CN116987699A - 用于制备通用型car-t细胞的基因片段、其工具***及应用 - Google Patents
用于制备通用型car-t细胞的基因片段、其工具***及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116987699A CN116987699A CN202311141019.3A CN202311141019A CN116987699A CN 116987699 A CN116987699 A CN 116987699A CN 202311141019 A CN202311141019 A CN 202311141019A CN 116987699 A CN116987699 A CN 116987699A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- gene
- protein
- cells
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 66
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 39
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims abstract description 22
- 101710153660 Nuclear receptor corepressor 2 Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 55
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 31
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 30
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 9
- 102100029452 T cell receptor alpha chain constant Human genes 0.000 claims description 8
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 claims description 7
- 101150090724 3 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 238000013329 compounding Methods 0.000 claims description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 13
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 13
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 11
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 10
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 9
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 7
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 238000011357 CAR T-cell therapy Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 101100382541 Escherichia coli (strain K12) casD gene Proteins 0.000 description 2
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 101100387131 Myxococcus xanthus (strain DK1622) devS gene Proteins 0.000 description 2
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 2
- 101100273269 Thermus thermophilus (strain ATCC 27634 / DSM 579 / HB8) cse3 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 2
- PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N UTP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 2
- 210000002203 alpha-beta t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 101150049463 cas5 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150106467 cas6 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 229950010342 uridine triphosphate Drugs 0.000 description 2
- PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N uridine-triphosphate Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- UVBYMVOUBXYSFV-XUTVFYLZSA-N 1-methylpseudouridine Chemical compound O=C1NC(=O)N(C)C=C1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UVBYMVOUBXYSFV-XUTVFYLZSA-N 0.000 description 1
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150076800 B2M gene Proteins 0.000 description 1
- 102100027314 Beta-2-microglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 238000010440 CRISPR–Cas3 gene editing Methods 0.000 description 1
- 101100005249 Escherichia coli (strain K12) ygcB gene Proteins 0.000 description 1
- 102000011786 HLA-A Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 101150076359 Mhc gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 1
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 101150055191 cas3 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- -1 cmx8 Proteins 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 231100000226 haematotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000011369 optimal treatment Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及用于制备通用型CAR‑T细胞的基因片段、其工具***及应用。该基因片段的序列为SEQ ID No.1至SEQ ID No.11之一。将上述基因片段对应的crRNA与I‑B型CRISPR‑Cascade‑Cas3基因编辑***相结合后即形成工具***，能通过有效敲除TRAC基因从而获得通用型CAR‑T细胞。
Description
技术领域
本发明涉及用于制备通用型CAR-T细胞的基因片段、其工具***及应用，属于生物技术、生物医药技术领域。
背景技术
CAR-T疗法已经有多款药物先后上市，不管是在疗效还是商业化上，都取得了巨大的成功。但是，使用基因工程构造CAR细胞的成本高昂。如此昂贵的售价显然会为很多患者家庭带来沉重的负担。此外，目前自体CAR-T细胞疗法为定制化生产(以患者自体血液中T细胞为材料)，从收集患者T细胞到CAR-T细胞到成功制备大概要经历2-3周，对于一些患者来说，这个时间可能会超过他们的最佳治疗时期。因此，研究者开始考虑同种异体CAR-T细胞，即通用型CAR-T(UCAR-T)。UCAR-T最大的优势就是可以提前制备，当患者有需要时可以及时使用，极大地降低了生产成本和时间成本。移植物抗宿主病(GvHD)是同种异体CAR-T细胞治疗中需要克服的主要障碍，尤其是当患者的CAR-T细胞是由人类白细胞抗原(HLA)不匹配的健康供体产生时，UCAR-T的移植会引起严重的血液学毒性。因此制备UCAR-T细胞的主要设计原则是从同种异体健康供体中生成肿瘤抗原特异性T细胞，然后通过基因编辑的方法破坏同种异体T细胞的TCR基因和/或HLA I类基因来有效消除移植物抗宿主病。通过靶向TCR内源性α或β亚基恒定区的基因组序列或破坏MHC基因复合物的HLA-A基因座，使得TCR或HLAI类抗原的表达被消除，由此产生的T细胞不能识别同种异体抗原，从而消除GvHD。构建TCR缺陷型和HLA I类缺陷型最常用的基因编辑方法有锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和CRISPR-Cas9等。目前使用最普遍的是利用CRISPR-Cas9敲除TRAC及HLA，CRISPR-Cas9基因编辑通过切割DNA相关编码区域造成碱基的***或缺失(InDel)来沉默基因表达，但该方法并不能实现DNA长片段的清除，对于完全的基因敲除效率很低，因而可能导致UCAR-T产品无法完全消除GvHD。
本发明的发明人课题组于2022年9月19日申请的发明专利《一种I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑***及应用》中，公开了I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑***，能够使单个CRISPR靶向位点形成不同程度的长片段缺失，从而弥补CRISPR-Cas9产生长片段缺失的能力相对有限的空白。目前经进一步研究得出了该I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑***用于制备通用型CAR-T细胞的应用成果，为细胞基因敲除提供更完善更彻底的解决方案，并以此来申报本发明专利。
发明内容
本发明的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提供一种用于制备通用型CAR-T细胞的基因片段，将其对应的crRNA与I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑***相结合后，能够通过有效敲除TRAC基因从而获得通用型CAR-T细胞。同时还提供含有该基因片段的工具***，以及相关应用。
本发明解决其技术问题的技术方案如下：
用于制备通用型CAR-T细胞的基因片段，其特征是，所述基因片段与crRNA相对应；所述基因片段的基本结构为5'-tgagcac-子片段-gtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt-3'；所述基因片段的序列为SEQ ID No.1至SEQ ID No.11之一。
优选地，所述基因片段的序列为SEQ ID No.2或SEQ ID No.7。
根据上述基因片段可合成出相应的crRNA，用于制备通用型CAR-T细胞。
本发明还提供：
与前文所述基因片段对应的crRNA。
上述crRNA与I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑***相结合后，能通过有效敲除TRAC基因从而获得通用型CAR-T细胞。
本发明还提供：
一种工具***，其特征是，所述工具***含有前文所述的crRNA；所述工具***为I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑***。
优选地，所述I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑***由Cascade复合物以及Cas3蛋白组成；所述crRNA位于Cascade复合物中；所述Cascade复合物由Cmx8蛋白、Cas8蛋白、Cas5蛋白、Cas6蛋白、Cas11蛋白以及crRNA复合而成；所述Cmx8蛋白的氨基酸序列为SEQID NO.12；所述Cas8蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.13；所述Cas5蛋白的氨基酸序列为SEQID NO.14；所述Cas6蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.15；所述Cas11蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.16；所述Cas3蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.17。
上述工具***能对人原代T细胞进行基因编辑，敲除TRAC基因，获得通用型CAR-T细胞。
本发明还提供：
前文所述基因片段、或前文所述crRNA、或前文所述工具***用于制备敲除TRAC基因的药物的应用、或者用于制备通用型CAR-T细胞的应用。
含有前文所述工具***的细胞系或细胞株。
本发明还提供：
一种制备通用型CAR-T细胞的方法，其特征是，所述方法包括：采用前文所述的工具***对T细胞进行TRAC基因敲除，得到通用型CAR-T细胞。
一种通过利用前文所述的基因片段、或前文所述的crRNA、或前文所述的工具***、或前文所述的方法制备获得的通用型CAR-T细胞。
含有前文所述的通用型CAR-T细胞的细胞制剂。
本发明利用I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑***，针对性设计出crRNA，通过有效敲除TRAC基因从而获得通用型CAR-T细胞。与传统的利用CRISPR-Cas9编辑相比，本发明利用I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑***能造成长片段缺失的特点，能更加彻底地敲除TRAC基因，从而在细胞产品的通用性和特异性上更有优势，尤其适用于对于敲除程度要求高的应用场景，如通用型T细胞产品。
附图说明
图1为本发明实施例1的优选测试实验结果图。
图2为本发明实施例1的TRAC基因敲除位点示意图。
图3为本发明实施例1的流式细胞术检测编辑效率示意图。其中，百分比表示TCR-T细胞比例。
图4为本发明实施例1的编辑效率统计结果图(mean±SEM,n＝5)。
图5为本发明实施例1的基因组缺失范围示意图。
具体实施方式
本发明利用I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑***，通过反复深入地***性试验研究，获得了通过有效敲除TRAC基因从而获得通用型CAR-T细胞的技术手段，具体为将靶向T细胞TRAC基因的系列基因片段所对应的crRNA与I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑***相结合，以实现上述效果。
具体而言，系列基因片段的基本结构为5'-tgagcac-子片段-gtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt-3'。各基因片段的具体序列如下所示(各子片段以大写字母表示)：
SEQ ID No.1：
tgagcacGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAAgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.2：
tgagcacTCTAGCACAGTTTTGTCTGTGATATACACATCAGAgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.3：
tgagcacAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGGGCACGTGGCCCAGCgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.4：
tgagcacAGAAAGGAGAAGAGCAGCAGGCATGAGTTGAATGAgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.5：
tgagcacCACCATTGCACTCCAGCCTGGGCAACAAGAGCAAAgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.6：
tgagcacGTTCTACCTTTGAAACCTGAATGGTGTTGGTTACCgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.7：
tgagcacATGGATCTTCAGTGGGTTCTCTTGGGCTCTAGGTCgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.8：
tgagcacTCCTCTCTCCCCAGTACGGCTCTCTTAGCTCAGTAgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.9：
tgagcacGGAGGATCGCTTGAGCCCTGGAATGTTGAGGCTACgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.10：
tgagcacGCTCTGTTTGGGGCTATGTGGTAGAGTTCTAGGAGgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.11：
tgagcacCTGTGTATCTGGGCGTGTTGTATGTCCTGCTGCCGgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
其中，优选SEQ ID No.2或SEQ ID No.7。
本发明用于制备通用型CAR-T细胞的工具***由Cascade复合物以及Cas3蛋白组成；Cascade复合物由Cmx8蛋白、Cas8蛋白、Cas5蛋白、Cas6蛋白、Cas11蛋白以及crRNA复合而成；Cmx8蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.12；Cas8蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.13；Cas5蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.14；Cas6蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.15；Cas11蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.16；Cas3蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.17；与crRNA对应的基因片段为SEQ ID No.1至SEQ ID No.11之一，且优选SEQ ID No.2或SEQ ID No.7。
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
实施例1
本实施例通过敲除TRAC位点实现T细胞产品的通用性，以获得通用型CAR-T细胞。操作流程包括：培养T细胞，制备crRNA和mRNA并电转到T细胞，最后通过流式细胞术和长距离PCR来检测敲除效果。
一、具体实验内容
(1)T细胞培养
使用EasySepTM Human T Cell提取试剂盒从外周血单个核细胞(Peripheralblood mononuclear cells，PBMC)中分离CD3+T细胞。得到的CD3+T细胞接种至含有200U/mL人源IL-2的CTSTM AIM-VTM培养基中，用抗人CD3/CD28磁珠(磁珠与细胞浓度比为1:1)刺激2天。
(2)cas mRNAs体外转录
以携带cas3、cmx8、cas8、cas5、cas6、cas11基因的无内毒素线性质粒作为模板，按照mMessage mMachine T7 Ultra试剂盒的操作说明来进行体外转录，其中用N1-甲基假尿苷三磷酸(m1Ψ-5’-triphosphate)替代尿苷三磷酸(Uridine triphosphate)，并且补加120nt的poly(A)tail。反应产物经过纤维素法柱层析分离纯化后保存于-20℃。
(3)mRNA电转
CD3+T细胞在加入磁珠刺激48h后，可用于电转，去除磁珠，90g离心10min，弃上清，细胞沉淀加入P3缓冲液重悬(每100万个细胞加入20μL缓冲液)。使用Lonza 4D电穿孔***对每孔T细胞进行电穿孔，脉冲代码为EH115，cas mRNAs以及crRNA加入量如下表所示。电穿孔后，每孔立即加入80μL预热培养基，置于37℃细胞培养箱中静置10min，之后将细胞移至24孔细胞培养板。每隔2-3天，补加新鲜的培养基以及人源IL-2(终浓度为100U/mL)。
(4)流式细胞术分析
电穿孔后约5天，离心收集细胞。用25μL含有2％ FBS的PBS缓冲液重悬细胞沉淀，加入TCR特异性抗体IP26对细胞进行染色，在4℃避光孵育20分钟。之后将细胞用FACS缓冲液洗涤2次。使用BD AccuriTM C6 Plus流式细胞仪进行分析，收集到的数据用FlowJov10.7.1进行分析。
(5)PacBio测序分析
按照Puregene Cell试剂盒的操作说明，提取上一步中收集的细胞的基因组DNA。在编辑位点上下游设计引物，序列如下：
Fwd：ttccacctcaaaacattggttccgtc，
Rev：ccctctgacctctgccctaactgg，
利用上述引物，以提取的基因组DNA为模板，按照KOD FX Neo试剂盒的说明进行长片段PCR扩增，PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分离。在紫外灯下观察电泳后的凝胶，进行切胶回收，并通过PacBio测序进行分析。
二、TRAC基因敲除结果分析
为了探究I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑***在哺乳动物基因组中进行基因编辑的能力以及特征，本实施例针对TRAC基因座设计了11条protospacer并且分别合成了71nt的成熟crRNA，各crRNA对应的基因片段序列如下表所示。
对上述11条crRNA进行优选测试实验，具体为：每条crRNA与cas mRNAs一起通过电穿孔递送至CD3+T细胞，培养72h，通过抗体染色流式细胞术检测敲除效率。检测结果如图1所示。
根据上述结果，结合图2所示的TRAC基因敲除位点，选择SEQ ID No.2的crRNA作为G1，并选择SEQ ID No.7的crRNA作为G2，分别与cas mRNAs一起通过电穿孔递送至CD3+T细胞中。通过TCR特异性抗体IP26对T细胞进行染色(其中TRAC基因被破坏的细胞将不会表达TCR，无法对其进行染色)，然后通过流式细胞术来检测敲除效率。
通过流式分析发现，如图3、图4所示，通过递送mRNA以及不同的crRNA(G1、G2)，在CD3+T细胞体内分别可以达到约35.56％以及36.62％的敲除效率，最高可以分别达到40.5％和41.2％，且靶向上游或者下游的crRNA在编辑效率上并没有显著的差异；而递送非靶标的crRNA在CD3+T细胞内达到的效率仅为0.48％，可以忽略不计。
为进一步分析基因缺失的情况，本实施例通过流式分选收集TCR表达显著降低的细胞(靶向G1)，提取基因组进行长片段PCR，对PCR产物进行PacBio测序。将测序结果与原始序列进行比对，得到了总计73条缺失片段，其中有32个样本的缺失长度超过了1kb(如图5所示)；进一步分析发现缺失的起点并不位于假定的R-loop位点，而是位于PAM上游320nt到348nt的一个窗口中(其中有一个例外，其缺失起点位于PAM上游85nt)；并且造成的缺失都是从PAM近端到PAM远端，证明本实施例形成的工具***中，Cas3表现出3'-5'单向的切割活性，而缺失的终点最远可以达到PAM远端约4.5kb，利用本实施例形成的工具***可以在CD3+T细胞内对基因组造成单向的大片段敲除。
三、总结与讨论
通用型CAR-T细胞治疗中最大的挑战在于宿主细胞对通用型CAR-T细胞的免疫排斥以及通用型CAR-T细胞攻击宿主组织器官。αβT细胞占T细胞总数95％以上，αβT细胞的T细胞受体(TCR)由α链(TRAC基因编码)、β1链(TRBC1基因编码)和β2链(TRBC2基因编码)构成，同种异基因CAR-T细胞表面TCR可以识别宿主细胞抗原，引发移植物抗宿主病(GVHD)。此外，同种异基因CAR-T细胞表面的MHC，又称为人类白细胞抗原(HLA)，诱发宿主TCR识别，引起免疫排斥。HLA可分为HLA Ⅰ类分子和HLA Ⅱ类分子，其中，HLA Ⅰ类分子由具有高度多态性的α链和由B2M基因编码的β链(即β2微球蛋白)构成。
本实施例中，首先通过mRNA递送的方式，在CD3+T细胞内进行靶向敲除TRAC基因的编辑实验；在靶基因的上下游分别设计了敲除位点，递送cas mRNA以及crRNA，通过流式细胞术检测编辑效率；然后通过长片段PCR以及PacBio测序，确定DNA缺失的范围。通过上述实验最终确定，本实施例形成的工具***在T细胞内最高可以达到40％的敲除效率；同时经过测序分析，可以发现利用该工具可以在T细胞内造成长达4.5kb的DNA缺失，这也证明了该工具***在真核细胞中进行基因编辑的能力。
本发明首次利用I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑***在T细胞内进行基因编辑，这对于后续开发I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑***的临床应用奠定了基础。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
Claims (10)
1.用于制备通用型CAR-T细胞的基因片段，其特征是，所述基因片段与crRNA相对应；所述基因片段的基本结构为5'-tgagcac-子片段-gtgtccaaaccattg atgccgtaaggcgt-3'；所述基因片段的序列为SEQ ID No.1至SEQ ID No.11之一。
2.根据权利要求1所述的基因片段，其特征是，所述基因片段的序列为SEQ ID No.2或SEQ ID No.7。
3.与权利要求1或2所述的基因片段对应的crRNA。
4.一种工具***，其特征是，所述工具***含有权利要求3所述的crRNA；所述工具***为I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑***。
5.根据权利要求4所述的工具***，其特征是，所述I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑***由Cascade复合物以及Cas3蛋白组成；所述crRNA位于Cascade复合物中；所述Cascade复合物由Cmx8蛋白、Cas8蛋白、Cas5蛋白、Cas6蛋白、Cas11蛋白以及crRNA复合而成；所述Cmx8蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.12；所述Cas8蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.13；所述Cas5蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.14；所述Cas6蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.15；所述Cas11蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.16；所述Cas3蛋白的氨基酸序列为SEQID NO.17。
6.权利要求1或2所述基因片段、或者权利要求3所述crRNA、或者权利要求4或5所述工具***用于敲除TRAC基因的应用、或者用于制备通用型CAR-T细胞的应用。
7.含有权利要求4或5所述工具***的细胞系或细胞株。
8.一种制备通用型CAR-T细胞的方法，其特征是，所述方法包括：采用权利要求4或5所述的工具***对T细胞进行TRAC基因敲除，得到通用型CAR-T细胞。
9.一种通过利用权利要求1或2所述的基因片段、或权利要求3所述的crRNA、或权利要求4或5所述的工具***、或权利要求8所述的方法制备获得的通用型CAR-T细胞。
10.含有权利要求9所述通用型CAR-T细胞的细胞制剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311141019.3A CN116987699A (zh) | 2023-09-05 | 2023-09-05 | 用于制备通用型car-t细胞的基因片段、其工具***及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311141019.3A CN116987699A (zh) | 2023-09-05 | 2023-09-05 | 用于制备通用型car-t细胞的基因片段、其工具***及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116987699A true CN116987699A (zh) | 2023-11-03 |
Family
ID=88532224
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311141019.3A Pending CN116987699A (zh) | 2023-09-05 | 2023-09-05 | 用于制备通用型car-t细胞的基因片段、其工具***及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116987699A (zh) |
Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104718284A (zh) * | 2012-05-25 | 2015-06-17 | 塞勒克提斯公司 | 工程化用于免疫疗法的异体和免疫抑制耐受性t细胞的方法 |
| CN109750035A (zh) * | 2017-11-02 | 2019-05-14 | 上海邦耀生物科技有限公司 | 靶向并引导Cas9蛋白高效切割TCR及B2M基因座的sgRNA |
| CA3163768A1 (en) * | 2018-06-13 | 2019-12-19 | Caribou Biosciences, Inc. | Engineered cascade components and cascade complexes |
| US20200181608A1 (en) * | 2017-06-20 | 2020-06-11 | Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. | METHOD FOR KNOCKING OUT TARGET GENE IN T CELL IN VITRO AND crRNA USED IN THE METHOD |
| CN111278980A (zh) * | 2017-07-14 | 2020-06-12 | 苏州克睿基因生物科技有限公司 | 一种基因编辑***及基因编辑的方法 |
| CN112512557A (zh) * | 2018-04-27 | 2021-03-16 | 克里斯珀医疗股份公司 | 用于浆细胞耗竭的抗bcma car-t-细胞 |
| WO2022132756A1 (en) * | 2020-12-14 | 2022-06-23 | Emendobio Inc. | Biallelic knockout of trac |
| WO2022147321A1 (en) * | 2020-12-30 | 2022-07-07 | The Broad Institute, Inc. | Type i-b crispr-associated transposase systems |
| WO2023039041A1 (en) * | 2021-09-10 | 2023-03-16 | Tmunity Therapeutics Inc. | Alternative generation of allogeneic human t cells |
| CN115851664A (zh) * | 2022-09-19 | 2023-03-28 | 中国药科大学 | 一种I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑***及应用 |
| CN116376945A (zh) * | 2023-03-28 | 2023-07-04 | 中国药科大学 | 一种I型Casposase基因***工具及应用 |
| CN116970609A (zh) * | 2023-09-05 | 2023-10-31 | 深圳市艾迪贝克生物医药有限公司 | 用于清除hbv病毒的基因片段、其工具***及应用 |
-
2023
- 2023-09-05 CN CN202311141019.3A patent/CN116987699A/zh active Pending
Patent Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104718284A (zh) * | 2012-05-25 | 2015-06-17 | 塞勒克提斯公司 | 工程化用于免疫疗法的异体和免疫抑制耐受性t细胞的方法 |
| US20200181608A1 (en) * | 2017-06-20 | 2020-06-11 | Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. | METHOD FOR KNOCKING OUT TARGET GENE IN T CELL IN VITRO AND crRNA USED IN THE METHOD |
| CN111278980A (zh) * | 2017-07-14 | 2020-06-12 | 苏州克睿基因生物科技有限公司 | 一种基因编辑***及基因编辑的方法 |
| CN109750035A (zh) * | 2017-11-02 | 2019-05-14 | 上海邦耀生物科技有限公司 | 靶向并引导Cas9蛋白高效切割TCR及B2M基因座的sgRNA |
| CN112512557A (zh) * | 2018-04-27 | 2021-03-16 | 克里斯珀医疗股份公司 | 用于浆细胞耗竭的抗bcma car-t-细胞 |
| CN112272704A (zh) * | 2018-06-13 | 2021-01-26 | 卡里布生物科学公司 | 改造的cascade组分和cascade复合体 |
| CA3163768A1 (en) * | 2018-06-13 | 2019-12-19 | Caribou Biosciences, Inc. | Engineered cascade components and cascade complexes |
| WO2022132756A1 (en) * | 2020-12-14 | 2022-06-23 | Emendobio Inc. | Biallelic knockout of trac |
| WO2022147321A1 (en) * | 2020-12-30 | 2022-07-07 | The Broad Institute, Inc. | Type i-b crispr-associated transposase systems |
| WO2023039041A1 (en) * | 2021-09-10 | 2023-03-16 | Tmunity Therapeutics Inc. | Alternative generation of allogeneic human t cells |
| CN115851664A (zh) * | 2022-09-19 | 2023-03-28 | 中国药科大学 | 一种I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑***及应用 |
| CN116376945A (zh) * | 2023-03-28 | 2023-07-04 | 中国药科大学 | 一种I型Casposase基因***工具及应用 |
| CN116970609A (zh) * | 2023-09-05 | 2023-10-31 | 深圳市艾迪贝克生物医药有限公司 | 用于清除hbv病毒的基因片段、其工具***及应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| MORTON, LT等: "Simultaneous Deletion of Endogenous TCRαβ for TCR Gene Therapy Creates an Improved and Safe Cellular Therapeutic", MOLECULAR THERAPY, vol. 28, no. 1, 8 January 2020 (2020-01-08), pages 64 - 74 * |
| STEPHANIE HEIN等: "Adaptation and modification of three CRISPR loci in two closely related cyanobacteria", RNA BIOL., vol. 10, no. 5, 1 May 2013 (2013-05-01), pages 852, XP055567408, DOI: 10.4161/rna.24160 * |
| 宋源等: "HER2靶向TRAC和B2M双基因敲除通用型CAR-T细胞的制备及对非小细胞肺癌细胞的杀伤作用", 细胞与分子免疫学杂志, vol. 38, no. 05, 18 May 2022 (2022-05-18), pages 432 - 438 * |
| 张钰雯等: "Ⅰ型CRISPR-Cas***效应物的结构特征及其在基因编辑领域的应用", 中国药科大学学报, vol. 52, no. 06, 25 December 2021 (2021-12-25), pages 675 - 683 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107630006B (zh) | 一种制备tcr与hla双基因敲除的t细胞的方法 | |
| JP7292213B2 (ja) | Ｃｒｉｓｐｒ／ｃｐｆ１を用いる、ｔ細胞における遺伝子編集のための組成物および方法 | |
| AU2024200000A1 (en) | Methods and compositions for gene editing in hematopoietic stem cells | |
| JP7190096B2 (ja) | 遺伝子編集ｔ細胞及びその使用 | |
| CN110616189B (zh) | 通用型靶向cd19抗原嵌合受体t细胞的制备及其应用 | |
| TW201922777A (zh) | 一種sgRNA構建體、提高胎兒血紅蛋白表達的方法及其應用與用途 | |
| CN110616186A (zh) | 增加同种异体t细胞移植相容性的方法及其应用 | |
| AU2016427822A1 (en) | Method for treating autoimmune disease using CD4 T-cells with engineered stabilization of expression of endogennous FOXP3 gene | |
| Wu et al. | The application of CRISPR-Cas9 genome editing tool in cancer immunotherapy | |
| Chen | Efficient gene editing in primary human T cells | |
| Manriquez-Roman et al. | CRISPR takes the front seat in CART-cell development | |
| TW202212352A (zh) | 用於富集基因改造t細胞之方法 | |
| CN110616233B (zh) | CRISPR-Cas9高效敲除原代T细胞基因的方法及其应用 | |
| CN116987699A (zh) | 用于制备通用型car-t细胞的基因片段、其工具***及应用 | |
| CN110029091B (zh) | Pd-1免疫检查点解除抑制的t淋巴细胞制剂的制法 | |
| US20230279352A1 (en) | Methods for generating primary immune cells | |
| WO2021136415A1 (zh) | 一种纯化ucart细胞的方法与应用 | |
| WO2021110099A1 (zh) | 用于改变基因序列的组合物及方法 | |
| EP4175651A1 (en) | Methods and compositions for editing the b2m locus in b cells | |
| Popova et al. | Clinical implementation of genome editing for correction of human diseases | |
| CN113122504A (zh) | 一种纯化ucart细胞的方法与应用 | |
| Gao et al. | Generation, ex vivo expansion and safety of engineered PD1-knockout primary T cells from cynomolgus macaques | |
| US20230272431A1 (en) | Methods and compositions for editing the b2m locus in b cells | |
| WO2023025207A1 (zh) | T细胞产品及其用途 | |
| Deng et al. | CRISPR/CAS9: A THERAPEUTIC SOLUTION BY MANIPULATING NUCLEIC ACIDS |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |