞，使细胞同时含有针对靶标基因的向导RNA和Cas9核酸酶；在向导RNA和Cas9核酸酶的共同作用下，剪切目的基因的双链靶标片段，诱发所述水稻细胞自身的DNA修复功能，实现目的基因中靶标片段的随机***和/或随机缺失。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述转入水稻细胞是指将所述重组载体经原生质体瞬时转化或农杆菌介导稳定转化到水稻细胞或组织中。

8.根据权利要求6或7的应用，其特征在于，所述应用用于获得在靶标片段上具有随机***和/或随机缺失的水稻植株。