TW202233584A - 用於基因治療之經修飾病毒顆粒 - Google Patents

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歐洲分子生物學實驗室
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Abstract

本發明係關於新穎經表面修飾病毒衣殼及包含該等經表面修飾病毒衣殼的重組病毒粒子。此外，本發明係關於用於製備經表面修飾病毒衣殼的中間體。該等經表面修飾病毒衣殼經設計以選擇性及/或更有效地提供基因治療。該等經表面修飾病毒衣殼，當結合至重組病毒粒子中時，可用於治療以基因異常為特徵的疾病。

Description

用於基因治療之經修飾病毒顆粒
本發明係關於用於基因遞送及基因治療的改進的經表面修飾病毒衣殼。提供了包含經修飾衣殼蛋白的腺相關病毒(AAV)顆粒。在某些實施例中，本發明進一步關於製造本發明之改進的經表面修飾病毒衣殼的方法，該方法藉由以下方式進行：去除腺相關病毒(AAV)衣殼中的天然結合位點，並將配位體引入該衣殼，從而提供具有增強的轉導效率及/或選擇性轉導所靶向之細胞的AAV。本發明之另一態樣關於用於治療疾病的經表面修飾病毒衣殼及治療疾病之方法，包含將經表面修飾病毒衣殼投與有需要之個體。本發明之另一態樣關於本發明之經表面修飾病毒衣殼，其用於細胞轉染，例如作為基礎研究中之基因遞送工具。
將攜帶遺傳資訊的分子引入細胞係現代醫學及基礎研究的有用工具。較佳之方法包括使用衍生自病毒的基因遞送媒介物，該等病毒包括腺病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、痘瘡病毒及腺相關病毒。其中，重組腺相關病毒(AAV)由於缺乏致病性、複製機能不全及表現穩定，已成為活體內基因治療的較佳病毒。超過100項使用基於AAV之載體的臨床試驗正在進行中，且最近有兩種AAV基因治療產品獲得了FDA的批准，亦即用於治療遺傳性視網膜疾病的沃替奈(Voretigene neparvovec-rzyl，LUXTURNA)及用於治療脊髓性肌肉萎縮症的奧納阿貝(onasemnogene abeparvovec-xioi，ZOLGENSMA)。
腺相關病毒係細小病毒科依賴病毒屬之成員。此等病毒係無包膜的；病毒基因體容納在二十面體蛋白質衣殼內。蛋白質衣殼與哺乳動物細胞表面多醣、蛋白質及醣蛋白的相互作用會觸發哺乳動物目標細胞對病毒粒子的內化。天然AAV分離株中蛋白質衣殼的胺基酸序列差異導致與哺乳動物細胞表面蛋白的結合模式不同，且由此導致細胞感染性或向性的模式不同。
Kern等人( J. Virology77 (20):11072-11081, 2003)揭示了腺相關病毒(AAV) 2型(AAV-2)對細胞的感染係藉由與硫酸乙醯肝素蛋白多醣的結合所介導的，並且可以與肝素發生競爭。AAV-2衣殼蛋白的突變分析表明，一組鹼性胺基酸(精胺酸484、487、585及588以及離胺酸532)有助於肝素與HeLa細胞的結合。此等胺基酸位於AAV-2衣殼的三重刺突區的三個簇中。R484及R585突變的重組AAV-2在小鼠中的組織分佈表明，與野生型重組AAV感染相比，肝臟感染顯著減少，但心臟感染仍在繼續。他們認為，雖然肝素結合會影響AAV-2的感染性，但似乎並非必然的。Afione等人(J. Virology 89 (3):1660-1672, 2014)進行了類似的分析，以確定有助於AAV5與哺乳動物細胞結合的衣殼殘基。
當前AAV基因治療中使用的衣殼用途有限。對所需組織的轉導效率低，迫使要投與高滴度的重組病毒，導致脫靶轉導及毒性，尤其係肝毒性。當前方法的另一個限制係，許多當前的AAV衣殼在轉導特定細胞類型方面係無效的，遺傳承載物必須要遞送至此等細胞類型才能進行有效治療。
正在採用多種方法來工程化經修飾衣殼，以改變重組AAV的細胞結合特異性，以用於基因治療。
一種方法係在人類、非人類靈長類動物及其他哺乳動物中尋找新的天然分離株。參見例如WO 2018/160582；WO 2015/121501；WO 2020/223232。此等方法不能確定會發現具有所需向性的衣殼。
另一種方法係在沒有肽***的情況下，經由取代對衣殼蛋白之一級胺基酸序列進行突變。通常，庫係用聚集在衣殼表面所需區域的隨機胺基酸突變構築的。接著，在活體內對庫進行篩選，並藉由自特定組織中回收來鑑別出能夠轉導特定組織及細胞的衣殼。一種相關之方法係應用計算機方法自已知AAV分離株的衣殼序列進行推斷，從而預測可能已改變組織及細胞類型向性的新官能衣殼。接著合成此等預測的衣殼並在活體內篩選組織轉導模式。參見例如US 9,695,220；US 10,738,087及WO 2019/217911。此等經驗方法依賴於製造高度複雜的庫及經驗評估。因此，對所需向性的識別依賴於意外發現。
一種更直接之方法係藉由***已知會與特定細胞類型結合的肽，經由將靶向細胞的肽的編碼區同框***衣殼(CAP)基因來改變衣殼蛋白的胺基酸序列。參見例如WO 2019/207132；WO 2021/077000；WO 2017/100671；及WO 2020/068990。然而，此種方法有侷限性：***的位置必須使其在重組產品的生產過程中不會明顯干擾病毒粒子的組裝，並且必須位於病毒衣殼上以促進與哺乳動物細胞表面目標的富有成效的相互作用及後續的內化。
此外，所有此等衣殼工程化方法均會產生全新的蛋白質衣殼，若沒有廣泛的臨床前及臨床表徵，此等衣殼就無法用於基因治療。
對改變AAV衣殼之組織特異性的新方法存在需求，該方法不依賴於意外發現並且不降低生產效率或不會在投與時降低轉導效率。
WO 2020/225363揭示了使用與細胞靶向特異性已知的配位體的化學綴合對完整病毒粒子的AAV衣殼進行組裝後修飾之方法，並揭示了利用此等方法製備的經表面修飾衣殼。對擴展及最佳化此類組裝後修飾方法存在需求。
鑒於上述限制，仍然需要開發對相關目標組織具有更高轉導效率及特異性的新病毒平台，以改進對相關特定細胞的轉導及/或在以較低滴度遞送時能夠有效。
本發明之一個態樣中係對病毒衣殼進行化學修飾以接受配位體連接並將相關配位體連接至該衣殼上。在一些實施例中，在修飾病毒以接受配位體連接之前去除AAV衣殼中的天然結合位點。
在本發明之一態樣中，提供了一種經表面修飾病毒衣殼，其包含以下各者中之一或多者：經由連接子與病毒衣殼蛋白共價綴合的配位體，該連接子包含：交聯部分，其中該交聯部分係藉由交聯劑反應性成對的第一成員與第二成員之間的反應形成的；及一或多個視情況選用之間隔子。
在一些實施例中，交聯劑反應性成對的第一成員與第二成員參與選自以下的反應：Cu(I)催化之疊氮化物-炔烴環加成(CuAAC)反應、應變促進之炔烴-疊氮化物環加成(SPAAC)反應、應變促進之炔烴-硝酮環加成(SPANC)反應、逆電子需求狄耳士-阿德爾(inverse electron demand Diels-Alder，IEEDD)反應、及史陶丁格連接(Staudinger ligation)及[4+1]環加成反應。
在一些實施例中，交聯部分包含以下至少一種：八員環及***環。在某些實施例中，交聯部分包含稠合以形成雙環部分的八員環及***環。
在一些實施例中，該反應係應變促進之炔烴-疊氮化物環加成(SPAAC)反應。在某些此等實施例中，交聯劑反應性成對包含環辛炔及疊氮化物。在某些實施例中，環辛炔選自二苄基環辛炔(DIBO)、二苯并氮雜環辛炔(DBCO)及聯芳氮雜環辛炔酮(BARAC)或其衍生物。在某些實施例中，環辛炔係DBCO。
在一些實施例中，交聯部分包含以下結構：
Figure 02_image004
其中R 1及R 2指示與該連接子的連接點。
在一些實施例中，該反應係逆電子需求狄耳士-阿德爾(IEEDD)反應。在某些此等實施例中，交聯劑反應性成對包含反式環辛烯及四𠯤。
在一些實施例中，交聯部分包含以下結構
Figure 02_image006
其中R 1及R 2指示與該連接子的連接點。
在一些實施例中，連接子包含一或多個間隔子。在某些實施例中，一或多個間隔子係乙二醇單體並且病毒與配位體之間的連接子中乙烯單體的總數總計小於50個單體。在某些實施例中，病毒與配位體之間的連接子中乙烯單體的總數總計小於25個單體。在替代實施例中，一或多個間隔子包含1至20個乙二醇單體。在某些實施例中，一或多個間隔子中之每一個包含2至8個乙二醇單體。在某些實施例中，一或多個間隔子中之每一個包含4個乙二醇單體。在某些實施例中，連接子包含至少兩個間隔子，該等間隔子各自包含4個聚乙二醇單體。
在一些實施例中，配位體係細胞類型特異性配位體。在某些實施例中，配位體選自細胞介素、生長因子、凝集素、毒素、單鏈抗體、肽及其組合。
在一些實施例中，連接子共價連接至衣殼蛋白一級序列之一級胺基。在某些實施例中，一級胺基選自N端胺基、離胺酸胺基酸殘基及精胺酸胺基酸殘基。在某些實施例中，一級胺基係離胺酸胺基酸殘基之側鏈。
在一些實施例中，連接子經由配位體之一級胺基共價連接至配位體。
在一些實施例中，連接子經由配位體之一級序列的非天然胺基酸殘基共價連接至配位體。在某些實施例中，非天然胺基酸殘基包含參與選自以下反應的交聯劑反應性成對之成員：Cu(I)催化之疊氮化物-炔烴環加成(CuAAC)反應、應變促進之炔烴-疊氮化物環加成(SPAAC)反應、應變促進之炔烴-硝酮環加成(SPANC)反應、逆電子需求狄耳士-阿德爾(IEEDD)反應、史陶丁格連接及[4+1]環加成反應。在某些實施例中，交聯劑反應性成對包含疊氮化物、環辛炔、環辛烯或1,2,4,5四𠯤部分。
在替代實施例中，連接子係配位體及連接子的融合蛋白之一部分。
在一些實施例中，經表面修飾病毒衣殼包含一或多個天然多醣結合位點。在一些實施例中，病毒衣殼未經修飾以去除天然多醣結合位點。在某些實施例中，與相同血清型的未經修飾病毒衣殼相比，經表面修飾病毒衣殼的特徵在於感染性增加。
在一些實施例中，病毒衣殼已被修飾以去除一或多個天然多醣結合位點。在某些實施例中，去除係經由已知會介導硫酸肝素結合的胺基酸的突變進行的。在某些實施例中，與未經修飾病毒衣殼相比，經表面修飾病毒衣殼的特徵在於改變的向性。在某些實施例中，經表面修飾病毒衣殼的特徵在於與未經修飾病毒衣殼相比提高的轉導效率。
在一些實施例中，病毒衣殼選自腺病毒衣殼、腺相關病毒衣殼、逆轉錄病毒衣殼、慢病毒衣殼、單純疱疹病毒衣殼及桿狀病毒衣殼。
在一些實施例中，病毒衣殼係腺相關病毒(AAV)衣殼。在某些實施例中，VP1的585及588處或VP2或VP3中的類似位置的至少一個精胺酸殘基已發生突變。在某些實施例中，VP1的585及588處的精胺酸殘基已突變為丙胺酸殘基。
在一些實施例中，經表面修飾病毒衣殼進一步包含與衣殼表面連接的分散的PEG寡聚物或PEG聚合物。在一些實施例中，經表面修飾病毒衣殼表現出逃脫預先存在的中和抗體、較低的免疫原性及免疫隱蔽性(immune stealth)。
在本發明之一態樣中，提供了一種經表面修飾病毒衣殼，其包含與根據式I的配位體連接的病毒衣殼蛋白：
Figure 02_image008
其中：
Figure 02_image010
係病毒衣殼； Y及Y'獨立地係連接部分； n及n'獨立地係0或1至50的整數； Sp及Sp'獨立地係視情況選用之間隔子； L係配位體； x係配位體與病毒衣殼之比率，且在50至250的範圍內；且 Q係選自：
Figure 02_image012
其中，Z為7或8員環狀或雜環結構。在某些實施例中，x在80至120的範圍內。
在本發明之一態樣中，提供了一種經表面修飾病毒衣殼，其包含與根據式I-1的配位體連接的病毒衣殼蛋白：
Figure 02_image014
其中：
Figure 02_image010
係病毒衣殼； n及n'獨立地係0至30的整數； L係配位體；且 x係1至300的整數。
在本發明之一態樣中，提供了一種組合物，其包含本文提供的經表面修飾病毒衣殼，其中平均配位體與病毒衣殼之比率為50至250。
在本發明之一態樣中，提供了一種醫藥組合物，其包含病毒粒子，該病毒粒子包含如本文提供的經表面修飾病毒衣殼，該醫藥組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。
在本發明之一態樣中，一種治療具有基因異常的患者之方法，該方法包含投與醫藥組合物，該醫藥組合物包含病毒粒子，該病毒粒子包含如本文提供的經表面修飾病毒衣殼，該醫藥組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。
在本發明之一態樣中，提供了一種經表面官能化病毒衣殼，其包含交聯劑反應性成對之成員及視情況選用之一或多個間隔子，其中該經表面官能化病毒衣殼適合與經官能化配位體反應，該配位體包含交聯劑反應性成對之成員，其中交聯劑反應性成對之成員參與選自以下的反應：Cu(I)催化之疊氮化物-炔烴環加成(CuAAC)反應、應變促進之炔烴-疊氮化物環加成(SPAAC)反應、應變促進之炔烴-硝酮環加成(SPANC)反應、逆電子需求狄耳士-阿德爾(IEEDD)反應、及史陶丁格連接及[4+1]環加成反應。
本發明之一態樣提供了一種製備本文所述的經表面修飾病毒衣殼之方法，該方法包含以下步驟： i)藉由使病毒衣殼蛋白與衣殼反應性連接子反應獲得經表面官能化病毒衣殼，該連接子包含交聯劑反應性成對的第一成員及視情況選用之一或多個間隔子； ii)將該經表面官能化病毒衣殼與經官能化配位體綴合，該經官能化配位體包含該交聯劑反應性成對的第二成員及視情況選用之一或多個間隔子； 其中該交聯劑反應性成對的該第一成員與該第二成員反應形成交聯部分Q；及 iii)獲得該經表面修飾病毒衣殼。
本發明之每一態樣之較佳特徵如針對其他態樣每一者，細節上作必要修改。此處提及的引用文件已在法律允許的最大範圍內納入。儘管已詳細描述本發明及其優點，但應理解，在不背離由所附申請專利範圍所限定之本發明之精神及範疇之情況下，本文可進行各種改變、取代及更改。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張於2020年11月11日申請之美國臨時申請案第63/112,457號之優先權，該申請案以全文引用之方式併入。 序列表
本申請案含有序列表，該序列表已經由EFS-Web提交且以全文引用之方式併入本文中。該ASCII拷貝係於____________創建的，名為_____sequencelisting.txt，大小為_____個位元組。 7.1. 定義
如本文所用，術語「rAAV」係指包含包裝在AAV衣殼內的重組核酸構築體的重組病毒粒子。
重組核酸構築體(與「重組病毒基因體」同義)包含位於AAV反向末端重複序列之間的聚核苷酸有效負荷(與「承載物」同義)。有效負荷可以係可表現的聚核苷酸或係為同源定向修復提供模板的DNA構築體。在各種實施例中，可表現的聚核苷酸編碼蛋白質(例如，編碼治療性蛋白質的轉殖基因)，或編碼用於基因編輯或RNA編輯機制諸如CRISPR、ADAR及ADAT的miRNA、siRNA或嚮導RNA。
術語「AAV」、「腺相關病毒」、「AAV病毒」、「AAV病毒粒子」、「AAV病毒顆粒」、「AAV顆粒」、「腺相關病毒載體」及「AAV載體」在本文中作為rAAV的同義詞使用。
如本文所用，哺乳動物細胞表面蛋白、多醣或蛋白多醣對「衣殼的結合」或「經表面修飾衣殼的結合」旨在結合包含該衣殼或經表面修飾衣殼的重組病毒粒子，通常為rAAV。
如本文所用，術語「治療(treat/treatment)」以其最廣泛接受的臨床意義使用。此等術語包括但不限於減輕疾病的徵象或症狀；改善疾病的徵象或症狀；緩解症狀；減弱疾病的程度；使疾病狀態穩定(亦即，不惡化)；延遲或減緩疾病進展；改善或緩和疾病病況；緩解(無論是部分還是全部)，無論是可偵測的還是不可偵測的；治癒；與未接受治療之預期存活期相比延長存活期。
「有效量」係本發明之AAV顆粒有效治療疾病之量。
如本文所用，術語「預防(prevention/preventing)」當在個體的上下文中使用時係指疾病的預防，通常在例如因存在基因體突變而處於發生疾病風險之個體中。
如本文所用，術語「向性」係指某些細胞或組織被病毒衣殼優先感染及/或轉導。在一較佳的實施例中，為了改變AAV衣殼的向性，衣殼被賦予某些特徵，諸如對目標細胞表面上的受體具有某些親和性，而此等特徵係其天生不具備的。
在本發明之上下文中，如在某些實施例中使用的術語「個體」較佳地係指哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、天竺鼠、兔、貓、犬、猴，或者較佳地係人類。術語「患者」較佳地係指哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、天竺鼠、兔、馬、牛、母牛、貓、犬、猴，或較佳地係指人類，例如人類患者，需要對其進行診斷、預後或治療。本發明之個體可能處於罹患疾病的危險中，諸如細菌感染、病毒感染、真菌感染或寄生蟲感染。與本發明上下文相關的醫學適應症的更詳細描述在本文別處提供。
術語「視情況經取代」意謂既定化學部分(例如烷基)可(但非必需)結合其他取代基(例如雜原子)。舉例而言，視情況經取代之烷基可以係完全飽和的烷基鏈(例如純烴)。替代地，同一個視情況經取代之烷基可具有不同於氫之取代基。舉例而言，其可在沿鏈的任何點處鍵合至鹵素原子、羥基或本文所描述之任何其他取代基。因此，術語「視情況經取代」意謂既定化學部分具有含有其他官能基之潛能，但未必具有任何其他官能基。用於所描述基團的視情況存在之取代之合適的取代基包括但不限於鹵素、側氧基、-OH、-CN、-COOH、-CH2CN、-O-(C 1-C 6)烷基、(C 1-C 6)烷基、(C 1-C 6)烷氧基、(C 1-C 6)鹵代烷基、(C 1-C 6)鹵代烷氧基、-O-(C 2-C 6)烯基、-O-(C 2-C 6)炔基、(C 2-C 6)烯基、(C 2-C 6)炔基、-OP(O)(OH) 2、-OC(O)(C 1-C 6)烷基、-C(O)(C 1-C 6)烷基、-OC(O)O(C 1-C 6)烷基、-NH2、-NH((C 1-C 6)烷基)、-N((C 1-C 6)烷基)2、-NHC(O)(C 1-C 6)烷基、-C(O)NH(C 1-C 6)烷基、-S(O)2(C 1-C 6)烷基、-S(O)NH(C 1-C 6)烷基及S(O)N((C 1-C 6)烷基) 2。取代基本身可以視情況經取代。如本文所用，「視情況經取代」亦指經取代或未經取代，其含義描述於下文中。包括額外取代的部分在本文中稱為取代部分之「衍生物」。舉例而言，烷基取代的硝酮係硝酮部分之衍生物的一實例。
術語「經取代」意謂指定基團或部分具有一或多個適合的取代基，其中取代基可在一或多個位置處連接至指定基團或部分。舉例而言，經環烷基取代之芳基可表示環烷基經由一個鍵或藉由與芳基稠合及共享兩個或更多個共用原子來連接至芳基之一個原子。
除非另有具體定義，「芳基」意謂具有1至3個芳環的環狀芳烴基團，包括單環或雙環基團，諸如苯基、聯苯基或萘基。當含有兩個芳環(雙環等)時，芳基的芳環視情況接合於一個點(例如聯苯基)或稠合(例如萘基)。芳基在任何連接點視情況經一或多個取代基(例如1至5個取代基)取代。例示性取代基包括但不限於-鹵素、側氧基、-OH、-CN、-COOH、-CH 2CN、-O-(C 1-C 6)烷基、(C 1-C 6)烷基、(C 1-C 6)烷氧基、(C 1-C 6)鹵代烷基、(C 1-C 6)鹵代烷氧基、-O-(C 2-C 6)烯基、-O-(C 2-C 6)炔基、(C 2-C 6)烯基、(C 2-C 6)炔基、-OP(O)(OH)2、-OC(O)(C 1-C 6)烷基、-C(O)(C 1-C 6)烷基、-OC(O)O(C 1-C 6)烷基、-NH2、-NH((C 1-C 6)烷基)、-N((C 1-C 6)烷基)2、-NHC(O)(C 1-C 6)烷基、-C(O)NH(C 1-C 6)烷基、-S(O)2(C 1-C 6)烷基、-S(O)NH(C 1-C 6)烷基及S(O)N((C 1-C 6)烷基) 2。
取代基本身視情況經取代。此外，當含有兩個稠合環時，芳基視情況具有與完全飽和環稠合之不飽和或部分飽和環。此等芳基之例示性環系統包括(但不限於)苯基、聯苯基、萘基、蒽基、丙烯合萘基、菲基、二氫茚基、茚基、四氫萘基、四氫苯并輪烯基及其類似基團。
鹵素或「鹵基」意謂氟、氯、溴或碘。
「烷基」意謂含有1-12個碳原子之直鏈或分支鏈飽和烴。(C 1-C 6)烷基之實例包括但不限於甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、異丙基、異丁基、二級丁基、三級丁基、異戊基、新戊基及異己基。
「烷氧基」意謂含有1-12個碳原子之直鏈或分支鏈飽和烴，鏈中含有末端「O」，例如-O(烷基)。烷氧基之實例包括但不限於甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、三級丁氧基或戊氧基。
「烯基」意謂含有2-12個碳原子之直鏈或分支鏈不飽和烴。「烯基」在鏈中含有至少一個雙鍵。烯基之雙鍵可與另一個不飽和基團非共軛或共軛。烯基之實例包括乙烯基、丙烯基、正丁烯基、異丁烯基、戊烯基或己烯基。烯基可未經取代或經取代且可為直鏈或分支鏈。
「炔基」意謂含有2-12個碳原子之直鏈或分支鏈不飽和烴。「炔基」在鏈中含有至少一個參鍵。炔基之實例包括乙炔基、炔丙基、正丁炔基、異丁炔基、戊炔基或己炔基。炔基可未經取代或經取代。
「環烷基」或「碳環基」意謂含有3-18個碳原子之單環或多環飽和碳環。環烷基之實例包括(但不限於)環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基、降𦯉烷基、降𦯉烯基、雙環[2.2.2]辛基或雙環[2.2.2]辛烯基及其衍生物。(C3-C8)環烷基係含有3至8個碳原子的環烷基。環烷基可為稠合(例如十氫萘)或橋聯(例如降𦯉烷)。
「鹵代烷基」意謂經一或多個鹵素取代之烷基。鹵代烷基之實例包括但不限於三氟甲基、二氟甲基、五氟乙基、三氯甲基等。
「鹵代烷氧基」意謂經一或多個鹵素取代之烷氧基。鹵代烷基之實例包括但不限於三氟甲氧基、二氟甲氧基、五氟乙氧基、三氯甲氧基等。
如本文所用的術語「醫藥學上可接受」係指生理學上可耐受的分子實體及組合物，且當投與人類時，其通常不會產生毒性或過敏或類似的不良反應，諸如胃部不適、頭暈及其類似反應。較佳地，如本文所用，術語「醫藥學上可接受」意謂經聯邦或州政府的管理機構批准或在美國藥典或其他普遍認可的藥典中列出的用於動物，更特定地用於人類。
如本文所用，「治療指數」係表述活性藥物治療效率的參數。舉例而言，當意味著需要高濃度的活性物質來達成治療功效或者當獲得功效所需的劑量會誘發毒性時，其係低的。相反，高治療指數意味著活性物質提供治療功效所需的劑量較低及/或當活性藥物的毒性較低時。 7.2.其他定則解釋
儘管與本文所述之彼等方法及材料相似或等效之方法及材料可用於方法及物質組合物的實踐或測試，但下文描述了合適的方法及材料。另外，材料、方法及實例僅為說明性的且並不意欲為限制性的。在此提及的所有出版物、專利申請案、專利及其他參考文獻均以全文引用的方式併入。
必須注意，如本文及所附申請專利範圍中所使用的，單數形式「一個(種) (a/an)」及「該」包括複數個提及物，除非上下文另有明確規定。因此，例如，提及「一抗體或抗原結合片段」包括複數個此類抗體及抗原結合片段，且提及「該重組腺相關病毒」包括提及一或多個重組腺相關病毒及熟習此項技術者已知的其等價物，等等。進一步應注意，申請專利範圍可經起草以排除任何視情況存在之要素。因此，此陳述旨在作為使用諸如「僅僅」、「僅」及其類似術語與敍述申請專利範圍要素或使用「否定」限制相關聯的排他性術語的前提基礎。
應瞭解，本發明之為清楚起見而在單獨實施例之上下文中描述的某些特徵亦可以組合形式提供於單一實施例中。相反，為簡潔起見而在單一實施例之上下文中所描繪的本發明之各種特徵亦可分開地或以任何適合子組合形式提供。具體言之，關於本發明之實施例之所有組合由本發明包涵且僅如同個別地及明確揭示各組合及每一組合一般揭示於本文中。另外，具體言之，各種實施例及其要素之所有子組合亦由本發明包涵且僅如同本文個別地及明確揭示各此類子組合及每一此類子組合一般揭示於本文中。
本文中論述之公開案僅僅提供在本申請案之申請日之前的揭示內容。提供的公開日期可能與實際公開日期不同，可能需要獨立確認。
在提供值範圍的情況下，應理解包括該範圍的所敍述端點。此外，除非上下文另有明確規定，否則該範圍的上限與下限之間以及該規定範圍內的任何其他規定值或中間值的每個中間值(一直到下限單位的十分之一)均包含在本發明中。此等較小範圍之上限及下限可獨立地包括於較小範圍內且亦涵蓋於本發明內，在所陳述範圍內受到任何特定排他性限制。當所陳述之範圍包括限度中之一者或兩者時，排除彼等所包括之限度中之任一者或兩者之範圍亦包括於本發明中。
本文所列舉之範圍應理解為範圍內所有值之簡寫，包括所敍述端點。舉例而言，1至50的範圍被理解為包括來自由以下組成之群的任何數字、數字組合或子範圍：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49及50，包括子範圍，諸如11至48或39至41。
如本文所用，術語「約」可允許值或範圍內的一定程度的可變性，例如在規定值或規定範圍的極限的10%以內。 7.3. 經表面修飾病毒衣殼
根據本發明，提供了經表面修飾病毒衣殼，其包含經由包含交聯部分Q的連接子與病毒衣殼蛋白共價綴合的配位體。亦提供了包含經表面修飾病毒衣殼的重組病毒粒子。
在一些實施例中，當與未經修飾重組病毒粒子相比時，所提供的經表面修飾病毒衣殼賦予其作為一部分所構成的重組病毒粒子以提高的轉導效率、提高的細胞類型選擇性或提高的轉導效率及提高的細胞類型選擇性兩者，該未經修飾重組病毒粒子例如包含具有相同一級胺基酸序列但未如本文所述被修飾以與配位體交聯的病毒衣殼。
根據本發明，提供了一種經表面官能化病毒衣殼，其包含交聯劑反應性成對的第一成員。亦提供了包含交聯劑反應性成對的第二成員的經官能化配位體，其中該交聯劑反應性成對的該第一成員與該第二成員反應形成交聯部分Q。經表面官能化病毒衣殼能夠與具有交聯劑反應性成對之互補成員的配位體交聯，亦即綴合。
在一些實施例中，組合物中的經表面修飾病毒衣殼包含x個綴合的配位體，其中x係組合物中每個衣殼綴合的配位體的平均數，在本文中亦稱為配位體/衣殼比率或LCR。在一些實施例中，x係1至500。在某些實施例中，x係1至300。在某些實施例中，x係100至200。在某些實施例中，x係110至190。在某些實施例中，x係130至170。在一些實施例中，x係1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295或300，或範圍由任何兩個前述數字定義。在某些實施例中，x係約135、約140、約145、約150、約155、約160、約165、約170、約175或約180。在某些實施例中，x係約55至約85。在某些實施例中，x係約140至約160。在某些實施例中，x係約135至約165。在某些實施例中，x係約130至約170。在某些實施例中，x係約150。在某些實施例中，x在上面提供的任何兩個數字之間的範圍內。
本發明亦提供了衣殼反應性連接子，其包含(i)能夠共價連接至病毒衣殼蛋白之衣殼反應性部分，及(ii)交聯劑反應性成對之成員。
在本發明之實施例中，根據本發明之經表面修飾病毒衣殼藉由以下步驟生產： i)藉由使病毒衣殼蛋白與衣殼反應性連接子反應獲得經表面官能化病毒衣殼，該連接子包含交聯劑反應性成對的第一成員及視情況選用之一或多個間隔子；以及 ii)將該經表面官能化病毒衣殼與經官能化配位體綴合，該經官能化配位體包含該交聯劑反應性成對的第二成員； 其中該交聯劑反應性成對的該第一成員與該第二成員反應形成交聯部分Q；及 iii)獲得該經表面修飾病毒衣殼。 7.3.1. 交聯劑反應性成對
為了實現配位體與病毒衣殼的共價綴合以產生經表面修飾病毒衣殼，重組病毒粒子被表面官能化以產生經表面官能化病毒衣殼蛋白，其接著與經官能化配位體反應。經表面官能化衣殼及經官能化配位體各自包含交聯劑反應性成對之成員。交聯劑反應性成對成員反應形成部分Q，該部分Q將病毒衣殼與配位體共價交聯。
在典型的實施例中，交聯劑反應性成對成員係生物正交的。如本文所用，術語生物正交化學係指可在生命系統內部發生而不干擾天然生化過程或可在活體外發生而不干擾反應產物的生化/生物活性的任何化學過程。已經開發了許多滿足生物正交性要求的化學綴合策略，包括疊氮化物與環辛炔之間(亦稱為無銅點擊化學)、硝酮與環辛炔之間的1,3-偶極環加成；由醛及酮形成肟/腙；四𠯤連接，例如，s-四𠯤及反式環辛烯衍生物的環加成或基於異腈的點擊反應；以及最近的四環烷連接。 7.3.1.1 CuAAC
在某些實施例中，交聯劑反應性成對選自參與Cu(I)催化之疊氮化物-炔烴環加成(CuAAC)的化學部分。在某些實施例中，交聯劑反應性成對包含疊氮化物及炔烴。本文亦考慮了保留所需化學反應性之此等部分的衍生物。在某些實施例中，交聯部分Q包含5員雜原子環。在某些實施例中，交聯部分Q包含1,4***。 7.3.1.2 SPAAC 及 SPANC
與CuAAC不同的是，無Cu點擊化學已經藉由消除細胞毒性銅催化劑被修改成生物正交的，從而使反應快速進行並且沒有活細胞毒性。該反應並非銅促進，而是應變促進之炔烴-疊氮化物環加成(SPAAC)。無銅點擊化學已被改編為使用硝酮作為1,3-偶極子而並非疊氮化物，並已用於肽的修飾。
在某些實施例中，交聯劑反應性成對選自參與應變促進之炔烴-硝酮環加成(SPANC)的化學部分。在某些實施例中，交聯劑反應性成對包含疊氮化物及硝酮。本文亦考慮了保留所需化學反應性之此等部分的衍生物。在某些實施例中，交聯部分Q包含異㗁唑啉。
在一些實施例中，交聯劑反應性成對係疊氮化物及硝酮，如下所示，其中R基團代表與衣殼反應性連接子或經官能化配位體的連接點。本文亦考慮了保留所需化學反應性之此等部分的衍生物。舉例而言，硝酮偶極子的碳及氮原子兩者上的取代以及無環及內環硝酮均可以被容忍。
Figure 02_image017
在一些實施例中，交聯劑反應性成對包含環辛炔類似物。在某些實施例中，交聯劑反應性成對包含環辛炔類似物，例如以下說明之彼等，其中R基團代表與衣殼反應性連接子或經官能化配位體的連接點。本文亦考慮了保留所需化學反應性之此等部分的衍生物。
Figure 02_image019
在某些實施例中，交聯劑反應性成對包含選自二苄基環辛炔(DIBO)、二苯并氮雜環辛炔(DIBAC或DBCO)及聯芳氮雜環辛炔酮(BARAC)之群的二苄基環辛炔類似物。本文亦考慮了保留所需化學反應性之此等部分的衍生物。
在某些實施例中，交聯劑反應性成對包含根據以下結構的硝酮，其中R1基團代表與衣殼反應性連接子或經官能化配位體的連接點。R2及R3沒有特定限制。在一些實施例中，R2及R3獨立地選自氫及C1-C4烷基，諸如甲基、乙基、丙基及丁基。本文亦考慮了保留所需化學反應性之此等部分的衍生物。
Figure 02_image021
在某些實施例中，交聯劑反應性成對包含如上所確定的二苄基環辛炔類似物及1,3-硝酮或疊氮化物。在某些實施例中，交聯劑反應性成對包含二苄基環辛炔(或其類似物)及1,3-硝酮或疊氮化物，如下所示，其中R 1基團代表與病毒衣殼或衣殼反應性連接子的連接點，且其中疊氮化物或硝酮上的R 2基團代表與經官能化配位體的連接點。在替代實施例中，交聯劑反應性成對包含二苄基環辛炔(或其類似物)及1,3-硝酮或疊氮化物，如下所示，其中R 1基團代表與配位體的連接點，且其中疊氮化物或硝酮上的R 2基團代表與經表面官能化病毒衣殼或衣殼反應性連接子的連接點。
Figure 02_image023
在某些實施例中，交聯部分Q包含根據以下說明的任一者的環狀部分，其中R 1及R 2代表與病毒衣殼的連接點。R 3及R 4可以係H或本文所述的任何取代基，條件係經取代的衍生物保持期望的化學反應性亦係本文所考慮的。
Figure 02_image025
7.3.1.3 IEDDA
在某些實施例中，交聯劑反應性成對包含參與逆電子需求狄耳士-阿德爾(IEDDA)反應的化學部分。在某些實施例中，交聯劑反應性成對包含貧電子二烯及富電子親二烯體。此類基團之實例係此項技術中已知的並且在別處有描述，例如F. Thalhammer等人, Tetrahedron Lett., 1990, 31, 6851-6854及B. L. Oliveira, Chem. Soc. Rev., 2017, 46, 4895-4950。在一些實施例中，貧電子二烯具有在二烯上取代的拉電子基團，如下文所例示。在一些實施例中，富電子親二烯體具有在親二烯體上取代的推電子基團，如下文所例示。
Figure 02_image027
在某些實施例中，交聯劑反應性成對包含參與狄耳士-阿德爾[4+2]-環加成的化學部分，二烯及親二烯體之間的反應經由二烯的4π電子與親二烯體的2π電子的表面/表面相互作用以π4 + π2方式形成六員環。與其中富電子二烯與貧電子親二烯體反應的正常電子需求狄耳士-阿德爾反應相反，在逆電子需求狄耳士-阿德爾反應(IEDDA)中，富電子親二烯體與貧電子二烯反應。炔烴親二烯體在反應後直接產生對應的嗒𠯤。
在某些實施例中，交聯劑反應性成對包含三𠯤(例如，1、2、4三𠯤)、四𠯤(Tz) (例如，1,2,4,5-四𠯤，亦稱為s-四𠯤)或應變的親二烯體，諸如降𦯉烯、反式環辛烯(TCO)、環丙烯或N-醯基氮雜環丁烯。在某些實施例中，交聯劑反應性成對包含下面例示的部分，其中R基團代表與本發明之衣殼反應性連接子、經表面官能化病毒衣殼或經官能化配位體的連接點。本文亦考慮了保留所需化學反應性之此等部分的衍生物。在某些實施例中，交聯劑反應性成對包含TCO及四𠯤。
Figure 02_image029
7.3.1.1 史陶丁格連接
在某些實施例中，交聯劑反應性成對選自參與史陶丁格反應的化學部分，諸如能夠反應產生亞胺基磷烷的疊氮化物、膦(PPh 2)或亞磷酸酯。
在某些實施例中，交聯劑反應性部分係三苯基膦，諸如如下所示的三苯基膦，其中R基團代表與本發明之衣殼反應性連接子的連接點。本文亦考慮了保留所需化學反應性的此部分的衍生物。
Figure 02_image031
7.3.1.2 [4+1] 環加成
在某些實施例中，交聯劑反應性成對選自參與[4+1]環加成及隨後的N 2之逆狄耳士-阿德爾消除的化學部分，例如異氰化物或1,2,4,5,四𠯤。
在一些實施例中，交聯劑反應性部分係如下所示的異氰化物，其中R基團代表連接點，例如與衣殼反應性連接子的連接點。在一些實施例中，交聯劑反應性部分係如下所示的1,2,4,5,四𠯤，其中R1或R2基團代表連接點，例如與配位體的連接點。本文亦考慮了保留所需化學反應性之此等部分的衍生物。
Figure 02_image033
7.3.1.1 標籤反應
在某些實施例中，交聯劑反應性部分係此項技術中已知的生物正交標籤，諸如SNAP-標籤、CLIP標籤、Halo-標籤或LUMIO-標籤或與此等標籤反應的化學基團，例如苄基鳥嘌呤基團、苄基胞嘧啶基團或氯代烷烴基團。在某些實施例中，交聯劑反應性部分之一個成員包含SNAP-標籤並且交聯劑反應性部分之另一個成員包含苄基鳥嘌呤基團。 7.3.2. 交聯部分 -Q
在本發明之一態樣中， 經表面修飾病毒衣殼包含部分Q，亦即藉由如本文所述的 交聯劑反應性成對之間的反應所形成的部分。
在某些實施例中，Q包含CuAAC反應之產物。在某些實施例中，Q包含SPAAC反應之產物。在某些實施例中，Q係SPANC反應之產物。在某些實施例中，Q包含IEEDD反應之產物。在某些實施例中，Q包含史陶丁格連接之產物。在某些實施例中，Q包含[4+1]環加成反應之產物。在一些實施例中，Q包含應變促進反應，例如SPAAC、SPANC及IEEDD之產物。
在某些實施例中，Q包含環狀部分。在某些實施例中，Q包含雙環部分。在某些實施例中，Q包含三環部分。在某些實施例中，Q包含包括0至3個選自O、S或N之雜原子的5-8員碳環。在某些實施例中，Q包含包括0至1個選自O及N之雜原子的八員環。在某些實施例中，Q包括包含0至3個選自O及N之雜原子的五員環。在某些實施例中，Q係***環。在某些實施例中，Q包含包括0-3個選自O及N之雜原子的六員環。在某些實施例中，Q包含包括2個N雜原子的六員環。
在一些實施例中，其中Q包含環狀部分，Q根據以下結構，其中Z係包含0-3個選自O或N之雜原子的7或8員碳環。
Figure 02_image035
在一些實施例中，Q包含以下結構：
Figure 02_image037
7.3.3. 經表面官能化病毒衣殼
在本發明之一態樣中，提供了經表面官能化病毒衣殼，其中病毒衣殼的表面 被官能化以包含交聯劑反應性成對之成員。在一些實施例中，病毒衣殼蛋白藉由 與衣殼反應性連接子的反應而被官能化。在一些實施例中，病毒衣殼的表面包含包括交聯劑反應性部分的 非天然胺基酸。在一些實施例中，病毒衣殼包含 融合蛋白，該融合蛋白包含在至少一種衣殼蛋白之一級序列中的 生物正交標籤。
在本發明之實施例中，提供了經表面官能化病毒衣殼，其中病毒衣殼的表面藉由與衣殼反應性連接子反應而被官能化。在一些實施例中，經表面官能化病毒衣殼包含y個衣殼反應性連接子基團，其中y係連接至每個病毒衣殼的衣殼反應性連接子的數目。
在本發明之一些實施例中，提供了包含經表面官能化病毒衣殼的組合物，其中Y係連接至每個衣殼的衣殼反應性連接子的平均數。 7.3.3.1 衣殼反應性連接子
根據本發明，衣殼反應性連接子包含i)可用於與衣殼表面形成共價連接的衣殼表面反應性部分，以及ii)交聯劑反應性成對的一個成員，其經選擇與在本發明之配位體上官能化的交聯劑反應性成對之另一成員相互反應。 7.3.3.1.1 間隔子
衣殼反應性連接子視情況進一步包含一或多個間隔子部分。間隔子部分沒有特定限制並且可以係此項技術中已知的任何間隔子。在一些實施例中，間隔子包含一或多個乙二醇單體，亦即聚乙二醇、-(O-CH 2-CH 2)n-或[PEG]n，對於「離散聚乙二醇」亦稱為「dPEG n」，其中「n」係環氧乙烷(或「乙二醇」)單元的數目。在某些實施例中，n為0。在某些實施例中，n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、75、100。 7.3.3.1.2 衣殼表面反應性部分
根據本發明，衣殼表面反應性部分沒有特定限制並且包括能夠共價連接至所需衣殼表面的任何部分。
在一些實施例中，衣殼表面反應性部分使用殘基特異性蛋白質標記中的已知技術共價連接至衣殼蛋白一級序列中暴露於表面的胺基酸殘基。
在一些實施例中，胺基酸殘基存在於野生型衣殼蛋白中。在其他實施例中，胺基酸殘基被工程化至衣殼之一級胺基酸序列中。 i. 衣殼表面一級胺
在一些實施例中，衣殼表面反應性部分包含與一級胺(-NH 2)反應的化學基團。一級胺存在於每個衣殼蛋白的N端及衣殼蛋白序列中離胺酸(Lys，K)胺基酸殘基的側鏈中。與一級胺反應的例示性化學基團包括異硫氰酸酯、異氰酸酯、醯基疊氮化物、NHS酯、磺醯氯、醛、乙二醛、環氧化物、環氧乙烷、碳酸酯、芳基鹵化物、醯亞胺酯、碳二亞胺、酸酐及氟苯基酯。大多數此等綴合物藉由醯化或烷基化與胺綴合。在一些實施例中，衣殼表面反應性部分包含NHS酯或醯亞胺酯，例如以下所示之彼等，其中R基團代表與衣殼反應性連接子的連接點。
Figure 02_image039
在一些實施例中，衣殼表面反應性部分共價連接至衣殼蛋白一級序列的暴露於表面的離胺酸殘基。在某些此等實施例中，衣殼表面反應性部分包含如下所示的NHS-酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯或苄基氟，其中R基團代表與衣殼反應性連接子的連接點，且
Figure 02_image041
符號代表衣殼蛋白序列中離胺酸殘基的連接點。
Figure 02_image043
在一些實施例中，衣殼反應性連接子包含N-羥基丁二醯亞胺酯(NHS酯)。NHS酯係由羧酸酯分子的碳二亞胺活化形成的反應性基團。NHS酯活化的衣殼反應性連接子在生理至弱鹼性條件(pH 7.2至9)中與一級胺反應，產生穩定的醯胺鍵。該反應釋放N-羥基丁二醯亞胺(NHS)。
在一些實施例中，衣殼反應性連接子包含四氟苯基(TFP)酯。TFP酯係由羧酸酯分子的碳二亞胺活化形成的反應性基團。羧酸的TFP酯以與NHS酯相同的速率與一級胺反應，形成共價醯胺鍵，該共價醯胺鍵與一級胺及NHS酯之間的反應形成的共價醯胺鍵相同。 ii. 衣殼表面巰基
在一些實施例中，衣殼表面反應性部分共價連接至暴露於表面的巰基。在一些實施例中，衣殼表面反應性部分共價連接至衣殼蛋白一級序列的暴露於表面的半胱胺酸殘基。
在某些此等實施例中，衣殼表面反應性部分包含如下例示的順丁烯二醯亞胺、碘乙醯胺、2-硫代吡啶或3-芳基丙腈，其中R基團代表與衣殼反應性連接子的連接點，且
Figure 02_image041
符號代表衣殼蛋白序列中離胺酸殘基的連接點。
Figure 02_image046
在一些實施例中，衣殼反應性連接子包含順丁烯二醯亞胺。順丁烯二醯亞胺及其衍生物係由順丁烯二酸酐藉由用胺處理接著脫水製備的。當反應混合物的pH值在6.5與7.5之間時，順丁烯二醯亞胺基團與巰基發生特異性反應；結果係形成不可逆的穩定硫醚鍵。 iii.非天然胺基酸
在一些實施例中，病毒衣殼的表面包含一或多種具有包含交聯劑反應性部分的非天然胺基酸之蛋白質。
在某些實施例中，非天然胺基酸選自：1：3-(6-乙醯萘-2-基胺基)-2-胺基丙酸(Anap)，2：(S)-1-羧基-3-(7-羥基-2-側氧基-2H-𠳭烯-4-基)丙-1-胺鎓(CouAA)，3：3-(5-(二甲基胺基)萘-1-磺醯胺)丙酸(丹磺醯基丙胺酸)，4： N ɛ-對疊氮苄氧羰基離胺酸(PABK)，5：炔丙基-L-離胺酸(PrK)，6： N ɛ-(1-甲基環丙-2-烯甲醯胺基)離胺酸(CpK)，7： N ɛ-丙烯醯離胺酸(AcrK)，8： N ɛ-(環辛-2-炔-1-基氧基)羰基)L-離胺酸(CoK)，9：雙環[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇離胺酸(BCNK)，10：反式-環辛-2-烯離胺酸(2'-TCOK)，11：反式-環辛-4-烯離胺酸(4'-TCOK)，12：二側氧基-TCO離胺酸(DOTCOK)，13：3-(2-環丁烯-1-基)丙酸(CbK)，14： N ɛ-5-降𦯉烯-2-基氧基羰基-L-離胺酸(NBOK)，15：環辛炔離胺酸(SCOK)，16：5-降𦯉烯-2-醇酪胺酸(NOR)，17：環辛-2-炔醇酪胺酸(COY)，18：(E)-2-(環辛-4-烯-1-基氧基)乙醇酪胺酸(DS1/2)，19：疊氮高丙胺酸(AHA)，20：高丙炔基甘胺酸(HPG)，21：疊氮基白胺酸(ANL)，及22： N ɛ-2-疊氮乙氧羰基-L-離胺酸(NEAK)，如下所示。
Figure 02_image048
7.3.4. 經官能化配位體
在本發明之一態樣中，提供了一種經官能化配位體，其中該配位體被官能化以包含交聯劑反應性成對之成員。在一些實施例中，配位體藉由與配位體反應性連接子反應而被官能化。在一些實施例中，配位體係多肽，並且多肽被突變以包括包含交聯劑反應性部分的非天然胺基酸。在一些實施例中，配位體係在配位體之一級序列中包含生物正交標籤的融合蛋白。 7.3.4.1 配位體反應性連接子
根據本發明，配位體反應性連接子包含i)可用於與配位體表面形成共價連接的配位體反應性部分，以及ii)可用於與本發明之經表面官能化病毒衣殼進行生物正交綴合的交聯劑反應性成對之成員。 7.3.4.1.1 間隔子
配位體反應性連接子視情況進一步包含至少一個間隔子部分。間隔子部分沒有特定限制並且可以係此項技術中已知的任何間隔子。在一些實施例中，間隔子包括乙二醇單體，亦即聚乙二醇、-(O-CH 2-CH 2)n-或[PEG]n，對於「離散聚乙二醇」亦稱為「dPEG n」，其中「n」係環氧乙烷(或「乙二醇」)單元的數目。在某些實施例中，n為0。在某些實施例中，n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、75、100。在某些實施例中，n係4。 7.3.4.1.2 配位體反應性部分
根據本發明，配位體反應性部分沒有特定限制並且包括能夠共價連接至所需配位體的任何部分。
在配位體係肽、寡肽或多肽之一些實施例中，配位體反應性部分使用殘基特異性蛋白質標記中的已知技術連接至配位體蛋白質一級序列中的胺基酸殘基。
在一些實施例中，胺基酸殘基存在於野生型配位體蛋白中。在其他實施例中，胺基酸殘基被工程化至配位體之一級胺基酸序列中。 i. 配位體一級胺
在一些實施例中，配位體反應性部分包含與一級胺(-NH 2)反應的化學基團。在配位體係多肽的實施例中，一級胺存在於每個配位體蛋白的N端及配位體蛋白序列中離胺酸(Lys，K)胺基酸殘基的側鏈中。與一級胺反應的例示性化學基團包括異硫氰酸酯、異氰酸酯、醯基疊氮化物、NHS酯、磺醯氯、醛、乙二醛、環氧化物、環氧乙烷、碳酸酯、芳基鹵化物、醯亞胺酯、碳二亞胺、酸酐及氟苯基酯。大多數此等化學基團藉由醯化或烷基化與胺綴合。在一些實施例中，衣殼表面反應性部分包含NHS酯或醯亞胺酯，例如以下所示之彼等，其中R基團代表與配位體反應性連接子的連接點。
Figure 02_image050
在配位體係多肽之一些實施例中，配位體反應性部分共價連接至配位體蛋白一級序列的暴露於表面的離胺酸殘基。在某些此等實施例中，配位體表面反應性部分包含如下所示的NHS-酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯或苄基氟，其中R基團代表與配位體反應性連接子的連接點，且
Figure 02_image041
符號代表配位體蛋白序列中離胺酸殘基的連接點。
Figure 02_image053
在一些實施例中，配位體反應性連接子包含N-羥基丁二醯亞胺酯(NHS酯)。NHS酯係由羧酸酯分子的碳二亞胺活化形成的反應性基團。NHS酯活化的配位體反應性連接子在生理至弱鹼性條件(pH 7.2至9)中與一級胺反應，產生穩定的醯胺鍵。該反應釋放N-羥基丁二醯亞胺(NHS)。 ii. 配位體巰基
在一些實施例中，配位體反應性部分共價連接至暴露於表面的巰基。在配位體係多肽之一些實施例中，配位體反應性部分共價連接至配位體蛋白一級序列的半胱胺酸殘基。
在某些此等實施例中，配位體反應性部分包含如下例示的順丁烯二醯亞胺、碘乙醯胺、2-硫代吡啶或3-芳基丙腈，其中R基團代表與配位體反應性連接子的連接點，且
Figure 02_image041
符號代表配位體蛋白序列中離胺酸殘基的連接點。
Figure 02_image056
在一些實施例中，配位體反應性連接子包含順丁烯二醯亞胺。順丁烯二醯亞胺及其衍生物係由順丁烯二酸酐藉由用胺處理接著脫水製備的。當反應混合物的pH值在6.5與7.5之間時，順丁烯二醯亞胺基團與巰基發生特異性反應；結果係形成不可逆的穩定硫醚鍵。 iii.非天然胺基酸
在一些實施例中，配位體係已經突變以包括包含交聯劑反應性部分的非天然胺基酸的多肽。
在某些實施例中，配位體多肽經突變以包含一或多個選自以下的非天然胺基酸：1：3-(6-乙醯萘-2-基胺基)-2-胺基丙酸(Anap)，2：(S)-1-羧基-3-(7-羥基-2-側氧基-2H-𠳭烯-4-基)丙-1-胺鎓(CouAA)，3：3-(5-(二甲基胺基)萘-1-磺醯胺)丙酸(丹磺醯基丙胺酸)，4： N ɛ-對疊氮苄氧羰基離胺酸(PABK)，5：炔丙基-L-離胺酸(PrK)，6： N ɛ-(1-甲基環丙-2-烯甲醯胺基)離胺酸(CpK)，7： N ɛ-丙烯醯離胺酸(AcrK)，8： N ɛ-(環辛-2-炔-1-基氧基)羰基)L-離胺酸(CoK)，9：雙環[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇離胺酸(BCNK)，10：反式-環辛-2-烯離胺酸(2'-TCOK)，11：反式-環辛-4-烯離胺酸(4'-TCOK)，12：二側氧基-TCO離胺酸(DOTCOK)，13：3-(2-環丁烯-1-基)丙酸(CbK)，14： N ɛ-5-降𦯉烯-2-基氧基羰基-L-離胺酸(NBOK)，15：環辛炔離胺酸(SCOK)，16：5-降𦯉烯-2-醇酪胺酸(NOR)，17：環辛-2-炔醇酪胺酸(COY)，18：(E)-2-(環辛-4-烯-1-基氧基)乙醇酪胺酸(DS1/2)，19：疊氮高丙胺酸(AHA)，20：高丙炔基甘胺酸(HPG)，21：疊氮基白胺酸(ANL)，22： N ɛ-2-疊氮乙氧羰基-L-離胺酸(NEAK)。
Figure 02_image058
iv.具有標籤反應性分子的融合蛋白
在本發明之實施例中，配位體係融合蛋白，其包含能夠以高親和力與其對應的對應物結合的標籤，諸如SNAP-標籤、CLIP-標籤、Halo標籤、Lumio標籤以及此項技術中已知的其他標籤。
苄基鳥嘌呤、苄基胞嘧啶及氯代烷烴被「自殺」酶識別，諸如SNAP。在本發明之上下文中，苄基鳥嘌呤或苄基胞嘧啶可視情況經取代以形成苄基鳥嘌呤或苄基胞嘧啶的衍生物。苄基鳥嘌呤衍生物或苄基胞嘧啶衍生物應理解為意謂苄基鳥嘌呤或苄基胞嘧啶基團，其經過修飾但仍會被自殺酶識別。
標籤分子可以係能夠與另一分子特異性結合的任何分子或生物分子。此等實例可以包括SNAP-標籤、CLIP-標籤、Lumio-標籤或Halo-標籤。舉例而言，親和標籤可以係SNAP-標籤，亦即烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶的突變體。重要的是，SNAP-標籤的受質之一係苄基鳥嘌呤。可用於本發明之市售產品包括例如來自Promega的Halo標籤、來自Life Technologies的Lumio標籤及來自NEB的SNAP/CLIP標籤。
自標記蛋白質標籤可在各種表現載體中市售獲得。SNAP-標籤係一種182個殘基的多肽(19.4 kDa)，可以與任何相關蛋白質融合，並進一步用合適的配位體(諸如螢光染料)特異性地且共價地加標籤。SNAP-標籤蛋白質係普遍存在的哺乳動物酶AGT的工程化版本，在人類中由O-6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(MGMT)基因編碼。SNAP-標籤係使用定向進化策略獲得的，導致hAGT變異體接受O6-苄基鳥嘌呤衍生物，而並非修復受損DNA中的烷基化鳥嘌呤衍生物。
CLIP-標籤係自SNAP-標籤進一步工程化而來的，接受O2-苄基胞嘧啶衍生物而非O6-苄基鳥嘌呤作為受質。後來開發了適用於蛋白質互補分析及蛋白質-蛋白質相互作用研究的分離的SNAP-標籤版本。
Halo標籤係一種自標記蛋白質標籤。其係一種衍生自細菌酶的297個殘基的肽(33 kDa)，旨在與合成配位體共價結合。Halo標籤係一種水解酶，具有經基因修飾的活性位點，可特異性結合反應性氯代烷烴連接子並提高配位體結合率。由於連接子部分的末端氯，在生理條件下，在蛋白質標籤與氯代烷烴連接子之間形成鍵的反應係快速且基本上不可逆的。在上述反應中，氯代烷烴反應性連接子的親核攻擊導致鹵素被胺基酸殘基置換，此導致共價烷基酶中間體的形成。接著，此中間體將被野生型水解酶內的胺基酸殘基水解。此將導致在反應之後酶的再生。然而，在經修飾鹵代烷脫鹵酶(Halo標籤)中，由於酶的突變，反應中間體不能進行後續反應，因為其不能被水解。此使得中間體作為穩定的共價加合物持續存在，沒有相關的逆反應。
使用此系統有兩個步驟：將相關蛋白質選殖及表現為SNAP-tag®融合體，以及使用所選的SNAP-標籤受質標記該融合體。SNAP-標籤係一種基於人類O6-烷基鳥嘌呤-DNA-烷基轉移酶(hAGT) (一種DNA修復蛋白)的小蛋白。在此種情況下，SNAP-標籤受質係連接至苄基連接子的鳥嘌呤離去基團。在標記反應中，受質的經取代苄基與SNAP-標籤共價連接。
SNAP-標籤蛋白質標記系統能夠使幾乎任何分子與相關蛋白質進行特異性共價連接。 7.3.5. 反應性連接子之實例
根據本發明之各種實施例，以下反應性連接子適合用作衣殼反應性連接子或配位體反應性連接子。 7.3.5.1.1 TCO-PEG4-NHS
Figure 02_image060
同義詞：反式-環辛烯-PEG4-NHS；經驗式(希爾記法(Hill Notation))：C24H38N2O10；分子量：514.57。 7.3.5.1.2 四 𠯤 -PEG5-NHS
Figure 02_image062
四𠯤-PEG5-NHS酯係一種胺反應性連接子，通常用於用四𠯤部分對蛋白質、肽或胺修飾寡核苷酸進行修飾。 7.3.5.1.3 疊氮基 -PEG4-NHS
Figure 02_image064
在本文中亦稱為「疊氮化物-PEG4-NHS」。 7.3.5.1.4 膦 -NHS
Figure 02_image066
分子量：461.40。 7.3.5.1.5 DBCO-PEG12-TFP 酯
Figure 02_image068
7.3.5.1.6 順丁烯二醯亞胺 -PEG8- 丁二醯亞胺酯
Figure 02_image070
順丁烯二醯亞胺PEG8丁二醯亞胺酯，31-(2,5-二氫-2,5-二側氧基-1H-吡咯-1-基)-29-側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷酸2,5-二側氧基-1-吡咯啶酯，順丁烯二醯亞胺-PEG8-NHS酯，31-(2,5-二氫-2,5-二側氧基-1H-吡咯-1-基)-29-側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷酸2,5-二側氧基-1-吡咯啶酯，順丁烯二醯亞胺-PEG8-NHS酯。 7.3.1. 式 I 的經表面修飾病毒衣殼
在某些實施例中，經表面修飾病毒衣殼係根據式I
Figure 02_image072
其中：
Figure 02_image074
係病毒衣殼； Y係連接部分； Y'係連接部分； Q係交聯部分； PEG係乙二醇的單體； n及n'獨立地係0至100的整數， Sp及Sp'獨立地係視情況選用之間隔子； L係配位體；且 x係1至300、100至200、120至180或約150的整數。
在某些實施例中，連接部分Y藉由衣殼反應性部分及衣殼蛋白之間的反應形成。在某些實施例中，連接部分Y藉由NHS酯與衣殼蛋白的胺基酸之一級胺基之間的反應形成。在一些實施例中，胺基係衣殼蛋白之一級序列中存在的離胺酸的側鏈。在一些實施例中，胺基係存在於AAV衣殼蛋白的野生型一級序列中的離胺酸。
在某些實施例中，連接部分Y'係藉由配位體反應性部分及配位體之間的反應形成的。在某些實施例中，連接部分Y'係藉由NHS酯及配位體的胺基之間的反應形成的。
在某些實施例中，Q係藉由交聯劑反應性成對之成員之間的反應形成之產物。在某些實施例中，Q係藉由DBCO及疊氮基反應形成的交聯部分。
在某些實施例中，Q係選自：
Figure 02_image076
其中，Z為7或8員環狀或雜環結構。
在某些實施例中，經表面修飾病毒衣殼根據式I-1：
Figure 02_image078
其中：
Figure 02_image010
係病毒衣殼； n及n'獨立地係選自0至30的整數； L係配位體；且 x係50至250之間的整數。
在某些實施例中，n為選自0至100的整數。在某些實施例中，n獨立地選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、75及100。
在某些實施例中，n'係選自0至100的整數。在某些實施例中，n'選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、75及100。 7.3.2. 配位體
用於本發明之配位體沒有特定限制，只要該配位體能夠如本文所述與病毒衣殼表面綴合即可。在一些實施例中，配位體選自具有位於哺乳動物細胞表面的同源物諸如受體之蛋白質配位體。在一些此等實施例中，同源蛋白參與經表面修飾病毒衣殼的轉導。
在一些實施例中，配位體係細胞類型特異性配位體。在某些實施例中，配位體選自多肽、蛋白質、單醣或多醣、類固醇激素、RGD基序肽、維生素、小分子或靶向肽。亦考慮的係抗體(例如，單鏈)及奈米抗體；酶，諸如蛋白酶、糖苷酶、脂肪酶、肽酶；免疫球蛋白，諸如CD47 (不要吃我的信號)；IgG蛋白酶，諸如IdeZ及IdeS；用於疫苗接種之蛋白質類及小分子佐劑。
根據一個實施例，細胞類型特異性配位體衍生自蛋白質，諸如轉鐵蛋白、表皮生長因子EGF、鹼性纖維母細胞生長因子bFGF。
根據一個實施例，細胞類型特異性配位體衍生自單醣或多醣，諸如半乳糖、N-乙醯半乳胺糖及甘露糖。
根據一個實施例，細胞類型特異性配位體衍生自維生素，諸如葉酸。
根據一個實施例，細胞類型特異性配位體衍生自小分子，包括萘普生(naproxen)、布洛芬(ibuprofen)或其他已知之蛋白質結合分子。
在某些實施例中，配位體選自蛋白質配位體，諸如生長因子或細胞介素；毒素次單元，諸如霍亂毒素B次單元；凝集素，諸如同工凝集素B4或小麥胚芽凝集素；黏著因子，諸如乳黏素；抗體或其單鏈可變片段，諸如抗CD-34抗體；更具體地，大腸桿菌重組scFv CD-34抗體片段；肽，諸如新皮啡肽(deltorphin)類鴉片受體配位體；及基因編輯核酸酶，諸如Cas9。 7.3.3. 病毒衣殼
在本發明之實施例中，病毒衣殼沒有特定限制。在一些實施例中，病毒衣殼選自無包膜病毒，諸如腺病毒或腺相關病毒。在一些實施例中，病毒衣殼選自包膜病毒，諸如逆轉錄病毒、慢病毒、單純疱疹病毒及桿狀病毒。實施例包括非天然存在之衣殼，並且包括並非一級胺基酸序列的變化或除了一級胺基酸序列的變化之外的天然存在之衣殼蛋白的生物或化學改變或變異。 7.3.3.1 AAV
所有重組腺相關病毒(rAAV或AAV在本文可互換使用)均可以在本發明之框架內實施。此類AAV顆粒能夠在哺乳動物活體內轉導範圍廣泛的有絲***後細胞，例如(包括但不限於)肌肉細胞、肝細胞及神經元。
在一些實施例中，AAV衣殼包含天然存在之AAV血清型的VP1、VP2及/或VP3衣殼蛋白。在一些實施例中，AAV包含一或多種非天然存在之VP1、VP2及/或VP3衣殼蛋白。在某些此等實施例中，非天然存在之VP1、VP2或VP3衣殼蛋白與天然存在之衣殼在一級胺基酸序列上不同。在某些實施例中，非天然存在之衣殼包括並非一級胺基酸序列的變化或除了一級胺基酸序列的變化之外的天然存在之AAV衣殼蛋白的生物或化學改變或變異。
在各種實施例中，衣殼蛋白係AAV1、AAV2、AAV3B、AAV5、AAV6、AAV8或AAV9天然存在之AAV血清型之彼等。在各種實施例中，衣殼蛋白選自PCT/US2014/060163、USP9695220、PCT/US2016/044819、PCT/US2018/032166、PCT/US2019/031851及PCT/US2019/047546中揭示的衣殼蛋白，該等專利以全文引用的方式併入本文中。
腺相關病毒衣殼可以自所有鑑別的天然血清型中選擇，且特定而言為AAV2、AAV3b、AAV5、AAV8、AAV9及AAV10，且甚至可以更特定而言為AAV2。
此外，腺相關病毒可以自藉由非天然方法產生的合成血清型中選擇，諸如但不限於：衣殼誘變、衣殼序列中的肽***或缺失、來自各種血清型的衣殼混排或祖先重建。
用於本發明之AAV衣殼藉由此項技術中已知的任何方法生產，但不限於此。舉例而言，AAV衣殼可以藉由多種方法生產，包括：HEK293細胞的短暫轉染、感染Ad或HSV的穩定細胞株、感染Ad或HSV的哺乳動物細胞(表現rep-cap及轉殖基因)或感染桿狀病毒載體的昆蟲細胞(表現rep-cap及轉殖基因)。藉由任何此等方法產生的AAV衣殼可用於產生本文所述的經表面官能化及經表面修飾病毒衣殼。在某些實施例中，載體係藉由用磷酸鈣-HeBS方法用兩種質體短暫轉染HEK293細胞產生的：pHelper、編碼AAV Rep2-Cap2之PDP2-KANA及腺病毒輔助基因(E2A、VA RNA及E4)及pVector ss-CAG-eGFP，如所提供的實例中所示。
在一些實施例中，根據需要，本發明之AAV衣殼包含來自病毒外來源的一或多個序列。
在一些實施例中，AAV的衣殼由三個重疊的衣殼蛋白(VP1、VP2、VP3)構成，含有獨特的VP1 N端、VP1/VP2共同部分及VP1、VP2及VP3共有的部分。
在某些實施例中，一或多種衣殼蛋白包含天然存在之胺基，亦即一級序列對應於野生型衣殼蛋白。在替代實施例中，一或多個衣殼蛋白之一級序列包含被工程化至野生型衣殼蛋白序列中的胺基酸。在某些此等實施例中，工程化胺基酸包括一或多個存在於衣殼表面的胺基，並且參與一或多種衣殼蛋白的表面官能化。在某些實施例中，參與衣殼表面官能化的天然存在之或工程化之胺基選自離胺酸、精胺酸及半胱胺酸。在特定實施例中，胺基酸係離胺酸。
根據一特定實施例，AAV衣殼包含一或多種來自天然存在之血清型的野生型衣殼蛋白。
根據另一特定實施例，AAV衣殼包含經遺傳修飾衣殼蛋白。在某些實施例中，經遺傳修飾衣殼蛋白係經工程化以包含一或多種遺傳修飾(突變、***或缺失)的天然存在之血清型。在一替代實施例中，rAAV衣殼由一或多種合成衣殼蛋白構成。在特定實施例中，AAV衣殼被工程化以改變天然向性，例如，以減少肝素結合。
在本發明之框架內，合成衣殼包括來自天然、遺傳修飾及人工創造(隨機突變、序列混排、計算機設計等)血清型的衣殼蛋白的任何組合，該等蛋白能夠組裝及產生自然界中不存在的新的AAV病毒衣殼。
目前，已鑑別出超過100種AAV血清型，其衣殼蛋白與可轉導不同細胞類型的特定細胞表面受體的結合能力不同。AAV2係第一個選殖至細菌質體中的血清型，此後一直被用作鑑別其他血清型的比較物。已全面測試了十二種血清型(AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及AAV12)轉導特定細胞類型及區分結合特定細胞表面受體的衣殼蛋白基序之間進行細胞連接的能力。在本發明之上下文中，AAV衣殼選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12係較佳的。然而，應當理解，在本發明之上下文中可以使用任何其他AAV衣殼。
在一個實施例中，本發明之腺相關病毒(AAV)顆粒選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及AAV12。迄今為止最常用的基因轉移系統係病毒的衍生物，例如腺相關病毒2型(AAV2)、AAV9及AAV8。在特定實施例中，rAAV衣殼AAV-2及AAV-9，其中衣殼蛋白視情況被進一步工程化以減少或改變天然向性，例如以減少肝素結合。 7.3.3.2 去除天然結合部分
在本發明之腺相關病毒(rAAV)衣殼的特定實施例中，rAAV選自具有天然細胞結合位點的天然血清型，該天然細胞結合位點能夠與已去除的硫酸乙醯肝素蛋白多醣結合。
在特定實施例中，藉由用不同的胺基酸(諸如丙胺酸)替換VP1的精胺酸585或精胺酸588及/或VP2或VP3中的類似精胺酸中之至少一個來工程化，從而去除肝素結合。在一些實施例中，VP2中的精胺酸448及精胺酸451或VP3中的383及386中之至少一個被改變。
在特定實施例中，本發明之腺相關病毒(AAV)衣殼包含至少一種自野生型突變之蛋白質，例如，其中工程化/突變之蛋白質選自野生型蛋白質VP1、VP2，及/或VP3。或者，該衣殼中之蛋白質VP1、VP2及/或VP3中的兩種被突變，或者該衣殼中的所有三種蛋白質VP1、VP2及VP3均被修飾。在特定實施例中，該衣殼中待修飾的至少一種蛋白質的至少一部分，例如一個胺基酸被突變(替換、***或缺失)。然而，亦有可能使該衣殼中之蛋白質VP1、VP2及VP3的多個部分發生突變，例如多個胺基酸，諸如2、3、4、5、6、7、8、9、10個或任何其他數目的部分或胺基酸。在特定實施例中，VP1的精胺酸484、487、585及588及離胺酸532中之至少一個，及/或VP2或VP3中的類似精胺酸，藉由用不同的胺基酸諸如丙胺酸對其進行替換而被去除。 7.3.1. PEG 免疫遮蔽
根據另一特定實施例，病毒衣殼表面可以根據此項技術中已知之方法進行修飾以包含用於避免與中和抗體相互作用的空間屏蔽劑。在一些實施例中，空間屏蔽劑衍生自合成聚合物，諸如聚乙二醇(PEG)或pHPMA。PEG聚合物係藉由聚合過程製備的，且包含各大小及分子量的非均質混合物，其特徵可以在於鏈長及分子量的泊松分佈(Poisson distribution)，亦稱為多分散指數(PDI)、分散指數或簡單的分散性(表示為符號「Đ」)。報導的分子量係平均分子量，且Đ (或PDI)表示樣品中的分子量範圍。 7.3.2. 衣殼承載物
包裝在本發明經表面修飾rAAV衣殼內的核酸承載物可以係任何類型的被rAAV有效轉導至細胞中的核酸分子。
在一些實施例中，rAAV衣殼的有效負荷或承載物係可表現的聚核苷酸。在某些實施例中，可表現的聚核苷酸編碼蛋白質(例如，編碼治療性蛋白質)。在某些實施例中，可表現的聚核苷酸編碼轉殖基因。在某些實施例中，可表現的聚核苷酸可被轉錄以提供嚮導RNA、反式活化CRISPR RNA (tracrRNA)、傳訊RNA (mRNA)、微小RNA (miRNA)或shRNA。
在一些實施例中，有效負荷提供用於同源定向修復的DNA同源構築體。
在一些實施例中，該核酸分子編碼細胞內抗體(例如中和細胞內的某些蛋白質)、係編碼肽毒素的核酸分子(例如阻斷疼痛路徑中的離子通道)、編碼光遺傳致動器的核酸分子(例如用於例如使用光打開或關閉神經元活動)，編碼藥物遺傳學工具的核酸分子(例如使用沒有干擾藥理作用的化學配位體打開或關閉神經元信號傳導)，編碼基於CRISPR的編輯器以進行精確基因編輯的核酸分子、編碼CRISPR表觀遺傳工具以調節基因表現的核酸分子，及/或編碼自殺基因以誘導細胞死亡的核酸分子。
較佳地，當承載物包含基因編輯核酸酶，諸如Cas9時，承載物進一步包含核酸分子，諸如gRNA及/或欲***宿主基因體的特定DNA。在某些此等實施例中，承載物包含已知與遺傳疾病相關的轉殖基因。
技術人員知道除Cas9之外的其他基因編輯核酸酶，諸如Cpfl、TALEN、ZFN或歸巢核酸內切酶。此外，使用DNA引導的Argonaute干擾系統(DAIS)進行工程化可能很方便。基本上，該Argonaute (Ago)蛋白係在至少一種外源寡核苷酸(DNA嚮導)存在下自引入該細胞的聚核苷酸異源表現的，該外源寡核苷酸提供對該Ago蛋白對預選基因座的切割特異性。TALEN及Cas9系統分別描述於WO 2013/176915及WO 2014/191128中。鋅指核酸酶(ZFN)最初描述於Kim, YG; Cha, J.; Chandrasegaran, S. (「Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain」 (1996). Proc Natl Acad Sci USA 93 (3): 1156-60)中。Cpfl係Zhang等人(Cpfl is a single RNA-guided Endonuclease of a Class 2 CRIPR-Cas System. (2015). Cell;163:759-771)描述的2類CRISPR Cas系統。argonaute (AGO)基因家族最初描述在Guo S, Kemphues KJ. (Par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. (1995). Cell;81(4):611-20)中。 7.4. 製備經表面修飾病毒衣殼之方法
本發明之另一態樣係關於生產經表面修飾重組病毒衣殼之方法。在某些實施例中，所提供的衣殼用於將核酸轉導至真核細胞中，通常係哺乳動物細胞，特別係人類細胞。在一些實施例中，經表面修飾病毒衣殼係重組腺病毒病毒粒子。在一些實施例中，經表面修飾病毒衣殼係重組AAV病毒粒子。
該方法包含將配位體經由包含交聯部分Q的連接子與病毒衣殼蛋白交聯，亦即共價綴合的步驟。較佳地，配位體將至少一個哺乳動物細胞表面目標結合位點引入至該衣殼中，視情況其中將該衣殼中的天然細胞表面目標結合位點去除，諸如預先去除。
在一個實施例中，一種製備本文所述的經表面修飾病毒衣殼之方法，其包含以下步驟： i)藉由使病毒衣殼蛋白與衣殼反應性連接子反應獲得經表面官能化病毒衣殼，該連接子包含交聯劑反應性成對的第一成員及視情況選用之一或多個間隔子； ii)將該經表面官能化病毒衣殼與經官能化配位體綴合，該經官能化配位體包含該交聯劑反應性成對的第二成員及視情況選用之一或多個間隔子； 其中該交聯劑反應性成對的該第一成員與該第二成員反應形成交聯部分Q；及 iii)獲得該經表面修飾病毒衣殼。
如上所述，若該衣殼中的該天然哺乳動物細胞表面目標結合位點存在且未被去除，並且衣殼經表面修飾以包含至少一種根據本發明之配位體，則與未經如本文所述表面修飾的衣殼相比，所提供的經表面修飾病毒衣殼具有更高的感染率(亦即，改進的轉導-更高的效率或在更低效價下類似的效率)。在替代實施例中，若在衣殼表面修飾以包含配位體之前去除該衣殼中的該天然哺乳動物細胞目標結合位點(例如，已知肝素結合位點的遺傳修飾)，則所提供的經表面修飾衣殼與未經如本文所述表面修飾的衣殼相比具有以下中之一或多者：i)改變的向性及ii)改善的轉導。
上述方法產生的腺相關病毒(AAV)顆粒較佳選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、hu68、rh.10及其混合物。
藉由上述方法生產的腺相關病毒(AAV)顆粒的任何蛋白質均可以被修飾。較佳地，該衣殼中之蛋白質VP1、VP2或VP3中之至少一種在上述方法中被修飾。或者，該衣殼中之蛋白質VP1、VP2及/或VP3中的兩種被修飾，或者該衣殼中的所有三種蛋白質VP1、VP2及VP3均被修飾。較佳地，該衣殼中待修飾的至少一種蛋白質的至少一部分，例如至少一個胺基酸被修飾。然而，亦可以修飾該衣殼中之蛋白質VP1、VP2及VP3的多個部分，例如多個胺基酸，諸如2、3、4、5、6、7、8、9、10個或任何其他數目的部分或胺基酸。較佳地，VP1的精胺酸484、487、585及588及離胺酸532中之至少一個及/或VP2或VP3中的類似精胺酸藉由用不同的胺基酸諸如丙胺酸對其進行替換而被去除。
來自天然AAV血清型(必要時進一步基因修飾)的衣殼蛋白，諸如VP1、VP2或VP3，在特定胺基酸處進行化學修飾。此類修飾之實例係此項技術中眾所周知的，並在例如R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 第3版. CRC Press, 2005中進行了總結，該文獻以引用的方式併入本文中。胺基酸的化學修飾包括但不限於藉由以下方式修飾：醯基化、醯胺化、離胺酸的吡啶氧基化、還原烷基化、用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)對胺基進行三硝基苄化、對羧基進行醯胺化修飾以及藉由將半胱胺酸過氧甲酸氧化為氧化半胱胺酸進行巰基化、形成巰基衍生物，與其他硫醇化合物形成混合二硫化物，與順丁烯二醯亞胺反應，與碘乙酸或碘乙醯胺發生羧甲基化，以及在鹼性pH值下與氰酸酯發生胺基甲醯化，但不限於此。在此方面，技術人員可參考Current Protocols in Protein Science, Coligan等人編. (John Wiley & Sons NY 1995-2000, 其全部內容明確地併入本文中)的第15章以獲得與蛋白質化學修飾相關的更廣泛之方法論。
在上述用於產生改進的腺相關病毒(AAV)之方法之一些實施例中，衣殼修飾包含去除天然結合位點及引入配位體結合位點，例如經由用衣殼表面反應性部分對衣殼表面進行官能化。在某些其他實施例中，AAV衣殼之天然結合位點未改變，亦即未被去除，並且根據本發明引入至少一個配位體結合位點或配位體。
在一些實施例中，藉由上述用於產生改進的腺相關病毒(AAV)顆粒之方法去除天然結合位點，其中天然結合位點能夠與硫酸乙醯肝素蛋白多醣結合。在某些此等實施例中，藉由用不同的胺基酸諸如丙胺酸替換VP1的精胺酸585及588及/或VP2或VP3中的類似精胺酸中之至少一個來去除天然結合位點。
在一些實施例中，根據本發明引入的配位體結合位點係能夠實現配位體共價連接的結合位點。在某些此等實施例中，配位體結合位點選自連接至可用離胺酸殘基的苄基鳥嘌呤基團，更佳藉由使該衣殼與苄基鳥嘌呤N-羥基丁二醯亞胺(BG-NHS)及/或苄基胞嘧啶N-羥基丁二醯亞胺(BC-NHS)反應來連接。
本發明較佳使用能夠以高親和力結合其特定配位體的標籤，諸如SNAP-標籤、CLIP-標籤、Halo-標籤、Lumio-標籤及其他標籤。上述方法中引入的標籤分子可以係能夠與另一分子特異性結合的任何分子或生物分子。此等實例可以包括SNAP-標籤、CLIP-標籤、Lumio-標籤或Halo-標籤。舉例而言，親和標籤可以係SNAP-標籤，亦即烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶的突變體。重要的是，SNAP-標籤的受質之一係苄基鳥嘌呤。可用於本發明之市售產品包括例如來自Promega的Halo標籤、來自Life Technologies的Lumio標籤及來自NEB的SNAP/CLIP標籤。所引入的該配位體結合位點較佳連接至該可用離胺酸殘基的ε-胺基或一級胺。
因此，上述用於產生改進的腺相關病毒(AAV)顆粒之方法係進一步較佳的，其中該方法進一步包含以下步驟：將配位體連接至該苄基鳥嘌呤及/或該苄基胞嘧啶基團，特定而言Halo標籤TM、SNAP-標籤TM或CLIP-標籤TM。
該待連接的配位體可以係任何種類的配位體，但較佳選自蛋白質配位體，諸如生長因子或細胞介素；毒素次單元，諸如霍亂毒素B次單元；凝集素，諸如同工凝集素B4或小麥胚芽凝集素；黏著因子，諸如乳黏素；抗體，諸如抗CD-34抗體；肽，諸如新皮啡肽類鴉片受體配位體；及基因編輯核酸酶，諸如Cas9。 7.5. 調配物
本發明之另一實施例係關於用於治療疾病的前述經表面修飾病毒衣殼，其中投與個體的該AAV呈液體、乾燥或半固體形式，諸如呈以下形式：錠劑、包衣錠、發泡錠、膠囊、粉劑、顆粒、糖衣錠、***錠、丸劑、針劑、滴劑、栓劑、乳劑、軟膏、凝膠、酊劑、糊劑、乳膏、濕敷布、漱口溶液、植物汁液、鼻用劑、吸入混合物、氣霧劑、漱口水、口腔噴霧劑、鼻腔噴霧劑或室內噴霧劑。
在某些實施例中，提供包含重組病毒粒子之醫藥組合物，該重組病毒粒子包含如本文提供的經表面修飾病毒衣殼，在該病毒衣殼中容納有重組核酸承載物，該醫藥組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑、增溶劑、填充劑、防腐劑及/或賦形劑。此類醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑、增溶劑、填充劑、防腐劑及/或賦形劑可以例如見於Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第20版. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000中。
本發明之另一態樣係關於一種醫藥組合物，其包含根據本發明之經表面修飾病毒衣殼以及至少一種醫藥學上可接受之載劑及/或稀釋劑，亦即與醫藥學上可接受之添加劑、載劑、稀釋劑、溶劑、過濾劑、潤滑劑、賦形劑、黏合劑或穩定劑組合。較佳地，將該組合物以噴霧劑、包衣、泡沫、洗劑、凝膠、漱口水、經口調配物或注射劑的形式投與該個體。該組合物可以全身性地、經口地或藉由任何其他臨床/醫學上可接受之方法投與該個體。
本發明之另一態樣則關於一種套組，其包含：a)如根據本發明揭示及/或根據本發明使用的經表面修飾病毒衣殼，或包含如根據本發明揭示之經表面修飾病毒衣殼之醫藥組合物，b)將該經表面修飾病毒衣殼或該醫藥組合物應用於該目標的書面說明；及視情況選用之裝有供使用的經表面修飾病毒衣殼或組合物及書面說明的容器。
本發明之另一態樣係關於上述套組在需要該治療之個體中預防、治療及/或抑制病毒感染的用途。 7.6. 治療疾病之方法
本發明亦包括用於治療處於疾病(包括單基因或多基因遺傳疾病)發展及/或進展風險中的個體之方法，其中將如本發明所提供的治療有效量之AAV顆粒投與患者。在此種情況下，治療有效描述了足以藉由解決症狀來治療疾病(諸如遺傳疾病)的AAV顆粒的量。治療有效亦可以係足以預防疾病，諸如遺傳疾病的症狀發生的量。處於疾病風險中可以由例如易患該疾病的遺傳及/或表型症狀引起。在一些實施例中，已確定處於遺傳疾病風險中的患者攜帶或缺乏與遺傳疾病相關的基因。
本發明之另一態樣則關於一種治療可藉由基因治療治療的疾病之方法，該方法包含將根據本發明之經表面修飾病毒衣殼投與有需要之個體。
用本發明之經表面修飾病毒衣殼治療的細胞及/或個體較佳地係哺乳動物來源的，諸如人類來源的。然而，根據進入細胞的機制的相似性，本發明亦可有利地用於獸醫學、細胞培養程序或甚至植物細胞疾病。在一些實施例中，該待處理細胞係哺乳動物細胞、原核細胞或植物細胞。在特定實施例中，該待處理細胞係人類細胞。
本發明之又一實施例係關於用於治療疾病之前述方法，其包含將根據本發明之經表面修飾病毒衣殼投與有需要之個體，其中投與個體之該經表面修飾病毒衣殼呈液體、乾燥或半固體形式，諸如呈以下形式：錠劑、包衣錠、發泡錠、膠囊、粉劑、顆粒、糖衣錠、***錠、丸劑、針劑、滴劑、栓劑、乳劑、軟膏、凝膠、酊劑、糊劑、乳膏、濕敷布、漱口溶液、植物汁液、鼻用劑、吸入混合物、氣霧劑、漱口水、口腔噴霧劑、鼻腔噴霧劑或室內噴霧劑。
欲藉由上述治療疾病之方法治療的疾病包含將經表面修飾病毒衣殼投與個體。在某些實施例中，該疾病選自癌症；遺傳性單基因疾病，諸如遺傳性視網膜疾病；遺傳性皮膚病，諸如奧姆斯特德症候群(Olmsted Syndrome)或家族性原發性局部皮膚類澱粉變性；感染性疾病、腎上腺腦白質失養症、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、芳族L-胺基酸缺乏、巴頓病(Batten disease)、貝克爾肌肉營養不良(Becker muscular dystrophy)、β-地中海貧血、卡納萬病(Canavan disease)、慢性肉芽腫病、克果納傑症候群(Crigler-Najjar syndrome)、囊腫性纖維化、杜興氏肌肉失養症、法布立病(Fabry disease)、家族性腺瘤性瘜肉病、家族性高膽固醇血症、家族性卵磷脂-膽固醇醯基轉移酶缺乏症、範可尼貧血(Fanconi anemia)、半乳糖唾液酸貯積症、高歇氏病(Gaucher's disease)、回旋狀萎縮、A型血友病、B型血友病、賀勒氏症候群(Hurler syndrome) (I型黏多醣貯積症)、韓特氏症候群(Hunter syndrome) (II型黏多醣貯積症)、亨汀頓氏舞蹈病(Huntington's chorea)、接合型大皰性表皮鬆解、晚期嬰兒神經元類蠟脂褐質病、白血球黏附缺陷，肢帶型肌肉營養不良、脂蛋白脂肪酶缺乏症、異染性腦白質失養症、Sly症候群(VII型黏多醣貯積症)、內瑟頓症候群(Netherton syndrome)、鳥胺酸轉胺甲醯酶缺乏症、龐培氏病(Pompe disease)、嘌呤核苷磷酸化酶缺乏症、隱性營養不良性大皰性表皮鬆解、A型山菲利普病(sanfilippo A) (IIIA型黏多醣病)、B型山菲利普病(sanfilippo B) (IIIB型黏多醣病)、鐮狀細胞病、嚴重複合免疫不全症、脊髓性肌肉萎縮症、戴-薩克斯病(Tay Sachs disease)、威斯科特-奧爾德里奇症候群(Wiskott-Aldrich syndrome)、馮吉爾克病(von Gierke disease) (Ia型肝醣貯積病)、X性聯肌微管性肌病、終末期腎病貧血、心絞痛(穩定、不穩定、難治性)、冠狀動脈狹窄、嚴重肢體缺血、心臟衰竭、間歇性跛行、心肌缺血、周邊血管疾病、肺性高血壓、靜脈性潰瘍、腺病毒感染、巨細胞病毒感染、艾司坦氏-巴爾氏病毒(Epstein-Barr virus)感染、B型肝炎感染、C型肝炎感染、HIV/AIDS、流感、日本腦炎、瘧疾、小兒呼吸道疾病、呼吸道融合性病毒、破傷風、結核病、婦科癌症、乳癌、卵巢癌、宮頸癌、外陰癌、神經系統癌症、神經膠質母細胞瘤、軟腦膜癌病、神經膠質瘤、星狀細胞瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、胃腸道癌症、結腸癌、結腸直腸癌、肝轉移癌、肝炎後肝癌、胰臟癌、膽囊癌、肝細胞癌、泌尿生殖系統癌、***癌、腎癌、膀胱癌、肛門生殖器腫瘤、皮膚癌、黑色素瘤(惡性/轉移性)、頭頸癌、鼻咽癌、鱗狀細胞癌、食道癌、肺癌、腺癌、小細胞/非小細胞癌、間皮瘤、血液癌、白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤、肉瘤、生殖細胞癌、李-佛美尼症候群(Li-Fraumeni syndrome)、甲狀腺癌、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、腕隧道症候群、慢性創傷性腦損傷、肘隧道症候群、糖尿病神經病變、癲癇、巨大軸突神經病變、晚期嬰兒神經元類蠟脂褐質病、多發性硬化、重症肌無力、疼痛、帕金森病(Parkinson disease)、周邊神經病變、2型脊髓性肌肉萎縮症、全色盲、年齡相關之黃斑部變性、無脈絡脈畸型、糖尿病性黃斑部水腫、青光眼、萊伯氏先天性黑蒙(Leber congenital amaurosis)、2型黃斑毛細血管擴張症、色素性視網膜炎、淺表角膜斑、X性聯視網膜劈裂、關節炎(類風濕性、發炎性、退行性)、退行性關節病、嚴重直腸發炎病、潰瘍性結腸炎、慢性腎病、糖尿病潰瘍、足部潰瘍、逼尿肌過度活躍、***功能障礙、骨折、聽力損失、遺傳性包涵體肌病變、移植物抗宿主病/移植患者、口腔黏膜炎、腮腺唾液機能減退、全身性硬化症、I型糖尿病、及傷口癒合，或其組合。
亦提供了一種治療疾病之方法，其包含將根據本發明之經表面修飾病毒衣殼投與有需要之個體，其中將該經表面修飾病毒衣殼以醫藥組合物形式投與該個體或細胞，例如與醫藥學上可接受之添加劑、載劑、稀釋劑、溶劑、過濾劑、潤滑劑、賦形劑、黏合劑或穩定劑組合。在某些實施例中，將該組合物以噴霧劑、包衣、泡沫、洗劑、凝膠、漱口水、經口調配物或注射劑的形式投與該個體。該組合物可以全身性地、經口地或藉由任何其他臨床/醫學上可接受之方法投與該個體。
本發明之另一態樣係關於根據本發明之經表面修飾病毒衣殼用於細胞轉染，例如作為研究中的基因遞送工具。該用途亦可以用於美容目的，並且本發明包括與本文揭示的醫學治療類似的美容治療方法。為此，亦可以將根據本發明之經表面修飾病毒衣殼以美容組合物的形式投與個體或細胞，例如與美容上安全且可接受之添加劑、載劑、稀釋劑、溶劑、過濾劑、潤滑劑、賦形劑、黏合劑或穩定劑組合。在某些實施例中，將該組合物以噴霧劑、包衣、泡沫、洗劑、凝膠、漱口水、經口調配物或注射劑的形式投與該個體。該組合物可以全身性地、經口地或藉由任何其他臨床/美容上可接受之方法投與該個體。
技術人員知道使用衍生自AAV的載體在活體外及活體內轉移基因之方法，諸如在WO 93/09239、US4797368、US 5139941及EP 488 528中描述之彼等。
本發明之另一態樣係關於一種套組，其包含：a)用於細胞轉染的經表面修飾病毒衣殼，b)使用經表面修飾病毒衣殼轉染細胞的書面說明；及視情況選用之裝有經表面修飾病毒衣殼及書面說明的容器。 7.6.1. 適應症
本發明之另一態樣係關於包含根據本發明之經表面修飾病毒衣殼的重組病毒粒子用於治療疾病，以及藉由投與有效量的包含本文所述的經表面修飾衣殼的重組病毒粒子來治療疾病之方法。在某些實施例中，本文提供的組合物用於包含基因治療的治療。此外，本發明提供了經表面修飾病毒衣殼組合物在製備用於基因治療之藥劑中的用途。此外，本發明提供包含基因治療的治療方法，其中該方法包括投與經表面修飾病毒衣殼組合物。
可以藉由根據本發明使用的經表面修飾病毒衣殼治療或預防的疾病種類沒有特定限制。利用根據本發明使用的經表面修飾病毒衣殼治療或預防的疾病包括可以藉由基因治療治療的彼等疾病，諸如癌症；遺傳性單基因疾病，諸如遺傳性視網膜疾病；遺傳性皮膚病，諸如奧姆斯特德症候群或家族性原發性局部皮膚類澱粉變性；感染性疾病、共濟失調、腎上腺腦白質失養症、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、芳族L-胺基酸缺乏、巴頓病、貝克爾肌肉營養不良、β-地中海貧血、卡納萬病、慢性肉芽腫病、克果納傑症候群、囊腫性纖維化、杜興氏肌肉失養症、法布立病、家族性腺瘤性瘜肉病、家族性高膽固醇血症、家族性卵磷脂-膽固醇醯基轉移酶缺乏症、範可尼貧血、半乳糖唾液酸貯積症、高歇氏病、回旋狀萎縮、A型及B型血友病、賀勒氏症候群(I型黏多醣貯積症)、韓特氏症候群(II型黏多醣貯積症)、亨汀頓氏舞蹈病、接合型大皰性表皮鬆解、晚期嬰兒神經元類蠟脂褐質病、白血球黏附缺陷，肢帶型肌肉營養不良、脂蛋白脂肪酶缺乏症、異染性腦白質失養症、Sly症候群(VII型黏多醣貯積症)、內瑟頓症候群、鳥胺酸轉胺甲醯酶缺乏症、龐培氏病、嘌呤核苷磷酸化酶缺乏症、隱性營養不良性大皰性表皮鬆解、A型山菲利普病(IIIA型黏多醣病)、B型山菲利普病(IIIB型黏多醣病)、鐮狀細胞病、嚴重複合免疫不全症、脊髓性肌肉萎縮症、戴-薩克斯病、威斯科特-奧爾德里奇症候群、馮吉爾克病(Ia型肝醣貯積病)、X性聯肌微管性肌病、終末期腎病貧血、心絞痛(穩定、不穩定、難治性)、冠狀動脈狹窄、嚴重肢體缺血、心臟衰竭、間歇性跛行、心肌缺血、周邊血管疾病、肺性高血壓、靜脈性潰瘍、腺病毒感染、巨細胞病毒感染、艾司坦氏-巴爾氏病毒感染、B型肝炎感染、C型肝炎感染、HIV/AIDS、流感、日本腦炎、瘧疾、小兒呼吸道疾病、呼吸道融合性病毒、破傷風、結核病、婦科癌症、乳癌、卵巢癌、宮頸癌、外陰癌、神經系統癌症、神經膠質母細胞瘤、軟腦膜癌病、神經膠質瘤、星狀細胞瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、胃腸道癌症、結腸癌、結腸直腸癌、肝轉移癌、肝炎後肝癌、胰臟癌、膽囊癌、肝細胞癌、泌尿生殖系統癌、***癌、腎癌、膀胱癌、肛門生殖器腫瘤、皮膚癌、黑色素瘤(惡性/轉移性)、頭頸癌、鼻咽癌、鱗狀細胞癌、食道癌、肺癌、腺癌、小細胞/非小細胞癌、間皮瘤、血液癌、白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤、肉瘤、生殖細胞癌、李-佛美尼症候群、甲狀腺癌、阿茲海默氏病、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、腕隧道症候群、慢性創傷性腦損傷、肘隧道症候群、糖尿病神經病變、癲癇、巨大軸突神經病變、晚期嬰兒神經元類蠟脂褐質病、多發性硬化、重症肌無力、疼痛、帕金森病、周邊神經病變、2型脊髓性肌肉萎縮症、全色盲、年齡相關之黃斑部變性、無脈絡脈畸型、糖尿病性黃斑部水腫、青光眼、萊伯氏先天性黑蒙、2型黃斑毛細血管擴張症、色素性視網膜炎、淺表角膜斑、X性聯視網膜劈裂、關節炎(類風濕性、發炎性、退行性)、退行性關節病、嚴重直腸發炎病、潰瘍性結腸炎、慢性腎病、糖尿病潰瘍/足部潰瘍、逼尿肌過度活躍、***功能障礙、骨折、聽力損失、遺傳性包涵體肌病變、移植物抗宿主病/移植患者、口腔黏膜炎、腮腺唾液機能減退、全身性硬化症、I型糖尿病及/或傷口癒合。
在某些實施例中，欲根據本發明治療的共濟失調係與由小腦或脊椎退化組成的遺傳性疾病相關的共濟失調，並且甚至可以表現為重疊的小腦及感覺性共濟失調。導致共濟失調的遺傳性疾病包括體染色體顯性遺傳疾病，諸如脊髓小腦性共濟失調、發作性共濟失調及齒狀核紅核蒼白球萎縮症，以及體染色體隱性遺傳疾病，諸如弗里德賴希共濟失調(Friedreich's ataxia) (感覺性及小腦性，前者居多)及尼曼匹克病(Niemann Pick disease)，共濟失調-毛細血管擴張症(感覺性及小腦性，後者居多)及無β脂蛋白血症。X性聯共濟失調病況之一實例係罕見的脆弱X相關震顫/共濟失調症候群或FXTAS。
在某些實施例中，待治療的適應症係脂蛋白脂肪酶缺乏症、大B細胞淋巴瘤、β地中海貧血、套細胞淋巴瘤、血管內皮生長因子周邊動脈疾病、頭頸部鱗狀細胞癌、脊髓性肌肉萎縮症、腺苷脫胺酶缺乏症(ADA-SCID)、具有復發皮膚病灶之患者的黑色素瘤、B細胞淋巴母細胞性白血病或萊伯氏先天性黑蒙。
在某些實施例中，待治療的適應症包括恰克-馬利-杜斯氏病(Charcot-Marie-Tooth) (所有類型)、神經節苷脂貯積病(所有類型)、遺傳性癲癇(亦即卓飛病(Dravet))、結節性硬化症、脊髓損傷、所有髓鞘脫失遺傳性運動及感覺神經病變(HMSN)、克拉培氏病(Krabbe disease)、進行性骨化性纖維發育不良、神經纖維瘤病1及2、自發性震顫、脆弱X症候群、勒-奈二氏症候群(Lesch-Nyhan syndrome)、肌強直性營養不良、多系統萎縮(MSA)、齊薇格症候群(Zellweger syndrome)、視神經脊髓炎或德維克氏病(Devic's disease)、橋腦中央髓鞘溶解症；脊髓病，諸如脊髓癆(梅毒性脊髓病)；腦白質病，諸如進行性多灶性腦白質病；腦白質失養症及格巴二氏症候群(Guillain-Barré syndrome)及其慢性對應症，慢性發炎性髓鞘脫失多發性神經病變。
在某些實施例中，待治療的適應症係抗MAG周邊神經病變、或銅缺乏相關病況(周邊神經病變、脊髓病及罕見的視神經病變)，或進行性發炎性神經病變。 7.6.2. 投與模式
本發明之另一態樣係關於用於治療疾病的根據本發明之經表面修飾病毒衣殼的投與方式。
在一些實施例中，可以使用此項技術中已知的合適方式直接或間接投與根據本發明之經表面修飾病毒衣殼。本發明之方法及用途包括全身、區域或局部地或藉由任何途徑，例如藉由注射、輸注、經口(例如，攝入或吸入)或局部(例如，經皮)遞送及投與根據本發明組合物之經表面修飾病毒衣殼。例示性投與及遞送途徑包括靜脈內(i.v.)、關節內、腹膜內(i.p.)、動脈內、肌肉內、非經腸、皮下、胸膜內、局部、皮膚、皮內、經皮、非經腸，例如經黏膜、顱內、脊髓內、口腔(消化道)、黏膜、呼吸、鼻內、插管、肺內、肺內滴注、經頰、舌下、血管內、鞘內、腔內、離子電滲、眼內、眼科、光學、腺內、器官內、***內、鞘內、大池內。考慮到迄今為止已經取得的進展，預期對用於為個體或該個體的細胞、組織、器官提供根據本發明組合物之經表面修飾病毒衣殼的手段的改進。當然可以結合此類未來的改進以實現本發明之上述效果。在某些實施例中，在投與根據本發明之經表面修飾病毒衣殼的步驟中，將衣殼組合物溶解在與遞送方法相容的溶液中。在調配用於靜脈內、皮下、肌肉內、鞘內、關節內及/或心室內投與的某些實施例中，衣殼組合物被調配成生理鹽溶液。 7.7. 實例 實驗觀察總結
重組腺相關病毒(rAAV)已成為基礎研究及臨床應用的首選活體內基因遞送載體。重組AAV載體不會在宿主基因體中進行位點特異性整合，再加上適度的免疫原性，使其成為最安全的基因治療策略之一(Naso MF, Tomkowicz B, Perry WL, 第3版, Strohl WR. Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy. BioDrugs2017;31:317-34)。儘管AAV在活體內使用比其他病毒載體具有明顯的優勢，但仍有一些侷限性。舉例而言，其在轉導一些細胞類型時無效；因此，高效的基因轉移通常需要較高滴度。此又經由轉導不適當的細胞類型導致脫靶效應，大幅提高生產成本，並導致毒性。
改進AAV介導的基因遞送的努力最初集中在利用對不同細胞類型顯示不同向性的野生型血清型。藉由產生含有側接來自血清型2的ITR的轉殖基因及來自其他野生型血清型的衣殼的假型AAV，可以修改重組載體的轉導特異性。最近，合成AAV衣殼已經工程化，其含有藉由定向進化或合理設計獲得的衣殼蛋白(Colella P, Ronzitti G, Mingozzi F. Emerging Issues in AAV-Mediated In vivoGene Therapy. Mol Ther Methods Clin Dev2018;8:87-104)。此種方法之實例係開發經工程化AAV-PHP.eB及AAV-PHP.S衣殼，其可以轉導中樞及周邊神經系統(Chan KY, Jang MJ, Yoo BB, Greenbaum A, Ravi N, Wu WL等人. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat Neurosci2017;20:1172-9)。此等變異體可以全身注射至小鼠體內，以靶向整個腦或周邊神經節。然而，儘管此等方法取得了成功，其中衣殼蛋白VP1、VP2及/或VP3的一級胺基酸序列已經工程化的AAV載體仍然存在一些缺點，諸如全身轉導需要較高滴度，以及關於其超出嚙齒動物模型範圍的轉化潛力的問題。
吾人對此等問題的解決方案之一態樣係提供一種基於蛋白質化學之方法，該方法有助於將病毒衣殼(作為重組AAV病毒粒子的一部分)及其用殼體包裹的承載物靶向遞送至選擇的細胞中。在本發明中，吾人提供了經由生物正交化學將配位體交聯至AAV衣殼，從而改善向性及/或提高轉導效率。在某些實施例中，經表面修飾病毒衣殼的配位體與其在哺乳動物細胞表面上的同源受體結合以選擇性地介導基因遞送至展示合適同源受體的細胞類型中，由此能夠實現靶向病毒基因遞送。
在下面描述的某些實驗中，吾人經由衣殼中硫酸乙醯肝素蛋白多醣結合基序的突變產生了非感染性AAV血清型2病毒(Kern A, Schmidt K, Leder C, Müller OJ, Wobus CE, Bettinger K等人. Identification of a Heparin-Binding Motif on Adeno-Associated Virus Type 2 Capsids. Journal of Virology2003;77:11072-81) (R585/588A，稱為AAV2-ΔHSPG)，接著用包含交聯劑反應性成對之成員(例如苄基鳥嘌呤(BG)及環辛炔(DBCO))的反應性連接子對組裝的ΔHSPG-AAV2衣殼上暴露於表面的離胺酸殘基進行化學修飾。接著，吾人能夠將具有SNAP標籤融合物或疊氮化物官能基的經官能化配位體與病毒交聯，並以受體依賴性方式恢復病毒感染性。
吾人最初使用蛋白質配位體，諸如神經滋養蛋白及細胞介素(IL31)測試了該系統，因為此等分子的受體在皮膚及周邊神經系統的細胞亞群中表現。接著，吾人繼續比較蛋白質配位體，諸如針對相同受體的單鏈抗體(scFv)，以瞭解其是否在配位體靶向方面有所改善。吾人亦探索了其他類別的配位體，諸如霍亂毒素B (CTB)及各種凝集素，目的係將與配位體所具有的官能性相同的官能性(例如，在CTB的情況下，逆向轉運，或在凝集素的情況下，改善與細胞表面碳水化合物的結合)編碼至AAV中。
同時，吾人亦評估了除BG-SNAP標籤綴合之外的其他生物正交化學以及將更長的間隔子併入連接子的效果。吾人發現，二苯并環辛炔(DBCO)與疊氮基之間的應變促進之疊氮化物-炔烴點擊化學(SPAAC)反應令人驚訝地進一步提高了效率。此允許AAV與市售肽及蛋白質配位體輕鬆綴合，而無需生成SNAP融合蛋白。
總之，吾人之資料表明吾人之化學修飾方法比經序列修飾AAV衣殼具有許多優勢。與儘管進行了大量的研究但很少有人類組織特異性變異體被定義的經序列修飾衣殼不同，吾人之方法利用大量已知的人類細胞受體-配位體相互作用來驅動向性。與必須憑經驗確定組織向性的經序列修飾衣殼不同，當吾人消融AAV衣殼的天然細胞結合位點時，吾人之方法提供了由所連接配位體的受體特異性驅動的細胞靶向的高度特異性。並且，當連接的配位體在不消融或改變天然衣殼細胞結合位點的情況下增加轉導時，可以獲得更高的轉導效率，而不會顯著改變已知的向性。
此外，吾人之方法與任何AAV生產平台相容，不會影響病毒產量。本文提供之方法執行起來亦不貴，並且可以自小規模研究應用擴展至臨床規模生產。最後，提供的用於修改AAV衣殼表面的平台係模組化的，基本上允許任何病毒/配位體組合，且此應該有助於將其自嚙齒動物模型轉化至人類患者。
下表1總結了在下面的實例1-8中進一步詳細描述的一些加配位體的AAV實驗。
表 1
配位體 類別 受體 作為以下的標誌物 AAV 類型 化學性質 活體外 活體內 註釋
NGF R121W 蛋白質 TrkA 痛覺感受器 AAV2-ΔHSPG BG-SNAP PC12細胞，DRG神經元，器官型脊髓 IP，IV，神經內，皮下 與在DRG中染色的TrkA抗體重疊
BDNF 蛋白質 TrkB 機械性受器 AAV2-ΔHSPG BG-SNAP DRG神經元      
NT3 蛋白質 TrkC 本體受器 AAV2-ΔHSPG BG-SNAP DRG神經元      
IL31 K134A 蛋白質 IL31RA/ OSMR 角質細胞及本體受器 AAV2-ΔHSPG BG-SNAP 初生角質細胞 皮下 在IL31RA -/-小鼠中不存在信號
奈莫利珠單抗 scFv IL31RA 角質細胞及癢覺感受器 AAV2-ΔHSPG BG-SNAP及DBCO-疊氮化物 計劃 IP，IV，皮下   
霍亂毒素 B 次單元 毒素次單元 神經節苷脂GM1 大DRG神經元. 逆行示蹤劑 AAV2-ΔHSPG BG-SNAP及DBCO-疊氮化物 DRG神經元 皮下，神經內   
小麥胚芽凝集素 凝集素 N-乙醯葡萄糖胺 所有神經元 AAV2-ΔHSPG，PHP.S BG-SNAP及DBCO-疊氮化物 PC12細胞，DRG神經元，器官型脊髓 IV，神經內，皮下，前額葉皮層 亦在DRG神經元中加強PHP.S效率。
同工凝集素 B4 凝集素 α-半乳糖 脈管系統、非肽性痛覺感受器、小神經膠質細胞 AAV2-ΔHSPG，AAV2，AAV9 DBCO-疊氮化物 PC12細胞，DRG神經元，器官型脊髓 神經內，皮下，脊髓 亦在PC12細胞中加強AAV2及AAV9效率。
在隨後的實驗中，吾人使用了其他不需要添加SNAP標籤融合物來官能化配位體的交聯劑反應性成對。 實例 1. 去除 AAV2 中的天然結合位點
吾人早期實驗的一個目標係工程化腺相關病毒(AAV)衣殼，以便病毒選擇性地轉導相關細胞。此係藉由去除天然AAV衣殼蛋白中細胞的天然結合位點，例如藉由如本文所述的突變來達成的。接著將衣殼化學官能化以與經官能化配位體綴合。接著將生物正交官能化配位體共價連接至病毒上，並在活體外對細胞及在活體內對小鼠進行測試。儘管已經探索了AAV2、AAV9及PHP.S，但此等實例亦可以很容易地應用於其他病毒衣殼。
AAV2經由精胺酸585及588與硫酸乙醯肝素蛋白多醣結合。此等位置突變為丙胺酸以產生在CAP基因R585A+R588A中具有突變的缺失ΔHSPG。
質體pTAV2-0含有來自pAV-2的整個AAV-2基因體，包括兩個反向末端重複序列，選殖至pBluescript II的BamHI位點。產生了含有合適的AAV-2片段的亞質體，並將其用作定點誘變反應的模板。根據製造商的方案，藉由使用Stratagene (Amsterdam, The Netherlands) QuikChange定點誘變套組進行誘變。對於每個突變體，設計了兩個互補的PCR引子以含有替換序列，在突變的每一側上側接有15至20個同源鹼基對。藉由DNA定序來鑑別突變質體。接著將含有合適突變的片段亞選殖至含有蛋白質其餘部分的質體骨架(例如pTAV2-0)中，並對完整片段進行定序以檢查其他PCR突變。
在HEK293細胞或SF21昆蟲細胞中產生在CAP基因R585A+R588A中攜帶突變並且在CAG啟動子下攜帶tdTomato作為承載物的重組AAV2-ΔHSPG (Kern A, Schmidt K等人. Identification of a Heparin-Binding Motif on Adeno-Associated Virus Type 2 Capsids. Journal of virology2003;77:11072-81)，如前所述(Grieger JC等人. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nat Protoc2006;1:1412-28；Wu Y等人. A Recombinant Baculovirus Efficiently Generates Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors in Cultured Insect Cells and Larvae. Mol Ther Methods Clin Dev2018;10:38-47)。感染後5天採集細胞，用0.5%的Triton X-100裂解，用核酸酶處理，藉由切向流過濾濃縮，並使用等密度超速離心純化(Dias Florencio G等人. Simple downstream process based on detergent treatment improves yield and in vivotransduction efficacy of adeno-associated virus vectors. Mol Ther Methods Clin Dev2015;2:15024)。使用Q-PCR進行載體基因體滴定，引子靶向病毒承載物的啟動子區域(Grieger 2006)。 實例 2. 對 ΔHSPG 進行 BG-NHS 官能化以接受加 SNAP 標籤的配位體
配位體與蛋白質(例如蛋白質標記)的選擇性連接通常係藉由將生物正交基團併入蛋白質，接著進行化學選擇性修飾來實現的。此種方法亦被稱為「加標籤及修飾」。已經開發了多種生物正交反應，可分為：(1)經由羰基的縮合反應，(2)經由疊氮化物的「點擊」反應，(3)逆電子需求狄耳士-阿德爾環加成(DAINV)及其他環加成反應，(4)過渡金屬催化之偶聯及去老化反應，以及(5)半胱胺酸殘基處的標記反應，如上所述。
在吾人之第一組實驗中，藉由病毒與苄基鳥嘌呤NHS酯(亦稱為SNAP標籤受質，BG--NHS或BG-GLA-NHS)反應，苄基鳥嘌呤(BG)與暴露的離胺酸相連。為此，使用針頭，在室溫下將非水性DMSO添加至具有乾燥SNAP標籤配位體BG-NHS的小瓶中至所需的最終濃度(例如20 mM)。將欲胺官能化之蛋白質在溶劑(PBS)中稀釋至所需的最終濃度。將兩種製劑混合並在室溫下培育180分鐘，接著使用離心100 Kda MWCO過濾器單元去除未反應之組分。 BG-GLA-NHS：
Figure 02_image081
實例 3. 具有 C 端 SNAP 標籤的重組配位體
使用此系統有兩個步驟：將相關蛋白質選殖及表現為SNAP-tag®融合體，以及使用所選的SNAP-標籤受質標記該融合體。SNAP-標籤係一種基於人類O6-烷基鳥嘌呤-DNA-烷基轉移酶(hAGT) (一種DNA修復蛋白)的小蛋白。在此種情況下，SNAP-標籤受質係連接至苄基連接子的鳥嘌呤離去基團。在標記反應中，受質的經取代苄基與SNAP-標籤共價連接。
SNAP-標籤蛋白質標記系統能夠使幾乎任何分子與相關蛋白質特異性共價連接(對於本實驗，參見下面的實例4)。
具有C端SNAP標籤的重組配位體在大腸桿菌或哺乳動物細胞中產生。對於共價連接，接著藉由添加飽和濃度的加SNAP標籤的配位體並在室溫下培育隔夜，將加SNAP標籤的配位體連接至經BG修飾病毒上(參見 圖 1)。藉由使反應物通過離心100 Kda MWCO過濾器單元來去除過量的未反應之配位體。
對於本發明，實驗按照出於本發明目的進行修改之含有哺乳動物表現質體(pSNAPf)的SNAP-Cell®Starter套組(NEB)的說明書進行，該質體編碼側接用於選殖相關基因的限制性位點的SNAP-tag®。 實例 4. 靶向及加強轉導 - 經 BG-GLA-NHS 修飾 ΔHSPG AAV 衣殼與具有 C 端 SNAP 標籤的重組配位體的活體外及活體內測試
用多種類別的配位體測試上述衣殼表面修飾策略以確定配位體是否可以改變向性，該等配位體亦即蛋白質配位體，如生長因子、細胞介素等；毒素次單元，如霍亂毒素B次單元；凝集素，諸如同工凝集素B4或小麥胚芽凝集素；黏著因子，如乳黏素；抗體，諸如抗CD-34抗體(幹細胞標誌物)；及肽，諸如新皮啡肽類鴉片受體配位體。 實例 4a. ΔHSPG 衣殼不具有感染性，經表面修飾病毒衣殼恢復轉導效率
首先表明根據本發明之ΔHSPG病毒顆粒沒有殘留的感染活性，如在螢光報導體小鼠模型中的感覺神經元上所測試的( 圖 2)。小麥胚芽凝集素(WGA，凝集素；亦即WGA-SNAP)融合體(經由BG/SNAP連接子化學用WGA表面修飾的病毒衣殼)在同一螢光報導體小鼠模型中的感覺神經元上測試時將病毒轉導效率提高至100%或更高( 圖 3)。
接著，測試了幾種配位體，神經滋養因數NGF、NT3及BDNF (蛋白質配位體)將病毒遞送給不同的特定神經元群體，換言之，其賦予不同的向性，此取決於在螢光報導體小鼠模型中測試的衣殼構築體中使用的因子( 圖 4a- 圖 4c)。霍亂毒素B次單元(毒素)特異性地將病毒逆行引導至神經元細胞體(亦即細胞區室/部分特異性) ( 圖 5)。在類似的測試中，乳黏素(黏著因子)特異性地將病毒引導至暴露磷脂醯絲胺酸的巨噬細胞及神經元，而新皮啡肽(肽)將病毒特異性地引導至表現μ及δ類鴉片受體的神經元。
在 圖 6a- 圖 6b所示的實驗中，將用NGF配位體IV進行表面修飾的衣殼注射至三叉神經節中，接著在三週後取出感覺神經元組織並進行分析。切片組織用抗TrkA (NGF之受體)的抗體染色，發現非常好的重疊。TrkA抗體染色並不完美，因此80%的重疊係極其相關的。
在 圖 7所示的實驗中，來自 圖 6a- 圖 6c的切片用抗NF200及IB4的抗體染色，該等抗體標記其他神經元(分別為機械性受器及非肽性痛覺感受器)。同樣，此等標誌物並不完美，但可以看出綠色及藍色細胞與紅色感染細胞不同。
作為陰性對照，將IL31配位體以病毒方式引入IL31受體剔除小鼠不會導致感染。
總之，所有經配位體標記病毒均成功且特異性地僅轉導彼等表現相應受體的細胞，無論是在活體外施加至培養細胞中時，還是在小鼠中活體內注射時，亦即可以全身或局部注射，並選擇性地靶向不同的細胞群體。 實例 4b. 靶向 TrkA+ 痛覺感受器
在此實例中，周邊神經系統中的TrkA+痛覺感受器以衣殼表面修飾構築體為目標。NGF R121W配位體結合TrkA但不活化TrkA，將其與具有tdTomato承載物的ΔHSPG-AAV2 (如上所述製備的衣殼)交聯。將構築體皮下、神經內、眼眶後及腹膜內注射至小鼠中。三週後，使用TrkA抗體偵測及量化螢光。
發現對於眼眶後施加，80%的TrkA+細胞被NGF-AAV感染。83%的NGF-AAV感染細胞係TrkA+。亦發現不同的投與途徑在其高度有效結果方面沒有顯著差異。 實例 4c. 靶向 IL31RA+ 癢覺受體
在本實例中，IL31RA被AAV靶向，該AAV已被表面修飾以包含結合但不活化IL31RA的IL31 K134A靶向配位體。IL31RA與具有tdTomato承載物的ΔHSPG-AAV2 (如上所述的衣殼)交聯。將構築體注射至野生型及IL31RA剔除小鼠中。三週後，偵測來自報導基因的螢光並使用角蛋白14抗體進行重疊定量。發現所靶向的細胞對K14基本完全呈陽性。重要的是在IL31RA剔除小鼠中，未偵測到tomato表現。 實例 4d. 使用同工凝集素 B4 靶向
在此實例中，同工凝集素B4 (IB4)與如上所述具有tdTomato承載物的ΔHSPG-AAV2綴合。IB4可用作脈管系統、非肽性痛覺感受器及/或小神經膠質細胞之標誌物。將該構築體皮下、神經內或脊椎內注射。三週後，偵測到螢光。已發現，無論投與途徑如何，所靶向細胞基本上均係完全陽性的。 實例 4e. 使用小麥胚芽凝集素靶向
在此實例中，小麥胚芽凝集素(WGA)與如上所述具有tdTomato承載物的ΔHSPG-AAV2綴合。WGA與大多數神經元細胞膜上的N-乙醯葡萄胺糖結合，且用作(跨突觸)示蹤劑。在小鼠中，該構築體以靜脈內方式對P1新生小鼠，或以皮質內方式對成年小鼠進行注射。三週後，偵測到來自報導基因的螢光。
已發現加配位體的病毒可以更有效遞送基因(參見 圖 8a- 圖 8b)。用AAV9變異體PHP.S (1E+9載體基因體(VG))感染所培養的DRG神經元，並且發現上述經WGA修飾構築體造成強力提高遞送(參見 圖 8b)。 實例 5. 使用神經滋養蛋白配位體靶向
吾人選擇神經滋養蛋白配位體NGF、BDNF及NT3與AAV2-ΔHSPG綴合，因為其等受體標記功能不同的周邊感覺神經元群體。吾人亦產生與TrkA結合但不經由TrkA傳訊的突變體NGF R121W。因此，選擇NGF R121W來評估AAV之配位體靶向。
作為綴合策略，吾人首先嘗試編碼在AAV2 VP2蛋白的N端CLIP-標籤，以便經由雙功能連接子連接附加SNAP標籤的配位體。此種方法並不成功，因為AAV病毒衣殼不能支持CLIP-標籤的併入，反而僅在其等衣殼中產生VP1及VP3蛋白。吾人進一步探索了***較小的標籤，諸如諜標籤(Spytag)，以便最終與配位體-諜捕手(Spycatcher)融合體綴合。在病毒衣殼的位置588***諜標籤會造成病毒顆粒含有諜標籤，但產量降低超過10倍。此等實驗說明了與基因工程化AAV衣殼來連接靶向配位體相關的困難。
為了解決此問題，吾人推斷因為AAV衣殼表面有大量暴露的離胺酸殘基(超過1000個)，其應該可以經由胺反應性化學基團，諸如N-羥基丁二醯亞胺(NHS)酯進行修飾。因此，理論上，吾人將能夠經由與NHS-BG探針的標記反應，用SNAP-標籤反應性苄基鳥嘌呤(BG)基團裝飾AAV衣殼。因此，吾人建立了使用BG-GLA-NHS與AAV2-ΔHSPG之一系列莫耳比的反應，並將純化之產物施加至分離的背根神經節(DRG)神經元。自此實驗中，吾人確定經NGF R121W修飾AAV2-ΔHSPG確實依3E+9 VG病毒與1.73 nmol連接子的BG-GLA-NHS與AAV2-ΔHSPG的最佳莫耳比轉導DRG神經元群體，而單獨的AAV2-ΔHSPG則無效( 圖 9a- 圖 9f)。吾人已經最佳化該反應(參見下面的方法)，並發現一旦根據經驗確定了每種AAV製劑的最佳比率，該修飾就能在廣泛的反應性連接子(例如，彼等具有NHS酯衍生物者)、病毒濃度與純度、及配位體類別中運作。 方法
根據實例1中描述的程序製備重組AAV2-ΔHSPG。 實例 5a. 使用 NGF R121W -SNAP::AAV2-ΔHSPG 靶向
NGF R121W-SNAP係在哺乳動物細胞中產生的，如前所述(Nocchi L等人 Nerve growth factor-mediated photoablation of nociceptors reduces pain behavior in mice. Pain2019)。為了與AAV綴合，經純化AAV2-ΔHSPG與BG-GLA-NHS (NEB)或BG-PEG13-NHS (定製合成)以3E+9 VG病毒與1.73 nmol連接子的表觀VG與NHS連接子莫耳比在PBS pH 7.2中在室溫下反應3小時。反應物使用100 KDa MWCO離心過濾器純化，並在室溫下進一步與5 μM NGF R121W-SNAP一起培育隔夜。過量的未反應之NGF R121W-SNAP藉由通過100 Kda MWCO離心單元兩次來去除，並將交聯產物重新懸浮在PBS中。
Figure 02_image083
活體內注射及組織處理
對於活體內注射實驗，小鼠用2-2.5%異氟醚麻醉，接著經由皮下、神經內、腹膜內或眼眶後(IV)途徑注射。對於皮下注射，將10 ul中的3E+10 VG NGF R121W-SNAP::AAV2-ΔHSPG注射至爪的足底表面。對於神經內注射，將2 ul中的3E+9 VG NGF R121W-SNAP::ΔHSPG-AAV2注射至坐骨神經中。對於腹腔注射及眼眶後注射，注射了8E+10 VG或3E+10 VG NGF R121W-SNAP::ΔHSPG-AAV2。3週後，採集背根神經節及三叉神經節，將其固定在4%多聚甲醛中，在ScaleS中進行透明，並製備為全形包埋樣品。在一些實驗中，DRG亦以10 μm切片，與含有5%血清及0.3% Triton-X於PBS中的封閉溶液一起培育30分鐘，且隨後與抗TrkA抗體(R&D systems，1:200)在封閉溶液中在4℃下培育隔夜。在封閉溶液中加入二級抗體後持續1-2小時，用prolong gold封固。影像係用Leica SP5共焦顯微鏡拍攝的，並在ImageJ中進行分析。 結果
為了在活體外測試病毒轉導，將100 ul PBS中的1E+9 VG施加至96孔盤中的背根神經節神經元。每天監測螢光，且其通常在24小時後明顯，4天後達至峰值。如 圖 10a- 圖 10c所示，NGF R121W、BDNF及NT3偶聯的AAV2-ΔHSPG靶向形態不同的細胞亞型。
為了測試活體內病毒轉導，將10 ul PBS中的NGF R121W::AAV2-ΔHSPG眼眶內、腹膜內、神經內或皮下注射至小鼠中。3週後處死小鼠並採集組織以監測報導基因在不同器官中的螢光。 實例 5b. 連接子長度對 DRG 中轉導 NGF R121W::AAV2-ΔHSPG 的影響
在最初的實驗中，吾人測試了兩種不同的反應性連接子，一種稱為BG-GLA-NHS的短連接子，可自NEB市售獲得，而另一種稱為BG-PEG13-NHS的「長連接子」，吾人在內部合成。將用BG-GLA-NHS或BG-PEG13-NHS修飾的等量(3E+10 VG) NGF R121W::AAV2-ΔHSPG眼眶內注射至小鼠中，並採集DRG以評估轉導效率。參見 圖 11a- 圖 11f。自此等實驗中可以清楚地看出，較長的連接子比較短的連接子表現得好得多，不受理論的束縛，此可能係因為穩定性更高及/或活體內潛在的免疫逃脫。
吾人進一步比較了NGF R121W::AAV2-ΔHSPG的注射途徑，且發現與局部皮下或神經內注射相比，全身注射在DRG中產生更高水準的病毒轉導。參見 圖 12a- 圖 12d。此係出乎意料的，因為當吾人全身注射其他未經修飾AAV血清型時，吾人觀察到非常少的轉導，即使對於據報導在眼眶內注射時起作用的PHP.S亦是如此(Chan KY等人 Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat Neurosci2017;20:1172-9)。此等資料說明了吾人方法的效率。
最後，吾人藉由自經感染動物中採集DRG、切片並用抗NGF受體TrkA的抗體染色來評估NGF R121W::AAV2-ΔHSPG介導的基因遞送的特異性。吾人觀察到經病毒感染細胞與TrkA受體的存在之間存在很強的相關性：80%的TrkA陽性細胞被NGF R121W::AAV2-ΔHSPG感染，且83%的NGF R121W::AAV2-ΔHSPG感染細胞為TrkA陽性。 參見圖 13a- 圖 13d。 實例 5c. 使用 IL31 K134A::AAV2-ΔHSPG 靶向
介白素31 (Il31)被選為靶向配位體，因為其受體IL31RA及OSMR在角質細胞上高度表現，並且其在發炎性瘙癢中起關鍵作用(Furue M等人 Emerging role of interleukin-31 and interleukin-31 receptor in pruritus in atopic dermatitis. Allergy2018;73:29-36)。吾人生成了一個突變體IL31 K134A，其與IL31RA結合但不經由其傳訊(Nocchi L等人 Interleukin-31-mediated photoablation of pruritogenic epidermal neurons reduces itch-associated behaviours in mice. Nat Biomed Eng2019;3:114-25)，並將此突變體與如上所述AAV2-ΔHSPG綴合。IL31 K134A::AAV2-ΔHSPG在小鼠中以3E+10 VG皮下注射，且三週後，採集皮膚，進行切片並用抗K14抗體(角質細胞之標誌物)染色。如 圖 14a- 圖 14c所示，吾人觀察到經病毒感染細胞與K14陽性角質細胞之間幾乎100%重疊。重要的是，因為螢光持續時間比小鼠8-10天的表皮周轉時間更長(Potten CS, Saffhill R, Maibach HI. Measurement of the transit time for cells through the epidermis and stratum corneum of the mouse and guinea-pig. Cell Tissue Kinet 1987;20:461-72)，吾人之資料表明表皮幹細胞亦係本實驗的目標。事實上，轉錄體學研究表明IL31RA在毛囊間及毛囊表皮的基底角質細胞中表現，其中許多係表皮幹細胞(Joost S, Zeisel A, Jacob T, Sun X, La Manno G, Lonnerberg P等人 Single-Cell Transcriptomics Reveals that Differentiation and Spatial Signatures Shape Epidermal and Hair Follicle Heterogeneity. Cell Syst 2016;3:221-37 e9)。
為了進一步研究IL31 K134A::AAV2-ΔHSPG基因遞送的選擇性，吾人使用了IL31RA剔除小鼠品系(IL31RA -/-) (Nocchi 2018)。吾人無法在皮下注射IL31 K134A::AAV2-ΔHSPG的IL31RA -/-小鼠中偵測到報導基因tdtomato的任何信號，表明轉導確實係受體特異性的，參見 圖 15a- 圖 15c。 材料及方法 AAV 載體生產
根據實例1中描述的程序製備重組AAV2-ΔHSPG。 IL31 K134A-SNAP 與 AAV2-ΔHSPG 的化學修飾及偶聯
IL31 K134A-SNAP的生產如前所述(Nocchi 2019)。為了表面修飾AAV，經純化AAV2-ΔHSPG與BG-PEG13-NHS (定製合成)以3E+9 VG病毒與1.73 nmol連接子的表觀VG與NHS連接子莫耳比在PBS pH 7.2中在室溫下反應3小時。反應物使用100 KDa MWCO離心過濾器純化，並在室溫下進一步與5 μM IL31 K134A -SNAP一起培育隔夜。藉由通過100 KDa MWCO離心單元兩次來去除過量的未反應之經官能化配位體，並將綴合產物重新懸浮在PBS中。 活體內注射及組織處理
對於活體內注射實驗，野生型或IL31RA -/-小鼠用2-2.5%異氟醚麻醉，接著將10 ul PBS中的3E+10 VG IL31 K134A-SNAP::AAV2-ΔHSPG皮下注射至耳朵中。3週後，採集皮膚，將其在4%多聚甲醛中固定隔夜，並以40 μm切片。切片在4℃下用兔抗K14抗體(Covance 1:200稀釋)在含有5%山羊血清+0.3% Triton-X的PBS中染色隔夜。抗兔Alexa488二級抗體按1:1000稀釋，且在室溫下避光培育2小時。載玻片用prolong gold封固，且影像係用Leica SP5共焦顯微鏡拍攝的，並在ImageJ中進行分析。 結果
Il31被選為靶向配位體，因為其受體IL31RA及OSMR在角質細胞上高度表現，並且其在發炎性瘙癢中起關鍵作用(Furue 2018)。此外，吾人之前生成了一個突變體IL31 K134A，其與IL31RA結合但不經由其傳訊(Nocchi 2019)，並證明此突變體可用於靶向癢覺路徑。
將IL31 K134A::AAV2-ΔHSPG皮下注射至小鼠中，並檢查皮膚切片是否與K14 (角質細胞之標誌物)重疊。如 圖 14a- 圖 14c所示，吾人觀察到經病毒感染細胞及K14陽性角質細胞之間幾乎100%重疊。重要的是，因為螢光持續時間比小鼠8-10天的表皮周轉時間更長(Potten 1987)，吾人之資料表明表皮幹細胞亦係本實驗的目標。事實上，轉錄體學研究表明IL31RA在毛囊間及毛囊表皮的基底角質細胞中表現，其中許多係表皮幹細胞(Joost 2016)。
為了進一步研究IL31 K134A::AAV2-ΔHSPG基因遞送的選擇性，吾人利用了吾人之前生成的IL31RA剔除小鼠品系(IL31RA -/-) (Nocchi 2019)。吾人無法在皮下注射IL31 K134A::AAV2-ΔHSPG的IL31RA -/-小鼠中偵測到來自tdtomato報導基因的任何信號( 圖 15a- 圖 15c)，表明轉導確實係受體特異性的。 實例 6. 使用霍亂毒素 B 毒素次單元靶向 背景
選擇霍亂毒素B次單元(CTB)，因為其係一種經典的逆行示蹤劑，且吾人推斷藉由將其與AAV偶聯，吾人可能能夠實現AAV自神經元末梢轉運回細胞體。野生型AAV血清型逆向轉運的自然傾向很低，且因此基因治療及基礎科學均存在未滿足的需求，要產生能夠沿投射神經元運輸AAV的平台。以前解決此問題的嘗試使用定向進化將逆行功能工程化至AAV2的衣殼中(rAAV2-retro) (Tervo DG等人 A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron2016;92:372-82)。然而，吾人推斷，若CTB (以及可能的任何其他逆行示蹤劑)促進AAV的逆向轉運，則其將允許任何AAV簡單地事後轉導為逆行AAV。 方法
吾人最初在大腸桿菌中生產了CTB-SNAP融合蛋白，但發現SNAP標籤的存在減少了其逆向轉運。因此，吾人購買了未經修飾CTB並用疊氮基-PEG4-NHS酯對其進行了標記。簡而言之，CTB與10倍莫耳當量的疊氮基-PEG4-NHS酯在PBS中在pH 7.2下在室溫下反應3小時。經由用2 kDa MWCO膜透析去除未反應之疊氮基。為了與AAV綴合，將如上製備的經純化AAV2-ΔHSPG與DBCO-PEG4-NHS以3E+9 VG病毒與1.73 nmol連接子的VG莫耳比在PBS pH 7.2中在室溫下反應3小時。使用100 KDa MWCO離心過濾器純化反應物，並在室溫下與5 μM CTB-PEG4-疊氮化物進一步培育隔夜。藉由通過100 KDa MWCO離心單元兩次來去除多餘的未反應之配位體，並將CTB-ΔHSPG-AAV重新懸浮在PBS中。 結果
為了在活體外測試病毒轉導，將100 ul PBS中的1E+9 VG CTB-ΔHSPG-AAV施加至96孔盤中的背根神經節神經元。每天監測螢光，且其通常在24小時後明顯，4天後達至峰值。已知CTB會標記大DRG神經元(假定的機械性受器)，並且實際上CTB-ΔHSPG-AAV轉導大神經元，如 圖 16a所示。
為了測試活體內病毒轉導，將3E+9 VG CTB-ΔHSPG-AAV皮下注射至小鼠中。3週後處死小鼠並採集組織以監測細胞螢光。吾人在坐骨神經的纖維及DRG中的大神經元中觀察到了螢光信號，分別參見 圖 16b及 圖 16c。
在正在進行的實驗中，吾人亦將CTB與野生型AAV2綴合並將其注射至小鼠的腦中。吾人之目的係直接比較CTB-AAV2與野生型AAV2的逆向轉運。 實例 7. 使用凝集素靶向
選擇凝集素係因為其與AAV用於細胞連接的相同細胞表面碳水化合物特異性結合。因此，吾人推斷藉由將凝集素與AAV2-ΔHSPG綴合，吾人可能能夠模擬及改進天然AAV血清型。在最初的實驗中，吾人篩選了幾種凝集素-AAV2-ΔHSPG綴合物在器官型脊髓培養物中的轉導能力。接著吾人選擇了小麥胚芽凝集素(WGA)及同工凝集素B4 (IB4)進行進一步表徵，目的係在未來亦檢查扁豆凝集素(Lens culinaris lectin，Lens)及紫藤凝集素(Wisteria floribunda lectin，WFL)。 一般方法
凝集素與20倍莫耳當量的疊氮基-PEG4-NHS酯在PBS中在pH 7.2下在室溫下反應3小時。使用10 KDa分子MWCO離心過濾器去除未反應之疊氮基。為了表面官能化AAV，將如上製備的經純化AAV2-ΔHSPG與DBCO-PEG4-NHS以3E+9 VG病毒與1.73 nmol連接子的VG與連接子莫耳比在PBS pH 7.2中在室溫下反應3小時。反應物使用100 KDa MWCO離心過濾器純化，並在室溫下進一步與5 μM凝集素-PEG4-疊氮化物一起培育隔夜。藉由通過100 KDa MWCO離心單元兩次來去除過量的未反應之配位體，並將產生的凝集素-ΔHSPG-AAV構築體重新懸浮在PBS中。 實例 7a. 使用 WGA::AAV2-ΔHSPG 靶向 WGA 與 AAV2-ΔHSPG 的化學修飾及偶聯
WGA用20倍莫耳當量的疊氮基-PEG4-NHS酯在pH 7.2的PBS中在室溫下官能化3小時。使用10 KDa分子MWCO離心過濾器去除未反應之反應性連接子。為了表面官能化至AAV，將如上製備的經純化AAV2-ΔHSPG與DBCO-PEG4-NHS以3E+9 VG病毒與1.73 nmol連接子的表觀VG與DBCO-PEG4-NHS莫耳比在PBS pH 7.2中在室溫下反應3小時。反應物使用100 KDa MWCO離心過濾器純化，並在室溫下進一步與5 μM WGA-PEG4-疊氮化物一起培育隔夜。藉由通過100 KDa MWCO離心單元兩次來去除過量的未反應之經官能化配位體，並將產生的WGA-ΔHSPG-AAV構築體重新懸浮在PBS中。
為了在活體外測試病毒轉導，將100 ul PBS中的1E+9 VG WGA::AAV2-ΔHSPG施加至96孔盤中的背根神經節神經元。每天監測螢光，且其在24小時後明顯，4天後達至峰值，參見 圖 17a。WGA::AAV2-ΔHSPG基本上轉導培養皿中的所有細胞。鑒於此明顯高的效率，吾人亦在其他難以轉導的細胞類型(諸如小鼠早期胚胎)中嘗試了WGA::AAV2-ΔHSPG。自小鼠身上解剖出胚細胞，並使其在活體外在含有1.6E+9 VG WGA::AAV2-ΔHSPG的100 ul KSOM培養基中生長。每天監測螢光，且其在24小時後明顯，4天後達至峰值，此時100%的細胞係螢光的，參見 圖 17b。
所有影像均係使用Leica SP5共焦顯微鏡拍攝的，並在ImageJ中進行分析。
為了確定WGA::AAV2-ΔHSPG在小鼠活體內是否靶向周邊神經元，吾人對新生小鼠進行了全身注射。對於新生小鼠的實驗，將1 ul PBS中的1E+9 VG的WGA::AAV2-ΔHSPG注射至P1幼崽的淺顳靜脈中，如前所述(Stoica L, Ahmed SS, Gao G, Sena-Esteves M. Gene transfer to the CNS using recombinant adeno-associated virus. Curr Protoc Microbiol 2013;第14章:單元14D 5)。5週後處死小鼠，且採集皮膚、背根神經節(DRG)及脊髓，並將其固定在4%多聚甲醛中。用ScaleS使皮膚透明，並將其製備成全形包埋樣品，將DRG及脊髓以10 μm切片並封固在載玻片上。
在IV注射1E+9 VG的WGA::AAV2-ΔHSPG的新生小鼠中，吾人在皮膚、DRG及脊髓中的整個周邊神經系統中偵測到了穩健的轉導，但在中樞神經系統中未偵測到。 參見圖 18a- 圖 18c 。吾人在整個周邊神經系統中偵測到穩健的tdTomato螢光，此在皮膚中的神經纖維( 圖 18a)、DRG中的細胞體( 圖 18b)及脊髓中的中央末梢( 圖 18c)中係很明顯的。吾人沒有在中樞神經系統中觀察到螢光，表明WGA::AAV2-ΔHSPG不會穿過血腦障壁。
吾人亦藉由將經修飾病毒注入前額葉皮層並檢查丘腦投射神經元細胞體的螢光來研究WGA::AAV2-ΔHSPG是否在腦中進行逆向轉運。
為了在成年小鼠腦中注射，小鼠用2-2.5%異氟醚麻醉。執行頭剖開術並使用標準立體定位技術在以下座標處將500 nl PBS中的6E+8 VG的WGA::AAV2-ΔHSPG注射至前額葉皮層：M/L=0.500，A/P=-1.700，D/V=-1.8 (Stoica 2013)。5週後，用4%多聚甲醛灌注小鼠，採集腦並製作100 μm的冠狀切片。切片在成像前用DAPI染色。
如在 圖 19a- 圖 19c中可以看出，吾人在注射部位的腦切片( 圖 19a)及丘腦投射神經元的細胞體中( 圖 19b及 圖 19c)偵測到穩健的信號。 實例 7b. 使用 WGA::PHP.S 加強
為了探索使用WGA配位體進行表面官能化是否亦可用於提高合成AAV載體的轉導效率，吾人對PHP.S進行表面官能化，該PHP.S先前已被證明可以有效地轉導DRG神經元。經純化PHP.S如上製備，並與DBCO-PEG4-NHS以1E+9 VG與0.43 nmol、0.87 nmol、1.73 nmol、2.6 nmol或3.47 nmol DBCO-PEG4-NHS的VG:連接子莫耳比在PBS pH 7.2中在室溫下反應3小時。反應物使用100 KDa MWCO離心過濾器純化，並在室溫下進一步與0.1 nmol WGA-PEG4-疊氮化物一起培育隔夜。藉由通過100 KDa MWCO離心單元兩次來去除過量的未反應之官能化WGA，並將產生的WGA-PHP.S構築體重新懸浮在PBS中。接著以100 ul PBS中的1E+9 VG將未經修飾及經修飾的PHP.S施加至DRG神經元。如 圖 20a- 圖 20f所示，當WGA-PHP.S以與未經修飾PHP.S (1E+9 VG)等效的滴度施加至DRG神經元時，轉導效率大幅提高。此在0.43 nmol至3.47 nmol的DBCO-PEG4-NHS莫耳量範圍內很明顯。 實例 7c. 使用 IB4::AAV2-ΔHSPG 靶向
IB4用作DRG中非肽性感覺神經元及中樞神經系統中小神經膠質細胞的周邊脈管系統之標誌物。因此，吾人在小鼠中測試了IB4::AAV2-ΔHSPG的皮下、神經內及脊椎內注射。 IB4 與 AAV2-ΔHSPG 的化學修飾及偶聯
IB4與20倍莫耳當量的疊氮基-PEG4-NHS酯在PBS中在pH 7.2下在室溫下反應3小時。使用10 KDa分子MWCO離心過濾器去除未反應之疊氮基連接子。為了與AAV綴合，經純化AAV2-ΔHSPG與DBCO-PEG4-NHS以3E+9 VG病毒與1.73 nmol連接子的表觀VG與DBCO-PEG4-NHS莫耳比在PBS pH 7.2中在室溫下反應3小時。反應物使用100 KDa MWCO離心過濾器純化，並在室溫下進一步與5 μM IB4-PEG4-疊氮化物一起培育隔夜。藉由通過100 KDa MWCO離心單元兩次來去除過量的未反應之IB4，並將IB4-ΔHSPG-AAV重新懸浮於PBS中。 活體外施加、活體內注射及組織處理
對於培養的感覺神經元的實驗，自小鼠身上採集DRG，並在1 mg/ml膠原酶IV及0.05%胰蛋白酶中各自在37℃下培育25分鐘。將細胞過濾並懸浮在含有DMEM、10%熱不活化胎牛血清、0.8%葡萄糖及100 U青黴素/鏈黴素的培養基中，並鋪塗在用聚L-離胺酸處理過的玻璃蓋玻片上。第二天，去除培養基並將在100 ul PBS中的1E+9 VG IB4::AAV2-ΔHSPG添加至細胞中。2小時後，用培養基替換PBS，且細胞在37℃下保持5天，隨後用Zeiss AxioObserver A1顯微鏡成像。
對於活體內注射實驗，小鼠用2-2.5%異氟醚麻醉，接著經由皮下、神經內或脊椎內途徑注射。對於皮下注射，將10 ul中的3E+10 VG IB4::AAV2-ΔHSPG注射至爪的足底表面。對於神經內注射，將2 ul中的3E+9 VG IB4::ΔHSPG-AAV2注射至坐骨神經中。對於脊椎內注射，將1 ul中的6E+8 VG IB4::ΔHSPG-AAV2注射至腰脊髓中。3週後，採集組織，將其固定在4%多聚甲醛中，在ScaleS中進行透明，並製備為全形包埋樣品。對於神經內注射，脊髓亦以10 µm切片，並如前所述用IB4-488染色(Dhandapani R, Arokiaraj CM, Taberner FJ, Pacifico P, Raja S, Nocchi L等人 Control of mechanical pain hypersensitivity in mice through ligand-targeted photoablation of TrkB-positive sensory neurons. Nature communications2018;9:1640)。影像係用Leica SP5共焦顯微鏡拍攝的，並在ImageJ中進行分析。 結果
在周邊神經系統中，IB4被用作非肽性感覺神經元之標誌物。因此，吾人首先測試了IB4::AAV2-ΔHSPG是否會在活體外轉導此神經元群體。如 圖 21所示，吾人在所培養的DRG神經元中觀察到穩健的tdTomato螢光，此螢光主要侷限於小直徑細胞，表明為非肽性感覺神經元。IB4亦用作周邊脈管系統及中樞神經系統小神經膠質細胞之標誌物。因此，吾人在小鼠中測試了不同的注射途徑，以確定IB4::AAV2-ΔHSPG是否會在活體內靶向此等結構。在皮下注射IB4::AAV2-ΔHSPG後，吾人偵測到血管周圍內皮細胞及平滑肌細胞中的tdTomato表現( 圖 22a)。在將3E+9 VG IB4::ΔHSPG-AAV2注射至左側坐骨神經中後，吾人觀察到DRG中非肽性神經元( 圖 22b)及該等神經元在脊髓中之末梢( 圖 22c)中的螢光。為了確定表現是否與IB4陽性神經元一致，吾人用經螢光標記IB4-488染色脊髓切片。如 圖 22c所示，在同側脊髓中，吾人觀察到經IB4::ΔHSPG-AAV2轉導神經元與IB4-488染色之間有明顯的重疊，而在對側脊髓中則沒有。最後，在將IB4::ΔHSPG-AAV2注射至脊髓中後，吾人偵測到tdTomato在小神經膠質細胞中的穩健表現( 圖 22d)。 實例 7d. 使用 IB4::AAV2-HSPG 及 IB4::AAV9-HSPG 大幅加強 方法 AAV 生產
具有GFP承載物的重組AAV2及AAV9分別在SF21或HEK293中產生，如前所述(Grieger 2006及Wu 2018)。感染後5天採集細胞，用0.5%的Triton X-100裂解，用核酸酶處理，藉由切向流過濾濃縮，並使用等密度 超速離心純化(Dias Florencio G, Precigout G, Beley C, Buclez PO, Garcia L, Benchaouir R. Simple downstream process based on detergent treatment improves yield and in vivotransduction efficacy of adeno-associated virus vectors. Mol Ther Methods Clin Dev2015; 2:15024)。使用Q-PCR進行載體基因體滴定，引子靶向病毒承載物的啟動子區域(Grieger 2006)。 IB4 與 AAV2 或 AAV9 的化學修飾及偶聯
IB4與20倍莫耳當量的疊氮基-PEG4-NHS酯在PBS中在pH 7.2下在室溫下反應3小時。使用10 KDa分子MWCO離心過濾器去除未反應之疊氮基連接子。為了與AAV綴合，經純化AAV2或AAV9與DBCO-PEG4-NHS以3E+9 VG病毒與1.73 nmol連接子的表觀VG與DBCO-PEG4-NHS莫耳比在PBS pH 7.2中在室溫下反應3小時。反應物使用100 KDa MWCO離心過濾器純化，並在室溫下進一步與5 μM IB4-PEG4-疊氮化物一起培育隔夜。藉由通過100 KDa MWCO離心單元兩次來去除過量的未反應之IB4，並將IB4-AAV2或IB4-AAV9重新懸浮在PBS中。 活體外施加至 PC12 細胞
PC12細胞在含有5%馬血清、5%胎牛血清及100 U青黴素/鏈黴素的DMEM/F12培養基中在37℃下培養。將各種濃度的野生型AAV2、野生型AAV9、IB4-AAV2或IB4-AAV9與PC12細胞一起在PBS中培育2小時。接著，更換培養基，並將細胞在37℃下保持5天，隨後在4% PFA中固定，用DAPI標記並用Zeiss AxioObserver A1顯微鏡成像。藉由量測每個DAPI陽性細胞中之GFP螢光並繪製每個滴度的平均值+/-SEM來分析影像。 結果
PC12細胞難以使用野生型AAV血清型(諸如AAV2或AAV9)進行轉導。因此，吾人詢問AAV2或AAV9與IB4的綴合是否會增加此種細胞類型中的AAV轉導效率。如 圖 23之曲線圖及 圖 24a- 圖 24f之影像所示，吾人無法在用自2E+7至5E+9 VG的任何濃度下的AAV2處理的細胞中偵測到GFP螢光。然而，IB4與AAV的綴合大幅提高了轉導效率( 圖 24g- 圖 24l)，使得散佈之GFP陽性細胞在5E+8 VG下很明顯並且在5E+9 VG下此轉導效率增加至效率超過80%。此等值的量化(量測為所有細胞之GFP螢光強度)揭露出，在5E+8 VG下，IB4與AAV2的綴合使效率提高了15倍，而在1E+9 VG下，效率提高了38倍，而在5E+9 VG下，效率提高了104倍。
類似地，使用野生型AAV9在任何濃度下均未偵測到經處理之PC12細胞中之GFP螢光，參見 圖 25曲線圖及 圖 26a- 圖 26f。相比之下，經IB4-AAV9處理細胞在5E+8 VG的濃度下表現出愈來愈多數目的GFP陽性細胞，並且在5E+9 VG下效率較高，參見 圖 25曲線圖及 圖 26g- 圖 26l。值得注意的是，在用1E+9 VG處理之PC12細胞中，與野生型相比，IB4與AAV9的綴合將效率提高了9倍，而在5E+9 VG下，效率提高了84倍。 實例 8. 連接子長度對轉導效率的影響 方法 AAV 生產
根據實例1中描述的程序製備重組AAV2-ΔHSPG。 IB4 與 AAV2-ΔHSPG 的化學修飾及偶聯
IB4 (8.8 nmol)與20倍莫耳當量的疊氮基-PEGn-NHS酯(176 nmol)在PBS中在pH 7.2下在室溫下反應3小時。使用10 KDa分子MWCO離心過濾器去除未反應之疊氮基。為了與AAV綴合，6E+12經純化AAV2-ΔHSPG與0.17 nmol、0.52 nmol、1.73 nmol或5.2 nmol DBCO在PBS pH 7.2中在室溫下反應3小時。反應物使用100 KDa MWCO離心過濾器純化，並在室溫下進一步與0.1 nmol IB4-PEG4-疊氮化物一起培育隔夜。藉由通過100 KDa MWCO離心單元兩次來去除過量的未反應之IB4，並將經修飾AAV重新懸浮在PBS中。
研究了表2中的以下連接子組合(及分子的商業來源)：
表 2
疊氮基-PEGn-NHS (L) DBCO-PEGn-NHS (V) 總 PEGn GFP 螢光影像
無間隔子 0 (來自 Thermo) 0 (來自 Sigma) 0 圖 26a- 圖 26d
短 2 (來自 Broadpharm) 1 (來自 Broadpharm) 3 圖 27a- 圖 27d
中等 4 (來自 Thermo) 4 (來自 Sigma) 8 圖 28a- 圖 28d
長 8 (來自 Sigma) 8 (來自 Broadpharm) 16 圖 29a- 圖 29d
活體外施加至 PC12 細胞
PC12細胞在含有5%馬血清、5%胎牛血清及100 U青黴素/鏈黴素的DMEM/F12培養基中在37℃下培養。以不同的莫耳比及不同的連接子長度綴合的IB4::AAV2-ΔHSPG顆粒與PC12細胞一起在PBS中培育2小時。接著，更換培養基，並將細胞在37℃下保持5天，隨後在4% PFA中固定，用DAPI標記並用Zeiss AxioObserver A1顯微鏡成像。藉由量測每個DAPI陽性細胞中之GFP螢光並繪製每個滴度的平均值+/-SEM來分析影像。參見 圖 30。 結果及解釋
在此等實驗中，吾人研究了連接子長度(亦即沒有乙二醇單體間隔子)對轉導效率的影響。吾人選擇PC12細胞作為目標細胞株係因為其難以使用標準AAV載體進行轉導(由此降低背景)，而選擇IB4作為靶向配位體係因為其與此等細胞結合牢固。吾人對4種不同的連接子長度進行了實驗，並使用一系列莫耳比量測了每個連接子的效率。此處的理由係每個連接子可能與病毒或配位體的反應不同，並且藉由使用一系列修飾比率，吾人將能夠捕捉到反應效率的任何變化，且最終捕捉到最終構築體之轉導效率。
藉由查看 圖 31中繪製的資料，很明顯，在AAV及配位體之間沒有間隔子對轉導效率有很強的負面影響。很少有細胞被用0.17 nmol、0.52 nmol及1.73 nmol NHS-DBCO產生的經表面修飾衣殼轉導，且只有在5.2 nmol時吾人才能觀察到明顯的感染。此很有趣，因為其表明即使在配位體與病毒之間沒有任何間隔子，仍然可以轉導細胞。然而，此需要相對於AAV較高濃度的NHS-DBCO來製備構築體。不受理論束縛，一種可能性係靶向配位體-疊氮化物與AAV-DBCO之間的交聯反應可能受到空間位阻的限制，並且反應進行需要DBCO基團在病毒上的最佳沈積。總PEGn=3 PEG短間隔子比根本沒有間隔子表現得更好，但同樣在低莫耳比(0.17 nmol)下效率降低。有趣的是，在更高的修飾比率下，此間隔子長度的表現略好於所有其他長度。當以3E+9 VG病毒與0.17 nmol連接子的AAV:配位體莫耳比生產時，具有中等(n=8)及長(n=16)間隔子的構築體表現相似，並顯示出更高的轉導效率。此等資料表明，在此範圍內增加間隔子長度會提高轉導效率，尤其在次最佳修飾比率下。 實例 9. PEG 連接子的大小限制
研究了包含離散PEG (dPEG)及分散PEG (pPEG)間隔子的AAV構築體在PC12細胞中對AAV轉導效率的影響，提供了各種連接子長度。為此，吾人藉由組合以下各者用WGA配位體對AAV2ΔHSPG衣殼進行表面修飾：(i)用選自DBCO-PEGn-NHS (其中n為4、12、約45 (dPEG 2K)、約114 (dPEG 5K)、約228 (dPEG 10K)、約682 (dPEG 30K)或DBCO-PEGn-TFP (其中n為24)的衣殼反應性連接子官能化的衣殼，與(ii)用配位體反應性連接子，亦即疊氮化物-PEGn-NHS (其中n為4、12、24或約114 (dPEG 5K))官能化的WGA配位體。表3中進一步說明了對應於所研究的各種連接子/PEG間隔子的構築體，其中衣殼反應性連接子為DBCO-PEGn-NHS，除非另用「TFP」指示。 表 3-用存在於配位體反應性連接子(L)及衣殼反應性連接子(V)上的各種PEGn間隔子製備的經表面修飾病毒構築體
   圖 32:    PEGn (L) PEGn (V) 總長度(乙二醇單體的數目) (加下劃線時為近似值)
a dPEG4+dPEG4 4 4 8
b dPEG12+dPEG4 12 4 16
c dPEG24+dPEG4 24 4 28
d dPEG4+dPEG12 4 12 16
e dPEG12+dPEG12 12 12 24
f dPEG24+dPEG12 24 12 36
g dPEG4+dPEG24 4 24 (TFP) 28
h dPEG12+dPEG24 12 24 (TFP) 36
i dPEG24+dPEG24 24 24 (TFP) 48
j dPEG4+pPEG2K 4 2KD (45)* 49
k dPEG4+pPEG5K 4 5KD (114)* 118
l dPEG4+pPEG10K 4 10KD (228)* 232
m dPEG4+pPEG30K 4 30KD (682)* 686
n pPEG5K+dPEG4 5KD (114)* 4 118
o pPEG5K+pPEG2K 5KD (114)* 2KD (45)* 159
p pPEG5K+pPEG5K 5KD (114)* 5KD (114)* 228
q pPEG5K+pPEG10K 5KD (114)* 10KD (228)* 342
r pPEG5K+pPEG30K 5KD (114)* 30KD (682)* 796
*多分散PEG大小以平均分子量的形式提供。括號內係乙二醇單體的相應平均數。 方法
根據實例1中描述的程序製備重組AAV2-ΔHSPG。 WGA 與具有不同連接子的 AAV2ΔHSPG 的化學修飾及偶聯
WGA (1.7 nmol)藉由與20倍莫耳當量的配位體反應性連接子疊氮化物-PEGn-NHS (54 nmol) (其中n為4、12或24)在100 ul PBS中在pH 7.2下在室溫下反應3小時而被官能化。使用10 KDa分子MWCO離心過濾器去除未反應之連接子。為了將經官能化配位體與AAV綴合，首先為每個衣殼反應性連接子製備經表面官能化AAV衣殼：DBCO-PEGn-NHS (其中n為4、12或24)及DBCO-PEGn-TFP (其中n為4，12或24)。每個衣殼/配位體構築體的轉導效率藉由以一系列的衣殼與配位體比率製備每個構築體來最佳化。具體而言，藉由將3E+9 VG經純化AAV2ΔHSPG與0.17 nmol、0.52 nmol、1.73 nmol及5.2 nmol所選擇的反應性連接子在PBS pH 7.2中在室溫下反應3小時來製備每個經表面官能化AAV衣殼。接下來，將每個獲得的經表面官能化衣殼與0.1 nmol WGA-PEGn-疊氮化物(經官能化靶向配位體)在室溫下培育一小時，並在4℃下培育隔夜，以獲得各種WGA-AAV2ΔHSPG表面修飾構築體。 活體外施加至 PC12 細胞
PC12細胞在含有5%馬血清、5%胎牛血清及100 U青黴素/鏈黴素的DMEM/F12培養基中在37℃下培養。PC12細胞與3E+9 VG的各種WGA-AAV2ΔHSPG構築體一起在PBS中培育2小時。接著，更換培養基，並將細胞在37℃下保持5天，用Hoechst標記，並用Zeiss AxioObserver A1顯微鏡成像。藉由量測每個Hoechst陽性細胞中之GFP螢光並繪製每個滴度的平均值+/-SEM來分析影像。 結果
總之， 圖 32- 圖 36中所示的資料表明，用於修飾病毒的PEG連接子的大小對於控制以達成所需的轉導效率加強而言很重要，並且在圍繞PEG12的所測試系統中似乎係最佳的。在配位體方面，更長的連接子似乎係可以容忍的，包括分散PEG 5000，但並不理想。
圖 32a- 圖 32s係用每種製備的WGA-AAV2ΔHSPG表面修飾構築體處理的Hoechst標記之PC12細胞之影像。如 圖 32a- 圖 32s及 圖 33- 圖 36中所示，在實驗中獲得最亮的影像，表明最有效的轉導，其中連接子包含具有在4-24 (或4-12)範圍內的「n」的各種PEG長度(亦即乙二醇單體)且其中整個連接子包含總「n」為8至24 (或8-16)的PEG單元。最佳組合係病毒上的DBCO-PEG4及配位體上的疊氮化物-PEG4 (總n=8) ( 圖 32a)，接著係病毒上的DBCO-PEG12及配位體上的疊氮化物-PEG4 (總n=16) ( 圖 32d)，病毒上的DBCO-PEG4及配位體上的疊氮化物-PEG12 (總n＝8) ( 圖 32b)，以及病毒上的DBCO-PEG12及配位體上的疊氮化物-PEG12 (總n＝24) ( 圖 32e)。使用顯示一些信號的分散PEG的唯一條件係WGA-疊氮化物-PEG 5000與病毒中的DBCO-PEG4反應( 圖 32n)。離散PEG 4L+4V及12L+12V組合的表現明顯好於更長的分散pPEG。
圖 33及 圖 34進一步證實了用AAV2ΔHSPG病毒構築體處理之PC12細胞的個別及平均(分別)細胞轉導效率的加強，該等病毒構築體表面用WGA修飾，具有離散PEG連接子間隔子(亦即乙二醇單體)，其中總n (病毒衣殼與配位體之間形成的連接子中的PEG單體的總和)在8與24之間。
圖 35及 圖 36比較了所選離散及分散PEG組合與未經修飾病毒的平均轉導效率。在 圖 35中，可以看出離散PEG 4L+4V及12L+12V組合明顯優於更長的分散PEG間隔子。 圖 36只關注表現最差的離散及分散PEG組合。有趣的是，只有5KL+4V的表現優於對照，此表明連接子病毒側有限的間隔子長度可能有助於獲得所需的加強轉導，而連接子配位體側的間隔子長度可能更適合使用更長的間隔子。 實例 10. DBCO- 疊氮化物交聯劑反應性成對對於 WGA-AAV2ΔHSPG 構築體表現最佳
除了吾人已經探索過的DBCO-疊氮化物化學之外，吾人接下來研究了不同的連接子化學是否會提高PC12細胞中的AAV轉導效率。為此，吾人使用TCO/四𠯤連接以及分別經由史陶丁格連接反應的膦-NHS/疊氮化物交聯劑反應性成對製備了AAV2ΔHSPG-WGA構築體。
TCO/四𠯤連接化學基於反式環辛烯及四𠯤反應對之間的逆需求狄耳士-阿德爾環加成反應，形成二氫嗒𠯤鍵，並且已知具有任何其他生物正交連接對所無法比擬的超快動力學(＞800 M-1s-1)。
NHS-疊氮化物及NHS-膦雙官能連接子包含NHS酯，其具有胺反應性並適用於衍生蛋白質的一級胺。一旦蛋白質(衣殼或配位體)被疊氮或膦官能化，兩種組分就會混合以實現有效及穩定的綴合。膦基團經由史陶丁格反應與疊氮化物反應生成氮雜-偶極體中間體，該中間體被捕獲以形成穩定的共價醯胺鍵。 方法
根據實例1中描述的程序製備重組AAV2-ΔHSPG。
為了製備此等實驗中使用的經官能化靶向配位體，在DMSO中製備四𠯤-PEG5-NHS及疊氮基-PEG4-NHS的150 mM儲備溶液。WGA (27 uM，1 mg/ml)與20倍莫耳當量的四𠯤-PEG5-NHS (540 uM)或疊氮基-PEG4-NHS (540 uM)在pH 7.2的PBS中在室溫下反應3小時。使用10 KDa分子MWCO離心過濾器去除未反應之連接子。
為了製備用於此等實驗的經表面官能化病毒衣殼：在DMSO中製備20 mM TCO-PEG4-NHS或膦-NHS儲備溶液。為了表面修飾AAV衣殼，將3E+9 VG經純化AAV2ΔHSPG與0.17 nmol、0.52 nmol、1.73 nmol及5.2 nmol TCO-PEG4-NHS或膦-NHS在20 ul PBS pH 7.2中在室溫下反應3小時。接著將經TCO或Phos表面修飾AAV分別與0.1 nmol的WGA-PEG5-四𠯤或WGA-PEG4-疊氮化物在室溫下培育一小時，接著在4℃下培育隔夜。 活體外施加至 PC12 細胞
PC12細胞在含有5%馬血清、5%胎牛血清及100 U青黴素/鏈黴素的DMEM/F12培養基中在37℃下培養。PC12細胞與以上述各種AAV:連接子比率製備的WGA-AAV2ΔHSPG構築體一起在PBS中培育2小時。接著，更換培養基，並將細胞在37℃下保持5天，用Hoechst標記，並用Zeiss AxioObserver A1顯微鏡成像。藉由量測每個Hoechst陽性細胞中之GFP螢光並繪製每個滴度的平均值+/-SEM來分析影像。 結果
如 圖 37a- 圖 37f及 圖 38- 圖 39中所示，在用使用TCO/四𠯤連接與WGA綴合的AAV2ΔHSPG處理的細胞中偵測到非常低水準的tdTomato螢光，表明轉導效率低下。在用使用膦-NHS/疊氮化物與WGA綴合的AAV2ΔHSPG處理的細胞中，轉導稍微明顯( 圖 40a- 圖 40d及 圖 41- 圖 42)；然而，與未經修飾AAV2ΔHSPG相比，觀察到的轉導僅略有改善( 圖 37e及 圖 40e)。顯示最高轉導效率的化學修飾仍然係使用DBCO-疊氮化物交聯劑反應性成對製備的AAV構築體( 圖 37f及 圖 40f)。 實例 11. AAV 顆粒的定量及病毒表面的化學修飾背景
為了量化AAV衣殼的表面修飾程度，吾人使用了具有已知衣殼濃度的標準AAV9 (自Innovavector購買)。使用此標準物，吾人接著使用兩種策略量化修飾的程度：(1)吾人使NHS-PEG4-DBCO與病毒反應，並根據DBCO發色團的吸光度計算每個衣殼的DBCO分子數目。接著吾人將WGA-PEG4-疊氮化物與經修飾AAV9綴合，並根據DBCO吸光度的降低，計算每個衣殼的配位體數目。(2)吾人將經螢光標記疊氮基配位體(WGA-SNAP-TMR-PEG4-疊氮化物)與病毒綴合，再次使用吸光度量測，評估每個病毒的配位體數目。 方法 AAV9 用 DBCO 修飾，接著與 WGA 疊氮基交聯
3.6E+10 VG AAV9與終體積為97 ul的52 nmol DBCO-PEG4-NHS在振盪器上在室溫下一起培育3小時。選擇此量的連接子係因為其在與AAV9綴合並施加至PC12細胞時提供了最佳的轉導效率。
為了用WGA-疊氮基配位體修飾病毒，將2.8 nmol WGA與20倍莫耳當量的疊氮基-PEG4-NHS酯(56 nmol)在最終體積為100 ul的PBS中在pH 7.2下在室溫(RT)下反應3小時。隨後，使用10 KDa分子MWCO離心過濾器去除未反應之疊氮基團。之後，加入242.5 nmol WGA-疊氮基並在室溫下培育1小時。修飾後，使用含Pluronic F68 0.001% NaCl 200 mM的PBS及100 KDa分子MWCO沖洗樣品三次，以去除多餘的未結合試劑。自管柱中收集的20 ul藉由高速真空濃縮並重新懸浮於10 ul Pluronic F68 0.001% NaCl 200 mM PBS中。除了與WGA-疊氮基反應之外，吾人亦有另外兩組：1)單獨的AAV9及2)僅與DBCO一起培育的AAV9。為了糾正反應及淨化過程中病毒的損失，使用5 ul樣品進行ddPCR分析。 評估 PEG4-DBCO 及 WGA-PEG4- 疊氮基對病毒的化學修飾程度
在307 nm波長處量測吸光度，此係嵌入DBCO中的發色團的吸光度峰值。AAV9-PEG4-DBCO與WGA-PEG4-疊氮基之間的反應會導致DBCO中存在的發色團丟失，因此與樣品PEG4-DBCO及PEG4-DBCO+WGA-PEG4-疊氮化物中PEG4-DBCO分子總數的差異應提供與病毒結合的配位體分子的數目。
原始資料處理如下： ●使用吸光度相對於PEG4-DBCO濃度的標準曲線，根據樣品吸光度計算PEG4-DBCO分子總數(針對單獨的AAV9的吸光度及反應淨化後未反應之NHS-PEG4-DBCO的殘留吸光度進行校正)； ●藉由用總DBCO分子數除以總衣殼數來計算每個衣殼上的PEG4-DBCO分子數目； ●藉由自僅樣品PEG4-DBCO中減去樣品PEG4-DBCO+WGA-PEG4-疊氮基中存在的PEG4-DBCO分子數目，計算與病毒結合的配位體分子數目。 用經螢光標記配位體修飾病毒
為了用經螢光標記配位體修飾病毒，將2.8 nMol的WGA-SNAP與20倍莫耳當量的疊氮基-PEG4-NHS酯(56 nMol)在最終體積為100 ul的PBS中在pH 7.2下在室溫(RT)下反應3小時。使用10 KDa分子MWCO離心過濾器去除未反應之疊氮基。接著將螢光BG-四甲基玫瑰紅(BG-TMR，來自NEB)以等莫耳濃度與WGA-SNAP疊氮基在室溫下培育1小時以獲得WGA-SNAP-TMR-PEG4-疊氮化物。
為了用WGA-SNAP-TMR-PEG4-疊氮化物修飾病毒，將3.6E+10 VG AAV9與最終體積為97 ul的52 nmol DBCO-PEG4-NHS在振盪器上在室溫下培育3小時。之後，加入242.5 nmol的WGA-SNAP-TMR-PEG4-疊氮化物並在室溫下培育1小時。作為對照，吾人使用1)單獨的AAV9；2)僅與TMR-WGA-疊氮基一起培育且沒有任何DBCO-PEG4-NHS連接子的AAV9；3)與WGA-疊氮基一起培育的AAV9。修飾後，使用含Pluronic F68 0.001% NaCl 200 mM的PBS及100 KDa分子MWCO沖洗樣品三次，以去除多餘的未結合試劑。收集自管柱收集的20 ul用於吸光度量測及ddPCR分析。
評估每個AAV9衣殼的螢光配位體數目。 ●吸光度係在544 nm波長處量測的，此係TMR的吸光度峰值。原始資料處理如下： ●自AAV9-PEG4-DBCO::WGA-SNAP-TMR-PEG4-Azide的總吸光度值減去單獨的AAV9的吸光度值，根據TMR的吸光度及消光係數計算TMR分子總數； ●計算衣殼上TMR分子(由此配位體分子)的數目，將總TMR分子數除以總衣殼數； 結果
基於DBCO的吸光度，吾人計算出每個病毒的PEG4-DBCO分子數約為210，而WGA-PEG4-疊氮化物配位體的數目約為每個衣殼150個分子( 圖 43)。根據螢光WGA-SNAP-TMR-PEG4-疊氮化物的量測，吾人估計配位體的數目為每個衣殼170個分子( 圖 44)。用此兩種策略獲得的數字符合此一事實，亦即最豐富的AAV衣殼蛋白VP3 (每個病毒粒子50個VP3拷貝)暴露了10個離胺酸，此意味著對於連接子DBCO-PEG4-NHS，因此對於配位體大約有500個結合位點。 實例 12. 臨床相關衣殼的感染性增加 方法 AAV 生產
具有GFP承載物的重組AAV3及AAV8購自Innovavector，而具有tdTomato承載物的AAV5購自Addgene (質體#59462)。在HEK293T中生產具有tdTomato承載物的AAV6，如前所述(Grieger 2006，Wu 2018)。感染後5天採集細胞，用0.5%的Triton X-100裂解，用核酸酶處理，藉由切向流過濾濃縮，並使用等密度超速離心純化(Dias 2015)。使用Q-PCR進行載體基因體滴定，引子靶向病毒承載物的啟動子區域(Grieger 2006)。 WGA 與 AAV3 、 AAV5 、 AAV6 及 AAV8 的化學修飾及偶聯
WGA (1.7 nmol)與20倍莫耳當量的疊氮基-PEG4-NHS反應性連接子(54 nmol)在100 ul PBS中在pH 7.2下在室溫下反應3小時以產生官能化的靶向WGA配位體。使用10 KDa分子MWCO離心過濾器去除未反應之反應性連接子。為了與AAV綴合，將3E+9 VG的每種經純化AAV3、AAV5、AAV6及AAV8與0.17 nmol、0.52 nmol、1.73 nmol及5.2 nmol DBCO-PEGn-NHS在20 ul PBS pH 7.2中在室溫下反應3小時，以確定最佳化的衣殼與連接子比率，從而形成經表面官能化病毒衣殼。接著將每種獲得的經表面官能化病毒衣殼產物與0.1 nmol WGA-PEG4-疊氮化物在室溫下培育一小時並在4℃下培育隔夜以產生相應的經WGA表面修飾病毒衣殼。 活體外施加至 PC12 細胞
PC12細胞在含有5%馬血清、5%胎牛血清及100 U青黴素/鏈黴素的DMEM/F12培養基中在37℃下培養。PC12細胞與3E+9 VG的每種如上所述製備的經WGA表面修飾病毒衣殼產物一起在PBS中培育2小時。接著，更換培養基，並將細胞在37℃下保持5天，隨後在4% PFA中固定，用DAPI標記並用Zeiss AxioObserver A1顯微鏡成像。藉由量測每個DAPI陽性細胞中之GFP螢光並繪製每個滴度的平均值+/-SEM來分析影像。 結果
使用AAV3、AAV6及AAV8等野生型AAV血清型很難轉導PC12細胞。因此，吾人詢問將此等AAV血清型與WGA綴合後，與未經修飾野生型病毒相比，是否會增加此種細胞類型中的AAV轉導效率，加強病毒感染。如 圖 45a、 圖 51a及 圖 54a所示，吾人無法在用未經修飾野生型AAV血清型AAV3、AAV6及AAV8處理的細胞中偵測到GFP或RFP/tdTomato螢光。相比之下，用WGA對血清型AAV3、AAV6及AAV8進行表面修飾大幅提高了轉導效率( 圖 45b- 圖 45e、 圖 46- 圖 47、 圖 51b- 圖 51e、 圖 52- 圖 53、 圖 54b- 圖 54e及 圖 55- 圖 56)，使得經轉導陽性細胞對於在不同反應性連接子莫耳量下的所有血清型均係明顯的。
用野生型AAV5處理之PC12細胞顯示出比AAV3、AAV6及AAV8更高的轉導水準( 圖 48a)。根據本發明之WGA對AAV5的表面修飾顯著提高了轉導效率( 圖 48b- 圖 48e)。對於用不同莫耳量的反應性連接子製備的所有經表面修飾病毒衣殼產物，細胞表現出數目遞增的tdTomato陽性細胞( 圖 49- 圖 50)。 實例 13.AAVR 對經修飾載體內化的要求 方法 AAVR KO HEK293 細胞的產生
使用CRISPR-Cas9技術剔除HEK293細胞中的AAV受體(AAVR)基因(KIAA0319L)。簡而言之，用含有嘌呤黴素及潮黴素選擇卡匣的spCas9及gRNA (ATAGGTGTAACTACGTCACT) (SEQ ID NO: 1)質體轉染HEK293細胞。細胞在含有嘌呤黴素及潮黴素的HEK293培養基中生長。擴增後，AAVR2剔除(KO) HEK293細胞在感染AAV2 eGFP後藉由螢光活化細胞分選(FACS)進行選擇。eGFP螢光陰性的細胞在嘌呤黴素及潮黴素培養基中被富集及進一步擴增。HEK293細胞用AAV2 eGFP感染，用FACS純化，且總共擴增四次。 WGA 與 AAV2 的表面修飾及交聯
靶向配位體WGA (1.7 nmol)與20倍莫耳當量的反應性連接子疊氮化物-PEG4-NHS (54 nmol)在100 ul PBS中在pH 7.2下在室溫下反應3小時以形成經官能化靶向配位體。使用10 KDa分子MWCO離心過濾器去除未反應之反應性連接子。為了將經官能化靶向配位體與AAV2綴合，將1E+9 VG經純化AAV2與0.17 nmol DBCO-PEG4-NHS在20 ul PBS pH 7.2中在室溫下反應3小時。將獲得的經表面官能化病毒衣殼與0.1 nmol WGA-PEG4-疊氮化物在室溫下培育一小時，並在4℃下培育隔夜，以產生「WGA-AAV2」表面修飾病毒衣殼。 活體外施加至 AAVR KO HEK293 細胞
WGA-AAV2或未經修飾AAV2以1E+9 VG的滴度添加至AAVR KO HEK293中。轉導後5天，使用ImageJ開放原碼軟體對細胞進行成像及量化。 結果
在此等實驗中，吾人希望研究根據本發明進行表面修飾的AAV載體是否可以繞過AAVR受體對細胞進入及轉導的要求。為了實現此點，吾人生成了其中AAVR基因經缺失的HEK293細胞株。在正常HEK293細胞中，吾人觀察到AAV2的穩健轉導，如FACS分析( 圖 57)及顯微鏡檢查( 圖 58a)所示。在AAVR KO HEK293細胞中，AAV2 tdTomato的轉導急劇減少( 圖 58b)。
吾人進一步研究了配位體WGA是否足以挽救AAV2進入AAVR KO細胞。吾人發現，與對照(AAV2未經修飾)相比，WGA-AAV2感染導致tdTomato陽性細胞的百分比及平均螢光強度(MFI)的數值顯著更高( 圖 59a- 圖 59b及 圖 60a- 圖 60b)。此表明即使在沒有AAVR的情況下，用WGA修飾AAV2亦能使載體進入細胞，此表明其繞過了AAVR介導的內化。 實例 14. 使用奈莫利珠單抗 -SNAP-AAV2ΔHSPG 的 ScFv 靶向 方法 AAV 生產
根據實例1中描述的程序製備重組AAV2-ΔHSPG。 奈莫利珠單抗 -SNAP 的生產
奈莫利珠單抗的胺基酸序列獲自IMGT/3D結構資料庫(http: //imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/details.cgi?pdbcode=10064) (SEQ ID NO: 2)。合成含有上游GP64信號序列及下游Sortag、SNAP-標籤及6×His標籤的相應DNA (SEQ ID NO. 3)，如( 圖 61)所示。使用桿狀病毒表現系統將其選殖至pFastBac中進行生產。蛋白質使用標準方法在SF9昆蟲細胞中生產，並使用親和層析自細胞培養基中純化。 AAV2-ΔHSPG 與奈莫利珠單抗 -SNAP 的表面修飾及交聯
3E+10 VG經純化AAV2-ΔHSPG與17.3 nmol BG-PEG13-NHS (定製合成)在200 μl PBS pH 7.2中在室溫下反應3小時以產生BG官能化病毒衣殼。反應物使用100 KDa MWCO離心過濾器純化，並在室溫下進一步與1 nmol奈莫利珠單抗-SNAP官能化配位體一起培育隔夜，以產生「奈莫利珠單抗-SNAP::AAV2-ΔHSPG」表面修飾病毒衣殼。藉由通過100 KDa MWCO離心單元兩次來去除過量未反應之配位體，並將經表面修飾病毒衣殼重新懸浮於PBS中。 活體內注射及組織處理
對於活體內注射實驗，野生型小鼠用2-2.5%異氟醚麻醉，接著將10 ul PBS中的3E+10 VG奈莫利珠單抗-SNAP::AAV2-ΔHSPG皮下注射至耳朵中。3週後，採集皮膚，將其在4%多聚甲醛中固定隔夜，並以40 μm切片。切片在4℃下用兔抗K14 (Covance 1:200稀釋)在含有5%山羊血清+0.3% Triton-X的PBS中染色隔夜。抗兔Alexa488二級抗體按1:1000稀釋，且在室溫下避光培育2小時。載玻片用prolong gold封固，且影像係用Leica SP5共焦顯微鏡拍攝的，並在ImageJ軟體中進行分析。 結果
奈莫利珠單抗被選為scFv，因為其對IL31RA受體具有特異性，並且在中度至重度異位性皮膚炎的臨床試驗中顯示出一定的前景(1)。將奈莫利珠單抗-SNAP::AAV2-ΔHSPG皮下注射至小鼠中，並檢查皮膚切片是否與K14 (角質細胞之標誌物)重疊。如 圖 62a、 圖 62b及 圖 62c中所示，吾人觀察到經病毒感染細胞與毛囊周圍的K14陽性角質細胞之間存在大量重疊。重要的是，因為螢光持續時間比小鼠8-10天的表皮周轉時間更長(2)，吾人之資料表明表皮幹細胞亦係本實驗的目標。事實上，轉錄體學研究表明IL31RA在毛囊間及毛囊表皮的基底角質細胞中表現，其中許多係表皮幹細胞(3)。 參考文獻 1. Nemoto O, Furue M, Nakagawa H, Shiramoto M, Hanada R, Matsuki S等人 The first trial of CIM331, a humanized antihuman interleukin-31 receptor A antibody, in healthy volunteers and patients with atopic dermatitis to evaluate safety, tolerability and pharmacokinetics of a single dose in a randomized, double-blind, placebo-controlled study. The British journal of dermatology 2016;174:296-304 2. Potten CS, Saffhill R, Maibach HI. Measurement of the transit time for cells through the epidermis and stratum corneum of the mouse and guinea-pig. Cell Tissue Kinet 1987;20:461-72 3. Joost S, Zeisel A, Jacob T, Sun X, La Manno G, Lonnerberg P等人 Single-Cell Transcriptomics Reveals that Differentiation and Spatial Signatures Shape Epidermal and Hair Follicle Heterogeneity. Cell Syst 2016;3:221-37 e9 實例 15. 對免疫隱蔽性——逃脫中和抗體的研究
識別AAV衣殼蛋白的中和抗體係AAV介導的基因治療的主要障礙。目前，即使係低滴度的抗AAV中和抗體測試呈陽性的患者亦被排除在使用AAV作為基因治療載體的臨床試驗之外。由於大約50%的群體自小就具有抗AAV的中和抗體，因此藉由擴大符合條件的患者池，找到一種逃脫/規避體液免疫之方法將獲得顯著的益處。目前該領域的很多研究均集中在免疫逃脫之態樣(Wang M等人 Prediction of adeno-associated virus neutralizing antibody activity for clinical application. Gene Ther. 2015年12月; 22(12):984-92.)。吾人假設用本文描述的反應性連接子、或連接子及配位體一起，對AAV進行表面修飾可能導致中和抗體的識別降低。
在活體外研究了以下各者對AAV體液免疫的影響：(i)用不同量的反應性連接子使病毒官能化，及(ii)僅在病毒側或在配位體及病毒兩側的連接子長度。為了測試第一者，測試了人類IgG對野生型AAV2的結合及中和，該野生型AAV2被不同莫耳量的具有固定長度間隔子的連接子官能化，但沒有配位體。對於第二者，亦測試了人類IgG對AAV2的結合及中和，該AAV2被固定量的離散PEG (dPEG)及分散PEG (pPEG)間隔子官能化，並且未綴合或綴合至亦用固定量的離散PEG (dPEG)及分散PEG (pPEG)間隔子官能化的WGA。在對野生型AAV2感染具有不同允許性的細胞株或初生細胞上測試中和作用。 材料 AAV 載體
在HEK293T細胞中產生了具有tdtomato承載物的重組AAV2。轉染後3天採集細胞，在核糖核酸酶存在下用Triton X-100裂解。重組AAV2藉由切向流過濾濃縮，並使用等密度超速離心(Grieger 2006)進行純化。AAV滴定係使用qPCR進行的，引子靶向病毒承載物的ITR區域(Dias 2015)。 人類彙集血清及小鼠血清
人類彙集血清購自Sigma (目錄號：H4522-20ML)。將人類血清熱不活化以不活化補體或其他非抗體病毒抑制因子，且冷凍儲存以便進一步使用。在全身注射AAV2後4週自小鼠中收集小鼠血清。自尾靜脈收集血液並在室溫下放置30分鐘以凝結。藉由在預冷離心機中以2000 g離心10分鐘的離心步驟去除凝塊。收集由血清組成的上清液，且在56℃下熱不活化30分鐘。血清在-20℃下儲存至使用。 方法 使用不同病毒與反應性連接子比率用 DBCO-PEG(12)-NHS 連接子對病毒 (AAV2) 進行表面修飾
如之前的實驗中所做的，0.52 nmol、1.73 nmol、5.2 nmol、17.3 nmol、52 nmol或173.3 nmol DBCO-PEG(12)-NHS連接子在20 ul PBS、pH 7.2中與3E+9 VG AAV2在室溫下綴合3小時。 PEG(n)- 疊氮化物 -NHS 官能化 WGA 與 DBCO-PEG(n) 官能化 AAV2 的交聯探索 PEG 長度
與實例9類似，野生AAV2衣殼用衣殼反應性DBCO-PEGn-NHS連接子官能化，其中n為4或2k以分別產生「4病毒」或「5k病毒」構築體。WGA配位體用配位體反應性疊氮化物-PEGn-NHS連接子官能化，其中n為4或5K，以分別產生「4配位體」或「5k配位體」。具體而言，WGA (1.7 nmol)與20倍莫耳當量的疊氮化物-PEGn-NHS (54 nmol)在100 ul PBS中在pH 7.2下在室溫下反應3小時。使用10 KDa分子MWCO離心過濾器去除未反應之連接子。0.1 nmol WGA-PEG(n)-疊氮化物與經表面修飾病毒合併在室溫下交聯反應1小時，且進一步在4℃下反應隔夜。 ELISA
使用酶聯免疫吸附分析(ELISA)偵測AAV2特異性IgG抗體。96孔ELISA盤用稀釋在塗佈緩衝液(37 mM Na 2CO 3、63 mM NaHCO 3於H 2O中；pH 9.6)中的AAV2顆粒以1×10^9 vg/孔的濃度在室溫下塗佈2小時或在4℃下塗佈隔夜。用洗滌緩衝液(含有0.05% Tween20的PBS)洗滌盤三次。加入封閉溶液(含0.05% Tween20及5%脫脂奶粉的PBS)並將盤在37℃下培育2小時。封閉盤後用洗滌緩衝液洗滌一次。將血清稀釋液加入孔中，且在室溫下培育2小時或在4℃下培育隔夜。將盤用洗滌緩衝液洗滌三次，並與在稀釋緩衝液(含0.05% Tween20及1%脫脂奶粉的PBS)中稀釋的抗IgG的HRP綴合二級抗體在37℃下培育1小時。將盤用洗滌緩衝液洗滌三次，並加入HRP的受質TMB。為了終止反應，加入含有酸性酸的終止溶液，並用分光光度計在450 nm下量測吸光度(表示為光密度單位，OD)。OD值在減去背景後報導，並與抗體與固定抗原(AAV)的結合程度相關。 用 HEK293T 細胞 ( 允許的細胞株 ) 進行中和分析
將HEK293T細胞在37℃及5% CO 2下維持在補充有5% FBS及100 U青黴素/鏈黴素的DMEM+Glutamax中。對於該分析，細胞以每96孔3×10^4個細胞接種，且以1000的MOI添加AAV病毒，該AAV病毒在37℃下與人類或小鼠血清的2倍連續稀釋液一起預培育1小時。72小時後，使用來自BioRad的S3e細胞分選儀藉由流式細胞術分析經轉導細胞的螢光。 用 PC12 細胞 ( 允許性較差的細胞株 ) 進行中和分析
將PC12細胞在37℃及5% CO 2下維持在補充有10%馬血清、5% FBS及100 U青黴素/鏈黴素的DMEM/F12中。對於該分析，細胞以每96孔3×10^4個細胞接種，且以1000的MOI添加AAV病毒，該AAV病毒在37℃下與小鼠血清的2倍連續稀釋液一起預培育1小時。5天後使用Zeiss AxioObserver A1顯微鏡獲取經轉導細胞的螢光。 初生背根神經節 (DRG) 神經元的中和分析
玻璃底培養皿用15 μl液滴的聚L-離胺酸溶液(儲備溶液濃度：1 mg/ml，用H 2O以1:10稀釋)在37℃下塗佈1小時。1小時後除去液滴並用PBS洗滌培養皿兩次。接著，將在PBS中按1:50稀釋的15 μl Matrigel添加至培養皿中，並在37℃下培育。在接種細胞之前，除去Matrigel液滴並將培養皿風乾。隨後自成年小鼠中分離出DRG。初生細胞(主要係神經元及衛星細胞)進一步藉由膠原酶在37℃下對DRG處理25分鐘，接著洗滌以及用胰蛋白酶培育步驟進行分離。用500 μl完全培養基終止反應，且將細胞懸浮液過濾，離心並重新懸浮於細胞培養基中。向每個培養皿中加入10 μl細胞懸浮液。1小時後輕輕加入100 μl培養基。第二天除去培養基並向培養皿中加入200 μl新鮮培養基。第二天將培養基更換為100 μl不含FBS的DMEM+青黴素/鏈黴素。15分鐘後，除去無血清培養基，且將與血清一起預培育的未經修飾及PEG4-DBCO:疊氮化物-PEG4-WGA修飾病毒加入細胞中，15分鐘後加入50 μl培養基。第二天，將2 ml DMEM/F12培養基加入每個培養皿中。五天後用共焦顯微鏡對經轉導細胞進行成像。 結果
在 圖 63a及 圖 63b中，吾人用不同量的連接子DBCO-PEG4化學修飾AAV2並用人類彙集血清進行ELISA，該血清含有抗AAV2的抗體( 圖 63a)。根據吾人之假設，增加每個病毒的連接子量會導致IgG抗體對病毒的識別降低，如將最高量的連接子(173.3 nmol)與最低量(0.52 nmol)相比OD信號降低80%所示。然而，在此等增加的連接子量下，病毒的轉導效率大大降低。此等資料表明，在如本文實例8及9確立的用於產生已顯示提供增強的轉導效率的構築體的連接子與病毒比率下，抗體對病毒的識別受到間隔子長度與結合之間的負相關的影響。
吾人亦在HEK293T細胞中進行了中和分析以進一步闡明在增加的連接子量下觀察到的與具有DBCO-PEG12連接子的AAV2結合的IgG降低是否與中和活性的喪失相關( 圖 63b)。如 圖 63b所示，抗體的中和能力不受以0.52 nmol、1.73 nmol、5.2 nmol、17.3 nmol、52 nmol或173.3 nmol/3E+9 VG病毒的連接子量(值得注意的是，該等量仍然係與增強的轉導相容的量)製備的構築體的影響。因此，儘管抗體結合減少，但用與增強轉導相容的連接子的量官能化之病毒不太可能導致逃脫中和。
吾人進一步研究了在僅與病毒相連的連接子部分上或在病毒及配位體上增加PEG間隔子長度是否會影響抗體的識別。吾人用DBCO-PEG4-NHS (「4-病毒」)、DBCO-PEG2000-NHS (「2K-病毒」)修飾病毒；以及藉由首先用DBCO-PEG4-NHS連接子進行表面官能化，接著與WGA-PEG5000-疊氮化物交聯來修飾病毒(「4-病毒5K配位體」)；以及藉由首先用DBCO-PEG2000-NHS連接子進行表面官能化，接著與WGA-PEG4-疊氮化物交聯來修飾病毒(「2K-病毒4配位體」)( 圖 64a)。藉由增加PEG間隔子長度，吾人藉由ELISA觀察到抗體對AAV的識別沒有差異( 圖 64a)。因此，中和能力在增加DBCO-PEGn-NHS連接子的PEG長度時沒有差異，在改變WGA-PEG-疊氮化物的PEG長度時亦沒有差異( 圖 64b- 圖 64c)。
由於吾人藉由使用高度允許的HEK293T細胞株在中和分析中沒有觀察到任何變化，故吾人改為使用允許性較低的神經元細胞株PC12細胞( 圖 65)及初生DRG ( 圖 66)。在此等實驗中，吾人用DBCO-PEG4-NHS對病毒進行表面修飾，接著將其與WGA-PEG4-疊氮化物交聯，並將經表面修飾病毒與含有抗AAV2抗體的小鼠血清的連續稀釋液一起培育。如 圖 65所示，在PC12細胞中，未經修飾AAV的轉導在測試的所有血清稀釋度下均被阻斷，而WGA修飾病毒在稀釋度為1:16時逃脫中和抗體的識別，此表明，不受理論約束，WGA表面修飾病毒可能使用不同的途徑進入PC12細胞，藉此規避抗體的抑制。吾人亦將此種中和分析應用於DRG培養物，並且在此吾人亦展示了WGA表面修飾病毒在完全中和未經修飾AAV2的血清稀釋度下的逃逸( 圖 66)。 序列表SEQ ID NO: 1
Figure 02_image085
SEQ ID NO: 2-奈莫利珠單抗之胺基酸序列
Figure 02_image087
SEQ ID NO: 3-奈莫利珠單抗SNAP之合成胺基酸序列
Figure 02_image089
等效物及以引用之方式併入
儘管本發明已參照較佳實施例及各種替代實施例加以具體顯示且描述，但應瞭解，在不背離本發明之精神及範疇之情況下，熟習相關技術者可在其中作出形式及細節的各種變更。
在本說明書正文中引用的所有參考文獻、授權專利及專利申請案特此以全文引用的方式併入以用於所有目的。
PCT/EP2020/062713出於所有目的以全文引用的方式併入本文中。
參照以下對利用了本發明之原理的說明性實施例進行闡述的詳細描述及隨附圖式，將更好地理解本發明之特徵、態樣及優點，在該等圖式中：
圖 1顯示用BG基團官能化的病毒衣殼表面的表面修飾的示意圖，該等BG基團與加SNAP標籤的融合配位體反應以產生具有改進的遺傳承載物向性及/或轉導效率的經表面修飾病毒。
圖 2顯示根據本發明之ΔHSPG病毒衣殼無殘留感染活性(深色圖)；去除了肝素結合位點的構築體在螢光報導體小鼠模型的感覺神經元上進行了測試。插圖顯示細胞之相位差顯微影像。
圖 3顯示當在與 圖 2所用類似的螢光報導體小鼠模型中的感覺神經元上測試時，用小麥胚芽凝集素(WGA)融合配位體表面修飾的衣殼使病毒轉導效率完全恢復至100% (螢光細胞)。
圖 4a- 圖 4c顯示神經滋養因數NGF ( 圖 4a)、NT3 ( 圖 4b)及BDNF ( 圖 4c)在與衣殼表面綴合時將病毒遞送至不同的神經元群體。插圖顯示細胞的相位差顯微影像。在與 圖 2類似的螢光報導體小鼠模型中的感覺神經元上測試了構築體。
圖 5顯示用霍亂毒素B次單元表面修飾的衣殼在注射至皮膚中時將病毒逆行轉運至神經元細胞體。插圖顯示細胞的顯微影像。在與 圖 2類似的螢光報導體小鼠模型中的感覺神經元上測試了構築體。
圖 6a- 圖 6c顯示注射了具有根據本發明之NGF配位體IV的病毒三週後三叉神經節中的感覺神經元組織( 圖 6a)，用抗TrkA的抗體(NGF的受體， 圖 6b)染色。可以看到至少80%的重疊( 圖 6c)。
圖 7顯示用抗NF200及IB4的抗體對來自 圖 6a的切片進行的染色，該等抗體主要分別標記出其他神經元(機械性受器(綠色/灰色)及非肽性痛覺感受器(藍色/深灰色))。紅色(淺灰色)感染的細胞主要不同於綠色及藍色細胞。
圖 8a- 圖 8b顯示基因遞送對於有配位體的病毒更有效。 圖 8a顯示正常的AAV9變異體PHP.S； 圖 8b顯示進一步用WGA修飾的 圖 8a的PHP.S變異體。WGA修飾的構築體引起遞送的強勁增加。
圖 9a- 圖 9f顯示在不同修飾比率下DRG神經元的NGF R121W-SNAP::AAV2-ΔHSPG轉導。插圖顯示相位差影像。
圖 10a- 圖 10c顯示DRG神經元的神經滋養蛋白-AAV2-ΔHSPG轉導。 圖 10a- 圖 10c顯示NGF R121W、BDNF及NT3 (分別)偶聯的AAV2-ΔHSPG靶向形態上不同的細胞亞型。
圖 11a- 圖 11f顯示連接子長度對NGF R121W-SNAP::AAV2-ΔHSPG在不同感覺神經節的轉導效率的影響。眼眶後注射3E+10病毒基因體(VG)。 圖 11a- 圖 11c顯示較短BG-GLA連接子的結果。 圖 11d- 圖 11f顯示較長BG-PEG13連接子的結果。
圖 12a- 圖 12d顯示注射途徑對DRG中轉導效率的影響。不同注射途徑的DRG轉導效率的組織學分析。皮膚( 圖 12a)或神經( 圖 12b)中的局部注射。全身注射IP ( 圖 12c)或IV ( 圖 12d)。
圖 13a- 圖 13d確認了NGF R121W-SNAP::AAV2-ΔHSPG對DRG中TrkA+細胞的選擇性。眼眶後注射3E+10 VG顆粒後DRG中轉導選擇性的組織學分析： 圖 13a顯示來自NGF R121W-SNAP::AAV2-ΔHSPG的螢光tdTomato信號(紅色)； 圖 13b顯示使用抗TrkA的抗體鑑別的呈綠色的TrkA+細胞(綠色)； 圖 13c係合併後之影像(橙色)。 圖 13d量化了作為TrkA陽性細胞的感染細胞數及經感染的TrkA陽性細胞數。
圖 14a- 圖 14c顯示野生型小鼠角質細胞的活體內IL31 K134A-AAV2-ΔHSPG感染。皮下注射3E+10 VG顆粒後野生型小鼠皮膚中轉導選擇性的組織學分析： 圖 14a顯示來自IL31 K134ASNAP::AAV2-ΔHSPG (紅色)的螢光tdTomato信號。 圖 14b顯示使用抗K14的抗體鑑別的角質細胞(綠色)。 圖 14c顯示合併後之影像(橙色)。
圖 15a- 圖 15c顯示IL31 K134A-AAV2-ΔHSPG在不存在Il31RA受體的情況下不感染角質細胞。皮下注射3E+10 VG顆粒後IL31RA-/-小鼠皮膚中轉導選擇性的組織學分析： 圖 15a顯示不存在來自IL31 K134A::AAV2-ΔHSPG的螢光信號。 圖 15b顯示使用抗K14的抗體鑑別的角質細胞(綠色)。 圖 15c顯示合併後之影像(橙色)。
圖 16a- 圖 16c顯示活體外及活體內的CTB-ΔHSPG-AAV轉導。
圖 17a- 圖 17b顯示活體外WGA-ΔHSPG-AAV轉導。
圖 18a- 圖 18c顯示WGA::AAV2-ΔHSPG的新生兒IV注射。將1E+9 VG的WGA::AAV2-ΔHSPG IV注射至新生小鼠中。在皮膚( 圖 18a)、DRG ( 圖 18b)及脊髓( 圖 18c)中的神經元中觀察到穩健的tdTomato螢光。
圖 19a- 圖 19c顯示小鼠腦中WGA::AAV2-ΔHSPG的逆向轉運。將6E+8 VG的WGA::AAV2-ΔHSPG注射至成年小鼠的前額葉皮層中。在注射部位( 圖 19a)及丘腦( 圖 19b- 圖 19c)觀察到穩健的tdTomato螢光，表明自末端至細胞體的逆向轉運。
圖 20a- 圖 20f顯示在不同病毒:配位體比率下使用WGA-ΔHSPG-AAV在DRG中PHP.S轉導效率的加強。
圖 21顯示將IB4::AAV2-ΔHSPG施加至培養的DRG神經元中。將1E+9 VG的IB4::AAV2-ΔHSPG施加至培養的DRG神經元中。在大多數小型神經元中觀察到穩健的tdTomato螢光。
圖 22a- 圖 22d顯示在成年小鼠中活體內注射IB4::AAV2-ΔHSPG。經由皮下、神經內及脊椎內注射途徑注射IB4::AAV2-ΔHSPG。( 圖 22a)皮下注射後IB4::AAV2-ΔHSPG的脈管系統標記。( 圖 22b)來自在坐骨神經中注射了IB4::AAV2-ΔHSPG的小鼠的全形包埋DRG。( 圖 22c)來自在左側坐骨神經中注射了IB4::AAV2-ΔHSPG的小鼠並用IB4-488染色的脊髓切片。同側信號重疊。( 圖 22d)來自在脊髓中注射了IB4::AAV2-ΔHSPG的小鼠的經標記小神經膠質細胞。
圖 23顯示隨著施加至PC12細胞的野生型AAV2 (對應於 圖 24a- 圖 24f中之影像)及IB4-AAV2 (對應於 圖 24g- 圖 24l中之影像)濃度增加的轉導效率圖。
圖 24a- 圖 24l顯示以每個濃度的野生型AAV2 ( 圖 24a- 圖 24f)及IB4-AAV2 ( 圖 24g- 圖 24l)處理之PC12細胞之GFP螢光。
圖 25顯示隨著施加至PC12細胞的野生型AAV9 (對應於 圖 26a- 圖 26f中之影像)及IB4-AAV9 (對應於 圖 26g- 圖 26l中之影像)濃度增加的轉導效率圖。
圖 26a- 圖 26l顯示以每個濃度的野生型AAV9 ( 圖 26a- 圖 26f)或IB4-AAV9 ( 圖 26g- 圖 26l)處理之PC12細胞之GFP螢光。
圖 27a- 圖 27d顯示在沒有間隔子的情況下以增加的莫耳比與ΔHSPG-AAV2綴合並施加至PC12細胞的IB4的代表性GFP螢光影像。
圖 28a- 圖 28d顯示以增加量的具有n=3 PEG短間隔子的反應性連接子製備並施加至PC12細胞的IB4:ΔHSPG-AAV2構築體之代表性影像。
圖 29a- 圖 29d顯示以增加量的具有n=8 PEG中等間隔子的衣殼反應性連接子製備並施加至PC12細胞的IB4:ΔHSPG-AAV2構築體之代表性影像。
圖 30a- 圖 30d顯示以增加量的具有n=16 PEG長間隔子的衣殼反應性連接子製備並施加至PC12細胞的IB4:ΔHSPG-AAV2構築體之代表性影像。
圖 31顯示對於具有不同連接子長度(n＝3，平均值+/-SEM)處於遞增的配位體與病毒莫耳比時每個細胞中平均GFP螢光強度的量化。
圖 32a- 圖 32s顯示對應於WGA:AAV2ΔHSPG病毒構築體在PC12細胞中轉導效率之GFP螢光影像，該病毒構築體包含在病毒側(V)及WGA配位體側(L)上具有不同間隔子長度(亦即PEGn (乙二醇單元)之(n))的連接子，其中病毒被不同莫耳量的連接子官能化。
圖 33顯示用經WGA修飾且具有不同連接子間隔子的AAV2ΔHSPG病毒轉導之PC12細胞的平均GFP螢光強度的圖表。繪製的資料對應於平均轉導效率。
圖 34顯示與未經修飾病毒相比(紅色虛線)，用經WGA表面修飾且具有不同連接子間隔子的AAV2ΔHSPG病毒構築體處理之PC12細胞的個別細胞轉導效率的圖表。
圖 35顯示與未經修飾病毒相比，用經WGA表面修飾且具有不同連接子間隔子的AAV2ΔHSPG病毒構築體處理之PC12細胞的平均轉導效率。
圖 36顯示僅展示表現較差的離散及分散PEG組合的表現的量化。
圖 37a- 圖 37d顯示用AAV2ΔHSPG-WGA構築體處理之PC12細胞中的tdTomato螢光影像，該等構築體使用TCO/四𠯤連接製備，其中病毒被不同莫耳量的連接子官能化。 圖 37e顯示未經修飾病毒； 圖 37f顯示用以3E+9 VG:1.73 nmol病毒:連接子比率使用DBCO/疊氮化物交聯劑反應性成對製備的AAV2ΔHSPG-WGA處理之PC12細胞中的tdTomato螢光影像。
圖 38 及圖 39顯示對tdTomato螢光影像的量化，以分別提供與以3E+9 VG:1.73 nmol病毒:連接子比率使用DBCO/疊氮化物製備的AAV2ΔHSPG-WGA獲得的結果相比，在用以不同的病毒與連接子比率使用TCO/四𠯤連接製備的AAV2ΔHSPG-WGA構築體處理之PC12細胞中之平均轉導效率及個別細胞轉導效率。
圖 40a- 圖 40d顯示用以不同比率的病毒與連接子之比率使用膦-NHS/疊氮化物連接製備的AAV2ΔHSPG-WGA構築體處理之PC12細胞中的tdTomato螢光影像。 圖 40e顯示未經修飾病毒； 圖 40f顯示用以3E+9 VG:1.73 nmol病毒:連接子比率使用DBCO/疊氮化物交聯劑反應性成對製備的AAV2ΔHSPG-WGA處理之PC12細胞中的tdTomato螢光影像。
圖 41 及圖 42顯示對tdTomato螢光影像的量化，以分別提供與以3E+9 VG:1.73 nmol病毒:連接子比率使用DBCO/疊氮化物製備的AAV2ΔHSPG-WGA獲得的結果相比，在用以不同的病毒與連接子比率使用膦-NHS/疊氮化物連接製備的AAV2ΔHSPG-WGA構築體處理之PC12細胞中之平均轉導效率及個別細胞轉導效率。
圖 43說明在最佳轉導效率下每個AAV9的PEG4-DBCO分子的數目及每個AAV9的WGA-PEG4-疊氮分子的數目。
圖 44繪示對於AAV9-PEG4-DBCO::WGA-SNAP-TMR-PEG4-疊氮化物構築體及在僅與WGA-SNAP-TMR-PEG4-疊氮化物一起培育而不首先經DBCO-PEG4-NHS連接子官能化的對照AAV9情況下的每個AAV顆粒的配位體數目。
圖 45a- 圖 45e繪示用未經修飾野生型AAV3 ( 圖 45a)及以各種病毒:連接子比率製備的WGA-AAV3 ( 圖 45b- 圖 45e)處理之PC12細胞中之GFP或RFP螢光。
圖 46 及圖 47顯示對螢光影像的量化，以分別提供用所製備的AAV3ΔHSPG-WGA構築體處理之PC12細胞中之平均轉導效率及個別細胞轉導效率。
圖 48a- 圖 48e繪示用未經修飾野生型AAV5 ( 圖 48a)及以各種病毒:連接子比率製備的WGA-AAV3 ( 圖 48b- 圖 48e)處理之PC12細胞中之GFP或RFP螢光。
圖 49 及圖 50顯示對螢光影像的量化，以分別提供在用如 圖 48中製備的AAV6ΔHSPG-WGA構築體處理之PC12細胞中之平均轉導效率及個別細胞轉導效率。
圖 51a- 圖 51 e繪示用未經修飾野生型AAV6 ( 圖 51a)及以各種病毒:連接子比率製備的WGA-AAV6 ( 圖 51b- 圖 51e)處理之PC12細胞中之GFP或RFP螢光。
圖 52 及圖 53顯示對tdTomato螢光影像的量化，以分別提供在用如 圖 51中製備的WGA-AAV6構築體處理之PC12細胞中之平均轉導效率及個別細胞轉導效率。
圖 54a- 圖 54e繪示用未經修飾野生型AAV8 ( 圖 54a)及以各種病毒:連接子比率製備的WGA-AAV8 ( 圖 54b- 圖 54e)處理之PC12細胞中之GFP或RFP螢光。
圖 55 及圖 56顯示對螢光影像的量化，以分別提供用如 圖 54中製備的WGA-AAV8構築體處理之PC12細胞中之平均轉導效率及個別細胞轉導效率。
圖 57繪示如藉由FACS分析的AAV2對HEK293細胞的轉導(未經轉導細胞，灰色；及經轉導細胞，黑色)。
圖 58a繪示藉由顯微鏡分析的AAV2對HEK293細胞的轉導。 圖 58b繪示在AAVR基因缺失後AAV2對HEK293細胞的轉導。
圖 59a- 圖 59b係WT AAV2載體( 圖 59a)及( 圖 59b) WGA-AAV2對AAVR-KO HEK293細胞之轉導之代表性影像。
圖 60a- 圖 60b分別係平均螢光強度(MFI)及tdtomato陽性細胞的百分比，亦即表徵WT AAV2載體及WGA-AAV2對AAVR KO HEK293細胞之轉導之資料。
圖 61係含有上游GP64信號序列及下游Sortag、SNAP-標籤及6×His標籤之奈莫利珠單抗(Nemolizumab) SNAP的合成胺基酸序列。GP 64信號序列以斜體顯示，奈莫利珠單抗以粗體顯示，Sortag以下劃線顯示，Snap標籤以灰色顯示，6×HIS以灰色粗體顯示(SEQ ID NO. 3)，星號表示終止密碼子。
圖 62a- 圖 62c繪示皮下注射3E+10 VG顆粒的奈莫利珠單抗-AAV2ΔHSPG構築體後野生型小鼠皮膚中轉導選擇性的組織學分析。 圖 62a顯示來自奈莫利珠單抗SNAP AAV2ΔHSPG病毒感染細胞的螢光tdTomato信號(紅色)。 圖 62b顯示使用抗K14的抗體鑑別的角質細胞(綠色)。 圖 62c顯示病毒感染的角質細胞的合併影像(橙色)。
圖 63a- 圖 63b繪示使用不同量的DBCO-PEGn連接子官能化的經表面修飾AAV2的人類抗體介導的識別及中和。 圖 63a彙集人類血清中所含的IgG與使用不同量的DBCO-PEGn連接子官能化的AAV2的結合，藉由ELISA量測並表示為在450 nm光下量測的光密度(OD)單位。 圖 63b繪示在HEK293T細胞中進行的中和分析，其中未經修飾及經修飾病毒與不同稀釋度的彙集人類血清預培育，其中針對每種血清稀釋度指示轉導抑制百分比。
圖 64a- 圖 64c繪示使用在病毒及配位體上具有各種PEG長度的連接子對AAV2進行化學修飾後的抗體識別及中和。 圖 64a繪示人類IgG與對病毒及配位體用不同連接子PEG長度修飾的AAV2的結合，如在 圖 63a所量測。 圖 64b- 圖 64c繪示人類抗體對與不同稀釋度的人類彙集血清預培育的未經修飾及經修飾病毒的中和活性，如 圖 63b所示，其中4病毒=DBCO PEG4；2K病毒=DBCO-PEG2000；5K配位體=WGA-PEG5000-疊氮化物；4配位體=WGA-PEG4-疊氮化物)。
圖 65a- 圖 65n繪示在PC12細胞中使用未經修飾物及AAV2-WGA的中和分析。未經修飾物( 圖 65a- 圖 65g)及使用PEG4-疊氮化物修飾的AAV2-WGA ( 圖 65h- 圖 65n)在加入PC12細胞之前與AAV2免疫的小鼠血清的2倍連續稀釋液一起培育。
圖 66a- 圖 66f繪示使用未經修飾物( 圖 66a- 圖 66c)及使用PEG4-疊氮化物修飾的AAV2-WGA ( 圖 66d- 圖 66f)的初生DRG神經元的中和分析。未經修飾物及AAV2-WGA在加入DRG培養物中之前與含有抗AAV2抗體的小鼠血清稀釋液一起預培育。
Figure 110142094-A0101-11-0002-1

Claims (49)

  1. 一種經表面修飾病毒衣殼，其包含以下一或多者： 經由連接子與病毒衣殼蛋白共價綴合的配位體， 該連接子包含： 交聯部分，其中該交聯部分係藉由交聯劑反應性成對的第一成員與第二成員之間的反應形成；及 視情況選用之一或多個間隔子。
  2. 如請求項1之經表面修飾病毒衣殼，其中該交聯劑反應性成對的該第一成員與該第二成員參與選自以下的反應：Cu(I)催化之疊氮化物-炔烴環加成(CuAAC)反應、應變促進之炔烴-疊氮化物環加成(strain-promoted alkyne-azide cycloaddition，SPAAC)反應、應變促進之炔烴-硝酮環加成(strain-promoted alkyne-nitrone cycloaddition，SPANC)反應、逆電子需求狄耳士-阿德爾(inverse electron demand Diels-Alder，IEEDD)反應、及史陶丁格連接(Staudinger ligation)及[4+1]環加成反應。
  3. 如前述請求項中任一項之經表面修飾病毒衣殼，其中該交聯部分包含以下中至少一個：八員環及***環。
  4. 如請求項2之經表面修飾病毒衣殼，其中該反應係應變促進之炔烴-疊氮化物環加成(SPAAC)反應。
  5. 如前述請求項中任一項之經表面修飾病毒衣殼，其中該交聯劑反應性成對包含環辛炔及疊氮化物。
  6. 如請求項5之經表面修飾病毒衣殼，其中該環辛炔選自二苄基環辛炔(DIBO)、二苯并氮雜環辛炔(DBCO)及聯芳氮雜環辛炔酮(BARAC)或其衍生物。
  7. 如請求項6之經表面修飾病毒衣殼，其中該環辛炔係DBCO。
  8. 如前述請求項中任一項之經表面修飾病毒衣殼，其中該交聯部分包含以下結構：
    Figure 03_image002
    其中R 1及R 2指示與該連接子的連接點。
  9. 如請求項2之經表面修飾病毒衣殼，其中該反應係逆電子需求狄耳士-阿德爾(IEEDD)反應。
  10. 如請求項1至2及3至9中任一項之經表面修飾病毒衣殼，其中該交聯劑反應性成對包含反式環辛烯及四𠯤。
  11. 如請求項1至2及9至10中任一項之經表面修飾病毒衣殼，其中該交聯部分包含以下結構
    Figure 03_image092
    其中R 1及R 2指示與該連接子的連接點。
  12. 如前述請求項中任一項之經表面修飾病毒衣殼，其中該連接子包含一或多個間隔子。
  13. 如請求項12之經表面修飾病毒衣殼，其中該一或多個間隔子包含1至20個聚乙二醇單體。
  14. 如請求項13之經表面修飾病毒衣殼，其中該一或多個間隔子包含2至8個聚乙二醇單體。
  15. 如請求項14之經表面修飾病毒衣殼，其中該一或多個間隔子中之一者包含4個聚乙二醇單體。
  16. 如請求項15之經表面修飾病毒衣殼，其包含兩個間隔子，該等間隔子包含4個聚乙二醇單體。
  17. 如前述請求項中任一項之經表面修飾病毒衣殼，其中該配位體係細胞類型特異性配位體。
  18. 如前述請求項中任一項之經表面修飾病毒衣殼，其中該配位體選自細胞介素、生長因子、凝集素、毒素、單鏈抗體、多鏈抗體或抗原結合抗體片段、肽及其組合。
  19. 如前述請求項中任一項之經表面修飾病毒衣殼，其中該連接子共價連接至該衣殼蛋白一級序列之一級胺基。
  20. 如請求項19之經表面修飾病毒衣殼，其中該一級胺基選自N端胺基、離胺酸ε胺基及精胺酸胺基酸基團。
  21. 如請求項20之經表面修飾病毒衣殼，其中該一級胺基係離胺酸胺基酸殘基的ε胺基。
  22. 如前述請求項中任一項之經表面修飾病毒衣殼，其中該連接子經由該配位體之一級胺基共價連接至該配位體。
  23. 如前述請求項中任一項之經表面修飾病毒衣殼，其中該連接子經由靶向配位體之一級序列的非天然胺基酸殘基共價連接至該靶向配位體。
  24. 如請求項23之經表面修飾病毒衣殼，其中該非天然胺基酸殘基包含參與選自以下反應的該交聯劑反應性成對之成員：Cu(I)催化之疊氮化物-炔烴環加成(CuAAC)反應、應變促進之炔烴-疊氮化物環加成(SPAAC)反應、應變促進之炔烴-硝酮環加成(SPANC)反應、逆電子需求狄耳士-阿德爾(IEEDD)反應、史陶丁格連接及[4+1]環加成反應。
  25. 如請求項24之經表面修飾病毒衣殼，其中該交聯劑反應性成對包括疊氮化物、環辛炔、環辛烯或1,2,4,5四𠯤部分。
  26. 如請求項1至25中任一項之經表面修飾病毒衣殼，其中該病毒衣殼之蛋白質序列已經突變以減弱或消除該衣殼與哺乳動物細胞多醣或蛋白多醣的結合。
  27. 如請求項1至25中任一項之經表面修飾病毒衣殼，其中該病毒衣殼之蛋白質序列沒有突變以減弱或消除該衣殼蛋白與哺乳動物細胞多醣或蛋白多醣的結合。
  28. 如請求項26或27之經表面修飾病毒衣殼，其特徵在於比具有相同衣殼蛋白序列的未經修飾病毒衣殼提高之感染性。
  29. 如前述請求項中任一項之經表面修飾病毒衣殼，其中該病毒衣殼選自腺病毒衣殼、腺相關病毒衣殼、逆轉錄病毒衣殼、慢病毒衣殼、單純疱疹病毒衣殼及桿狀病毒衣殼。
  30. 如請求項29之經表面修飾病毒衣殼，其中該病毒衣殼係腺相關病毒(AAV)衣殼。
  31. 如請求項30之經表面修飾病毒衣殼，其中VP1的585及588處或VP2或VP3中的類似位置的至少一個精胺酸殘基已經突變。
  32. 如請求項31之經表面修飾病毒衣殼，其中VP1的585及588處的精胺酸殘基已突變為丙胺酸殘基。
  33. 如請求項31或32之經表面修飾病毒衣殼，其特徵在於與未經修飾病毒衣殼相比已改變的向性。
  34. 如前述請求項中任一項之經表面修飾病毒衣殼，其中該經表面修飾病毒衣殼表現出逃脫預先存在的中和抗體。
  35. 一種根據式I的經表面修飾病毒衣殼：
    Figure 03_image094
    其中：
    Figure 03_image010
    係病毒衣殼； Y及Y'獨立地係連接部分； n及n'獨立地係0或1至50的整數； Sp及Sp'獨立地係視情況選用之間隔子； L係配位體； x係配位體與衣殼之比率，該比率在1至500的範圍內；且 Q係選自：
    Figure 03_image097
    其中，Z為7或8員環狀或雜環結構。
  36. 如請求項35之經表面修飾病毒衣殼，其中x在100-200的範圍內。
  37. 如請求項36之經表面修飾病毒衣殼，其中x在130-170的範圍內。
  38. 一種根據式I-1的經表面修飾病毒衣殼：
    Figure 03_image099
    其中：
    Figure 03_image010
    係病毒衣殼； n及n'獨立地係選自0至30的整數； L係配位體；且 x係1至500的整數。
  39. 如請求項38之經表面修飾病毒衣殼，其中x在100-200的範圍內。
  40. 如請求項1至39中任一項之經表面修飾病毒衣殼，其中該配位體與衣殼之比率(x)在130至170的範圍內。
  41. 一種醫藥組合物，其包含至少一種重組病毒粒子，該重組病毒粒子包含如請求項1至40中任一項之經表面修飾病毒衣殼及重組聚核苷酸承載物，該醫藥組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑、增溶劑、填充劑、防腐劑、賦形劑或其組合。
  42. 一種治療患有可藉由細胞內遞送重組聚核苷酸承載物治療的疾病的患者之方法，該方法包含： 投與治療有效量之如請求項41之醫藥組合物， 其中該重組聚核苷酸承載物能夠治療該疾病。
  43. 一種用於治療可藉由細胞內遞送重組聚核苷酸承載物來治療的疾病的組合物，該組合物包含： 治療有效量之如請求項41之醫藥組合物， 其中該重組聚核苷酸承載物能夠治療該疾病。
  44. 一種如請求項1至40中任一項之經表面修飾病毒衣殼的用途，其用於製造供治療可藉由細胞內遞送重組聚核苷酸承載物來治療的疾病用之藥劑。
  45. 一種經表面官能化病毒衣殼，其包含交聯劑反應性成對的第一成員及視情況選用之一或多個間隔子，其中該經表面官能化病毒衣殼適合與經官能化配位體反應，該經官能化配位體包含該交聯劑反應性成對的第二成員及視情況選用之一或多個間隔子，其中該交聯劑反應性成對之成員參與選自以下的反應：Cu(I)催化之疊氮化物-炔烴環加成(CuAAC)反應、應變促進之炔烴-疊氮化物環加成(SPAAC)反應、應變促進之炔烴-硝酮環加成(SPANC)反應、逆電子需求狄耳士-阿德爾(IEEDD)反應、及史陶丁格連接及[4+1]環加成反應。
  46. 一種製備經表面修飾病毒衣殼之方法，該方法包含以下步驟： i)藉由使病毒衣殼蛋白與衣殼反應性連接子反應獲得經表面官能化病毒衣殼，該連接子包含交聯劑反應性成對的第一成員及視情況選用之一或多個間隔子； ii)將該經表面官能化病毒衣殼與經官能化配位體綴合，該經官能化配位體包含該交聯劑反應性成對的第二成員及視情況選用之一或多個間隔子； 其中該交聯劑反應性成對的該第一成員與該第二成員反應形成交聯部分Q。
  47. 如請求項46之方法，其中該經表面修飾病毒衣殼係根據請求項1至40中任一項。
  48. 一種重組病毒粒子，其包含如請求項1至40中任一項之經表面修飾衣殼。
  49. 如請求項48之重組病毒粒子，其中該重組病毒粒子係rAAV。
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