BR112020013848A2 - métodos para expandir linfócitos infiltrantes de tumor e para tratar um indivíduo com câncer, população de linfócitos infiltrantes de tumor, e, método para avaliar fatores de transcrição - Google Patents

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Abstract

A presente invenção provê processos e métodos aperfeiçoados e/ou encurtados para reprogramar TILs com o propósito de preparar populações terapêuticas de TILs com eficácia terapêutica aumentada. Tais TILs reprogramados encontram uso em regimes de tratamento terapêutico.

Description

1 / 509
MÉTODOS PARA EXPANDIR LINFÓCITOS INFILTRANTES DE TUMOR E PARA TRATAR UM INDIVÍDUO COM CÂNCER, POPULAÇÃO DE LINFÓCITOS INFILTRANTES DE TUMOR, E, MÉTODO PARA AVALIAR FATORES DE TRANSCRIÇÃO REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica a prioridade aos Pedido de Patente Provisório Norte-Americana nº 62/614.887, depositado em 8 de janeiro de 2018, Pedido de Patente Provisório Norte-Americana nº 62/664.034, depositado em 27 de abril de 27 de 2018, Pedido de Patente Provisório Norte- Americana nº 62/669.319, depositado em 9 de maio de 2018, Pedido de Patente Provisório Norte-Americana nº 62/697.921, depositado em 13 de julho de 2018, Pedido de Patente Provisório Norte-Americana nº 62/734.868, depositado em 21 de setembro de 2018, e Pedido de Patente Provisório Norte- Americana nº 62/773.715, depositado em 30 de novembro de 2018, que são pelo presente documentos incorporados em suas totalidades como referências.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que tem sido submetida eletronicamente no formato ASCII e é pelo presente documento incorporada em sua totalidade como referência. A dita cópia ASCII, criada em 7 de janeiro de 2019, é nomeada 116983-5034- WO_ST25.txt e é de tamanho de 122 kilobytes.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[003] O tratamento de cânceres volumosos, refratários, usando transferência adotiva de linfócitos infiltrantes de tumor (TILs, Tumor Infiltrating Lymphocytes) representa uma abordagem poderosa para terapia de pacientes com prognósticos desfavoráveis. Gattinoni, et al., Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393. Um grande número de TILs são requeridos para imunoterapia bem sucedida, e um processo robusto e confiável é necessário para comercialização. Isto tem sido um desafio a ser alcançado por causa dos
2 / 509 problemas técnicos, logísticos, e regulatórios relacionados à expansão de células. A expansão de TIL baseada em IL-2 seguida por um “processo de expansão rápida” (REP, Rapid Expansion Process) tem se tornado um método preferido para expansão de TIL por causa de suas velocidade e eficiência. Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39; Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42. REP pode resultar em uma expansão de 1.000 vezes de TILs durante um período de 14 dias, embora ele exija um grande excesso (por exemplo, 200 vezes) de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs, Peripheral Blood Mononuclear Cells, também conhecidas como células mononucleares (MNCs, Mononuclear Cells)) alogeneicas irradiadas, com frequência de múltiplos doadores, como células alimentadoras, e também anticorpo anti-CD3 (OKT3) e doses altas de IL-2. Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42. TILs que têm sido submetidos a um procedimento de REP têm produzido terapia com células adotivas bem sucedida após imunossupressão do hospedeiro em pacientes com melanoma.
[004] Há uma necessidade urgente para prover processos de fabricação de TIL mais potentes ou eficazes e terapias baseadas em tais processos que sejam apropriadas para fabricação em escala comercial e aprovação regulatória para uso em pacientes humanos em múltiplos centros clínicos. A presente invenção atende a esta necessidade pela provisão de processos de alteração genética transiente para reprogramação de TILs com o propósito de preparar populações terapêuticas de TILs com eficácia terapêutica aumentada.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[005] A presente invenção provê métodos aperfeiçoados e/ou encurtados para expandir TILs e produzir populações terapêuticas de TILs.
[006] A presente invenção provê um método para expandir linfócitos
3 / 509 infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs compreendendo: (i) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente; (ii) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2, e opcionalmente OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs; (iii) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com adicionais IL-2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é pelo menos 100 vezes maior em número que a segunda população de TILs, e em que a segunda expansão é realizada durante pelo menos 14 dias com o propósito de obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs; e (iv) expor a segunda e/ou terceira população de TILs aos fatores de transcrição (TFs, Transcription Factors) e/ou a outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína, em que os TFs e/ou as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína proveem expressão alterada de antígenos de tumor e/ou uma alteração no número de células-T específicas para antígenos de tumor na população terapêutica de TILs.
[007] Em algumas modalidades, o método compreende, adicionalmente, expor a segunda e/ou terceira população de TILs aos fatores de transcrição (TFs) e/ou a outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína, em que os TFs e/ou as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína proveem expressão alterada de antígenos de tumor e/ou uma alteração no número de células-T específicas para antígenos de tumor na população terapêutica de TILs.
[008] A presente invenção também provê um método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs compreendendo:
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(a) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3 a 14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (b) para a etapa (c) ocorre sem abrir o sistema; (d) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com adicionais IL- 2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema; (e) expor a segunda e/ou terceira população de TILs aos fatores de transcrição (TFs) e/ou a outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína, em que os TFs e/ou as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína proveem expressão alterada de antígenos de tumor e/ou uma alteração no número de células-T específicas para antígenos de tumor na população terapêutica de TILs;
5 / 509 (f) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (d), em que a transição da etapa (d) para a etapa (e) ocorre sem abrir o sistema; e (g) transferir a população colhida de TILs da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (e) para a etapa (f) ocorre sem abrir o sistema.
[009] Em algumas modalidades, o método compreende, adicionalmente, realizar uma segunda expansão adicional antes ou depois da etapa (iv) pela suplementação do meio de cultura de células da terceira população de TILs com IL-2 adicional, OKT-3 adicional, e APCs adicionais, em que a segunda expansão adicional é realizada durante pelo menos 14 dias para obter uma população terapêutica de TILs maior que a obtida na etapa (iii), em que a população terapêutica maior de TILs apresenta uma alteração no número de células-T específicas para antígenos de tumor.
[0010] Em algumas modalidades, o método compreende, adicionalmente, a etapa de criopreservar a bolsa de infusão compreendendo a população colhida de TILs na etapa (f) usando um processo de criopreservação.
[0011] Em algumas modalidades, o processo de criopreservação é realizado usando uma razão de 1:1 entre a população colhida de TILs e o meio de criopreservação.
[0012] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos são células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). Em algumas modalidades, as PBMCs são irradiadas e alogeneicas. Em algumas modalidades, as PBMCs são adicionadas à cultura de células em qualquer um dos dias 9 até 14 na etapa (d). Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos são células apresentadoras de antígenos artificiais.
[0013] Em algumas modalidades, a colheita na etapa (e) é realizada usando um sistema de processamento de células baseado em membrana.
6 / 509
[0014] Em algumas modalidades, a colheita na etapa (e) é realizada usando um “LOVO Cell Processing System” (Sistema de Processamento de Células LOVO).
[0015] Em algumas modalidades, os múltiplos fragmentos compreendem de cerca de 4 a cerca de 50 fragmentos, em que cada fragmento tem um volume de cerca de 27 mm3.
[0016] Em algumas modalidades, os múltiplos fragmentos compreendem de cerca de 30 a cerca de 60 fragmentos com um volume total de cerca de 1.300 mm3 a cerca de 1.500 mm3.
[0017] Em algumas modalidades, os múltiplos fragmentos compreendem de cerca de 50 fragmentos com um volume total de cerca de
1.350 mm3.
[0018] Em algumas modalidades, os múltiplos fragmentos compreendem de cerca de 50 fragmentos com uma massa total de cerca de 1 grama a cerca de 1,5 gramas.
[0019] Em algumas modalidades, o meio de cultura de células é provido em um recipiente selecionado a partir do grupo consistindo em um recipiente-G e uma bolsa de células Xuri.
[0020] Em algumas modalidades, o meio de cultura de células na etapa (d) compreende, adicionalmente, IL-15 e/ou IL-21.
[0021] Em algumas modalidades, a concentração de Il-2 é cerca de
10.000 UI/mL a cerca de 5.000 UI/mL.
[0022] Em algumas modalidades, a concentração de IL-15 é de cerca de 500 UI/mL a cerca de 100 UI/mL.
[0023] Em algumas modalidades, a concentração de IL-12 é de cerca de 20 UI/mL a cerca de 0,5 UI/mL.
[0024] Em algumas modalidades, a bolsa de infusão na etapa (f) é uma bolsa de infusão contendo HypoThermosol.
[0025] Em algumas modalidades, o meio de criopreservação
7 / 509 compreende sulfóxido dimetílico (DMSO). Em algumas modalidades, o meio de criopreservação compreende 7% a 10% sulfóxido dimetílico (DMSO).
[0026] Em algumas modalidades, o primeiro período na etapa (c) e o segundo período na etapa (e) são, cada um, independentemente, realizados dentro de um período de 10 dias, 11 dias, ou 12 dias.
[0027] Em algumas modalidades, o primeiro período na etapa (c) e o segundo período na etapa (e) são, cada um, independentemente, realizados dentro de um período de 11 dias.
[0028] Em algumas modalidades, as etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 22 dias.
[0029] Em algumas modalidades, as etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 20 dias a cerca de 22 dias.
[0030] Em algumas modalidades, as etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 15 dias a cerca de 20 dias.
[0031] Em algumas modalidades, as etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 20 dias.
[0032] Em algumas modalidades, as etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 15 dias.
[0033] Em algumas modalidades, as etapas (a) até (f) são realizadas em 22 dias ou menos.
[0034] Em algumas modalidades, as etapas (a) até (f) são realizadas em 20 dias ou menos.
[0035] Em algumas modalidades, as etapas (a) até (f) são realizadas em 15 dias ou menos.
[0036] Em algumas modalidades, as etapas (a) até (f) são realizadas em 10 dias ou menos.
[0037] Em algumas modalidades, as etapas (a) até (f) e a criopreservação são realizadas em 22 dias ou menos.
[0038] Em algumas modalidades, população terapêutica de TILs
8 / 509 colhida na etapa (e) compreende TILs suficientes para uma dosagem terapeuticamente eficaz dos TILs.
[0039] Em algumas modalidades, o número de TILs suficientes para uma dosagem terapeuticamente eficaz é de cerca de 2,3×1010 a cerca de 13,7×1010.
[0040] Em algumas modalidades, as etapas (b) até (e) são realizadas em um recipiente único, em que a realização das etapas (b) até (e) em um recipiente único resulta em um aumento no rendimento de TIL por tumor resseccionado em comparação com a realização das etapas (b) até (e) em mais que um recipiente.
[0041] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos são adicionadas aos TILs durante o segundo período na etapa (d) sem abrir o sistema.
[0042] Em algumas modalidades, a terceira população de TILs na etapa (d) provê uma produção de interferon-gama de pelo menos 5 vezes ou mais quando administrada a um indivíduo.
[0043] Em algumas modalidades, o risco de contaminação microbiana é reduzido em comparação com um sistema aberto.
[0044] Em algumas modalidades, os TILs da etapa (f) ou (g) são infundidos em um paciente.
[0045] Em algumas modalidades, os múltiplos fragmentos compreendem cerca de 4 fragmentos.
[0046] A presente invenção também provê um método para tratar um indivíduo com câncer, o método compreendendo administrar linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) expandidos compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor resseccionado de um indivíduo pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado;
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(c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3 a 14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (b) para a etapa (c) ocorre sem abrir o sistema; (d) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com adicionais IL- 2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema; (e) expor a segunda e/ou terceira população de TILs aos fatores de transcrição (TFs) e/ou a outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína, em que os TFs e/ou as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína proveem expressão aumentada de antígenos de tumor e/ou um aumento no número de células-T específicas para antígenos de tumor na população terapêutica de TILs; (f) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (d), em que a transição da etapa (d) para a etapa (e) ocorre sem abrir o sistema; e (g) transferir a população colhida de TILs da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (e) para a etapa (f) ocorre
10 / 509 sem abrir o sistema; (h) opcionalmente criopreservar a bolsa de infusão compreendendo a população colhida de TILs da etapa (f) usando um processo de criopreservação; e (i) administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz da terceira população de TILs da bolsa de infusão na etapa (g) ao paciente.
[0047] Em algumas modalidades, a população terapêutica de TILs colhida na etapa (f) compreende TILs suficientes para administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz dos TILs na etapa (h).
[0048] Em algumas modalidades, o número de TILs suficientes para administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz na etapa (h) é de cerca de 2,3×1010 a cerca de 13,7×1010.
[0049] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos (APCs, Antigen Presenting Cells) são PBMCs.
[0050] Em algumas modalidades, as PBMCs são adicionadas à cultura de células em qualquer um dos dias 9 até 14 na etapa (d).
[0051] Em algumas modalidades, antes de administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz de células TIL na etapa (h), um regime de linfodepleção não mieloablativo tem sido administrado ao paciente.
[0052] Em algumas modalidades, regime de linfodepleção não mieloablativo compreende as etapas de administração de ciclofosfamida a uma dose de 60 mg/m²/dia durante dois dias seguida pela administração de fludarabina a uma dose de 25 mg/m²/dia durante cinco dias.
[0053] Em algumas modalidades, o método compreende, adicionalmente, a etapa de tratamento do paciente com um regime de alta dose de IL-2 iniciando no dia após a administração das células TIL ao paciente na etapa (h).
[0054] Em algumas modalidades, o regime de alta dose de IL-2 compreende 600.000 ou 720.000 UI/kg administrados como uma infusão
11 / 509 intravenosa de bolus durante 15 minutos a cada oito horas até tolerância.
[0055] Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir do grupo consistindo em melanoma, câncer ovariano, câncer cervical, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC, Non-Small-Cell Lung Cancer), câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer causado pelo vírus do papiloma humano, câncer de cabeça e pescoço (incluindo carcinoma de células escamosas da cabeça e do pescoço (HNSCC, Head and Neck Squamous Cell Carcinoma)), câncer renal, e carcinoma de célula renal.
[0056] Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir do grupo consistindo em melanoma, HNSCC, cânceres cervicais, e NSCLC.
[0057] Em algumas modalidades, o câncer é melanoma.
[0058] Em algumas modalidades, o câncer é HNSCC.
[0059] Em algumas modalidades, o câncer é um câncer cervical.
[0060] Em algumas modalidades, o câncer é NSCLC.
[0061] A presente invenção também provê métodos para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs compreendendo: (a) adicionar fragmentos de tumor processados de um tumor ressecionado de um paciente a um sistema fechado para obter uma primeira população de TILs; (b) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3 a 14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (a) para a etapa (b) ocorre sem abrir o sistema;
12 / 509 (c) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com adicionais IL- 2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que a transição da etapa (b) para a etapa (c) ocorre sem abrir o sistema; (d) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (c), em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema; e (e) transferir a população colhida de TILs da etapa (d) para uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (d) para (e) ocorre sem abrir o sistema.
[0062] Em algumas modalidades, a população terapêutica de TILs colhida na etapa (d) compreende TILs suficientes para uma dosagem terapeuticamente eficaz dos TILs.
[0063] Em algumas modalidades, o número de TILs suficientes para uma dosagem terapeuticamente eficaz é de cerca de 2,3×1010 a cerca de 13,7×1010.
[0064] Em algumas modalidades, o método compreende, adicionalmente, a etapa de criopreservar a bolsa de infusão compreendendo a população colhida de TILs usando um processo de criopreservação.
[0065] Em algumas modalidades, o processo de criopreservação é realizado usando uma razão de 1:1 entre a população colhida de TILs e o meio de criopreservação.
[0066] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos são células mononucleares do sangue periférico (PBMCs).
[0067] Em algumas modalidades, as PBMCs são irradiadas e
13 / 509 alogeneicas.
[0068] O método de acordo com a reivindicação 68, em que as PBMCs são adicionadas à cultura de células em qualquer um dos dias 9 até 14 na etapa (c).
[0069] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos são células apresentadoras de antígenos artificiais.
[0070] Em algumas modalidades, a colheita na etapa (d) é realizada usando um “LOVO Cell Processing System” (sistema de processamento de células LOVO).
[0071] Em algumas modalidades, os múltiplos fragmentos compreendem de cerca de 4 a cerca de 50 fragmentos, em que cada fragmento tem um volume de cerca de 27 mm3.
[0072] Em algumas modalidades, os múltiplos fragmentos compreendem de cerca de 30 a cerca de 60 fragmentos com um volume total de cerca de 1.300 mm3 a cerca de 1.500 mm3.
[0073] Em algumas modalidades, os múltiplos fragmentos compreendem de cerca de 50 fragmentos com um volume total de cerca de
1.350 mm3.
[0074] Em algumas modalidades, os múltiplos fragmentos compreendem de cerca de 50 fragmentos com uma massa total de cerca de 1 grama a cerca de 1,5 gramas.
[0075] Em algumas modalidades, os múltiplos fragmentos compreendem cerca de 4 fragmentos.
[0076] Em algumas modalidades, o segundo meio de cultura de células é provido em um recipiente selecionado a partir do grupo consistindo em um recipiente-G e uma bolsa de células Xuri.
[0077] Em algumas modalidades, a bolsa de infusão na etapa (e) é uma bolsa de infusão contendo HypoThermosol.
[0078] Em algumas modalidades, o primeiro período na etapa (b) e o
14 / 509 segundo período na etapa (c) são, cada um, independentemente, realizados dentro de um período de 10 dias, 11 dias, ou 12 dias.
[0079] Em algumas modalidades, o primeiro período na etapa (b) e o segundo período na etapa (c) são, cada um, independentemente, realizados dentro de um período de 11 dias.
[0080] Em algumas modalidades, as etapas (a) até (e) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 22 dias.
[0081] Em algumas modalidades, as etapas (a) até (e) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 20 dias.
[0082] Em algumas modalidades, as etapas (a) até (e) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 15 dias.
[0083] Em algumas modalidades, as etapas (a) até (e) são realizadas em 22 dias ou menos.
[0084] Em algumas modalidades, as etapas (a) até (e) e a criopreservação são realizadas em 22 dias ou menos.
[0085] Em algumas modalidades, as etapas (b) até (e) são realizadas em um recipiente único, em que a realização das etapas (b) até (e) em um recipiente único resulta em um aumento no rendimento de TIL por tumor resseccionado em comparação com a realização das etapas (b) até (e) em mais que um recipiente.
[0086] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos são adicionadas aos TILs durante o segundo período na etapa (c) sem abrir o sistema.
[0087] Em algumas modalidades, o risco de contaminação microbiana é reduzido em comparação com um sistema aberto.
[0088] Em algumas modalidades, os TILs da etapa (e) são infundidos em um paciente.
[0089] Em algumas modalidades, o recipiente fechado compreende um biorreator único.
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[0090] Em algumas modalidades, o recipiente fechado compreende um frasco G-Rex-10.
[0091] Em algumas modalidades, o recipiente fechado compreende um frasco G-Rex-100.
[0092] Em algumas modalidades, na etapa (d) as células apresentadoras de antígenos (APCs) são adicionadas à cultura de células da segunda população de TILs a uma razão de APC:TIL de 25:1 a 100:1.
[0093] Em algumas modalidades, a cultura de células tem uma razão de 2,5×109 APCs para 100×106 TILs.
[0094] Em algumas modalidades, na etapa (c) as células apresentadoras de antígenos (APCs) são adicionadas à cultura de células da segunda população de TILs a uma razão de APC:TIL de 25:1 a 100:1.
[0095] Em algumas modalidades, a cultura de células tem uma razão de 2,5×109 APCs para 100×106 TILs.
[0096] A presente invenção também provê uma população de TILs expandidos para uso no tratamento de um indivíduo com câncer, em que a população de TILs expandidos é uma terceira população de TILs obtenível por um método compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor resseccionado de um indivíduo pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3 a 14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de
16 / 509 TILs, e em que a transição da etapa (b) para a etapa (c) ocorre sem abrir o sistema; (d) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com adicionais IL- 2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema; (e) expor a segunda e/ou terceira população de TILs aos fatores de transcrição (TFs) e/ou a outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína, em que os TFs e/ou as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína proveem expressão aumentada de antígenos de tumor e/ou um aumento no número de células-T específicas para antígenos de tumor na população terapêutica de TILs; (f) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (d), em que a transição da etapa (d) para a etapa (e) ocorre sem abrir o sistema; e (g) transferir a população colhida de TILs da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (e) para a etapa (f) ocorre sem abrir o sistema; e (h) opcionalmente criopreservar a bolsa de infusão compreendendo a população colhida de TILs da etapa (f) usando um processo de criopreservação.
[0097] Em algumas modalidades, a população de TILs é para uso para tratar um indivíduo com câncer de acordo com os métodos descritos acima e na presente invenção, em que o método adicionalmente compreende uma ou
17 / 509 mais das características citadas acima e na presente invenção.
[0098] A presente invenção também provê métodos de ensaio para determinar a viabilidade de TIL. A presente descrição provê métodos para ensaiar TILs para viabilidade pela expansão de linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população maior de TILs compreendendo: (i) obter uma primeira população de TILs que tem sido previamente expandida; (ii) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 para produzir uma segunda população de TILs; e (iii) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com adicionais IL- 2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é pelo menos 100 vezes maior em número que a segunda população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante pelo menos 14 dias com o propósito de obter a terceira população de TILs, e em que a terceira população de TILs é adicionalmente ensaiada para viabilidade.
[0099] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente: (iv) realizar uma segunda expansão adicional pela suplementação do meio de cultura de células da terceira população de TILs com IL-2 adicional, OKT-3 adicional, e APCs adicionais, em que a segunda expansão adicional é realizada durante pelo menos 14 dias para obter uma população de TILs maior que a obtida na etapa (iii), e em que a terceira população é adicionalmente ensaiada para viabilidade.
[00100] Em algumas modalidades, antes da etapa (i), as células são criopreservadas.
[00101] Em algumas modalidades, as células são descongeladas antes
18 / 509 da realização da etapa (i).
[00102] Em algumas modalidades, a etapa (iv) é repetida uma a quatro vezes com o propósito de obter TILs suficientes para análise.
[00103] Em algumas modalidades, as etapas (i) até (iii) ou (iv) são realizadas dentro de um período de cerca de 40 dias a cerca de 50 dias.
[00104] Em algumas modalidades, as etapas (i) até (iii) ou (iv) são realizadas dentro de um período de cerca de 42 dias a cerca de 48 dias.
[00105] Em algumas modalidades, as etapas (i) até (iii) ou (iv) são realizadas dentro de um período de cerca de 42 dias a cerca de 45 dias.
[00106] Em algumas modalidades, as etapas (i) até (iii) ou (iv) são realizadas dentro de cerca de 44 dias.
[00107] Em algumas modalidades, as células das etapas (iii) ou (iv) expressam CD4, CD8, e TCR α β em teores similares aos das células recém- colhidas.
[00108] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos são células mononucleares do sangue periférico (PBMCs).
[00109] Em algumas modalidades, as PBMCs são adicionadas à cultura de células em qualquer um dos dias 9 até 17 na etapa (iii).
[00110] Em algumas modalidades, as APCs são APCs artificiais (aAPCs, artificial APCs).
[00111] Em algumas modalidades, o método compreende, adicionalmente, a etapa de transdução da primeira população de TILs com um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica um receptor de célula-T de alta afinidade.
[00112] Em algumas modalidades, a etapa de transdução ocorre antes da etapa (i).
[00113] Em algumas modalidades, o método compreende, adicionalmente, a etapa de transdução da primeira população de TILs com um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica um
19 / 509 receptor quimérico de antígeno (CAR, Chimeric Antigen Receptor) compreendendo um anticorpo de fragmento variável de cadeia única fusionado com pelo menos um endodomínio de uma molécula de sinalização de célula-T.
[00114] Em algumas modalidades, a etapa de transdução ocorre antes da etapa (i).
[00115] Em algumas modalidades, os TILs são ensaiados para viabilidade.
[00116] Em algumas modalidades, os TILs são ensaiados para viabilidade após a criopreservação.
[00117] Em algumas modalidades, os TILs são ensaiados para viabilidade após a criopreservação e após a etapa (iv).
[00118] A presente invenção também provê um método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs compreendendo expor os TILs aos fatores de transcrição (TFs) e/ou a outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína com o propósito de gerar uma população terapêutica de TILs, em que os TFs e/ou as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína proveem expressão aumentada de antígenos de tumor e/ou um aumento no número de células-T específicas para antígenos de tumor na população terapêutica de TILs.
[00119] Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em indução de expressão de proteína.
[00120] Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em uma redução de expressão de proteína.
[00121] Em algumas modalidades, um ou mais sd-RNA(s) é utilizado para reduzir a expressão transiente de proteína.
[00122] A presente invenção também provê um método para avaliar fatores de transcrição (TFs) e/ou outras moléculas capazes de transientemente
20 / 509 alterar a expressão de proteína, em que o método compreende expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs, expor os TILs aos fatores de transcrição (TFs) e/ou a outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína com o propósito de gerar uma população terapêutica de TILs, em que os TFs e/ou as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína proveem expressão alterada de antígenos de tumor e/ou uma alteração no número de células-T específicas para antígenos de tumor na população terapêutica de TILs.
[00123] Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo um gene selecionado a partir do grupo consistindo em PD-1, TGFBR2, CBLB (CBL-B), CISH, CCRs (Chimeric Co-Stimulatory Receptors, receptores coestimulatórios quiméricos), IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, NOTCH 1/2 ICD, TIM3, LAG3, TIGIT, TGFβ, CCR2, CCR4, CCR5, CXCR1, CXCR2, CSCR3, CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP1- β), CCL5 (RANTES), CXCL1/CXCL8, CCL22, CCL17, CXCL1/CXCL8, VHL, CD44, PIK3CD, SOCS1, e proteína-quinase A (PKA) dependente de cAMP.
[00124] Em algumas modalidades, a presente invenção provê um método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 e opcionalmente compreendendo um anticorpo agonista de 4-1BB durante cerca de 2 a 5 dias;
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(d) colocar a primeira população de TILs em contato com pelo menos um sd-RNA, em que o sd-RNA é adicionado a uma concentração de 0,1 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 0,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 0,75 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1,25 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 2 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, ou 10 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, e em que o sd-RNA é para inibir a expressão de uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, e combinações das mesmas; (e) opcionalmente realizar uma etapa de eletroporação estéril na primeira população de TILs, em que a etapa de eletroporação estéril medeia a transferência do pelo menos um sd-RNA; (f) adicionar OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 1 a 3 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que as transições da etapa (c) para a etapa (f) ocorrem sem abrir o sistema; (g) repousar a segunda população de TILs durante cerca de 1 dia; (h) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com IL-2 adicional, opcionalmente anticorpo OKT-3, opcionalmente um anticorpo OX40, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 11 dias para obter a terceira população de TILs, em que a segunda expansão
22 / 509 é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que as transições da etapa (c) para a etapa (h) ocorrem sem abrir o sistema; (i) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (h) para prover uma população colhida de TILs, em que a transição da etapa (h) para a etapa (i) ocorre sem abrir o sistema, a população colhida de TILs é uma população terapêutica de TILs; (j) transferir a população colhida de TILs da etapa (i) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (i) para a etapa (j) ocorre sem abrir o sistema; e (k) criopreservar a população colhida de TILs usando um meio de criopreservação baseado em sulfóxido dimetílico.
[00125] Em algumas modalidades, a presente invenção provê um método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 e opcionalmente compreendendo um anticorpo agonista de 4-1BB durante cerca de 2 a 5 dias; (d) colocar a primeira população de TILs em contato com pelo menos um sd-RNA, em que o sd-RNA é adicionado a uma concentração de 0,1 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 0,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 0,75 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1,25 μM de sd- RNA/10.000 TILs, 1,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 2 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, ou 10 μM de sd-RNA/10.000 TILs, e
23 / 509 em que o sd-RNA é para inibir a expressão de uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, e combinações das mesmas; (e) opcionalmente realizar uma etapa de eletroporação estéril na primeira população de TILs, em que a etapa de eletroporação estéril medeia a transferência do pelo menos um sd-RNA; (f) adicionar OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 1 a 3 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que as transições da etapa (c) para a etapa (f) ocorrem sem abrir o sistema; (g) repousar a segunda população de TILs durante cerca de 1 dia; (h) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com IL-2 adicional, opcionalmente anticorpo OKT-3, opcionalmente um anticorpo OX40, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 11 dias para obter a terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que a transição da etapa (g) para a etapa (h) ocorre sem abrir o sistema; (i) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (h) para prover uma população colhida de TILs, em que a transição da etapa (h) para a etapa (i) ocorre sem abrir o sistema, a população colhida de TILs é uma população terapêutica de TILs; (j) transferir a população colhida de TILs da etapa (i) para uma
24 / 509 bolsa de infusão, em que a transição da etapa (i) para a etapa (j) ocorre sem abrir o sistema; e (k) criopreservar a população colhida de TILs usando um meio de criopreservação baseado em sulfóxido dimetílico.
[00126] Em algumas modalidades, a presente invenção provê um método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 e opcionalmente compreendendo um anticorpo agonista de 4-1BB durante cerca de 2 a 5 dias; (d) adicionar OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 1 a 3 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema; (e) repousar a segunda população de TILs durante cerca de 1 dia; (f) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com IL-2 adicional, opcionalmente anticorpo OKT-3, opcionalmente um anticorpo OX40, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7
25 / 509 a 11 dias para obter a terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que as transições da etapa (c) para a etapa (f) ocorrem sem abrir o sistema; (g) colocar a segunda população de TILs durante qualquer uma das etapas (d), (e), e/ou (f) em contato com pelo menos um sd-RNA, em que o sd-RNA é adicionado a uma concentração de 0,1 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 0,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 0,75 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1,25 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 2 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, ou 10 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, e em que o sd-RNA é para inibir a expressão de uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, e combinações das mesmas; (h) opcionalmente realizar uma etapa de eletroporação estéril na segunda população de TILs, em que a etapa de eletroporação estéril medeia a transferência do pelo menos um sd-RNA; (i) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapas (g) ou (h) para prover uma população colhida de TILs, em que as transições da etapa (g) para a etapa (i) ocorrem sem abrir o sistema, a população colhida de TILs é uma população terapêutica de TILs; (j) transferir a população colhida de TILs da etapa (i) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (i) para a etapa (j) ocorre sem abrir o sistema; e (k) criopreservar a população colhida de TILs usando um meio de criopreservação baseado em sulfóxido dimetílico.
[00127] Em algumas modalidades, a presente invenção provê um método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma
26 / 509 população terapêutica de TILs compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 e opcionalmente compreendendo um anticorpo agonista de 4-1BB durante cerca de 2 a 5 dias; (d) adicionar OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 1 a 3 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema; (e) repousar a segunda população de TILs durante cerca de 1 dia; (f) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com IL-2 adicional, opcionalmente anticorpo OKT-3, opcionalmente um anticorpo OX40, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 11 dias para obter a terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que a transição da etapa (e) para a etapa (f) ocorre sem abrir o sistema; (g) colocar a segunda população de TILs durante qualquer uma das etapas (d), (e), e/ou (f) em contato com pelo menos um sd-RNA, em que o
27 / 509 sd-RNA é adicionado a uma concentração de 0,1 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 0,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 0,75 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1,25 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 2 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 5 μM de sd- RNA/10.000 TILs, ou 10 μM de sd-RNA/10.000 TILs, e em que o sd-RNA é para inibir a expressão de uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, e combinações das mesmas; (h) opcionalmente realizar uma etapa de eletroporação estéril na segunda população de TILs, em que a etapa de eletroporação estéril medeia a transferência do pelo menos um sd-RNA; (i) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapas (g) ou (h) para prover uma população colhida de TILs, em que as transições da etapa (e) para a etapa (h) ocorrem sem abrir o sistema, a população colhida de TILs é uma população terapêutica de TILs; (j) transferir a população colhida de TILs da etapa (i) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (h) para a etapa (i) ocorre sem abrir o sistema; e (k) criopreservar a população colhida de TILs usando um meio de criopreservação baseado em sulfóxido dimetílico.
[00128] Em algumas modalidades, o sd-RNA é adicionado à primeira população de células duas vezes por dia, um vez por dia, a cada dois dias, a cada três dias, a cada quatro dias, a cada cinco dias, a cada seis dias, ou a cada sete dias durante o primeiro período de expansão.
[00129] Em algumas modalidades, o sd-RNA é adicionado à segunda população de células duas vezes por dia, um vez por dia, a cada dois dias, a cada três dias, a cada quatro dias, a cada cinco dias, a cada seis dias, ou a cada sete dias durante o primeiro período de expansão.
[00130] Em algumas modalidades, dois sd-RNAs são adicionados para
28 / 509 inibir a expressão de duas moléculas selecionadas a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB.
[00131] Em algumas modalidades, dois sd-RNAs são adicionados para inibir a expressão de duas moléculas, em que as duas moléculas são selecionadas a partir do grupo consistindo em: i. PD-1 e LAG-3, ii. PD-1 e TIM-3, iii. PD-1 e CISH, iv. PD-1 e CBLB, v. LAG-3 e TIM-3, vi. LAG-3 e CISH, vii. LAG-3 e CBLB, viii. TIM-3 e CISH, ix. TIM-3 e CBLB, e x. CISH e CBLB.
[00132] Em algumas modalidades, mais que dois sd-RNAs são adicionados para inibir a expressão de mais que duas moléculas selecionadas a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB.
[00133] Em algumas modalidades, a expressão de pelo menos uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB é reduzida em pelo menos 80%, 85%, 90%, ou 95% nos TILs em contato com o pelo menos um sd-RNA.
[00134] Em algumas modalidades, a expressão de pelo menos uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB é reduzida em pelo menos 80%, 85%, 90%, ou 95% durante pelo menos 12 horas, pelo menos 24 horas, ou pelo menos 48 horas, nos TILs em contato com o pelo menos um sd-RNA.
DESCRIÇÃO BREVE DOS DESENHOS
[00135] Figura 1: Mostra um diagrama de uma modalidade do
29 / 509 processo 2A, um processo de 22 dias para fabricar TIL.
[00136] Figura 2: Mostra uma comparação entre o processo 1C e uma modalidade do processo 2A para fabricar TIL.
[00137] Figura 3: Mostra a linha do tempo do processo 1C.
[00138] Figura 4: Mostra o processo de uma modalidade de terapia com TIL usando o processo 2A para fabricar TIL, incluindo etapas de administração e coterapia, para contagens mais altas de células.
[00139] Figura 5: Mostra o processo de uma modalidade de terapia com TIL usando o processo 2A para fabricar TIL, incluindo etapas de administração e coterapia, para contagens mais baixas de células.
[00140] Figura 6: Mostra um esquema detalhado para uma modalidade do processo 2A.
[00141] Figura 7A – Figura 7C: Representam as etapas principais de uma modalidade do processo 2A incluindo as etapas de criopreservação.
[00142] Figura 8: Diagrama de Processo 2A Exemplificador que provê uma visão geral das Etapas A até F.
[00143] Figura 9: Fluxograma de Processo sobre o Plano de Coleta de Dados do Processo 2A.
[00144] Figura 10: Esquema sobre modalidade exemplificadora do Protocolo de Expansão Rápida (REP, Rapid Expansion Protocol). Após a chegada, o tumor é fragmentado, colocado em frascos G-Rex com IL-2 para expressão de TIL (expansão pre-REP), durante 11 dias. Para os estudos com coquetel triplo, IL-2/IL-15/IL-21 é adicionada no início do pre-REP. Para o Protocolo de Expansão Rápida (REP), os TILs são cultivados com células alimentadoras e OKT3 para expansão por REP durante um adicional de 11 dias.
[00145] Figura 11: Processo de fabricação exemplificador de TIL Criopreservado (~22 dias).
[00146] Figura 12: Mostra um diagrama de uma modalidade do
30 / 509 processo 2A, um processo de 22 dias para fabricar TIL.
[00147] Figura 13: Tabela de comparação de Etapas A até F das modalidades exemplificadoras do processo 1C e do processo 2A.
[00148] Figura 14: Comparação detalhada de uma modalidade do processo 1C e uma modalidade do processo 2A.
[00149] Figura 15: Representação de uma modalidade de um processo de fabricação de TIL criopreservado (22 dias).
[00150] Figura 16: Tabela de aprimoramentos de processo de Ger 1 a Ger 2.
[00151] Figura 17: Esquema do processo de fabricação de LN-144 criopreservado Ger 2.
[00152] Figura 18: Mostra um diagrama de uma modalidade do processo 2A, um processo de 22 dias para fabricar TIL.
[00153] Figura 19: Mostra um esquema de solda estéril (consulte, Nota 5.11 do Processo no Exemplo 16) do pacote de transferência de Suspensão de TILs no fundo (linha única) de um Filtro de Sangue por Gravidade.
[00154] Figura 20: Mostra um esquema de solda estéril (consulte, Nota 5.11 do Processo no Exemplo 16) da linha vermelha de remoção de meio do G-Rex-100MCS no pacote de transferência de “Sobrenadante”.
[00155] Figura 21: Mostra um esquema da solda (consulte, Nota 5.11 do Processo no Exemplo 16) de 4S-4M60 a uma Conexão de Célula CC2, substituindo uma ponta perfurante (spike) única do aparelho de Conexão de Célula (B) pela extremidade de 4 pontas perfurantes (spikes) do manifolde 4S-4M60 em (G).
[00156] Figura 22: Mostra um esquema da solda (consulte, Nota 5.11 do Processo no Exemplo 16) do conjunto de transferência de fluido de bomba Repeater™ em uma das extremidades de Luer macho de 4S-4M60.
[00157] Figura 23: Mostra um esquema de solda estéril (consulte,
31 / 509 Nota 5.11 do Processo no Exemplo 16) da extremidade terminal longa do filtro de sangue por gravidade na bolsa fonte LOVO.
[00158] Figura 24: Mostra um esquema de solda estéril (consulte, Nota 5.11 do Processo no Exemplo 16) de uma das duas linhas de fonte do filtro na bolsa de colheita de “suspensão de TILs agrupados”.
[00159] Figura 25: Mostra um esquema de solda estéril (consulte, Nota 5.11 do Processo no Exemplo 16) de um 4S-4M60 em uma Conexão de Célula CC2 substituindo uma ponta perfurante (spike) única do aparelho de Conexão de Célula (B) pela extremidade de 4 pontas perfurantes (spikes) do manifolde 4S-4M60 em (G).
[00160] Figura 26: Mostra um esquema de solda estéril (consulte, Nota 5.11 do Processo no Exemplo 16) das Criobolsas CS750 no cabo de ligações preparado na etapa 8.14.8, substituindo uma das quatro extremidades Luer macho (E) por cada bolsa.
[00161] Figura 27: Mostra um esquema da conexão (consulte, Nota
5.11 do Processo no Exemplo 16) das bolsas CS-10 nas pontas perfurantes (spikes) do 4S-4M60.
[00162] Figura 28: Mostra um esquema da conexão (consulte, Nota
5.11 do Processo no Exemplo 16) da bolsa de “TILs Formulados” na ponta perfurante (spike) restante (A) no aparelho preparado na etapa 8.14.10.
[00163] Figura 29: Mostra um diagrama da vedação por calor (consulte, Nota 5.12 de Processo no Exemplo 16) em F, removendo a bolsa de retentado vazia e as bolsas CS-10.
[00164] Figura 30: Mostra um esquema de uma modalidade de um processo de TILs para edição genética transiente.
[00165] Figura 31: Mostra esquemas de modalidades de processos de TILs para edição genética transiente.
[00166] Figura 32: Mostra um esquema que relaciona a incorporação de uma etapa de transferência de RNA em um processo de TILs para
32 / 509 propósitos de reprogramação gênica transiente.
[00167] Figura 33: Mostra uma visão geral das abordagens de modificação genética propostas para expressão gênica transientemente alterada em TILs.
[00168] Figura 34: Mostra uma visão geral de quimiocinas e receptores de quimiocinas para os quais alteração transiente de expressão gênica pode ser utilizada para aprimorar o tráfego de TILs para o sítio de tumor.
[00169] Figura 35: Mostra uma segunda visão geral de quimiocinas e receptores de quimiocinas para os quais alteração transiente de expressão gênica pode ser utilizada para aprimorar o tráfego de TILs para o sítio de tumor.
[00170] Figura 36: Mostra uma representação estrutural esquemática de uma modalidade exemplificadora de ácido ribonucleico autodistribuível (sd-RNA, self-delivering ribonucleic acid). Consulte, Ligtenberg, et al., Mol. Therapy, 2018.
[00171] Figura 37: Mostra uma representação estrutural esquemática de uma modalidade exemplificadora de sd-RNA. Consulte, Publicação de Patente Norte-Americana nº 2016/0304873.
[00172] Figura 38: Mostra um esquema exemplificador para a síntese de mRNA usando um molde de DNA obtido por PCR com o uso de iniciadores especialmente desenhados. O iniciador direto contém um promotor de bacteriófago adequado para transcrição in vitro e o iniciador reverso contém um trecho de poliT. O produto de PCR é um cassete de expressão adequado para transcrição in vitro. Poliadenilados na extremidade 3’ do mRNA nascente podem prevenir a síntese runoff de RNA aberrante e a criação de produto de RNA de fita dupla. Após a completitude da transcrição, a cauda de poli(A) pode ser adicionalmente prolongada com poli(A)- polimerase. (Consulte, a Patente Norte-Americana nº 8.859.229.)
33 / 509
[00173] Figura 39: Tabela mostrando o silenciamento, mediado por sd-rxRNA, de PDCD1, TIM3, CBLB, LAG3, e CISH.
[00174] Figura 40: Silenciamento gênico, mediado por sd-rxRNA, em TIL; protocolo exemplificador. Tumores exemplificadores incluem melanoma (fresco ou congelado; n=6), tumor de mama (fresco ou congelado; n=5), tumor de pulmão (n=1), sarcoma (n=1), e/ou tumor ovariano (n=1).
[00175] Figura 41: Redução da expressão de proteína foi detectada em 4 dos 5 alvos. PD1: n=9, TIM3: n=8, LAG3/CISH: n=2, Cb1-b n=2. Preparações de pre-REP TILs de melanoma e de câncer de mama fresco, 2µM de sd-rxRNA. KD (Knockdown, Atenuação) % calculada como (100- (100*(gene de interesse/NTC))).
[00176] Figura 42: KD induzida por sd-rxRNA decresceu com o tempo e a estimulação. n=3, preparações de pre-REP TILs de melanoma, 2µM de sd-rxRNA.
[00177] Figura 43: Viabilidade de TIL foi muito pouco afetada por PDCD1 sd-rxRNA. PD1, TIM3 n>6, preparações de pre-REP TILs de câncer de mama fresco/melanoma fresco. LAG3, CISH n=2, pre-REP TILs de câncer de mama e de melanoma, 2µM de sd-rxRNA.
[00178] Figura 44: KD (Atenuações), mediadas por sd-rxRNA, de PD1 e TIM3, foram associadas às alterações fenotípicas indicativas de ativação de TIL. n=3, preparações de pre-REP TILs de melanoma, 2µM de sd-rxRNA.
[00179] Figura 45A e Figura 45B: Atenuação (Knockdown, KD) de PD1 e TIM3 pelos sd-rxRNAs não afeta a expressão de outros marcadores inibitórios/de exaustão. A) e B) n=3, TIM3: n=2, preparações de pre-REP TILs de melanoma, 2µM de sd-rxRNA.
[00180] Figura 46: KD de PD1 e TIM3 não aprimorou significativamente a secreção de IFNγ. n=3, preparações de pre-REP TILs de melanoma, 2µM de sd-rxRNA.
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[00181] Figura 47A - Figura 47F: Mobilização de CD107a não foi afetada por nenhuns dos sd-rxRNAs. A) n=6, preparações de pre-REP TILs de melanoma, 2µM de sd-rxRNA. B) n=2, preparações de pre-REP TILs de câncer de mama e de melanoma, 2µM de sd-rxRNA. C) n=3, TILs de Melanoma Congelado e de câncer de mama fresco. D) n=3, TILs de Melanoma Congelado e de câncer de mama fresco e de câncer de pulmão fresco. E) e F) n=3, preparações frescas de tumores de câncer de mama.
[00182] Figura 48: A Análise Celular em Tempo Real xCELLigence [“xCELLigence Real-Time Cell Analysis” (RTCA)].
[00183] Figura 49A e Figura 49B: PD1 KD TILs produziram maior eficiência exterminadora. A) Figura representativa da eficiência exterminadora. B) Figura representativa de n=3, TILs de melanoma, 2µM de sd-rxRNA.
[00184] Figura 50A e Figura 50B: Experimentos de resposta à dose de sd-rxRNA. A) n=3, preparações frescas de tumores de câncer de mama. B) n=3, preparações de pre-REP TILs de melanoma.
[00185] Figura 51: Atenuação (Knockdown, KD), mediada por sd- rxRNA, de CBLB não pôde ser detectada. A) Gráfico. B) Gráficos de ensaio por citometria de fluxo. n=2, preparações de TILs de câncer de mama fresco e de melanoma pre-REP. Não houve alteração em teores de mRNA de CBLB em comparação com NTC. Não houve alteração em teor de proteína de Cb1-b usando ensaio via citometria de fluxo.
[00186] Figura 52A e Figura 52B: Mostram o teste de silenciamento gênico, mediado por sd-rxRNA, no processo de fabricação de TIL da Iovance, avaliando o fenótipo de TIL. Atenuação (knockdown, KD), mediada por sd- rxRNA, de PD-1 esteve associada às alterações fenotípicas indicativas de ativação de TIL. PD-1, n>6, preparações de TILs de câncer de mama fresco/melanoma pre-REP, 2µM de sd-rxRNA. A) CD25, CCR7, CD27, CD28, CD56, CD95, 4-1BB, e OX40. B) CD25, CD56, CCR7, 4-1BB, e
35 / 509 OX40. N=12, TILs frescos e congelados; câncer de mama, melanoma, câncer ovariano, e câncer de pulmão.
[00187] Figura 53A e Figura 53B: Adição de PD1 sd-rxRNA reduziu significativamente o crescimento celular mas não a viabilidade de TILs. A) Expansão em vezes. B) Viabilidade celular. n=7, TILs de câncer de mama, sarcoma e câncer de pulmão.
[00188] Figura 54A e Figura 54B: KD (Atenuação) de PD1 não aprimorou a mobilização de CD107a e a secreção de IFNγ em resposta à estimulação não específica. A) Percentagem de células CD8 que expressam CD107a antes e depois da estimulação. B) Secreção de IFNγ antes e depois da estimulação. n=6, TILs de melanoma.
BREVE DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[00189] SEQ ID NO:1 é a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de muromonabe.
[00190] SEQ ID NO:2 é a sequência de aminoácidos da cadeia leve de muromonabe.
[00191] SEQ ID NO:3 é a sequência de aminoácidos de uma proteína IL-2 humana recombinante.
[00192] SEQ ID NO:4 é a sequência de aminoácidos de aldesleucina.
[00193] SEQ ID NO:5 é a sequência de aminoácidos de uma proteína IL-4 humana recombinante.
[00194] SEQ ID NO:6 é a sequência de aminoácidos de uma proteína IL-7 humana recombinante.
[00195] SEQ ID NO:7 é a sequência de aminoácidos de uma proteína IL-15 humana recombinante.
[00196] SEQ ID NO:8 é a sequência de aminoácidos de uma proteína IL-21 humana recombinante.
[00197] SEQ ID NO:9 é a sequência de aminoácidos de 4-1BB humana.
36 / 509
[00198] SEQ ID NO:10 é a sequência de aminoácidos de 4-1BB murina.
[00199] SEQ ID NO:11 é a cadeia pesada do anticorpo monoclonal agonista de 4-1BB, utomilumabe (PF-05082566).
[00200] SEQ ID NO:12 é a cadeia leve do anticorpo monoclonal agonista de 4-1BB, utomilumabe (PF-05082566).
[00201] SEQ ID NO:13 é a região variável da cadeia pesada (VH, Heavy chain Variable region) do anticorpo monoclonal agonista de 4-1BB, utomilumabe (PF-05082566).
[00202] SEQ ID NO:14 é a região variável da cadeia leve (VL, Light chain Variable region) do anticorpo monoclonal agonista de 4-1BB, utomilumabe (PF-05082566).
[00203] SEQ ID NO:15 é a CDR1 da cadeia pesada do anticorpo monoclonal agonista de 4-1BB, utomilumabe (PF-05082566).
[00204] SEQ ID NO:16 é a CDR2 da cadeia pesada do anticorpo monoclonal agonista de 4-1BB, utomilumabe (PF-05082566).
[00205] SEQ ID NO:17 é a CDR3 da cadeia pesada do anticorpo monoclonal agonista de 4-1BB, utomilumabe (PF-05082566).
[00206] SEQ ID NO:18 é a CDR1 da cadeia leve do anticorpo monoclonal agonista de 4-1BB, utomilumabe (PF-05082566).
[00207] SEQ ID NO:19 é a CDR2 da cadeia leve do anticorpo monoclonal agonista de 4-1BB, utomilumabe (PF-05082566).
[00208] SEQ ID NO:20 é a CDR3 da cadeia leve do anticorpo monoclonal agonista de 4-1BB, utomilumabe (PF-05082566).
[00209] SEQ ID NO:21 é a cadeia pesada do anticorpo monoclonal agonista de 4-1BB, urelumabe (BMS-663513).
[00210] SEQ ID NO:22 é a cadeia leve do anticorpo monoclonal agonista de 4-1BB, urelumabe (BMS-663513).
[00211] SEQ ID NO:23 é a região variável da cadeia pesada (VH) do
37 / 509 anticorpo monoclonal agonista de 4-1BB, urelumabe (BMS-663513).
[00212] SEQ ID NO:24 é a região variável da cadeia leve (VL) do anticorpo monoclonal agonista de 4-1BB, urelumabe (BMS-663513).
[00213] SEQ ID NO:25 é a CDR1 da cadeia pesada do anticorpo monoclonal agonista de 4-1BB, urelumabe (BMS-663513).
[00214] SEQ ID NO:26 é a CDR2 da cadeia pesada do anticorpo monoclonal agonista de 4-1BB, urelumabe (BMS-663513).
[00215] SEQ ID NO:27 é a CDR3 da cadeia pesada do anticorpo monoclonal agonista de 4-1BB, urelumabe (BMS-663513).
[00216] SEQ ID NO:28 é a CDR1 da cadeia leve do anticorpo monoclonal agonista de 4-1BB, urelumabe (BMS-663513).
[00217] SEQ ID NO:29 é a CDR2 da cadeia leve do anticorpo monoclonal agonista de 4-1BB, urelumabe (BMS-663513).
[00218] SEQ ID NO:30 é a CDR3 da cadeia leve do anticorpo monoclonal agonista de 4-1BB, urelumabe (BMS-663513).
[00219] SEQ ID NO:31 é um domínio Fc da proteína de fusão agonista de TNFRSF (Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily, superfamília de receptores de fatores de necrose tumoral).
[00220] SEQ ID NO:32 é um linker da proteína de fusão agonista de TNFRSF.
[00221] SEQ ID NO:33 é um linker da proteína de fusão agonista de TNFRSF.
[00222] SEQ ID NO:34 é um linker da proteína de fusão agonista de TNFRSF.
[00223] SEQ ID NO:35 é um linker da proteína de fusão agonista de TNFRSF.
[00224] SEQ ID NO:36 é um linker da proteína de fusão agonista de TNFRSF.
[00225] SEQ ID NO:37 é um linker da proteína de fusão agonista de
38 / 509 TNFRSF.
[00226] SEQ ID NO:38 é um linker da proteína de fusão agonista de TNFRSF.
[00227] SEQ ID NO:39 é um linker da proteína de fusão agonista de TNFRSF.
[00228] SEQ ID NO:40 é um linker da proteína de fusão agonista de TNFRSF.
[00229] SEQ ID NO:41 é um linker da proteína de fusão agonista de TNFRSF.
[00230] SEQ ID NO:42 é um domínio Fc da proteína de fusão agonista de TNFRSF.
[00231] SEQ ID NO:43 é um linker da proteína de fusão agonista de TNFRSF.
[00232] SEQ ID NO:44 é um linker da proteína de fusão agonista de TNFRSF.
[00233] SEQ ID NO:45 é um linker da proteína de fusão agonista de TNFRSF.
[00234] SEQ ID NO:46 é uma sequência de aminoácidos do ligante de 4-1BB (4-1BBL, 4-1BB Ligand).
[00235] SEQ ID NO:47 é uma porção solúvel do polipeptídeo 4-1BBL.
[00236] SEQ ID NO:48 é uma região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo agonista de 4-1BB, 4B4-1-1 versão 1.
[00237] SEQ ID NO:49 é uma região variável da cadeia leve (VL) do anticorpo agonista de 4-1BB, 4B4-1-1 versão 1.
[00238] SEQ ID NO:50 é uma região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo agonista de 4-1BB, 4B4-1-1 versão 2.
[00239] SEQ ID NO:51 é uma região variável da cadeia leve (VL) do anticorpo agonista de 4-1BB, 4B4-1-1 versão 2.
[00240] SEQ ID NO:52 é uma região variável da cadeia pesada (VH)
39 / 509 do anticorpo agonista de 4-1BB, H39E3-2.
[00241] SEQ ID NO:53 é uma região variável da cadeia leve (VL) do anticorpo agonista de 4-1BB, H39E3-2.
[00242] SEQ ID NO:54 é a sequência de aminoácidos de OX40 humana.
[00243] SEQ ID NO:55 é a sequência de aminoácidos de OX40 murina.
[00244] SEQ ID NO:56 é a cadeia pesada do anticorpo monoclonal agonista de OX40, tavolixizumabe (MEDI-0562).
[00245] SEQ ID NO:57 é a cadeia leve do anticorpo monoclonal agonista de OX40, tavolixizumabe (MEDI-0562).
[00246] SEQ ID NO:58 é a região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal agonista de OX40, tavolixizumabe (MEDI-0562).
[00247] SEQ ID NO:59 é a região variável da cadeia leve (VL) do anticorpo monoclonal agonista de OX40, tavolixizumabe (MEDI-0562).
[00248] SEQ ID NO:60 é a CDR1 da cadeia pesada do anticorpo monoclonal agonista de OX40, tavolixizumabe (MEDI-0562).
[00249] SEQ ID NO:61 é a CDR2 da cadeia pesada do anticorpo monoclonal agonista de OX40, tavolixizumabe (MEDI-0562).
[00250] SEQ ID NO:62 é a CDR3 da cadeia pesada do anticorpo monoclonal agonista de OX40, tavolixizumabe (MEDI-0562).
[00251] SEQ ID NO:63 é a CDR1 da cadeia leve do anticorpo monoclonal agonista de OX40, tavolixizumabe (MEDI-0562).
[00252] SEQ ID NO:64 é a CDR2 da cadeia leve do anticorpo monoclonal agonista de OX40, tavolixizumabe (MEDI-0562).
[00253] SEQ ID NO:65 é a CDR3 da cadeia leve do anticorpo monoclonal agonista de OX40, tavolixizumabe (MEDI-0562).
[00254] SEQ ID NO:66 é a cadeia pesada do anticorpo monoclonal agonista de OX40, 11D4.
40 / 509
[00255] SEQ ID NO:67 é a cadeia leve do anticorpo monoclonal agonista de OX40, 11D4.
[00256] SEQ ID NO:68 é a região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal agonista de OX40, 11D4.
[00257] SEQ ID NO:69 é a região variável da cadeia leve (VL) do anticorpo monoclonal agonista de OX40, 11D4.
[00258] SEQ ID NO:70 é a CDR1 da cadeia pesada do anticorpo monoclonal agonista de OX40, 11D4.
[00259] SEQ ID NO:71 é a CDR2 da cadeia pesada do anticorpo monoclonal agonista de OX40, 11D4.
[00260] SEQ ID NO:72 é a CDR3 da cadeia pesada do anticorpo monoclonal agonista de OX40, 11D4.
[00261] SEQ ID NO:73 é a CDR1 da cadeia leve do anticorpo monoclonal agonista de OX40, 11D4.
[00262] SEQ ID NO:74 é a CDR2 da cadeia leve do anticorpo monoclonal agonista de OX40, 11D4.
[00263] SEQ ID NO:75 é a CDR3 da cadeia leve do anticorpo monoclonal agonista de OX40, 11D4.
[00264] SEQ ID NO:76 é a cadeia pesada do anticorpo monoclonal agonista de OX40, 18D8.
[00265] SEQ ID NO:77 é a cadeia leve do anticorpo monoclonal agonista de OX40, 18D8.
[00266] SEQ ID NO:78 é a região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal agonista de OX40, 18D8.
[00267] SEQ ID NO:79 é a região variável da cadeia leve (VL) do anticorpo monoclonal agonista de OX40, 18D8.
[00268] SEQ ID NO:80 é a CDR1 da cadeia pesada do anticorpo monoclonal agonista de OX40, 18D8.
[00269] SEQ ID NO:81 é a CDR2 da cadeia pesada do anticorpo
41 / 509 monoclonal agonista de OX40, 18D8.
[00270] SEQ ID NO:82 é a CDR3 da cadeia pesada do anticorpo monoclonal agonista de OX40, 18D8.
[00271] SEQ ID NO:83 é a CDR1 da cadeia leve do anticorpo monoclonal agonista de OX40, 18D8.
[00272] SEQ ID NO:84 é a CDR2 da cadeia leve do anticorpo monoclonal agonista de OX40, 18D8.
[00273] SEQ ID NO:85 é a CDR3 da cadeia leve do anticorpo monoclonal agonista de OX40, 18D8.
[00274] SEQ ID NO:86 é a região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal agonista de OX40, Hu119-122.
[00275] SEQ ID NO:87 é a região variável da cadeia leve (VL) do anticorpo monoclonal agonista de OX40, Hu119-122.
[00276] SEQ ID NO:88 é a CDR1 da cadeia pesada do anticorpo monoclonal agonista de OX40, Hu119-122.
[00277] SEQ ID NO:89 é a CDR2 da cadeia pesada do anticorpo monoclonal agonista de OX40, Hu119-122.
[00278] SEQ ID NO:90 é a CDR3 da cadeia pesada do anticorpo monoclonal agonista de OX40, Hu119-122.
[00279] SEQ ID NO:91 é a CDR1 da cadeia leve do anticorpo monoclonal agonista de OX40, Hu119-122.
[00280] SEQ ID NO:92 é a CDR2 da cadeia leve do anticorpo monoclonal agonista de OX40, Hu119-122.
[00281] SEQ ID NO:93 é a CDR3 da cadeia leve do anticorpo monoclonal agonista de OX40, Hu119-122.
[00282] SEQ ID NO:94 é a região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal agonista de OX40, Hu106-222.
[00283] SEQ ID NO:95 é a região variável da cadeia leve (VL) do anticorpo monoclonal agonista de OX40, Hu106-222.
42 / 509
[00284] SEQ ID NO:96 é a CDR1 da cadeia pesada do anticorpo monoclonal agonista de OX40, Hu106-222.
[00285] SEQ ID NO:97 é a CDR2 da cadeia pesada do anticorpo monoclonal agonista de OX40, Hu106-222.
[00286] SEQ ID NO:98 é a CDR3 da cadeia pesada do anticorpo monoclonal agonista de OX40, Hu106-222.
[00287] SEQ ID NO:99 é a CDR1 da cadeia leve do anticorpo monoclonal agonista de OX40, Hu106-222.
[00288] SEQ ID NO:100 é a CDR2 da cadeia leve do anticorpo monoclonal agonista de OX40, Hu106-222.
[00289] SEQ ID NO:101 é a CDR3 da cadeia leve do anticorpo monoclonal agonista de OX40, Hu106-222.
[00290] SEQ ID NO:102 é uma sequência de aminoácidos do ligante de OX40 (OX40L, OX40Ligand).
[00291] SEQ ID NO:103 é uma porção solúvel do polipeptídeo OX40L.
[00292] SEQ ID NO:104 é uma porção solúvel alternativa do polipeptídeo OX40L.
[00293] SEQ ID NO:105 é a região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal agonista de OX40, 008.
[00294] SEQ ID NO:106 é a região variável da cadeia leve (VL) do anticorpo monoclonal agonista de OX40, 008.
[00295] SEQ ID NO:107 é a região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal agonista de OX40, 011.
[00296] SEQ ID NO:108 é a região variável da cadeia leve (VL) do anticorpo monoclonal agonista de OX40, 011.
[00297] SEQ ID NO:109 é a região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal agonista de OX40, 021.
[00298] SEQ ID NO:110 é a região variável da cadeia leve (VL) do
43 / 509 anticorpo monoclonal agonista de OX40, 021.
[00299] SEQ ID NO:111 é a região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal agonista de OX40, 023.
[00300] SEQ ID NO:112 é a região variável da cadeia leve (VL) do anticorpo monoclonal agonista de OX40, 023.
[00301] SEQ ID NO:113 é a região variável da cadeia pesada (VH) de um anticorpo monoclonal agonista de OX40.
[00302] SEQ ID NO:114 é a região variável da cadeia leve (VL) de um anticorpo monoclonal agonista de OX40.
[00303] SEQ ID NO:115 é a região variável da cadeia pesada (VH) de um anticorpo monoclonal agonista de OX40.
[00304] SEQ ID NO:116 é a região variável da cadeia leve (VL) de um anticorpo monoclonal agonista de OX40.
[00305] SEQ ID NO:117 é a região variável da cadeia pesada (VH) de um anticorpo monoclonal agonista de OX40 humanizado.
[00306] SEQ ID NO:118 é a região variável da cadeia pesada (VH) de um anticorpo monoclonal agonista de OX40 humanizado.
[00307] SEQ ID NO:119 é a região variável da cadeia leve (VL) de um anticorpo monoclonal agonista de OX40 humanizado.
[00308] SEQ ID NO:120 é a região variável da cadeia leve (VL) de um anticorpo monoclonal agonista de OX40 humanizado.
[00309] SEQ ID NO:121 é a região variável da cadeia pesada (VH) de um anticorpo monoclonal agonista de OX40 humanizado.
[00310] SEQ ID NO:122 é a região variável da cadeia pesada (VH) de um anticorpo monoclonal agonista de OX40 humanizado.
[00311] SEQ ID NO:123 é a região variável da cadeia leve (VL) de um anticorpo monoclonal agonista de OX40 humanizado.
[00312] SEQ ID NO:124 é a região variável da cadeia leve (VL) de um anticorpo monoclonal agonista de OX40 humanizado.
44 / 509
[00313] SEQ ID NO:125 é a região variável da cadeia pesada (VH) de um anticorpo monoclonal agonista de OX40.
[00314] SEQ ID NO:126 é a região variável da cadeia leve (VL) de um anticorpo monoclonal agonista de OX40.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Introdução
[00315] A terapia adotiva de células que utiliza TILs cultivados ex vivo pelo Protocolo de Expansão Rápida (REP) tem produzido terapia adotiva de células bem sucedida após imunossupressão do hospedeiro em pacientes com melanoma. Os parâmetros de aceitação de infusão atuais baseiam-se em leituras da composição de TILs (por exemplo, positividade para CD28, CD8, ou CD4) e nas vezes numéricas de expansão e de viabilidade do produto de REP.
[00316] Os atuais protocolos REP fornecem pouco discernimento sobre a saúde do TIL que será infundido no paciente. As células-T experimentam uma profunda mudança metabólica durante o curso de maturação delas de células-T naïve para células-T efetoras (consulte, Chang, et al., Nat. Immunol. 2016, 17, 364, expressamente incorporado em sua totalidade pelo presente documento, e em particular com respeito à discussão e aos marcadores de metabolismos anaeróbico e aeróbico). Por exemplo, as células-T naïve baseiam-se em respiração mitocondrial para produzirem ATP, enquanto que as células-T efetoras, saudáveis, maduras, como TIL, são elevadamente glicolíticas, baseando-se em glicólise aeróbica, para proverem as substâncias bioenergéticas que elas necessitam para proliferação, migração, ativação, e eficácia antitumoral.
[00317] Os atuais processos de fabricação de TIL são limitados pelas preocupações de duração, custo, esterilidade, e outros fatores aqui descritos de modo que o potencial para comercializar tais processos é enormemente limitado, e por estas e outras razões, no momento presente não há disponível
45 / 509 processo comercial. A presente invenção provê processos de fabricação de TIL que utilizam metodologias de alteração de expressão transiente de proteína e terapias baseadas em tais processos que são apropriadas para fabricação em escala comercial e aprovação regulatória para uso em pacientes humanos em múltiplos centros clínicos. A presente invenção provê processos de alteração genética transiente para reprogramação de TILs com o propósito de preparar populações terapêuticas de TILs com eficácia terapêutica aumentada. II. Definições
[00318] A não ser que sejam definidos de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como é comumente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual pertence esta invenção. Todas as patentes e publicações aqui referidas são incorporadas em suas totalidades como referências.
[00319] O termo “in vivo” refere-se a um evento que ocorre em um corpo do indivíduo.
[00320] O termo “in vitro” refere-se a um evento que ocorre fora de um corpo do indivíduo. Os ensaios in vitro abrangem ensaios baseados em células nos quais células vivas ou mortas são utilizadas e podem também abranger um ensaio isento de células no qual não são utilizadas nenhumas células intactas.
[00321] O termo “ex vivo” refere-se a um evento que envolve o tratamento ou a realização de um procedimento em uma célula, um tecido, e/ou um órgão que tem sido removido(a) de um corpo do indivíduo. Apropriadamente, a célula, o tecido e/ou o órgão pode ser retornado(a) para o corpo do indivíduo em um método de cirurgia ou tratamento.
[00322] O termo “expansão rápida” significa um aumento no número de TILs específicos para antígenos de pelo menos cerca de 3 vezes (ou 4, 5, 6, 7, 8, ou 9 vezes) durante um período de uma semana, mais preferivelmente de
46 / 509 pelo menos cerca de 10 vezes (ou 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90 vezes) durante um período de uma semana, com a máxima preferência de pelo menos cerca de 100 vezes durante um período de uma semana. Numerosos protocolos de expansão rápida são descritos abaixo.
[00323] Por “linfócitos infiltrantes de tumor” ou “TILs” aqui, quer-se dizer, uma população de células originalmente obtidas como células brancas do sangue que têm deixado a corrente sanguínea de um indivíduo e migradas para dentro de um tumor. Os TILs incluem, mas não se limitam a, célula-T (linfócitos-T) citotóxicas CD8+, células-T Th1 e Th17 CD4+, células exterminadoras naturais, células dendríticas e macrófagos M1. Os TILs incluem ambos TILs primários e secundários. “TILs primários” são aqueles que são obtidos de amostras de tecidos de paciente como aqui descritas (algumas vezes referidas como “recém-colhidas”), e “TILs secundários” são quaisquer populações de células TIL que têm sido expandidas ou proliferadas, conforme aqui discutido, incluindo, mas não se limitando a, TILs em massa (totais) e TILs expandidos (“REP TILs” ou “post-REP TILs”). As populações de células TIL podem incluir TILs geneticamente modificados.
[00324] Por “população de células” (incluindo TILs) aqui, quer-se dizer, numerosas células que compartilham características comuns. Em geral, as populações geralmente estão na faixa numérica de 1×106 a 1×1010, com diferentes populações de TIL compreendendo números diferentes. Por exemplo, o crescimento inicial de TILs primários na presença de IL-2 resulta em uma população de TILs em massa de aproximadamente 1×108 células. A expansão por REP é geralmente realizada para prover populações de 1,5×109 a 1,5×1010 células para infusão.
[00325] Por “TILs criopreservados” aqui, quer-se dizer, que os TILs, primários, em massa, ou expandidos (REP TILs), são tratados e armazenados na faixa de cerca de -150°C a -60°C. Métodos gerais para criopreservação são também descritos aqui alhures, incluindo nos Exemplos. Para clareza, “TILs
47 / 509 criopreservados” são distinguíveis das amostras de tecido congeladas que são usadas como uma fonte de TILs primários.
[00326] Por “TILs criopreservados descongelados” aqui, quer-se dizer, uma população de TILs que foi previamente criopreservada e então tratada para retornar para a temperatura ambiente ou mais alta, incluindo mas não se limitando às temperaturas de cultura de células ou temperaturas nas quais os TILs podem ser administrados a um paciente.
[00327] Os TILs podem ser, geralmente, definidos quer bioquimicamente, usando marcadores de superfície celular, quer funcionalmente, pela capacidade deles para se infiltrarem em tumores e realizarem o tratamento. Os TILs podem ser geralmente categorizados pela expressão de um ou mais dos seguintes biomarcadores: CD4, CD8, TCR αβ, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1, e CD25. Adicional e alternativamente, os TILs podem ser funcionalmente definidos pela capacidade deles para se infiltrarem em tumores sólidos após reintrodução em um paciente.
[00328] O termo “meios de criopreservação” ou “meio de criopreservação” refere-se a qualquer meio que pode ser usado para criopreservação de células, Tais meios podem incluir meios compreendendo 7% a 10% de DMSO. Meios exemplificadores incluem CryoStor® CS10, HyperThermasol®, e também combinações dos mesmos. O termo “CS10” refere-se a um meio de criopreservação que é obtido junto à Stemcell Technologies ou junto à Biolife Solutions. O meio CS10 pode ser referido pelo nome comercial CryoStor® CS10. O meio CS10 é um meio isento de soro, isento de componentes animais, que compreende DMSO.
[00329] O termo “célula-T de memória central” refere-se a um subconjunto de células-T que no ser humano são CD45R0+ e constitutivamente expressam CCR7 (CCR7hi) e CD62L (CD62hi). O fenótipo de superfície de células-T de memória central também inclui TCR, CD3,
48 / 509 CD127 (IL-7R), e IL-15R. Os fatores de transcrição para as células-T de memória central incluem BCL-6, BCL-6B, MBD2, e BMI1. As células-T de memória central predominantemente secretam IL-2 e CD40L como moléculas efetoras após ativação de TCR (T Cell Receptor, receptor de célula-T). As células-T de memória central são predominantes no compartimento CD4 no sangue, e no ser humano estão proporcionalmente enriquecidas nos linfonodos e nas tonsilas.
[00330] O termo “célula-T efetora de memória” refere-se a um subconjunto de células-T de humano ou de mamíferos que, como as células-T de memória central, são CD45R0+, mas têm perdido a expressão constitutiva de CCR7 (CCR7lo) e são heterogêneas ou baixas para a expressão de CD62L (CD62Llo). O fenótipo de superfície de células-T de memória central também inclui TCR, CD3, CD127 (IL-7R), e IL-15R. Os fatores de transcrição para as células-T de memória central incluem BLIMP1. As células-T efetoras de memória rapidamente secretam teores altos de citocinas inflamatórias após estimulação antigênica, incluindo interferon-γ, IL-4, e IL-5. As células-T efetoras de memória são predominantes no compartimento CD8 no sangue, e no ser humano estão predominantemente enriquecidas no pulmão, no fígado, e no intestino. As células-T efetoras de memória CD8+ transportam grandes quantidades de perforina.
[00331] O termo “sistema fechado” refere-se a um sistema que está fechado para o ambiente externo. Qualquer sistema fechado apropriado para métodos de cultura de células pode ser utilizado com os métodos da presente invenção. Sistemas fechados incluem, por exemplo, mas não se limitam aos recipientes-G fechados. Logo que um segmento de tumor é adicionado ao sistema fechado, o sistema não é aberto para o ambiente externo até que os TILs estejam prontos para serem administrados ao paciente.
[00332] Os termos “fragmentação”, “fragmento”, e “fragmentado”, como aqui usados, para descrever processos para disrupção de um tumor,
49 / 509 incluem métodos de fragmentação mecânica como trituração, fatiamento, divisão, e morcelação de tecido de tumor, e também, qualquer outro método para disrupcionar a estrutura física de tecido de tumor.
[00333] Os termos “células mononucleares do sangue periférico” e “PBMCs” referem-se a uma célula do sangue periférico tendo um núcleo redondo, incluindo linfócitos (células-T, células-B, células NK) e monócitos. Preferivelmente, as células mononucleares do sangue periférico são células mononucleares do sangue periférico alogeneicas irradiadas. PBMCs são um tipo de célula apresentadora de antígenos.
[00334] O termo “anticorpo anti-CD3” refere-se a um anticorpo ou uma variante do mesmo, por exemplo, um anticorpo monoclonal e incluindo anticorpos humanos, humanizados, quiméricos ou murinos que são direcionados contra o receptor CD3 no receptor antigênico de célula-T de células-T maduras. Os anticorpos anti-CD3 incluem OKT-3, também conhecido como muromonabe. Os anticorpos anti-CD3 também incluem o clone UHCT1, também conhecido como T3 e CD3ε. Outros anticorpos anti- CD3 incluem, por exemplo, otelixizumabe, teplizumabe, e visilizumabe.
[00335] O termo “OKT-3” (também referido aqui como “OKT3”) refere-se a um anticorpo monoclonal ou biossimilar ou variante do mesmo, incluindo anticorpos humanos, humanizados, quiméricos ou murinos, direcionados contra o receptor CD3 no receptor antigênico de célula-T de células-T maduras T, e inclui formas comercialmente disponíveis como OKT- 3 (30 ng/mL, MACS GMP CD3 puro, Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, EUA) e muromonabe ou variantes, substituições de aminoácidos conservativas, glicoformas, ou biossimilares do mesmo. As sequências de aminoácidos das cadeias pesada e leve de muromonabe são apresentadas na Tabela 1 (SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2). Um hibridoma capaz de produzir OKT-3 está depositado na “American Type Culture Collection” e designado com o número de acesso à ATCC de CRL 8001. Um hibridoma capaz de
50 / 509 produzir OKT-3 está também depositado na “European Collection of Authenticated Cell Cultures” (ECACC) e atribuído com o Nº de Catálogo
86022706. TABELA 1. Sequências de aminoácidos de muromonabe. Identificador Sequência (Símbolos de Aminoácido de Uma Letra) SEQ ID NO:1 QVQLQQSGAE LARPGASVKM SCKASGYTFT RYTMHWVKQR Cadeia pesada de PGQGLEWIGY INPSRGYTNY 60 muromonabe NQKFKDKATL TTDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARYY DDHYCLDYWG QGTTLTVSSA 120
KTTAPSVYPL APVCGGTTGS SVTLGCLVKG YFPEPVTLTW NSGSLSSGVH TFPAVLQSDL 180
YTLSSSVTVT SSTWPSQSIT CNVAHPASST KVDKKIEPRP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 240
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN 300
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE 360
LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW 420 QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 450 SEQ ID NO:2 QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSASSSVS YMNWYQQKSG Cadeia leve de TSPKRWIYDT SKLASGVPAH 60 muromonabe FRGSGSGTSY SLTISGMEAE DAATYYCQQW SSNPFTFGSG TKLEINRADT APTVSIFPPS 120
SEQLTSGGAS VVCFLNNFYP KDINVKWKID GSERQNGVLN SWTDQDSKDS TYSMSSTLTL 180 TKDEYERHNS YTCEATHKTS TSPIVKSFNR NEC 213
[00336] O termo “IL-2” (também referido aqui como “IL2”) refere-se ao fator de crescimento de célula-T conhecido como interleucina-2, e inclui todas as formas de IL-2 incluindo formas de humano e de mamíferos, substituições de aminoácidos conservativas, glicoformas, biossimilares, e variantes da mesma. IL-2 é descrita, por exemplo, em Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88 e Malek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79, cujas descrições são aqui incorporadas como referência. A sequência de aminoácidos de IL-2 humana recombinante adequada para uso na invenção é apresentada na Tabela 2 (SEQ ID NO:3). Por exemplo, o termo IL-2 abrange formas humana, recombinante de IL-2 como aldesleucina (PROLEUKIN, comercialmente disponível junto a múltiplos fornecedores em 22 milhões de UI por frascos de uso único), e também como a forma de IL-2 recombinante comercialmente fornecida pela CellGenix, Inc., Portsmouth, NH, EUA (CELLGRO GMP) ou ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ,
51 / 509 EUA (Nº de Catálogo CYT-209-b) e outros equivalentes comerciais de outros vendedores. Aldesleucina (IL-2 humana des-alanil-1, serina-125) é uma forma recombinante humana não glicosilada de IL-2 com um peso molecular de aproximadamente 15 kDa. A sequência de aminoácidos de aldesleucina adequada para uso na invenção é apresentada na Tabela 2 (SEQ ID NO:4). O termo IL-2 também abrange formas peguiladas de IL-2, conforme aqui descritas, incluindo o pró-fármaco IL-2 peguilada NKTR-214, disponível junto à Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, EUA. IL-2 peguilada NKTR-214 adequada para uso na invenção é descrita na Publicação de Pedido de Patente Norte-Americana nº US 2014/0328791 A1 e na Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO 2012/065086 A1, cujas descrições são aqui incorporadas como referências. Formas alternativas de IL-2 conjugada adequadas para uso na invenção são descritas em Patentes Norte-Americana nºs 4.766.106, 5.206.344, 5.089.261 e 4902.502, cujas descrições são aqui incorporadas como referências. Formulações de IL-2 adequadas para uso na invenção são descritas em Patente Norte-Americana nº 6.706.289, cuja descrição é aqui incorporada como referência. TABELA 2. Sequências de aminoácidos de interleucinas. Identificador Sequência (Símbolos de Aminoácido de Uma Letra) SEQ ID NO:3 MAPTSSSTKK TQLQLEHLLL DLQMILNGIN NYKNPKLTRM LTFKFYMPKK IL-2 humana ATELKHLQCL 60 recombinante EEELKPLEEV LNLAQSKNFH LRPRDLISNI NVIVLELKGS ETTFMCEYAD (rhIL-2) ETATIVEFLN 120 RWITFCQSII STLT 134 SEQ ID NO:4 PTSSSTKKTQ LQLEHLLLDL QMILNGINNY KNPKLTRMLT FKFYMPKKAT Aldesleucina ELKHLQCLEE 60
ELKPLEEVLN LAQSKNFHLR PRDLISNINV IVLELKGSET TFMCEYADET ATIVEFLNRW 120 ITFSQSIIST LT 132 SEQ ID NO:5 MHKCDITLQE IIKTLNSLTE QKTLCTELTV TDIFAASKNT TEKETFCRAA IL-4 humana TVLRQFYSHH 60 recombinante EKDTRCLGAT AQQFHRHKQL IRFLKRLDRN LWGLAGLNSC PVKEANQSTL (rhIL-4) ENFLERLKTI 120 MREKYSKCSS 130 SEQ ID NO:6 MDCDIEGKDG KQYESVLMVS IDQLLDSMKE IGSNCLNNEF NFFKRHICDA IL-7 humana NKEGMFLFRA 60 recombinante ARKLRQFLKM NSTGDFDLHL LKVSEGTTIL LNCTGQVKGR KPAALGEAQP (rhIL-7) TKSLEENKSL 120 KEQKKLNDLC FLKRLLQEIK TCWNKILMGT KEH 153
52 / 509 SEQ ID NO:7 MNWVNVISDL KKIEDLIQSM HIDATLYTES DVHPSCKVTA MKCFLLELQV IL-15 humana ISLESGDASI 60 recombinante HDTVENLIIL ANNSLSSNGN VTESGCKECE ELEEKNIKEF LQSFVHIVQM rhIL-15) FINTS 115 SEQ ID NO:8 MQDRHMIRMR QLIDIVDQLK NYVNDLVPEF LPAPEDVETN CEWSAFSCFQ IL-21 humana KAQLKSANTG 60 recombinante NNERIINVSI KKLKRKPPST NAGRRQKHRL TCPSCDSYEK KPPKEFLERF rhIL-21) KSLLQKMIHQ 120 HLSSRTHGSE DS 132
[00337] O termo “IL-4” (também referido aqui como “IL4”) refere-se à citocina conhecida como interleucina 4, que é produzida pelas células-T Th2 e por eosinófilos, basófilos, e mastócitos. A IL-4 regula a diferenciação de células-T auxiliares naïve (células Th0) para células-T Th2. Steinke e Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70. Após ativação por IL-4, as células-T Th2 subsequentemente produzem IL-4 adicional em um ciclo de retroalimentação positivo. A IL-4 também estimula a proliferação de células-B e a expressão de MHC de classe II, e induz a mudança de classe para expressão de IgE e IgG1 a partir de células-B. A IL-4 humana recombinante adequada para uso na invenção está comercialmente disponível junto a múltiplos fornecedores, incluindo ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, EUA (Nº de Catálogo CYT-211) e ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA (proteína recombinante IL-15 humana, Nº de Catálogo Gibco CTP0043). A sequência de aminoácidos de IL-4 humana recombinante adequada para uso na invenção é apresentada na Tabela 2 (SEQ ID NO:5).
[00338] O termo “IL-7” (também referido aqui como “IL7”) refere-se a uma citocina glicosilada derivada de tecido conhecida como interleucina 7, que pode ser obtida de células estromais e epiteliais, e também de células dendríticas. Fry e Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904. IL-7 pode estimular o desenvolvimento de células-T. A IL-7 liga-se ao receptor de IL-7, um heterodímero consistindo em cadeia alfa e cadeia gama comum do receptor de IL-7, que induz uma série de sinais importantes para o desenvolvimento de células-T dentro do timo e para a sobrevivência dentro da periferia. A IL-7 humana recombinante adequada para uso na invenção está comercialmente disponível junto à múltiplos fornecedores, incluindo ProSpec-Tany
53 / 509 TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, EUA (Nº de Catálogo CYT-254) e ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA (proteína humana recombinante IL-7, Nº de Catálogo Gibco PHC0071). A sequência de aminoácidos de IL-7 humana recombinante adequada para uso na invenção é apresentada na Tabela 2 (SEQ ID NO:6).
[00339] O termo “IL-15” (também referido aqui como “IL15”) refere- se ao fator de crescimento de célula-T conhecido como interleucina-15, e inclui todas as formas de IL-15 incluindo formas de humano e de mamíferos, substituições de aminoácidos conservativas, glicoformas, biossimilares, e variantes da mesma. A IL-15 é descrita, por exemplo, em Fehniger e Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32, cuja descrição é aqui incorporada como referência. A IL-15 compartilha as subunidades β e γ de receptor de sinalização com IL-2. A IL-15 humana recombinante é uma cadeia polipeptídica não glicosilada, individual, contendo 114 aminoácidos (e uma metionina N-terminal) com uma massa molecular de 12,8 kDa. A IL-15 humana recombinante está comercialmente disponível junto à múltiplos fornecedores, incluindo ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, EUA (Nº de Catálogo CYT-230-b) e ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA (proteína humana recombinante IL-15, Nº de Catálogo 34-8159- 82). A sequência de aminoácidos da IL-15 humana recombinante adequada para uso na invenção é apresentada na Tabela 2 (SEQ ID NO:7).
[00340] O termo “IL-21” (também referido aqui como “IL21”) refere- se à proteína citocina pleiotrópica conhecida como interleucina-21, e inclui todas as formas de IL-21 incluindo formas de humano e de mamíferos, substituições de aminoácidos conservativas, glicoformas, biossimilares, e variantes da mesma. IL-21 é descrita, por exemplo, em Spolski e Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95, cuja descrição é aqui incorporada como referência. IL-21 é predominantemente produzida por células-T exterminadoras naturais e células-T CD4+ humanas ativadas. A IL-21 humana
54 / 509 recombinante é uma cadeia polipeptídica, não glicosilada, individual, contendo 132 aminoácidos com uma massa molecular de 15,4 kDa. A IL-21 humana recombinante está comercialmente disponível junto à múltiplos fornecedores, incluindo ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, EUA (Nº de Catálogo CYT-408-b) e ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA (proteína humana recombinante IL-21, Nº de Catálogo 14-8219- 80). A sequência de aminoácidos de IL-21 humana recombinante adequada para uso na invenção é apresentada na Tabela 2 (SEQ ID NO:8).
[00341] Quando “uma quantidade eficaz antitumoral”, “uma quantidade eficaz inibidora de tumor”, ou “quantidade terapêutica” é indicada, a quantidade exata das composições da presente invenção a serem administradas pode ser determinada por um médico com consideração das diferenças individuais em idade, peso, tamanho de tumor, extensão de infecção ou metástase, e condição do paciente (indivíduo). Pode ser geralmente declarado que uma composição farmacêutica compreendendo os linfócitos infiltrantes de tumor (por exemplo, TILs secundários ou linfócitos citotóxicos geneticamente modificados), aqui descritos, podem ser administrados em uma dosagem de 104 a 1011 células/kg de peso corporal (por exemplo, 105 a 106, 105 a 1010, 105 a 1011, 106 a 1010, 106 a 1011,107 a 1011, 107 a 1010, 108 a 1011, 108 a 1010, 109 a 1011, ou 109 a 1010 células/kg de peso corporal), incluindo todos os valores inteiros dentro daquelas faixas. Composições de linfócitos infiltrantes de tumor (incluindo em alguns casos, linfócitos citotóxicos geneticamente modificados) podem também ser administradas múltiplas vezes nestas dosagens. Os linfócitos infiltrantes de tumor (incluindo em alguns casos, linfócitos citotóxicos geneticamente modificados) podem ser administrados pelo uso de técnicas de infusão que são comumente conhecidas em imunoterapia (consulte, por exemplo, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988). A dosagem ótima e o regime de tratamento ótimo para um paciente específico podem ser facilmente
55 / 509 determinados por uma pessoa versada na técnica de medicina pela monitoração do paciente para sinais de doença e ajuste, correspondentemente, do tratamento.
[00342] O termo “malignidade hematológica” refere-se aos cânceres e tumores de mamíferos dos tecidos hematopoiéticos e linfoides, incluindo mas não se limitando aos, tecidos do sangue, medula óssea, linfonodos, e sistema linfático. As malignidades hematológicas são também referidas como “tumores líquidos”. As malignidades hematológicas incluem, mas não se limitam a, leucemia linfoblástica aguda (ALL, Acute Lymphoblastic Leukemia), linfoma linfocítico crônico (CLL, Chronic Lymphocytic Lymphoma), linfoma linfocítico pequeno (SLL, Small Lymphocytic Lymphoma), leucemia mielógena aguda (AML, Acute Myelogenous Leukemia), leucemia mielógena crônica (CML, Chronic Myelogenous Leukemia), leucemia monocítica aguda (AMoL, Acute Monocytic Leukemia), linfoma de Hodgkin, e linfoma de não Hodgkin. O termo “malignidade hematológica de células-B” refere-se às malignidades hematológicas que afetam as células-B.
[00343] O termo “tumor sólido” refere-se a uma massa anormal de tecido que habitualmente não contém cistos ou áreas líquidas. Os tumores sólidos podem ser benignos ou malignos. O termo “câncer de tumor sólido” refere-se aos tumores sólidos malignos, neoplásicos, ou cancerosos. Os cânceres de tumor sólido incluem, mas não se limitam a, sarcomas, carcinomas, e linfomas, como cânceres do pulmão, da mama, da próstata, do cólon, do reto, e da bexiga. A estrutura tecidual de tumores sólidos inclui compartimentos teciduais interdependentes incluindo o parênquima (células cancerosas) e as células estromais de suporte nas quais as células cancerosas estão dispersadas e que podem prover um microambiente de suporte.
[00344] O termo “tumor líquido” refere-se a uma massa anormal de células que é de natureza fluida. Os cânceres de tumor líquido incluem, mas
56 / 509 não se limitam a, leucemias, mielomas, e linfomas, e também malignidades hematológicas. Os TILs obtidos dos tumores líquidos podem ser também referidos aqui como linfócitos infiltrantes de medula (MILs, Marrow Infiltrating Lymphocytes).
[00345] O termo “microambiente”, como aqui usado, pode referir-se ao microambiente de tumor sólido ou hematológico como um todo ou a um subconjunto de células dentro do microambiente. O microambiente de tumor, como aqui usado, refere-se a uma mistura complexa de “células, fatores solúveis, moléculas de sinalização, matrizes celulares, e estímulos mecânicos que promovem transformação neoplásica, suportam invasão e crescimento de tumor, protegem o tumor contra imunidade do hospedeiro, favorecem resistência terapêutica, e proveem nichos para metástases dominantes prosperarem”, conforme descrito em Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72,
2473. Embora os tumores expressem antígenos que devem ser reconhecidos pelas células-T, a depuração do tumor pelo sistema imune é rara por causa da supressão imune pelo microambiente.
[00346] Em uma modalidade, a invenção inclui um método de tratamento de um câncer com uma população de TILs, em que um paciente é pré-tratado com quimioterapia não mieloablativa antes de uma infusão de TILs de acordo com a invenção. Em algumas modalidades, a população de pode ser provida em que um paciente é pré-tratado com quimioterapia não mieloablativa antes de uma infusão de TILs de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, a quimioterapia não mieloablativa é ciclofosfamida 60 mg/kg/dia durante 2 dias (dias 27 e 26 antes da infusão de TIL) e fludarabina 25 mg/m²/d durante 5 dias (dias 27 a 23 antes da infusão de TIL). Em uma modalidade, após a quimioterapia não mieloablativa a infusão de TIL (no dia 0) de acordo com a invenção, o paciente recebe uma infusão intravenosa de IL-2 intravenosamente a 720.000 UI/kg a cada 8 horas até tolerância fisiológica.
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[00347] Revelações experimentais indicam que linfodepleção antes da transferência adotiva de linfócitos-T específicos para tumor desempenha uma função muito importante na intensificação da eficácia do tratamento pela eliminação de células-T regulatórias e elementos competidores do sistema imune (“escoadouros de citocinas”). Consequentemente, algumas modalidades da invenção utilizam uma etapa de linfodepleção (algumas vezes também referida como “condicionamento imunossupressor”) no paciente antes da introdução dos rTILs da invenção.
[00348] Os termos “coadministração”, “coadministrar”, “administrado em combinação com”, “administrar em combinação com”, “simultâneo”, e “concomitante”, como aqui usados, abrangem administração de dois ou mais ingredientes ativos (em uma modalidade preferida da presente invenção, por exemplo, pelo menos um agonista de canal de potássio em combinação com uma pluralidade de TILs) a um indivíduo de modo que ambos os ingredientes farmacêuticos e/ou os metabólitos deles estejam presentes no indivíduo ao mesmo tempo. A coadministração inclui administração simultânea em composições separadas, administração em tempos diferentes em composições separadas, ou administração em uma composição na qual dois ou mais ingredientes farmacêuticos ativos estão presentes. A administração simultânea em composições separadas e a administração em uma composição na qual ambos os agentes estão presentes são preferidas.
[00349] O termo “quantidade eficaz” ou “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se àquela quantidade de um composto ou de uma combinação de compostos, conforme aqui descrita, que é suficiente para realizar a aplicação pretendida incluindo, mas não se limitando ao, tratamento de doença. A quantidade terapeuticamente eficaz pode variar dependendo da aplicação pretendida (in vitro ou in vivo), ou do indivíduo e da condição da doença sendo tratado(a) (por exemplo, o peso, a idade e o sexo do indivíduo), da gravidade da condição doente, ou da maneira de administração. O termo
58 / 509 também se aplica a uma dose que induzirá uma resposta específica em células alvo (por exemplo, a redução da adesão de plaquetas e/ou da migração de células). A dose específica variará dependendo dos compostos específicos escolhidos, do regime de dosagem a ser seguido, se o composto é administrado em combinação com outros compostos, da sincronização temporal da administração, do tecido ao qual ele é administrado, e do sistema de distribuição física no qual o composto é transportado.
[00350] Os termos “tratamento”, “tratando”, “tratar”, e semelhantes, referem-se à obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em termos de prevenção parcial ou completa de uma doença ou do sintoma da mesma e/ou pode ser terapêutico em termos de uma cura parcial ou completa para uma doença e/ou um efeito adverso atribuível à doença. “Tratamento”, como aqui usado, abrange qualquer tratamento de uma doença em um mamífero, particularmente em um humano, e inclui: (a) prevenção da ocorrência da doença em um indivíduo que pode estar predisposto à doença mas ainda não tem sido diagnosticado como tendo- a; (b) inibição da doença, isto é, interrupção de seu desenvolvimento ou de sua progressão; e (c) alívio da doença, isto é, causação da regressão da doença e/ou alívio de um ou mais sintomas da doença. “Tratamento” também significa que abrange distribuição de um agente com o propósito de prover um efeito farmacológico, mesmo na ausência de uma doença ou condição. Por exemplo, “tratamento” abrange distribuição de uma composição que pode produzir uma resposta imune ou conferir imunidade na ausência de uma condição doente, por exemplo, no caso de uma vacina.
[00351] O termo “heteróloga” quando usado com referência às porções de um ácido nucleico ou de uma proteína indica que o ácido nucleico ou a proteína compreende duas ou mais subsequências que não são encontradas na mesma relação entre si na natureza. Por exemplo, o ácido nucleico é tipicamente recombinantemente produzido, tendo duas ou mais sequências de
59 / 509 um gene não relacionado disposto para produzir um novo ácido nucleico funcional, por exemplo, um promotor de uma fonte e uma região codificante de outra fonte, ou regiões codificantes de fontes diferentes. Similarmente, uma proteína heteróloga indica que a proteína compreende duas ou mais subsequências que não são encontradas na mesma relação entre si na natureza (por exemplo, uma proteína de fusão).
[00352] Os termos “identidade de sequência”, “identidade percentual”, e “identidade percentual de sequência” (ou sinônimos dos mesmos, por exemplo, “99% idêntico”) no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou polipeptídeos, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas ou têm uma percentagem especificada de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos que são os mesmos, quando comparadas ou alinhadas (introduzindo lacunas, se necessárias) para correspondência máxima, não considerando nenhumas substituições de aminoácidos conservativas como parte da identidade de sequência. A identidade percentual pode ser medida usando algoritmos ou programas de computador de comparação de sequências ou por inspeção visual. São conhecidos na técnica vários algoritmos e programas de computador que podem ser usados para obter alinhamentos de sequências de aminoácidos ou de nucleotídeos. Os programas adequados para determinar a identidade percentual de sequência incluem por exemplo a suíte BLAST de programas disponível junto ao portal da Internet do “Norte-Americana Government’s National Center for Biotechnology Information BLAST”. Comparações entre duas sequências podem ser realizadas usando quer o algoritmo BLASTN quer o algoritmo BLASTP. BLASTN é usado para comparar sequências de ácidos nucleicos, enquanto que BLASTP é usado para comparar sequências de aminoácidos. ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, Califórnia, EUA) ou MegAlign, disponíveis junto à DNASTAR, são programas de computador adicionais publicamente disponíveis que podem ser usados para alinhar
60 / 509 sequências. Uma pessoa versada na técnica pode determinar os parâmetros apropriados para o alinhamento máximo pelo programa de computador de alinhamento específico. Em determinadas modalidades, são usados os parâmetros padrão do programa de computador de alinhamento.
[00353] Como aqui usado, o termo “variante” abrange mas não se limita aos anticorpos ou às proteínas de fusão que compreendem uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de aminoácidos de um anticorpo de referência por meio de uma ou mais substituições, deleções e/ou adições em determinadas posições dentro da ou adjacente à sequência de aminoácidos do anticorpo de referência. A variante pode compreender uma ou mais substituições conservativas em sua sequência de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de um anticorpo de referência. As substituições conservativas podem envolver, por exemplo, a substituição de aminoácidos similarmente carregados ou não carregados. A variante mantém a capacidade para especificamente se ligar ao antígeno do anticorpo de referência. O termo variante também inclui anticorpos peguilados ou proteínas peguiladas.
[00354] Por “linfócitos infiltrantes de tumor” ou “TILs” aqui, quer-se dizer uma população de células originalmente obtidas como células vermelhas do sangue que têm deixado a corrente sanguínea de um indivíduo e migrado para dentro de um tumor. Os TILs incluem, mas não se limitam a, células-T (linfócitos-T) citotóxicas CD8+, células-T Th1 e Th17 CD4+, células exterminadoras naturais, células dendríticas e macrófagos M1. Os TILs incluem ambos TILs primários e secundários. “TILs primários” são aqueles que são obtidos das amostras de tecidos do paciente conforme aqui descritas (algumas vezes referidas como “recém-colhidas”), e “TILs secundários” são quaisquer populações de células TIL que têm sido expandidas ou proliferadas conforme aqui discutido, incluindo, mas não se limitando a, TILs em massa, TILs expandidos (“REP TILs”) e também “reREP TILs” conforme aqui
61 / 509 discutido. reREP TILs podem incluir, por exemplo, TILs de segunda expansão ou TILs de segunda expansão adicional (como, por exemplo, aqueles descritos na etapa D da Figura 8, incluindo TILs referidos como reREP TILs).
[00355] Os TILs podem ser geralmente definidos quer bioquimicamente, usando marcadores de superfície celular, quer funcionalmente, pela capacidade deles para se infiltrarem em tumor e realizarem o tratamento. Os TILs podem ser geralmente categorizados pela expressão de um ou mais dos seguintes biomarcadores: CD4, CD8, TCR αβ, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1, e CD25. Adicional e alternativamente, os TILs podem ser funcionalmente definidos pela capacidade deles para se infiltrarem em tumores sólidos após reintrodução em um paciente. Os TILS podem ser adicionalmente categorizados pela potência – por exemplo, Os TILS podem ser considerados potentes se, por exemplo, a liberação de interferon (IFN) é maior que cerca de 50 pg/mL, maior que cerca de 100 pg/mL, maior que cerca de 150 pg/mL, ou maior que cerca de 200 pg/mL.
[00356] O termo “desoxirribonucleotídeo” abrange desoxirribonucleotídeos naturais e sintéticos, não modificados e modificados. A modificações incluem alterações na porção açúcar, na porção base e/ou nas ligações entre desoxirribonucleotídeo no oligonucleotídeo.
[00357] O termo “RNA” define uma molécula compreendendo pelo menos um resíduo de ribonucleotídeo. O termo “ribonucleotídeo” define um nucleotídeo com um grupo hidroxila na posição 2’ de uma porção b-D- ribofuranose. O termo RNA inclui RNA de fita dupla, RNA de fita simples, RNA isolado como RNA parcialmente purificado, RNA essencialmente puro, RNA sintético, RNA recombinantemente produzido, e também RNA alterado que difere do RNA de ocorrência natural pela adição, deleção, substituição e/ou alteração de um ou mais nucleotídeos. Nucleotídeos das moléculas de
62 / 509 RNA aqui descritas podem também compreender nucleotídeos não padrão, como nucleotídeos de ocorrência não natural ou nucleotídeos ou desoxinucleotídeos quimicamente sintetizados. Estes RNAs alterados podem ser referidos como análogos de RNA de ocorrência natural.
[00358] O termo “nucleotídeo modificado” refere-se a um nucleotídeo que tem uma ou mais modificações no nucleosídeo, na nucleobase, no anel pentose, ou no grupo fosfato. Por exemplo, os nucleotídeos modificados excluem ribonucleotídeos contendo monofosfato de adenosina, monofosfato de guanosina, monofosfato de uridina, e monofosfato de citidina e os desoxirribonucleotídeos contendo monofosfato de desoxiadenosina, monofosfato de desoxiguanosina, monofosfato de desoxitimidina, monofosfato de desoxicitidina. As modificações incluem aquelas de ocorrência natural que resultam da modificação por enzimas que modificam nucleotídeos, como metiltransferases.
[00359] Os nucleotídeos modificados também incluem nucleotídeos sintéticos ou de ocorrência não natural. As modificações sintéticas ou de ocorrência natural em nucleotídeos incluem aquelas com modificações-2’, por exemplo, 2’-O-metila, 2’-metoxietoxila, 2’-fluoro, 2’-alila, 2’-O-[2- (metilamino)-2-oxoetila], 4’-tio, 4’-CH2-O-2’-ponte, 4’-(CH2)2-O-2’-ponte, 2’-LNA, e 2’-O-(N-metilcarbamato) ou aquelas compreendendo análogos de base. Com respeito aos nucleotídeos 2’-modificados, conforme descritos na presente descrição, por “amino” quer-se dizer 2’-NH2 ou 2’-O-NH2, que pode estar modificado ou não modificado. Tais grupos modificados são descritos, por exemplo, nas Patentes Norte-Americana nºs 5.672.695 e 6.248.878; aqui incorporadas como referências.
[00360] Os termos “microRNA” ou “miRNA” referem-se a um ácido nucleico que forma um RNA de fita simples, cujo RNA de fita simples tem a capacidade para alterar a expressão (reduzir ou inibir a expressão; modular a expressão; direta ou indiretamente intensificar a expressão) de um gene ou
63 / 509 gene alvo quando o miRNA é expressado na mesma célula que o gene ou o gene alvo. Em uma modalidade, um miRNA refere-se a um ácido nucleico que tem identidade substancial ou completa com respeito a um gene alvo e forma um miRNA de fita simples. Em algumas modalidades o miRNA pode estar na forma de pre-miRNA, em que o pre-miRNA é RNA de fita dupla. A sequência do miRNA pode corresponder ao gene alvo de comprimento completo, ou uma subsequência do mesmo. Tipicamente, o miRNA é pelo menos cerca de 15-50 nucleotídeos em comprimento (por exemplo, cada sequência do miRNA de fita simples é de 15-50 nucleotídeos em comprimento, e o miRNA de fita dupla é de cerca de 15-50 pares de bases em comprimento). Em algumas modalidades o miRNA é de 20-30 bases nucleotídicas. Em algumas modalidades o miRNA é de 20-25 nucleotídeos em comprimento. Em algumas modalidades o miRNA é de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 nucleotídeos em comprimento.
[00361] O termo “gene alvo” inclui genes conhecidos ou identificados como moduladores da expressão de um gene envolvido em um mecanismo de resistência imune, e podem ser um de vários grupos de genes, como receptores supressores, por exemplo, CTLA4 e PD1; receptores de citocinas que inativam células imunes, por exemplo, receptor de TGF-beta, LAG3, e/ou TIM3, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o gene alvo inclui um ou mais dentre PD-1, TGFBR2, CBLB (CBL-B), CISH, CCRs (receptores coestimulatórios quiméricos), IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL- 15, IL-21, domínio intracelular (ICD, IntraCellular Domain) de NOTCH 1/2 (“NOTCH 1/2 ICD”), ligante de NOTCH mDLL1, TIM3, LAG3, TIGIT, TGFβ, CCR2, CCR4, CCR5, CXCR1, CXCR2, CSCR3, CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP1-β), CCL5 (RANTES), CXCL1/CXCL8, CCL22, CCL17, CXCL1/CXCL8, VHL, CD44, PIK3CD, SOCS1, e/ou proteína-quinase A (PKA) dependente de cAMP.
[00362] As frases “RNA interferente pequeno” (small interfering RNA)
64 / 509 ou siRNA” ou “RNA interferente curto” (short interfering RNA) ou “RNA silenciador” (silencing RNA), definem um grupo de moléculas de RNA de fita dupla, compreendendo fitas de RNA senso e antissenso, cada uma geralmente de cerca de 1.022 nucleotídeos em comprimento, opcionalmente incluindo uma projeção 3’ de 1-3 nucleotídeos. siRNA é ativo na via de interferência de RNA (RNAi, RNA interference), e interfere na expressão de genes alvo específicos com sequências de nucleotídeos complementares.
[00363] O termo sd-RNA refere-se aos agentes de RNAi “autodistribuíveis” (self-deliverable RNAi agents) que são formados como um híbrido de oligonucleotídeos antissenso de RNA de fita dupla assimétrico. O RNA de fita dupla inclui uma fita guia (senso) de cerca de 19-25 nucleotídeos e uma fita passageira (antissenso) de cerca de 10-19 nucleotídeos com uma formação duplex que resulta em uma cauda fosforotiolada de fita simples de cerca de 5-9 nucleotídeos. Em algumas modalidades, as sequências de RNA podem ser modificadas com modificações estabilizadoras e hidrofóbicas como esteróis, por exemplo, colesterol, vitamina D, naftila, isobutila, benzila, indol, triptofano, e fenila, que conferem estabilidade e absorção celular eficaz na ausência de qualquer formulação ou reagente de transfecção. Em algumas modalidades, os ensaios de resposta imune que testam proteínas induzidas por IFN indicam que os sd-RNAs produzem um perfil imunoestimulatório reduzido em comparação com outros agentes de RNAi. Consulte, por exemplo, Byrne et al., December 2013, J. Ocular Pharmacology and Therapeutics, 29(10): 855-864, incorporado como referência. Em algumas modalidades, os sd-RNAs aqui descritos estão comercialmente disponíveis junto à Advirna LLC, Worcester, MA, EUA.
[00364] Os termos “carreador farmaceuticamente aceitável” ou “excipiente farmaceuticamente aceitável” são pretendidos para incluir qualquer um de e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardantes de
65 / 509 absorção, e ingredientes inertes. O uso de tais carreadores farmaceuticamente aceitáveis ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis para ingredientes farmacêuticos ativos é bem conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer carreador farmaceuticamente aceitável ou excipiente farmaceuticamente aceitável convencional é incompatível com o ingrediente farmacêutico ativo, seu uso nas composições farmacêuticas é considerado. Ingredientes farmacêuticos ativos adicionais, como outros fármacos, podem também ser incorporados nas composições e nos métodos descritos.
[00365] Os termos “cerca de” e “aproximadamente” significam dentro de uma faixa estatisticamente significativa de um valor. Uma tal faixa pode estar dentro de uma ordem de magnitude, preferivelmente dentro de 50%, mais preferivelmente dentro de 20%, mais preferivelmente ainda dentro de 10%, e muito mais preferivelmente dentro de 5% de um dado valor ou de uma dada faixa. A variação permissível abrangida pelos termos “cerca de” ou “aproximadamente” depende do sistema específico sob estudo, e pode ser facilmente reconhecida por uma pessoa comumente versada na técnica. Além disso, como aqui usados, os termos “cerca de” e “aproximadamente” significam que dimensões, tamanhos, formulações, parâmetros, formatos e outras quantidades e características não são e não precisam ser exatos, mas podem ser aproximados e/ou maiores ou menores, conforme desejado, refletindo as tolerâncias, os fatores de conversão, o arredondamento, o erro de medição e semelhantes, e outros fatores conhecidos por aquelas pessoas versadas na técnica. Em geral, uma dimensão, um tamanho, uma formulação, um parâmetro, um formato ou outra quantidade ou característica é “cerca de” ou “aproximada” seja ou não expressamente declarado(a) como tal. É observado que modalidades de vários diferentes tamanhos, formatos e dimensões podem utilizar as disposições descritas.
[00366] Os termos transicionais “compreendendo”, “consistindo essencialmente em”, e “consistindo em”, quando usados nas reivindicação
66 / 509 anexadas, na forma original e emendada, definem o escopo das reivindicações com respeito ao que elementos ou etapas de reivindicação adicionais não citados(as), se houver, são excluídos(as) do escopo da(s) reivindicação(ões). O termo “compreendendo” é pretendido para ser inclusivo ou de extremidade aberta e não exclui qualquer elemento, método, etapa ou material adicional, não citado. O termo “consistindo em” exclui qualquer elemento, etapa ou material diferente daqueles especificados na reivindicação e, no último caso, impurezas comuns associadas ao(s) material(ais) especificado(s). O termo “consistindo essencialmente em” limita o escopo de uma reivindicação aos elementos, etapas ou material(ais) especificado(s) e àqueles que não afetam materialmente (as) característica(s) básica(s) e nova(s) da invenção reivindicada. Todas composições, métodos, e kits aqui descritos que representam, como modalidades, a presente invenção podem, em modalidades alternativas, serem mais especificamente definidos por qualquer um dos termos transitórios “compreendendo”, “consistindo essencialmente em”, e “consistindo em”. III. Métodos de Expressão de Proteína Transientemente Alterada em TILs
[00367] Em algumas modalidades, os TILs expandidos da presente invenção são adicionalmente manipulados antes da, durante a, ou após a etapa de expansão, incluindo durante processos de fabricação estéreis, fechados, cada um conforme aqui provido, com o propósito de alterar a expressão de proteína. Em algumas modalidades, a expressão de proteína transientemente alterada é devido à edição genética transiente. Em algumas modalidades, os TILs expandidos da presente invenção são tratados com fatores de transcrição (TFs) e/ou outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína nos TILs. Em algumas modalidades, os TFs e/ou outras moléculas que são capazes de transientemente alterar a expressão de proteína proveem expressão alterada de antígenos de tumor e/ou uma alteração no número de
67 / 509 células-T específicas para antígenos de tumor em uma população de TILs.
[00368] Em algumas modalidades, a presente invenção inclui edição genética mediante inserção de nucleotídeos, como mediante inserção de ácido ribonucleico (RNA), incluindo inserção de RNA mensageiro (mRNA, messenger RNA) ou RNA interferente pequeno (ou curto) (siRNA, small (or short) interfering RNA), em uma população de TILs para promoção da expressão de uma ou mais proteínas ou inibição da expressão de uma ou mais proteínas, e também combinações simultâneas de ambas promoção de um conjunto de proteínas com inibição de outro conjunto de proteínas.
[00369] Em algumas modalidades, os TILs expandidos da presente invenção experimentam alteração transiente de expressão de proteína. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína ocorre na população de TIL em massa antes da primeira expansão, incluindo, por exemplo, na população de TIL obtida, por exemplo, da Etapa A conforme indicado na Figura 8. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína ocorre durante a primeira expansão, incluindo, por exemplo, na população de TIL expandida, por exemplo, na Etapa B conforme indicado na Figura 8. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína ocorre após a primeira expansão, incluindo, por exemplo, na população de TIL na transição entre a primeira expansão e a segunda expansão, a população de TIL obtida, por exemplo, da Etapa B e incluída na Etapa C conforme indicado na Figura 8. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína ocorre na população de TIL em massa antes da segunda expansão, incluindo, por exemplo, na população de TIL obtida, por exemplo, da Etapa C e antes de sua expansão na Etapa D conforme indicado na Figura 8. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína ocorre durante a segunda expansão, incluindo, por exemplo, na população de TIL expandida, por exemplo, na Etapa D conforme indicado na Figura 8. Em algumas
68 / 509 modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína ocorre após a segunda expansão, incluindo, por exemplo, na população de TIL obtida da expansão, por exemplo, na Etapa D conforme indicado na Figura 8.
[00370] Em uma modalidade, um método de transientemente alterar a expressão de proteína em uma população de TILs inclui a etapa de eletroporação. Em uma modalidade, um método de transientemente alterar a expressão de proteína em uma população de TILs é realizado de acordo com os métodos representados nas Figura 30 e Figura 31. Os métodos de eletroporação são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Tsong, Biophys. J. 1991, 60, 297-306, e Publicação de Pedido de Patente Norte-Americana nº 2014/0227237 A1, cujas descrições de cada são aqui incorporadas como referências. Em uma modalidade, um método de transientemente alterar a expressão de proteína em população de TILs inclui a etapa de transfecção por fosfato de cálcio. Os métodos de transfecção por fosfato de cálcio (precipitação de DNA por fosfato de cálcio, revestimento de superfície celular, e endocitose) são conhecidos na técnica e são descritos em Graham e van der Eb, Virology 1973, 52, 456-467; Wigler, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1979, 76, 1373-1376; e Chen e Okayarea, Mol. Cell. Biol. 1987, 7, 2745-2752; e em Patente Norte-Americana nº 5.593.875, cujas descrições, de cada, são aqui incorporadas como referências. Em uma modalidade, um método de transientemente alterar a expressão de proteína em uma população de TILs inclui a etapa de transfecção lipossômica. Os métodos de transfecção lipossômica, como métodos que utilizam formulação lipossômica 1:1 (p/p) de o lipídio catiônico cloreto de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N- trimetilamônio (DOTMA) e a dioleoilfosfotidiletanolamina (DOPE) em água filtrada, são conhecidos na técnica e são descritos em Rose, et al., Biotechniques 1991, 10, 520-525 e Felgner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 1987, 84, 7413-7417 e nas Patentes Norte-Americana nºs 5.279.833;
5.908.635; 6.056.938; 6.110.490; 6.534.484; e 7.687.070, cujas descrições, de
69 / 509 cada, são aqui incorporadas como referências. Em uma modalidade, um método de transientemente alterar a expressão de proteína em uma população de TILs inclui a etapa de transfecção usando métodos descritos nas Patentes Norte-Americana nºs 5.766.902; 6.025.337; 6.410.517; 6.475.994; e
7.189.705; cujas descrições, de cada, são aqui incorporadas como referências.
[00371] Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em um aumento em Células-Tronco-T de Memória (TSCMs, Stem Memory T Cells). As TSCMs são progenitoras iniciais de células-T de memória central antígeno-experientes. As TSCMs geralmente desempenham as capacidades de sobrevivência de longa duração, de autorrenovação, e de multipotência que definem as células-tronco, e são geralmente desejáveis para a geração de produtos de TIL eficazes. As TSCM têm mostrado atividade antitumoral intensificada comparadas com outros subconjuntos de células-T em modelos em camundongo de transferência adotiva de células (Gattinoni et al. Nat Med 2009, 2011; Gattinoni, Nature Rev. Cancer, 2012; Cieri et al. Blood 2013). Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em uma população de TIL com uma composição compreendendo uma alta proporção de TSCM. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em um aumento de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% na percentagem de TSCM. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em um aumento de pelo menos a 1 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, ou 10 vezes em TSCMs na população de TIL. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em uma população de TIL com pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 10%,
70 / 509 pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de TSCMs. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em uma população terapêutica de TIL com pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de TSCMs.
[00372] Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em rejuvenescimento de células-T antígeno-experientes. Em algumas modalidades, o rejuvenescimento inclui, por exemplo, proliferação aumentada, ativação de células-T aumentada, e/ou reconhecimento de antígenos aumentado.
[00373] Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína altera a expressão em uma grande fração das células-T com o propósito de preservar o repertório de TCRs derivados de tumor. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína não altera o repertório de TCRs derivados de tumor. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína mantém o repertório de TCRs derivados de tumor.
[00374] Em algumas modalidades, a alteração transiente de proteína resulta em expressão alterada de um gene específico. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo um gene incluindo mas não se limitando a PD-1 (também referido como PDCD1 ou CD279), TGFBR2, CCR4/5, CBLB (CBL-B), CISH, CCRs (receptores coestimulatórios quiméricos), IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-
71 / 509
21, NOTCH 1/2 ICD, TIM3, LAG3, TIGIT, TGFβ, CCR2, CCR4, CCR5, CXCR1, CXCR2, CSCR3, CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP1- β), CCL5 (RANTES), CXCL1/CXCL8, CCL22, CCL17, CXCL1/CXCL8, VHL, CD44, PIK3CD, SOCS1, e/ou proteína-quinase A (PKA) dependente de cAMP.
Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo um gene selecionado a partir do grupo consistindo em PD-1, TGFBR2, CCR4/5, CBLB (CBL-B), CISH, CCRs (receptores coestimulatórios quiméricos), IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21, NOTCH 1/2 ICD, TIM3, LAG3, TIGIT, TGFβ, CCR2, CCR4, CCR5, CXCR1, CXCR2, CSCR3, CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP1-β), CCL5 (RANTES), CXCL1/CXCL8, CCL22, CCL17, CXCL1/CXCL8, VHL, CD44, PIK3CD, SOCS1, e/ou proteína-quinase A (PKA) dependente de cAMP.
Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo PD-1. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo TGFBR2. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo CCR4/5. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo CBLB.
Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo CISH.
Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo CCRs (receptores coestimulatórios quiméricos). Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo IL-2. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo IL-7. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo IL-10. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo IL-12. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo IL-15. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo IL-21. Em algumas modalidades, a alteração transiente de
72 / 509 expressão de proteína tem como alvo NOTCH 1/2 ICD.
[00375] Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo a via de sinalização NOTCH, como mediante o NOTCH 1/2 ICD e/ou mediante outro ligante de NOTCH, como mDLL1 (consulte, por exemplo Kondo, T. et al., “NOTCH-mediated conversion of activated T cells into stem cell memory-like T cells for adoptive immunotherapy”, Nature Communications, Vol. 8, Article number: 15338 (2017), que é aqui incorporado em sua totalidade como referência).
[00376] Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo TIM3. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo LAG3. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo TIGIT. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo TGFβ. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo CCR1. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo CCR2. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo CCR4. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo CCR5. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo CXCR1. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo CXCR2. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo CSCR3. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo CCL2 (MCP-1). Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo CCL3 (MIP-1α). Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo CCL4 (MIP1-β). Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo CCL5 (RANTES). Em algumas
73 / 509 modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo CXCL1. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo CXCL8. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo CCL22. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo CCL17. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo VHL. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo CD44. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo PIK3CD. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo SOCS1. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo proteína-quinase A (PKA) dependente de cAMP.
[00377] Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão aumentada e/ou superexpressão de um receptor de quimiocina. Em algumas modalidades, o receptor de quimiocina que é superexpressado por expressão transiente de proteína inclui um receptor com um ligante que inclui mas não se limita a CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP- 1α), CCL4 (MIP1-β), CCL5 (RANTES), CXCL1, CXCL8, CCL22, e/ou CCL17. Em algumas modalidades, o receptor de quimiocina que é superexpressado por expressão transiente de proteína inclui um receptor um receptor com um ligante que inclui mas não se limita a IL-2, IL-7, IL-10, IL- 15, e IL-21, e também domínio intracelular (ICD) de NOTCH 1/2). Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo a via de sinalização NOTCH, como mediante o NOTCH 1/2 ICD e/ou mediante outro ligante de NOTCH, como mDLL1 (consulte, por exemplo Kondo, T. et al., “NOTCH-mediated conversion of activated T cells into stem cell memory-like T cells for adoptive immunotherapy”, Nature Communications, Vol. 8, Article number: 15338 (2017), que é aqui
74 / 509 incorporado em sua totalidade como referência).
[00378] Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em uma expressão decrescida e/ou reduzida de PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, TIGIT, TGFβR2, e/ou TGFβ (incluindo resultando, por exemplo, no bloqueio da via de TGFβ). Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão decrescida e/ou reduzida de CBLB (CBL-B). Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão decrescida e/ou reduzida de CISH.
[00379] Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão aumentada e/ou superexpressão de resulta em expressão aumentada e/ou superexpressão de receptores de quimiocinas com o propósito de, por exemplo, aprimorar o tráfego ou movimento de TIL no sítio de tumor. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão aumentada e/ou superexpressão de um CCR (Chimeric Co-Stimulatory Receptor, receptor coestimulatório quimérico). Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão aumentada e/ou superexpressão de um receptor de quimiocina selecionado a partir do grupo consistindo em CCR1, CCR2, CCR4, CCR5, CXCR1, CXCR2, e/ou CSCR3.
[00380] Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão aumentada e/ou superexpressão de uma interleucina. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão aumentada e/ou superexpressão de uma interleucina selecionada a partir do grupo consistindo em IL-2, IL-12, IL-15, e/ou IL-21.
[00381] Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo a via de sinalização NOTCH, como mediante o NOTCH 1/2 ICD e/ou mediante outro ligante de NOTCH, como mDLL1
75 / 509 (consulte, por exemplo Kondo, T. et al., “NOTCH-mediated conversion of activated T cells into stem cell memory-like T cells for adoptive immunotherapy”, Nature Communications, Vol. 8, Article number: 15338 (2017), que é aqui incorporado em sua totalidade como referência). Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão aumentada e/ou superexpressão de NOTCH 1/2 ICD. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão aumentada e/ou superexpressão de um ligante de NOTCH, como mDLL1. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão aumentada e/ou superexpressão de VHL. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão aumentada e/ou superexpressão de CD44. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão aumentada e/ou superexpressão de PIK3CD. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão aumentada e/ou superexpressão de SOCS1, Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão decrescida e/ou reduzida de proteína-quinase A (PKA) dependente de cAMP.
[00382] Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão decrescida e/ou reduzida de uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), e combinações das mesmas. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão decrescida e/ou reduzida de duas moléculas selecionadas a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), e combinações das mesmas. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão decrescida e/ou reduzida de PD-1 e uma
76 / 509 molécula selecionada a partir do grupo consistindo em LAG3, TIM3, CTLA- 4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), e combinações das mesmas. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão decrescida e/ou reduzida de PD-1, LAG-3, CISH, CBLB, TIM3, e combinações das mesmas. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão decrescida e/ou reduzida de PD-1 e uma dentre LAG3, CISH, CBLB, TIM3, e combinações das mesmas. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão decrescida e/ou reduzida de PD-1 e LAG3. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão decrescida e/ou reduzida de PD-1 e CISH. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão decrescida e/ou reduzida de PD-1 e CBLB. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão decrescida e/ou reduzida de LAG3 e CISH. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão decrescida e/ou reduzida de LAG3 e CBLB. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão decrescida e/ou reduzida de CISH e CBLB. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão decrescida e/ou reduzida de TIM3 e PD-1. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão decrescida e/ou reduzida de TIM3 e LAG3. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão decrescida e/ou reduzida de TIM3 e CISH. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão decrescida e/ou reduzida de TIM3 e CBLB.
[00383] Em algumas modalidades, uma molécula de adesão selecionada a partir do grupo consistindo em CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2,
77 / 509 CXCR3, CX3CR1, e combinações das mesmas, é inserida por um método gamarretroviral ou lentiviral na primeira população de TILs, na segunda população de TILs, ou na população colhida de TILs (por exemplo, a expressão da molécula de adesão é aumentada).
[00384] Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão decrescida e/ou reduzida de uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), e combinações das mesmas, e expressão aumentada e/ou intensificada de CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1, e combinações das mesmas. Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína resulta em expressão decrescida e/ou reduzida de uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG3, TIM3, CISH, CBLB, e combinações das mesmas, e expressão aumentada e/ou intensificada de CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1, e combinações das mesmas.
[00385] Em algumas modalidades, há uma redução na expressão de cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, ou cerca de 95%. Em algumas modalidades, há uma redução na expressão de pelo menos cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, ou cerca de 95%. Em algumas modalidades, há uma redução na expressão de pelo menos cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, ou cerca de 95%. Em algumas modalidades, há uma redução na expressão de pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, ou cerca de 95%. Em algumas modalidades, há uma redução na expressão de pelo menos cerca de 85%, cerca de 90%, ou cerca de 95%. Em algumas modalidades, há uma redução na expressão de pelo menos cerca de 80%. Em algumas modalidades,
78 / 509 há uma redução na expressão de pelo menos cerca de 85%, Em algumas modalidades, há uma redução na expressão de pelo menos cerca de 90%. Em algumas modalidades, há uma redução na expressão de pelo menos cerca de 95%. Em algumas modalidades, há uma redução na expressão de pelo menos cerca de 99%.
[00386] Em algumas modalidades, há um aumento na expressão de cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, ou cerca de 95%. Em algumas modalidades, há um aumento na expressão de pelo menos cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, ou cerca de 95%. Em algumas modalidades, há um aumento na expressão de pelo menos cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, ou cerca de 95%. Em algumas modalidades, há um aumento na expressão de pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, ou cerca de 95%. Em algumas modalidades, há um aumento na expressão de pelo menos cerca de 85%, cerca de 90%, ou cerca de 95%. Em algumas modalidades, há um aumento na expressão de pelo menos cerca de 80%. Em algumas modalidades, há um aumento na expressão de pelo menos cerca de 85%, Em algumas modalidades, há um aumento na expressão de pelo menos cerca de 90%. Em algumas modalidades, há um aumento na expressão de pelo menos cerca de 95%. Em algumas modalidades, há um aumento na expressão de pelo menos cerca de 99%.
[00387] Em algumas modalidades, alteração transiente de expressão de proteína é induzida pelo tratamento dos TILs com fatores de transcrição (TFs) e/ou outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína nos TILs. Em algumas modalidades, a plataforma microfluídica isenta de vetor SQZ é utilizada para distribuição intracelular dos fatores de
79 / 509 transcrição (TFs) e/ou de outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína.
Tais métodos que demonstram a capacidade para distribuir proteínas, incluindo fatores de transcrição, para uma variedade de células humanas primárias, incluindo células-T (Sharei et al.
PNAS 2013, e também Sharei et al.
PLOS ONE 2015 e Greisbeck et al.
J.
Immunology vol. 195, 2015) têm sido descritos, incluindo métodos rápidos para deformar células usando uma constrição microfluídica de modo que um TF ou outra molécula entre nas células; consulte, por exemplo, Publicações de Pedidos de Patente Internacionais nºs WO 2013/059343A1, WO 2017/008063A1, ou WO 2017/123663A1, ou Publicações de Pedidos de Patente Norte-Americana nºs US 2014/0287509A1, US 2018/0201889A1, ou US 2018/0245089A1, todas as quais são aqui incorporadas em suas totalidades como referências.
Tais métodos descritos em Publicações de Pedidos de Patente Internacionais nºs WO 2013/059343A1, WO 2017/008063A1, ou WO 2017/123663A1, ou Publicações de Pedidos de Patente Norte-Americana nºs US 2014/0287509A1, US 2018/0201889A1, ou US 2018/0245089A1 podem ser utilizados com a presente invenção com o propósito de expor uma população de TILs aos fatores de transcrição (TFs) e/ou a outras moléculas capazes de induzir expressão transiente de proteína, em que os TFs e/ou as outras moléculas capazes de induzir expressão transiente de proteína proveem expressão aumentada de antígenos de tumor e/ou um aumento no número de células-T específicas para antígenos de tumor na população de TILs, resultando, por conseguinte, na reprogramação da população de TIL e em um aumento na eficácia terapêutica da população de TIL reprogramada em comparação com a população de TIL não reprogramada.
Em algumas modalidades, a reprogramação resulta em uma subpopulação aumentada de células-T efetoras e/ou de células-T de memória relativa à população de partida ou anterior (isto é, anterior à reprogramação ) de TILs, conforme aqui descrita.
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[00388] Em algumas modalidades, o fator de transcrição (TF) inclui mas não se limita a TCF-1, NOTCH 1/2 ICD, e/ou MYB. Em algumas modalidades, o fator de transcrição (TF) é TCF-1. Em algumas modalidades, o fator de transcrição (TF) é NOTCH 1/2 ICD. Em algumas modalidades, o fator de transcrição (TF) é MYB. Em algumas modalidades, o fator de transcrição (TF) é administrado com cultura de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC, induced Pluripotent Stem Cell), como o “KNOCKOUT Serum Replacement” comercialmente disponível (Gibco/ThermoFisher), para induzir reprogramação de TIL adicional. Em algumas modalidades, o fator de transcrição (TF) é administrado com um coquetel de iPSC para induzir reprogramação de TIL adicional. Em algumas modalidades, o fator de transcrição (TF) é administrado sem um coquetel de iPSC. Em algumas modalidades, a reprogramação resulta em um aumento na percentagem de TSCMs. Em algumas modalidades, a reprogramação resulta em um aumento na percentagem de TSCMs em cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, ou cerca de 95% de TSCMs.
[00389] Em algumas modalidades, o método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs compreende: (i) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente; (ii) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2, e opcionalmente OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs; (iii) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com adicionais IL-
81 / 509 2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é pelo menos 100 vezes maior em número que a segunda população de TILs, e em que a segunda expansão é realizada durante pelo menos 14 dias com o propósito de obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs; e (iv) expor a segunda e/ou terceira população de TILs aos fatores de transcrição (TFs) e/ou a outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína, em que os TFs e/ou as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína proveem expressão alterada de antígenos de tumor e/ou uma alteração no número de células-T específicas para antígenos de tumor na população terapêutica de TILs.
[00390] Em uma modalidade, um método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs compreende: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 e opcionalmente compreendendo um anticorpo agonista de 4-1BB durante cerca de 2 a 5 dias; (d) adicionar OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 1 a 3 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50
82 / 509 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema; (e) realizar uma etapa de eletroporação estéril na segunda população de TILs, em que a etapa de eletroporação estéril medeia a transferência de pelo menos um RNA interferente curto ou um RNA mensageiro; (f) repousar a segunda população de TILs durante cerca de 1 dia; (g) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com IL-2 adicional, opcionalmente anticorpo OKT-3, opcionalmente um anticorpo OX40, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 11 dias para obter a terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que a transição da etapa (f) para a etapa (g) ocorre sem abrir o sistema; (h) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (g) para prover uma população colhida de TILs, em que a transição da etapa (g) para a etapa (h) ocorre sem abrir o sistema, a população colhida de TILs é uma população terapêutica de TILs; (i) transferir a população colhida de TILs da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (e) para a etapa (f) ocorre sem abrir o sistema; e (j) criopreservar a população colhida de TILs usando um meio de criopreservação baseado em sulfóxido dimetílico, em que a etapa de eletroporação estéril compreende a distribuição de um RNA interferente curto para inibir a expressão de uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3,
83 / 509 CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), e combinações das mesmas.
[00391] De acordo com uma modalidade, um método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs compreende: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 e opcionalmente compreendendo um anticorpo agonista de 4-1BB durante cerca de 2 a 5 dias; (d) adicionar OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 1 a 3 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema; (e) realizar uma etapa de disrupção de membrana microfluídica SQZ na segunda população de TILs, em que a etapa de disrupção de membrana microfluídica SQZ medeia a transferência de pelo menos um RNA interferente curto ou um RNA mensageiro; (f) repousar a segunda população de TILs durante cerca de 1 dia; (g) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com IL-2 adicional, opcionalmente anticorpo OKT-3, opcionalmente um anticorpo OX40, e
84 / 509 células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 11 dias para obter a terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que a transição da etapa (f) para a etapa (g) ocorre sem abrir o sistema; (h) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (g) para prover uma população colhida de TILs, em que a transição da etapa (g) para a etapa (h) ocorre sem abrir o sistema, a população colhida de TILs é uma população terapêutica de TILs; (i) transferir a população colhida de TILs da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (e) para a etapa (f) ocorre sem abrir o sistema; e (j) criopreservar a população colhida de TILs usando um meio de criopreservação baseado em sulfóxido dimetílico, em que a etapa de disrupção de membrana microfluídica SQZ compreende a distribuição de um RNA interferente curto para inibir a expressão de uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD- 1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), e combinações das mesmas.
[00394] Em algumas modalidades, um método de alteração transiente de expressão de proteína, conforme descrito acima, pode ser combinado com um método de geneticamente modificar uma população de TILs que inclui a etapa de incorporação estável de genes para produção de uma ou mais proteínas. Em uma modalidade, um método de geneticamente modificar uma população de TILs inclui a etapa de transdução retroviral. Em uma modalidade, um método de geneticamente modificar uma população de TILs inclui a etapa de transdução lentiviral. Os sistemas de transdução lentiviral são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Levine, et al.,
85 / 509 Proc. Nat’l Acad. Sci. 2006, 103, 17372-77; Zufferey, et al., Nat. Biotechnol. 1997, 15, 871-75; Dull, et al., J. Virology 1998, 72, 8463-71, e Patente Norte- Americana nº 6.627.442, cujas descrições, de cada, são aqui incorporadas como referências. Em uma modalidade, um método de geneticamente modificar uma população de TILs inclui a etapa de transdução gamarretroviral. Os sistema de transdução gamarretroviral são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Cepko e Pear, Cur. Prot. Mol. Biol. 1996, 9.9.1-9.9.16, cuja descrição é aqui incorporada como referência. Em uma modalidade, um método de geneticamente modificar uma população de TILs inclui a etapa de transferência de gene mediada por transposon. Os sistemas de transferência de gene mediada por transposon são conhecidos na técnica e incluem os sistemas nos quais a transposase é provida como vetor de expressão de DNA ou como um RNA expressável ou uma proteína de modo que expressão de longa duração da transposase não ocorre nas células transgênicas, por exemplo, uma transposase provida como um mRNA (por exemplo, um mRNA compreendendo um quepe (cap) e cauda poli(A)). Sistemas de transferência de gene mediada por transposon adequados, incluindo a transposase Tc1-like do tipo salmonídeo (transposase SB ou “Sleeping Beauty”), como SB10, SB11, e SB100x, e enzimas modificadas com atividade enzimática aumentada, são descritas, por exemplo, em Hackett, et al., Mol. Therapy 2010, 18, 674-83 e Patente Norte-Americana nº
6.489.458, cujas descrições, de cada, são aqui incorporadas como referências.
[00395] Em uma modalidade, um método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs compreende: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado;
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(c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 e opcionalmente compreendendo um anticorpo agonista de 4-1BB durante cerca de 2 a 5 dias; (d) adicionar OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 1 a 3 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema; (e) realizar uma etapa de eletroporação estéril ou uma etapa de disrupção de membrana microfluídica SQZ na segunda população de TILs, em que a etapa de eletroporação estéril ou a etapa de disrupção de membrana microfluídica SQZ medeia a transferência de pelo menos um RNA interferente curto ou um RNA mensageiro; (f) repousar a segunda população de TILs durante cerca de 1 dia; (g) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com IL-2 adicional, opcionalmente anticorpo OKT-3, opcionalmente um anticorpo OX40, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 11 dias para obter a terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que a transição da etapa (f) para a etapa (g) ocorre sem abrir o sistema; (h) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (g) para prover uma população colhida de TILs, em que a transição da etapa (g)
87 / 509 para a etapa (h) ocorre sem abrir o sistema, a população colhida de TILs é uma população terapêutica de TILs; (i) transferir a população colhida de TILs da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (e) para a etapa (f) ocorre sem abrir o sistema; e (j) criopreservar a população colhida de TILs usando um meio de criopreservação baseado em sulfóxido dimetílico, em que a etapa de eletroporação [estéril compreende] a distribuição de um RNA interferente curto para inibir a expressão de uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), e combinações das mesmas, e adicionalmente em que a molécula de adesão selecionada a partir do grupo consistindo em CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1, e combinações das mesmas é inserida por um método gamarretroviral ou lentiviral na primeira população de TILs, segunda população de TILs, ou população colhida de TILs.
[001] Em algumas modalidades, a alteração transiente de expressão de proteína é uma redução na expressão induzida pela interferência de RNA autodistribuível (sd-RNA), que é um duplex de siRNA assimétrico quimicamente sintetizado com uma alta percentagem de substituições 2’-OH (tipicamente flúor ou -OCH3) que compreende uma fita antissenso (guia) de 20-nucleotídeos e uma fita sendo (passageira) de 13 a 15 bases conjugada com colesterol em sua extremidade 3’ usando um linker glicol tetraetilênico (TEG, TetraEthyleneGlycol). Métodos de uso de sd-RNA têm sido descritos em Khvorova e Watts, Nat. Biotechnol. 2017, 35, 238–248; Byrne, et al., J. Ocul. Pharmacol. Ther. 2013, 29, 855-864; e Ligtenberg, et al., Mol. Therapy, 2018, no prelo, cujas descrições são aqui incorporadas como referências. Em uma modalidade, a distribuição de sd-RNA em uma população de TIL é realizada sem o uso de eletroporação, SQZ, ou outros
88 / 509 métodos, ao contrário, usando um período de 1 a 3 dias no qual uma população de TIL é exposta ao sd-RNA a uma concentração d 1 µM/10.000 TILs no meio. Em uma modalidade, a distribuição de sd-RNA em uma população de TIL é realizada usando um período de 1 a 3 dias no qual uma população de TIL é exposta ao sd-RNA a uma concentração de 10 µM/10.000 TILs no meio. Em uma modalidade, a distribuição de sd-RNA em uma população de TIL é realizada usando um período de 1 a 3 dias no qual uma população de TIL é exposta ao sd-RNA a uma concentração de 50 µM/10.000 TILs no meio. Em uma modalidade, a distribuição de sd-RNA em uma população de TIL é realizada usando um período de 1 a 3 dias no qual uma população de TIL é exposta ao sd-RNA a uma concentração de entre 0,1 µM/10.000 TILs e 50 µM/10.000 TILs no meio. Em uma modalidade, a distribuição de sd-RNA em uma população de TIL é realizada usando um período de 1 a 3 dias no qual uma população de TIL é exposta ao sd-RNA a uma concentração de entre 0,1 µM/10.000 TILs e 50 µM/10.000 TILs no meio, em que a exposição ao sd-RNA é realizada duas, três, quatro, ou cinco vezes pela adição de sd-RNA fresco ao meio. Outros processos adequados são descrito, por exemplo, em Publicações de Pedido de Patente Norte-Americana nºs US 2011/0039914 A1, US 2013/0131141 A1, e US 2013/0131142 A1, e Patente Norte-Americana nº 9.080.171, cujas descrições são aqui incorporadas como referências.
[002] Em algumas modalidades, o sd-RNA é inserido em uma população de TILs durante a fabricação usando um processo de acordo com a Figura 32. Em algumas modalidades, o sd-RNA codifica RNA que interfere com NOTCH 1/2 ICD, ligante de NOTCH mDLL1, PD-1, CTLA-4 TIM-3, LAG-3, TIGIT, TGFβ, TGFBR2, proteína-quinase A (PKA) dependente de cAMP, BAFF BR3, CISH, e/ou CBLB. Em algumas modalidades, a redução em expressão é determinada baseada em uma percentagem de silenciamento de gene, por exemplo, conforme avaliada por citometria de fluxo e/ou qPCR.
89 / 509 Em algumas modalidades, há uma redução na expressão de cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, ou cerca de 95%. Em algumas modalidades, há uma redução na expressão de pelo menos cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, ou cerca de 95%. Em algumas modalidades, há uma redução na expressão de pelo menos cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, ou cerca de 95%. Em algumas modalidades, há uma redução na expressão de pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, ou cerca de 95%. Em algumas modalidades, há uma redução na expressão de pelo menos cerca de 85%, cerca de 90%, ou cerca de 95%. Em algumas modalidades, há uma redução na expressão de pelo menos cerca de 80%. Em algumas modalidades, há uma redução na expressão de pelo menos cerca de 85%, Em algumas modalidades, há uma redução na expressão de pelo menos cerca de 90%. Em algumas modalidades, há uma redução na expressão de pelo menos cerca de 95%. Em algumas modalidades, há uma redução na expressão de pelo menos cerca de 99%.
[003] Em uma modalidade, um método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs compreende: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 e opcionalmente compreendendo um anticorpo agonista de 4-1BB durante cerca
90 / 509 de 2 a 5 dias; (d) adicionar OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 1 a 3 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema; (e) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com IL-2 adicional, um ou mais RNA autodistribuível (self-delivering RNA) (sd-RNA), opcionalmente anticorpo OKT-3, opcionalmente um anticorpo OX40, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 11 dias para obter a terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que a transição da etapa (f) para a etapa (g) ocorre sem abrir o sistema; (h) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (g) para prover uma população colhida de TILs, em que a transição da etapa (g) para a etapa (h) ocorre sem abrir o sistema, a população colhida de TILs é uma população terapêutica de TILs; (i) transferir a população colhida de TILs da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (e) para a etapa (f) ocorre sem abrir o sistema; e (j) crio preservar a população colhida de TILs usando um meio de criopreservação baseado em sulfóxido dimetílico, em que os um ou mais sd-RNA transientemente inibe(m) a expressão de uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-
91 / 509 1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), e combinações das mesmas.
[004] Em uma modalidade, um método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs compreende: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 e opcionalmente compreendendo um anticorpo agonista de 4-1BB durante cerca de 2 a 5 dias; (d) adicionar OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 1 a 3 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema; (e) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com IL-2 adicional, um ou mais RNA autodistribuível (sd-RNA), opcionalmente anticorpo OKT- 3, opcionalmente um anticorpo OX40, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 11 dias para obter a terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que a transição da etapa (f) para a etapa (g) ocorre sem abrir o sistema;
92 / 509 (h) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (g) para prover uma população colhida de TILs, em que a transição da etapa (g) para a etapa (h) ocorre sem abrir o sistema, a população colhida de TILs é uma população terapêutica de TILs; (i) transferir a população colhida de TILs da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (e) para a etapa (f) ocorre sem abrir o sistema; e (j) criopreservar a população colhida de TILs usando um meio de criopreservação baseado em sulfóxido dimetílico, em que os um ou mais sd-RNA transientemente inibe(m) a expressão de uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD- 1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), e combinações das mesmas, e adicionalmente em que a molécula de adesão selecionada a partir do grupo consistindo em CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1, e combinações das mesmas é inserida por um método gamarretroviral ou lentiviral na primeira população de TILs, segunda população de TILs, ou população colhida de TILs. A. Métodos com sd-RNA
[005] A tecnologia de RNAi autodistribuível baseada na modificação química de siRNAs pode ser utilizada com os métodos da presente invenção para bem sucedidamente distribuir os sd-RNAs nos TILs conforme aqui descrito. A combinação de modificações na cadeia principal com estrutura de siRNA assimétrica e um ligante hidrofóbico (consulte, por exemplo, Ligtenberg, et al., Mol. Therapy, 2018 e Publicação de Patente Norte- Americana nº 20160304873, e também as Figuras 36 e 37 aqui) permite que sd-RNAs penetrem em células de mamífero cultivadas sem formulações e métodos adicionais pela simples adição ao meio de cultura, aproveitando-se da estabilidade dos sd-RNAs às nucleases. Esta estabilidade permite a sustentação de teores constantes de redução, mediada por RNAi, da atividade
93 / 509 do gene alvo simplesmente pela manutenção da concentração ativa de sd- RNA no meio. Embora não haja o desejo de se vincular à teoria, a estabilização da cadeia principal de sd-RNA provê redução prolongada nos efeitos de expressão genética que podem perdurar durante meses em células não divisórias.
[006] Em uma modalidade, um sd-RNA aqui usado para genes alvo, aqui revelados, tem a estrutura mostrada na Figura 36 ou na Figura 37.
[007] Em algumas modalidades, ocorre mais que 95% de eficiência de transfecção de TILs e uma redução em expressão do alvo pelos vários sd- RNAs específicos. Em algumas modalidades, sd-RNAs contendo vários resíduos de ribose não modificados foram substituídos por sequências completamente modificadas para aumentar a potência e/ou a longevidade do efeito de RNAi. Em algumas modalidades, uma redução no efeito de expressão é mantida durante 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 5 dias, 6 dias, 7 dias, ou 8 dias ou mais. Em algumas modalidades, a redução no efeito de expressão decresce em 10 dias ou mais após o tratamento dos TILs com sd-RNA. Em algumas modalidades, mais que 70% de redução em expressão da expressão do alvo é mantido. Em algumas modalidades, mais que 70% de redução em expressão da expressão do alvo é mantido em TILs. Em algumas modalidades, uma redução em expressão na via de PD-1/PD-L1 permite que os TILs apresentem um efeito in vivo mais potente, que é em algumas modalidades, devido à evitação dos efeitos supressores da via de PD-1/PD- L1. Em algumas modalidades, uma redução em expressão de PD-1 pelo sd- RNA resulta em um aumento da proliferação de TIL.
1. Seleção e Características de sd-RNA a. Estrutura do Oligonucleotídeo sd-RNA
[008] RNA interferente pequeno (siRNA), algumas vezes conhecido como RNA interferente curto ou RNA silenciador, é uma molécula de RNA de fita dupla, geralmente de 19-25 pares de bases em comprimento. O siRNA
94 / 509 é usado em interferência de RNA (RNAi), onde ele interfere na expressão de genes específicos com sequências de nucleotídeos complementares.
[009] RNA de fita dupla (dsRNA, double stranded RNA) pode ser geralmente usado para definir qualquer molécula compreendendo um par de fitas de RNA complementares, geralmente uma fita senso (passageira) e antissenso (guia), e pode incluir regiões de projeção de fita simples. O termo dsRNA, contrastado com siRNA, geralmente se refere a uma molécula precursora que inclui a sequência de uma molécula de siRNA que é liberada da molécula de dsRNA maior pela ação de sistemas de enzimas de clivagem, incluindo Dicer.
[0010] sd-RNA (self-deliverable RNA, RNA autodistribuível) são uma classe nova de compostos de RNAi covalentemente modificados que não exigem um veículo de distribuição para entrarem em células e têm farmacologia aprimorada comparados como os siRNAs tradicionais. “RNA autodistribuível” ou “sd-RNA” é um híbrido antissenso interferente de RNA hidrofobicamente modificado, demonstrado em ser elevadamente eficaz in vitro em células primárias e in vivo após administração local. Absorção robusta e/ou silenciamento robusto sem toxicidade têm sido demonstrados. Os sd-RNAs são moléculas de ácido nucleico geralmente assimétricas quimicamente modificadas com mínimas regiões de fita dupla. As moléculas de sd-RNA tipicamente contêm regiões de fita simples e regiões de fita dupla, e podem conter uma variedade de modificações químicas dentro de ambas as regiões de fita simples e de fita dupla da molécula. Adicionalmente, as moléculas de sd-RNA podem se ligadas a um conjugado hidrofóbico como uma molécula do tipo esterol convencional ou avançada, conforme aqui descrito. sd-RNAs (e/ou RNAs capazes de serem utilizados em maneiras similares aos sd-RNAs) e métodos associados para preparar tais sd-RNAs também têm sido descritos extensivamente, por exemplo, em Publicação de Patente Norte-Americana nº US 2016/0304873, Publicação de Pedido de
95 / 509
Patente Internacional nº WO2010/033246, Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO2017/070151, Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO2009/102427, Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO201/1119887, Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO2010/033247, Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO2009045457, Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO2011/119852, Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO2011/119871, Publicação de Patente Norte-Americana nº US 2011/0263680, Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO2010/033248, Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO2010/078536, Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO2010/090762, Publicação de Patente Norte-Americana nº US 20110039914, Publicação Internacional nº WO2011/109698, Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO2010/090762, Patente Norte- Americana nº US 8.815.818, Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO2016/094845, Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO2017/193053, Publicação de Patente Norte-Americana nº US 2006/0276635, Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO2001/009312, Publicação de Patente Norte-Americana nº US 2017/0043024, Publicação de Patente Norte-Americana nº US 2017/0312367, Publicação de Patente Norte-Americana nº US 2016/0319278, Publicação de Patente Norte-Americana nº US 2017/0369882, Patente Norte-Americana nº US 8.501.706, Publicação de Patente Norte-Americana nº US 2004/0224405, Patente Norte-Americana nº US 8.252.755, Publicação de Patente Norte- Americana nº US 2007/0031844, Publicação de Patente Norte-Americana nº US 2007/0039072, Publicação de Patente Norte-Americana nº US 2007/0207974, Publicação de Patente Norte-Americana nº US 2007/0213520, Publicação de Patente Norte-Americana nº US 2007/0213521, Publicação de Patente Norte-Americana nº US 2007/0219362, Publicação de Patente Norte-
96 / 509 Americana nº US 2007/0238868, Publicação de Patente Norte-Americana nº US 2014/0148362, Publicação de Patente Norte-Americana nº US 2016/0193242, Publicação de Patente Norte-Americana nº US 2016/01946461, Publicação de Patente Norte-Americana nº US 2016/0201058, Publicação de Patente Norte-Americana nº US 2016/0201065, Publicação de Patente Norte-Americana nº US 2017/0349904, Publicação de Patente Norte-Americana nº US 2018/0119144, Patente Norte-Americana nº US 7.834.170, Patente Norte-Americana nº US 8.090.542, e Publicação de Patente Norte-Americana nº US 2012/0052487, todas as quais são aqui incorporadas em suas totalidades como referências para todos os propósitos; também sd-RNAs estão comercialmente disponíveis junto à Advirna LLC, Worcester, MA, EUA. Para otimizar a estrutura, a química, o direcionamento (targeting) para posição, as preferências de sequência, e semelhantes, de sd- RNA, um algoritmo patenteado tem sido desenvolvido e utilizado para predição de potência de sd-RNA (consulte, por exemplo, US 20160304873). Com base nestas análises, sequências de sd-RNA funcionais têm sido geralmente definidas como tendo mais que 70% de redução em expressão à concentração de 1 µM, com uma probabilidade maior que 40%. b. Estrutura de Oligonucleotídeo sd-RNA
[0011] Em algumas modalidades, um ou mais sd-RNAs para uso na presente invenção podem ser gerados a partir de um molde de DNA de fita dupla linear. Em algumas modalidades, o molde de DNA de fita dupla linear para gerar os um ou mais sd-RNAs é um conforme descrito em Patente Norte- Americana nº US 8.859.229, e também descrito abaixo.
[0012] Em algumas modalidades, um molde de DNA de fita dupla linear obtido pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e adequado para transcrição in vitro de um mRNA compreende de 5’ para 3’: um promotor de RNA-polimerase na fita codificante do DNA de fita dupla, uma região 5’-não traduzida menor que 3.000 nucleotídeos em comprimento e eficaz para a
97 / 509 tradução do mRNA em um polipeptídeo detectável após transfecção para dentro de uma célula eucariótica, uma matriz de leitura aberta que codifica o polipeptídeo, em que o polipeptídeo é heterólogo à célula a ser transfectada e em que o polipeptídeo é selecionado a partir do grupo consistindo em um ligante ou um receptor de uma célula imune, um polipeptídeo que estimula ou inibe uma função do sistema imune, e um polipeptídeo que inibe a função de um polipeptídeo oncogênico, região-3’-não traduzida eficaz para a tradução do mRNA em um polipeptídeo detectável após transfecção para dentro de uma célula eucariótica, e um trecho de poli(A) de 50-5.000 nucleotídeos na fita codificante do DNA de fita dupla, em que o promotor é heterólogo à matriz de leitura aberta, e em que o molde de DNA não está contido dentro de um vetor de DNA e termina com a extremidade-3’ do trecho de poli(A). Em algumas modalidades, o promotor de RNA-polimerase compreende uma sequência consenso de ligação para uma RNA-polimerase selecionada a partir do grupo consistindo em T7, T3 ou SP6 RNA-polimerase.
Em algumas modalidades, a matriz de leitura aberta codifica um polipeptídeo de fusão.
Em algumas modalidades, a matriz de leitura aberta codifica um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo em PD-1, TGFBR2, CBLB (CBL- B), CISH, CCRs (receptores coestimulatórios quiméricos), IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, NOTCH 1/2 ICD, TIM3, LAG3, TIGIT, TGFβ, CCR2, CCR4, CCR5, CXCR1, CXCR2, CSCR3, CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP1- β), CCL5 (RANTES), CXCL1/CXCL8, CCL22, CCL17, CXCL1/CXCL8, VHL, CD44, PIK3CD, SOCS1, proteína-quinase A (PKA) dependente de cAMP, e combinações das mesmas.
Em algumas modalidades, a matriz de leitura aberta codifica um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), e combinações das mesmas.
Em algumas modalidades, [DNA] de fita dupla linear compreende, adicionalmente, um sítio de entrada ribossomal interno.
Em algumas modalidades, o trecho de
98 / 509 poli(A) é de 300-400 nucleotídeos em comprimento.
[0013] Em algumas modalidades, o molde de DNA de fita dupla linear da reivindicação 1, em que de 5’ para 3’, o molde consiste em um promotor de RNA-polimerase na fita codificante do DNA de fita dupla, uma região 5’-não traduzida menor que 3.000 nucleotídeos em comprimento e eficaz para a tradução do mRNA em um polipeptídeo detectável após transfecção para dentro de uma célula eucariótica, uma matriz de leitura aberta que codifica o polipeptídeo, em que o polipeptídeo é heterólogo à célula a ser transfectada e em que o polipeptídeo é selecionado a partir do grupo consistindo em um ligante ou um receptor de uma célula imune, um polipeptídeo que estimula ou inibe uma função do sistema imune, e um polipeptídeo que inibe a função de um polipeptídeo oncogênico, a região-3’- não traduzida eficaz para a tradução do mRNA em um polipeptídeo detectável após transfecção para dentro de uma célula eucariótica, e um trecho de poli(A) de 50-5.000 nucleotídeos na fita codificante do DNA de fita dupla, em que o promotor é heterólogo à matriz de leitura aberta, e em que o molde de DNA não está contido dentro de um vetor de DNA e termina com a extremidade-3’ do trecho de poli(A). Em algumas modalidades, a região 3’- não traduzida é pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento.
[0014] Em algumas modalidades, a presente invenção provê um método de gerar o molde de DNA de fita dupla linear descrito acima, em que o método compreende gerar iniciadores direto e reverso, em que o iniciador direto compreende uma pluralidade de nucleotídeos que são substancialmente complementares à fita não codificante de um DNA de fita dupla de interesse, e uma pluralidade de nucleotídeos que funcionam como um sítio de ligação para uma RNA-polimerase, em que o iniciador reverso compreende uma pluralidade de nucleotídeos que são substancialmente complementares à fita codificante de um DNA de fita dupla alvo de interesse, e uma pluralidade de nucleotídeos de desoxitimidina, e realização de amplificação, via reação em
99 / 509 cadeia da polimerase, do DNA alvo, usando os iniciadores direto e reverso para formar o molde de DNA de fita dupla linear.
Em algumas modalidades, a presente invenção provê um método de gerar o molde de DNA de fita dupla linear descrito acima, em que o método compreende gerar iniciadores direto e reverso, em que o iniciador direto compreende uma pluralidade de nucleotídeos que são substancialmente complementares a uma região de nucleotídeos diretamente a montante de um DNA de fita dupla alvo de interesse, em que o iniciador reverso compreende uma pluralidade de nucleotídeos que são substancialmente complementares a uma região de nucleotídeos diretamente a jusante de um DNA de fita dupla alvo de interesse, e realização de amplificação, via reação em cadeia da polimerase, do DNA alvo usando os iniciadores direto e reverso para formar o molde de DNA de fita dupla linear.
Em algumas modalidades, os iniciadores compreendem sequências de nucleotídeos que são substancialmente complementares aos trechos de nucleotídeos nas regiões 5’- e 3’-não traduzidas de um DNA de fita dupla de interesse.
Em algumas modalidades, os iniciadores compreendem sequências de nucleotídeos que são substancialmente complementares aos trechos de nucleotídeos dentro da matriz de leitura aberta de um DNA de fita dupla de interesse.
Em algumas modalidades, os iniciadores compreendem sequências de nucleotídeos que são substancialmente complementares aos trechos de nucleotídeos dentro da matriz de leitura aberta de um DNA de fita dupla de interesse, em que os iniciadores compreendem, adicionalmente, regiões 5’- e 3’-não traduzidas, em que o trecho de nucleotídeos no iniciador direto que compreende a região 5’-não traduzida está entre os nucleotídeos que compreendem o promotor de RNA-polimerase e os nucleotídeos que são substancialmente complementares à fita não codificante de um DNA de fita dupla alvo de interesse, e em que o trecho de nucleotídeos no iniciador reverso que compreende a região 3’-não traduzida está entre a pluralidade de nucleotídeos de desoxitimidina e os nucleotídeos que são substancialmente
100 / 509 complementares à fita codificante de um DNA de fita dupla alvo de interesse. Em algumas modalidades, o iniciador direto e a matriz de leitura aberta compreendem uma sequência consenso Kozak.
[0015] Em algumas modalidades, a invenção provê um método de gerar um ou mais RNAs para transfecção de células compreendendo realizar a transcrição in vitro a partir do molde de DNA de fita dupla linear. Em algumas modalidades, o método compreende, adicionalmente, usar uma poli(A)-polimerase para prolongar a cauda poli(A) do RNA com um ou mais nucleotídeos de adenina ou análogos dos mesmos. Em algumas modalidades, o método compreende, adicionalmente, adicionar nucleotídeos durante a transcrição que funcionam como um quepe (cap) 5’ para o RNA transcrito. Em algumas modalidades, o RNA tem como alvo um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo em PD-1, TGFBR2, CBLB (CBL- B), CISH, CCRs (receptores coestimulatórios quiméricos), IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, NOTCH 1/2 ICD, TIM3, LAG3, TIGIT, TGFβ, CCR2, CCR4, CCR5, CXCR1, CXCR2, CSCR3, CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP1- β), CCL5 (RANTES), CXCL1/CXCL8, CCL22, CCL17, CXCL1/CXCL8, VHL, CD44, PIK3CD, SOCS1, proteína-quinase A (PKA) dependente de cAMP, e combinações das mesmas. Em algumas modalidades, o RNA tem como alvo um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo em PD- 1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), e combinações dos mesmos.
[0016] Em algumas modalidades, a invenção emprega o uso de um ou mais RNAs isolados compreendendo uma ou mais matrizes de leitura aberta, produzidas a partir do molde de DNA de fita dupla linear. Em algumas modalidades, a invenção provê um método para expressar um ou mais RNAs em uma célula compreendendo colocar as células em contato com um ou mais RNAs produzidos a partir do molde de DNA de fita dupla linear. Em algumas modalidades, os RNAs estão presentes em quantidades molares diferentes
101 / 509 para prover teores de expressão separados dos RNAs nas células. Em algumas modalidades, os um ou mais RNAs têm como alvo um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo em PD-1, TGFBR2, CBLB (CBL- B), CISH, CCRs (receptores coestimulatórios quiméricos), IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, NOTCH 1/2 ICD, TIM3, LAG3, TIGIT, TGFβ, CCR2, CCR4, CCR5, CXCR1, CXCR2, CSCR3, CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP1- β), CCL5 (RANTES), CXCL1/CXCL8, CCL22, CCL17, CXCL1/CXCL8, VHL, CD44, PIK3CD, SOCS1, proteína-quinase A (PKA) dependente de cAMP, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, os um ou mais RNAs têm como alvo um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), e combinações dos mesmos. (i) Regiões Não Traduzidas
[0017] As estruturas químicas com a capacidade para promover estabilidade e/ou eficiência de tradução podem também ser usadas. O RNA preferivelmente tem 5’- e 3’-UTRs (UnTranslated Regions). Os exemplos abaixo demonstram que a inclusão de 44 pares de bases de 5’-UTR no molde de PCR permitiu maior eficiência de tradução de CFP RNA transcrito quando comparado com os moldes de PCR contendo apenas 6 pares de bases de 5’- UTR. O exemplos também demonstram que a adição de 113 pares de base de 3’-UTR permite maior eficiência de tradução de GFP RNA transcrito quando comparado com os moldes de PCR contendo apenas 11 pares de bases de 3’- UTR. Em geral, o comprimento da 3’-UTR ultrapassa 100 nucleotídeos, e portanto é preferida a 3’-UTR mais longa que 100 nucleotídeos. Em uma modalidade a sequência de 3’-UTR está entre 100 e 5000 nucleotídeos. O comprimento da 5’-UTR não é tão crítico quanto o comprimento da 3’-UTR e pode ser mais curto. Em uma modalidade, a 5’-UTR está entre zero e 3.000 nucleotídeos em comprimento. O comprimento das sequências de 5’-UTR e 3’-UTR a serem adicionadas à região codificante pode ser alterado por
102 / 509 métodos diferentes, incluindo, mas não se limitando ao, desenho de iniciadores para PCR que se anelam com regiões diferentes das UTRs. Com o uso desta abordagem, uma pessoa comumente versada na técnica pode modificar os comprimentos de 5’-UTR e de 3’-UTR exigidos para alcançar a ótima eficiência de tradução após a transfecção do RNA transcrito.
[0018] As 5’-UTR e 3’-UTR podem ser de ocorrência natural, 5’- UTR e 3’-UTR endógenas para o gene de interesse. Alternativamente, as sequências de UTR que não são endógenas para o gene de interesse podem ser adicionadas pela incorporação das sequências de UTR nos iniciadores direto e reverso ou por quaisquer outras modificações do molde. O uso de sequências de UTR que não são endógenas para o gene de interesse pode ser útil para modificar a estabilidade e/ou a eficiência de tradução do RNA. Por exemplo, é sabido que os elementos ricos em AU nas sequências de 3’-UTR podem decrescer a estabilidade de mRNA. Portanto, as 3’-UTRs podem ser selecionadas ou desenhadas para aumentar a estabilidade do RNA transcrito baseado nas propriedades de UTRs que são bem conhecidas na técnica.
[0019] Em uma modalidade, uma 5’-UTR pode conter a sequência Kozak do gene endógeno. Alternativamente, quando uma 5’-UTR que não é endógena ao gene de interesse estiver sendo adicionada por PCR conforme descrito acima, uma sequência consenso Kozak pode ser redesenhada pela adição de uma sequência de 5’-UTR. As sequências Kozak podem aumentar a eficiência de tradução de alguns transcritos de RNA, mas não parece que são requeridas para todos os RNAs para permitir tradução eficiente. O requisito de sequências Kozak para muitos mRNAs é conhecido na técnica. Em outras modalidades uma 5’-UTR pode ser derivada de um vírus de RNA cujo genoma de RNA é estável em células. Em outras modalidades vários análogos de nucleotídeos podem ser usados na 3’-UTR ou na 5’-UTR para impedir a degradação do mRNA por exonuclease. (ii) Promotor de RNA-Polimerase
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[0020] Para permitir a síntese de RNA a partir de um molde de DNA sem a necessidade de clonagem de gene, um promotor de transcrição deve ser ligado ao molde de DNA a montante da sequência a ser transcrita. Sequências de promotor de RNA-polimerase de bacteriófago podem ser ligadas à St UTR por diferentes métodos de modificação genética, como ligação de DNA, ou podem ser adicionadas ao iniciador direto (5’) da sequência que é substancialmente complementar ao DNA alvo. Quando uma sequência que funciona como um promotor para uma RNA-polimerase é adicionado à extremidade 5’ do iniciador direto, o promotor de RNA-polimerase torna-se incorporado no produto de PCR a montante da matriz de leitura aberta que é para ser transcrita. Em uma modalidade preferida, o promotor é um promotor de T7-polimerase, conforme descrito acima. Outros promotores úteis incluem, mas não se limitam aos, promotores de T3 e SP6 RNA-polimerases. Sequências de nucleotídeos consenso para os promotores T7, T3 e SP6 são conhecidas na técnica. (iii) Cauda Poli(A) e Quepe (Cap) 5’
[0021] Em uma modalidade preferida, o mRNA tem tanto um quepe (cap) na extremidade 5’ quanto uma cauda poli(A) na extremidade 3’ que determinam a ligação ao ribossomo, a iniciação de tradução e a estabilidade de mRNA na célula. Em um molde de DNA circular, por exemplo, DNA plasmidial, a RNA-polimerase produz um produto concatamérico longo que não é adequado para expressão em células eucarióticas. A transcrição de DNA plasmidial linearizado na extremidade da 3’-UTR resulta em mRNA de tamanho normal que não é eficaz em transfecção eucariótica mesmo se ele for poliadenilado após a transcrição.
[0022] Em um molde de DNA linear, RNA-polimerase de fago T7 pode prolongar a extremidade 3’ do transcrito para além da última base do molde (Schenborn e Mierendorf, Nuc. Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva e Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003). Isto
104 / 509 poderia resultar em dobra de transcrito runoff seguida por troca de molde com a segunda fita de DNA ou transcrição do próprio RNA (Triana-Alonso et al., J.
Biol.
Chem., 270:6298-307 (1995); Dunn e Studier, J.
Mol.
Biol., 166:477- 535 (1983); Arnaud-Barbe et al., Nuc.
Acids Res., 26:3550-54 (1998); Macdonald et al., 1993), e então transcrição aberrante em uma direção reversa e acumulação de RNA de fita dupla, que pode inibir a expressão de gene.
A própria linearização de não é suficiente para transcrição correta (Triana- Alonso et al., J.
Biol.
Chem., 270:6298-307 (1995); Dunn e Studier, J.
Mol.
Biol., 166:477-535 (1983); Arnaud-Barbe et al., 1998 Nuc.
Acids Res., 26:3550-54 (1998); Macdonald et al., J.
Mol.
Biol., 232:1030-47 (1993); Nakano et al., Biotechnol.
Bioeng., 64:194-99 (1999), “plasmid DNA linearized downstream of a poly(A/T) stretch of 64-100 nucleotides results in good templates” (Saeboe-Larssen et al., J.
Immunol.
Meth., 259:191-203 (2002); Boczkowski et al., Cancer Res., 60:1028-34 (2000); Elango et al., Biochem Riophys Res.
Commun., 330:958-966 2005). Um sinal de terminação endógeno para T7 RNA-polimerase codifica um RNA que pode se dobrar em uma estrutura em haste-alça seguida por uma trilha de resíduos de uridina (Dunn e Studier, J.
Mol.
Biol., 166:477-535 (1983); Arnaud-Barbe et al., 1998 Nuc.
Acids Res., 26:3550-54 (1998)). Mesmo sem um grampo-de-cabelo (hairpin), uma trilha de uridinas sintetizadas pode atenuar a transcrição (Kiyama e Oishi, Nuc.
Acids Res., 24:4577-4583 (1996). Foi hipotetizado que a linearização de DNA plasmidial a jusante do trecho de poli(A/T) provavelmente formou um tipo de terminador “dinâmico” prevenindo transcrição potencial aberrante: uma excisão 3’ do transcrito de RNA sobre um trecho de poli(A/T) e transcrição na direção reversa criará um sinal do tipo-terminação crescente -- um trecho de poli(U) prolongado e um grampo- de-cabelo de poli(A/U). Consequentemente, iniciadores de PCR reversos foram desenhados com uma sequência de ancoragem 3’ a jusante do gene GFP (Green Fluorescent Protein, Proteína Fluorescente Verde) e um trecho
105 / 509 de 100 bases 5’ de poli(T) (Figura 38).
[0023] O método convencional de integração de trechos de poliA/T em um molde de DNA é clonagem molecular. Entretanto, a sequência de poliA/T integrada em DNA plasmidial pode causar instabilidade plasmidial, que é a razão de porquê moldes de DNA plasmidial obtidos de células bacterianas estão, com frequência, elevadamente contaminados com deleções e outras aberrações. Isto torna o processo de clonagem não apenas laborioso e demorado mas com frequência não confiável. Isto é a razão de porquê um método que permite a construção de moldes de DNA com trechos de poliA/T 3’ sem clonagem [é] elevadamente desejável.
[0024] O segmento de poliA/T do molde de DNA transcricional pode ser produzido durante PCR pelo uso de um iniciador reverso contendo uma cauda de poliT, como cauda de 100T (o tamanho pode ser de 50-5.000 T), ou após a PCR por qualquer outro método, incluindo, mas não se limitando a, ligação de DNA ou recombinação in vitro. As caudas de poli(A) também proveem estabilidade aos RNAs e reduzem a degradação deles. Geralmente, o comprimento de um cauda de poli(A) correlaciona-se positivamente com a estabilidade do RNA transcrito. Em uma modalidade, a cauda de poli(A) está entre 100 e 5.000 adenosinas. Os exemplos abaixo demonstram que um trecho de 100 pares de bases de poli(A) é suficiente para permitir tradução eficaz de um transcrito de RNA.
[0025] As caudas de poli(A) de RNAs podem ser adicionalmente prolongadas após a transcrição in vitro com o uso de uma poli(A)-polimerase, como poliA-polimerase de E. coli (E-PAP, E. coli polyA polymerase). Os exemplos abaixo demonstram que o aumento do comprimento de uma cauda de poli(A) de100 nucleotídeos para entre 300 e 400 nucleotídeos resulta em um aumento de cerca de duas vezes na eficiência de tradução do RNA. Adicionalmente, a ligação de diferentes grupos químicos à extremidade 3’ pode aumentar a estabilidade do mRNA. Tal ligação pode conter nucleotídeos
106 / 509 modificados/artificiais, aptâmeros e outros compostos. Por exemplo, análogos de ATP podem ser incorporados na cauda de poli(A) usando poli(A)- polimerase. Análogos de ATP podem adicionalmente aumentar a estabilidade do RNA. Análogos de ATP adequados incluem, mas não se limitam a, cordiocipina e 8-azaadenosina.
[0026] Os quepes (caps) 5’ podem também prover estabilidade às moléculas de RNA. Em uma modalidade preferida, os RNAs produzidos pelos métodos aqui revelados incluem um quepe (cap) 5’. O quepe (cap) 5’ pode, por exemplo, ser análogos de quepe (cap) m7G(5’)ppp(5’)G, m7G(5’)ppp(5’)A, G(5’)ppp(5’)G ou G(5’)ppp(5’)A, que estão todos comercialmente disponíveis. O quepe (cap) 5’ pode também ser um análogo- de-quepe-anti-reverso (ARCA, Anti-Reverse-Cap-Analog) (consulte, Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001)) ou qualquer outro análogo adequado. O quepe (cap) 5’ é provido usando técnicas conhecidas na técnica e aqui descritas (Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).
[0027] Os RNAs produzidos pelos métodos aqui revelados podem também conter uma sequência de sítio de entrada ribossomal interno (IRES, Internal Ribosome Entry Site). A sequência de IRES pode ser qualquer sequência viral, cromossomal ou artificialmente desenhada que inicia a ligação ribossomal independente de quepe (cap) ao mRNA e facilita a iniciação de tradução. Podem ser incluídos quaisquer solutos adequados para eletroporação celular, que podem conter fatores que facilitam as permeabilidade e viabilidade celulares como açúcares, peptídeos, lipídios, proteínas, antioxidantes, e tensoativos.
[0028] Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 70% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção
107 / 509 apresentam uma redução de 75% em expressão do gene alvo.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 80% em expressão do gene alvo.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 85% em expressão do gene alvo.
Em algumas modalidades, as sequências de sd- RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 90% em expressão do gene alvo.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 95% em expressão do gene alvo.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 99% em expressão do gene alvo.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM a cerca de 10 µM, em algumas modalidades, de cerca de 0,25 µM a cerca de 4 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd- RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA
108 / 509 usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2.25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 4,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 5,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração
109 / 509 de cerca de 6,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 7,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 8,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 9,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 10,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM a cerca de 10 µM/10.000 TILs, ou cerca de 0,25 µM a cerca de 4 µM/10.000 TILs.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM/10.000 TILs.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,5 µM/10.000 TILs.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,75 µM/10.000 TILs.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,0 µM/10.000 TILs.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,25 µM/10.000 TILs.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene
110 / 509 alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,5 µM/10.000 TILs.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,75 µM/10.000 TILs.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,0 µM/10.000 TILs.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,25 µM/10.000 TILs.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,5 µM/10.000 TILs.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,75 µM/10.000 TILs.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,0 µM/10.000 TILs.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,25 µM/10.000 TILs.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,5 µM/10.000 TILs.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,75 µM/10.000 TILs.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 4,0 µM/10.000 TILs.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma
111 / 509 redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 5,0 µM/10.000 TILs.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 6,0 µM/10.000 TILs.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 7,0 µM/10.000 TILs.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 8,0 µM/10.000 TILs.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 9,0 µM/10.000 TILs.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 10,0 µM/10.000 TILs.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM/10.000 TILs/100 μL de meio.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,5 µM/10.000 TILs/100 μL de meio.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,75 µM/10.000 TILs/100 μL de meio.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,0 µM/10.000 TILs/100 μL de meio.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de
112 / 509
1,25 µM/10.000 TILs/100 μL de meio.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,5 µM/10.000 TILs/100 μL de meio.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,75 µM/10.000 TILs/100 μL de meio.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,0 µM/10.000 TILs/100 μL de meio.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,25 µM/10.000 TILs/100 μL de meio.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,5 µM/10.000 TILs/100 μL de meio.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,75 µM/10.000 TILs/100 μL de meio.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,0 µM/10.000 TILs/100 μL de meio.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,25 µM/10.000 TILs/100 μL de meio.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,5 µM/10.000 TILs/100 μL de meio.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em
113 / 509 expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,75 µM/10.000 TILs/100 μL de meio. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 4,0 µM/10.000 TILs/100 μL de meio. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 5,0 µM/10.000 TILs/100 μL de meio. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 6,0 µM/10.000 TILs/100 μL de meio. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 7,0 µM/10.000 TILs/100 μL de meio. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 8,0 µM/10.000 TILs/100 μL de meio. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 9,0 µM/10.000 TILs/100 μL de meio. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 10,0 µM/10.000 TILs/100 μL de meio. c. Modificações em sd-RNA
[0029] Em algumas modalidades, os agentes oligonucleotídicos compreendem uma ou mais modificações para aumentar a estabilidade e/ou a efetividade do agente terapêutico, e para realizar distribuição eficiente do oligonucleotídeo para as células ou o tecido a ser(em) tratado(as). Tais modificações podem incluir uma modificação 2’-O-metila, uma modificação
114 / 509 2’-O-Fluro, uma modificação difosforotioato, nucleotídeo 2’-F-modificado, um nucleotídeo 2’-O-metil-modificado e/ou um 2’-desoxinucleotídeo. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo é modificado para incluir uma ou mais modificações hidrofóbicas incluindo, por exemplo, esterol, colesterol, vitamina D, naftila, isobutila, benzila, indol, triptofano, e/ou fenila. Em uma modalidade específica adicional, nucleotídeos quimicamente modificados são combinação de modificação fosforotioatos, modificação 2’-O-metila, modificação 2’-desoxi, modificações hidrofóbicas e modificação fosforotioatos. Em algumas modalidades, os açúcares podem ser modificados e os açúcares modificados podem incluir, mas não se limitam a, D-ribose, 2’- O-alquila (incluindo 2’-O-metila e 2’-O-etila), isto é, 2’-alcoxila, 2’-amino, 2’-S-alquila, 2’-halo (incluindo 2’-fluoro), T-metoxietoxila, 2’-aliloxila (- OCH2CH=CH2), 2’-propargila, 2’-propila, etinila, etenila, propenila, e ciano e semelhantes. Em uma modalidade, a porção açúcar pode ser uma hexose e incorporada em um oligonucleotídeo conforme descrito (Augustyns, K., et al., Nucl. Acids. Res., 18:4711 (1992)).
[0030] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo de fita dupla da invenção é de fita dupla ao longo de seu comprimento inteiro, isto é, sem sequência de fita simples de projeção em qualquer extremidade da molécula, isto é, é de extremidade cega. Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico individuais podem ser de comprimentos diferentes. Em outras palavras, um oligonucleotídeo de fita dupla da invenção não é de fita dupla ao longo de seu comprimento inteiro. Por exemplo, quando duas moléculas de ácido nucleico separadas são usadas, uma das moléculas, por exemplo, a primeira molécula compreendendo uma sequência antissenso, pode ser mais longa que a segunda molécula que hibridiza com a mesma (deixando uma porção da molécula de fita simples). Em algumas modalidades, quando uma molécula de ácido nucleico individual é usada, uma porção da molécula em qualquer extremidade pode permanecer com fita simples.
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[0031] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo de fita dupla da invenção contém malpareamentos e/ou alças ou saliências, mas é de fita dupla ao longo de pelo menos cerca de 70% do comprimento do oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo de fita dupla da invenção é de fita dupla ao longo de pelo menos cerca de 80% do comprimento do oligonucleotídeo. Em outra modalidade, um oligonucleotídeo de fita dupla da invenção é de fita dupla ao longo de pelo menos cerca de 90%-95% do comprimento do oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo de fita dupla da invenção é de fita dupla ao longo de pelo menos cerca de 96%-98% do comprimento do oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo de fita dupla da invenção contém pelo menos ou até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 malpareamentos.
[0032] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo pode ser substancialmente protegido contra nucleases por exemplo, pela modificação das ligações 3’ ou 5’ (por exemplo, Patente Norte-Americana nº 5.849.902 e WO 98/13526). Por exemplo, podem ser preparados oligonucleotídeos resistentes pela inclusão de um “grupo bloqueador”. O termo “grupo bloqueador”, como aqui usado, refere-se aos substituintes (por exemplo, diferentes de grupos OH) que podem ser ligados aos oligonucleotídeos ou nucleomonômeros, quer como grupos protetores quer como grupos acopladores para síntese (por exemplo, FITC, propila (CH2-CH2-CH3), glicol (-O-CH2-CH2-O-), fosfato (PO32-), hidrogenofosfonato, ou fosforoamidito). “Grupos bloqueadores” podem também incluir “grupos bloqueadores terminais” ou “grupos bloqueadores de exonuclease” que protegem as terminações-5’ e -3’ do oligonucleotídeo, incluindo nucleotídeos modificados e estruturas não nucleotídicas resistentes às exonucleases.
[0033] Em algumas modalidades, pelo menos uma porção dos polinucleotídeos contíguos dentro do sd-RNA são ligadas por uma ligação
116 / 509 substituta, por exemplo, uma ligação fosforotioato.
[0034] Em algumas modalidades, a modificação química pode resultar em pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 aprimoramentos em absorção celular. Em algumas modalidades, pelo menos um dos resíduos C ou U inclui uma modificação hidrofóbica. Em algumas modalidades, uma pluralidade de Cs e Us contêm uma modificação hidrofóbica. Em algumas modalidades, pelo menos 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60% 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou pelo menos 95% das Cs e Us podem conter uma modificação hidrofóbica. Em algumas modalidades, todas as Cs e Us contêm uma modificação hidrofóbica.
[0035] Em algumas modalidades, o sd-RNA ou os sd-rxRNAs apresenta(m) liberação endossomal intensificada de moléculas de sd-rxRNA mediante a incorporação de aminas protonáveis. Em algumas modalidades, as aminas protonáveis são incorporadas na fita senso (na parte da molécula que é descartada após o carregamento de RISC (RNA-induced silencing complex, complexo silenciador induzido por RNA). Em algumas modalidades, os compostos de sd-RNA da invenção compreendem um composto assimétrico compreendendo uma região duplex (requerida para a entrada eficiente de RISC de 10-15 bases de comprimento) e região de fita simples de 4-12 nucleotídeos de comprimento; com um duplex de 13 nucleotídeos. Em algumas modalidades, é utilizada uma região de fita simples de 6 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a região de fita simples do sd-RNA compreende 2-12 ligações fosforotioato internucleotídeos (referidas como modificações fosforotioato). Em algumas modalidades, são utilizadas 6-8 ligações fosforotioato internucleotídeos. Em algumas modalidades, os compostos de sd-RNA da invenção também incluem um padrão de
117 / 509 modificação química exclusivo, que provê estabilidade e é compatível com a entrada de RISC.
[0036] A fita guia, por exemplo, pode também estar modificada por uma modificação química que confirma a estabilidade sem interferir com a entrada de RISC. Em algumas modalidades, o padrão de modificação química na fita guia inclui a maioria dos nucleotídeos C e U estando 2’-F-modificados e a extremidade-5’ estando fosforilada.
[0037] Em algumas modalidades, pelo menos 30% dos nucleotídeos no sd-RNA ou sd-rxRNA estão modificados. Em algumas modalidades, pelo menos 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% dos nucleotídeos no sd-RNA ou sd- rxRNA estão modificados. Em algumas modalidades, 100% dos nucleotídeos no sd-RNA ou sd-rxRNA estão modificados.
[0038] Em algumas modalidades, as moléculas de sd-RNA têm mínimas regiões de fita dupla. Em algumas modalidades a região da molécula que é de fita dupla está na faixa de 8-15 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a região da molécula que é de fita dupla é de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades a região de fita dupla é de 13 nucleotídeos de comprimento. Pode haver 100% de complementaridade entre a fita guia e a fita passageira, ou pode haver um ou mais malpareamentos entre a fita guia e a fita passageira. Em algumas modalidades, em uma extremidade da molécula de fita dupla, a molécula quer é de extremidade cega quer tem uma projeção de um nucleotídeo. A região de fita simples da molécula é, em algumas modalidades, entre 4 e 12 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a região de fita
118 / 509 simples pode ser de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a região de fita simples pode também se de menos que 4 ou mais que 12 nucleotídeos de comprimento. Em determinadas modalidades, a região de fita simples é de 6 ou 7 nucleotídeos de comprimento.
[0039] Em algumas modalidades, as moléculas de sd-RNA têm estabilidade aumentada. Em alguns casos, uma molécula de sd-RNA ou de sd- rxRNA quimicamente modificada tem uma meia-vida, em média, que é mais longa que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou mais que 24 horas, incluindo quaisquer valores intermediários. Em algumas modalidades, o sd-rxRNA tem uma meia-vida, em média, que é mais longa que 12 horas.
[0040] Em algumas modalidades, o sd-RNA é otimizado para potência aumentada e/ou toxicidade reduzida. Em algumas modalidades, o comprimento de nucleotídeos da fita guia e/ou da fita passageira, e/ou o número de modificações fosforotioato na fita guia e/ou na fita passageira, podem, em alguns aspectos, influenciar a potência da molécula de RNA, enquanto que a substituição de modificações 2’-fluoro (2’F) por modificações 2’-O-metila (2’OMe) pode, em alguns aspectos, influenciar a toxicidade da molécula. Em algumas modalidades, é predito que a redução no teor de 2’F de uma molécula reduz a toxicidade da molécula. Em algumas modalidades, o número de modificação fosforotioato em uma molécula de RNA pode influenciar a absorção da molécula para dentro de uma célula, por exemplo a eficiência de absorção passiva da molécula para dentro de uma célula. Em algumas modalidades, os sd-RNAs não têm modificação 2’F e ainda são distinguidos por igual eficácia em absorção celular e penetração em tecido.
[0041] Em algumas modalidades, uma fita guia é de aproximadamente 18-19 nucleotídeos em comprimento e tem aproximadamente 2-14 modificações fosfato. Por exemplo, uma fita guia
119 / 509 pode conter 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou mais que 14 nucleotídeos que são modificados com fosfato.
A fita guia pode conter uma ou mais modificações que conferem estabilidade aumentada sem interferirem com a entrada de RISC.
Os nucleotídeos modificados com fosfato, como nucleotídeos modificados com fosforotioato, podem estar na extremidade-3’, na extremidade-5’ ou espalhados ao longo da fita guia.
Em algumas modalidades, o terminal-3’ de 10 nucleotídeos da fita guia contém 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos modificados com fosforotioato.
A fita guia pode também conter modificações 2’F e/ou 2’OMe, que podem estar localizadas ao longo da molécula.
Em algumas modalidades, o nucleotídeo na posição da fita guia (o nucleotídeo na posição mais 5’ da fita guia) está modificado com 2’OMe e/ou fosforilado.
Os nucleotídeos C e U dentro da fita guia podem estar modificados com 2’F.
Por exemplo, os nucleotídeos C e U nas posições 2-10 de uma fita guia de 19 nt (nucleotídeos) (ou em posições correspondentes em uma fita guia de um comprimento diferente) podem estar modificados com 2’F.
Os nucleotídeos C e U nucleotídeos dentro da fita guia podem também estar modificados com 2’OMe.
Por exemplo, os nucleotídeos C e U nas posições 11-18 de uma fita guia de 19 nt (ou em posições correspondentes em uma fita guia de um comprimento diferente) podem estar modificados com 2’OMe.
Em algumas modalidades, o nucleotídeo na extremidade mais 3’ da fita guia estão não modificado.
Em determinadas modalidades, a maioria das Cs e Us dentro da fita guia estão modificadas com 2’F e a extremidade 5’ da fita guia está fosforilada.
Em outras modalidades, a posição 1 e as Cs ou Us nas posições 11-18 estão modificadas com 2’OMe e a extremidade 5’ da fita guia está fosforilada.
Em outras modalidades, a posição 1 e as Cs ou Us nas posições 11-18 estão modificadas com 2’OMe, a extremidade 5’ da fita guia está fosforilada, e as Cs ou Us nas posições 2-10 estão modificadas com 2’F. d.
A Distribuição de sd-RNA
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[0042] A tecnologia de RNAi autodistribuível provê um método de diretamente transfectar células com o agente de RNAi, sem a necessidade de formulações ou técnicas adicionais. A capacidade para transfectar linhagens celulares difíceis de transfectar, a alta atividade in vivo, e a simplicidade de uso, são características das composições e dos métodos que apresentam vantagens funcionais significativas sobre as técnicas baseadas em siRNA tradicionais, e como tais, os métodos com sd-RNA são utilizados em várias modalidades relacionadas aos métodos de redução em expressão do gene alvo nos TILs da presente invenção. Os métodos com sd-RNAi permitem direcionar a distribuição de compostos quimicamente sintetizados para uma ampla variedade de células primárias e tecidos primários, ambos ex-vivo e in vivo. Os sd-RNAs descritos, aqui, em algumas modalidades da invenção estão comercialmente disponíveis junto à Advirna LLC, Worcester, MA, EUA.
[0043] A estrutura geral das moléculas de sd-RNA é mostrada na Figura 36. Os sd-RNAs são formados como estruturas híbridas de oligonucleotídeos antissenso de siRNA hidrofobicamente modificados, e são revelados, por exemplo, em Byrne et al., December 2013, J. Ocular Pharmacology and Therapeutics, 29(10): 855-864, aqui incorporado em sua totalidade como referência.
[0044] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos de sd-RNA podem ser distribuídos para os TILs aqui descritos usando eletroporação estéril.
[0045] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos podem ser distribuídos para as células em combinação com um sistema de distribuição transmembrana. Em algumas modalidades, este sistema de distribuição transmembrana compreende lipídios, vetores virais, e semelhantes. Em algumas modalidades, o agente oligonucleotídico é um agente de RNAi de autodistribuição, que não requer nenhuns agentes de distribuição.
[0046] Em modalidades, os oligonucleotídeos, como RNAs ou sd-
121 / 509 RNAs aqui descritos, podem ser introduzidos em células alvo usando métodos diferentes, por exemplo, métodos comercialmente disponíveis que incluem, mas não se limitam a, eletroporação (Amaxa Nucleofector-II™ (Amaxa Biosystems, Colônia, Alemanha)), (ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, MA, EUA), Neon™ Transfection System (comercialmente disponível junto à ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EUA), e/ou o Gene Pulser II™ (BioRad, Denver, CO, EUA), Multiporator™ (Eppendort, Hamburgo, Alemanha), transfecção mediada por lipossoma catiônico usando lipofecção, encapsulação em polímero, transfecção mediada por peptídeo, ou sistemas de distribuição de partícula biolística como “pistolas de genes” (consulte, por exemplo, Nishikawa, et al. Hum. Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)), aqui incorporado em sua totalidade como referência. Consulte, também, Patente Norte-Americana nº 8.859.229, Pedido de Patente Norte-Americana nº 2016/0230188, e também o “Amaxa Nucleofector® II Manual” (disponível junto à World Wide Web em http://icob.sinica.edu.tw/pubweb/bio- chem/Core%20Facilities/Data/R401-core/Nucleofector_Manual_II_Apr06.pd f).
[0047] Em algumas modalidades, eletroporação pode ser realizada usando um Amaxa NUCLEOFECTOR-II™ de acordo com as recomendações do fabricante. Em algumas modalidades, os TILs podem ser transfectados usando solução V de NUCLEOFECTOR-II™ e o conjunto de regimes recomendados para eletroporação. Em algumas modalidades, os TILs podem ser transfectados usando as soluções V, T e R e diferentes regimes de eletroporação. Em algumas modalidades, os TILs podem ser transfectados usando solução de células-T de NUCLEOFECTOR-II™ e diferentes regimes de eletroporação. Métodos alternativos de distribuição de ácidos nucleicos podem também ser utilizados para transfectar os oligonucleotídeos aqui descritos usados: transfecção mediada por lipossoma catiônico foi realizada usando LIPOFECTIN™ ou LIPOFECTAMIN™ (Invitrogen). Eletroporação
122 / 509 foi também realizada com o ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, MA, EUA), o Gene Pulser II™ (BioRad, Denver, CO, EUA), Multiporator™ (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha), e/ou o NeonTM Transfection System (comercialmente disponível junto à ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Em algumas modalidades, um DNA plasmidial pmaxGFP (Amaxa Biosystems) pode ser utilizado como o DNA de controle. Em algumas modalidades, a eficiência de transfecção (ET) pode ser determinada aproximadamente 3, 6, 9, 12, 15, e/ou 18 horas após a transfecção por separação de células ativadas por fluorescência (FACS, Fluorescence Activated Cell Sorting). Em alguns experimentos os transfectantes podem ser adicionalmente analisados a cada 12 horas a 24 horas até que a GFP (Green Fluorescent Protein, Proteína Fluorescente Verde) não possa mais ser detectada para os controles de GFP. Em algumas modalidades, a viabilidade celular pode ser determinada por exclusão com corante azul tripano.
[0048] Os oligonucleotídeos e as composições de oligonucleotídeo são colocados em contato com (por exemplo, colocados em contato com, também referido aqui como administrados a ou distribuídos para) e absorvidos pelos TILs aqui descritos, incluindo mediante absorção passiva pelos TILs. O sd-RNA pode ser adicionado aos TILs conforme aqui descritos durante a primeira expansão, por exemplo Etapa B, após a primeira expansão, por exemplo, durante a Etapa C, antes da ou durante a segunda expansão, por exemplo antes da ou durante a Etapa D, após a Etapa D e antes da colheita na etapa E, durante e após a colheita na Etapa F, antes da ou durante a formulação final e/ou transferência para Bolsa de infusão na Etapa F, e também antes de qualquer etapa de criopreservação opcional na Etapa F. Além disso, o sd-RNA pode ser adicionado após o descongelamento de qualquer etapa de criopreservação na Etapa F. Em uma modalidade, um ou mais sd-RNAs que têm como alvos genes conforme aqui descritos, incluindo PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, podem ser adicionados ao meio de
123 / 509 cultura de células compreendendo TILs e outros agentes em concentrações selecionadas a partir do grupo consistindo em 100 nM a 20 mM, 200 nM a 10 mM, 500 nM a 1 mM, 1 µM a 100 µM, e 1 µM a 100 µM.
Em uma modalidade, um ou mais sd-RNAs que têm como alvos genes conforme aqui descritos, incluindo PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, podem ser adicionados ao meio de cultura de células compreendendo TILs e outros agentes em quantidades selecionadas a partir do grupo consistindo em 0,1 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 0,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 0,75 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1,25 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 2 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, ou 10 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio.
Em uma modalidade, um ou mais sd-RNAs que têm como alvos genes conforme aqui descritos, incluindo PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, podem ser adicionados às culturas de TIL durante os estágios pre-REP ou REP duas vezes por dia, um vez por dia, a cada dois dias, a cada três dias, a cada quatro dias, a cada cinco dias, a cada seis dias, ou a cada sete dias.
Em uma modalidade, um ou mais sd-RNAs que têm como alvos genes conforme aqui descritos, incluindo PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, podem ser adicionados ao meio de cultura de células compreendendo TILs e outros agentes em quantidades selecionadas a partir do grupo consistindo em 0,1 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 0,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 0,75 μM de sd- RNA/10.000 TILs, 1 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1,25 μM de sd- RNA/10.000 TILs, 1,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 2 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, ou 10 μM de sd-RNA/10.000 TILs.
Em uma modalidade, um ou mais sd-RNAs que têm como alvos genes conforme aqui descritos, incluindo PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, podem ser adicionados às culturas de TIL durante o primeiro estágio de expansão, o
124 / 509 segundo estágio de expansão, e/ou estágios de expansão adicionais duas vezes por dia, um vez por dia, a cada dois dias, a cada três dias, a cada quatro dias, a cada cinco dias, a cada seis dias, ou a cada sete dias.
[0049] As composições de oligonucleotídeo da invenção, incluindo sd-RNA, podem ser colocadas em contato com os TILs conforme aqui descritos durante o processo de expansão, por exemplo pela dissolução de sd- RNA em altas concentrações no meio de cultura de células e pela permissão de tempo suficiente para ocorrer a absorção passiva. Em algumas modalidades, as altas concentrações incluem 0,1 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 0,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 0,75 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1,25 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1,5 μM de sd- RNA/10.000 TILs, 2 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, ou 10 μM de sd-RNA/10.000 TILs. Em algumas modalidades, as altas concentrações incluem 2 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 5 μM de sd- RNA/10.000 TILs, ou 10 μM de sd-RNA/10.000 TILs. Em algumas modalidades, as altas concentrações incluem 5 μM de sd-RNA/10.000 TILs ou até 10 μM de sd-RNA/10.000 TILs.
[0050] Em algumas modalidades, a distribuição de oligonucleotídeos para dentro de células pode ser intensificada por métodos adequados reconhecidos na técnica incluindo fosfato de cálcio, DMSO, glicerol ou dextrana, eletroporação, ou por transfecção, por exemplo, usando composição de lipídios catiônicos, aniônicos, ou neutros ou lipossomas usando métodos conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, WO 90/14074; WO 91/16024; WO 91/17424; Patente Norte-Americana nº 4.897.355; Bergan et al. 1993. Nucleic Acids Research. 21 :3567). e. Combinações de sd-RNA
[0051] Em algumas modalidades, mais que um sd-RNA é usado para reduzir a expressão de um gene alvo. Em algumas modalidades, um ou mais dentre PD-1, TIM-3, CBLB, LAG3 e/ou CISH que têm como alvos sd-RNAs
125 / 509 são usados juntos. Em algumas modalidades, um PD-1 sd-RNA é usado com um ou mais dentre TIM-3, CBLB, LAG3 e/ou CISH com o propósito de reduzir a expressão de mais que um alvo gênico. Em algumas modalidades, um LAG3 sd-RNA é usado em combinação com um CISH que tem como alvo sd-RNA para reduzir a expressão gênica de ambos os alvos. Em algumas modalidades, os sd-RNAs que têm como alvos um ou mais dentre PD-1, TIM- 3, CBLB, LAG3 e/ou CISH, aqui, estão comercialmente disponíveis junto à Advirna LLC, Worcester, MA, EUA. Em algumas modalidades, os sd-RNAs que têm como alvos um ou mais dentre PD-1, TIM-3, CBLB, LAG3 e/ou CISH têm a estrutura mostrada na Figura 36 ou na Figura 37.
[0052] Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo um gene selecionado a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo um gene selecionado a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, um sd-RNA tem como alvo PD-1 e outro sd-RNA tem como alvo um gene selecionado a partir do grupo consistindo em LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo um gene selecionado dentre PD-1, LAG-3, CISH, CBLB, TIM3, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo um gene selecionado dentre PD-1 e um dentre LAG3, CISH, CBLB, TIM3, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, um sd-RNA tem como alvo PD-1 e um sd-RNA tem como alvo LAG3. Em algumas modalidades, um sd-RNA tem como alvo PD-1 e um sd-RNA tem como alvo CISH. Em algumas modalidades, um sd-RNA tem como alvo PD-1 e um sd- RNA tem como alvo CBLB. Em algumas modalidades, um sd-RNA tem como alvo LAG3 e um sd-RNA tem como alvo CISH. Em algumas
126 / 509 modalidades, um sd-RNA tem como alvo LAG3 e um sd-RNA tem como alvo CBLB. Em algumas modalidades, um sd-RNA tem como alvo CISH e um sd-RNA tem como alvo CBLB. Em algumas modalidades, um sd-RNA tem como alvo TIM3 e um sd-RNA tem como alvo PD-1. Em algumas modalidades, um sd-RNA tem como alvo TIM3 e um sd-RNA tem como alvo LAG3. Em algumas modalidades, um sd-RNA tem como alvo TIM3 e um sd- RNA tem como alvo CISH. Em algumas modalidades, um sd-RNA tem como alvo TIM3 e um sd-RNA tem como alvo CBLB. f. Superexpressão de Receptores Coestimulatórios ou Moléculas de Adesão
[0053] De acordo com modalidades adicionais, a alteração da expressão de proteína de TILs durante o método de expansão de TIL pode também permitir a expressão de um ou mais genes de ponto de checagem imune a serem intensificados em pelo menos uma porção da população terapêutica de TILs. Por exemplo, a alteração da expressão de proteína pode causar a expressão de um receptor estimulatório a ser intensificado, o que significa que ele é superexpressado em comparação com a expressão de um receptor estimulatório que não tem sido geneticamente modificado. Exemplos não limitadores de genes de ponto de checagem imune que podem apresentar expressão intensificada pela alteração transiente da expressão de proteína em TILs da presente invenção incluem determinados receptores de quimiocinas e interleucinas, como CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1, IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21, o domínio intracelular (ICD) de NOTCH 1/2, e/ou o ligante de NOTCH mDLL1. (i) CCRs & CCLs
[0054] Para a imunoterapia adotiva de células-T ser eficaz, as células- T precisam ser transportadas apropriadamente para dentro de tumores pelas quimiocinas. Uma igualação entre as quimiocinas secretadas pelas células tumorais, quimiocinas presentes na periferia, e receptores de quimiocinas
127 / 509 expressados pelas células-T é importante para o transporte bem sucedido de células-T para dentro de um leito tumoral.
[0055] De acordo com modalidades específicas, a alteração dos métodos de expressão de proteína da presente invenção pode ser usada para aumentar a expressão de determinados receptores de quimiocinas nos TILs, como um ou mais dentre CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, e/ou CX3CR1. A superexpressão de CCRs pode ajudar a promover a função efetora e a proliferação de TILs após a transferência adotiva. Em algumas modalidades, a alteração dos métodos de expressão de proteína da presente invenção pode ser usada para aumentar a expressão de CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP1-β), CCL5 (RANTES), CXCL1, CXCL8, CCL22, e/ou CCL17 nos TILs.
[0056] De acordo com modalidades específicas, a expressão de um ou mais dentre CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3 e/ou CX3CR1 em TILs é intensificada de acordo com as composições e os métodos da presente invenção. Por exemplo, um método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs pode ser realizado de acordo com qualquer modalidade dos métodos aqui descritos (por exemplo, processo 2A ou os métodos mostrados nas Figuras 20 e 21), em que o método compreende edição genética de pelo menos uma porção dos TILs pela intensificação da expressão de um ou mais dentre CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3 e/ou CX3CR1. Conforme descrito com mais detalhe abaixo, o processo de edição genética pode compreender o uso de uma nuclease programável que medeia a geração de uma quebra de fita simples ou de fita dupla em um gene de receptor de quimiocina. Por exemplo, um método CRISPR, um método TALE, ou um método dedo de zinco pode ser usado para intensificar a expressão de determinados receptores de quimiocinas nos TILs.
[0057] Em uma modalidade, as moléculas de adesão CCR4 e/ou
128 / 509 CCR5 são inseridas em uma população de TIL usando um método gamarretroviral ou lentiviral conforme aqui descrito. Em uma modalidade, a molécula de adesão CXCR2 é inserida em uma população de TIL usando um método gamarretroviral ou lentiviral conforme descrito em Forget, et al., Frontiers Immunology 2017, 8, 908 ou Peng, et al., Clin. Cancer Res. 2010, 16, 5458, cujas descrições são aqui incorporadas como referências.
[0058] Em algumas modalidades, a presente invenção provê um método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs compreendendo: (i) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente; (ii) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2, e opcionalmente OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs; (iii) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com adicionais IL- 2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é pelo menos 100 vezes maior em número que a segunda população de TILs, e em que a segunda expansão é realizada durante pelo menos 14 dias com o propósito de obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs; e (iv) expor a segunda e/ou terceira população de TILs aos fatores de transcrição (TFs) e/ou a outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína, em que os TFs e/ou as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína proveem expressão alterada de antígenos de tumor e/ou uma alteração no número de células-T específicas para antígenos de tumor na população terapêutica de TILs, em que a expressão alterada é um aumento na expressão de uma ou
129 / 509 mais dentre CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1, CCL2 (MCP- 1), CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP1-β), CCL5 (RANTES), CXCL1, CXCL8, e/ou CCL22. (ii) Interleucinas & Outras
[0059] De acordo com modalidades adicionais, os métodos de edição genética da presente invenção podem ser usados para aumentar a expressão de determinadas interleucinas, como uma ou mais dentre IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-15, e IL-21, e também o domínio intracelular (ICD) de NOTCH 1/2. Tem sido demonstrado que determinadas interleucinas aumentam as funções efetoras de células-T e medeiam o controle de tumor.
[0060] De acordo com modalidades específicas, a expressão de uma ou mais dentre IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-15, e IL-21, e também do domínio intracelular (ICD) de NOTCH 1/2 em TILs é intensificada de acordo com as composições e os métodos da presente invenção. Em algumas modalidades, a presente invenção provê um método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs compreendendo: (i) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente; (ii) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2, e opcionalmente OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs; (iii) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com adicionais IL- 2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é pelo menos 100 vezes maior em número que a segunda população de TILs, e em que a segunda expansão é realizada durante pelo menos 14 dias com o propósito de obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs; e
130 / 509 (iv) expor a segunda e/ou terceira população de TILs aos fatores de transcrição (TFs) e/ou a outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína, em que os TFs e/ou as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína proveem expressão alterada de antígenos de tumor e/ou uma alteração no número de células-T específicas para antígenos de tumor na população terapêutica de TILs, em que a expressão alterada é um aumento na expressão de uma ou mais dentre IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-15, e IL-21, e também do domínio intracelular (ICD) de NOTCH 1/2. IV. Processos de Fabricação de TIL
[0061] Um processo de fabricação de TIL exemplificador conhecido como o processo 2A contendo algumas destas características é representado na Figura 1, e algumas das vantagens desta modalidade da presente invenção sobre o processo 1C são descritas na Figura 2, o mesmo nas Figuras 13 e 14. O processo 1C é mostrado para comparação na Figura 3. Duas linhas de tempo alternativas para a terapia com TIL baseada no processo 2A são mostradas na Figura 4 (contagens de células mais altas) e na Figura 5 (contagens de células mais baixas). Uma modalidade do processo 2A é mostrada na Figura 6 e também na Figura 8. As Figuras 13 e 14 proveem, adicionalmente, um processo 2A exemplificador comparado com um processo 1C exemplificador.
[0062] Conforme aqui discutido, a presente invenção pode incluir uma etapa relacionada à reestimulação de TILs criopreservados para aumentar a atividade metabólica deles e por conseguinte a saúde relativa antes da transplantação para dentro de um paciente, e métodos de teste da saúde metabólica. Conforme geralmente aqui descrito, os TILs são geralmente retirados de uma amostra de paciente e manipulados para expandir o número deles antes da transplantação para dentro de um paciente. Em algumas modalidades, os TILs podem ser opcionalmente geneticamente manipulados
131 / 509 conforme discutido abaixo.
[0063] Em algumas modalidades, os TILs podem estar criopreservados. Logo que descongelados, eles podem ser também reestimulados para aumentar o metabolismo deles antes da infusão para dentro de um paciente.
[0064] Em algumas modalidades, a primeira expansão (incluindo os processos referidos como o preREP e também os processos mostrados na Figura 8 como a Etapa A) é encurtada para 3 a 4 dias e a segunda expansão (incluindo os processos referidos como o REP e também os processos mostrados na Figura 8 como a Etapa B) é encurtada para 7 a 14 dias, conforme discutido em detalhe abaixo e também nos Exemplos e nas Figuras. Em algumas modalidades, a primeira expansão (por exemplo, uma expansão descrita como Etapa B na Figura 8) é encurtada para 11 dias e a segunda expansão (por exemplo, uma expansão conforme descrita na Etapa D na Figura 8) é encurtada para 11 dias, conforme discutido nos Exemplos e mostrado nas Figuras 4, 5 6, e 7. Em algumas modalidades, a combinação de a primeira expansão e a segunda expansão (por exemplo, as expansões descritas como as Etapa B e Etapa D na Figura 8) é encurtada para 22 dias, conforme discutido em detalhe abaixo e nos Exemplos e nas Figuras.
[0065] As Designações A, B, C, etc., de “Etapa”, abaixo, são com referência à Figura 8 e com referência a determinadas modalidades aqui descritas. A ordem das Etapas abaixo e na Figura 8 é exemplificadora e qualquer combinação ou ordem de etapas, e também etapas adicionais, repetição de etapas, e/ou omissão de etapas é considerada pelo presente pedido e pelos métodos aqui revelados. A. ETAPA A: Obter Amostra de Tumor de Paciente
[0066] Em geral, os TILs são inicialmente obtidos de uma amostra de tumor de paciente (“TILs primários”) e então expandidos em uma população maior para manipulação adicional conforme aqui descrita, opcionalmente
132 / 509 criopreservados, reestimulados, conforme aqui descrito, e opcionalmente avaliados para fenótipo e parâmetros metabólicos conforme uma indicação da saúde de TIL.
[0067] Uma amostra de tumor de paciente pode ser obtida usando métodos conhecidos na técnica, geralmente via ressecção cirúrgica, biopsia com agulha ou outros meios para obter uma amostra que contém uma mistura de tumor e células TIL. Em geral, a amostra de tumor pode ser de qualquer tumor sólido, incluindo tumores primários, tumores invasivos ou tumores metastásicos. A amostra de tumor podem também ser um tumor líquido, como um tumor obtido de uma malignidade hematológica. O tumor sólido pode ser de qualquer tipo de câncer, incluindo, mas não se limitando a, câncer de mama, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer de cérebro, câncer renal, câncer de estômago, e câncer de pele (incluindo mas não se limitando a carcinoma de células escamosas, carcinoma basocelular, e melanoma). Em algumas modalidades, os TILs úteis são obtidos de tumores de melanoma maligno, porque tem sido relatado que estes têm particularmente teores altos de TILs.
[0068] O termo “tumor sólido” refere-se a uma massa anormal de tecido que habitualmente não contém cistos ou áreas líquida. Os tumores sólidos podem ser benignos ou malignos. O termo “câncer de tumor sólido” refere-se aos tumores sólidos malignos, neoplásicos, ou cancerosos. Os cânceres de tumor sólido incluem, mas não se limitam a, sarcomas, carcinomas, e linfomas, como cânceres do pulmão, da mama, câncer de mama triplo negativo, da próstata, do cólon, do reto, e da bexiga. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado dentre câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço (incluindo, por exemplo, carcinoma de células escamosas da cabeça e do pescoço (HNSCC)) glioblastoma, câncer ovariano, sarcoma, câncer pancreático, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de mama triplo negativo, e carcinoma de pulmão de células não pequenas. A estrutura
133 / 509 tecidual de tumor sólidos inclui compartimentos teciduais interdependentes incluindo o parênquima (células cancerosas) e as células estromais de suporte nas quais as células cancerosas estão dispersadas e que podem prover um microambiente de suporte.
[0069] O termo “malignidade hematológica” refere-se aos cânceres e tumores de mamíferos dos tecidos hematopoiéticos e linfoides, incluindo mas não se limitando aos, tecidos do sangue, medula óssea, linfonodos, e sistema linfático. As malignidades hematológicas são também referidas como “tumores líquidos”. As malignidades hematológicas incluem, mas não se limitam a, leucemia linfoblástica aguda (ALL), linfoma linfocítico crônico (CLL), linfoma linfocítico pequeno (SLL), leucemia mielógena aguda (AML), leucemia mielógena crônica (CML), leucemia monocítica aguda (AMoL), linfoma de Hodgkin, e linfomas de não Hodgkin. O termo “malignidade hematológica de células-B” refere-se às malignidades hematológicas que afetam as células-B.
[0070] Logo que obtida, a amostra de tumor é geralmente fragmentada usando dissecação afiada em pedaços pequenos de entre 1 e cerca de 8 mm3, com de cerca de 2-3 mm3 sendo particularmente úteis. Os TILs são cultivados a partir destes fragmentos usando digestos enzimáticos de tumor. Tais digestos de tumor podem ser produzidos por incubação em meio enzimático (por exemplo, tampão “Roswell Park Memorial Institute” (RPMI) 1640, 2 mM de glutamato, 10 mcg/mL de gentamicina, 30 unidades/mL de DNase e 1,0 mg/mL de colagenase) seguida por dissociação mecânica (por exemplo, usando um dissociador de tecido). Os digestos de tumor podem ser produzidos pelas colocação do tumor em meio enzimático e dissociação mecânica do tumor durante aproximadamente 1 minuto, seguida por incubação durante 30 minutos a 37°C em 5% de CO2, seguida por ciclos repetidos de dissociação mecânica e incubação sob as condições supracitadas até que estejam presentes apenas pedaços pequenos de tecido. No final deste
134 / 509 processo, se a suspensão de células contém um grande número de células vermelhas do sangue ou de células mortas, uma separação em gradiente de densidade usando polissacarídeo hidrofílico ramificado FICOLL® pode ser realizada para remover estas células. Métodos alternativos conhecidos na técnica podem ser usados, como aqueles descritos na Publicação de Pedido de Patente Norte-Americana nº 2012/0244133 A1, cuja descrição é aqui incorporada como referência. Qualquer um dos métodos supracitados pode ser usado em qualquer uma das modalidades aqui descritas para os métodos de expandir TILs ou métodos de tratar um câncer.
[0071] Em geral, a suspensão de células colhida é chamada de uma “população de células primárias” ou uma “população de células recém- colhidas”.
[0072] Em algumas modalidades, a fragmentação inclui fragmentação física, incluindo, por exemplo, dissecação e também digestão. Em algumas modalidades, a fragmentação é fragmentação física. Em algumas modalidades, a fragmentação é dissecação. Em algumas modalidades, a fragmentação é por digestão. Em algumas modalidades, os TILs podem ser inicialmente cultivados a partir de digestos enzimáticos de tumor e dos fragmentos de tumor obtidos de pacientes. Em uma modalidade, os TILs podem ser inicialmente cultivados a partir de digestos enzimáticos de tumor e dos fragmentos de tumor obtidos de pacientes.
[0073] Em algumas modalidades, se o tumor é um tumor sólido, o tumor é submetido à fragmentação física após a amostra de tumor ser obtida, por exemplo, na Etapa A (conforme provida na Figura 8). Em algumas modalidades, a fragmentação ocorre antes da criopreservação. Em algumas modalidades, a fragmentação ocorre após a criopreservação. Em algumas modalidades, a fragmentação ocorre após obter o tumor e na ausência de qualquer criopreservação. Em algumas modalidades, o tumor é fragmentado e 10, 20, 30, 40 ou mais fragmentos ou pedaços são colocados em cada
135 / 509 recipiente para a primeira expansão. Em algumas modalidades, o tumor é fragmentado e 30 ou 40 fragmentos ou pedaços são colocados em cada recipiente para a primeira expansão. Em algumas modalidades, o tumor é fragmentado e 40 fragmentos ou pedaços são colocados em cada recipiente para a primeira expansão. Em algumas modalidades, os múltiplos fragmentos compreendem de cerca de 4 a cerca de 50 fragmentos, em que cada fragmento tem um volume de cerca de 27 mm3. Em algumas modalidades, os múltiplos fragmentos compreendem de cerca de 30 a cerca de 60 fragmentos com um volume total de cerca de 1.300 mm3 a cerca de 1.500 mm3. Em algumas modalidades, os múltiplos fragmentos compreendem de cerca de 50 fragmentos com um volume total de cerca de 1.350 mm3. Em algumas modalidades, os múltiplos fragmentos compreendem de cerca de 50 fragmentos com uma massa total de cerca de 1 grama a cerca de 1,5 gramas. Em algumas modalidades, os múltiplos fragmentos compreendem cerca de 4 fragmentos.
[0074] Em algumas modalidades, os TILs são obtidos a partir dos fragmentos de tumor. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor é obtido por dissecação afiada. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor está entre cerca de 1 mm3 e 10 mm3. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor está entre cerca de 1 mm3 e 8 mm3. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor é de cerca de 1 mm3. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor é de cerca de 2 mm3. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor é de cerca de 3 mm3. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor é de cerca de 4 mm3. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor é de cerca de 5 mm3. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor é de cerca de 6 mm3. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor é de cerca de 7 mm3. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor é de cerca de 8 mm3. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor é de cerca de 9 mm3. Em algumas modalidades, o
136 / 509 fragmento de tumor é de cerca de 10 mm3. Em algumas modalidades, os tumores são de 1-4 mm x 1-4 mm x 1-4 mm. Em algumas modalidades, os tumores são de 1 mm x 1 mm x 1 mm. Em algumas modalidades, os tumores são de 2 mm x 2 mm x 2 mm. Em algumas modalidades, os tumores são de 3 mm x 3 mm x 3 mm. Em algumas modalidades, os tumores são de 4 mm x 4 mm x 4 mm.
[0075] Em algumas modalidades, os tumores são resseccionados com o propósito de minimizar a quantidade de tecidos hemorrágicos, necróticos, e/ou adiposos em cada pedaço. Em algumas modalidades, os tumores são resseccionados com o propósito de minimizar a quantidade de tecido hemorrágico em cada pedaço. Em algumas modalidades, os tumores são resseccionados com o propósito de minimizar a quantidade de tecido necrótico em cada pedaço. Em algumas modalidades, os tumores são resseccionados com o propósito de minimizar a quantidade de tecido adiposo em cada pedaço.
[0076] Em algumas modalidades, a fragmentação de tumor é realizada com o propósito de manter a estrutura interna do tumor. Em algumas modalidades, a fragmentação de tumor é realizada sem realizar um movimento de serradura com um escalpelo. Em algumas modalidades, os TILs são obtidos a partir de digestos de tumor. Em algumas modalidades, os digestos de tumor foram gerados por incubação em meio enzimático, por exemplo, mas não se limitando a, RPMI 1640, 2 mM de GlutaMAX™, 10 mg/mL de gentamicina, 30 U/mL de DNase, e 1,0 mg/mL de colagenase, seguida por dissociação mecânica (GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA, EUA). Após colocação do tumor em meio enzimático, o tumor pode ser mecanicamente dissociado durante aproximadamente 1 minuto. A solução pode ser então incubada durante 30 minutos a 37°C em 5% de CO2 e ele é então mecanicamente disrupcionado de novo durante aproximadamente 1 minuto. Após ser incubado de novo durante 30 minutos a 37°C em 5% de
137 / 509 CO2, o tumor pode ser mecanicamente disrupcionado uma terceira vez durante aproximadamente 1 minuto. Em algumas modalidades, após a terceira disrupção mecânica se pedaços grandes estão presentes, 1 ou 2 dissociações mecânicas adicionais são aplicadas na amostra, com ou sem 30 minutos adicionais de incubação a 37°C em 5% de CO2. Em algumas modalidades, no término da incubação final se a suspensão de células contém um número grande de células vermelhas do sangue ou células mortas, uma separação em gradiente de densidade usando Ficoll® pode ser realizada para remover estas células.
[0077] Em algumas modalidades, a suspensão de células colhida antes da primeira etapa de expansão é chamada de uma “população de células primárias” ou uma “população de células recém-colhidas”.
[0078] Em algumas modalidades, as células podem ser opcionalmente congeladas após a colheita da amostra e armazenadas antes da entrada na expansão descrita na etapa B, que é descrita em mais detalhe abaixo, e também exemplificada na Figura 8. B. ETAPA B: Primeira Expansão
[0079] Em algumas modalidades, os presentes métodos proveem a obtenção de TILs jovens, que são capazes de ciclos de replicação aumentada após administração a um indivíduo/paciente e como tais podem prover benefícios terapêuticos adicionais em comparação com os TILs mais velhos (isto é, TILs que têm sido adicionalmente submetidos a mais rodadas de replicação antes da administração a um indivíduo/paciente). As características de TILs jovens têm sido descritas na literatura, por exemplo, Donia, et al., Scandinavian Journal of Immunology, 75:157–167 (2012); Dudley et al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010); Huang et al., J. Immunother., 28(3):258– 267 (2005); Besser et al., Clin. Cancer Res., 19(17):OF1-OF9 (2013); Besser et al., J. Immunother. 32:415–423 (2009); Robbins, et al., J. Immunol. 2004; 173:7125-7130; Shen et al., J. Immunother., 30:123–129 (2007); Zhou, et al.,
138 / 509 J. Immunother., 28:53–62 (2005); e Tran, et al., J. Immunother., 31:742–751 (2008), todos os quais são aqui incorporados em suas totalidades como referências.
[0080] Os diversos receptores de antígenos de linfócitos-B e -T são produzidos pela recombinação somática de um número limitado, mas grande, de segmentos de genes. Estes segmentos de genes: V (variável), D (diversidade), J (junção), e C (constante), determinam a especificidade de ligação e as aplicações a jusante de imunoglobulinas e dos receptores de células-T (TCRs, T-Cell Receptors). A presente invenção provê um método para gerar TILs que apresenta e aumenta a diversidade do repertório de células-T. Em algumas modalidades, os TILs obtidos pelo presente método apresentam um aumento na diversidade do repertório de células-T. Em algumas modalidades, os TILs obtidos pelo presente método apresentam um aumento na diversidade do repertório de células-T em comparação com os TILs recém-colhidos e/ou os TILs preparados usando outros métodos diferentes daqueles aqui providos incluindo, por exemplo, os métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, os TILs obtidos pelo presente método apresentam um aumento na diversidade do repertório de células-T em comparação com os TILs recém- colhidos e/ou os TILs preparados usando os métodos referidos como o processo 1C, conforme exemplificado na Figura 13. Em algumas modalidades, os TILs obtidos na primeira expansão apresentam um aumento na diversidade do repertório de células-T. Em algumas modalidades, o aumento na diversidade é um aumento na diversidade de imunoglobulinas e/ou na diversidade do repertório de células-T. Em algumas modalidades, a diversidade é na imunoglobulina, é na cadeia pesada de imunoglobulina. Em algumas modalidades, a diversidade é na imunoglobulina, é na cadeia leve de imunoglobulina. Em algumas modalidades, a diversidade é no repertório de células-T. Em algumas modalidades, a diversidade é em um dos receptores de
139 / 509 célula-T selecionados a partir do grupo consistindo em receptores alfa, beta, gama, e delta. Em algumas modalidades, há um aumento na expressão de receptor de célula-T (TCR) alfa e/ou beta. Em algumas modalidades, há um aumento na expressão de receptor de célula-T (TCR) alfa. Em algumas modalidades, há um aumento na expressão de receptor de célula-T (TCR) beta. Em algumas modalidades, há um aumento na expressão de TCRab (isto é, TCRα/β).
[0081] Após dissecação ou digestão de fragmentos de tumor, por exemplo como descrito na Etapa A da Figura 8, as células resultantes são cultivadas em soro contendo IL-2 sob condições que favorecem o crescimento de TILs sobre tumor e outras células. Em algumas modalidades, os digestos de tumor são incubados em poços de 2mL em meio compreendendo soro AB humano inativado com 6.000 UI/mL de IL-2. Esta população de células primárias é cultivada durante um período de dias, geralmente de 3 a 14 dias, resultando em uma população de TIL em massa, geralmente de cerca de 1×108 células TIL em massa. Em algumas modalidades, esta população de células primárias é cultivada durante um período de 7 a 14 dias, resultando em uma população de TIL em massa, geralmente cerca de 1×108 células TIL em massa. Em algumas modalidades, esta população de células primárias é cultivada durante um período de 10 a 14 dias, resultando em uma população de TIL em massa, geralmente cerca de 1×108 células TIL em massa. Em algumas modalidades, esta população de células primárias é cultivada durante um período de cerca de 11 dias, resultando em uma população de TIL em massa, geralmente cerca de 1×108 células TIL em massa.
[0082] Em uma modalidade preferida, a expansão de TILs pode ser realizada usando uma etapa de expansão de TIL em massa inicial (por exemplo como aquelas descritas na Etapa B da Figura 8, que podem incluir processos referidos como pre-REP) conforme descrito abaixo e aqui, seguida por uma segunda expansão (Etapa D, incluindo processos referidos como
140 / 509 etapas de protocolo de expansão rápida (REP)) conforme descrito abaixo sob Etapa D e aqui, seguida por criopreservação opcional, e seguida por uma segunda Etapa D (incluindo processos referidos como etapa de REP de reestimulação) conforme descrito abaixo e aqui. As TILs obtidas deste processo podem ser opcionalmente distinguidas para características fenotípicas e parâmetros metabólicos conforme aqui descrito.
[0083] Em modalidades nas quais as culturas de TIL são iniciadas em placas de 24 poços, por exemplo, incluindo placas de cultura de células de 24 poços de fundo plano “Costar® 24-Well Cell Culture Cluster” (Corning Incorporated, Corning, NY, EUA, cada poço pode ser semeado com 1×106 células de digesto de tumor ou um fragmento de tumor em 2mL de meio completo (CM, Complete Medium) com IL-2 (6.000 UI/mL; Chiron Corp., Emeryville, CA, EUA). Em algumas modalidades, o fragmento de tumor está entre cerca de 1 mm3 e 10 mm3.
[0084] Em algumas modalidades, o meio de cultura de primeira expansão é referido como “CM”, uma abreviação para Culture Media (Meio de Cultura). Em algumas modalidades, CM para Etapa B consiste em RPMI 1640 com GlutaMAX™, suplementado com 10% de soro AB humano, 25 mM de Hepes, e 10 mg/mL de gentamicina. Em modalidades nas quais as culturas são iniciadas em frascos permeáveis a gás com uma capacidade de 40mL e um fundo de silicone de 10 cm2 permeável a gás (por exemplo, G- Re×10; Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN, EUA) (Figura 1), cada frasco foi carregado com 10–40×106 células de digesto de tumor viáveis ou 5–30 fragmentos de tumor em 10–40mL de CM com IL-2. Tanto o frasco G-Re×10 quanto as placas de 24 poços foram incubados em uma incubadora umidificada a 37°C em 5% de CO2 e 5 dias após o início da cultura, metade do meio foi removido e substituído por CM fresco e IL-2 e após o dia 5, metade do meio foi trocado a cada 2–3 dias.
[0085] Após a preparação dos fragmentos de tumor, as células
141 / 509 resultantes (isto é, fragmentos) são cultivadas em soro contendo IL-2 sob condições que favorecem o crescimento de TILs sobre tumor e outras células.
Em algumas modalidades, os digestos de tumor são incubados em poços de 2mL em meio compreendendo soro AB humano inativado (ou, em alguns casos, conforme descrito aqui, na presença de uma população de células aAPC) com 6.000 UI/mL de IL-2. Esta população de células primárias é cultivada durante um período de dias, geralmente de 10 a 14 dias, resultando em uma população de TIL em massa, geralmente cerca de 1×108 células TIL em massa.
Em algumas modalidades, o meio de crescimento durante a primeira expansão compreende IL-2 ou uma variante da mesma.
Em algumas modalidades, a IL é IL-2 humana recombinante (rhIL-2, recombinant human IL-2). Em algumas modalidades a solução de estoque de IL-2 tem um atividade específica de 20-30×106 UI/mg para um frasco de 1 mg.
Em algumas modalidades a solução de estoque de IL-2 tem um atividade específica de 20×106 UI/mg para um frasco de 1 mg.
Em algumas modalidades a solução de estoque de IL-2 tem um atividade específica de 25×106 UI/mg para um frasco de 1 mg.
Em algumas modalidades a solução de estoque de IL-2 tem um atividade específica de 30×106 UI/mg para um frasco de 1 mg.
Em algumas modalidades, a solução de estoque de IL-2 tem uma concentração final de 4-8×106 UI/mg de IL-2. Em algumas modalidades, a solução de estoque de IL-2 tem uma concentração final de 5-7×106 UI/mg de IL-2. Em algumas modalidades, a solução de estoque de IL-2 tem uma concentração final de 6×106 UI/mg de IL-2. Em algumas modalidades, a solução de estoque de IL-2 é preparada conforme descrito no Exemplo 4. Em algumas modalidades, o meio de cultura de primeira expansão compreende cerca de 10.000 UI/mL de IL-2, cerca de 9.000 UI/mL de IL-2, cerca de 8.000 UI/mL de IL-2, cerca de 7.000 UI/mL de IL-2, cerca de 6.000 UI/mL de IL-2 ou cerca de 5.000 UI/mL de IL-2. Em algumas modalidades, o meio de cultura de primeira expansão compreende de cerca de 9.000 UI/mL de IL-2 a
142 / 509 cerca de 5.000 UI/mL de IL-2. Em algumas modalidades, o meio de cultura de primeira expansão compreende de cerca de 8.000 UI/mL de IL-2 a cerca de
6.000 UI/mL de IL-2. Em algumas modalidades, o meio de cultura de primeira expansão compreende de cerca de 7.000 UI/mL de IL-2 a cerca de
6.000 UI/mL de IL-2. Em algumas modalidades, o meio de cultura de primeira expansão compreende cerca de 6.000 UI/mL de IL-2. Em uma modalidade, o meio de cultura de células compreende, adicionalmente, IL-2. Em algumas modalidades, o meio de cultura de células compreende cerca de
3.000 UI/mL de IL-2. Em uma modalidade, o meio de cultura de células compreende, adicionalmente, IL-2. Em uma modalidade preferida, o meio de cultura de células compreende cerca de 3.000 UI/mL de IL-2. Em uma modalidade, o meio de cultura de células compreende cerca de 1.000 UI/mL, cerca de 1.500 UI/mL, cerca de 2.000 UI/mL, cerca de 2.500 UI/mL, cerca de
3.000 UI/mL, cerca de 3.500 UI/mL, cerca de 4.000 UI/mL, cerca de 4.500 UI/mL, cerca de 5.000 UI/mL, cerca de 5.500 UI/mL, cerca de 6.000 UI/mL, cerca de 6.500 UI/mL, cerca de 7.000 UI/mL, cerca de 7.500 UI/mL, ou cerca de 8.000 UI/mL de IL-2. Em uma modalidade, o meio de cultura de células compreende entre 1.000 e 2.000 UI/mL, entre 2.000 e 3.000 UI/mL, entre
3.000 e 4.000 UI/mL, entre 4.000 e 5.000 UI/mL, entre 5.000 e 6.000 UI/mL, entre 6.000 e 7.000 UI/mL, entre 7.000 e 8.000 UI/mL, ou cerca de 8.000 UI/mL de IL-2.
[0086] Em algumas modalidades, o meio de cultura de primeira expansão compreende cerca de 500 UI/mL de IL-15, cerca de 400 UI/mL de IL-15, cerca de 300 UI/mL de IL-15, cerca de 200 UI/mL de IL-15, cerca de 180 UI/mL de IL-15, cerca de 160 UI/mL de IL-15, cerca de 140 UI/mL de IL-15, cerca de 120 UI/mL de IL-15, ou cerca de 100 UI/mL de IL-15. Em algumas modalidades, o meio de cultura de primeira expansão compreende cerca de 500 UI/mL de IL-15 a cerca de 100 UI/mL de IL-15. Em algumas modalidades, o meio de cultura de primeira expansão compreende cerca de
143 / 509 400 UI/mL de IL-15 a cerca de 100 UI/mL de IL-15. Em algumas modalidades, o meio de cultura de primeira expansão compreende cerca de 300 UI/mL de IL-15 a cerca de 100 UI/mL de IL-15. Em algumas modalidades, o meio de cultura de primeira expansão compreende cerca de 200 UI/mL de IL-15. Em algumas modalidades, o meio de cultura de células compreende cerca de 180 UI/mL de IL-15. Em uma modalidade, o meio de cultura de células compreende, adicionalmente, IL-15. Em uma modalidade preferida, o meio de cultura de células compreende cerca de 180 UI/mL de IL-15.
[0087] Em algumas modalidades, o meio de cultura de primeira expansão compreende cerca de 20 UI/mL de IL-21, cerca de 15 UI/mL de IL- 21, cerca de 12 UI/mL de IL-21, cerca de 10 UI/mL de IL-21, cerca de 5 UI/mL de IL-21, cerca de 4 UI/mL de IL-21, cerca de 3 UI/mL de IL-21, cerca de 2 UI/mL de IL-21, cerca de 1 UI/mL de IL-21, ou cerca de 0,5 UI/mL de IL-21. Em algumas modalidades, o meio de cultura de primeira expansão compreende cerca de 20 UI/mL de IL-21 a cerca de 0,5 UI/mL de IL-21. Em algumas modalidades, o meio de cultura de primeira expansão compreende cerca de 15 UI/mL de IL-21 a cerca de 0,5 UI/mL de IL-21. Em algumas modalidades, o meio de cultura de primeira expansão compreende cerca de 12 UI/mL de IL-21 a cerca de 0,5 UI/mL de IL-21. Em algumas modalidades, o meio de cultura de primeira expansão compreende cerca de 10 UI/mL de IL-21 a cerca de 0,5 UI/mL de IL-21. Em algumas modalidades, o meio de cultura de primeira expansão compreende cerca de 5 UI/mL de IL-21 a cerca de 1 UI/mL de IL-21. Em algumas modalidades, o meio de cultura de primeira expansão compreende cerca de 2 UI/mL de IL-21. Em algumas modalidades, o meio de cultura de células compreende cerca de 1 UI/mL de IL-21. Em algumas modalidades, o meio de cultura de células compreende cerca de 0,5 UI/mL de IL-21. Em uma modalidade, o meio de cultura de células compreende, adicionalmente, IL-21. Em uma modalidade preferida, o
144 / 509 meio de cultura de células compreende cerca de 1 UI/mL de IL-21.
[0088] Em uma modalidade, o meio de cultura de células compreende anticorpo OKT-3. Em algumas modalidades, o meio de cultura de células compreende cerca de 30 ng/mL de anticorpo OKT-3. Em uma modalidade, o meio de cultura de células compreende cerca de 0,1 ng/mL, cerca de 0,5 ng/mL, cerca de 1 ng/mL, cerca de 2,5 ng/mL, cerca de 5 ng/mL, cerca de 7,5 ng/mL, cerca de 10 ng/mL, cerca de 15 ng/mL, cerca de 20 ng/mL, cerca de 25 ng/mL, cerca de 30 ng/mL, cerca de 35 ng/mL, cerca de 40 ng/mL, cerca de 50 ng/mL, cerca de 60 ng/mL, cerca de 70 ng/mL, cerca de 80 ng/mL, cerca de 90 ng/mL, cerca de 100 ng/mL, cerca de 200 ng/mL, cerca de 500 ng/mL, e cerca de 1 µg/mL de anticorpo OKT-3. Em uma modalidade, o meio de cultura de células compreende entre 0,1 ng/mL e 1 ng/mL, entre 1 ng/mL e 5 ng/mL, entre 5 ng/mL e 10 ng/mL, entre 10 ng/mL e 20 ng/mL, entre 20 ng/mL e 30 ng/mL, entre 30 ng/mL e 40 ng/mL, entre 40 ng/mL e 50 ng/mL, e entre 50 ng/mL e 100 ng/mL de anticorpo OKT-3. Em algumas modalidades, o meio de cultura de células não compreende anticorpo OKT-3.
[0089] Em algumas modalidades, o meio de cultura de células compreende um ou mais agonistas de TNFRSF em um meio de cultura de células. Em algumas modalidades, o agonista de TNFRSF compreende um agonista de 4-1BB. Em algumas modalidades, o agonista de TNFRSF é um agonista de 4-1BB, e o agonista de 4-1BB é selecionado a partir do grupo consistindo em urelumabe, utomilumabe, EU-101, uma proteína de fusão, e fragmentos, derivados, variantes, biossimilares, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o agonista de TNFRSF é adicionado a uma concentração suficiente para alcançar uma concentração no meio de cultura de células de entre 0,1 µg/mL e 100 µg/mL. Em algumas modalidades, o agonista de TNFRSF é adicionado a uma concentração suficiente para alcançar uma concentração no meio de cultura de células de entre 20 µg/mL e 40 µg/mL.
145 / 509
[0090] Em algumas modalidades, além de um ou mais agonistas de TNFRSF, o meio de cultura de células compreende, adicionalmente, IL-2 a uma concentração final de cerca de 3.000 UI/mL e anticorpo OKT-3 a uma concentração final de cerca de 30 ng/mL, e em que os um ou mais agonistas de TNFRSF compreendem um agonista de 4-1BB.
[0091] Em algumas modalidades, o meio de cultura de primeira expansão é referido como “CM”, uma abreviação para Culture Media (Meio de Cultura). Em algumas modalidades, ele é referido como CM1 (Culture Medium 1, meio de cultura 1). Em algumas modalidades, o CM consiste em RPMI 1640 com GlutaMAX™, suplementado com 10% de soro AB humano, 25 mM de Hepes, e 10 mg/mL de gentamicina. Em modalidades nas quais as culturas são iniciadas em frascos permeáveis a gás com uma capacidade de 40mL e um fundo de silicone de 10 cm2 permeável a gás (por exemplo, G- Re×10; Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN, EUA) (Figura 1), cada frasco foi carregado com 10–40x 106 células de digesto de tumor viáveis ou 5–30 fragmentos de tumor em 10–40mL de CM com IL-2. Tanto o frasco G-Re×10 quanto as placas de 24 poços foram incubados em uma incubadora umidificada a 37°C em 5% de CO2 e 5 dias após o início da cultura, metade do meio foi removido e substituído por CM fresco e IL-2 e após o dia 5, metade do meio foi trocado a cada 2–3 dias. Em algumas modalidades, o CM é o CM1 descrito nos Exemplos, consulte, o Exemplo 5. Em algumas modalidades, a primeira expansão ocorre em um meio de cultura de células inicial ou um primeiro meio de cultura de células. Em algumas modalidades, o meio de cultura de células inicial ou o primeiro meio de cultura de células compreende IL-2.
[0092] Em algumas modalidades, o processo de primeira expansão (incluindo processos como, por exemplo, aqueles descritos na Etapa B da Figura 8, que podem incluir aqueles algumas vezes referidos como o pre- REP) é encurtado para 3 a 14 dias, conforme discutido nos Exemplos e nas
146 / 509 Figuras. Em algumas modalidades, a primeira expansão (incluindo processos como, por exemplo, aqueles descritos na Etapa B da Figura 8, que podem incluir aqueles algumas vezes referidos como o pre-REP) é encurtada para 7 a 14 dias, conforme discutido nos Exemplos e mostrado nas Figuras 4 e 5, e também incluindo, por exemplo, uma expansão conforme descrita na Etapa B da Figura 8. Em algumas modalidades, a primeira expansão da Etapa B é encurtada para 10-14 dias, conforme discutido nos Exemplos e mostrado nas Figuras 4 e 5. Em algumas modalidades, a primeira expansão é encurtada para 11 dias, conforme discutido nos Exemplos e mostrado nas Figuras 4 e 5, e também incluindo, por exemplo, uma expansão conforme descrita na Etapa B da Figura 8.
[0093] Em algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, ou 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 1 dia a 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 2 dias a 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 3 dias a 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 4 dias a 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 5 dias a 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 6 dias a 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 7 dias a 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 8 dias a 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 9 dias a 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 10 dias a 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 11 dias a 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 12 dias a 14 dias. Em
147 / 509 algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 13 dias a 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 1 dia a 11 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 2 dias a 11 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 3 dias a 11 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 4 dias a 11 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 5 dias a 11 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 6 dias a 11 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 7 dias a 11 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 8 dias a 11 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 9 dias a 11 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 10 dias a 11 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 11 dias.
[0094] Em algumas modalidades, uma combinação de IL-2, IL-7, IL- 15, e/ou IL-21 é utilizada como uma combinação durante a primeira expansão. Em algumas modalidades, IL-2, IL-7, IL-15, e/ou IL-21 e também quaisquer combinações das mesmas podem ser incluídas durante a primeira expansão, incluindo por exemplo durante a Etapa B do processo de acordo com a Figura 8, e também aqui descrito. Em algumas modalidades, uma combinação de IL-2, IL-15, e IL-21 é utilizada como uma combinação durante a primeira expansão. Em algumas modalidades, IL-2, IL-15, e IL-21 e também quaisquer combinações das mesmas podem ser incluídas durante a Etapa B de processo de acordo com a Figura 8 e conforme aqui descrito.
[0095] Em algumas modalidades, o processo de primeira expansão (incluindo processos referidos como o pre-REP; por exemplo, a Etapa B de
148 / 509 acordo com a Figura 8) é encurtado para 3 a 14 dias, conforme discutido nos Exemplos e nas Figuras. Em algumas modalidades, a primeira expansão da Etapa B é encurtada para 7 a 14 dias, conforme discutido nos Exemplos e mostrado nas Figuras 4 e 5. Em algumas modalidades, a primeira expansão da Etapa B é encurtada para 10 a 14 dias, conforme discutido nos Exemplos e mostrado nas Figuras 4, 5, 6, e 7. Em algumas modalidades, a primeira expansão é encurtada para 11 dias, conforme discutido nos Exemplos e mostrado nas Figuras 4, 5, 6, e 7.
[0096] Em algumas modalidades, a primeira expansão, por exemplo, a Etapa B de acordo com a Figura 8, é realizada em um biorreator de sistema fechado. Em algumas modalidades, a sistema fechado é utilizado para a expansão de TIL, conforme aqui descrito. Em algumas modalidades, um biorreator único é utilizado. Em algumas modalidades, o biorreator único utilizado é por exemplo um G-Rex-10 ou um G-Rex-100. Em algumas modalidades, o biorreator de sistema fechado é um biorreator único.
[0097] Em algumas modalidades, um ou mais sd-RNAs que têm como alvos genes conforme aqui descritos, incluindo PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, podem ser adicionados ao meio de cultura de células durante a primeira expansão, por exemplo, a Etapa B de acordo com a Figura 8, compreendendo TILs e outros agentes em quantidades selecionadas a partir do grupo consistindo em 0,1 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 0,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 0,75 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1,25 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 2 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, ou 10 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio. Em algumas modalidades, um ou mais sd-RNAs que têm como alvos genes conforme aqui descritos, incluindo PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, podem ser adicionados às culturas de TIL durante a
149 / 509 primeira expansão, por exemplo, a Etapa B de acordo com a Figura 8, duas vezes por dia, um vez por dia, a cada dois dias, a cada três dias, a cada quatro dias, a cada cinco dias, a cada seis dias, ou a cada sete dias. Em uma modalidade, um ou mais sd-RNAs que têm como alvos genes conforme aqui descritos, incluindo PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, podem ser adicionados ao meio de cultura de células compreendendo TILs e outros agentes durante a primeira expansão, por exemplo, a Etapa B de acordo com a Figura 8, em quantidades selecionadas a partir do grupo consistindo em 0,1 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 0,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 0,75 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1,25 μM de sd- RNA/10.000 TILs, 1,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 2 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, ou 10 μM de sd-RNA/10.000 TILs. Em uma modalidade, um ou mais sd-RNAs que têm como alvos genes conforme aqui descritos, incluindo PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, podem ser adicionados às culturas de TIL durante a primeira expansão, por exemplo, a Etapa B de acordo com a Figura 8, duas vezes por dia, um vez por dia, a cada dois dias, a cada três dias, a cada quatro dias, a cada cinco dias, a cada seis dias, ou a cada sete dias. C. ETAPA C: Transição da Primeira Expansão para a Segunda Expansão
[0098] Em alguns casos, a população de TIL em massa obtida a partir da primeira expansão, incluindo por exemplo a população de TIL obtida, por exemplo, da Etapa B conforme indicado na Figura 8, pode ser imediatamente criopreservada, usando os protocolos discutidos aqui abaixo. Alternativamente, a população de TIL obtida a partir da primeira expansão, referida como a segunda população de TIL, pode ser submetida a uma segunda expansão (que pode incluir expansões algumas vezes referidas como REP) e então criopreservada conforme discutido abaixo. Similarmente, no caso no qual TILs geneticamente modificados serão usados em terapia, a
150 / 509 primeira população de TIL (algumas vezes referida como a população de TIL em massa) ou a segunda população de TIL (que pode, em algumas modalidades, incluir populações referidos como as populações de REP TIL) pode ser submetida às modificações genéticas para tratamentos adequados antes da expansão ou após a primeira expansão e antes da segunda expansão.
[0099] Em algumas modalidades, os TILs obtidos a partir da primeira expansão (por exemplo, da etapa B conforme indicado na Figura 8) são armazenados até fenotipificados para seleção. Em algumas modalidades, os TILs obtidos a partir da primeira expansão (por exemplo, da etapa B conforme indicado na Figura 8) são não armazenados e prosseguidos diretamente para a segunda expansão. Em algumas modalidades, os TILs obtidos a partir da primeira expansão são não criopreservados após a primeira expansão e antes da segunda expansão. Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre a cerca de 3 dias, 4, dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, ou 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre a cerca de 3 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre a cerca de 4 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre a cerca de 4 dias a 10 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre a cerca de 7 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre a cerca de 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.
[00100] Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre a 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7
151 / 509 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, ou 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.
Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 1 dia a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.
Em algumas modalidades, a primeira expansão de TIL pode proceder durante 2 dias a 14 dias.
Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 3 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.
Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 4 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.
Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 5 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.
Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 6 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.
Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 7 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.
Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 8 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.
Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 9 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.
Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 10 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.
Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 11 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.
Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 12 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.
Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 13 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.
Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.
Em
152 / 509 algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 1 dia a 11 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 2 dias a 11 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 3 dias a 11 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 4 dias a 11 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 5 dias a 11 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 6 dias a 11 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 7 dias a 11 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 8 dias a 11 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 9 dias a 11 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 10 dias a 11 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 11 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.
[00101] Em algumas modalidades, os TILs não são armazenados após a primeira expansão e antes da segunda expansão, e os TILs são prosseguidos diretamente para a segunda expansão (por exemplo, em algumas modalidades, não há armazenamento durante a transição da Etapa B para a Etapa D conforme mostrado na Figura 8). Em algumas modalidades, a transição ocorre em sistema fechado, conforme aqui descrito. Em algumas modalidades, os TILs da primeira expansão, a segunda população de TILs, prosseguem
153 / 509 diretamente para a segunda expansão sem período de transição.
[00102] Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão, por exemplo, a Etapa C de acordo com a Figura 8, é realizada em um biorreator de sistema fechado. Em algumas modalidades, um sistema fechado é utilizado para a expansão de TIL, conforme aqui descrito. Em algumas modalidades, um biorreator único é utilizado. Em algumas modalidades, o biorreator único utilizado é por exemplo um G-Rex-10 ou um G-Rex-100. Em algumas modalidades, o biorreator de sistema fechado é um biorreator único.
[00103] Em algumas modalidades, um ou mais sd-RNAs que têm como alvos genes conforme aqui descritos, incluindo PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, podem ser adicionados ao meio de cultura de células durante a transição da primeira expansão para a segunda expansão, por exemplo, a Etapa C de acordo com a Figura 8, compreendendo TILs e outros agentes em quantidades selecionadas a partir do grupo consistindo em 0,1 μM de sd- RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 0,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 0,75 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1 μM de sd- RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1,25 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 2 μM de sd- RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, ou 10 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio. Em algumas modalidades, um ou mais sd-RNAs que têm como alvos genes conforme aqui descritos, incluindo PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, podem ser adicionados às culturas de TIL durante a transição da primeira expansão para a segunda expansão, por exemplo, a Etapa C de acordo com a Figura 8, duas vezes por dia, um vez por dia, a cada dois dias, a cada três dias, a cada quatro dias, a cada cinco dias, a cada seis dias, ou a cada sete dias. Em uma modalidade, um ou mais sd-RNAs que têm como alvos genes conforme aqui descritos, incluindo PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, podem ser
154 / 509 adicionados ao meio de cultura de células compreendendo TILs e outros agentes durante a transição da primeira expansão para a segunda expansão, por exemplo, a Etapa C de acordo com a Figura 8 em quantidades selecionadas a partir do grupo consistindo em 0,1 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 0,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 0,75 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1,25 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 2 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 5 μM de sd- RNA/10.000 TILs, ou 10 μM de sd-RNA/10.000 TILs. Em uma modalidade, um ou mais sd-RNAs que têm como alvos genes conforme aqui descritos, incluindo PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, podem ser adicionados às culturas de TIL durante a transição da primeira expansão para a segunda expansão, por exemplo, a Etapa C de acordo com a Figura 8, duas vezes por dia, um vez por dia, a cada dois dias, a cada três dias, a cada quatro dias, a cada cinco dias, a cada seis dias, ou a cada sete dias.
1. Citocinas
[00104] Os métodos de expansão aqui descritos geralmente usam meios de cultura com altas doses de uma citocina, em particular de IL-2, conforme é conhecido na técnica.
[00105] Alternativamente, o uso de combinações de citocinas para a expansão rápida e/ou a segunda expansão de TILS é adicionalmente possível, com combinações de duas ou mais dentre IL-2, IL-15 e IL-21 conforme é geralmente descrito na Publicação Internacional nº WO 2015/189356 e na Publicação Internacional nº WO 2015/189357, pelo presente documento incorporadas em suas totalidades como referências. Por conseguinte, combinações possíveis incluem IL-2 e IL-15, IL-2 e IL-21, IL-15 e IL-21 e IL-2, IL-15 e IL-21, com a última encontrando uso específico em muitas modalidades. O uso de combinações de citocinas especialmente favorece a geração de linfócitos, e em particular de células-T conforme aqui descrito. D. ETAPA D: Segunda Expansão
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[00106] Em algumas modalidades, a população de células TIL é expandida em número após a colheita e o processamento em massa inicial por exemplo, após a Etapa A e a Etapa B, e a transição referida como a Etapa C, conforme indicado na Figura 8). Esta expansão adicional é referida aqui como a segunda expansão, que pode incluir processos de expansão geralmente referidos na técnica como um processo de expansão rápida (REP; e também processos conforme indicados na Etapa D da Figura 8). A segunda expansão é geralmente realizada usando um meio de cultura compreendendo numerosos componentes, incluindo células alimentadoras, uma fonte de citocinas, e um anticorpo anti-CD3, em um recipiente permeável a gás.
[00107] Em algumas modalidades, a segunda expansão ou segunda expansão de TIL (que pode incluir expansões algumas vezes referidas como REP; e também processos conforme indicados na Etapa D da Figura 8) [de TIL] pode ser realizada usando quaisquer frascos ou recipientes de TIL conhecidos por aquelas pessoas. Em algumas modalidades, a segunda expansão de TIL pode proceder durante 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, ou 14 dias. Em algumas modalidades, a segunda expansão de TIL pode proceder durante cerca de 7 dias a cerca de 14 dias. Em algumas modalidades, a segunda expansão de TIL pode proceder durante cerca de 8 dias a cerca de 14 dias. Em algumas modalidades, a segunda expansão de TIL pode proceder durante cerca de 9 dias a cerca de 14 dias. Em algumas modalidades, a segunda expansão de TIL pode proceder durante cerca de 10 dias a cerca de 14 dias. Em algumas modalidades, a segunda expansão de TIL pode proceder durante cerca de 11 dias a cerca de 14 dias. Em algumas modalidades, a segunda expansão de TIL pode proceder durante cerca de 12 dias a cerca de 14 dias. Em algumas modalidades, a segunda expansão de TIL pode proceder durante cerca de 13 dias a cerca de 14 dias. Em algumas modalidades, a segunda expansão de TIL pode proceder durante cerca de 14 dias.
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[00108] Em uma modalidade, a segunda expansão pode ser realizada em um recipiente permeável a gás usando os métodos da presente descrição (incluindo, por exemplo, expansões referidas como REP; e também processos conforme indicados na Etapa D da Figura 8). Por exemplo, os TILs podem ser rapidamente expandidos usando estimulação de receptores de células-T não específicos na presença de interleucina-2 (IL-2) ou interleucina-15 (IL-15). A estimulação de receptores de células-T não específicos pode incluir, por exemplo, um anticorpo anti-CD3, como cerca de 30 ng/mL de OKT3, um anticorpo monoclonal de camundongo anti-CD3 (comercialmente disponível junto à Ortho-McNeil, Raritan, NJ, EUA ou Miltenyi Biotech, Auburn, CA, EUA) ou UHCT-1 (comercialmente disponível junto à BioLegend, San Diego, CA, EUA). Os TILs podem ser expandidos para induzir estimulação adicional dos TILs in vitro pela inclusão de um ou mais antígenos durante a segunda expansão, incluindo porções antigênicas dos mesmos, como epítopo(s), do câncer, que podem ser opcionalmente expressados a partir de um vetor, como um peptídeo ligante antígeno leucocitário humano A2 (HLA- A2, Human Leukocyte Antigen A2), por exemplo, 0,3 μΜ de MART-1:26-35 (27 L) ou gpl 00:209-217 (210M), opcionalmente na presença de um fator de crescimento de célula-T, como 300 UI/mL de IL-2 ou de IL-15. Outros antígenos adequados podem incluir, por exemplo, NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, antígeno tirosinase de câncer, MAGE-A3, SSX-2, e VEGFR2, ou porções antigênicas dos mesmos. TIL pode também ser rapidamente expandido por reestimulação com o(s) mesmo(s) antígeno(s) do câncer pulsado(s) sobre células apresentadoras de antígenos que expressam HLA-A2. Alternativamente, os TILs podem ser adicionalmente reestimulados com, por exemplo, exemplo, linfócitos autólogos, irradiados ou com linfócitos alogeneicos HLA-A2+ irradiados e IL-2. Em algumas modalidades, a reestimulação ocorre como parte da segunda expansão. Em algumas modalidades, a segunda expansão ocorre na presença de linfócitos autólogos,
157 / 509 irradiados, ou com linfócitos alogeneicos HLA-A2+ irradiados e IL-2.
[00109] Em uma modalidade, o meio de cultura de células compreende, adicionalmente, IL-2. Em algumas modalidades, o meio de cultura de células compreende cerca de 3.000 UI/mL de IL-2. Em uma modalidade, o meio de cultura de células compreende cerca de 1.000 UI/mL, cerca de 1.500 UI/mL, cerca de 2.000 UI/mL, cerca de 2.500 UI/mL, cerca de
3.000 UI/mL, cerca de 3.500 UI/mL, cerca de 4.000 UI/mL, cerca de 4.500 UI/mL, cerca de 5.000 UI/mL, cerca de 5.500 UI/mL, cerca de 6.000 UI/mL, cerca de 6.500 UI/mL, cerca de 7.000 UI/mL, cerca de 7.500 UI/mL, ou cerca de 8.000 UI/mL de IL-2. Em uma modalidade, o meio de cultura de células compreende entre 1.000 e 2.000 UI/mL, entre 2.000 e 3.000 UI/mL, entre
3.000 e 4.000 UI/mL, entre 4.000 e 5.000 UI/mL, entre 5.000 e 6.000 UI/mL, entre 6.000 e 7.000 UI/mL, entre 7.000 e 8.000 UI/mL, ou entre 8.000 UI/mL de IL-2.
[00110] Em uma modalidade, o meio de cultura de células compreende anticorpo OKT-3. Em algumas modalidades, o meio de cultura de células compreende cerca de 30 ng/mL de anticorpo OKT-3. Em uma modalidade, o meio de cultura de células compreende cerca de 0,1 ng/mL, cerca de 0,5 ng/mL, cerca de 1 ng/mL, cerca de 2,5 ng/mL, cerca de 5 ng/mL, cerca de 7,5 ng/mL, cerca de 10 ng/mL, cerca de 15 ng/mL, cerca de 20 ng/mL, cerca de 25 ng/mL, cerca de 30 ng/mL, cerca de 35 ng/mL, cerca de 40 ng/mL, cerca de 50 ng/mL, cerca de 60 ng/mL, cerca de 70 ng/mL, cerca de 80 ng/mL, cerca de 90 ng/mL, cerca de 100 ng/mL, cerca de 200 ng/mL, cerca de 500 ng/mL, e cerca de 1 µg/mL de anticorpo OKT-3. Em uma modalidade, o meio de cultura de células compreende entre 0,1 ng/mL e 1 ng/mL, entre 1 ng/mL e 5 ng/mL, entre 5 ng/mL e 10 ng/mL, entre 10 ng/mL e 20 ng/mL, entre 20 ng/mL e 30 ng/mL, entre 30 ng/mL e 40 ng/mL, entre 40 ng/mL e 50 ng/mL, e entre 50 ng/mL e 100 ng/mL de anticorpo OKT-3. Em algumas modalidades, o meio de cultura de células não compreende anticorpo OKT-3.
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[00111] Em algumas modalidades, o meio de cultura de células compreende um ou mais agonistas de TNFRSF em um meio de cultura de células. Em algumas modalidades, o agonista de TNFRSF compreende um agonista de 4-1BB. Em algumas modalidades, o agonista de TNFRSF é um agonista de 4-1BB, e o agonista de 4-1BB é selecionado a partir do grupo consistindo em urelumabe, utomilumabe, EU-101, uma proteína de fusão, e fragmentos, derivados, variantes, biossimilares, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o agonista de TNFRSF é adicionado a uma concentração suficiente para alcançar uma concentração no meio de cultura de células de entre 0,1 µg/mL e 100 µg/mL. Em algumas modalidades, o agonista de TNFRSF é adicionado a uma concentração suficiente para alcançar uma concentração no meio de cultura de células de entre 20 µg/mL e 40 µg/mL.
[00112] Em algumas modalidades, além de um ou mais agonistas de TNFRSF, o meio de cultura de células compreende, adicionalmente, IL-2 a uma concentração final de cerca de 3.000 UI/mL e anticorpo OKT-3 a uma concentração final de cerca de 30 ng/mL, e em que os um ou mais agonistas de TNFRSF compreendem um agonista de 4-1BB.
[00113] Em algumas modalidades, uma combinação de IL-2, IL-7, IL- 15, e/ou IL-21 é utilizada como uma combinação durante a segunda expansão. Em algumas modalidades, IL-2, IL-7, IL-15, e/ou IL-21 e também quaisquer combinações das mesmas podem ser incluídas durante a segunda expansão, incluindo por exemplo durante a Etapa D de processos de acordo com a Figura 8, e também aqui descrito. Em algumas modalidades, uma combinação de IL-2, IL-15, e IL-21 é utilizada como uma combinação durante a segunda expansão. Em algumas modalidades, IL-2, IL-15, e IL-21 e também quaisquer combinações das mesmas podem ser incluídas durante a Etapa D de processos de acordo com a Figura 8 e conforme aqui descrito.
[00114] Em algumas modalidades, a segunda expansão pode ser
159 / 509 conduzida em um meio de cultura de células suplementado compreendendo IL-2, OKT-3, células alimentadoras apresentadoras de antígenos, e opcionalmente um agonista de TNFRSF. Em algumas modalidades, a segunda expansão ocorre em um meio de cultura de células suplementado. Em algumas modalidades, o meio de cultura de células suplementado compreende IL-2, OKT-3, e células alimentadoras apresentadoras de antígenos. Em algumas modalidades, o segundo meio de cultura de células compreende IL-2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs; também referidas como células alimentadoras apresentadoras de antígenos). Em algumas modalidades, a segunda expansão ocorre em um meio de cultura de células compreendendo IL-2, OKT-3, e células alimentadoras apresentadoras de antígenos (isto é, células apresentadoras de antígenos).
[00115] Em algumas modalidades, um meio de cultura de segunda expansão compreende cerca de 500 UI/mL de IL-15, cerca de 400 UI/mL de IL-15, cerca de 300 UI/mL de IL-15, cerca de 200 UI/mL de IL-15, cerca de 180 UI/mL de IL-15, cerca de 160 UI/mL de IL-15, cerca de 140 UI/mL de IL-15, cerca de 120 UI/mL de IL-15, ou cerca de 100 UI/mL de IL-15. Em algumas modalidades, um meio de cultura de segunda expansão compreende cerca de 500 UI/mL de IL-15 a cerca de 100 UI/mL de IL-15. Em algumas modalidades, um meio de cultura de segunda expansão compreende cerca de 400 UI/mL de IL-15 a cerca de 100 UI/mL de IL-15. Em algumas modalidades, um meio de cultura de segunda expansão compreende cerca de 300 UI/mL de IL-15 a cerca de 100 UI/mL de IL-15. Em algumas modalidades, um meio de cultura de segunda expansão compreende cerca de 200 UI/mL de IL-15. Em algumas modalidades, o meio de cultura de células compreende cerca de 180 UI/mL de IL-15. Em uma modalidade, o meio de cultura de células compreende, adicionalmente, IL-15. Em uma modalidade preferida, o meio de cultura de células compreende cerca de 180 UI/mL de IL-15.
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[00116] Em algumas modalidades, um meio de cultura de segunda expansão compreende cerca de 20 UI/mL de IL-21, cerca de 15 UI/mL de IL- 21, cerca de 12 UI/mL de IL-21, cerca de 10 UI/mL de IL-21, cerca de 5 UI/mL de IL-21, cerca de 4 UI/mL de IL-21, cerca de 3 UI/mL de IL-21, cerca de 2 UI/mL de IL-21, cerca de 1 UI/mL de IL-21, ou cerca de 0,5 UI/mL de IL-21. Em algumas modalidades, um meio de cultura de segunda expansão compreende cerca de 20 UI/mL de IL-21 a cerca de 0,5 UI/mL de IL-21. Em algumas modalidades, um meio de cultura de segunda expansão compreende cerca de 15 UI/mL de IL-21 a cerca de 0,5 UI/mL de IL-21. Em algumas modalidades, um meio de cultura de segunda expansão compreende cerca de 12 UI/mL de IL-21 a cerca de 0,5 UI/mL de IL-21. Em algumas modalidades, um meio de cultura de segunda expansão compreende cerca de 10 UI/mL de IL-21 a cerca de 0,5 UI/mL de IL-21. Em algumas modalidades, um meio de cultura de segunda expansão compreende cerca de 5 UI/mL de IL-21 a cerca de 1 UI/mL de IL-21. Em algumas modalidades, um meio de cultura de segunda expansão compreende cerca de 2 UI/mL de IL-21. Em algumas modalidades, o meio de cultura de células compreende cerca de 1 UI/mL de IL-21. Em algumas modalidades, o meio de cultura de células compreende cerca de 0,5 UI/mL de IL-21. Em uma modalidade, o meio de cultura de células compreende, adicionalmente, IL-21. Em uma modalidade preferida, o meio de cultura de células compreende cerca de 1 UI/mL de IL-
21.
[00117] Em algumas modalidades as células alimentadoras apresentadoras de antígenos (APCs) são PBMCs. Em uma modalidade, a razão entre TILs e PBMCs e/ou células apresentadoras de antígenos na expansão rápida e/ou na segunda expansão é cerca de 1 a 25, cerca de 1 a 50, cerca de 1 a 100, cerca de 1 a 125, cerca de 1 a 150, cerca de 1 a 175, cerca de 1 a 200, cerca de 1 a 225, cerca de 1 a 250, cerca de 1 a 275, cerca de 1 a 300, cerca de 1 a 325, cerca de 1 a 350, cerca de 1 a 375, cerca de 1 a 400, ou cerca
161 / 509 de 1 a 500. Em uma modalidade, a razão entre TILs e PBMCs na expansão rápida e/ou na segunda expansão está entre 1e 50 e 1 e 300. Em uma modalidade, a razão entre TILs e PBMCs na expansão rápida e/ou na segunda expansão está entre 1 a 100 e 1 a 200.
[00118] Em uma modalidade, REP e/ou a segunda expansão é realizada em frascos com os TILs em massa sendo misturados com um excesso de 100 ou 200 vezes de células alimentadoras inativadas, 30 mg/mL de anticorpo anti-CD3 OKT3 e 3.000 UI/mL de IL-2 em 150mL de meio. A substituição de meio é realizada (geralmente substituição de 2/3 do meio via respiração com meio fresco) até as células serem transferidas para uma câmara de crescimento alternativa. As câmaras de crescimento alternativas incluem frascos G-Rex e recipientes permeáveis a gás como mais completamente discutido abaixo.
[00119] Em algumas modalidades, a segunda expansão (que pode incluir os processos referidos como o processo REP) é encurtada para 7 a 14 dias, conforme discutido nos Exemplos e nas Figuras. Em algumas modalidades, a segunda expansão é encurtada para 11 dias.
[00120] Em uma modalidade, REP e/ou a segunda expansão pode ser realizado(a) usando frascos T-175 e bolsas permeáveis a gás conforme previamente descrito (Tran, et al., J. Immunother. 2008, 31, 742-51; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42) ou artigos para cultura (cultureware) permeáveis a gás (frascos G-Rex). Em algumas modalidades, a segunda expansão (incluindo expansões referidas como expansões rápidas) é realizada em frascos T-175, e cerca de 1×106 TILs suspensos em 150mL de meio podem ser adicionados a cada frasco T-175. Os TILs podem ser cultivados em uma mistura de 1 para 1 de CM e meio AIM-V®, suplementada com 3.000 UI por mL de IL-2 e 30 ng por mL de anticorpo anti-CD3. Os frascos T-175 podem ser incubados a 37° C em 5% de CO2. Metade do meio pode ser trocada no dia 5 usando meio 50/50 com 3.000 UI por mL de IL-2. Em
162 / 509 algumas modalidades, no dia 7 as células de dois frascos T-175 podem ser combinadas em uma bolsa de 3L e 300mL de AIM V com 5% de soro AB humano e 3.000 UI por mL de IL-2 foi adicionado a 300mL de suspensão de TIL. O número de células em cada bolsa foi contado a cada dia ou a cada dois dias e meio fresco foi adicionado para manter a contagem de células 0,5 e 2,0×106 células/mL.
[00121] Em uma modalidade, a segunda expansão (que pode incluir expansões referidas como REP, e também referidas à Etapa D da Figura 8) pode ser realizada em frascos permeáveis a gás de capacidade de 500mL com fundos de silicone de 100 cm2 permeáveis a gás (G-Rex-100, comercialmente disponíveis junto à Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, EUA), 5×106 ou 10×106 TILs podem ser cultivados com PBMCs em 400mL de meio 50/50, suplementado com 5% de soro AB humano, 3.000 UI por mL de IL-2 e 30 ng por mL de anticorpo anti-CD3 (OKT3). Os frascos G- Rex-100 podem ser incubados a 37°C em 5% de CO2. No dia 5, 250mL de sobrenadante podem ser removidos e colocados em frascos de centrífuga e centrifugados a 1.500 rpm (491 x g) durante 10 minutos. Os péletes de TIL podem ser ressuspensos com 150mL de meio fresco com 5% de soro AB humano, 3.000 UI por mL de IL-2, e adicionados de volta aos frascos G-Rex- 100 originais. Quando os TILs são expandidos serialmente em frascos G-Rex- 100, no dia 7 os TILs em cada frasco G-Rex-100 podem ser suspensos nos 300mL de meio presentes em cada frasco e a suspensão de células pode ser dividida em 3 alíquotas de 100mL que podem ser usadas para semear 3 frascos G-Rex-100. Então 150mL de AIM-V® com 5% de soro AB humano e
3.000 UI por mL de IL-2 podem ser adicionados a cada frasco. Os frascos G- Rex-100 podem ser incubados a 37° C em 5% de CO2 e após 4 dias, 150mL de AIM-V® com 3.000 UI por mL de IL-2 podem ser adicionados a cada frasco G-Rex-100. As células podem ser colhidas no dia 14 de cultura.
[00122] Em uma modalidade, a segunda expansão (incluindo
163 / 509 expansões referidas como REP) é realizada em frascos com os TILs em massa sendo misturados com um excesso de 100 ou 200 vezes de células alimentadoras inativadas, 30 mg/mL de anticorpo anti-CD3 OKT3 e 3.000 UI/mL de IL-2 em 150mL de meio. Em algumas modalidades, a substituição de meio é realizada até que as células sejam transferidas para uma câmara de crescimento alternativa. Em algumas modalidades, 2/3 do meio é substituído por respiração por meio fresco. Em algumas modalidades, câmaras de crescimento alternativas incluem frascos G-Rex e recipientes permeáveis a gás como mais completamente discutido abaixo.
[00123] Em uma modalidade, a segunda expansão (incluindo expansões referidas como REP) é realizada e compreende, adicionalmente, uma etapa na qual os TILs são selecionados para reatividade tumoral superior. Qualquer método de seleção conhecido na técnica pode ser usado. Por exemplo, os métodos descritos na Publicação de Pedido de Patente Norte- Americana nº 2016/0010058 A1, cujas descrições são aqui incorporadas como referências, podem ser usados para a seleção de TILs para reatividade tumoral superior.
[00124] Opcionalmente, um ensaio de viabilidade celular pode ser realizado após a segunda expansão (incluindo expansões referidas como a expansão REP), usando ensaios padrão conhecidos na técnica. Por exemplo, um ensaio de exclusão com azul tripano pode ser realizado em uma amostra dos TILs em massa, que seletivamente marca células mortas e permite uma avaliação da viabilidade. Em algumas modalidades, as amostras de TIL podem ser contadas e a viabilidade pode ser determinada usando um contador de células automático Cellometer® K2 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, EUA). Em algumas modalidades, a viabilidade é determinada de acordo com o protocolo de “Cellometer® K2 Image Cytometer Automatic Cell Counter” descrito, por exemplo, no Exemplo 15.
[00125] Em algumas modalidades, a segunda expansão (incluindo
164 / 509 expansões referidas como REP) de TIL pode ser usada usando frascos T-175 e bolsas permeáveis a gás conforme previamente descrito (Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008, J. Immunother., 31:742–751, e Dudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003, J. Immunother., 26:332–342) ou frascos G-Rex permeáveis a gás. Em algumas modalidades, a segunda expansão é realizada usando frascos. Em algumas modalidades, a segunda expansão é realizada usando frascos G-Rex permeáveis a gás. Em algumas modalidades, a segunda expansão é realizada em frascos T-175, e cerca de 1×106 TILs são suspensos em cerca de 150mL de meio e isto é adicionado a cada frasco T-175. Os TILs são cultivados com PBMC alogeneica irradiada (50 Gy) como células “alimentadoras” em uma razão de 1 para 100 e as células foram cultivadas em uma mistura de 1 para 1 de CM e meio AIM-V® (meio 50/50), suplementado com 3.000 UI/mL de IL-2 e 30 ng/mL de anticorpo anti-CD3. Os frascos T-175 são incubados a 37°C em 5% de CO2. Em algumas modalidades, metade do meio é trocado no dia 5 usando meio 50/50 com 3.000 UI/mL de IL-2. Em algumas modalidades, no dia 7, as células de 2 frascos T-175 são combinadas em uma bolsa de 3L e 300mL de AIM-V® com 5% de soro AB humano e 3.000 UI/mL de IL-2 são adicionados aos 300mL de suspensão de TIL. O número de células em cada bolsa pode ser contado a cada dia ou a cada dois dias e meio fresco pode ser adicionado para manter a contagem de células entre cerca de 0,5 e cerca de 2,0×106 células/mL.
[00126] Em algumas modalidades, a segunda expansão (incluindo expansões referidas como REP) é realizada em frascos de capacidade de 500mL com fundos de silicone de 100 cm2 permeáveis a gás (G-Rex-100, Wilson Wolf) (Figura 1), cerca de 5×106 ou 10×106 TIL são cultivados com PBMC alogeneica irradiada em uma razão de 1 para 100 em 400mL de meio 50/50, suplementado com 3.000 UI/mL de IL-2 e 30 ng/mL de anticorpo anti- CD3. Os frascos G-Rex-100 são incubados a 37°C em 5% de CO2. Em
165 / 509 algumas modalidades, no dia 5, 250mL de sobrenadante são removidos e colocados em frascos de centrífuga e centrifugados a 1.500 rpm (491g) durante 10 minutos. Os péletes de TIL podem ser então ressuspensos com 150mL de meio fresco 50/50 com 3.000 UI/mL de IL-2 e adicionados de volta aos frascos G-Rex-100 originais. Em modalidades nas quais os TILs são expandidos serialmente em frascos G-Rex-100, no dia 7 os TILs em cada frasco G-Rex-100 são suspensos nos 300mL de meio presentes em cada frasco e a suspensão de células foi dividida em três alíquotas de 100mL que são usadas para semear 3 frascos G-Rex-100. Então 150mL de AIM-V® com 5% de soro AB humano e 3.000 UI/mL de IL-2 são adicionados a cada frasco. Os frascos G-Rex-100 são incubados a 37°C em 5% de CO2 e após 4 dias 150mL de AIM-V® com 3.000 UI/mL de IL-2 são adicionados a cada frasco G-Rex-100. As células são colhidas no dia 14 de cultura.
[00127] Os diversos receptores de antígenos de linfócitos-B e -T são produzidos por recombinação somática de um número limitado, porém grande, de segmentos de genes. Estes segmentos de genes: V (variável), D (diversidade), J (junção), e C (constante), determinam a especificidade de ligação e as aplicações a jusante de imunoglobulinas e receptores de células-T (TCRs). A presente invenção provê um método para gerar TILs que apresentam e aumentam a diversidade do repertório de células-T. Em algumas modalidades, os TILs obtidos pelo presente método apresentam um aumento na diversidade do repertório de células-T. Em algumas modalidades, os TILs obtidos na segunda expansão apresentam um aumento na diversidade do repertório de células-T. Em algumas modalidades, o aumento na diversidade é um aumento na diversidade de imunoglobulinas e/ou na diversidade do repertório de células-T. Em algumas modalidades, a diversidade é na imunoglobulina, é na cadeia pesada de imunoglobulina. Em algumas modalidades, a diversidade é na imunoglobulina, é na cadeia leve de imunoglobulina. Em algumas modalidades, a diversidade é no repertório de
166 / 509 células-T. Em algumas modalidades, a diversidade é em um dos receptores de célula-T selecionados a partir do grupo consistindo em receptores alfa, beta, gama, e delta. Em algumas modalidades, há um aumento na expressão de receptor de célula-T (TCR) alfa e/ou beta. Em algumas modalidades, há um aumento na expressão de receptor de célula-T (TCR) alfa. Em algumas modalidades, há um aumento na expressão de receptor de célula-T (TCR) beta. Em algumas modalidades, há um aumento na expressão de TCRab (isto é, TCRα/β).
[00128] Em algumas modalidades, o meio de cultura de segunda expansão (por exemplo, algumas vezes referido como CM2 ou o segundo meio de cultura de células), compreende IL-2, OKT-3, e também as células alimentadoras apresentadoras de antígenos (APCs), conforme discutido com mais detalhe abaixo.
[00129] Em algumas modalidades, a segunda expansão, por exemplo, a Etapa D de acordo com a Figura 8, é realizada em um biorreator de sistema fechado. Em algumas modalidades, um sistema fechado é utilizado para a expansão de TIL, conforme aqui descrito. Em algumas modalidades, um biorreator único é utilizado. Em algumas modalidades, o biorreator único utilizado é por exemplo um G-Rex-10 ou um G-Rex-100. Em algumas modalidades, o biorreator de sistema fechado é um biorreator único.
[00130] Em algumas modalidades, um ou mais sd-RNAs que têm como alvos genes conforme aqui descritos, incluindo PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, podem ser adicionados ao meio de cultura de células durante a segunda expansão, por exemplo, a Etapa D de acordo com a Figura 8, compreendendo TILs e outros agentes em quantidades selecionadas a partir do grupo consistindo em 0,1 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 0,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 0,75 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1,25 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1,5 μM de sd-RNA/10.000
167 / 509 TILs/100 μL de meio, 2 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, ou 10 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio. Em algumas modalidades, um ou mais sd-RNAs que têm como alvos genes conforme aqui descritos, incluindo PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, podem ser adicionados às culturas de TIL durante a segunda expansão, por exemplo, a Etapa D de acordo com a Figura 8, duas vezes por dia, um vez por dia, a cada dois dias, a cada três dias, a cada quatro dias, a cada cinco dias, a cada seis dias, ou a cada sete dias. Em uma modalidade, um ou mais sd-RNAs que têm como alvos genes conforme aqui descritos, incluindo PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, podem ser adicionados ao meio de cultura de células compreendendo TILs e outros agentes durante a segunda expansão, por exemplo, a Etapa D de acordo com a Figura 8, em quantidades selecionadas a partir do grupo consistindo em 0,1 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 0,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 0,75 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1,25 μM de sd- RNA/10.000 TILs, 1,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 2 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, ou 10 μM de sd-RNA/10.000 TILs. Em uma modalidade, um ou mais sd-RNAs que têm como alvos genes conforme aqui descritos, incluindo PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, podem ser adicionados às culturas de TIL durante a segunda expansão, por exemplo, a Etapa D de acordo com a Figura 8, duas vezes por dia, um vez por dia, a cada dois dias, a cada três dias, a cada quatro dias, a cada cinco dias, a cada seis dias, ou a cada sete dias.
1. Células Alimentadoras e Células Apresentadoras de Antígenos
[00131] Em uma modalidade, os procedimentos de segunda expansão aqui descritos (por exemplo incluindo expansão como aquelas descritas na Etapa D da Figura 8, e também aquelas referidas como REP) requerem um excesso de células alimentadoras durante a expansão de REP TIL e/ou durante a segunda expansão. Em muitas modalidades, as células
168 / 509 alimentadoras são células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) obtidas de unidades de sangue integral padrão de doadores de sangue saudáveis. As PBMCs são obtidas usando métodos padrão como separação em gradiente Ficoll-Paque®.
[00132] Em geral, as PBMCs alogeneicas são inativadas, quer via irradiação quer tratamento com calor, e usadas nos procedimentos REP, conforme descritos nos Exemplos, que provê um protocolo exemplificador para avaliar a incompetência em replicação das PBMCs alogeneicas irradiadas.
[00133] Em algumas modalidades, as PBMCs são consideradas incompetentes em replicação e aceitas para uso nos procedimentos de expansão de TIL aqui descritos se o número total de células viáveis no dia 14 é menor que o número de células viáveis inicial posto em cultura no dia 0 do REP e/ou no dia 0 da segunda expansão (isto é, o dia de início da segunda expansão).
[00134] Em algumas modalidades, as PBMCs são consideradas incompetentes em replicação e aceitas para uso nos procedimentos de expansão de TIL aqui descritos se o número total de células viáveis, cultivadas na presença de OKT3 e IL-2, no dia 7 e no dia 14, não tem aumentado a partir do número de célula viáveis iniciais posto em cultura no dia 0 de REP e/ou no dia 0 da segunda expansão (isto é, o dia de início da segunda expansão). Em algumas modalidades, as PBMCs são cultivadas na presença de 30 ng/ml de anticorpo OKT3 e 3.000 UI/mL de IL-2.
[00135] Em algumas modalidades, as PBMCs são consideradas incompetentes em replicação e aceitas para uso nos procedimentos de expansão de TIL aqui descritos se o número total de células viáveis, cultivadas na presença de OKT3 e IL-2, no dia 7 e no dia 14, não tem aumentado a partir do número de células viáveis inicial posto em cultura no dia 0 do REP e/ou no dia 0 da segunda expansão (isto é, o dia de início da
169 / 509 segunda expansão). Em algumas modalidades, as PBMCs são cultivadas na presença de 5-60 ng/mL de anticorpo OKT3 e de 1.000-6.000 UI/mL de IL-2. Em algumas modalidades, as PBMCs são cultivadas na presença de 10-50 ng/mL de anticorpo OKT3 e de 2.000-5.000 UI/mL de IL-2. Em algumas modalidades, as PBMCs são cultivadas na presença de 20-40 ng/mL de anticorpo OKT3 e de 2.000-4.000 UI/mL de IL-2. Em algumas modalidades, as PBMCs são cultivadas na presença de 25-35 ng/mL de anticorpo OKT3 e de 2.500-3.500 UI/mL de IL-2.
[00136] Em algumas modalidades, as células alimentadoras apresentadoras de antígenos são PBMCs. Em algumas modalidades, as células alimentadoras apresentadoras de antígenos são células alimentadoras apresentadoras de antígenos artificiais. Em uma modalidade, a razão entre TILs e células alimentadoras apresentadoras de antígenos na segunda expansão é de cerca de 1 a 25, cerca de 1 a 50, cerca de 1 a 100, cerca de 1 a 125, cerca de 1 a 150, cerca de 1 a 175, cerca de 1 a 200, cerca de 1 a 225, cerca de 1 a 250, cerca de 1 a 275, cerca de 1 a 300, cerca de 1 a 325, cerca de 1 a 350, cerca de 1 a 375, cerca de 1 a 400, ou cerca de 1 a 500. Em uma modalidade, a razão entre TILs e células alimentadoras apresentadoras de antígenos na segunda expansão está entre 1 e 50 e 1 e 300. Em uma modalidade, a razão entre TILs e células alimentadoras apresentadoras de antígenos na segunda expansão está entre 1 e 100 e 1 e 200.
[00137] Em uma modalidade, os procedimentos de segunda expansão aqui descritos requerem uma razão de cerca de 2,5×109 células alimentadoras para cerca de 100×106 TILs. Em outra modalidade, os procedimentos de segunda expansão aqui descritos requerem uma razão de cerca de 2,5×109 células alimentadoras para cerca de 50×106 TILs. Em ainda outra modalidade, os procedimentos de segunda expansão aqui descritos requerem cerca de 2,5×109 células alimentadoras para cerca de 25×106 TILs.
[00138] Em uma modalidade, os procedimentos de segunda expansão
170 / 509 aqui descritos requerem um excesso de células alimentadoras durante a segunda expansão. Em muitas modalidades, as células alimentadoras são células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) obtidas de unidades de sangue integral padrão de doadores de sangue saudáveis. As PBMCs são obtidas usando métodos padrão como separação em gradiente Ficoll-Paque®. Em uma modalidade, células apresentadoras de antígenos artificiais (aAPC) são usadas no lugar de PBMCs.
[00139] Em geral, as PBMCs alogeneicas são inativadas, quer via irradiação quer tratamento com calor, e usadas nos procedimentos de expansão de TIL aqui descritos, incluindo os procedimentos exemplificadores descritos nas Figuras 4, 5, 6, e 7.
[00140] Em uma modalidade, células apresentadoras de antígenos artificiais são usadas na segunda expansão como uma substituição das, ou em combinação com as, PBMCs.
2. Citocinas
[00141] Os métodos de expansão aqui descritos geralmente usam meios de cultura com altas doses de uma citocina, em particular IL-2, conforme é conhecido na técnica.
[00142] Alternativamente, o uso de combinações de citocinas para a expansão rápida e/ou a segunda expansão de TILs é adicionalmente possível, com combinações de duas ou mais dentre IL-2, IL-15 e IL-21 conforme é geralmente descrito na Publicação Internacional nº WO 2015/189356 e na Publicação Internacional nº WO 2015/189357, expressamente incorporadas pelo presente documento em suas totalidades como referências. Por conseguinte, as combinações possíveis incluem IL-2 e IL-15, IL-2 e IL-21, IL-15 e IL-21 e IL-2, IL-15 e IL-21, com a última encontrando uso específico em muitas modalidades. O uso de combinações de citocinas especificamente favorece a geração de linfócitos, e em particular de células-T conforme aqui descrito.
171 / 509 E. ETAPA E: Colheita de TILs
[00143] Após a etapa de segunda expansão, as células podem ser colhidas. Em algumas modalidades os TILs são colhidos após uma, duas, três, quatro ou mais etapas de expansão, por exemplo, conforme providas na Figura 8. Em algumas modalidades os TILs são colhidos após duas etapas de expansão, por exemplo, conforme provido na Figura 8.
[00144] Os TILs podem ser colhidos em qualquer maneira apropriada e estéril, incluindo, por exemplo, por centrifugação. Métodos para colheita de TIL são bem conhecidos na técnica e qualquer um de tais métodos pode ser utilizado com o presente processo. Em algumas modalidades, os TILs são colhidos usando um sistema automatizado.
[00145] Colhedoras de células e/ou sistemas de processamento de células estão comercialmente disponíveis junto a uma variedade de fornecedores, incluindo, por exemplo, Fresenius Kabi, Tomtec Life Science, Perkin Elmer, e Inotech Biosystems International, Inc. Qualquer colhedora de células pode ser utilizada com os presentes métodos. Em algumas modalidades, a colhedora de células e/ou os sistemas de processamento de células é uma colhedora de células à base de membrana. Em algumas modalidades, a colheita de células é via um sistema de processamento de células, como o Sistema LOVO (fabricado por Fresenius Kabi). O termo “LOVO Cell Processing System” (Sistema de Processamento de Células LOVO) também se refere a qualquer instrumento ou dispositivo fabricado por qualquer vendedor que pode bombear uma solução compreendendo células através de uma membrana ou de um filtro como uma membrana rotativa ou um filtro rotativo em um ambiente estéril e/ou de sistema fechado, permitindo o fluxo contínuo e o processamento das células para remover o sobrenadante ou o meio de cultura de células sem peletização. Em algumas modalidades, a colhedora de células e/ou o sistema de processamento de células pode realizar separação, lavagem, troca de fluido, concentração, e/ou outras etapas de
172 / 509 processamento em um sistema fechado, estéril.
[00146] Em algumas modalidades, a colheita, por exemplo, a Etapa E de acordo com a Figura 8, é realizada a partir de um biorreator de sistema fechado. Em algumas modalidades, um sistema fechado é utilizado para a expansão de TIL, conforme aqui descrito. Em algumas modalidades, um biorreator único é utilizado. Em algumas modalidades, o biorreator único utilizado é por exemplo um G-Rex-10 ou um G-Rex-100. Em algumas modalidades, o biorreator de sistema fechado é um biorreator único.
[00147] Em algumas modalidades, a Etapa E de acordo com a Figura 8, é realizada de acordo com os processos descritos no Exemplo 16. Em algumas modalidades, o sistema fechado é acessado via seringas sob condições estéreis com o propósito de manter a esterilidade e a natureza fechada do sistema. Em algumas modalidades, é utilizado um sistema fechado conforme descrito no Exemplo 16.
[00148] Em algumas modalidades, os TILs são colhidos de acordo com os métodos descritos no Exemplo 16. Em algumas modalidades, os TILs entre dias 1 e 11 são colhidos usando os métodos descritos na Seção 8.5 (referido como o Dia 11 de colheita de TILs no Exemplo 16). Em algumas modalidades, os TILs entre dias 12 e 22 são colhidos usando os métodos conforme descritos na Seção 8.12 (referido como o Dia 22 de colheita de TILs no Exemplo 16). F. ETAPA F: Formulação Final / Transferência para Bolsa de Infusão
[00149] Após as Etapas A até E, conforme providas em uma ordem exemplificadora na Figura 8 e conforme descritas em detalhe acima e aqui, serem completadas, as células são transferidas para um recipiente para uso em administração a um paciente. Em algumas modalidades, logo que um número terapeuticamente suficiente de TILs é obtido usando os métodos de expansão descritos acima, eles são transferidos para um recipiente para uso em administração a um paciente.
173 / 509
[00150] Em uma modalidade, os TILs expandidos usando APCs da presente descrição são administrados a um paciente como uma composição farmacêutica. Em uma modalidade, a composição farmacêutica é uma suspensão de TILs em um tampão estéril. Os TILs expandidos usando PBMCs da presente descrição podem ser administrados por qualquer rota adequada conhecida na técnica. Em algumas modalidades, as células-T são administradas como uma infusão intra-arterial ou intravenosa única, que preferivelmente demora aproximadamente 30 a 60 minutos. Outras rotas de administração adequadas incluem intraperitoneal, intratecal, e intralinfática.
1. Composições Farmacêuticas, Dosagens, e Regimes de Dosagem
[00151] Em uma modalidade, os TILs expandidos usando os métodos da presente descrição são administrados a um paciente como uma composição farmacêutica. Em uma modalidade, a composição farmacêutica é uma suspensão de TILs em um tampão estéril. Os TILs expandidos usando PBMCs da presente descrição podem ser administrados por qualquer rota adequada conhecida na técnica. Em algumas modalidades, as células-T são administradas como uma infusão intra-arterial ou intravenosa única, que preferivelmente demora aproximadamente 30 a 60 minutos. Outras rotas de administração adequadas incluem intraperitoneal, intratecal, e intralinfática.
[00152] Qualquer dose adequada de TILs pode ser administrada. Em algumas modalidades, de cerca de 2,3×1010 a cerca de 13,7×1010 TILs são administrados, com uma média de cerca de 7,8×1010 TILs, particularmente se o câncer é melanoma. Em uma modalidade, cerca de 1,2×1010 a cerca de 4,3×1010 de TILs são administrados. Em algumas modalidades, cerca de 3×1010 a cerca de 12×1010 TILs são administrados. Em algumas modalidades, cerca de 4×1010 a cerca de 10×1010 TILs são administrados. Em algumas modalidades, cerca de 5×1010 a cerca de 8×1010 TILs são administrados. Em algumas modalidades, cerca de 6×1010 a cerca de 8×1010 TILs são administrados. Em algumas modalidades, cerca de 7×1010 a cerca de 8×1010
174 / 509 TILs são administrados. Em algumas modalidades, a dosagem terapeuticamente eficaz é cerca de 2,3×1010 a cerca de 13,7×1010. Em algumas modalidades, a dosagem terapeuticamente eficaz é cerca de 7,8×1010 TILs, particularmente se o câncer é melanoma. Em algumas modalidades, a dosagem terapeuticamente eficaz é cerca de 1,2×1010 a cerca de 4,3×1010 TILs. Em algumas modalidades, a dosagem terapeuticamente eficaz é cerca de 3×1010 a cerca de 12×1010 TILs. Em algumas modalidades, a dosagem terapeuticamente eficaz é cerca de 4×1010 a cerca de 10×1010 TILs. Em algumas modalidades, a dosagem terapeuticamente eficaz é cerca de 5×1010 a cerca de 8×1010 TILs. Em algumas modalidades, a dosagem terapeuticamente eficaz é cerca de 6×1010 a cerca de 8×1010 TILs. Em algumas modalidades, a dosagem terapeuticamente eficaz é cerca de 7×1010 a cerca de 8×1010 TILs.
[00153] Em algumas modalidades, o número de TILs providos nas composições farmacêuticas da invenção é cerca de 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 7×1013, 8×1013, e 9×1013. Em uma modalidade, o número de TILs providos nas composições farmacêuticas da invenção está na faixa de 1×106 a 5×106, 5×106 a 1×107, 1×107 a 5×107, 5×107 a 1×108, 1×108 a 5×108, 5×108 a 1×109, 1×109 a 5×109, 5×109 a 1×1010, 1×1010 a 5×1010, 5×1010 a 1×1011, 5×1011 a 1×1012, 1×1012 a 5×1012, e 5×1012 a 1×1013.
[00154] Em algumas modalidades, a concentração dos TILs providos nas composições farmacêuticas da invenção é menor que, por exemplo, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%,
175 / 509 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, 0,09%, 0,08%, 0,07%, 0,06%, 0,05%, 0,04%, 0,03%, 0,02%, 0,01%, 0,009%, 0,008%, 0,007%, 0,006%, 0,005%, 0,004%, 0,003%, 0,002%, 0,001%, 0,0009%, 0,0008%, 0,0007%, 0,0006%, 0,0005%, 0,0004%, 0,0003%, 0,0002% ou 0,0001% p/p, p/v ou v/v da composição farmacêutica.
[00155] Em algumas modalidades, a concentração dos TILs providos nas composições farmacêuticas da invenção é maior que 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19,75%, 19,50%, 19,25% 19%, 18,75%, 18,50%, 18,25% 18%, 17,75%, 17,50%, 17,25% 17%, 16,75%, 16,50%, 16,25% 16%, 15,75%, 15,50%, 15,25% 15%, 14,75%, 14,50%, 14,25% 14%, 13,75%, 13,50%, 13,25% 13%, 12,75 %, 12,50%, 12,25% 12%, 11,75%, 11,50%, 11,25% 11%, 10,75%, 10,50%, 10,25% 10%, 9,75%, 9,50%, 9,25% 9%, 8,75%, 8,50%, 8,25% 8%, 7,75%, 7,50%, 7,25% 7%, 6,75%, 6,50%, 6,25% 6%, 5,75%, 5,50%, 5,25% 5%, 4,75%, 4,50%, 4,25%, 4%, 3,75%, 3,50%, 3,25%, 3%, 2,75 %, 2,50%, 2,25%, 2%, 1,75%, 1,50%, 125%, 1%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, 0,09%, 0,08%, 0,07%, 0,06%, 0,05%, 0,04%, 0,03%, 0,02%, 0,01%, 0,009%, 0,008%, 0,007%, 0,006%, 0,005%, 0,004%, 0,003%, 0,002%, 0,001%, 0,0009%, 0,0008%, 0,0007%, 0,0006%, 0,0005%, 0,0004%, 0,0003%, 0,0002% ou 0,0001% p/p, p/v, ou v/v da composição farmacêutica.
[00156] Em algumas modalidades, a concentração dos TILs providos nas composições farmacêuticas da invenção está na faixa de cerca de 0,0001% a cerca de 50%, cerca de 0,001% a cerca de 40%, cerca de 0,01% a cerca de 30%, cerca de 0,02% a cerca de 29%, cerca de 0,03% a cerca de 28%, cerca de 0,04% a cerca de 27%, cerca de 0,05% a cerca de 26%, cerca de 0,06% a cerca de 25%, cerca de 0,07% a cerca de 24%, cerca de 0,08% a cerca de 23%, cerca de 0,09% a cerca de 22%, cerca de 0,1% a cerca de 21%, cerca de 0,2% a cerca de 20%, cerca de 0,3% a cerca de 19%, cerca de 0,4% a
176 / 509 cerca de 18%, cerca de 0,5% a cerca de 17%, cerca de 0,6% a cerca de 16%, cerca de 0,7% a cerca de 15%, cerca de 0,8% a cerca de 14%, cerca de 0,9% a cerca de 12% ou cerca de 1% a cerca de 10% p/p, p/v ou v/v da composição farmacêutica.
[00157] Em algumas modalidades, a concentração dos TILs providos nas composições farmacêuticas da invenção está na faixa de cerca de 0,001% a cerca de 10%, cerca de 0,01% a cerca de 5%, cerca de 0,02% a cerca de 4,5%, cerca de 0,03% a cerca de 4%, cerca de 0,04% a cerca de 3,5%, cerca de 0,05% a cerca de 3%, cerca de 0,06% a cerca de 2,5%, cerca de 0,07% a cerca de 2%, cerca de 0,08% a cerca de 1,5%, cerca de 0,09% a cerca de 1%, cerca de 0,1% a cerca de 0,9% p/p, p/v ou v/v da composição farmacêutica.
[00158] Em algumas modalidades, a quantidade dos TILs providos nas composições farmacêuticas da invenção é igual a ou menor que 10 g, 9,5 g, 9,0 g, 8,5 g, 8,0 g, 7,5 g, 7,0 g, 6,5 g, 6,0 g, 5,5 g, 5,0 g, 4,5 g, 4,0 g, 3,5 g, 3,0 g, 2,5 g, 2,0 g, 1,5 g, 1,0 g, 0,95 g, 0,9 g, 0,85 g, 0,8 g, 0,75 g, 0,7 g, 0,65 g, 0,6 g, 0,55 g, 0,5 g, 0,45 g, 0,4 g, 0,35 g, 0,3 g, 0,25 g, 0,2 g, 0,15 g, 0,1 g, 0,09 g, 0,08 g, 0,07 g, 0,06 g, 0,05 g, 0,04 g, 0,03 g, 0,02 g, 0,01 g, 0,009 g, 0,008 g, 0,007 g, 0,006 g, 0,005 g, 0,004 g, 0,003 g, 0,002 g, 0,001 g, 0,0009 g, 0,0008 g, 0,0007 g, 0,0006 g, 0,0005 g, 0,0004 g, 0,0003 g, 0,0002 g, ou 0,0001 g.
[00159] Em algumas modalidades, a quantidade dos TILs providos nas composições farmacêuticas da invenção é maior que 0,0001 g, 0,0002 g, 0,0003 g, 0,0004 g, 0,0005 g, 0,0006 g, 0,0007 g, 0,0008 g, 0,0009 g, 0,001 g, 0,0015 g, 0,002 g, 0,0025 g, 0,003 g, 0,0035 g, 0,004 g, 0,0045 g, 0,005 g, 0,0055 g, 0,006 g, 0,0065 g, 0,007 g, 0,0075 g, 0,008 g, 0,0085 g, 0,009 g, 0,0095 g, 0,01 g, 0,015 g, 0,02 g, 0,025 g, 0,03 g, 0,035 g, 0,04 g, 0,045 g, 0,05 g, 0,055 g, 0,06 g, 0,065 g, 0,07 g, 0,075 g, 0,08 g, 0,085 g, 0,09 g, 0,095 g, 0,1 g, 0,15 g, 0,2 g, 0,25 g, 0,3 g, 0,35 g, 0,4 g, 0,45 g, 0,5 g, 0,55 g, 0,6 g, 0,65 g, 0,7 g, 0,75 g, 0,8 g, 0,85 g, 0,9 g, 0,95 g, 1 g, 1,5 g, 2 g, 2,5, 3 g, 3,5, 4
177 / 509 g, 4,5 g, 5 g, 5,5 g, 6 g, 6,5 g, 7 g, 7,5 g, 8 g, 8,5 g, 9 g, 9,5 g, ou 10 g.
[00160] Os TILs providos nas composições farmacêuticas da invenção são eficazes ao longo de uma ampla faixa de dosagem. A dosagem exata dependerá da rota de administração, da forma na qual o composto é administrado, do sexo e da idade do indivíduo a ser tratado, do peso corporal do indivíduo a ser tratado, e da preferência e da experiência do médico atendente. As dosagens clinicamente comprovadas dos TILs podem também ser usadas se apropriadas. As quantidades das composições farmacêuticas administradas usando os método aqui, como as dosagens de TILs, dependerão do ser humano ou mamífero sendo tratado, da gravidade do distúrbio ou da condição, da taxa de administração, da disposição dos ingredientes farmacêuticos ativos e do arbítrio do médico prescritor.
[00161] Em algumas modalidades, os TILs podem ser administrados em uma dose única. Tal administração pode ser por injeção, por exemplo, injeção intravenosa. Em algumas modalidades, os TILs podem ser administrados em doses múltiplas. A dosagem pode ser uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, seis vezes, ou mais que seis vezes por ano. A dosagem pode ser uma vez por mês, uma vez a cada duas semanas, uma vez por semana, ou uma vez a cada dois dias. A administração de TILs pode continuar desde que seja necessária.
[00162] Em algumas modalidades, uma dosagem eficaz de TILs é cerca de 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 7×1013, 8×1013, e 9×1013. Em algumas modalidades,
178 / 509 uma dosagem eficaz de TILs está na faixa de 1×106 a 5×106, 5×106 a 1×107, 1×107 a 5×107, 5×107 a 1×108, 1×108 a 5×108, 5×108 a 1×109, 1×109 a 5×109, 5×109 a 1×1010, 1×1010 a 5×1010, 5×1010 a 1×1011, 5×1011 a 1×1012, 1×1012 a 5×1012, e 5×1012 a 1×1013.
[00163] Em algumas modalidades, uma dosagem eficaz de TILs está na faixa de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 4,3 mg/kg, cerca de 0,15 mg/kg a cerca de 3,6 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg a cerca de 3,2 mg/kg, cerca de 0,35 mg/kg a cerca de 2,85 mg/kg, cerca de 0,15 mg/kg a cerca de 2,85 mg/kg, cerca de 0,3 mg a cerca de 2,15 mg/kg, cerca de 0,45 mg/kg a cerca de 1,7 mg/kg, cerca de 0,15 mg/kg a cerca de 1,3 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg a cerca de 1,15 mg/kg, cerca de 0,45 mg/kg a cerca de 1 mg/kg, cerca de 0,55 mg/kg a cerca de 0,85 mg/kg, cerca de 0,65 mg/kg a cerca de 0,8 mg/kg, cerca de 0,7 mg/kg a cerca de 0,75 mg/kg, cerca de 0,7 mg/kg a cerca de 2,15 mg/kg, cerca de 0,85 mg/kg a cerca de 2 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 1,85 mg/kg, cerca de 1,15 mg/kg a cerca de 1,7 mg/kg, cerca de 1,3 mg/kg mg a cerca de 1,6 mg/kg, cerca de 1,35 mg/kg a cerca de 1,5 mg/kg, cerca de 2,15 mg/kg a cerca de 3,6 mg/kg, cerca de 2,3 mg/kg a cerca de 3,4 mg/kg, cerca de 2,4 mg/kg a cerca de 3,3 mg/kg, cerca de 2,6 mg/kg a cerca de 3,15 mg/kg, cerca de 2,7 mg/kg a cerca de 3 mg/kg, cerca de 2,8 mg/kg a cerca de 3 mg/kg, ou cerca de 2,85 mg/kg a cerca de 2,95 mg/kg.
[00164] Em algumas modalidades, uma dosagem eficaz de TILs está na faixa de cerca de 1 mg a cerca de 500 mg, cerca de 10 mg a cerca de 300 mg, cerca de 20 mg a cerca de 250 mg, cerca de 25 mg a cerca de 200 mg, cerca de 1 mg a cerca de 50 mg, cerca de 5 mg a cerca de 45 mg, cerca de 10 mg a cerca de 40 mg, cerca de 15 mg a cerca de 35 mg, cerca de 20 mg a cerca de 30 mg, cerca de 23 mg a cerca de 28 mg, cerca de 50 mg a cerca de 150 mg, cerca de 60 mg a cerca de 140 mg, cerca de 70 mg a cerca de 130 mg, cerca de 80 mg a cerca de 120 mg, cerca de 90 mg a cerca de 110 mg, ou cerca de 95 mg a cerca de 105 mg, cerca de 98 mg a cerca de 102 mg, cerca
179 / 509 de 150 mg a cerca de 250 mg, cerca de 160 mg a cerca de 240 mg, cerca de 170 mg a cerca de 230 mg, cerca de 180 mg a cerca de 220 mg, cerca de 190 mg a cerca de 210 mg, cerca de 195 mg a cerca de 205 mg, ou cerca de 198 a cerca de 207 mg.
[00165] Uma quantidade eficaz dos TILs pode ser administrada em quer dose única quer doses múltiplas por meio de qualquer um dos modos aceitos de administração de agentes que têm utilidades similares, incluindo rotas intranasal e transdérmica, por injeção intra-arterial, intravenosamente, intraperitonealmente, parenteralmente, intramuscularmente, subcutaneamente, topicamente, por transplantação, ou por inalação. G. Componentes Opcionais do Meio de Células
1. Anticorpos anti-CD3
[00166] Em algumas modalidades, o meio de cultura usado nos métodos de expansão aqui descritos (incluindo aqueles referidos como REP, consulte por exemplo, a Figura A) também inclui um anticorpo anti-CD3. Um anticorpo anti-CD3 em combinação com IL-2 induz ativação de células-T e divisão celular na população de TIL. Este efeito pode ser visto com anticorpos de comprimento completo e também com fragmentos Fab e F(ab’)2, com os primeiros sendo geralmente preferidos; consulte, por exemplo, Tsoukas et al., J. Immunol. 1985, 135, 1719, incorporado pelo presente documento em sua totalidade como referência.
[00167] Como será reconhecido por aquelas pessoas versadas na técnica, há numerosos anticorpos anti-CD3-humano adequados que encontram uso na invenção, incluindo anticorpos monoclonais e policlonais anti-CD3-humano de vários mamíferos, incluindo, mas não se limitando a, anticorpos murinos, humanos, primatas, de ratos, e caninos. Em modalidades específicas, é usado o anticorpo anti-CD3, OKT3 (comercialmente disponível junto à Ortho-McNeil, Raritan, NJ, EUA, ou junto à Miltenyi Biotech, Auburn, CA, EUA).
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2. Agonistas de 4-1BB (CD137)
[00168] Em uma modalidade, o agonista de TNFRSF é um agonista de 4-1BB (CD137). O agonista de 4-1BB pode ser qualquer molécula ligante de 4-1BB conhecida na técnica. A molécula ligante de 4-1BB pode ser um anticorpo monoclonal ou uma proteína de fusão capaz de ligação a um 4-1BB humana ou de mamífero. Os agonistas de 4-1BB ou as moléculas ligantes de 4-1BB podem compreender uma cadeia pesada de imunoglobulina de qualquer isótipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina. O agonista de 4-1BB ou a molécula ligante de 4-1BB pode ter ambas uma cadeia pesada e uma cadeia leve. Como aqui usado, o termo molécula ligante também inclui anticorpos (incluindo anticorpos de comprimento completo), anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento completo), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), anticorpos humanos, humanizados ou quiméricos, e fragmentos de anticorpo, por exemplo, fragmentos Fab, fragmentos F(ab′), fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, fragmentos de ligação ao epítopo, de qualquer um dos supracitados, e formas modificadas de anticorpos, por exemplo, moléculas de scFv, que se ligam a 4-1BB. Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é uma proteína de ligação ao antígeno que é um anticorpo completamente humano. Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é uma proteína de ligação ao antígeno que é um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades, os agonistas de 4-1BB para uso nos métodos e nas composições presentemente revelados(as) incluem anticorpos anti-4-1BB, anticorpos de humano anti-4-1BB, anticorpos de camundongo anti-4-1BB, anticorpos de mamífero anti-4-1BB, anticorpos monoclonais anti-4-1BB, anticorpos policlonais anti-4-1BB, anticorpos quiméricos anti-4-1BB, adnectinas anti-4- 1BB, anticorpos anti-domínio-4-1BB, fragmentos de cadeia única anti-4-1BB,
181 / 509 fragmentos de cadeia pesada anti-4-1BB, fragmentos de cadeia leve anti-4- 1BB, proteínas de fusão anti-4-1BB, e fragmentos, derivados, conjugados, variantes, ou biossimilares dos mesmos. É sabido que os anticorpos agonísticos anti-4-1BB induzem respostas imunes fortes. Lee, et al., PLOS One 2013, 8, e69677. Em uma modalidade preferida, o agonista de 4-1BB é um anticorpo monoclonal (isto é, um anticorpo derivado de uma linhagem celular única), humanizado ou completamente humano, agonístico, anti-4- 1BB. Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é EU-101 (Eutilex Co. Ltd.), utomilumabe, ou urelumabe, ou um fragmento, um derivado, um conjugado, uma variante, ou um biossimilar do mesmo. Em uma modalidade preferida, o agonista de 4-1BB é utomilumabe ou urelumabe, ou um fragmento, um derivado, um conjugado, uma variante, ou um biossimilar do mesmo.
[00169] Em uma modalidade preferida, o agonista de 4-1BB ou a molécula ligante de 4-1BB pode também ser uma proteína de fusão. Em uma modalidade preferida, um agonista multimérico de 4-1BB, como um agonista trimérico ou hexamérico de 4-1BB (com três ou seis domínios de ligação ao ligante), pode induzir agrupamento de receptores superiores (4-1BBL) e formação de complexo de sinalização celular interna em comparação com um anticorpo monoclonal, agonístico, que tipicamente possui dois domínios de ligação ao ligante. Proteínas de fusão triméricas (trivalentes) ou hexaméricas (ou hexavalentes) ou superiores compreendendo três domínios ligantes de TNFRSF e IgG1-Fc e opcionalmente adicionalmente ligando duas ou mais destas proteínas de fusão são descritas, por exemplo, em Gieffers, et al., Mol. Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47.
[00170] É sabido que proteínas de fusão agonísticas de 4-1BB e anticorpos agonísticos de 4-1BB induzem respostas imunes fortes. Em uma modalidade preferida, o agonista de 4-1BB é um anticorpo monoclonal ou uma proteína de fusão que se liga especificamente ao antígeno 4-1BB em uma maneira suficiente para reduzir toxicidade. Em algumas modalidades, o
182 / 509 agonista de 4-1BB é uma proteína de fusão agonística ou anticorpo monoclonal agonístico de 4-1BB que anula a toxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC, Antibody-Dependent Cellular Toxicity), por exemplo a citotoxicidade de células NK. Em algumas modalidades, o agonista de 4-1BB é uma proteína de fusão agonística de 4-1BB ou um anticorpo monoclonal agonístico de 4-1BB que anula a fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP, Antibody-Dependent Cell Phagocytosis). Em algumas modalidades, o agonista de 4-1BB é uma proteína de fusão agonística de 4-1BB ou um anticorpo monoclonal agonístico de 4-1BB que anula a citotoxicidade dependente de complemento (CDC, Complement-Dependent Cytotoxicity). Em algumas modalidades, o agonista de 4-1BB é uma proteína de fusão agonística de 4-1BB ou um anticorpo monoclonal agonístico de 4-1BB que anula a funcionalidade da região Fc.
[00171] Em algumas modalidades, os agonistas de 4-1BB são distinguidos pela ligação à 4-1BB humana (SEQ ID NO:9) com alta afinidade e alta atividade agonística. Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é uma molécula ligante que se liga à 4-1BB humana (SEQ ID NO:9). Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é uma molécula ligante que se liga à 4-1BB murina (SEQ ID NO:10). As sequências de aminoácidos do antígeno 4-1BB ao qual um agonista de 4-1BB ou uma molécula ligante se liga são resumidas na Tabela 3. TABELA 3. Sequências de aminoácidos de antígenos 4-1BB. Identificador Sequência (Símbolos de Aminoácido de Uma Letra) SEQ ID NO:9 MGNSCYNIVA TLLLVLNFER TRSLQDPCSN CPAGTFCDNN RNQICSPCPP 4-1BB humana, NSFSSAGGQR 60 Superfamília de TCDICRQCKG VFRTRKECSS TSNAECDCTP GFHCLGAGCS MCEQDCKQGQ receptores de ELTKKGCKDC 120 fatores de CFGTFNDQKR GICRPWTNCS LDGKSVLVNG TKERDVVCGP SPADLSPGAS necrose tumoral, SVTPPAPARE 180 membro 9 PGHSPQIISF FLALTSTALL FLLFFLTLRF SVVKRGRKKL LYIFKQPFMR (Homo sapiens) PVQTTQEEDG 240 CSCRFPEEEE GGCEL 255
183 / 509 SEQ ID NO:10 MGNNCYNVVV IVLLLVGCEK VGAVQNSCDN CQPGTFCRKY NPVCKSCPPS 4-1BB murina, TFSSIGGQPN 60 Superfamília de CNICRVCAGY FRFKKFCSST HNAECECIEG FHCLGPQCTR CEKDCRPGQE receptores de LTKQGCKTCS 120 fatores de LGTFNDQNGT GVCRPWTNCS LDGRSVLKTG TTEKDVVCGP PVVSFSPSTT necrose tumoral, ISVTPEGGPG 180 membro 9 (Mus GHSLQVLTLF LALTSALLLA LIFITLLFSV LKWIRKKFPH IFKQPFKKTT musculus) GAAQEEDACS 240 CRCPQEEEGG GGGYEL 256
[00172] Em algumas modalidades, as composições, os processos e os métodos descritos(as) incluem um agonista de 4-1BB que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma KD de cerca de 100 pM ou mais baixa, que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma KD de cerca de 90 pM ou mais baixa, que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma KD de cerca de 80 pM ou mais baixa, que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma KD de cerca de 70 pM ou mais baixa, que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma KD de cerca de 60 pM ou mais baixa, que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma KD de cerca de 50 pM ou mais baixa, que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma KD de cerca de 40 pM ou mais baixa, ou que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma KD de cerca de 30 pM ou mais baixa.
[00173] Em algumas modalidades, as composições, os processos e os métodos descritos(as) incluem um agonista de 4-1BB que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma kassoc de cerca de 7,5×105 1/M·s ou mais rápida, que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma kassoc de cerca de 7,5×105 1/M·s ou mais rápida, que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma kassoc de cerca de 8×105 l/M·s ou mais rápida, que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma kassoc de cerca de 8,5×105 1/M·s ou mais rápida, que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma kassoc de cerca de 9×105 1/M·s ou mais rápida, que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma kassoc de cerca de 9,5×105 1/M·s ou mais rápida, ou que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma kassoc de cerca de 1×106 1/M·s ou mais rápida.
[00174] Em algumas modalidades, as composições, os processos e os métodos descritos(as) incluem um agonista de 4-1BB que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma kdissoc de cerca de 2×10-5 1/s ou mais lenta, que
184 / 509 se liga à 4-1BB humana ou murina com uma kdissoc de cerca de 2,1×10-5 1/s ou mais lenta, que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma kdissoc de cerca de 2,2×10-5 1/s ou mais lenta, que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma kdissoc de cerca de 2,3×10-5 1/s ou mais lenta, que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma kdissoc de cerca de 2,4×10-5 1/s ou mais lenta, que se liga à 4- 1BB humana ou murina com uma kdissoc de cerca de 2,5×10-5 1/s ou mais lenta, que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma kdissoc de cerca de 2,6×10-5 1/s ou mais lenta ou que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma kdissoc de cerca de 2,7×10-5 1/s ou mais lenta, que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma kdissoc de cerca de 2,8×10-5 1/s ou mais lenta, que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma kdissoc de cerca de 2,9×10-5 1/s ou mais lenta, ou que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma kdissoc de cerca de 3×10-5 1/s ou mais lenta.
[00175] Em algumas modalidades, as composições, os processos e os métodos descritos(as) incluem um agonista de 4-1BB que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma CI50 de cerca de 10 nM ou mais baixa, que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma CI50 de cerca de 9 nM ou mais baixa, que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma CI50 de cerca de 8 nM ou mais baixa, que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma CI50 de cerca de 7 nM ou mais baixa, que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma CI50 de cerca de 6 nM ou mais baixa, que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma CI50 de cerca de 5 nM ou mais baixa, que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma CI50 de cerca de 4 nM ou mais baixa, que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma CI50 de cerca de 3 nM ou mais baixa, que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma CI50 de cerca de 2 nM ou mais baixa, ou que se liga à 4-1BB humana ou murina com uma CI50 de cerca de 1 nM ou mais baixa.
[00176] Em uma modalidade preferida, o agonista de 4-1BB é utomilumabe, também conhecido como PF-05082566 ou MOR-7480, ou um
185 / 509 fragmento, um derivado, uma variante, ou um biossimilar do mesmo. O utomilumabe está disponível junto à Pfizer, Inc. O utomilumabe é um anticorpo monoclonal (completamente humano) de Homo sapiens, imunoglobulina G2-lambda, anti-[membro 9 da superfamília de receptores de fatores de necrose tumoral (TNFRSF9 (Tumor Necrosis Factor Receptor (TNFR) Superfamily member 9), 4-1BB, antígeno ILA de célula-T, CD137, de Homo sapiens)]. A sequência de aminoácidos de utomilumabe é mostrada na Tabela 4. O utomilumabe compreende sítios de glicosilação em Asn59 e Asn292; pontes de dissulfeto intracadeia da cadeia pesada nas posições 22-96 (VH-VL), 143-199 (CH1-CL), 256-316 (CH2) e 362-420 (CH3); pontes de dissulfeto intracadeia da cadeia leve nas posições 22’-87’ (VH-VL) e 136’- 195’ (CH1-CL); pontes de dissulfeto intercadeias das cadeia pesada-cadeia pesada nas posições 218-218, 219-219, 222-222, e 225-225 da isoforma IgG2A, nas posições 218-130, 219-219, 222-222, e 225-225 da isoforma IgG2A/B, e nas posições 219-130 (2), 222-222, e 225-225 da isoforma IgG2B; e pontes de dissulfeto intercadeias das cadeia pesada-cadeia leve nas posições 130-213’ (2) da isoforma IgG2A, nas posições 218-213’ e 130-213’ da isoforma IgG2A/B, e nas posições 218-213’ (2) da isoforma IgG2B. A preparação e as propriedades de utomilumabe e de suas variantes e de seus fragmentos são descritas nas Patentes Norte-Americana nºs 8.821.867;
8.337.850; e 9.468.678, e Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO 2012/032433 A1, cujas descrições, de cada, são aqui incorporadas como referências. As características pré-clínicas de utomilumabe são descritas em Fisher, et al., Cancer Immunolog. & Immunother. 2012, 61, 1721-33. Testes clínicos atuais de utomilumabe em uma variedade de indicações hematológicas e de tumor sólido incluem os indicadores NCT02444793, NCT01307267, NCT02315066, e NCT02554812 de Norte-Americana National Institutes of Health clinicaltrials.gov.
[00177] Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende uma
186 / 509 cadeia pesada apresentada pela SEQ ID NO:11 e uma cadeia leve apresentada pela SEQ ID NO:12. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende cadeias pesada e leve tendo as sequências mostradas em SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12, respectivamente, ou fragmentos de ligação ao antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variáveis de cadeia única (scFv, single- chain variable fragments), variantes, ou conjugados dos mesmos. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende cadeias pesada e leve que são, cada, pelo menos 99% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende cadeias pesada e leve que são, cada, pelo menos 98% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende cadeias pesada e leve que são, cada, pelo menos 97% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende cadeias pesada e leve que são, cada, pelo menos 96% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende cadeias pesada e leve que são, cada, pelo menos 95% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12, respectivamente.
[00178] Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB compreende as CDRs das cadeias pesada e leve ou regiões variáveis (VRs, Variable Regions) de utomilumabe. Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada do agonista de 4-1BB (VH) compreende a sequência mostrada em SEQ ID NO:13, e a região variável da cadeia leve do agonista de 4-1BB (VL) compreende a sequência mostrada em SEQ ID NO:14, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 99% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14,
187 / 509 respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 98% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 97% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4- 1BB compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 96% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 95% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende um anticorpo scFv compreendendo regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 99% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14.
[00179] Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende domínios CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada tendo as sequências apresentadas em SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, e SEQ ID NO:17, respectivamente, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas, e domínios CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve tendo as sequências apresentadas em SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, e SEQ ID NO:20, respectivamente, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas.
[00180] Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é um anticorpo monoclonal biossimilar agonista de 4-1BB aprovado pelas autoridades regulatórias de fármacos com referência ao utomilumabe. Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal biossimilar compreende um anticorpo 4- 1BB compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 97% de identidade de sequência, por exemplo, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência, em comparação com a sequência de aminoácidos de um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência e que
188 / 509 compreende uma ou mais modificações pós-traducionais em comparação com o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é utomilumabe.
Em algumas modalidades, as uma ou mais modificações pós- traducionais são selecionadas de uma ou mais dentre: glicosilação, oxidação, desamidação, e truncação.
Em algumas modalidades, o biossimilar é um anticorpo agonista de 4-1BB autorizado ou submetido à autorização, em que o anticorpo agonista de 4-1BB é provido em uma formulação que difere das formulações de um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é utomilumabe.
O anticorpo agonista de 4-1BB pode ser autorizado por uma autoridade regulatória de fármacos como a Norte-Americana FDA (FDA (“Norte-Americana Food and Drug Administration”, Administração de Fármacos e Alimentos dos Estados Unidos) e/ou a Agência Europeia de Medicamentos (EMA, “European Medicines Agency”) da União Europeia.
Em algumas modalidades, o biossimilar é provido como uma composição que compreende, adicionalmente, um ou mais excipientes, em que os um ou mais excipientes são os mesmos que ou diferentes dos excipientes compreendidos em um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é utomilumabe.
Em algumas modalidades, o biossimilar é provido como uma composição que compreende, adicionalmente, um ou mais excipientes, em que os um ou mais excipientes são os mesmos que ou diferentes dos excipientes compreendidos em um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é utomilumabe.
TABELA 4. Sequências de aminoácidos dos anticorpos agonistas de 4- 1BB relacionadas ao utomilumabe.
189 / 509 Identificador Sequência (Símbolos de Aminoácido de Uma Letra) SEQ ID NO:11 EVQLVQSGAE VKKPGESLRI SCKGSGYSFS TYWISWVRQM cadeia pesada de PGKGLEWMGK IYPGDSYTNY 60 utomilumabe SPSFQGQVTI SADKSISTAY LQWSSLKASD TAMYYCARGY GIFDYWGQGT LVTVSSASTK 120
GPSVFPLAPC SRSTSESTAA LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP AVLQSSGLYS 180
LSSVVTVPSS NFGTQTYTCN VDHKPSNTKV DKTVERKCCV ECPPCPAPPV AGPSVFLFPP 240
KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVQF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTFRVVSV 300
LTVVHQDWLN GKEYKCKVSN KGLPAPIEKT ISKTKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL 360
TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PMLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC 420 SVMHEALHNH YTQKSLSLSP G 441 SEQ ID NO:12 SYELTQPPSV SVSPGQTASI TCSGDNIGDQ YAHWYQQKPG QSPVLVIYQD cadeia leve de KNRPSGIPER 60 utomilumabe FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCATY TGFGSLAVFG GGTKLTVLGQ PKAAPSVTLF 120
PPSSEELQAN KATLVCLISD FYPGAVTVAW KADSSPVKAG VETTTPSKQS NNKYAASSYL 180 SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP TECS 214 SEQ ID NO:13 EVQLVQSGAE VKKPGESLRI SCKGSGYSFS TYWISWVRQM PGKGLEWMG região variável KIYPGDSYTN 60 da cadeia pesada YSPSFQGQVT ISADKSISTA YLQWSSLKAS DTAMYYCARG YGIFDYWGQ de utomilumabe GTLVTVSS 118 SEQ ID NO:14 SYELTQPPSV SVSPGQTASI TCSGDNIGDQ YAHWYQQKPG QSPVLVIYQD região variável KNRPSGIPER 60 da cadeia leve de FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCATY TGFGSLAVFG GGTKLTVL 108 utomilumabe SEQ ID NO:15 STYWIS 6 CDR1 da cadeia pesada de utomilumabe SEQ ID NO:16 KIYPGDSYTN YSPSFQG 17 CDR2 da cadeia pesada de utomilumabe SEQ ID NO:17 RGYGIFDY 8 CDR3 da cadeia pesada de utomilumabe SEQ ID NO:18, SGDNIGDQYA H 11 CDR1 da cadeia leve de utomilumabe SEQ ID NO:19 QDKNRPS 7 CDR2 da cadeia leve de utomilumabe SEQ ID NO:20 ATYTGFGSLA V 11 CDR3 da cadeia leve de utomilumabe
[00181] Em uma modalidade preferida, o agonista de 4-1BB é o anticorpo monoclonal urelumabe, também conhecido como BMS-663513 e 20H4.9.h4a, ou um fragmento, um derivado, uma variante, ou um biossimilar
190 / 509 do mesmo. O urelumabe está disponível junto à Bristol-Myers Squibb, Inc., e junto à Creative Biolabs, Inc. O urelumabe é um anticorpo monoclonal de Homo sapiens (completamente humano), imunoglobulina G4-kappa, [anti- membro 9 da superfamília de receptores de fatores de necrose tumoral (TNFRSF9, 4-1BB, antígeno ILA de célula-T, CD137, de Homo sapiens)]. As sequências de aminoácidos de urelumabe são apresentadas na Tabela 5. O urelumabe compreende sítios de N-glicosilação em posições 298 (e 298”); pontes de dissulfeto intracadeia da cadeia pesada nas posições 22-95 (VH-VL), 148-204 (CH1-CL), 262-322 (CH2) e 368-426 (CH3) (e nas posições 22”-95”, 148”-204”, 262”-322”, e 368”-426”); pontes de dissulfeto intracadeia da cadeia leve nas posições 23’-88’ (VH-VL) e 136’-196’ (CH1-CL) (e nas posições 23”‘-88”‘ e 136”‘-196”‘); pontes de dissulfeto intercadeias das cadeia pesada-cadeia pesada nas posições 227-227” e 230-230”; e pontes de dissulfeto intercadeias das cadeia-pesada-cadeia leve em 135-216’ e 135”- 216”‘. A preparação e as propriedades de urelumabe e de suas variantes e de seus fragmentos são descritas em Patentes Norte-Americana nºs 7.288.638 e
8.962.804, cujas descrições são aqui incorporadas como referências. As características pré-clínicas e clínicas de urelumabe são descritas em Segal, et al., Clin. Cancer Res. 2016, disponíveis em http:/dx.doi.org/ 10.1158/1078-
0432.CCR-16-1272. Testes clínicos atuais de urelumabe em uma variedade de indicações hematológicas e de tumor sólido incluem os identificadores NCT01775631, NCT02110082, NCT02253992, e NCT01471210 de Norte- Americana National Institutes of Health clinicaltrials.gov.
[00182] Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende uma cadeia pesada apresentada pela SEQ ID NO:21 e uma cadeia leve apresentada pela SEQ ID NO:22. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende cadeias pesada e leve tendo as sequências mostradas em SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:22, respectivamente, ou fragmentos de ligação ao antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variáveis de cadeia única (scFv),
191 / 509 variantes, ou conjugados dos mesmos. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende cadeias pesada e leve que são, cada, pelo menos 99% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:22, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende cadeias pesada e leve que são, cada, pelo menos 98% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:22, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende cadeias pesada e leve que são, cada, pelo menos 97% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:22, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende cadeias pesada e leve que são, cada, pelo menos 96% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:22, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende cadeias pesada e leve que são, cada, pelo menos 95% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:22, respectivamente.
[00183] Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB compreende as CDRs das cadeias pesada e leve ou regiões variáveis (VRs) de urelumabe. Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada do agonista de 4-1BB (VH) compreende a sequência mostrada em SEQ ID NO:23, e a região variável da cadeia leve do agonista de 4-1BB (VL) compreende a sequência mostrada em SEQ ID NO:24, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 99% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:23 e SEQ ID NO:24, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 98% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:23 e SEQ ID NO:24, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 97% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:23 e SEQ ID NO:24, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende regiões VH e VL que são,
192 / 509 cada, pelo menos 96% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:23 e SEQ ID NO:24, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4- 1BB compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 95% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:23 e SEQ ID NO:24, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende um anticorpo scFv compreendendo regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 99% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:23 e SEQ ID NO:24.
[00184] Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende domínios CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada tendo as sequências apresentadas em SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, e SEQ ID NO:27, respectivamente, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas, e domínios CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve tendo as sequências apresentadas em SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, e SEQ ID NO:30, respectivamente, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas.
[00185] Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é um anticorpo monoclonal biossimilar agonista de 4-1BB aprovado pelas autoridades regulatórias de fármacos com referência ao urelumabe. Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal biossimilar compreende um anticorpo 4-1BB compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 97% de identidade de sequência, por exemplo, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência, em comparação com a sequência de aminoácidos de um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência e que compreende uma ou mais modificações pós-traducionais em comparação com o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é urelumabe. Em algumas modalidades, as uma ou mais modificações pós- traducionais são selecionadas de uma ou mais dentre: glicosilação, oxidação, desamidação, e truncação. Em algumas modalidades, o biossimilar é um anticorpo agonista de 4-1BB autorizado ou submetido à autorização, em que o
193 / 509 anticorpo agonista de 4-1BB é provido em uma formulação que difere das formulações de um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é urelumabe. O anticorpo agonista de 4-1BB pode ser autorizado por uma autoridade regulatória de fármacos como a Norte-Americana FDA (“Norte-Americana Food and Drug Administration”, Administração de Fármacos e Alimentos dos Estados Unidos) e/ou a Agência Europeia de Medicamentos (EMA, “European Medicines Agency”) da União Europeia. Em algumas modalidades, o biossimilar é provido como uma composição que compreende, adicionalmente, um ou mais excipientes, em que os um ou mais excipientes são os mesmos que ou diferentes dos excipientes compreendidos em um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é urelumabe. Em algumas modalidades, o biossimilar é provido como uma composição que compreende, adicionalmente, um ou mais excipientes, em que os um ou mais excipientes são os mesmos que ou diferentes dos excipientes compreendidos em um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é urelumabe. TABELA 5. Sequências de aminoácidos dos anticorpos agonistas de 4- 1BB relacionadas ao urelumabe. Identificador Sequência (Símbolos de Aminoácido de Uma Letra)
SEQ ID QVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVYGGSFS GYYWSWIRQS NO:21 cadeia PEKGLEWIGE INHGGYVTYN 60 pesada de PSLESRVTIS VDTSKNQFSL KLSSVTAADT AVYYCARDYG PGNYDWYFDL urelumabe WGRGTLVTVS 120
SASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS 180
SGLYSLSSVV TVPSSSLGTK TYTCNVDHKP SNTKVDKRVE SKYGPPCPPC PAPEFLGGPS 240
VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST 300
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMT 360
KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE 420 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK 448
194 / 509
SEQ ID EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD NO:22 cadeia ASNRATGIPA 60 leve de RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPPALTF CGGTKVEIKR urelumabe TVAAPSVFIF 120
PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST 180 LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC 216
SEQ ID MKHLWFFLLL VAAPRWVLSQ VQLQQWGAGL LKPSETLSLT NO:23 cadeia CAVYGGSFSG YYWSWIRQSP 60 pesada EKGLEWIGEI NHGGYVTYNP SLESRVTISV DTSKNQFSLK LSSVTAADTA variável de VYYCARDYGP 120 urelumabe
SEQ ID MEAPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS NO:24 cadeia SYLAWYQQKP 60 leve variável GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ de urelumabe 110 SEQ ID GYYWS 5 NO:25 CDR1 da cadeia pesada de urelumabe SEQ ID EINHGGYVTY NPSLES 16 NO:26 CDR2 da cadeia pesada de urelumabe SEQ ID DYGPGNYDWY FDL 13 NO:27 CDR3 da cadeia pesada de urelumabe SEQ ID RASQSVSSYL A 11 NO:28 CDR1 da cadeia leve de urelumabe SEQ ID DASNRAT 7 NO:29 CDR2 da cadeia leve de urelumabe SEQ ID QQRSDWPPAL T 11 NO:30 CDR3 da cadeia leve de urelumabe
[00186] Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é selecionado a partir do grupo consistindo em 1D8, 3Elor, 4B4 (BioLegend 309809), H4- 1BB-M127 (BD Pharmingen 552532), BBK2 (Thermo Fisher MS621PABX), 145501 (Leinco Technologies B591), o anticorpo produzido pela linhagem celular depositada como ATCC No. HB-11248 e revelado na Patente Norte- Americana nº 6.974.863, 5F4 (BioLegend 31 1503), C65-485 (BD Pharmingen 559446), anticorpos revelados em Publicação de Pedido de Patente Norte-Americana nº US 2005/0095244, anticorpos revelados em
195 / 509 Patente Norte-Americana nº 7.288.638 (como 20H4.9-IgG1 (BMS-663031)), anticorpos revelados em Patente Norte-Americana nº 6.887.673 (como 4E9 ou BMS-554271), anticorpos revelados em Patente Norte-Americana nº
7.214.493, anticorpos revelados em Patente Norte-Americana nº 6.303.121, anticorpos revelados em Patente Norte-Americana nº 6.569.997, anticorpos revelados em Patente Norte-Americana nº 6.905.685 (como 4E9 ou BMS- 554271), anticorpos revelados em Patente Norte-Americana nº 6.362.325 (como 1D8 ou BMS-469492; 3H3 ou BMS-469497; ou 3E1), anticorpos revelados em Patente Norte-Americana nº 6.974.863 (como 53A2); anticorpos revelados em Patente Norte-Americana nº 6.210.669 (como 1D8, 3B8, ou 3E1), anticorpos descritos em Patente Norte-Americana nº 5.928.893, anticorpos revelados em Patente Norte-Americana nº 6.303.121, anticorpos revelados em Patente Norte-Americana nº 6.569.997, anticorpos revelados em Publicações de Pedidos de Patente Internacionais nºs WO 2012/177788, WO 2015/119923, e WO 2010/042433, e fragmentos, derivados, conjugados, variantes, ou biossimilares dos mesmos, em que a descrição de cada uma das patentes ou publicações de pedido de patente supracitadas é aqui incorporada como referência.
[00187] Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é uma proteína de fusão agonística de 4-1BB descrita em Publicações de Pedidos de Patente Internacionais nºs WO 2008/025516 A1, WO 2009/007120 A1, WO 2010/003766 A1, WO 2010/010051 A1, e WO 2010/078966 A1; Publicações de Pedidos de Patente Norte-Americana nºs US 2011/0027218 A1, US 2015/0126709 A1, US 2011/0111494 A1, US 2015/0110734 A1, e US 2015/0126710 A1; e Patentes Norte-Americana nºs 9.359.420, 9.340.599,
8.921.519, e 8.450.460, cujas descrições são aqui incorporadas como referências.
[00188] Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é uma proteína de fusão agonística de 4-1BB conforme representada pela Estrutura I-A (proteína
196 / 509 de fusão de fragmento de anticorpo-Fc C-terminal) ou Estrutura I-B (proteína de fusão de fragmento de anticorpo-Fc N-terminal), ou um fragmento, um derivado, um conjugado, uma variante, ou um biossimilar da mesma:
[00189] Nas estruturas I-A e I-B, os cilindros referem-se aos domínios ligantes de polipeptídeo individuais. As estruturas I-A e I-B compreendem três domínios ligantes de TNFRSF linearmente ligados derivados de por exemplo, 4-1BBL ou um anticorpo que se liga à 4-1BB, que se dobra para formar uma proteína trivalente, que é então ligada a uma segunda proteína trivalente mediante IgG1-Fc (incluindo domínios CH3 e CH2) é então usada para ligar duas das proteínas trivalentes juntas mediantes ligações dissulfeto (ovais alongadas pequenas), estabilizando a estrutura e provendo um agonista capaz de unir os domínios de sinalização intracelular dos seis receptores e das proteínas de sinalização para formar um complexo de sinalização. Os domínios ligantes de TNFRSF denotados como cilindros podem ser domínio de scFv compreendendo, por exemplo, uma cadeia VH e uma cadeia VL conectadas por um linker que pode compreender resíduos hidrofílicos e sequências com Gly e Ser para flexibilidade, e também com Glu e Lys para solubilidade. Qualquer desenho de domínio de scFv pode ser usado, como
197 / 509 aqueles descritos em de Marco, Microbial Cell Factories, 2011, 10, 44; Ahmad, et al., Clin. & Dev. Immunol. 2012, 980250; Monnier, et al., Antibodies, 2013, 2, 193-208; ou nas referência incorporadas aqui alhures. Estruturas de proteína de fusão desta forma são descritas em Patentes Norte- Americana nºs 9.359.420, 9.340.599, 8.921.519, e 8.450.460, cujas descrições são aqui incorporadas como referências.
[00190] As sequências de aminoácidos dos outros domínios de polipeptídeo da estrutura I-A são apresentadas na Tabela 6. O domínio de Fc preferivelmente compreende um domínio constante completo (aminoácidos 17-230 de SEQ ID NO:31) o domínio de dobradiça completo (aminoácidos 1- 16 de SEQ ID NO:31) ou uma porção do domínio de dobradiça (por exemplo, aminoácidos 4-16 de SEQ ID NO:31). Os linkers preferidos para conexão de um anticorpo-Fc C-terminal podem ser selecionados das modalidades apresentadas nas SEQ ID NO:32 a SEQ ID NO:41, incluindo os linkers adequados para fusão de polipeptídeos adicionais. TABELA 6. Sequências de aminoácidos das proteínas de fusão TNFRSF, incluindo proteínas de fusão 4-1BB, com desenho de proteína de fusão de fragmento de anticorpo-Fc C-terminal (estrutura I-A). Identificador Sequência (Símbolos de Aminoácido de Uma Letra) SEQ ID NO:31 KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS domínio de Fc HEDPEVKFNW 60
YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS 120
KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 180
LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 230 SEQ ID NO:32 GGPGSSKSCD KTHTCPPCPA PE 22 linker SEQ ID NO:33 GGSGSSKSCD KTHTCPPCPA PE 22 linker SEQ ID NO:34 GGPGSSSSSS SKSCDKTHTC PPCPAPE 27 linker SEQ ID NO:35 GGSGSSSSSS SKSCDKTHTC PPCPAPE 27 linker SEQ ID NO:36 GGPGSSSSSS SSSKSCDKTH TCPPCPAPE 29 linker SEQ ID NO:37 GGSGSSSSSS SSSKSCDKTH TCPPCPAPE 29 linker SEQ ID NO:38 GGPGSSGSGS SDKTHTCPPC PAPE 24 linker
198 / 509 SEQ ID NO:39 GGPGSSGSGS DKTHTCPPCP APE 23 linker SEQ ID NO:40 GGPSSSGSDK THTCPPCPAP E 21 linker SEQ ID NO:41 GGSSSSSSSS GSDKTHTCPP CPAPE 25 linker
[00191] Sequências de aminoácidos dos outros domínios de polipeptídeo de estrutura I-B são apresentadas na Tabela 7. Se um fragmento de anticorpo Fc está fusionado na terminação-N de uma proteína de fusão TNRFSF como na estrutura I-B, a sequência do módulo Fc é preferivelmente aquela mostrada em SEQ ID NO:42, e as sequências de linker são preferivelmente selecionadas daquelas modalidades apresentadas em SEQ ID NO:43 a SEQ ID NO:45. TABELA 7. Sequências de aminoácidos das proteínas de fusão TNFRSF, incluindo as proteínas de fusão 4-1BB, com desenho de proteína de fusão de fragmento de anticorpo-Fc N-terminal (estrutura I-B). Identificador Sequência (Símbolos de Aminoácido de Uma Letra)
SEQ ID METDTLLLWV LLLWVPAGNG DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT NO:42 LMISRTPEVT 60 domínio de Fc CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK 120
CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 180
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS 240 LSLSPG 246 SEQ ID SGSGSGSGSG S 11 NO:43 linker SEQ ID SSSSSSGSGS GS 12 NO:44 linker SEQ ID SSSSSSGSGS GSGSGS 16 NO:45 linker
[00192] Em uma modalidade, um agonista de proteína de fusão 4-1BB de acordo com as estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios ligantes de 4-1BB selecionados a partir do grupo consistindo em uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável de utomilumabe, uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável de urelumabe, uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável de utomilumabe, uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável selecionadas das cadeias pesadas variáveis
199 / 509 e cadeias leves variáveis descritas na Tabela 8, qualquer combinação de uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável das supracitadas, e fragmentos, derivados, conjugados, variantes, e biossimilares das mesmas.
[00193] Em uma modalidade, um agonista de proteína de fusão 4-1BB de acordo com as estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios ligantes de 4-1BB compreendendo uma sequência de 4-1BB. Em uma modalidade, um agonista de proteína de fusão 4-1BB de acordo com as estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios ligantes de 4-1BB compreendendo uma sequência de acordo com a SEQ ID NO:46. Em uma modalidade, um agonista de proteína de fusão 4-1BB de acordo com as estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios ligantes de 4-1BB compreendendo uma sequência de 4-1BB solúvel. Em uma modalidade, um agonista de proteína de fusão 4-1BB de acordo com as estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios ligantes de 4-1BB compreendendo uma sequência de acordo com a SEQ ID NO:47.
[00194] Em uma modalidade, um agonista de proteína de fusão 4-1BB de acordo com as estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios ligantes de 4-1BB que é um domínio de scFV compreendendo regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 95% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14, respectivamente, em que os domínios de VH e VL são conectados por um linker. Em uma modalidade, um agonista de proteína de fusão 4-1BB de acordo com as estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios ligantes de 4-1BB que é um domínio de scFV compreendendo regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 95% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:23 e SEQ ID NO:24, respectivamente, em que os domínios de VH e VL são conectados por um linker. Em uma modalidade, um agonista de proteína de fusão 4-1BB de acordo com as estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios ligantes de 4-1BB que é um domínio de scFV compreendendo regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 95%
200 / 509 idênticas às sequências de VH e VL apresentadas na Tabela 8, em que os domínios de VH e VL são conectados por um linker. TABELA 8. Domínios de polipeptídeo adicionais úteis como domínios ligantes de 4-1BB em proteínas de fusão ou como anticorpos scFv agonistas de 4-1BB. Identificador Sequência (Símbolos de Aminoácido de Uma Letra) SEQ ID NO:46 MEYASDASLD PEAPWPPAPR ARACRVLPWA LVAGLLLLLL 4-1BBL LAAACAVFLA CPWAVSGARA 60
SPGSAASPRL REGPELSPDD PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL 120
TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA 180
LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV 240 TPEIPAGLPS PRSE 254 SEQ ID NO:47 LRQGMFAQLV AQNVLLIDGP LSWYSDPGLA GVSLTGGLSY domínio solúvel KEDTKELVVA KAGVYYVFFQ 60 de 4-1BBL LELRRVVAGE GSGSVSLALH LQPLRSAAGA AALALTVDLP PASSEARNSA FGFQGRLLHL 120 SAGQRLGVHL HTEARARHAW QLTQGATVLG LFRVTPEIPA GLPSPRSE 68 SEQ ID NO:48 QVQLQQPGAE LVKPGASVKL SCKASGYTFS SYWMHWVKQR cadeia pesada PGQVLEWIGE INPGNGHTNY 60 variável de 4B4- NEKFKSKATL TVDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARSF 1-1 versão 1 TTARGFAYWG QGTLVTVS 118 SEQ ID NO:49 DIVMTQSPAT QSVTPGDRVS LSCRASQTIS DYLHWYQQKS HESPRLLIKY cadeia leve ASQSISGIPS 60 variável de 4B4- RFSGSGSGSD FTLSINSVEP EDVGVYYCQD GHSFPPTFGG GTKLEIK 107 1-1 versão 1 SEQ ID NO:50 QVQLQQPGAE LVKPGASVKL SCKASGYTFS SYWMHWVKQR cadeia pesada PGQVLEWIGE INPGNGHTNY 60 variável de 4B4- NEKFKSKATL TVDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARSF 1-1 versão 2 TTARGFAYWG QGTLVTVSA 119 SEQ ID NO:51 DIVMTQSPAT QSVTPGDRVS LSCRASQTIS DYLHWYQQKS HESPRLLIKY cadeia leve ASQSISGIPS 60 variável de 4B4- RFSGSGSGSD FTLSINSVEP EDVGVYYCQD GHSFPPTFGG GTKLEIKR 108 1-1 versão 2 SEQ ID NO:52 MDWTWRILFL VAAATGAHSE VQLVESGGGL VQPGGSLRLS cadeia pesada CAASGFTFSD YWMSWVRQAP 60 variável de GKGLEWVADI KNDGSYTNYA PSLTNRFTIS RDNAKNSLYL H39E3-2 QMNSLRAEDT AVYYCARELT 120 SEQ ID NO:53 MEAPAQLLFL LLLWLPDTTG DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKSSQSLL cadeia leve SSGNQKNYL 60 variável de WYQQKPGQPP KLLIYYASTR QSGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA H39E3-2 110
[00195] Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é um polipeptídeo de fusão de cadeia única agonístico de 4-1BB compreendendo (i) um primeiro domínio ligante de 4-1BB solúvel, (ii) um primeiro linker de peptídeo, (iii) um segundo domínio ligante de 4-1BB solúvel, (iv) um segundo linker de peptídeo, e (v) um terceiro domínio ligante de 4-1BB solúvel,
201 / 509 compreendendo, ainda, um domínio adicional na extremidade N-terminal e/ou C-terminal, e em que o domínio adicional é um domínio de fragmento Fab ou Fc. Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é um polipeptídeo de fusão de cadeia única agonístico de 4-1BB compreendendo (i) um primeiro domínio ligante de 4-1BB solúvel, (ii) um primeiro linker de peptídeo, (iii) um segundo domínio ligante de 4-1BB solúvel, (iv) um segundo linker de peptídeo, e (v) um terceiro domínio ligante de 4-1BB solúvel, compreendendo, ainda, um domínio adicional na extremidade N-terminal e/ou C-terminal, em que o domínio adicional é um domínio de fragmento Fab ou Fc, em que cada um dos domínios de 4-1BB solúveis não possui uma região em haste (que contribui para a trimerização e provê uma determinada distância à membrana celular, mas não é parte do domínio ligante de 4-1BB) e os primeiro e segundo linkers de peptídeo independentemente têm um comprimento de 3-8 aminoácidos.
[00196] Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é um polipeptídeo de fusão de cadeia única agonístico de 4-1BB compreendendo (i) um primeiro domínio de citocina da superfamília de fatores de necrose tumoral (TNF) solúvel, (ii) um primeiro linker de peptídeo, (iii) um segundo domínio de citocina da superfamília de TNF solúvel, (iv) um segundo linker de peptídeo, e (v) um terceiro domínio de citocina da superfamília de TNF solúvel, em que cada um dos domínios de citocina da superfamília de TNF solúveis não possui uma região em haste e os primeiro e segundo linkers de peptídeo independentemente têm um comprimento de 3-8 aminoácidos, e em que cada domínio de citocina da superfamília de TNF é um domínio ligante de 4-1BB.
[00197] Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é um anticorpo scFv agonístico de 4-1BB compreendendo qualquer um dos domínios de VH supracitados ligados a qualquer um dos domínios de VL supracitados.
[00198] Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é anticorpo agonista de 4-1BB da BPS Bioscience, de número de catálogo de 79097-2,
202 / 509 comercialmente disponível junto à BPS Bioscience, San Diego, CA, EUA. Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é anticorpo agonista de 4-1BB da Creative Biolabs, de número de catálogo de MOM-18179, comercialmente disponível junto à Creative Biolabs, Shirley, NY, EUA.
3. Agonistas de OX40 (CD134)
[00199] Em uma modalidade, o agonista de TNFRSF é um agonista de OX40 (CD134). O agonista de OX40 pode ser qualquer molécula ligante de OX40 conhecida na técnica. A molécula ligante de OX40 pode ser um anticorpo monoclonal ou uma proteína de fusão capaz de ligação à OX40 de humano ou de mamífero. Os agonistas de OX40 ou as moléculas ligantes de OX40 podem compreender uma cadeia pesada de imunoglobulina de qualquer isótipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina. O agonista de OX40 ou a molécula ligante de OX40 pode ter ambas uma cadeia pesada e uma cadeia leve. Como aqui usado, o termo molécula ligante também inclui anticorpos (incluindo anticorpos de comprimento completo), anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento completo), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), anticorpos humanos, humanizados ou quiméricos, e fragmentos de anticorpos, por exemplo, fragmentos Fab, fragmentos F(ab′), fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, fragmentos de ligação ao epítopo de qualquer um dos supracitados, e formas modificadas de anticorpos, por exemplo, moléculas de scFv, que se ligam à OX40. Em uma modalidade, o agonista de OX4 é uma proteína de ligação ao antígeno que é um anticorpo completamente humano. Em uma modalidade, o agonista de OX4 é uma proteína de ligação ao antígeno que é um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades, os anticorpos OX40 para uso nos métodos presentemente revelados e nas composições presentemente reveladas incluem anticorpos
203 / 509 anti-OX40, anticorpos de humano anti-OX40, anticorpos de camundongo anti-OX40, anticorpos de mamífero anti-OX40, anticorpos monoclonais anti- OX40, anticorpos policlonais anti-OX40, anticorpos quiméricos anti-OX40, adenectinas anti-OX40, anticorpos anti-domínio-de-OX40, fragmentos de cadeia única anti-OX40, fragmentos de cadeia pesada anti-OX40, fragmentos de cadeia leve anti-OX40, proteínas de fusão anti-OX40, e fragmentos, derivados, conjugados, variantes, ou biossimilares dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o agonista de OX4 é um anticorpo monoclonal (isto é, um anticorpo derivado de uma linhagem celular única), humanizado ou completamente humano, agonístico, anti-OX40.
[00200] Em uma modalidade preferida, o agonista de OX40 ou a molécula ligante de OX40 pode também ser uma proteína de fusão. As proteínas de fusão OX40 compreendendo um domínio de Fc fusionado em OX40L são descritas, por exemplo, em Sadun, et al., J. Immunother. 2009, 182, 1481-89. Em uma modalidade preferida, um agonista multimérico de OX40, como um agonista trimérico ou hexamérico de OX40 (com três ou seis domínios de ligação ao ligante), pode induzir agrupamento de receptores superiores (OX40) e formação de complexo de sinalização celular interna em comparação com um anticorpo monoclonal, agonístico, que tipicamente possui dois domínios de ligação ao ligante. Proteínas de fusão triméricas (trivalentes) ou hexaméricas (ou hexavalentes) ou superiores compreendendo três domínios ligantes de TNFRSF e IgG1-Fc e opcionalmente adicionalmente ligando duas ou mais destas proteínas de fusão são descritas, por exemplo, em Gieffers, et al., Mol. Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-
47.
[00201] É sabido que os anticorpos agonísticos de OX40 e as proteínas de fusão agonísticas induzem respostas imunes fortes. Curti, et al., Cancer Res. 2013, 73, 7189-98. Em uma modalidade preferida, o agonista de OX4 é um anticorpo monoclonal ou uma proteína de fusão que se liga
204 / 509 especificamente ao antígeno OX40 em uma maneira suficiente para reduzir a toxicidade. Em algumas modalidades, o agonista de OX4 é um anticorpo monoclonal agonístico de OX40 ou uma proteína de fusão agonística de OX40 que anula a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), por exemplo a citotoxicidade de células NK. Em algumas modalidades, o agonista de OX4 é um anticorpo monoclonal agonístico de OX40 ou uma proteína de fusão agonística de OX40 que anula a fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP). Em algumas modalidades, o agonista de OX4 é um anticorpo monoclonal agonístico de OX40 ou uma proteína de fusão agonística de OX40 que anula a citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Em algumas modalidades, o agonista de OX4 é um anticorpo monoclonal agonístico de OX40 ou uma proteína de fusão agonística de OX40 que anula a funcionalidade da região Fc.
[00202] Em algumas modalidades, os agonistas de OX40 são distinguidos pela ligação à OX40 humana (SEQ ID NO:54) com alta afinidade e alta atividade agonística. Em uma modalidade, o agonista de OX4 é uma molécula ligante que se liga à OX40 humana (SEQ ID NO:54). Em uma modalidade, o agonista de OX4 é uma molécula ligante que se liga à OX40 murina (SEQ ID NO:55). As sequências de aminoácidos do antígeno OX40 ao qual um agonista de OX40 ou uma molécula ligante de OX40 se liga são resumidas na Tabela 9. TABELA 9. Sequências de aminoácidos de antígenos OX40. Identificador Sequência (Símbolos de Aminoácido de Uma Letra) SEQ ID NO:54 MCVGARRLGR GPCAALLLLG LGLSTVTGLH CVGDTYPSND RCCHECRPGN OX40 humana GMVSRCSRSQ 60 (Homo NTVCRPCGPG FYNDVVSSKP CKPCTWCNLR SGSERKQLCT ATQDTVCRCR sapiens) AGTQPLDSYK 120
PGVDCAPCPP GHFSPGDNQA CKPWTNCTLA GKHTLQPASN SSDAICEDRD PPATQPQETQ 180
GPPARPITVQ PTEAWPRTSQ GPSTRPVEVP GGRAVAAILG LGLVLGLLGP LAILLALYLL 240 RRDQRLPPDA HKPPGGGSFR TPIQEEQADA HSTLAKI 277
205 / 509 SEQ ID NO:55 MYVWVQQPTA LLLLGLTLGV TARRLNCVKH TYPSGHKCCR OX40 murina ECQPGHGMVS RCDHTRDTLC 60 (Mus HPCETGFYNE AVNYDTCKQC TQCNHRSGSE LKQNCTPTQD TVCRCRPGTQ musculus) PRQDSGYKLG 120
VDCVPCPPGH FSPGNNQACK PWTNCTLSGK QTRHPASDSL DAVCEDRSLL ATLLWETQRP 180
TFRPTTVQST TVWPRTSELP SPPTLVTPEG PAFAVLLGLG LGLLAPLTVL LALYLLRKAW 240 RLPNTPKPCW GNSFRTPIQE EHTDAHFTLA KI 272
[00203] Em algumas modalidades, as composições, os processos e os métodos descritos(as) incluem um agonista de OX40 que se liga à OX40 humana ou murina com uma KD de cerca de 100 pM ou mais baixa, que se liga à OX40 humana ou murina com uma KD de cerca de 90 pM ou mais baixa, que se liga à OX40 humana ou murina com uma KD de cerca de 80 pM ou mais baixa, que se liga à OX40 humana ou murina com uma KD de cerca de 70 pM ou mais baixa, que se liga à OX40 humana ou murina com uma KD de cerca de 60 pM ou mais baixa, que se liga à OX40 humana ou murina com uma KD de cerca de 50 pM ou mais baixa, que se liga à OX40 humana ou murina com uma KD de cerca de 40 pM ou mais baixa, ou que se liga à OX40 humana ou murina com uma KD de cerca de 30 pM ou mais baixa.
[00204] Em algumas modalidades, as composições, os processos e os métodos descritos(as) incluem um agonista de OX40 que se liga à OX40 humana ou murina com uma kassoc de cerca de 7,5×105 1/M·s ou mais rápida, que se liga à OX40 humana ou murina com uma kassoc de cerca de 7,5×105 1/M·s ou mais rápida, que se liga à OX40 humana ou murina com uma kassoc de cerca de 8×105 1/M·s ou mais rápida, que se liga à OX40 humana ou murina com uma kassoc de cerca de 8,5×105 1/M·s ou mais rápida, que se liga à OX40 humana ou murina com uma kassoc de cerca de 9×105 1/M·s ou mais rápida, que se liga à OX40 humana ou murina com uma kassoc de cerca de 9,5×105 1/M·s ou mais rápida, ou que se liga à OX40 humana ou murina com uma kassoc de cerca de 1×106 1/M·s ou mais rápida.
[00205] Em algumas modalidades, as composições, os processos e os métodos descritos(as) incluem um agonista de OX40 que se liga à OX40 humana ou murina com uma kdissoc de cerca de 2×10-5 1/s ou mais lenta, que
206 / 509 se liga à OX40 humana ou murina com uma kdissoc de cerca de 2,1×10-5 1/s ou mais lenta, que se liga à OX40 humana ou murina com uma kdissoc de cerca de 2,2×10-5 1/s ou mais lenta, que se liga à OX40 humana ou murina com uma kdissoc de cerca de 2,3×10-5 1/s ou mais lenta, que se liga à OX40 humana ou murina com uma kdissoc de cerca de 2,4×10-5 1/s ou mais lenta, que se liga à OX40 humana ou murina com uma kdissoc de cerca de 2,5×10-5 1/s ou mais lenta, que se liga à OX40 humana ou murina com uma kdissoc de cerca de 2,6×10-5 1/s ou mais lenta ou que se liga à OX40 humana ou murina com uma kdissoc de cerca de 2,7×10-5 1/s ou mais lenta, que se liga à OX40 humana ou murina com uma kdissoc de cerca de 2,8×10-5 1/s ou mais lenta, que se liga à OX40 humana ou murina com uma kdissoc de cerca de 2,9×10-5 1/s ou mais lenta, ou que se liga à OX40 humana ou murina com uma kdissoc de cerca de 3×10-5 1/s ou mais lenta.
[00206] Em algumas modalidades, as composições, os processos e os métodos descritos(as) incluem agonista de OX40 que se liga à OX40 humana ou murina com uma CI50 de cerca de 10 nM ou mais baixa, que se liga à OX40 humana ou murina com uma CI50 de cerca de 9 nM ou mais baixa, que se liga à OX40 humana ou murina com uma CI50 de cerca de 8 nM ou mais baixa, que se liga à OX40 humana ou murina com uma CI50 de cerca de 7 nM ou mais baixa, que se liga à OX40 humana ou murina com uma CI50 de cerca de 6 nM ou mais baixa, que se liga à OX40 humana ou murina com uma CI50 de cerca de 5 nM ou mais baixa, que se liga à OX40 humana ou murina com uma CI50 de cerca de 4 nM ou mais baixa, que se liga à OX40 humana ou murina com uma CI50 de cerca de 3 nM ou mais baixa, que se liga à OX40 humana ou murina com uma CI50 de cerca de 2 nM ou mais baixa, ou que se liga à OX40 humana ou murina com uma CI50 de cerca de 1 nM ou mais baixa.
[00207] Em algumas modalidades, o agonista de OX4 é tavolixizumabe, também conhecido como MEDI0562 ou MEDI-0562. O
207 / 509 tavolixizumabe está disponível junto à MedImmune, uma subsidiária da AstraZeneca, Inc. O tavolixizumabe é um anticorpo monoclonal humanizado ou quimérico, imunoglobulina G1-kappa, anti-[membro 4 da superfamília de receptores de fatores de necrose tumoral (TNFRSF4, Tumor Necrosis Factor Receptor (TNFR) Superfamily Member 4, OX40, CD134, de Homo sapiens)]. As sequências de aminoácidos de tavolixizumabe são apresentadas na Tabela
10. O tavolixizumabe compreende sítios de N-glicosilação em posições 301 e 301”, com glicanas do tipo-CHO biantenárias complexas fucosiladas; pontes de dissulfeto intracadeia da cadeia pesada nas posições 22-95 (VH-VL), 148- 204 (CH1-CL), 265-325 (CH2) e 371-429 (CH3) (e nas posições 22”-95”, 148”- 204”, 265”-325”, e 371”-429”); pontes de dissulfeto intracadeia da cadeia leve nas posições 23’-88’ (VH-VL) e 134’-194’ (CH1-CL) (e nas posições 23”‘- 88”‘ e 134”‘-194”‘); pontes de dissulfeto intercadeias das cadeia pesada- cadeia pesada nas posições 230-230” e 233-233”; e pontes de dissulfeto intercadeias das cadeia-pesada-cadeia leve em 224-214’ e 224”-214”‘. Testes clínicos atuais de tavolixizumabe em uma variedade de indicações de tumor sólido incluem os identificadores NCT02318394 e NCT02705482 de Norte- Americana National Institutes of Health clinicaltrials.gov.
[00208] Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende uma cadeia pesada apresentada pela SEQ ID NO:56 e uma cadeia leve apresentada pela SEQ ID NO:57. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende cadeias pesada e leve tendo as sequências mostradas em SEQ ID NO:56 e SEQ ID NO:57, respectivamente, ou fragmentos de ligação ao antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variáveis de cadeia única (scFv), variantes, ou conjugados dos mesmos. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende cadeias pesada e leve que são, cada, pelo menos 99% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:56 e SEQ ID NO:57, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende cadeias pesada e leve que são, cada, pelo menos 98% idênticas às sequências mostradas em
208 / 509 SEQ ID NO:56 e SEQ ID NO:57, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende cadeias pesada e leve que são, cada, pelo menos 97% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:56 e SEQ ID NO:57, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende cadeias pesada e leve que são, cada, pelo menos 96% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:56 e SEQ ID NO:57, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende cadeias pesada e leve que são, cada, pelo menos 95% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:56 e SEQ ID NO:57, respectivamente.
[00209] Em uma modalidade, o agonista de OX40 compreende as CDRs das cadeias pesada e leve ou regiões variáveis (VRs) de tavolixizumabe. Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada (VH) do agonista de OX40 compreende a sequência mostrada em SEQ ID NO:58, e a região variável da cadeia leve (VL) do agonista de OX40 compreende a sequência mostrada em SEQ ID NO:59, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 99% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:58 e SEQ ID NO:59, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 98% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:58 e SEQ ID NO:59, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 97% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:58 e SEQ ID NO:59, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 96% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:58 e SEQ ID NO:59, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 95% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:58 e SEQ ID NO:59, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40
209 / 509 compreende um anticorpo scFv compreendendo regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 99% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:58 e SEQ ID NO:59.
[00210] Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende domínios CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada tendo as sequências apresentadas em SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, e SEQ ID NO:62, respectivamente, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas, e domínios CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve tendo as sequências apresentadas em SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, e SEQ ID NO:65, respectivamente, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas.
[00211] Em uma modalidade, o agonista de OX4 é um anticorpo monoclonal biossimilar agonista de OX40 aprovado pelas autoridades regulatórias de fármacos com referência ao tavolixizumabe. Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal biossimilar compreende um anticorpo OX40 compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 97% de identidade de sequência, por exemplo, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência, em comparação com a sequência de aminoácidos de um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência e que compreende uma ou mais modificações pós-traducionais em comparação com o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é tavolixizumabe. Em algumas modalidades, as uma ou mais modificações pós- traducionais são selecionadas de uma ou mais dentre: glicosilação, oxidação, desamidação, e truncação. Em algumas modalidades, o biossimilar é um anticorpo agonista de OX40 autorizado ou submetido à autorização, em que o anticorpo agonista de OX40 é provido em uma formulação que difere das formulações de um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é tavolixizumabe. O anticorpo agonista de OX40 pode ser
210 / 509 autorizado por uma autoridade regulatória de fármacos como a Norte- Americana FDA (“Norte-Americana Food and Drug Administration”, Administração de Fármacos e Alimentos dos Estados Unidos) e/ou a Agência Europeia de Medicamentos (EMA, “European Medicines Agency”) da União Europeia. Em algumas modalidades, o biossimilar é provido como uma composição que compreende, adicionalmente, um ou mais excipientes, em que os um ou mais excipientes são os mesmos que ou diferentes dos excipientes compreendidos em um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é tavolixizumabe. Em algumas modalidades, o biossimilar é provido como uma composição que compreende, adicionalmente, um ou mais excipientes, em que os um ou mais excipientes são os mesmos que ou diferentes dos excipientes compreendidos em um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é tavolixizumabe. TABELA 10. Sequências de aminoácidos dos anticorpos agonistas de OX40 relacionadas ao tavolixizumabe. Identificador Sequência (Símbolos de Aminoácido de Uma Letra) SEQ ID NO:56 QVQLQESGPG LVKPSQTLSL TCAVYGGSFS SGYWNWIRKH PGKGLEYIGY cadeia pesada ISYNGITYHN 60 de PSLKSRITIN RDTSKNQYSL QLNSVTPEDT AVYYCARYKY DYDGGHAMDY tavolixizumabe WGQGTLVTVS 120
SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS 180
SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPELLG 240
GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY 300
NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE 360
EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR 420 WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K 451 SEQ ID NO:57 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY cadeia leve de TSKLHSGVPS 60 tavolixizumabe RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDFATYYCQQ GSALPWTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP 120
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT 180 LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC 214
211 / 509 SEQ ID NO:58 QVQLQESGPG LVKPSQTLSL TCAVYGGSFS SGYWNWIRKH PGKGLEYIGY região variável ISYNGITYHN 60 da cadeia PSLKSRITIN RDTSKNQYSL QLNSVTPEDT AVYYCARYKY DYDGGHAMDY pesada de WGQGTLVT 118 tavolixizumabe SEQ ID NO:59 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY região variável TSKLHSGVPS 60 da cadeia leve RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDFATYYCQQ GSALPWTFGQ GTKVEIKR 108 de tavolixizumabe SEQ ID NO:60 GSFSSGYWN 9 CDR1 da cadeia pesada de tavolixizumabe SEQ ID NO:61 YIGYISYNGI TYH 13 CDR2 da cadeia pesada de tavolixizumabe SEQ ID NO:62 RYKYDYDGGH AMDY 14 CDR3 da cadeia pesada de tavolixizumabe SEQ ID NO:63 QDISNYLN 8 CDR1 da cadeia leve de tavolixizumabe SEQ ID NO:64 LLIYYTSKLH S 11 CDR2 da cadeia leve de tavolixizumabe SEQ ID NO:65 QQGSALPW 8 CDR3 da cadeia leve de tavolixizumabe
[00212] Em algumas modalidades, o agonista de OX4 é 11D4, que é um anticorpo completamente humano disponível junto à Pfizer, Inc. A preparação e as propriedades de 11D4 são descritas em Patentes Norte- Americana nºs 7.960.515; 8.236.930; e 9.028.824, cujas descrições são aqui incorporadas como referências. As sequências de aminoácidos de 11D4 são apresentadas na Tabela 11.
[00213] Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende uma cadeia pesada apresentada pela SEQ ID NO:66 e uma cadeia leve apresentada pela SEQ ID NO:67. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende cadeias pesada e leve tendo as sequências mostradas em SEQ ID NO:66 e SEQ ID NO:67, respectivamente, ou fragmentos de ligação ao antígeno,
212 / 509 fragmentos Fab, fragmentos variáveis de cadeia única (scFv), variantes, ou conjugados dos mesmos. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende cadeias pesada e leve que são, cada, pelo menos 99% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:66 e SEQ ID NO:67, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende cadeias pesada e leve que são, cada, pelo menos 98% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:66 e SEQ ID NO:67, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende cadeias pesada e leve que são, cada, pelo menos 97% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:66 e SEQ ID NO:67, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende cadeias pesada e leve que são, cada, pelo menos 96% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:66 e SEQ ID NO:67, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende cadeias pesada e leve que são, cada, pelo menos 95% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:66 e SEQ ID NO:67, respectivamente.
[00214] Em uma modalidade, o agonista de OX40 compreende as CDRs das cadeias pesada e leve ou regiões variáveis (VRs) de 11D4. Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada (VH) do agonista de OX40 compreende a sequência mostrada em SEQ ID NO:68, e a região variável da cadeia leve (VL) do agonista de OX40 compreende a sequência mostrada em SEQ ID NO:69, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 99% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:68 e SEQ ID NO:69, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 98% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:68 e SEQ ID NO:69, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 97% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:68 e SEQ ID NO:69, respectivamente. Em uma
213 / 509 modalidade, um agonista de OX40 compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 96% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:68 e SEQ ID NO:69, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 95% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:68 e SEQ ID NO:69, respectivamente.
[00215] Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende domínios CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada tendo as sequências apresentadas em SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, e SEQ ID NO:72, respectivamente, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas, e domínios CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve tendo as sequências apresentadas em SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, e SEQ ID NO:75, respectivamente, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas.
[00216] Em uma modalidade, o agonista de OX4 é um anticorpo monoclonal biossimilar agonista de OX40 aprovado pelas autoridades regulatórias de fármacos com referência a 11D4. Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal biossimilar compreende um anticorpo OX40 compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 97% de identidade de sequência, por exemplo, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência, em comparação com a sequência de aminoácidos de um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência e que compreende uma ou mais modificações pós-traducionais em comparação com o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é 11D4. Em algumas modalidades, as uma ou mais modificações pós-traducionais são selecionadas de uma ou mais dentre: glicosilação, oxidação, desamidação, e truncação. Em algumas modalidades, o biossimilar é um anticorpo agonista de OX40 autorizado ou submetido à autorização, em que o anticorpo agonista de OX40 é provido em uma formulação que difere das formulações de um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o
214 / 509 produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é 11D4. O anticorpo agonista de OX40 pode ser autorizado por uma autoridade regulatória de fármacos como a Norte-Americana FDA (“Norte-Americana Food and Drug Administration”, Administração de Fármacos e Alimentos dos Estados Unidos) e/ou a Agência Europeia de Medicamentos (EMA, “European Medicines Agency”) da União Europeia. Em algumas modalidades, o biossimilar é provido como uma composição que compreende, adicionalmente, um ou mais excipientes, em que os um ou mais excipientes são os mesmos que ou diferentes dos excipientes compreendidos em um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é 11D4. Em algumas modalidades, o biossimilar é provido como uma composição que compreende, adicionalmente, um ou mais excipientes, em que os um ou mais excipientes são os mesmos que ou diferentes dos excipientes compreendidos em um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é 11D4. TABELA 11. Sequências de aminoácidos dos anticorpos agonistas de OX40 relacionadas a 11D4. Identificador Sequência (Símbolos de Aminoácido de Uma Letra)
SEQ ID EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYSMNWVRQA PGKGLEWVSY NO:66 ISSSSSTIDY 60 cadeia pesada ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCARES GWYLFDYWGQ de 11D4 GTLVTVSSAS 120
TKGPSVFPLA PCSRSTSEST AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL 180
YSLSSVVTVP SSNFGTQTYT CNVDHKPSNT KVDKTVERKC CVECPPCPAP PVAGPSVFLF 240
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTFRVV 300
SVLTVVHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPAPIE KTISKTKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV 360
SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPMLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF 420 SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK 444
215 / 509
SEQ ID DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SWLAWYQQKP EKAPKSLIYA NO:67 ASSLQSGVPS 60 cadeia leve RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNSYPPTFGG GTKVEIKRTV de 11D4 AAPSVFIFPP 120
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT 180 LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC 214
SEQ ID EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYSMNWVRQA PGKGLEWVSY NO:68 ISSSSSTIDY 60 região ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCARES GWYLFDYWGQ variável da GTLVTVSS 118 cadeia pesada de 11D4
SEQ ID DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SWLAWYQQKP EKAPKSLIYA NO:69 ASSLQSGVPS 60 região RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNSYPPTFGG GTKVEIK 107 variável da cadeia leve de 11D4 SEQ ID SYSMN 5 NO:70 CDR1 da cadeia pesada de 11D4 SEQ ID YISSSSSTID YADSVKG 17 NO:71 CDR2 da cadeia pesada de 11D4 SEQ ID ESGWYLFDY 9 NO:72 CDR3 da cadeia pesada de 11D4 SEQ ID RASQGISSWL A 11 NO:73 CDR1 da cadeia leve de 11D4 SEQ ID AASSLQS 7 NO:74 CDR2 da cadeia leve de 11D4 SEQ ID QQYNSYPPT 9 NO:75 CDR3 da cadeia leve de 11D4
[00217] Em algumas modalidades, o agonista de OX4 é 18D8, que é um anticorpo completamente humano disponível junto à Pfizer, Inc. A preparação e as propriedades de 18D8 são descritas em Patentes Norte- Americana nºs 7.960.515; 8.236.930; e 9.028.824, cujas descrições são aqui incorporadas como referências. A sequência de aminoácidos de 18D8 são apresentadas na Tabela 12.
216 / 509
[00218] Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende uma cadeia pesada apresentada pela SEQ ID NO:76 e uma cadeia leve apresentada pela SEQ ID NO:77. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende cadeias pesada e leve tendo as sequências mostradas em SEQ ID NO:76 e SEQ ID NO:77, respectivamente, ou fragmentos de ligação ao antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variáveis de cadeia única (scFv), variantes, ou conjugados dos mesmos. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende cadeias pesada e leve que são, cada, pelo menos 99% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:76 e SEQ ID NO:77, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende cadeias pesada e leve que são, cada, pelo menos 98% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:76 e SEQ ID NO:77, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende cadeias pesada e leve que são, cada, pelo menos 97% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:76 e SEQ ID NO:77, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende cadeias pesada e leve que são, cada, pelo menos 96% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:76 e SEQ ID NO:77, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende cadeias pesada e leve que são, cada, pelo menos 95% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:76 e SEQ ID NO:77, respectivamente.
[00219] Em uma modalidade, o agonista de OX40 compreende as CDRs das cadeias pesada e leve ou regiões variáveis (VRs) de 18D8. Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada (VH) do agonista de OX40 compreende a sequência mostrada em SEQ ID NO:78, e a região variável da cadeia leve (VL) do agonista de OX40 compreende a sequência mostrada em SEQ ID NO:79, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 99% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:78 e SEQ ID NO:79, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista
217 / 509 de OX40 compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 98% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:78 e SEQ ID NO:79, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 97% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:78 e SEQ ID NO:79, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 96% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:78 e SEQ ID NO:79, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 95% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:78 e SEQ ID NO:79, respectivamente.
[00220] Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende domínios CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada tendo as sequências apresentadas em SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, e SEQ ID NO:82, respectivamente, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas, e domínios CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve tendo as sequências apresentadas em SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, e SEQ ID NO:85, respectivamente, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas.
[00221] Em uma modalidade, o agonista de OX4 é um anticorpo monoclonal biossimilar agonista de OX40 aprovado pelas autoridades regulatórias de fármacos com referência ao 18D8. Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal biossimilar compreende um anticorpo OX40 compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 97% de identidade de sequência, por exemplo, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência, em comparação com a sequência de aminoácidos de um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência e que compreende uma ou mais modificações pós-traducionais em comparação com o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é 18D8. Em algumas modalidades, as uma ou mais modificações pós-traducionais são
218 / 509 selecionadas de uma ou mais dentre: glicosilação, oxidação, desamidação, e truncação.
Em algumas modalidades, o biossimilar é um anticorpo agonista de OX40 autorizado ou submetido à autorização, em que o anticorpo agonista de OX40 é provido em uma formulação que difere das formulações de um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é 18D8. O anticorpo agonista de OX40 pode ser autorizado por uma autoridade regulatória de fármacos como a Norte-Americana FDA (“Norte-Americana Food and Drug Administration”, Administração de Fármacos e Alimentos dos Estados Unidos) e/ou Agência Europeia de Medicamentos (EMA, “European Medicines Agency”) da União Europeia.
Em algumas modalidades, o biossimilar é provido como uma composição que compreende, adicionalmente, um ou mais excipientes, em que os um ou mais excipientes são os mesmos que ou diferentes dos excipientes compreendidos em um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é 18D8. Em algumas modalidades, o biossimilar é provido como uma composição que compreende, adicionalmente, um ou mais excipientes, em que os um ou mais excipientes são os mesmos que ou diferentes dos excipientes compreendidos em um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é 18D8. TABELA 12. Sequências de aminoácidos dos anticorpos agonistas de OX40 relativas a 18D8.
219 / 509 Identificador Sequência (Símbolos de Aminoácido de Uma Letra) SEQ ID NO:76 EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA cadeia pesada de PGKGLEWVSG ISWNSGSIGY 60 18D8 ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TALYYCAKDQ STADYYFYYG MDVWGQGTTV 120
TVSSASTKGP SVFPLAPCSR STSESTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV 180
LQSSGLYSLS SVVTVPSSNF GTQTYTCNVD HKPSNTKVDK TVERKCCVEC PPCPAPPVAG 240
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVQFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQFN 300
STFRVVSVLT VVHQDWLNGK EYKCKVSNKG LPAPIEKTIS KTKGQPREPQ VYTLPPSREE 360
MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPM LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW 420 QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 450 SEQ ID NO:77 EIVVTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD cadeia leve de ASNRATGIPA 60 18D8 RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPTFGQG TKVEIKRTVA APSVFIFPPS 120
DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL 180 SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC 213 SEQ ID NO:78 EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA região variável PGKGLEWVSG ISWNSGSIGY 60 da cadeia pesada ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TALYYCAKDQ STADYYFYYG de 18D8 MDVWGQGTTV 120 TVSS 124 SEQ ID NO:79 EIVVTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD região variável ASNRATGIPA 60 da cadeia leve de RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPTFGQG TKVEIK 106 18D8 SEQ ID NO:80 DYAMH 5 CDR1 da cadeia pesada de 18D8 SEQ ID NO:81 GISWNSGSIG YADSVKG 17 CDR2 da cadeia pesada de 18D8 SEQ ID NO:82 DQSTADYYFY YGMDV 15 CDR3 da cadeia pesada de 18D8 SEQ ID NO:83 RASQSVSSYL A 11 CDR1 da cadeia leve de 18D8 SEQ ID NO:84 DASNRAT 7 CDR2 da cadeia leve de 18D8 SEQ ID NO:85 QQRSNWPT 8 CDR3 da cadeia leve de 18D8
[00222] Em algumas modalidades, o agonista de OX4 é Hu119-122, que é um anticorpo humanizado disponível junto à GlaxoSmithKline plc. A preparação e as propriedades de Hu119-122 são descritas em Patentes Norte- Americana nºs 9.006.399 e 9.163.085, e em Publicação de Patente Internacional nº WO 2012/027328, cujas descrições são aqui incorporadas
220 / 509 como referências. As sequências de aminoácidos de Hu119-122 são apresentadas na Tabela 13.
[00223] Em uma modalidade, o agonista de OX40 compreende as CDRs das cadeias pesada e leve ou regiões variáveis (VRs) de Hu119-122. Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada (VH) do agonista de OX40 compreende a sequência mostrada em SEQ ID NO:86, e a região variável da cadeia leve (VL) do agonista de OX40 compreende a sequência mostrada em SEQ ID NO:87, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 99% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:86 e SEQ ID NO:87, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 98% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:86 e SEQ ID NO:87, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 97% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:86 e SEQ ID NO:87, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 96% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:86 e SEQ ID NO:87, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 95% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:86 e SEQ ID NO:87, respectivamente.
[00224] Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende domínios CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada tendo as sequências apresentadas em SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, e SEQ ID NO:90, respectivamente, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas, e domínios CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve tendo as sequências apresentadas em SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, e SEQ ID NO:93, respectivamente, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas.
[00225] Em uma modalidade, o agonista de OX4 é um anticorpo
221 / 509 monoclonal biossimilar agonista de OX40 aprovado pelas autoridades regulatórias de fármacos com referência a Hu119-122. Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal biossimilar compreende um anticorpo OX40 compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 97% de identidade de sequência, por exemplo, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência, em comparação com a sequência de aminoácidos de um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência e que compreende uma ou mais modificações pós-traducionais em comparação com o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é Hu119-122. Em algumas modalidades, as uma ou mais modificações pós- traducionais são selecionadas de uma ou mais dentre: glicosilação, oxidação, desamidação, e truncação.
Em algumas modalidades, o biossimilar é um anticorpo agonista de OX40 autorizado ou submetido à autorização, em que o anticorpo agonista de OX40 é provido em uma formulação que difere das formulações de um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é Hu119-122. O anticorpo agonista de OX40 pode ser autorizado por uma autoridade regulatória de fármacos como a Norte-Americana FDA (“Norte-Americana Food and Drug Administration”, Administração de Fármacos e Alimentos dos Estados Unidos) e/ou Agência Europeia de Medicamentos (EMA, “European Medicines Agency”) da União Europeia.
Em algumas modalidades, o biossimilar é provido como uma composição que compreende, adicionalmente, um ou mais excipientes, em que os um ou mais excipientes são os mesmos que ou diferentes dos excipientes compreendidos em um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é Hu119-122. Em algumas modalidades, o biossimilar é provido como uma composição que compreende, adicionalmente, um ou mais excipientes, em
222 / 509 que os um ou mais excipientes são os mesmos que ou diferentes dos excipientes compreendidos em um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é Hu119-122. TABELA 13. Sequências de aminoácidos dos anticorpos agonistas de OX40 relacionadas a Hu119-122. Identificador Sequência (Símbolos de Aminoácido de Uma Letra) SEQ ID NO:86 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASEYEFP SHDMSWVRQA região variável PGKGLELVAA INSDGGSTYY 60 da cadeia pesada PDTMERRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARHY de Hu119-122 DDYYAWFAYW GQGTMVTVSS 120 SEQ ID NO:87 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASKSVS TSGYSYMHWY QQKPGQAPRL região variável LIYLASNLES 60 da cadeia leve GVPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQHSRELPL TFGGGTKVEI K de Hu119-122 111 SEQ ID NO:88 SHDMS 5 CDR1 da cadeia pesada de Hu119-122 SEQ ID NO:89 AINSDGGSTY YPDTMER 17 CDR2 da cadeia pesada de Hu119-122 SEQ ID NO:90 HYDDYYAWFA Y 11 CDR3 da cadeia pesada de Hu119-122 SEQ ID NO:91 RASKSVSTSG YSYMH 15 CDR1 da cadeia leve de Hu119- 122 SEQ ID NO:92 LASNLES 7 CDR2 da cadeia leve de Hu119- 122 SEQ ID NO:93 QHSRELPLT 9 CDR3 da cadeia leve de Hu119- 122
[00226] Em algumas modalidades, o agonista de OX4 é Hu106-222, que é um anticorpo humanizado disponível junto à GlaxoSmithKline plc. A preparação e as propriedades de Hu106-222 são descritas em Patentes Norte- Americana nºs 9.006.399 e 9.163.085, e em Publicação de Patente Internacional nº WO 2012/027328, cujas descrições são aqui incorporadas como referências. As sequências de aminoácidos de Hu106-222 são apresentadas na Tabela 14.
223 / 509
[00227] Em uma modalidade, o agonista de OX40 compreende as CDRs das cadeias pesada e leve ou regiões variáveis (VRs) de Hu106-222. Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada (VH) do agonista de OX40 compreende a sequência mostrada em SEQ ID NO:94, e a região variável da cadeia leve (VL) do agonista de OX40 compreende a sequência mostrada em SEQ ID NO:95, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 99% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:94 e SEQ ID NO:95, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 98% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:94 e SEQ ID NO:95, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 97% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:94 e SEQ ID NO:95, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 96% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:94 e SEQ ID NO:95, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 95% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:94 e SEQ ID NO:95, respectivamente.
[00228] Em uma modalidade, um agonista de OX40 compreende domínios CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada tendo as sequências apresentadas em SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, e SEQ ID NO:98, respectivamente, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas, e domínios CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve tendo as sequências apresentadas em SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, e SEQ ID NO:101, respectivamente, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas.
[00229] Em uma modalidade, o agonista de OX4 é um anticorpo monoclonal biossimilar agonista de OX40 aprovado pelas autoridades regulatórias de fármacos com referência ao Hu106-222. Em uma modalidade,
224 / 509 o anticorpo monoclonal biossimilar compreende um anticorpo OX40 compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 97% de identidade de sequência, por exemplo, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência, em comparação com a sequência de aminoácidos de um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência e que compreende uma ou mais modificações pós-traducionais em comparação com o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é Hu106-222. Em algumas modalidades, as uma ou mais modificações pós- traducionais são selecionadas de uma ou mais dentre: glicosilação, oxidação, desamidação, e truncação.
Em algumas modalidades, o biossimilar é um anticorpo agonista de OX40 autorizado ou submetido à autorização, em que o anticorpo agonista de OX40 é provido em uma formulação que difere das formulações de um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é Hu106-222. O anticorpo agonista de OX40 pode ser autorizado por uma autoridade regulatória de fármacos como a Norte-Americana FDA (“Norte-Americana Food and Drug Administration”, Administração de Fármacos e Alimentos dos Estados Unidos) e/ou Agência Europeia de Medicamentos (EMA, “European Medicines Agency”) da União Europeia.
Em algumas modalidades, o biossimilar é provido como uma composição que compreende, adicionalmente, um ou mais excipientes, em que os um ou mais excipientes são os mesmos que ou diferentes dos excipientes compreendidos em um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é Hu106-222. Em algumas modalidades, o biossimilar é provido como uma composição que compreende, adicionalmente, um ou mais excipientes, em que os um ou mais excipientes são os mesmos que ou diferentes dos excipientes compreendidos em um produto medicinal de referência ou
225 / 509 produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é Hu106-222. TABELA 14. Sequências de aminoácidos dos anticorpos agonistas de OX40 relativas a Hu106-222. Identificador Sequência (Símbolos de Aminoácido de Uma Letra) SEQ ID NO:94 QVQLVQSGSE LKKPGASVKV SCKASGYTFT DYSMHWVRQA região variável PGQGLKWMGW INTETGEPTY 60 da cadeia ADDFKGRFVF SLDTSVSTAY LQISSLKAED TAVYYCANPY YDYVSYYAMD pesada de YWGQGTTVTV 120 Hu106-222 SS 122 SEQ ID NO:95 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVS TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS região variável ASYLYTGVPS 60 da cadeia leve RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCQQ HYSTPRTFGQ GTKLEIK 107 de Hu106-222 SEQ ID NO:96 DYSMH 5 CDR1 da cadeia pesada de Hu106-222 SEQ ID NO:97 WINTETGEPT YADDFKG 17 CDR2 da cadeia pesada de Hu106-222 SEQ ID NO:98 PYYDYVSYYA MDY 13 CDR3 da cadeia pesada de Hu106-222 SEQ ID NO:99 KASQDVSTAV A 11 CDR1 da cadeia leve de Hu106-222 SEQ ID SASYLYT 7 NO:100 CDR2 da cadeia leve de Hu106-222 SEQ ID QQHYSTPRT 9 NO:101 CDR3 da cadeia leve de Hu106-222
[00230] Em algumas modalidades, o anticorpo agonista de OX40 é MEDI6469 (também referido como 9B12). MEDI6469 é um anticorpo monoclonal murino. Weinberg, et al., J. Immunother. 2006, 29, 575-585. Em algumas modalidades o agonista de OX4 é um anticorpo produzido pelo hibridoma 9B12, depositado em Biovest Inc. (Malvern, MA, EUA), conforme descrito em Weinberg, et al., J. Immunother. 2006, 29, 575-585, cuja descrição é pelo presente documento aqui incorporada em sua totalidade como referência. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende as
226 / 509 sequências CDR de MEDI6469. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada e/ou uma sequência de região variável da cadeia leve de MEDI6469.
[00231] Em uma modalidade, o agonista de OX4 é L106 BD (Pharmingen, Produto de nº 340420). Em algumas modalidades, o agonista de OX40 compreende as CDRs do anticorpo L106 (BD Pharmingen, Produto de nº 340420). Em algumas modalidades, o agonista de OX40 compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada e/ou uma sequência de região variável da cadeia leve de anticorpo L106 (BD Pharmingen, Produto de nº 340420). Em uma modalidade, o agonista de OX4 é ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, Nº de catálogo 20073). Em algumas modalidades, o agonista de OX40 compreende as CDRs de anticorpo ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, Nº de catálogo 20073). Em algumas modalidades, o agonista de OX40 compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada e/ou uma sequência de região variável da cadeia leve de anticorpo ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, Nº de catálogo 20073). Em uma modalidade, o agonista de OX4 é o anticorpo monoclonal murino anti-mCD134/mOX40 (clone OX86), comercialmente disponível junto à InVivoMAb, BioXcell Inc, West Lebanon, NH, EUA.
[00232] Em uma modalidade, o agonista de OX4 é selecionado dentre os agonistas de OX40 descritos em Publicações de Pedidos de Patente Internacionais nºs WO 95/12673, WO 95/21925, WO 2006/121810, WO 2012/027328, WO 2013/028231, WO 2013/038191, e WO 2014/148895; Pedido de Patente Europeu nº EP 0672141; Publicações de Pedidos de Patente Norte-Americana nºs US 2010/136030, US 2014/377284, US 2015/190506, e US 2015/132288 (incluindo clones 20E5 e 12H3); e Patentes Norte- Americana nºs 7.504.101, 7.550.140, 7.622.444, 7.696.175, 7.960.515,
7.961.515, 8.133.983, 9.006.399, e 9.163.085, a descrição de cada é aqui incorporada em sua totalidade como referência.
227 / 509
[00233] Em uma modalidade, o agonista de OX4 é uma proteína de fusão agonística de OX40 conforme representada pela Estrutura I-A (proteína de fusão de fragmento de anticorpo-Fc C-terminal) ou Estrutura I-B (proteína de fusão de fragmento de anticorpo-Fc N-terminal), ou um fragmento, um derivado, um conjugado, uma variante, ou um biossimilar da mesma. As propriedades das estruturas I-A e I-B são descritas acima e nas Patentes Norte-Americana nºs 9.359.420, 9.340.599, 8.921.519, e 8.450.460, cujas descrições são aqui incorporadas como referências. Sequências de aminoácidos dos domínios de polipeptídeo da estrutura I-A são apresentadas na Tabela 6. O domínio de Fc preferivelmente compreende um domínio constante completo (aminoácidos 17-230 de SEQ ID NO:31) o domínio de dobradiça completo (aminoácidos 1-16 de SEQ ID NO:31) ou uma porção do domínio de dobradiça (por exemplo, aminoácidos 4-16 de SEQ ID NO:31). Os linkers preferidos para conectar um anticorpo-Fc C-terminal podem ser selecionados das modalidades apresentadas em SEQ ID NO:32 a SEQ ID NO:41, incluindo os linkers adequados para fusão de polipeptídeos adicionais. Igualmente, as sequências de aminoácidos dos domínios de polipeptídeo da estrutura I-B são apresentadas na Tabela 7. Se um fragmento de anticorpo Fc está fusionado na terminação-N de uma proteína de fusão TNRFSF como na estrutura I-B, a sequência da molécula Fc é preferivelmente aquela mostrada em SEQ ID NO:42, e as sequências de linkers são preferivelmente selecionadas daquelas modalidades apresentadas em SED ID NO:43 a SEQ ID NO:45.
[00234] Em uma modalidade, uma proteína de fusão agonista de OX40 de acordo com as estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios ligantes de OX40 selecionados a partir do grupo consistindo em uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável de tavolixizumabe, uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável de 11D4, uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável de 18D8, uma cadeia pesada variável e
228 / 509 uma cadeia leve variável de Hu119-122, uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável de Hu106-222, uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável selecionadas das cadeias pesadas variáveis e cadeias leves variáveis descritas na Tabela 15, qualquer combinação de uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável das supracitadas, e fragmentos, derivados, conjugados, variantes, e biossimilares das mesmas.
[00235] Em uma modalidade, uma proteína de fusão agonista de OX40 de acordo com as estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios ligantes de OX4 compreendendo uma sequência de OX40. Em uma modalidade, uma proteína de fusão agonista de OX40 de acordo com as estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios ligantes de OX4 compreendendo uma sequência de acordo com a SEQ ID NO:102. Em uma modalidade, uma proteína de fusão agonista de OX40 de acordo com as estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios ligantes de OX4 compreendendo uma sequência de OX40L solúvel. Em uma modalidade, uma proteína de fusão agonista de OX40 de acordo com as estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios ligantes de OX4 compreendendo uma sequência de acordo com a SEQ ID NO:103. Em uma modalidade, uma proteína de fusão agonista de OX40 de acordo com as estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios ligantes de OX4 compreendendo uma sequência de acordo com a SEQ ID NO:104.
[00236] Em uma modalidade, uma proteína de fusão agonista de OX40 de acordo com as estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios ligantes de OX4 que é um domínio de scFV compreendendo regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 95% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:58 e SEQ ID NO:59, respectivamente, em que os domínios de VH e VL são conectados por um linker. Em uma modalidade, uma proteína de fusão agonista de OX40 de acordo com as estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios ligantes de OX4 que é um domínio de scFV compreendendo
229 / 509 regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 95% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:68 e SEQ ID NO:69, respectivamente, em que os domínios de VH e VL são conectados por um linker.
Em uma modalidade, uma proteína de fusão agonista de OX40 de acordo com as estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios ligantes de OX4 que é um domínio de scFV compreendendo regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 95% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:78 e SEQ ID NO:79, respectivamente, em que os domínios de VH e VL são conectados por um linker.
Em uma modalidade, uma proteína de fusão agonista de OX40 de acordo com as estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios ligantes de OX4 que é um domínio de scFV compreendendo regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 95% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:86 e SEQ ID NO:87, respectivamente, em que os domínios de VH e VL são conectados por um linker.
Em uma modalidade, uma proteína de fusão agonista de OX40 de acordo com as estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios ligantes de OX4 que é um domínio de scFV compreendendo regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 95% idênticas às sequências mostradas em SEQ ID NO:94 e SEQ ID NO:95, respectivamente, em que os domínios de VH e VL são conectados por um linker.
Em uma modalidade, uma proteína de fusão agonista de OX40 de acordo com as estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios ligantes de OX4 que é um domínio de scFV compreendendo regiões VH e VL que são, cada, pelo menos 95% idênticas às sequências de VH e VL apresentadas na Tabela 15, em que os domínios de VH e VL são conectados por um linker.
TABELA 15. Domínios de polipeptídeo adicionais úteis como domínios ligantes de OX40 em proteínas de fusão (por exemplo, estruturas I-A e I- B) ou como anticorpos scFv agonistas de OX40.
230 / 509 Identificador Sequência (Símbolos de Aminoácido de Uma Letra)
SEQ ID MERVQPLEEN VGNAARPRFE RNKLLLVASV IQGLGLLLCF TYICLHFSAL NO:102 QVSHRYPRIQ 60 OX40L SIKVQFTEYK KEKGFILTSQ KEDEIMKVQN NSVIINCDGF YLISLKGYFS QEVNISLHYQ 120
KDEEPLFQLK KVRSVNSLMV ASLTYKDKVY LNVTTDNTSL DDFHVNGGEL ILIHQNPGEF 180 CVL 183
SEQ ID SHRYPRIQSI KVQFTEYKKE KGFILTSQKE DEIMKVQNNS VIINCDGFYL NO:103 ISLKGYFSQE 60 domínio solúvel VNISLHYQKD EEPLFQLKKV RSVNSLMVAS LTYKDKVYLN VTTDNTSLDD de OX40L FHVNGGELIL 120 IHQNPGEFCV L 131
SEQ ID YPRIQSIKVQ FTEYKKEKGF ILTSQKEDEI MKVQNNSVII NCDGFYLISL NO:104 KGYFSQEVNI 60 domínio solúvel SLHYQKDEEP LFQLKKVRSV NSLMVASLTY KDKVYLNVTT DNTSLDDFHV de OX40L NGGELILIHQ 120 (alternativo) NPGEFCVL 128
SEQ ID EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYTMNWVRQA PGKGLEWVSA NO:105 ISGSGGSTYY 60 cadeia pesada ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKDR YSQVHYALDY variável de 008 WGQGTLVTVS 120
SEQ ID DIVMTQSPDS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLL HSNGYNYLDW YLQKAGQSPQ NO:106 LLIYLGSNRA 60 cadeia leve SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCQQYYNHP TTFGQGTK 108 variável de 008
SEQ ID EVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DYTMNWVRQA PGKGLEWVSS NO:107 ISGGSTYYAD 60 cadeia pesada SRKGRFTISR DNSKNTLYLQ MNNLRAEDTA VYYCARDRYF RQQNAFDYWG variável de 011 QGTLVTVSSA 120
SEQ ID DIVMTQSPDS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLL HSNGYNYLDW YLQKAGQSPQ NO:108 LLIYLGSNRA 60 cadeia leve SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCQQYYNHP TTFGQGTK 108 variável de 011
SEQ ID EVQLVESGGG LVQPRGSLRL SCAASGFTFS SYAMNWVRQA PGKGLEWVAV NO:109 ISYDGSNKYY 60 cadeia pesada ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKDR YITLPNALDY variável de 021 WGQGTLVTVS 120
SEQ ID DIQMTQSPVS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLL HSNGYNYLDW YLQKPGQSPQ NO:110 LLIYLGSNRA 60 cadeia leve SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCQQYKSNP PTFGQGTK 108 variável de 021
SEQ ID EVQLVESGGG LVHPGGSLRL SCAGSGFTFS SYAMHWVRQA PGKGLEWVSA NO:111 IGTGGGTYYA 60 cadeia pesada DSVMGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCARYDN variável de 023 VMGLYWFDYW GQGTLVTVSS 120
SEQ ID EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD NO:112 cadeia ASNRATGIPA 60 leve variável de RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPPAFGG GTKVEIKR 108 023
SEQ ID EVQLQQSGPE LVKPGASVKM SCKASGYTFT SYVMHWVKQK PGQGLEWIGY NO:113 INPYNDGTKY 60 região variável NEKFKGKATL TSDKSSSTAY MELSSLTSED SAVYYCANYY GSSLSMDYWG da cadeia QGTSVTVSS 119 pesada
SEQ ID DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY NO:114 TSRLHSGVPS 60 região variável RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GNTLPWTFGG GTKLEIKR 108 da cadeia leve region
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SEQ ID EVQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKTSGYTFK DYTMHWVKQS HGKSLEWIGG NO:115 IYPNNGGSTY 60 região variável NQNFKDKATL TVDKSSSTAY MEFRSLTSED SAVYYCARMG YHGPHLDFDV da cadeia WGAGTTVTVS 120 pesada P 121
SEQ ID DIVMTQSHKF MSTSLGDRVS ITCKASQDVG AAVAWYQQKP GQSPKLLIYW NO:116 ASTRHTGVPD 60 região variável RFTGGGSGTD FTLTISNVQS EDLTDYFCQQ YINYPLTFGG GTKLEIKR 108 da cadeia leve
SEQ ID QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFT DYSMHWVKQA PGKGLKWMGW NO:117 região INTETGEPTY 60 variável da ADDFKGRFAF SLETSASTAY LQINNLKNED TATYFCANPY YDYVSYYAMD cadeia pesada YWGHGTSVTV 120 de anticorpo SS 122 humanizado
SEQ ID QVQLVQSGSE LKKPGASVKV SCKASGYTFT DYSMHWVRQA NO:118 PGQGLKWMGW INTETGEPTY 60 região variável ADDFKGRFVF SLDTSVSTAY LQISSLKAED TAVYYCANPY YDYVSYYAMD da cadeia YWGQGTTVTV 120 pesada de SS 122 anticorpo humanizado
SEQ ID DIVMTQSHKF MSTSVRDRVS ITCKASQDVS TAVAWYQQKP GQSPKLLIYS NO:119 ASYLYTGVPD 60 região variável RFTGSGSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYSTPRTFGG GTKLEIK 107 da cadeia leve de anticorpo humanizado
SEQ ID DIVMTQSHKF MSTSVRDRVS ITCKASQDVS TAVAWYQQKP GQSPKLLIYS NO:120 ASYLYTGVPD 60 região variável RFTGSGSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYSTPRTFGG GTKLEIK 107 da cadeia leve de anticorpo humanizado
SEQ ID EVQLVESGGG LVQPGESLKL SCESNEYEFP SHDMSWVRKT PEKRLELVAA NO:121 INSDGGSTYY 60 região variável PDTMERRFII SRDNTKKTLY LQMSSLRSED TALYYCARHY DDYYAWFAYW da cadeia GQGTLVTVSA 120 pesada de anticorpo humanizado
SEQ ID EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASEYEFP SHDMSWVRQA PGKGLELVAA NO:122 INSDGGSTYY 60 região variável PDTMERRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARHY DDYYAWFAYW da cadeia GQGTMVTVSS 120 pesada de anticorpo humanizado
SEQ ID DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS TSGYSYMHWY QQKPGQPPKL NO:123 LIYLASNLES 60 região variável GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQHSRELPL TFGAGTKLEL K da cadeia leve 111 de anticorpo humanizado
SEQ ID EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASKSVS TSGYSYMHWY QQKPGQAPRL NO:124 LIYLASNLES 60 região variável GVPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQHSRELPL TFGGGTKVEI K 111 da cadeia leve de anticorpo humanizado
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SEQ ID MYLGLNYVFI VFLLNGVQSE VKLEESGGGL VQPGGSMKLS CAASGFTFSD NO:125 AWMDWVRQSP 60 região variável EKGLEWVAEI RSKANNHATY YAESVNGRFT ISRDDSKSSV YLQMNSLRAE da cadeia DTGIYYCTWG 120 pesada EVFYFDYWGQ GTTLTVSS 138
SEQ ID MRPSIQFLGL LLFWLHGAQC DIQMTQSPSS LSASLGGKVT ITCKSSQDIN NO:126 KYIAWYQHKP 60 região variável GKGPRLLIHY TSTLQPGIPS RFSGSGSGRD YSFSISNLEP EDIATYYCLQ da cadeia leve YDNLLTFGAG 120 TKLELK 126
[00237] Em uma modalidade, o agonista de OX4 é um polipeptídeo de fusão de cadeia única agonístico de OX40 compreendendo (i) um primeiro domínio ligante de OX40 solúvel, (ii) um primeiro linker de peptídeo, (iii) um segundo domínio ligante de OX40 solúvel, (iv) um segundo linker de peptídeo, e (v) um terceiro domínio ligante de OX40 solúvel, compreendendo, ainda, um domínio adicional na extremidade N-terminal e/ou C-terminal, e em que o domínio adicional é um domínio de fragmento Fab ou Fc. Em uma modalidade, o agonista de OX4 é um polipeptídeo de fusão de cadeia única agonístico de OX40 compreendendo (i) um primeiro domínio ligante de OX40 solúvel, (ii) um primeiro linker de peptídeo, (iii) um segundo domínio ligante de OX40 solúvel, (iv) um segundo linker de peptídeo, e (v) um terceiro domínio ligante de OX40 solúvel, compreendendo, ainda, um domínio adicional na extremidade N-terminal e/ou C-terminal, em que o domínio adicional é um domínio de fragmento Fab ou Fc em que cada um dos domínios ligantes de OX40 solúveis não tem uma região em haste (que contribui para a trimerização e provê uma determinada distância à membrana celular, mas não é parte do domínio ligante de OX40) e os primeiro e segundo linkers de peptídeo independentemente têm um comprimento de 3-8 aminoácidos.
[00238] Em uma modalidade, o agonista de OX4 é um polipeptídeo de fusão de cadeia única agonístico de OX40 compreendendo (i) um primeiro domínio de citocina da superfamília de fatores de necrose tumoral (TNF) solúvel, (ii) um primeiro linker de peptídeo, (iii) um segundo domínio de citocina da superfamília de TNF solúvel, (iv) um segundo linker de peptídeo,
233 / 509 e (v) um terceiro domínio de citocina da superfamília de TNF solúvel, em que cada um dos domínios de citocina da superfamília de TNF solúveis não possui uma região em haste e os primeiro e segundo linkers de peptídeo independentemente têm um comprimento de 3-8 aminoácidos, e em que o domínio de citocina da superfamília de TNF é um domínio ligante de OX40.
[00239] Em algumas modalidades, o agonista de OX4 é MEDI6383. MEDI6383 é uma proteína de fusão agonística de OX40 e pode ser preparada conforme descrito em Patente Norte-Americana nº 6.312.700, cuja descrição é aqui incorporada como referência.
[00240] Em uma modalidade, o agonista de OX4 é um anticorpo scFv agonístico de OX40 compreendendo qualquer um dos domínios de VH supracitados ligados a qualquer um dos domínios de VL supracitados.
[00241] Em uma modalidade, o agonista de OX4 é anticorpo monoclonal MOM-18455 agonista de OX40 da Creative Biolabs, comercialmente disponível junto à Creative Biolabs, Inc., Shirley, NY, EUA.
[00242] Em uma modalidade, o agonista de OX4 é clone Ber-ACT35 de anticorpo agonístico de OX40 comercialmente disponível junto à BioLegend, Inc., San Diego, CA, EUA. H. Análises Opcionais de Viabilidade Celular
[00243] Opcionalmente, um ensaio de viabilidade celular pode ser realizado após a primeira expansão na Etapa B, usando ensaios padrão conhecidos na técnica. Opcionalmente, um ensaio de viabilidade celular pode ser realizado após a primeira expansão (algumas vezes referida como a expansão em massa inicial), usando ensaios padrão conhecidos na técnica. Por exemplo, um ensaio de exclusão com azul tripano pode ser realizado em uma amostra dos TILs em massa, que seletivamente marca as células mortas e permite a avaliação da viabilidade. Outros ensaios para uso no teste de viabilidade podem ser incluídos, mas não se limitam ao, ensaio com azul Alamar; e o ensaio MTT.
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1. Contagens de Células, Viabilidade, e Citometria de Fluxo
[00244] Em algumas modalidades, são medidas as contagens de células e/ou a viabilidade celular. A expressão de marcadores como, mas não limitados a, CD3, CD4, CD8, e CD56, e também de qualquer outro aqui revelado ou descrito, pode ser medida por citometria de fluxo com anticorpos, por exemplo, mas não se limitando àqueles comercialmente disponíveis junto à BD Biosciences (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) usando um citômetro de fluxo FACSCantoTM (BD Biosciences). As células podem ser contadas manualmente usando um hemocitômetro C-chip descartável (VWR, Batavia, IL, EUA) e a viabilidade pode ser avaliada usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo mas não se limitando à, coloração com azul tripano.
[00245] Em alguns casos, a população de TIL em massa pode ser imediatamente criopreservada, usando os protocolos discutidos abaixo. Alternativamente, a população de TIL em massa pode ser submetida ao REP e então criopreservada conforme discutido abaixo. Similarmente, no caso no qual TILs geneticamente modificados serão usados em terapia, as populações de TIL em massa ou de REP TIL podem ser submetidas às modificações genéticas para tratamentos adequados.
2. Culturas de Células
[00246] Em uma modalidade, um método para expandir TILs pode incluir o uso de cerca de 5.000mL a cerca de 25.000mL de meio de células, de cerca de 5.000mL a cerca de 10.000mL de meio de células, ou de cerca de
5.800mL a cerca de 8.700mL de meio de células. Em uma modalidade, a expansão do número de TILs usa não mais que um tipo de meio de cultura de células. Qualquer meio de cultura de células adequado pode ser usado, por exemplo, meio de cultura de células AIM-V® (L-glutamina, 50 μM de sulfato de estreptomicina, e 10 μM de sulfato de gentamicina) (Invitrogen, Carlsbad CA, EUA). Sob esse aspecto, os métodos da invenção vantajosamente
235 / 509 reduzem a quantidade de meio e o número de tipos de meio requerido para expandir o número de TIL. Em uma modalidade, a expansão do número de TIL pode compreender adição de meio de cultura de células fresco às células (também referida como alimentação das células) não mais frequentemente que a cada terceiro ou quarto dia. A expansão do número de células em um recipiente permeável a gás simplifica os procedimentos necessários para expandir o número de células pela redução da frequência de alimentação necessária para expandir as células.
[00247] Em uma modalidade, o meio de células no primeiro recipiente permeável a gás e/ou no segundo recipiente permeável a gás não é filtrado. O uso de meio de células não filtrado pode simplificar os procedimentos necessários para expandir o número de células. Em uma modalidade, o meio de células no primeiro recipiente permeável a gás e/ou no segundo recipiente permeável a gás não possui beta-mercaptoetanol (BME).
[00248] Em uma modalidade, a duração do método compreendendo a obtenção de uma amostra de tecido tumoral do mamífero; a cultura da amostra de tecido tumoral em um primeiro recipiente permeável a gás contendo o meio de células dentro do mesmo; a obtenção de TILs a partir da amostra de tecido tumoral; a expansão do número de TILs em um segundo recipiente permeável a gás contendo o meio de células dentro do mesmo usando aAPCs demora de cerca de 14 dias a cerca de 42 dias, por exemplo, cerca de 28 dias.
[00249] Em uma modalidade, os TILs são expandidos em recipientes permeáveis a gás. Recipientes permeáveis a gás têm sido usados para expandir TILs usando PBMCs usando métodos, composições, e dispositivos conhecidos(as) na técnica, incluindo aqueles(as) descritos(as) em Publicação de Pedido de Patente Norte-Americana nº 2005/0106717 A1, cujas descrições são aqui incorporadas como referências. Em uma modalidade, os TILs são expandidos em bolsas permeáveis a gás. Em uma modalidade, os TILs são
236 / 509 expandidos usando um sistema de expansão de células que expande TILs em bolsas permeáveis a gás, como o “Xuri Cell Expansion System W25” (GE Healthcare). Em uma modalidade, os TILs são expandidos usando um sistema de expansão de células que expande TILs em bolsas permeáveis a gás, como o “WAVE Bioreactor System”, também conhecido como o “Xuri Cell Expansion System W5” (GE Healthcare). Em uma modalidade, o sistema de expansão de células inclui uma bolsa permeável a gás com um volume selecionado a partir do grupo consistindo em cerca de 100mL, cerca de 200mL, cerca de 300mL, cerca de 400mL, cerca de 500mL, cerca de 600mL, cerca de 700mL, cerca de 800mL, cerca de 900mL, cerca de 1L, cerca de 2L, cerca de 3 L, cerca de 4 L, cerca de 5 L, cerca de 6 L, cerca de 7 L, cerca de 8 L, cerca de 9 L, e cerca de 10L.
[00250] Em uma modalidade, os TILs podem ser expandidos em frascos G-Rex (comercialmente disponíveis junto à Wilson Wolf Manufacturing). Tais modalidades permitem que as populações de células se expandam de cerca de 5×105 células/cm2 para entre 10×106 e 30×106 células/cm2. Em uma modalidade esta expansão é conduzida sem adição de meio de cultura de células fresco às células (também referida como alimentação das células). Em uma modalidade, isto é sem alimentação desde que o meio resida a uma altura de cerca de 10 cm no frasco G-Rex. Em uma modalidade isto é sem alimentação mas com a adição de uma ou mais citocinas. Em uma modalidade, a citocina pode ser adicionada como um bolus sem nenhuma necessidade de misturar a citocina com o meio. Tais recipientes, dispositivos, e métodos são conhecidos na técnica e têm sido usados para expandir TILs, e incluem aqueles descritos em Publicação de Pedido de Patente Norte-Americana nº US 2014/0377739A1, Publicação Internacional nº WO 2014/210036 A1, Publicação de Pedido de Patente Norte-Americana nº Norte-Americana 2013/0115617 A1, Publicação Internacional nº WO 2013/188427 A1, Publicação de Pedido de Patente
237 / 509 Norte-Americana nº US 2011/0136228 A1, Patente Norte-Americana nº US
8.809.050 B2, Publicação Internacional nº WO 2011/072088 A2, Publicação de Pedido de Patente Norte-Americana nº US 2016/0208216 A1, Publicação de Pedido de Patente Norte-Americana nº US 2012/0244133 A1, Publicação Internacional nº WO 2012/129201 A1, Publicação de Pedido de Patente Norte-Americana nº US 2013/0102075 A1, Patente Norte-Americana nº US
8.956.860 B2, Publicação Internacional nº WO 2013/173835 A1, Publicação de Pedido de Patente Norte-Americana nº US 2015/0175966 A1, cujas descrições são aqui incorporadas como referências. Tais processos são também descritos Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292. I. Modificação Genética Opcional de TILs
[00251] Em algumas modalidades, os TILs são opcionalmente geneticamente modificados para incluir funcionalidades adicionais, incluindo, mas não se limitando a, um receptor de célula-T (TCR) de alta afinidade, por exemplo, um TCR reconhecido como alvo em um antígeno associado a tumor como MAGE-1, HER2, ou NY-ESO-1, ou um receptor quimérico de antígeno (CAR) que se liga a uma molécula de superfície celular associada a tumor (por exemplo, mesotelina) ou uma molécula de superfície celular restrita à linhagem (por exemplo, CD19). J. Criopreservação Opcional de TILs
[00252] Conforme discutido acima, e exemplificado nas Etapas A até E conforme providas na Figura 8, a criopreservação pode ocorrer em numerosos pontos ao longo de todo o processo de expansão de TIL. Em algumas modalidades, a população expandida de TILs após a segunda expansão (conforme provida por exemplo, de acordo com a Etapa D da Figura 8) pode ser criopreservada. A criopreservação pode ser geralmente realizada pela colocação da população de TIL dentro de uma solução de congelamento, por exemplo, 85% de soro AB com complemento inativado e 15% de sulfóxido dimetílico (DMSO). As células em solução são colocadas dentro de frascos
238 / 509 criogênicos e armazenadas durante 24 horas a -80°C, com transferência opcional para congeladores de nitrogênio gasoso para criopreservação. Consulte Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986. Em algumas modalidades, os TILs são criopreservados em 5% de DMSO. Em algumas modalidades, os TILs são criopreservados em meio de cultura de células mais 5% de DMSO. Em algumas modalidades, os TILs são criopreservados de acordo com os métodos providos nos Exemplos 8 e 9.
[00253] Quando apropriado, as células são removidas do congelador e descongeladas em um banho de água a 37°C até que aproximadamente 4/5 da solução esteja descongelado. As células são geralmente ressuspensas em meio completo e opcionalmente lavadas uma ou mais vezes. Em algumas modalidades, os TILs descongelados são contados e avaliados para viabilidade conforme é conhecido na técnica. K. Métodos para Caracterização Fenotípica de TILs Expandidos
[00254] Produção de Granzima B: A Granzima B é outra medição da capacidade de TIL para exterminar células alvo. Sobrenadantes de meio reestimulados conforme descrito acima usando anticorpos para CD3, CD28, e CD137/4-1BB foram também avaliados para os teores deles de Granzima B usando o Kit ELISA DuoSet para Granzima B Humana (“Human Granzyme B DuoSet ELISA Kit”) (R & D Systems, Minneapolis, MN, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Em algumas modalidades, a segunda expansão de TILs ou a segunda expansão adicional de TILs (como, por exemplo, aquelas descritas na Etapa D da Figura 8, incluindo TILs referidos como reREP TILs) tem aumentado a produção de Granzima B.
[00255] Em algumas modalidades, o comprimento de telômero pode ser usado como uma medição da viabilidade celular e/ou da função celular. Em algumas modalidades, os telômeros são surpreendentemente de mesmo comprimento nos TILs produzidos pela presente invenção em comparação com os TILs preparados usando outros métodos diferentes daqueles aqui
239 / 509 providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Medição do comprimento de telômero: Diversos métodos têm sido usados para medir o comprimento de telômeros em DNA genômico e preparações citológicas. A análise de fragmento de restrição de telômero (TRF, Telomere Restriction Fragment) é o padrão ouro (método de referência) para medir o comprimento de telômero (de Lange et al., 1990). Contudo, a principal limitação de TRF é o requisito de uma quantidade grande de DNA (1,5 ^g). Duas técnicas amplamente usadas para a medição dos comprimentos de telômero a saber, hibridização fluorescente in situ (FISH. Fluorescence In Situ Hybridization; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) e PCR quantitativa podem ser utilizadas com a presente invenção.
[00256] Em algumas modalidades, a saúde de TIL é medida por secreção de IFN-gama (IFN-γ). Em algumas modalidades, a secreção de IFN- γ é indicativa de TILs ativos. Em algumas modalidades, é utilizado um ensaio de potência para a produção de IFN-γ. A produção de IFN-γ é outra medição de potencial citotóxico. A produção de IFN-γ pode ser medida pela determinação dos teores da citocina IFN-γ no meio de TIL estimulado com anticorpos para CD3, CD28, e CD137/4-1BB. Os teores de IFN-γ no meio a partir destes TILs estimulados podem ser determinados usando a medição da liberação de IFN-γ.
[00257] Em algumas modalidades, o potencial citotóxico de TIL para lisar células alvo foi avaliado usando um ensaio de cocultura de TIL com a linhagem celular bioluminescente, P815 (Clone G6), de acordo com um ensaio bioluminescente de lise redirecionada (ensaio de potência) para ensaio de TIL que mede a citotoxicidade de TIL em uma maneira dependente de dose elevadamente sensível.
[00258] Em algumas modalidades, os presentes métodos proveem um ensaio para avaliar a viabilidade de TIL, usando os métodos conforme
240 / 509 descrito acima. Em algumas modalidades, os TILs são expandidos conforme discutido acima, incluindo, por exemplo, conforme provido na Figura 8. Em algumas modalidades, os TILs são criopreservados antes de serem ensaiados para viabilidade. Em algumas modalidades, avaliação de viabilidade inclui descongelamento dos TILs antes da realização de uma primeira expansão, uma segunda expansão, e uma segunda expansão adicional. Em algumas modalidades, os presentes métodos proveem um ensaio para avaliação de proliferação celular, toxicidade celular, morte celular, e/ou outros termos relacionados com viabilidade da população de TIL. A viabilidade pode ser medida por qualquer um dos ensaios metabólicos de TIL descritos acima e também por quaisquer métodos conhecidos para avaliação de viabilidade celular que são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, os presentes métodos proveem um ensaio para avaliação de proliferação celular, toxicidade celular, morte celular, e/ou outros termos relacionados com viabilidade dos TILs expandidos usando os métodos aqui descritos, incluindo aqueles exemplificados na Figura 8.
[00259] A presente invenção também provê métodos de ensaio para determinar a viabilidade de TIL. Em algumas modalidades, os TILs têm igual viabilidade em comparação com os TILs recém-colhidos e/ou os TILs preparados usando outros métodos que aqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, os TILs têm viabilidade aumentada em comparação com os TILs recém-colhidos e/ou os TILs preparados usando outros métodos que aqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. A presente descrição provê métodos para ensaiar TILs para viabilidade pela expansão de linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população maior de TILs compreendendo: (i) obter uma primeira população de TILs que tem sido
241 / 509 previamente expandida; (ii) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2, e opcionalmente OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs; e (iii) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com adicionais IL- 2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é pelo menos 100 vezes maior em número que a segunda população de TILs, e em que a segunda expansão é realizada durante pelo menos 14 dias com o propósito de obter a terceira população de TILs, e em que a terceira população de TILs é adicionalmente ensaiada para viabilidade.
[00260] Em algumas modalidades, o método compreende, adicionalmente: (iv) realizar uma segunda expansão adicional pela suplementação do meio de cultura de células da terceira população de TILs com IL-2 adicional, OKT-3 adicional, e APCs adicionais, em que a segunda expansão adicional é realizada durante pelo menos 14 dias para obter uma população de TILs maior que a obtida na etapa (iii), e em que a terceira população é adicionalmente ensaiada para viabilidade.
[00261] Em algumas modalidades, antes da etapa (i), as células são criopreservadas.
[00262] Em algumas modalidades, as células são descongeladas antes da realização da etapa (i).
[00263] Em algumas modalidades, a etapa (iv) é repetida uma a quatro vezes com o propósito de obter TILs suficientes para análise.
[00264] Em algumas modalidades, as etapas (i) até (iii) ou (iv) são realizadas dentro de um período de cerca de 40 dias a cerca de 50 dias.
[00265] Em algumas modalidades, as etapas (i) até (iii) ou (iv) são
242 / 509 realizadas dentro de um período de cerca de 42 dias a cerca de 48 dias.
[00266] Em algumas modalidades, as etapas (i) até (iii) ou (iv) são realizadas dentro de um período de cerca de 42 dias a cerca de 45 dias.
[00267] Em algumas modalidades, as etapas (i) até (iii) ou (iv) são realizadas dentro de cerca de 44 dias.
[00268] Em algumas modalidades, as células das etapas (iii) ou (iv) expressam CD4, CD8, e TCR α β em teores similares aos das células recém- colhidas.
[00269] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos são células mononucleares do sangue periférico (PBMCs).
[00270] Em algumas modalidades, as PBMCs são adicionadas à cultura de células em qualquer um dos dias 9 até 17 na etapa (iii).
[00271] Em algumas modalidades, as APCs são APCs artificiais (aAPCs).
[00272] Em algumas modalidades, o método compreende, adicionalmente, a etapa de transdução da primeira população de TILs com um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica um receptor de célula-T de alta afinidade.
[00273] Em algumas modalidades, a etapa de transdução ocorre antes da etapa (i).
[00274] Em algumas modalidades, o método compreende, adicionalmente, a etapa de transdução da primeira população de TILs com um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica um receptor quimérico de antígeno (CAR) compreendendo um anticorpo de fragmento variável de cadeia única fusionado com pelo menos um endodomínio de uma molécula de sinalização de célula-T.
[00275] Em algumas modalidades, a etapa de transdução ocorre antes da etapa (i).
[00276] Em algumas modalidades, os TILs são ensaiados para
243 / 509 viabilidade.
[00277] Em algumas modalidades, os TILs são ensaiados para viabilidade após a criopreservação.
[00278] Em algumas modalidades, os TILs são ensaiados para viabilidade após a criopreservação e após a etapa (iv).
[00279] Os diversos receptores de antígenos de linfócitos-B e -T são produzidos por recombinação somática de um número limitado, porém grande de segmentos de genes. Estes segmentos de genes: V (variável), D (diversidade), J (junção), e C (constante), determinam a especificidade de ligação e as aplicações a jusante de imunoglobulinas e receptores de células-T (TCRs). A presente invenção provê um método para gerar TILs que apresentam e aumentam a diversidade do repertório de células-T (algumas vezes referido como policlonalidade). Em algumas modalidades, o aumento na diversidade do repertório de células-T é em comparação com os TILs recém-colhidos e/ou os TILs preparados usando outros métodos que aqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, os TILs obtidos pelo presente método apresentam um aumento na diversidade do repertório de células-T. Em algumas modalidades, os TILs obtidos na primeira expansão apresentam um aumento na diversidade do repertório de células-T. Em algumas modalidades, o aumento na diversidade é um aumento na diversidade de imunoglobulinas e/ou na diversidade do repertório de células-T. Em algumas modalidades, a diversidade é na imunoglobulina, é na cadeia pesada de imunoglobulina. Em algumas modalidades, a diversidade é na imunoglobulina, é na cadeia leve de imunoglobulina. Em algumas modalidades, a diversidade é no repertório de células-T. Em algumas modalidades, a diversidade é em um dos receptores de célula-T selecionados a partir do grupo consistindo em receptores alfa, beta, gama, e delta. Em algumas modalidades, há um aumento na expressão de receptor de célula-T
244 / 509 (TCR) alfa e/ou beta. Em algumas modalidades, há um aumento na expressão de receptor de célula-T (TCR) alfa. Em algumas modalidades, há um aumento na expressão de receptor de célula-T (TCR) beta. Em algumas modalidades, há um aumento na expressão de TCRab (isto é, TCRα/β).
[00280] De acordo com a presente descrição, um método para ensaiar TILs para viabilidade e/ou para adicionalmente usar em administração a um indivíduo. Em algumas modalidades, o método para ensaiar linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) compreende: (i) obter uma primeira população de TILs; (ii) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2, e opcionalmente OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs; e (iii) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com adicionais IL- 2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a segunda população de TILs; (iv) colher, lavar, e criopreservar a terceira população de TILs; (v) armazenar os TILs criopreservados a uma temperatura criogênica; (vi) descongelar a terceira população de TILs para prover uma terceira população de TILs descongelada; e (vii) realizar uma segunda expansão adicional de uma porção da terceira população de TILs descongelada pela suplementação do meio de cultura de células da terceira população com IL-2, OKT-3, e APCs durante um período de expansão adicional (algumas vezes referido como um período reREP) de pelo menos 3 dias, em que a terceira expansão é realizada para obter uma quarta população de TILs, em que o número de TILs na quarta população é comparado com o número de TILs na terceira população de TILs
245 / 509 para obter uma razão; (viii) determinar, baseado na razão na etapa (vii), se a população de TILs descongelada é adequada para administração a um paciente; (ix) administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz da terceira população de TILs descongelada ao paciente quando a razão entre o número de TILs na quarta população de TILs e o número de TILs na terceira população de TILs é determinada como sendo maior que 5:1 na etapa (viii).
[00281] Em algumas modalidades, o período de expansão adicional (algumas vezes referido como um período reREP) é realizado até que a razão entre o número de TILs na quarta população de TILs e o número de TILs na terceira população de TILs seja maior que 50:1.
[00282] Em algumas modalidades, o número de TILs suficientes para uma dosagem terapeuticamente eficaz é de cerca de 2,3×1010 a cerca de 13,7×1010.
[00283] Em algumas modalidades, as etapas (i) até (vii) são realizadas dentro de um período de cerca de 40 dias a cerca de 50 dias. Em algumas modalidades, as etapas (i) até (vii) são realizadas dentro de um período de cerca de 42 dias a cerca de 48 dias. Em algumas modalidades, as etapas (i) até (vii) são realizadas dentro de um período de cerca de 42 dias a cerca de 45 dias. Em algumas modalidades, as etapas (i) até (vii) são realizadas dentro de cerca de 44 dias.
[00284] Em algumas modalidades, as células das etapas (iii) ou (vii) expressam CD4, CD8, e TCR α β em teores similares aos das células recém- colhidas. Em algumas modalidades as células são TILs.
[00285] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos são células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). Em algumas modalidades, as PBMCs são adicionadas à cultura de células em qualquer um dos dias 9 até 17 na etapa (iii).
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[00286] Em algumas modalidades, as APCs são APCs artificiais (aAPCs).
[00287] Em algumas modalidades, a etapa de transdução da primeira população de TILs é realizada com um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica um receptor de célula-T de alta afinidade.
[00288] Em algumas modalidades, a etapa de transdução ocorre antes da etapa (i).
[00289] Em algumas modalidades, a etapa de transdução da primeira população de TILs é realizada com um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica um receptor quimérico de antígeno (CAR) compreendendo um anticorpo de fragmento variável de cadeia única fusionado com pelo menos um endodomínio de uma molécula de sinalização de célula-T.
[00290] Em algumas modalidades, a etapa de transdução ocorre antes da etapa (i).
[00291] Em algumas modalidades, os TILs são ensaiados para viabilidade após a etapa (vii).
[00292] A presente descrição também provê outros métodos para ensaiar TILs. Em algumas modalidades, a descrição provê um método para ensaiar TILs compreendendo: (i) obter uma porção de uma primeira população de TILs criopreservados; (ii) descongelar a porção da primeira população de TILs criopreservados; (iii) realizar uma primeira expansão pela cultura da porção da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs) durante um período de expansão adicional (algumas vezes referido como um período reREP) de pelo menos 3 dias, para produzir uma segunda população
247 / 509 de TILs, em que a porção da primeira população de TILs é comparada com a segunda população de TILs para obter uma razão do número de TILs, em que a razão entre o número de TILs na segunda população de TILs e o número de TILs na porção da primeira população de TILs é maior que 5:1; (iv) determinar, baseado na razão na etapa (iii), se a primeira população de TILs é adequada para uso em administração terapêutica a um paciente; (v) determinar se a primeira população de TILs é adequada para uso em administração terapêutica quando a razão entre o número de TILs na segunda população de TILs e o número de TILs na primeira população de TILs é determinada como sendo maior que 5:1 na etapa (iv).
[00293] Em algumas modalidades, a razão entre o número de TILs na segunda população de TILs e o número de TILs na porção da primeira população de TILs é maior que 50:1.
[00294] Em algumas modalidades, o método compreende, adicionalmente, realizar a expansão da primeira população inteira de TILs criopreservados da etapa (i) de acordo com os métodos conforme descritos em qualquer uma das modalidades aqui providas.
[00295] Em algumas modalidades, o método compreende, adicionalmente, administrar a primeira população inteira de TILs criopreservados da etapa (i) ao paciente. L. Sistemas Fechados para Fabricar TIL
[00296] A presente invenção provê o uso de sistemas fechados durante o processo de cultura de TIL. Tais sistemas fechados permitem as prevenção e/ou redução de contaminação microbiana, permitem o uso de menos frascos, e permitem reduções de custos. Em algumas modalidades, o sistema fechado usa dois recipientes.
[00297] Tais sistemas fechados são bem conhecidos na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, em
248 / 509 http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm e https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulator yInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm.
[00298] Em algumas modalidades, os sistemas fechados incluem sistemas Luer-lock e vedados por calor conforme descrito, por exemplo, no Exemplo 16. Em algumas modalidades, o sistema fechado é acessado via seringas sob condições estéreis com o propósito de manter a esterilidade e a natureza fechada do sistema. Em algumas modalidades, é utilizado um sistema fechado conforme descrito no Exemplo 16. Em algumas modalidades, os TILs são formulados em um recipiente de formulação de produto final de acordo com o método descrito no Exemplo 16, seção 8.14 “Formulação Final e Enchimento”.
[00299] Conforme provido na página da FDA na Internet, sistemas fechados com métodos estéreis são conhecidos e bem descritos. Consulte, https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulator yInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm, como referido acima e provido na parte pertinente abaixo. Introdução
[00300] Dispositivos conectores estéreis (STCDs, Sterile Connecting Devices) produzem soldas estéreis entre duas peças de tubulação compatível. Este procedimento permite a solda estéril de uma variedade de recipientes e diâmetros de tubos. Esta orientação descreve práticas recomendadas e procedimentos recomendados para uso destes dispositivos. Esta orientação não lida com os dados ou a informação que um fabricante de dispositivo conector estéril precisa submeter à FDA com o propósito de obter aprovação e liberação para comercialização. Também é importante observar que o uso de um dispositivo conector estéril fechado ou aprovado para propósitos não autorizados na rotulagem pode fazer com que o dispositivo seja considerado adulterado e de marca comercial falsa sob o “Federal Food, Drug and
249 / 509 Cosmetic Act”.
[00301] Em algumas modalidades, o sistema fechado usa um recipiente a partir do momento que os fragmentos de tumor são obtidos até os TILs estarem prontos para administração ao paciente ou para criopreservação. Em algumas modalidades, quando dois recipientes são usados, o primeiro recipiente é um recipiente-G fechado e a população de TILs é centrifugada e transferida para uma bolsa de infusão sem abrir o primeiro recipiente-G fechado. Em algumas modalidades, quando dois recipientes são usados, a bolsa de infusão é uma bolsa de infusão contendo HypoThermosol™. Um sistema fechado ou sistema de cultura de células TIL fechado é distinguido pelo fato de que logo que a amostra de tumor e/ou os fragmentos de tumor têm sido adicionados, o sistema é hermeticamente vedado a partir do lado externo para formar um ambiente fechado isento da invasão de bactérias, fungos, e/ou qualquer outra contaminação microbiana.
[00302] Em algumas modalidades, a redução em contaminação microbiana está entre cerca de 5% e cerca de 100%. Em algumas modalidades, a redução em contaminação microbiana está entre cerca de 5% e cerca de 95%. Em algumas modalidades, a redução em contaminação microbiana está entre cerca de 5% e cerca de 90%. Em algumas modalidades, a redução em contaminação microbiana está entre cerca de 10% e cerca de 90%. Em algumas modalidades, a redução em contaminação microbiana está entre cerca de 15% e cerca de 85%. Em algumas modalidades, a redução em contaminação microbiana é cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou cerca de 100%.
[00303] O sistema fechado permite o crescimento de TIL na ausência de e/ou com uma redução significativa em contaminação bacteriana.
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[00304] Além disso, pH, pressão parcial de dióxido de carbono e pressão parcial de oxigênio do ambiente de cultura de células TIL variam, cada, à medida que as células são cultivadas. Consequentemente, mesmo que um meio apropriado para a cultura de célula seja circulado, o ambiente fechado ainda necessita ser constantemente mantido como um ambiente ótimo para a proliferação de TILs. Para esta finalidade, é desejável que os fatores físicos de pH, pressão parcial de dióxido de carbono e pressão parcial de oxigênio dentro do líquido de cultura do ambiente fechado sejam monitorados por meio de um sensor, o sina no mesmo é usado para controlar um trocador de gás instalado na entrada do ambiente de cultura, e que a pressão parcial de gás do ambiente fechado seja ajustada em tempo real de acordo com as alterações no líquido de cultura de modo a otimizar o ambiente de cultura de células. Em algumas modalidades, a presente invenção provê um sistema de cultura de células fechado que incorpora na entrada ao ambiente fechado um trocador de gás equipado com um dispositivo de monitoração que mede o pH, a pressão parcial de dióxido de carbono e a pressão parcial de oxigênio do ambiente fechado, e otimiza o ambiente de cultura de células pelo ajuste automático das concentrações de gás com base nos sinais do dispositivo de monitoração.
[00305] Em algumas modalidades, a pressão dentro do ambiente fechado é contínua ou intermitentemente controlada. Isto é, a pressão no ambiente fechado pode ser variada por meio, por exemplo, de um dispositivo de manutenção de pressão, garantindo, assim, que o espaço seja adequado para crescimento de TILs em um estado de pressão positiva, ou promovendo a exsudação de fluido em um estado de pressão negativa e promovendo, assim, a proliferação celular. Pela aplicação de pressão negativa intermitentemente, além disso, é possível substituir uniforme e eficazmente o líquido circulante no ambiente fechado por meio de uma diminuição temporária do volume do ambiente fechado.
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[00306] Em algumas modalidades, os componentes de cultura ótimos para a proliferação dos TILs podem ser substituídos ou adicionados, e incluindo fatores como IL-2 e/ou OKT3, e também combinação, podem ser adicionados. C. Culturas de Células
[00307] Em uma modalidade, um método para expandir TILs, incluindo aqueles discutidos acima, e também conforme exemplificado na Figura 8, pode incluir o uso de cerca de 5.000mL a cerca de 25.000mL de meio de células, cerca de 5.000mL a cerca de 10.000mL de meio de células, ou cerca de 5.800mL a cerca de 8.700mL de meio de células. Em algumas modalidades, o meio é um meio isento de soro, conforme descrito por exemplo no Exemplo 21. Em algumas modalidades, o meio na primeira expansão é isento de soro. Em algumas modalidades, o meio na segunda expansão é isento de soro. Em algumas modalidades, os meios na primeira expansão e na segunda expansão são, ambos, isentos de soro. Em uma modalidade, a expansão do número de TILs usa não mais que um tipo de meio de cultura de células. Qualquer meio de cultura de células adequado pode ser usado, por exemplo, o meio de cultura de células AIM-V® (L- glutamina, 50 μM de sulfato de estreptomicina, e 10 μM de sulfato de gentamicina) (Invitrogen, Carlsbad CA, EUA). Sob esse aspecto, os métodos da invenção vantajosamente reduzem a quantidade de meio e o número de tipos de meio requeridos para expandir o número de TIL. Em uma modalidade, a expansão do número de TIL pode compreender alimentação das células não mais frequentemente que a cada terceiro ou quarto dia. A expansão do número de células em um recipiente permeável a gás simplifica os procedimentos necessários para expandir o número de células pela redução da frequência de alimentação necessária para expandir as células.
[00308] Em uma modalidade, o meio de células no primeiro recipiente permeável a gás e/ou no segundo recipiente permeável a gás é não filtrado. O
252 / 509 uso de meio de células não filtrado pode simplificar os procedimentos necessários para expandir o número de células. Em uma modalidade, o meio de células no primeiro recipiente permeável a gás e/ou no segundo recipiente permeável a gás não contém beta-mercaptoetanol (BME).
[00309] Em uma modalidade, a duração do método compreendendo obter uma amostra de tecido de tumor de um mamífero; cultivar a amostra de tecido de tumor em um primeiro recipiente permeável contendo o meio de células dentro do mesmo; obter TILs da amostra de tecido de tumor; expandir o número de TILs em um segundo recipiente permeável a gás contendo o meio de células, é de cerca de 7 a 14 dias, por exemplo, cerca de 11 dias. Em algumas modalidades o pre-REP é de cerca de 7 a 14 dias, por exemplo, cerca de 11 dias. Em algumas modalidades, o REP é de cerca de 7 a 14 dias, por exemplo, cerca de 11 dias.
[00310] Em uma modalidade, os TILs são expandidos em recipientes permeáveis a gás. Os recipientes permeáveis a gás têm sido usados para expandir TILs usando PBMCs usando métodos, composições, e dispositivos conhecidos(as) na técnica, incluindo aqueles(as) descritos(as) em Publicação de Pedido de Patente Norte-Americana nº 2005/0106717 A1, cujas descrições são aqui incorporadas como referências. Em uma modalidade, TILs são expandidos em bolsas permeáveis a gás. Em uma modalidade, os TILs são expandidos usando um sistema de expansão de células que expande TILs em bolsas permeáveis a gás, como o “Xuri Cell Expansion System W25” (GE Healthcare). Em uma modalidade, os TILs são expandidos usando um sistema de expansão de células que expande TILs em bolsas permeáveis a gás, como o “WAVE Bioreactor System”, também conhecido como o “Xuri Cell Expansion System W5” (GE Healthcare). Em uma modalidade, o sistema de expansão de células inclui uma bolsa permeável a gás com um volume selecionado a partir do grupo consistindo em cerca de 100mL, cerca de 200mL, cerca de 300mL, cerca de 400mL, cerca de 500mL, cerca de 600mL,
253 / 509 cerca de 700mL, cerca de 800mL, cerca de 900mL, cerca de 1L, cerca de 2L, cerca de 3 L, cerca de 4 L, cerca de 5 L, cerca de 6 L, cerca de 7 L, cerca de 8 L, cerca de 9 L, e cerca de 10L.
[00311] Em uma modalidade, os TILs podem ser expandidos em frascos G-Rex (comercialmente disponíveis junto à Wilson Wolf Manufacturing). Tais modalidades permitem que as populações de células se expandam de cerca de 5×105 células/cm2 a entre 10×106 e 30×106 células/cm2. Em uma modalidade isto é sem alimentação. Em uma modalidade, isto é sem alimentação desde que o meio resida a uma altura de cerca de 10 cm no frasco G-Rex. Em uma modalidade isto é sem alimentação mas com a adição de uma ou mais citocinas. Em uma modalidade, a citocina pode ser adicionada sem nenhuma necessidade de misturar a citocina com o meio. Tais recipientes, dispositivos, e métodos são conhecidos na técnica e têm sido usados para expandir TILs, e incluem aqueles descritos em Publicação de Pedido de Patente Norte-Americana nº US 2014/0377739A1, Publicação Internacional nº WO 2014/210036 A1, Publicação de Pedido de Patente Norte-Americana nº US 2013/0115617 A1, Publicação Internacional nº WO 2013/188427 A1, Publicação de Pedido de Patente Norte-Americana nº US 2011/0136228 A1, Patente Norte-Americana nº US 8,809,050 B2, Publicação Internacional nº WO 2011/072088 A2, Publicação de Pedido de Patente Norte-Americana nº US 2016/0208216 A1, Publicação de Pedido de Patente Norte-Americana nº US 2012/0244133 A1, Publicação Internacional nº WO 2012/129201 A1, Publicação de Pedido de Patente Norte-Americana nº US 2013/0102075 A1, Patente Norte-Americana nº US 8.956.860 B2, Publicação Internacional nº WO 2013/173835 A1, Publicação de Pedido de Patente Norte-Americana nº US 2015/0175966 A1, cujas descrições são aqui incorporadas como referências. Tais processos são também descritos em Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292. A. Modificação Genética Opcional de TILs
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[00312] Em algumas modalidades, os TILs são opcionalmente geneticamente modificados para incluir funcionalidades adicionais, incluindo, mas não se limitando a, um receptor de célula-T (TCR) de alta afinidade, por exemplo, um TCR que tem como alvo um antígeno associado a tumor como MAGE-1, HER2, ou NY-ESO-1, ou um receptor quimérico de antígeno (CAR) que se liga uma molécula de superfície celular associada a tumor (por exemplo, mesotelina) ou molécula de superfície celular restrita à linhagem (por exemplo, CD19). B. Criopreservação Opcional de TILs
[00313] Quer a população de TIL em massa quer a população expandida de TILs pode ser opcionalmente criopreservada. Em algumas modalidades, a criopreservação ocorre na população terapêutica de TIL. Em algumas modalidades, a criopreservação ocorre nos TILs colhidos após a segunda expansão. Em algumas modalidades, criopreservação ocorre nos TILs na Etapa F exemplificadora da Figura 8. Em algumas modalidades, os TILs são criopreservados na bolsa de infusão. Em algumas modalidades, os TILs são criopreservados antes da colocação em uma bolsa de infusão. Em algumas modalidades, os TILs são criopreservados e não colocados em uma bolsa de infusão. Em algumas modalidades, criopreservação é realizada usando um meio de criopreservação. Em algumas modalidades, o meio de criopreservação contém sulfóxido dimetílico (DMSO). Isto é geralmente realizado pela adição da população de TIL a uma solução de congelamento, por exemplo 85% de soro AB com complemento inativado e 15% de sulfóxido dimetílico (DMSO). As células em solução são colocadas em frascos criogênicos e armazenadas durante 24 horas a -80°C, com transferência opcional para congeladores de nitrogênio gasoso para criopreservação. Consulte, Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-
986.
[00314] Quando apropriado, as células são removidas do congelador e
255 / 509 descongeladas em um banho de água a 37°C até que aproximadamente 4/5 da solução seja descongelado. As células são geralmente ressuspensas em meio completo e opcionalmente lavadas uma ou mais vezes. Em algumas modalidades, os TILs descongelados podem ser contados e avaliados para viabilidade conforme é conhecido na técnica.
[00315] Em uma modalidade preferida, uma população de TILs é criopreservada usando meio de criopreservação CS10 (CryoStor 10, BioLife Solutions). Em uma modalidade preferida, uma população de TILs é criopreservada usando um meio de criopreservação contendo sulfóxido dimetílico (DMSO). Em uma modalidade preferida, uma população de TILs é criopreservada usando uma razão de 1:1 (vol:vol) entre o meio CS10 e o meio de cultura de células. Em uma modalidade preferida, uma população de TILs é criopreservada usando uma razão de cerca de 1:1 (vol:vol) entre o meio CS10 e o meio de cultura de células, compreendendo, ainda, IL-2 adicional.
[00316] Conforme discutido acima nas Etapas A até E, a criopreservação pode ocorrer em numerosos pontos ao longo de todo o processo de expansão de TIL.
[00317] Conforme discutido acima, e exemplificado nas Etapas A até E conforme providas na Figura 8, a criopreservação pode ocorrer em numerosos pontos ao longo de todo o processo de expansão de TIL. Em algumas modalidades, a população expandida de TILs após a segunda expansão (conforme provida, por exemplo, de acordo com Etapa D da Figura A) pode ser criopreservada. A criopreservação pode ser geralmente realizada pela adição da população de TIL a uma solução de congelamento, por exemplo, 85% de soro AB com complemento inativado e 15% sulfóxido dimetílico (DMSO). As células na solução são colocadas em frascos criogênicos e armazenadas durante 24 horas a -80°C, com transferência opcional para congeladores de nitrogênio gasoso para criopreservação. Consulte Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986. Em algumas modalidades, os TILs
256 / 509 são criopreservados em 5% de DMSO. Em algumas modalidades, os TILs são criopreservados em meio de cultura de células mais 5% de DMSO. Em algumas modalidades, os TILs são criopreservados de acordo com os métodos providos no Exemplo 16.
[00318] Em algumas modalidades, a população de TIL em massa após a primeira expansão de acordo com Etapa B ou a população expandida de TILs após as uma ou mais segundas expansões de acordo com Etapa D pode ser criopreservada. Criopreservação pode ser geralmente realizada pela adição da população de TIL a uma solução de congelamento, por exemplo, 85% de soro AB com complemento inativado e 15% sulfóxido dimetílico (DMSO). As células na solução são colocadas em frascos criogênicos e armazenadas durante 24 horas a -80°C, com transferência opcional para congeladores de nitrogênio gasoso para criopreservação. Consulte Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986.
[00319] Quando apropriado, as células são removidas do congelador e descongeladas em um banho de água a 37°C até que aproximadamente 4/5 da solução esteja descongelado. As células são geralmente ressuspensas em meio completo e opcionalmente lavadas uma ou mais vezes. Em algumas modalidades, os TILs descongelados podem ser contados e ensaiados para viabilidade conforme é conhecido na técnica.
[00320] Em alguns casos, a população de TIL da Etapa B pode ser imediatamente criopreservada, usando os protocolos discutidos abaixo. Alternativamente, a população de TIL em massa pode ser submetida às Etapa C e Etapa D e então criopreservada após a Etapa D. Similarmente, no caso no qual TILs geneticamente modificados serão usados em terapia, as populações de TIL da Etapa B ou Etapa D podem ser submetidas às modificação genéticas para tratamentos adequados. II. Métodos de Tratamento de Pacientes
[00321] Os métodos tratamento começam com a coleta inicial de TIL e
257 / 509 a cultura de TILs. Tais métodos têm sido, ambos, descritos na técnica, por exemplo, por Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35(3):283-292, aqui incorporado em sua totalidade como referência. As modalidade dos métodos de tratamento são descritas detalhadamente nas seções abaixo, incluindo os Exemplos.
[00322] Os TILs expandidos produzidos de acordo com os métodos aqui descritos, incluindo, por exemplo, conforme descritos nas Etapas A até F, acima, e de acordo com as Etapas A até F acima (também conforme mostradas, por exemplo, na Figura 8) encontram uso específico no tratamento de pacientes com câncer (por exemplo, conforme descrito em Goff, et al., J. Clinical Oncology, 2016, 34(20):2389-239, e também o conteúdo suplementar; incorporado aqui em sua totalidade como referência. Em algumas modalidades, os TILs foram crescidos a partir de depósitos resseccionados de melanoma metastásico conforme previamente descrito (consulte, Dudley, et al., J Immunother., 2003, 26:332-342; aqui incorporado em sua totalidade como referência). O tumor fresco pode ser dissecado sob condições estéreis. Uma amostra representativa pode ser coletada para análise patológica formal. Fragmentos individuais de 2 mm3 a 3 mm3 podem ser usados. Em algumas modalidades, 5, 10, 15, 20, 25 ou 30 amostras por paciente são obtidas. Em algumas modalidades, 20, 25, ou 30 amostras por paciente são obtidas. Em algumas modalidades, 20, 22, 24, 26, ou 28 amostras por paciente são obtidas. Em algumas modalidades, 24 amostras por paciente são obtidas. As amostras podem ser colocadas em poços individuais de uma placa de 24 poços, mantidas em meio de crescimento com alta dose de IL-2 (6.000 UI/mL), e monitoradas para destruição de tumor e/ou proliferação de TIL. Qualquer tumor com células viáveis permanecendo após o processamento pode ser enzimaticamente digerido em uma suspensão de células individuais e criopreservado, conforme aqui descrito.
[00323] Em algumas modalidades, o crescimento bem sucedido de TIL
258 / 509 pode ser amostrado para análise fenotípica (CD3, CD4, CD8, e CD56) e testado contra tumor autólogo quando disponível. O TIL pode ser considerado reativo se a cocultura, de um dia para o outro, produziu teores de interferon- gama (IFN-γ) ˃ 200 pg/mL e o dobro do nível de linha basal. (Goff, et al., J. Immunother., 2010, 33:840-847; aqui incorporado em sua totalidade como referência). Em algumas modalidades, as culturas com evidência de reatividade autóloga ou com padrões de crescimento suficiente podem ser selecionadas para uma segunda expansão (por exemplo, uma segunda expansão conforme provida de acordo com a Etapa D da Figura 8), incluindo segundas expansões que são algumas vezes referidas como expansão rápida (REP, Rapid Expansion). Em algumas modalidades, os TILs expandidos com alta reatividade autóloga (por exemplo, alta proliferação durante uma segunda expansão), são selecionados para uma segunda expansão adicional. Em algumas modalidades, os TILs com alta reatividade autóloga (por exemplo, alta proliferação durante a segunda expansão conforme provida na Etapa D da Figura 8), são selecionados para uma segunda expansão adicional de acordo com Etapa D da Figura 8.
[00324] Em algumas modalidades, o paciente não é movido diretamente para a ACT (Adoptive Cell Transfer, transferência adotiva de células), por exemplo, em algumas modalidades, após a coleta de tumor e/ou uma primeira expansão, as células não são utilizadas imediatamente. Em tais modalidades, os TILs podem ser criopreservados e descongelados 2 dias antes da administração a um paciente. Em tais modalidades, os TILs podem ser criopreservados e descongelados 1 dia antes da administração a um paciente. Em algumas modalidades, os TILs podem ser criopreservados e descongelados imediatamente antes da administração a um paciente.
[00325] Os fenótipos celulares de amostras criopreservadas de TIL de bolsa de infusão podem ser analisados por citometria de fluxo (por exemplo, FlowJo) para os marcadores de superfície CD3, CD4, CD8, CCR7, e
259 / 509 CD45RA (BD BioSciences), e também por qualquer um dos métodos aqui descritos. Citocinas séricas foram medidas usando técnicas de ensaio imunoabsorvente ligado à enzima padrão. Um aumento em IFN-γ sérico foi definido como ˃100 pg/mL e maior que 4 3 níveis de linha basal.
[00326] Em algumas modalidades, os TILs produzidos pelos métodos aqui providos, por exemplo aqueles exemplificados na Figura 8, proveem um aprimoramento surpreendente na eficácia clínica dos TILs. Em algumas modalidades, os TILs produzidos pelos métodos aqui providos, por exemplo aqueles exemplificados na Figura 8, apresenta eficácia clínica aumentada em comparação com os TILs produzidos pelos métodos diferentes daqueles aqui descritos, incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles exemplificados na Figura 8. Em algumas modalidades, os métodos diferentes daqueles aqui descritos incluem os métodos referidos como processo 1C e/ou Geração 1 (Ger 1). Em algumas modalidades, a eficácia aumentada é medida por DCR, ORR, e/ou outros processos clínicos. Em algumas modalidades, os TILs produzidos pelos métodos aqui providos, por exemplo aqueles exemplificados na Figura 8, apresentam uma resposta em função do tempo e um perfil de segurança similares em comparação com os TILs produzidos pelos métodos diferentes daqueles aqui descritos, incluindo, por exemplo, os métodos diferentes daqueles exemplificados na Figura 8, por exemplo o processo Ger 1.
[00327] Em algumas modalidades, o IFN-gama (IFN-γ) é indicativo de eficácia de tratamento e/ou eficácia clínica aumentada. Em algumas modalidades, o IFN-γ no sangue de indivíduos tratados com TILs é indicativo de TILs ativos. Em algumas modalidades, um ensaio de potência para a produção de IFN-γ é utilizado. A produção de IFN-γ é outra medição do potencial citotóxico. A produção de IFN-γ pode ser medida pela determinação dos teores da citocina IFN-γ no sangue, no soro, ou de TILs ex vivo de um indivíduo tratado com TILs preparados pelos métodos da presente invenção,
260 / 509 incluindo aqueles conforme descritos, por exemplo, na Figura 8. Em algumas modalidades, um aumento em IFN-γ é indicativo de eficácia de tratamento em um paciente tratado com os TILs produzidos pelos métodos da presente invenção.
Em algumas modalidades, o IFN-γ é aumentado uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes, ou cinco vezes ou mais em comparação com um paciente não tratado e/ou em comparação com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos que aqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, a secreção de IFN-γ é aumentada uma vez em comparação com um paciente não tratado e/ou em comparação com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos que aqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, a secreção de IFN-γ é aumentada duas vezes em comparação com um paciente não tratado e/ou em comparação com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos que aqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, a secreção de IFN-γ é aumentada três vezes em comparação com um paciente não tratado e/ou em comparação com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos que aqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, a secreção de IFN-γ é aumentada quatro vezes em comparação com um paciente não tratado e/ou em comparação com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos que aqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, a secreção de IFN-γ é aumentada cinco vezes em comparação com um paciente não tratado e/ou em comparação com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos que aqueles
261 / 509 aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, o IFN-γ é medido usando um kit Quantikine® ELISA. Em algumas modalidades, o IFN-γ é medido em TILs ex vivo de um indivíduo tratado com TILs preparados pelos métodos da presente invenção, incluindo aqueles conforme descritos, por exemplo, na Figura 8. Em algumas modalidades, o IFN-γ é medido no sangue de um indivíduo tratado com TILs preparados pelos métodos da presente invenção, incluindo aqueles conforme descritos, por exemplo, na Figura 8. Em algumas modalidades, o IFN-γ é medido em soro de TILs de um indivíduo tratado com TILs preparados pelos métodos da presente invenção, incluindo aqueles conforme descritos, por exemplo, na Figura 8.
[00328] Em algumas modalidades, os TILs preparados pelos métodos da presente invenção, incluindo aqueles conforme descritos, por exemplo, na Figura 8, apresentam policlonalidade aumentada em comparação com os TILs produzidos por outros métodos, incluindo aqueles não exemplificados na Figura 8, como, por exemplo, os métodos referidos como métodos de processo 1C. Em algumas modalidades, policlonalidade significativamente aumentada e/ou policlonalidade aumentada é indicativo de eficácia de tratamento e/ou eficácia clínica aumentada. Em algumas modalidades, a policlonalidade refere-se à diversidade do repertório de células-T. Em algumas modalidades, um aumento em policlonalidade pode ser indicativo de eficácia de tratamento com relação à administração dos TILs produzidos pelos métodos da presente invenção. Em algumas modalidades, a policlonalidade é aumentada uma vez, duas vezes, dez vezes, 100 vezes, 500 vezes, ou 1.000 vezes em comparação com os TILs preparados usando métodos diferentes daqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, a policlonalidade é aumentada uma vez em comparação com um paciente não
262 / 509 tratado e/ou em comparação com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos que aqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, a policlonalidade é aumentada duas vezes em comparação com um paciente não tratado e/ou em comparação com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos que aqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, a policlonalidade é aumentada dez vezes em comparação com um paciente não tratado e/ou em comparação com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos que aqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, a policlonalidade é aumentada 100 vezes em comparação com um paciente não tratado e/ou em comparação com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos que aqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, a policlonalidade é aumentada 500 vezes em comparação com um paciente não tratado e/ou em comparação com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos que aqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, a policlonalidade é aumentada 1.000 vezes em comparação com um paciente não tratado e/ou em comparação com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos que aqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8.
[00329] As medições de eficácia podem incluir a taxa de controle da doença (DCR, Disease Control Rate) e também a taxa de resposta total (ORR, Overall Response Rate), conforme conhecidas na técnica e também aqui
263 / 509 descritas.
1. Métodos de Tratamento de Cânceres e de Outras Doenças
[00330] As composições e os métodos aqui descritos podem ser usados em um método para tratar doenças. Em uma modalidade, são para uso no tratamento de distúrbios hiperproliferativos. Podem também ser usados no tratamento de outros distúrbios conforme aqui descritos e nos parágrafos a seguir.
[00331] Em algumas modalidades, o distúrbio hiperproliferativo é câncer. Em algumas modalidades, o distúrbio hiperproliferativo é um câncer de tumor sólido. Em algumas modalidades, o câncer de tumor sólido é selecionado a partir do grupo consistindo em melanoma, câncer ovariano, câncer cervical, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer causado pelo vírus do papiloma humano, câncer de cabeça e pescoço (incluindo carcinoma de células escamosas da cabeça e do pescoço (HNSCC)), câncer renal, e carcinoma de célula renal. Em algumas modalidades, o distúrbio hiperproliferativo é uma malignidade hematológica. Em algumas modalidades, o câncer de tumor sólido é selecionado a partir do grupo consistindo em leucemia linfocítica crônica, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células-B grandes difusas, linfoma de não Hodgkin, linfoma de Hodgkin, linfoma folicular, e linfoma de células do manto.
[00332] Em uma modalidade, a invenção inclui um método de tratamento de um câncer com uma população de TILs, em que um paciente é pré-tratado com quimioterapia não mieloablativa antes de uma infusão de TILs de acordo com a presente descrição. Em uma modalidade, a quimioterapia não mieloablativa é ciclofosfamida a 60 mg/kg/dia durante 2 dias (dias 27 e 26 antes da infusão de TIL) e fludarabina a 25 mg/m²/dia durante 5 dias (dias 27 a 23 antes da infusão de TIL). Em uma modalidade, após a quimioterapia não mieloablativa a infusão de TIL (no dia 0) de acordo
264 / 509 com a presente descrição, o paciente recebe uma infusão intravenosa de IL-2 intravenosamente a 720.000 UI/kg a cada 8 horas até tolerância fisiológica.
[00333] A eficácia dos compostos e das combinações de compostos aqui descritos no tratamento, na prevenção e/ou no manejo das doenças indicadas ou dos distúrbios indicados pode ser testada usando vários modelos conhecidos na técnica, que proveem orientação para o tratamento de doença humana. Por exemplo, modelos para determinação da eficácia de tratamentos para câncer ovariano são descritos, por exemplo, em Mullany, et al., Endocrinology 2012, 153, 1585-92; e Fong, et al., J. Ovarian Res. 2009, 2,
12. Modelos para determinação da eficácia de tratamentos para câncer pancreático são descritas em Herreros-Villanueva, et al., World J. Gastroenterol. 2012, 18, 1286-1294. Modelos para determinação da eficácia de tratamentos para câncer de mama são descritos, por exemplo, em Fantozzi, Breast Cancer Res. 2006, 8, 212. Modelos para determinação da eficácia de tratamentos para melanoma são descritos, por exemplo, em Damsky, et al., Pigment Cell & Melanoma Res. 2010, 23, 853–859. Modelos para determinação da eficácia de tratamentos para câncer de pulmão são descritos, por exemplo, em Meuwissen, et al., Genes & Development, 2005, 19, 643-
664. Modelos para determinação da eficácia de tratamentos para câncer de pulmão são descritos, por exemplo, em Kim, Clin. Exp. Otorhinolaryngol. 2009, 2, 55-60; e Sano, Head Neck Oncol. 2009, 1, 32.
[00334] Em algumas modalidades, o IFN-gama (IFN-γ) é indicativo de eficácia de tratamento para tratamento de distúrbios hiperproliferativos. Em algumas modalidades, o IFN-γ no sangue de indivíduos tratados com TILs é indicativo de TILs ativos. Em algumas modalidades, é utilizado um ensaio de potência para a produção de IFN-γ. A produção de IFN-γ é outra medição do potencial citotóxico. A produção de IFN-γ pode ser medida pela determinação dos teores da citocina IFN-γ no sangue de um indivíduo tratado com TILs preparados pelos métodos da presente invenção, incluindo aqueles conforme
265 / 509 descritos, por exemplo, na Figura 8. Em algumas modalidades, os TILs obtidos pelo presente método proveem IFN-γ aumentado no sangue de indivíduos tratados com os TILs do presente método em comparação com os indivíduos tratados com TILs preparados usando os métodos referidos como o processo 1C, conforme exemplificado na Figura 13. Em algumas modalidades, um aumento em IFN-γ é indicativo de eficácia de tratamento em um paciente tratado com os TILs produzidos pelos métodos da presente invenção.
Em algumas modalidades, o IFN-γ é aumentado uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes, ou cinco vezes ou mais em comparação com um paciente não tratado e/ou em comparação com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos que aqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, a secreção de IFN-γ é aumentada uma vez em comparação com um paciente não tratado e/ou em comparação com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos que aqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, a secreção de IFN-γ é aumentada duas vezes em comparação com um paciente não tratado e/ou em comparação com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos que aqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, a secreção de IFN-γ é aumentada três vezes em comparação com um paciente não tratado e/ou em comparação com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos que aqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, a secreção de IFN-γ é aumentada quatro vezes em comparação com um paciente não tratado e/ou em comparação com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos que aqueles aqui providos incluindo, por
266 / 509 exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, a secreção de IFN-γ é aumentada cinco vezes em comparação com um paciente não tratado e/ou em comparação com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos que aqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, o IFN-γ é medido usando um kit Quantikine® ELISA. Em algumas modalidades, o IFN-γ é medido usando um kit Quantikine® ELISA. Em algumas modalidades, o IFN-γ é medido em TILs ex vivo de um paciente tratado com os TILs produzidos pelos métodos da presente invenção. Em algumas modalidades, o IFN-γ é medido no sangue em um paciente tratado com os TILs produzidos pelos métodos da presente invenção. Em algumas modalidades, o IFN-γ é medido no soro em um paciente tratado com os TILs produzidos pelos métodos da presente invenção.
[00335] Em algumas modalidades, os TILs preparados pelos métodos da presente invenção, incluindo aqueles conforme descritos, por exemplo, na Figura 8, apresentam policlonalidade aumentada em comparação com os TILs produzidos por outros métodos, incluindo aqueles não exemplificados na Figura 8, como, por exemplo, os métodos referidos como métodos de processo 1C. Em algumas modalidades, policlonalidade significativamente aumentada e/ou policlonalidade aumentada é indicativo de eficácia de tratamento e/ou eficácia clínica aumentada para tratamento de cânceres. Em algumas modalidades, a policlonalidade refere-se à diversidade do repertório de células-T. Em algumas modalidades, um aumento em policlonalidade pode ser indicativo de eficácia de tratamento com relação à administração dos TILs produzidos pelos métodos da presente invenção. Em algumas modalidades, a policlonalidade é aumentada uma vez, duas vezes, dez vezes, 100 vezes, 500 vezes, ou 1.000 vezes em comparação com os TILs preparados usando métodos diferentes daqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos
267 / 509 diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, a policlonalidade é aumentada uma vez em comparação com um paciente não tratado e/ou em comparação com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos que aqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, a policlonalidade é aumentada duas vezes em comparação com um paciente não tratado e/ou em comparação com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos que aqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, a policlonalidade é aumentada dez vezes em comparação com um paciente não tratado e/ou em comparação com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos que aqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, a policlonalidade é aumentada 100 vezes em comparação com um paciente não tratado e/ou em comparação com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos que aqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, a policlonalidade é aumentada 500 vezes em comparação com um paciente não tratado e/ou em comparação com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos que aqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8. Em algumas modalidades, a policlonalidade é aumentada 1.000 vezes em comparação com um paciente não tratado e/ou em comparação com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos que aqueles aqui providos incluindo, por exemplo, métodos diferentes daqueles representados como modalidade na Figura 8.
2. Métodos de Coadministração
268 / 509
[00336] Em algumas modalidades, os TILs produzidos conforme aqui descrito, incluindo por exemplo os TILs derivados de um método descrito nas Etapas A até F da Figura 8, podem ser administrados em combinação com um ou mais reguladores de ponto de checagem imune, como os anticorpos descritos abaixo. Por exemplo, os anticorpos que têm como alvo PD-1 e que podem ser coadministrados com os TILs da presente invenção incluem, por exemplo, mas não se limitam a, nivolumabe (BMS-936558, Bristol-Myers Squibb; Opdivo®), pembrolizumabe (lambrolizumabe, MK03475 ou MK- 3475, Merck; Keytruda®), anticorpo humanizado JS001 anti-PD-1 (ShangHai JunShi), anticorpo monoclonal TSR-042 anti-PD-1 (Tesaro, Inc.), Pidilizumabe (anti-PD-1 mAb CT-011, Medivation), anticorpo monoclonal BGB-A317 anti-PD-1 (BeiGene), e/ou anticorpo SHR-1210 anti-PD-1 (ShangHai HengRui), anticorpo monoclonal humano REGN2810 (Regeneron), anticorpo monoclonal humano MDX-1106 (Bristol-Myers Squibb), e/ou anticorpo IgG4 humanizado PDR001 anti-PD-1 (Novartis). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é do clone: RMP1-14 (IgG de rato) - BioXcell, nº de catálogo BP0146. Outros anticorpos adequados para uso em métodos de coadministração com TILs produzidos de acordo com as Etapas A até F, conforme aqui descritas, são anticorpos anti-PD-1 revelados em Patente Norte-Americana nº 8.008.449, aqui incorporada como referência. Em algumas modalidades, o anticorpo ou a porção do mesmo de ligação ao antígeno especificamente se liga ao PD-L1 e inibe sua interação com PD-1, aumentando, assim, a atividade imune. Quaisquer anticorpos conhecidos na técnica que se ligam ao PD-L1 e disrupcionam a interação entre a PD-1 e o PD-L1, e estimula uma resposta imune antitumoral, são adequados para uso em métodos de coadministração com TILs produzidos de acordo com as Etapas A até F conforme aqui descritas. Por exemplo, os anticorpos que têm como alvo PD-L1 e estão em testes clínicos, incluem BMS-936559 (Bristol- Myers Squibb) e MPDL3280A (Genentech). Outros anticorpos adequados
269 / 509 que têm como alvo PD-Ll são revelados em Patente Norte-Americana nº
7.943.743, aqui incorporada como referência. Será entendido por uma pessoa comumente versada na técnica que qualquer anticorpo que se liga à PD-1 ou ao PD-L1, disrupciona a interação PD-1/PD-L1, e estimula uma resposta imune antitumoral, é adequado para uso em métodos de coadministração com TILs produzidos de acordo com as Etapas A até F conforme aqui descritas. Em algumas modalidades, o indivíduo administrado com a combinação de TILs produzidos de acordo com as Etapas A até F é coadministrado com um anticorpo anti-PD-1 quando o paciente tem um tipo de câncer que é refratário à administração do anticorpo anti-PD-1 sozinho. Em algumas modalidades, o paciente é administrado com TILs em combinação com anticorpo anti-PD-1 quando o paciente tem melanoma refratário. Em algumas modalidades, o paciente é administrado com TILs em combinação com anticorpo anti-PD-1 quando o paciente tem carcinoma de pulmão de células não pequenas (NSCLC, Non-Small-Cell Lung Carcinoma).
3. Pré-condicionamento Opcional de Pacientes por Linfodepleção
[00337] Em uma modalidade, a invenção inclui um método de tratamento de um câncer com uma população de TILs, em que um paciente é pré-tratado com quimioterapia não mieloablativa antes de uma infusão de TILs de acordo com a presente descrição. Em uma modalidade, a invenção inclui uma população de TILs para uso no tratamento de câncer em um paciente que tem sido pré-tratado com quimioterapia não mieloablativa. Em uma modalidade, a população de TILs é para administração por infusão. Em uma modalidade, a quimioterapia não mieloablativa é ciclofosfamida 60 mg/kg/dia durante 2 dias (dias 27 e 26 antes da infusão de TIL) e fludarabina 25 mg/m²/d durante 5 dias (dias 27 a 23 antes da infusão de TIL). Em uma modalidade, após a quimioterapia não mieloablativa a infusão de TIL (no dia 0) de acordo com a presente descrição, o paciente recebe uma infusão intravenosa de IL-2 (aldesleucina, comercialmente disponível como
270 / 509 PROLEUKIN) intravenosamente a 720.000 UI/kg a cada 8 horas até tolerância fisiológica. Em determinadas modalidades, a população de TILs é para uso no tratamento de câncer em combinação com IL-2, em que o IL-2 é administrado após a população de TILs.
[00338] Revelações experimentais indicam que a linfodepleção antes da transferência adotiva de linfócitos-T específicos para tumor desempenha uma função muito importante na intensificação da eficácia do tratamento pela eliminação de células-T regulatórias e elementos competidores do sistema imune (‘escoadouros de citocinas’). Consequentemente, algumas modalidades da invenção utilizam uma etapa de linfodepleção (algumas vezes também referida como “condicionamento imunossupressor”) no paciente antes da introdução dos TILs da invenção.
[00339] Em geral, a linfodepleção é realizada usando administração de fludarabina ou ciclofosfamida (a forma ativa sendo referida como mafosfamide) e combinações das mesmas. Tais métodos são descritos em Gassner, et al., Cancer Immunol. Immunother. 2011, 60, 75–85, Muranski, et al., Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668–681, Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-5239, e Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346–2357, todas as quais são aqui incorporadas em suas totalidades como referências.
[00340] Em algumas modalidades, a fludarabina é administrada a uma concentração de 0,5 μg/mL-10 μg/mL de fludarabina. Em algumas modalidades, a fludarabina é administrada a uma concentração de 1 μg/mL de fludarabina. Em algumas modalidades, o tratamento com fludarabina é administrada durante 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, ou 7 dias ou mais. Em algumas modalidades, a fludarabina é administrada a uma dosagem de 10 mg/kg/dia, 15 mg/kg/dia, 20 mg/kg/dia¸ 25 mg/kg/dia, 30 mg/kg/dia, 35 mg/kg/dia, 40 mg/kg/dia, ou 45 mg/kg/dia. Em algumas modalidades, o tratamento com fludarabina é administrada durante 2-7 dias a 35 mg/kg/dia. Em algumas modalidades, o tratamento com fludarabina é administrada
271 / 509 durante 4-5 dias a 35 mg/kg/dia. Em algumas modalidades, o tratamento com fludarabina é administrada durante 4-5 dias a 25 mg/kg/dia.
[00341] Em algumas modalidades, a mafosfamida, a forma ativa de ciclofosfamida, é obtida a uma concentração de 0,5 μg/mL-10 μg/mL pela administração de ciclofosfamida. Em algumas modalidades, a mafosfamida, a forma ativa de ciclofosfamida, é obtida a uma concentração de 1 μg/mL pela administração de ciclofosfamida. Em algumas modalidades, o tratamento com ciclofosfamida é administrado durante 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, ou 7 dias ou mais. Em algumas modalidades, a ciclofosfamida é administrada a uma dosagem de 100 mg/m²/dia, 150 mg/m²/dia, 175 mg/m²/dia, 200 mg/m²/dia, 225 mg/m²/dia, 250 mg/m²/dia, 275 mg/m²/dia, ou 300 mg/m²/dia. Em algumas modalidades, a ciclofosfamida é administrada intravenosamente (isto é, i.v.) Em algumas modalidades, o tratamento com ciclofosfamida é administrado durante 2- 7 dias a 35 mg/kg/dia. Em algumas modalidades, o tratamento com ciclofosfamida é administrado durante 4-5 dias a 250 mg/m²/dia i.v. Em algumas modalidades, o tratamento com ciclofosfamida é administrado durante 4 dias a 250 mg/m²/dia i.v.
[00342] Em algumas modalidades, a linfodepleção é realizada pela administração da fludarabina e da ciclofosfamida, juntas, a um paciente. Em algumas modalidades, a fludarabina é administrada a 25 mg/m²/dia i.v. e a ciclofosfamida é administrada a 250 mg/m²/dia i.v. durante 4 dias.
[00343] Em uma modalidade, a linfodepleção é realizada pela administração de ciclofosfamida a uma dose de 60 mg/m²/dia durante dois dias seguida pela administração de fludarabina a uma dose de 25 mg/m²/dia durante cinco dias.
4. Regimes de IL-2
[00344] Em uma modalidade, o regime de IL-2 compreende um regime de alta dose de IL-2, em que o regime de alta dose de IL-2 compreende
272 / 509 aldesleucina, ou um biossimilar da mesma ou uma variante da mesma, administrada(o) intravenosamente no dia após a administração de uma porção terapeuticamente eficaz de população terapêutica de TILs, em que a aldesleucina ou um biossimilar ou uma variante da mesma é administrada(o) a uma dose de 0,037 mg/kg ou 0,044 mg/kg UI/kg (massa corporal do paciente) usando infusões intravenosas de bolus durante 15 minutos a cada oito horas até tolerância, para um máximo de 14 doses. Após 9 dias de repouso, este cronograma pode ser repetido para outras 14 doses, para um máximo de 28 doses no total.
[00345] Em uma modalidade, o regime de IL-2 compreende um regime de IL-2 decrescente. Regimes de IL-2 decrescentes têm sido descritos em O’Dia, et al., J. Clin. Oncol. 1999, 17, 2752-61 e Eton, et al., Cancer 2.000, 88, 1703-9, cujas descrições são aqui incorporadas como referências. Em uma modalidade, um regime de IL-2 decrescente compreende 18×106 UI/m² administradas intravenosamente durante 6 horas, seguidas por 18×106 UI/m² administradas intravenosamente durante 12 horas, seguidas por 18×106 UI/m² administradas intravenosamente durante 24 horas, seguidas por 4,5×106 UI/m² administradas intravenosamente durante 72 horas. Este ciclo de tratamento pode ser repetido a cada 28 dias para um máximo de quatro ciclos. Em uma modalidade, um regime de IL-2 decrescente compreende 18.000.000 UI/m² no dia 1, 9.000.000 UI/m² no dia 2, e 4.500.000 UI/m² nos dias 3 e 4.
[00346] Em uma modalidade, o regime de IL-2 compreende administração de IL-2 peguilada a cada 1, 2, 4, 6, 7, 14 ou 21 dias a uma dose de 0,10 mg/dia a 50 mg/dia.
5. Transferência Adotiva de Células
[00347] A transferência adotiva de células (ACT) é uma forma muito eficaz de imunoterapia e envolve a transferência de células imunes com atividade antitumoral para dentro de pacientes com câncer. ACT é uma abordagem de tratamento que envolve a identificação, in vitro, de linfócitos
273 / 509 com atividade antitumoral, a expansão in vitro destas células para números grandes e a infusão delas para dentro do hospedeiro possuindo câncer. Os linfócitos usados para transferência adotiva podem ser derivados do estroma de tumores resseccionados (linfócitos infiltrantes de tumor ou TILs). Os TILs para ACT podem ser preparados conforme aqui descrito. Em algumas modalidades, os TILs são preparados, por exemplo, de acordo com um método conforme descrito na Figura 8. Também podem ser derivados ou do sangue se são geneticamente modificados para expressar receptores de células-T (TCRs) antitumorais ou receptores quiméricos de antígenos (CARs), enriquecidos com culturas de células tumorais linfocíticas mistas (MLTCs, Mixed Lymphocyte Tumor Cell Cultures), ou clonados usando células apresentadoras de antígenos autólogas e peptídeos derivados de tumor. ACT na qual os linfócitos se originam do hospedeiro possuindo câncer a ser infundido é chamada de ACT autóloga. A Publicação Norte-Americana nº 2011/0052530 refere-se a um método para realizar terapia adotiva de células para promover regressão de câncer, principalmente para tratamento de pacientes sofrendo de melanoma metastásico, que é aqui incorporada em sua totalidade, como referência, para estes métodos. Em algumas modalidades, os TILs podem ser administrados conforme aqui descrito. Em algumas modalidades, os TILs podem ser administrados em uma dose única. Tal administração pode ser por injeção, por exemplo, injeção intravenosa. Em algumas modalidades, os TILs e/ou linfócitos citotóxicos podem ser administrados em doses múltiplas. A dosagem pode ser uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, seis vezes, ou mais que seis vezes por ano. A dosagem pode ser uma vez por mês, uma vez a cada duas semanas, uma vez por semana, ou uma vez a cada dois dias. A administração de TILs e/ou de linfócitos citotóxicos pode continuar desde que necessária.
6. Modalidades de Tratamento Exemplificadoras
[00348] Em algumas modalidades, a presente descrição provê um
274 / 509 método de tratamento de um câncer com uma população de linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) compreendendo as etapas de (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente; (b) realizar uma expansão inicial da primeira população de TILs em um primeiro meio de cultura de células para obter uma segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 5 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que o primeiro meio de cultura de células compreende IL-2; (c) realizar uma expansão rápida da segunda população de TILs usando uma população de células apresentadoras de antígenos artificiais mieloides (aAPCs mieloides) em um segundo meio de cultura de células para obter uma terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a segunda população de TILs após 7 dias a partir do início da expansão rápida; e em que o segundo meio de cultura de células compreende IL-2 e OKT-3; (d) administrar uma porção terapeuticamente eficaz da terceira população de TILs a um paciente com o câncer.
Em algumas modalidades, uma população de linfócitos infiltrantes de tumor (TILs), da presente descrição, para uso em tratamento de câncer, em que a população de TILs é obtenível um método compreendendo as etapas de (b) realizar uma expansão inicial de uma primeira população de TILs obtida de um tumor ressecionado de um paciente em um primeiro meio de cultura de células para obter uma segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 5 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que o primeiro meio de cultura de células compreende IL-2; (c) realizar uma expansão rápida da segunda população de TILs usando uma população de células apresentadoras de antígenos artificiais mieloides (aAPCs mieloides) em um segundo meio de cultura de células para obter uma terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a segunda população de TILs após 7 dias a partir do início da expansão rápida; e em que o segundo meio de
275 / 509 cultura de células compreende IL-2 e OKT-3; (d) administrar uma porção terapeuticamente eficaz da terceira população de TILs a um paciente com o câncer.
Em algumas modalidades, o método compreende uma primeira etapa (a) de obter a primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente.
Em algumas modalidades, a IL-2 está presente a uma concentração final de cerca de 3.000 UI/mL e o anticorpo OKT-3 está presente a uma concentração final de cerca de 30 ng/mL no segundo meio de cultura de células.
Em algumas modalidades, a primeira expansão é realizada durante um período não maior que 14 dias.
Em algumas modalidades, a primeira expansão é realizada usando um recipiente permeável a gás.
Em algumas modalidades, a segunda expansão é realizada usando um recipiente permeável a gás.
Em algumas modalidades, a razão entre a segunda população de TILs e a população de aAPCs na expansão rápida está entre 1 a 80 e 1 a 400. Em algumas modalidades, a razão entre a segunda população de TILs e a população de aAPCs na expansão rápida é cerca de 1 a 300. Em algumas modalidades, o câncer para tratamento é selecionado a partir do grupo consistindo em melanoma, câncer ovariano, câncer cervical, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer causado pelo vírus do papiloma humano, câncer de cabeça e pescoço (incluindo carcinoma de células escamosas da cabeça e do pescoço (HNSCC)), câncer renal, e carcinoma de célula renal.
Em algumas modalidades, o câncer para tratamento é selecionado a partir do grupo consistindo em melanoma, câncer ovariano, e câncer cervical.
Em algumas modalidades, o câncer para tratamento é melanoma.
Em algumas modalidades, o câncer para tratamento é câncer ovariano.
Em algumas modalidades, o câncer para tratamento é câncer cervical.
Em algumas modalidades, o método de tratamento de câncer compreende, adicionalmente, a etapa de tratamento do paciente com um regime de linfodepleção não mieloablativo antes da administração da terceira população de TILs ao
276 / 509 paciente.
Em algumas modalidades, regime de linfodepleção não mieloablativo compreende as etapas de administração de ciclofosfamida a uma dose de 60 mg/m²/dia durante dois dias seguida pela administração de fludarabina a uma dose de 25 mg/m²/dia durante cinco dias.
Em algumas modalidades, o regime de alta dose de IL-2 compreende 600.000 ou 720.000 UI/kg de aldesleucina, ou de um biossimilar da mesma ou de uma variante da mesma, administradas como uma infusão intravenosa de bolus durante 15 minutos a cada oito horas até tolerância.
Em algumas modalidades, os TILs usados para tratamento têm sido colocados em contato com um ou mais sd- RNAs que têm como alvos genes conforme aqui descritos, incluindo PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, que podem ser adicionados ao meio de cultura de células durante a primeira expansão e/ou a segunda expansão, por exemplo, as etapas B, C, e/ou D de acordo com a Figura 8, em que os TILs e outros agentes podem ser adicionados em quantidades selecionadas a partir do grupo consistindo em 0,1 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 0,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 0,75 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1,25 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 2 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, ou 10 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio.
Em algumas modalidades, os TILs usados para tratamento têm sido colocados em contato com um ou mais sd-RNAs que têm como alvos genes conforme aqui descritos, incluindo PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, que podem ser adicionados às culturas de TIL durante a primeira expansão e/ou a segunda expansão, por exemplo, as etapas B, C, e/ou D de acordo com a Figura 8, duas vezes por dia, um vez por dia, a cada dois dias, a cada três dias, a cada quatro dias, a cada cinco dias, a cada seis dias, ou a cada sete dias.
Em uma modalidade, os TILs usados para tratamento têm sido colocados em contato com um ou mais sd-RNAs que têm como
277 / 509 alvos genes conforme aqui descritos, incluindo PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, em que os TILs e outros agentes podem ser adicionados durante a primeira expansão e/ou a segunda expansão, por exemplo, as etapas B, C, e/ou D de acordo com a Figura 8, em quantidades selecionadas a partir do grupo consistindo em 0,1 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 0,5 μM de sd- RNA/10.000 TILs, 0,75 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1 μM de sd- RNA/10.000 TILs, 1,25 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1,5 μM de sd- RNA/10.000 TILs, 2 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, ou 10 μM de sd-RNA/10.000 TILs. Em uma modalidade, os TILs usados para tratamento têm sido colocados em contato com um ou mais sd- RNAs que têm como alvos genes conforme aqui descritos, incluindo PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, em que os TILs e outros agentes podem ser adicionados às culturas de TIL durante a primeira expansão e/ou a segunda expansão, por exemplo, as etapas B, C, e/ou D de acordo com a Figura 8, duas vezes por dia, um vez por dia, a cada dois dias, a cada três dias, a cada quatro dias, a cada cinco dias, a cada seis dias, ou a cada sete dias.
EXEMPLOS
[00349] As modalidade aqui abrangidas são agora descritas com referência aos seguintes exemplos. Estes exemplos são providos apenas para o propósito de ilustração e a descrição abrangida aqui não deve ser em nenhuma maneira interpretada como sendo limitada a estes exemplos, mas, ao contrário, deve ser interpretada como abrangendo qualquer uma das e todas as variações que se tornam evidentes como resultado dos ensinamentos aqui providos. EXEMPLO 1: ENSAIOS EM SISTEMA FECHADO
[00350] Conforme aqui discutido, os protocolos e os ensaios foram desenvolvidos para gerar TILs a partir de tumores de pacientes em um sistema fechado.
[00351] Este Exemplo descreve um procedimento novo abreviado para
278 / 509 geração de números clinicamente relevantes de TILs a partir de tecido de tumor resseccionado de pacientes em dispositivos G-Rex e criopreservação do produto de células final. Aspectos adicionais deste procedimento são descritos nos Exemplos 2 a 8. Procedimento
[00352] Preparação Antecipada: Dia 0 (Realizada antecipadamente até 36 horas), Preparado Tampão de Lavagem de Isolamento de TIL (TIWB, TIL Isolation Wash Buffer) por suplementação com 500mL de Solução Salina Balanceada de Hanks (HBSS, Hanks Balanced Salt Solution) com 50 µg/mL de gentamicina. Para solução de estoque de 10 mg/mL de Gentamicina, transferidos 2,5mL para HBSS. Para solução de estoque de 50 mg/mL, transferido 0,5mL para HBSS.
[00353] Preparado meio CM1 com GlutaMAX™ de acordo com LAB- 005 “Preparation of media for PreREP and REP” for CM2 instructions” [LAB-005 “Preparação de meios para PreREP e REP” para instruções de CM2”]. Armazenar a 4°C até 24 horas. Permitido aquecer a 37°C durante pelo menos 1 hora antes do uso.
[00354] Removida(s) alíquota(s) de IL-2 do congelador a -20°C e colocada(s) alíquota(s) em refrigerador a 2-8°C. Removido espécime de tumor e armazenado a 4°C até pronto para processamento.
[00355] Expedido tumor não usado quer em HypoThermasol™ quer como fragmentos congelados em CryoStor CS10 (ambos comercialmente disponíveis junto à BioLife Solutions, Inc.). Processamento de tumor para TIL
[00356] Assepticamente transferidos os seguintes materiais para a Cabine de Biossegurança (BSC), conforme a necessidade, e rotulados de acordo com Tabela 16 abaixo. TABELA 16. Materiais para isolamento de tumor. Item Quantidade Rotulagem em Processo Mínima Tumor 1 N/A
279 / 509 Placa de Petri, 150 mm 1 Dissecação Placa de Petri, 100 mm 4 Lavar 1, 2, 3, 4 Placa de Petri, 100 mm 1 Tecido Desfavorável Placa de 6 poços 2 Rótulo da Tampa – “Fragmentos de tumor” Fundo da Placa – “Tecido Favorável” Régua 2 N/A Tampão de Lavagem 1 N/A Fórceps 1 N/A Fórceps longo 1 N/A Escalpelo Conforme a N/A necessidade
[00357] Transferidos 5mL de gentamicina para o frasco HBSS. Rotulado como TIWB. Remoinhado para misturar. Pipetados 50mL de TIWB para cada placa. Usando fórceps longo, removido(s) o(s) tumor(es) do frasco de Espécime e transferido(s) para a placa de Lavagem 1. Incubado o tumor à temperatura ambiente na placa de lavagem durante 3 minutos. Transferido o tumor para a placa de lavagem e incubado o tumor à temperatura ambiente no frasco de lavagem durante 3 minutos. Repetir a lavagem em frasco de lavagem novo.
[00358] Medido e registrado o comprimento do tumor. Realizada uma dissecação inicial dos pedaços de tumor em 10 pedaços intermediários e conservar a estrutura do tumor de cada pedaço intermediário. Trabalhando com um pedaço de tumor intermediário de cada vez, cuidadosamente fatiado o tumor em fragmentos de até 3x3x3mm. Repetido para os pedados de tumor intermediários restantes.
[00359] Se menos que 4 fragmentos de tumor estavam disponíveis, usados outros fragmentos conforme a disponibilidade para alcançar um número de 40 fragmentos. Quando menos que 40 fragmentos, 10-40 foram colocados em um frasco G-Rex-100M único. Frasco G-Rex-100M de Semeadura:
[00360] Assepticamente transferidos os seguintes materiais para a BSC, conforme a necessidade, e rotulados de acordo com a Tabela 4 abaixo. TABELA 17. Materiais Adicionais para Frascos de Semeadura. Rotulagem em Item Quantidade Mínima Processo Frasco G-Rex-100M Conforme a Necessidade Lote nº CM1 Quente Conforme a Necessidade Lote nº
280 / 509 Alíquotas de IL-2 Conforme a Necessidade Lote nº
[00361] Suplementado cada litro de CM1 com 1mL de solução de estoque de IL-2 (6×106 UI/mL).
[00362] Adicionados 1.000mL de CM1 preaquecido contendo 6.000 UI/mL de IL-2 em cada biorreator G-Rex-100M necessário conforme determinado pela Tabela 5 abaixo. Usando uma pipeta de transferência, transferido o número apropriado de fragmentos de tumor para cada frasco G- Rex-100M, distribuindo os fragmentos de acordo com a Tabela 5. Quando um ou mais fragmentos de tumor são transferidos para o frasco flutuante G-Rex- 100M, obtido um fragmento de tumor adicional conforme disponibilidade e transferido para o frasco G-Rex-100M. Registrado o número total de fragmentos adicionados a cada frasco. Deixado cada biorreator G-Rex-100M em incubadora a 37°C, 5% de CO2.
[00363] Quando >41 fragmentos foram obtidos, adicionados 1.000mL de CM1 completo preaquecido a um segundo biorreator G-Rex-100M. TABELA 18. Número de biorreatores G-Rex necessários. Número de Fragmentos G-Rex Número de G- CM1 Necessário Rex 1-40 G-Rex-100M 1 1.000mL 41-80 distribuir entre os frascos G-Rex-100M 2 2.000mL >80 Congelar os fragmentos em CS10 após pré-incubação durante 15 minutos Preparação Antecipada: Dia 11 (Preparada antecipadamente até 24 horas):
[00364] Preparados 6L de CM2 com GlutaMAX™. Usados procedimentos de laboratório de referência para “Preparation of media for PreREP and REP” for CM2 instructions”. Aquecido a 37°C, 1 hora antes de usar. Descongeladas alíquotas de IL-2: Removidas alíquotas de IL-2 do congelador e posicionadas a 4°C. Colheita de TILs (Dia 11)
[00365] Removidos frascos G-Rex-100M da incubadora e colocados em BSC2. Não perturbar as células sobre o fundo do frasco. Usando bomba GatheRex™ ou bomba peristáltica, aspirados ~900mL de sobrenadante de
281 / 509 cultura de células do(s) frasco(s). Ressuspensos os TILs por remoinho suave do frasco. Observado que todas as células têm sido liberadas da membrana. Transferida a suspensão de células residual para um pacote de transferência de sangue (300-1.000mL). Houve cuidado para não permitir que os fragmentos fossem transferidos para o pacote de transferência de sangue. Furado o pacote de transferência com um conjunto de transferência de plasma de 4 in (10 cm). Misturada a suspensão de células e usando uma seringa de 3mL, removido 1mL de suspensão de TILs para contagem de células. Deixado o pacote de transferência dentro da incubadora até pronto para uso. Preparação do meio
[00366] Preparado meio com aquecimento a 37°C durante >1h. Adicionados 3mL de solução de estoque de 6×106 UI/mL de rhIL-2 a 6L de CM2 para alcançar uma concentração final de 3.000 UI/mL de rhIL-2 (“CM2 completo”). Esterilmente soldado um conjunto de transferência de plasma de 4 in (10 cm) com Luer fêmea em um pacote de transferência de 1L. Transferidos 500mL de CM2 completo para um pacote de transferência de 1L. Usando uma seringa de 1,0mL com agulha, retirados 150 µL de solução de anticorpo anti-CD3 (clone OKT3) a 1 mg/mL, e transferidos para 500mL de “CM2 completo”. Armazenado a 37°C até o uso. Preparação do frasco
[00367] Transferidos 4,5L de “CM2 completo” para um frasco G-Rex- 500M e deixado o frasco dentro de incubadora a 37°C até pronto para uso. Congelamento de células alimentadoras irradiadas
[00368] Utilizadas 5,0×109 células alimentadoras alogeneicas irradiadas de dois ou mais doadores para uso. Removidas as células alimentadoras do congelador de LN2 (Nitrogênio Líquido). Descongeladas as células alimentadoras em incubadora a 37°C ou em banho de esferas. Removidas as células alimentadoras do banho quando quase completamente descongeladas mas ainda frias. Adicionada cada bolsa de células
282 / 509 alimentadoras diretamente ao frasco G-Rex-500M aberto para garantir número suficiente de células irradiadas (5×109 células, +/- 20%). Removido pacote de transferência de 1L com 500mL de “CM2 completo” + OKT3 e transferida para a BSC. Retirados os conteúdos inteiros das bolsas de células alimentadoras para dentro da seringa, registrado o volume, e dispensadas 5,0×109 células alimentadoras alogeneicas irradiadas para dentro do pacote de transferência.
[00369] Quando +/- 10% do número de células alvo (5,0×109) foi alcançado com viabilidade >70%, prosseguido. Quando menos que 90% do número de células alvo (5,0×109) foi alcançado com viabilidade >70%, descongelada outra bolsa e repetido conforme acima. Quando mais que 110% do número de células alvo foi alcançado, calculado o volume apropriado requerido para a dose de células desejada, e prosseguido. Cocultura de TILs e de células alimentadoras em frasco G-Rex-500M
[00370] Removido da incubadora o frasco G-Rex-500M contendo o meio preparado. Ligada ao pacote de transferência de células alimentadoras ao frasco G-Rex-500M e permitido que os conteúdos da bolsa drenassem para dentro do frasco G-Rex-500M. Calculado o volume de suspensão de TILs a ser adicionado para alcançar 200×106 células viáveis totais (TVC, Total Viable Cells). (TVC/mL) / 200 x 106 = mL
[00371] Quando TILs estavam entre 5×106 e 200×106 células viáveis totais, adicionados todos TILs (volume total) ao frasco G-Rex-500M. Quando a contagem de TILs foi maior que 200×106 células viáveis totais, adicionado o volume calculado necessário para 200×106 TILs a serem distribuídos em um frasco G-Rex-500M individual. Os TILs restantes foram centrifugados e congelados em pelo menos dois criofrascos até 108/mL em CS10, rotulados com identificação de TILs e de data de congelamento.
[00372] Deixado o frasco G-Rex-500M em incubadora a 37°C, 5% de
283 / 509 CO2 durante 5 dias. Preparação Antecipada: Dias 16-18
[00373] Aquecida uma bolsa de 10L de AIM V® para culturas iniciadas com menos que 50×106 TILs, aquecidas duas bolsas para aquelas culturas iniciadas com mais que 50×106 TILs a 37°C pelo menos 1 h ou até prontas para uso. Realizada contagem de células TIL: dias 16-18.
[00374] Removidos o frasco G-Rex-500M da incubadora e houve o cuidado para não perturbar a cultura de células sobre o fundo do frasco. Removidos 4L do meio de cultura de célula do frasco G-Rex-500M e colocados dentro de um recipiente estéril. Remoinhado o frasco G-Rex-500M até que todos os TILs tivessem sido ressuspensos da membrana. Transferida a suspensão de células para um pacote de transferência de 2L. Retido o frasco G-Rex-500M para uso posterior. Calculado o número total de frascos requeridos para subcultura de acordo com a seguinte fórmula. Frações arredondadas para cima. Número total de células viáveis / 1,0×109 = Número de frascos Preparo de CM4
[00375] Preparada uma bolsa de 10L de AIM-V® para cada dois novos frascos G-Rex-500M necessários. Aquecido meio adicional conforme a necessidade. Para 10L de AIM-V® necessários, adicionados 100mL de GlutaMAX™ para preparar CM4. Suplementado meio CM4 com rhIL-2 para uma concentração final de 3.000 UI/mL de rhIL-2. Dividida a cultura de células. Cheio cada frasco G-Rex-500M até 5 L. Distribuído uniformemente o volume de TILs de acordo com o número calculado de frascos G-Rex-500M. Deixados os frascos em incubadora a 37°C, 5% de CO2 até a colheita no Dia 22 de REP. Preparação Antecipada: dias 22-24:
[00376] Preparados 2L de tampão de lavagem com 1% de HSA pela
284 / 509 adição de 40mL de solução de HSA 25% a cada uma de duas bolsas de 1L de PlasmaLyte A 7.4. Agrupar em uma bolsa ancilar LOVO. Suplementados 200mL de CS10 com IL-2 a 600 UI/mL. Pré-esfriados cassetes de alumínio de 750mL de congelador a 4°C. Colheita de TILs: dias 22-24
[00377] Removidos os frascos G-Rex-500M da incubadora a 37°C e houve cuidado para não perturbar a cultura de células sobre o fundo do frasco. Aspirados e descartados 4,5L de sobrenadante de cultura de células de cada frasco. Remoinhado o frasco G-Rex-500M para completamente ressuspender os TILs. Colhidos os TILs para dentro da bolsa de bioprocesso. Misturada bem a bolsa e usando uma seringa de 3mL retirar 2 amostras de 2mL para contagem de células. Pesada a bolsa e verificada a diferença entre o peso inicial e o peso final. Usado o seguinte cálculo para determinar o volume de suspensão de células. Peso líquido de suspensão de células (mL) / 1,03 = Volume (mL)
[00378] Filtrar os TILs e preparar bolsa fonte LOVO. Logo que todas as células foram transferidas para a bolsa fonte LOVO, fechados todos os clampes e vedada a tubulação da bolsa fonte LOVO para remover o filtro, e a bolsa foi pesada. Calculado o volume.
[00379] Formular TILs 1:1 em CS10 frio suplementado com 600 UI/mL de rhIL-2.
[00380] Calculado o número requerido de criobolsas necessárias. (Volume de produto de células x 2) / 100 = Número de bolsas requeridas (arredondamento para baixo)
[00381] Calculado o volume para dispensar para dentro de cada bolsa. (Volume de produto de células x 2) / Número de bolsas requeridas = Volume a adicionar a cada bolsa
[00382] Assepticamente transferidos os seguintes materiais na Tabela 6 para a BSC.
285 / 509 TABELA 19. Materiais para criopreservação de TIL. Item Quantidade Rotulagem em Processo Mínima Produto de células 1 Lote nº Cassete de alumínio de congelador (750mL) 1 n/a CS10 Frio + IL-2 a 600 UI/mL Conforme a Lote nº Necessidade Dispositivo C1 de Conexão de Célula 1 n/a Criobolsas de 750mL calculadas Rotular alíquotas 1- maiores nº Seringa de 100mL Nº de criobolsas n/a +1 Torneira de 3 vias 1 n/a Criofrascos 5 Frascos satélites de crioproduto de
TIL Formulação de TILs:
[00383] Ligados o produto final de células LOVO, o Luer-lock da bolsa CS10 e o número apropriado de criobolsas. A quantidade de volume de CS10 necessária foi equivalente ao volume da bolsa de produto final de células LOVO. Misturada a bolsa de produto final de células LOVO por inversão.
[00384] Transferidos 100mL de produto formulado para dentro de cada bolsa. Removidas todas as bolhas de ar das criobolsas, e as criobolsas foram vedadas. Transferidas as bolsas vedadas para 4°C durante um tempo e colocadas dentro de cassetes de alumínio de congelador pré-esfriados. Criopreservação de TILs usando Congelador com Velocidade de Congelamento Controlada (Control Rate Freezer (CRF)).
[00385] Seguido o procedimento padrão para o Congelador com Velocidade de Congelamento Controlada. Após o uso do CRF, armazenadas as criobolsas em nitrogênio líquido (LN2). EXEMPLO 2: LINFODEPLEÇÃO
[00386] As contagens de células pode ser realizada no dia 7 e antes da linfodepleção. O produto de células final incluiu até aproximadamente 150×109 células viáveis formuladas em um mínimo de 50% de HypoThermosol™ em PlasmaLyte A™ (volume/volume) e até 0,5% de HSA (compatível para infusão humana) contendo 300 UI/mL de IL2. O produto final estava disponível para administração em um dos dois volumes para
286 / 509 infusão: 1) 250mL (em um bolsa de infusão de capacidade de 300mL) quando os TILs totais colhidos são ≤ 75×109,
OU 2) 500mL (em uma bolsa de infusão de capacidade de 600mL) quando os TILs totais colhidos são < 150×109.
[00387] Não pode ser predito o número total de células que puderam ser geradas para o produto de infusão de TILs final para cada paciente devido à variação de paciente para paciente nas taxas de expansão de células-T durante a etapa de REP. Um limite inferior de células nos dias 3, 4, 5, 6, 7 do REP de 3 a 14 dias é ajustado baseado no número mínimo de células necessárias com o propósito de tomar uma decisão para linfodepletar o paciente usando o regime de quimioterapia com ciclofosfamida mais fludarabina. Logo que começamos a linfodepleção com base neste número mínimo de células alcançado, nós nos comprometermos a tratar o paciente com o minério disponível de TILs que geramos no REP em qualquer um dos dias 3 a 14, e, em muitos casos, no dia 7. O limite superior da faixa para infusão (150×109 células viáveis) é baseado no limite superior conhecido publicado seguramente infundido no qual tem sido alcançada uma resposta clínica. Radvanyi, et al., Clin Cancer Res 2012, 18, 6758-6770. EXEMPLO 3: PROCESSO 2A – DIA 0
[00388] Este exemplo descreve o protocolo detalhado do dia 0 para o processo 2A descrito nos Exemplos 3 a 6. Preparação.
[00389] Confirmado que Meio de Lavagem de Tumor, CM1, e IL-2 estão dentro do prazo de validade. Colocado CM1 (Cell Media 1, meio de células 1) na incubadora. Método.
[00390] Preparado meio CM1 de TILs contendo 6.000 UI/mL de IL-2:
287 / 509 1L de CM1 e 1mL de solução de IL-2 (6.000.000 UI/mL). Adicionados 25mL de CM1+IL2 ao tubo cônico de 50mL a ser usado para fragmentos quando se adiciona ao frasco G-Rex e colocado na incubadora a 37°C para preaquecimento.
[00391] Bombeados 975mL de CM1 preaquecido contendo 6.000 UI/mL de IL-2 em cada biorreator G-Rex-100MCS. Deixado o biorreator G- Rex-100MCS na incubadora até ser necessário. Dissecação de Tecido
[00392] Registrada a hora de início de processamento de tumor. Pipetados 3-5mL de Meio de Lavagem de Tumor para dentro de cada poço de uma das placas de seis poços para pedaços de tumor em excesso. Pipetados 50mL de Meio de Lavagem de Tumor para as placas de lavagem 1-3 e a placa de armazenamento. Colocadas duas placas de dissecação de 150 mm dentro da Cabine de Biossegurança (BSC, Biosafety Cabinet). Colocados 3 tubos cônicos de 50mL dentro da BSC. Adicionados 5-20mL de Meio de Lavagem de Tumor a cada tubo cônico. O fórceps e os escalpelos foram imersos dentro do meio de lavagem de tumor, conforme a necessidade, durante o processo de lavagem e dissecação de tumor.
[00393] Removido(s) o(s) tumor(es) do frasco de Espécime e transferido(s) para a placa de Lavagem 1. Incubado o tumor à temperatura ambiente na placa de Lavagem 1 durante ≥3 minutos. Transferido o tumor para a placa de Lavagem 2. Incubado o tumor à temperatura ambiente na placa de Lavagem 2 durante ≥3 minutos. Transferido o tumor para a placa de Lavagem 3. Incubado o tumor à temperatura ambiente na placa de Lavagem 3 durante ≥3 minutos. Transferido o tumor para a placa de Dissecação, medido e registrado o comprimento do tumor.
[00394] Realizada uma dissecação inicial dos pedaços de tumor na placa de Dissecação em pedaços intermediários tomando o cuidado para conservar a estrutura do tumor de cada pedaço intermediário. Transferidos
288 / 509 quaisquer pedaços intermediários de tumor que não são ativamente dissecados em fragmentos para a placa de armazenamento de tecido para garantir que o tecido permanecesse hidratado durante o procedimento de dissecação inteiro.
[00395] Trabalhado com um pedaço intermediário de tumor de cada vez, cuidadosamente fatiado em fragmentos de aproximadamente 3×3×3mm na placa de Dissecação. Continuada a dissecação de fragmentos do pedaço intermediário de tumor até que tivesse sido avaliado todo o tecido no pedaço intermediário. Selecionados os fragmentos favoráveis e, usando uma pipeta de transferência, transferidos até 4 fragmentos favoráveis para dentro das gotas de meio de lavagem em um círculo na placa de fragmentos de tumor. Usando uma pipeta de transferência, um escalpelo ou um fórceps, transferido, o máximo possível, do tecido desfavorável e de produto residual para a Placa de Tecido Desfavorável. Todo o tecido restante foi colocado em um dos poços da placa de seis poços. (Tecido desfavorável foi indicado como tecido adiposo amarelo ou tecido necrótico). Continuado o processamento dos pedaços intermediários de tecido restantes, trabalhando com um pedaço intermediário de cada vez, durante um tempo até que o tumor inteiro tivesse sido processado.
[00396] Transferidos até 50 dos melhores fragmentos de tumor para o tubo cônico de 50mL rotulado com fragmentos de tumor contendo o CM1. Removidos os resíduos flutuantes do tubo cônico de 50mL. Registrado o número de fragmentos e de resíduos flutuantes. Remoinhado o tubo cônico com fragmentos de tumor e derramados os conteúdos do tubo cônico de 50mL para dentro do frasco G-Rex-100MCS. Se flutuam um ou mais fragmentos de tumor transferidos para o frasco G-Rex-100M, obtido um fragmento de tumor adicional quando disponível na Placa de Tecido Favorável e transferi-lo para o frasco G-Rex-100M.
[00397] Registrados o número de incubadora(s) e o número total de fragmentos adicionados a cada frasco. Colocado o biorreator G-Rex-100M em
289 / 509 incubadora a 37°C, 5% de CO2. EXEMPLO 4: PROCESSO 2A – DIA 11
[00398] Este exemplo descreve o protocolo do dia 11 detalhado para o processo 2A descrito nos Exemplos 3 a 6. Preparação Prévia. Dia antes do processamento:
[00399] CM2 pôde ser preparado antes do dia de ocorrência do processamento. Deixar a 4°C. Dia de processamento.
[00400] Preparado o cabo de ligações de células alimentadoras. Preparados 5mL de meio de criopreservação de acordo com CTF-FORM-318 e deixados a 4°C até necessários.
[00401] Preparo de Frasco G-Rex-500MCS. Usando seringa de 10mL, assepticamente transferido 0,5mL de solução de IL-2 (solução de estoque é de 6×106 UI/mL de IL-2) para cada litro de CM2 (Cell Media 2, meio de células 2) para dentro da bolsa de bioprocesso mediante um conector Luer fêmea estéril não usado. Garantido que toda a solução de IL-2 havia sido misturada com o meio. Bombeados 4,5 Litros do meio CM2 para dentro do frasco G- Rex-500MCS. Colocado o frasco G-Rex-500MCS na incubadora. Preparo de Células Alimentadoras Irradiadas:
[00402] Registrado o peso seco de um pacote de transferência (TP, Transfer Pack) de 1L. Bombeados 500mL de CM2 em peso para dentro da TP. Descongeladas as células alimentadoras no banho de água a 37°C (+/- 1°C). Misturada bem a formulação de células alimentadoras final. Usando uma seringa de 5mL e porta sem agulha, enxaguada a porta com um pouco da solução de células para garantir amostragem acurada e remover 1mL de células, deixado dentro do tubo rotulado para contagem. Realizadas contagem de células individuais na amostra de células alimentadoras e registrar os dados e ligar os dados brutos de contagem ao registro de batelada. Se a contagem de
290 / 509 células foi < 5 ×109, descongeladas mais células, contagem, e adicionadas às células alimentadoras. Pesada de novo a bolsa de células alimentadoras e calculado o volume. Calculado o volume de célula para remover.
[00403] Adição de Células Alimentadoras ao Frasco G-Rex.
[00404] Misturadas bem as células e removido o volume calculado, acima, para alcançar 5,0×109 células. Descartadas as células desnecessárias. Usando uma seringa de 1mL e agulha 18G, puxar 0,150mL de solução de OKT3, removida a agulha e transferido para a TP de células alimentadoras através do conector Luer fêmea. Esterilmente soldada a bolsa de células alimentadoras na linha vermelha do frasco G-Rex-500MCS. Removido o clampe da linha e permitido que as células alimentadoras fluam para dentro do frasco por gravidade. Retornado o frasco G-Rex-500MCS para a incubadora e registrada a hora.
[00405] Preparo de TILs: registrar a hora de início da colheita de TILs.
[00406] Cuidadosamente removido o frasco G-Rex-100MCS da incubadora. Usando a bomba GatheRex™, transferidos ~900mL do sobrenadante da cultura para o pacote de transferência de 1L. Remoinhar o frasco até que todas as células tenham sido soltas da membrana. Checada a membrana para garantir que todas as células estão soltas. Inclinado o frasco para longe da tubulação de colheita e permitido que os fragmentos de tumor se sedimentem ao longo da borda. Lentamente inclinado o frasco na direção da tubulação de colheita de modo que os fragmentos permaneçam sobre o lado oposto do frasco. Usando a bomba GatheRex™, transferida a suspensão de células residuais para dentro do pacote de transferência de 300mL evitando os fragmentos de tumor. Checado de novo se todas as células haviam sido removidas da membrana. Se necessário, retrolavado por soltura dos clampes na bomba GatheRex™ e permitido que um pouco de meio flua para dentro do frasco G-Rex-100MCS por gravidade. Aplicadas pancadas vigorosas no frasco para soltar as células e bombeado para a TP de 300mL. Após a
291 / 509 completitude da colheita, fechada a linha vermelha e vedado com calor.
[00407] Registrada a massa (incluindo a massa seca) da TP de 300mL contendo a suspensão de células e calculado o volume da suspensão de células. Misturadas bem as células. Assepticamente conectada uma seringa de 5mL, puxar 1mL, adicionado ao criofrasco. Repetido com a segunda seringa. Estas foram usadas para contagem de células, viabilidade das células. Colocadas em incubadora e registrada a hora de colocação na incubadora. Realizada uma contagem de células individuais em cada amostra e registrada. Se necessário, ajustada a densidade de TILs viáveis totais para ≤ 2×108 células viáveis. Calculado o volume para remover ou anotação do ajuste não é necessária.
[00408] Transferido o excesso de células para um tubo cônico de tamanho apropriado e colocado na incubadora com a tampa afrouxada para criopreservação posterior.
[00409] Removido o frasco G-Rex-500MCS da incubadora e bombeadas as células para dentro do frasco. Retornado o frasco G-Rex- 500MCS para a incubadora e registrada a hora de colocação do frasco G-Rex- 500MCS na incubadora. Criopreservação do Excesso de Células
[00410] Calculada a quantidade de meio de congelamento a ser adicionada às células: TABELA 20: Concentração de células alvo foi 1×108/mL A. Células totais removidas (da Etapa 15) mL B. Concentração de células alvo 1×108 células/mL Volume de meio de congelamento a adicionar (A/B) mL
[00411] Centrifugados TILs a 400 x g durante 5 min a 20°C com frenagem máxima e aceleração máxima. Assepticamente aspirado o sobrenadante. Ressuspensas as células no fluido restante, enquanto sob ressuspensão, lentamente adicionado o meio de congelamento. Aliquotado e deixado a -80°C. EXEMPLO 5: PROCESSO 2A – DIA 16
292 / 509
[00412] Este exemplo descreve o protocolo detalhado do dia 16 para o processo 2A descrito nos Exemplos 3 a 6. Colheita e Contagem de TILs:
[00413] Aquecida uma bolsa de 10L de CM4 para as culturas iniciadas com menos que 50×106 TILs em uma incubadora a 37°C durante pelo menos 30 minutos ou até pronta para uso. Removidos os frascos G-Rex-500MCS da incubadora, e usando a bomba GatheRex™, transferidos ~4L de sobrenadante de cultura para o Labtainer™ de 10L. Colhidos de acordo com as instruções de colheita da bomba GatheRex™.
[00414] Após remoção do sobrenadante, remoinhado o frasco até que todas as células tivessem sido soltas da membrana. Inclinado o frasco para garantir que a mangueira estivesse na borda do frasco. Usando a bomba GatheRex™, transferida a suspensão de células residuais para dentro da TP de 2L mantendo a borda inclinada até que todas as células fossem colhidas. Inspecionada a membrana para células aderentes. Aplicadas pancadas vigorosas no frasco para soltar as células. Adicionadas as células à TP de 2L. Vedado com calor o pacote de transferência de 2L. Registrada a massa do pacote de transferência com a suspensão de células e calculado o volume da suspensão de células. Determinado o volume da suspensão de células, incluindo a massa seca.
[00415] Misturadas as células suavemente e puxados 11mL e aliquotado conforme mostrado na Tabela 21. TABELA 21. Parâmetros de teste. Teste Volume de amostra Frasco Contagem de células e 2 amostras de 2mL Criofrascos viabilidade das células Micoplasma 1mL Criofrasco armazenado a 4°C até teste completado. Inoculado 0,5mL para dentro de cada um frasco de Esterilidade 1mL cultura anaeróbica e um frasco de cultura aeróbica. Citometria de Fluxo Contagem das células não usadas (Criopreservadas 2 – 2mL (Fluxo) para teste em batelada futura). Restante das células Descartado.
[00416] Calculado volume novo e registrado o volume em pacote de transferência de 2L com base no volume de suspensão de células e no volume
293 / 509 removido para (Controle de Qualidade, Quality Control) QC (11mL).
[00417] Inoculado e solicitado teste de esterilidade. Armazenada amostra de micoplasma a 4°C no rack suspenso para teste de micoplasma. Reservar até TIL ser semeado. Contagem de Células:
[00418] Realizadas contagens de células individuais e registrados os dados e ligados os dados brutos de contagem ao registro de batelada. Diluição Documentada. Documentado o programa de contagem do Cellometer®. Verificado se a diluição correta foi inserida no Cellometer®. Calculado o número total de frascos requeridos para subcultura. Adição de IL-2 ao CM
[00419] Colocada bolsa de 10L de AIM V® com GlutaMAX™. Retirados 5mL de solução de IL-2 para dentro da seringa (concentração final é 3.000 UI/mL) e dispensada a solução de IL-2 para dentro da bolsa. Repetido para as bolsas de AIM V® restantes. Preparo de Frascos G-Rex-500MCS Determinada a quantidade de CM4 a adicionar aos frascos. Registrado o volume de células adicionado por frasco e o volume de CM4 5.000mL-A. Colocados os frascos em incubadora a 37°C, 5% de CO2. Semeados os Frascos com TILs
[00420] Posicionada a bolsa de produto de células sobre balança analítica e registrada a hora que os TILs foram adicionados ao frasco G-Rex. Misturadas bem as células. Repetida a transferência de células para todos os frascos. Colocados os frascos em uma incubadora a 37°C, 5% de CO2 e registrada a hora que os TILs foram adicionados ao frasco G-Rex. Solicitado o teste para placas de sedimentação no laboratório de microbiologia, e também o teste para esterilidade aeróbica e esterilidade anaeróbica.
[00421] Criopreservação de Células de Citometria de Fluxo (Fluxo) e de Excesso de Células:
294 / 509 Calculada a quantidade de meio de congelamento requerida: Concentração de células alvo foi 1×108/mL; registradas células totais removidas. Concentração de células alvo foi 1×108 células/mL. Calculado o volume total de meio de congelamento a adicionar.
[00422] Preparado meio de criopreservação e deixado a 40°C até necessário. Centrifugados os TILs a 400 x g durante 5 min a 20°C com frenagem máxima e aceleração máxima. Aspirado o sobrenadante. Aplicados tapas suaves no fundo do tubo para ressuspender as células no fluido restante, e enquanto se aplicavam pancadas suaves no tubo, foi adicionado o meio de congelamento preparado. Aliquotado para dentro de criotubos de tamanho apropriado. Colocado em um congelador a -80°C. Dentro de 72 horas transferido para local de armazenamento permanente e documentadas e registradas a data e a hora de colocação em congelador a -80°C. EXEMPLO 6: PROCESSO 2A – DIA 22
[00423] Este exemplo descreve o protocolo detalhado do dia 22 para o processo 2A descrito nos Exemplos 3 a 6. Preparação Antecipada
[00424] Colocadas três bolsas de 1L de PlasmaLyte A na BSC. Preparado o agrupamento e rotuladas as bolsas de PlasmaLyte-A com HSA 1%. Carregados 120mL de HSA 25% para transferência. Transferido HSA para bolsa de PlasmaLyte-A™ de 3L. Misturar bem. Removidos 5mL de PlasmaLyte-A™ com HSA 1% da porta sem agulha na bolsa de 3 litros. Rotulado como Tampão de Lavagem de Células LOVO e com data. Preparação de IL-2
[00425] Dispensado PlasmaLyte-A™/HSA 1% da seringa de 5mL para dentro de um tubo cônico estéril de 50mL rotulado. Adicionado 0,05mL de solução de estoque de IL-2 ao tubo contendo PlasmaLyte e rotulado IL-2 6×104. Armazenar a 2-8°C. Preparação de Células
295 / 509
[00426] Removidos os frascos G-Rex-500M da incubadora a 37°C. Usando a bomba GatheRex™, volume reduzido no primeiro frasco. Remoinhado o frasco G-Rex-500M até que os TILs estivessem completamente ressuspensos enquanto se evitavam respingo ou espumação. Garantir que todas as células têm sido soltas da membrana. Inclinado o frasco G-Rex de modo que a suspensão de células fosse agrupada no lado do frasco. Ligada a bomba GatheRex™ para coletar a suspensão de células e garantido que todas as células haviam sido removidas do frasco. Se células permaneceram no frasco, adicionados 100mL de sobrenadante de volta ao frasco, remoinhado, e coletados para dentro da bolsa de suspensão de células. Repetido para os frascos adicionais. Vedado com calor e rotulado como Bolsa fonte LOVO. Registrado o peso seco.
[00427] Permitir que os TILs drenem da bolsa de suspensão de células através do filtro e para dentro da bolsa fonte LOVO. Logo que todas as células foram transferidas para a bolsa fonte LOVO, fechados todos os clampes, vedada com calor exatamente acima da marca e separada. Misturada bem a bolsa e usando duas seringas de 3mL retirar 2 amostras de 2mL independentes da porta de amostra da seringa para contagem das células e viabilidade das células. Pesada a bolsa e determinada a diferença entre o peso inicial e o peso fina. Registrados os dados e colocada em incubadora, incluindo a massa seca. Contagem das Células
[00428] Realizada uma contagem de células individuais em cada amostra e registrados os dados e ligar os dados brutos de contagem ao registro de batelada. Documentado o programa de contagem do Cellometer®. Verificado se a diluição correta foi inserida no Cellometer®. Determinado o número total de células nucleadas. Determinado o número de Células Nucleadas Totais (TNC, Total Nucleated Cells) a remover para reter = 1,5×1011 células para o processamento de células LOVO. Colocar as células
296 / 509 removidas em um recipiente de tamanho apropriado para eliminação. Colheita de Células LOVO
[00429] O Labtainer™ de 10L com conjunto de extensão Baxter™ na Preparação Prévia foi a bolsa de filtrado de substituição soldada no kit LOVO. Seguido os mostradores LOVO. Para iniciar o procedimento, selecionar o protocolo “TIL G-Rex Harvest” do menu suspenso e seguir as instruções.
[00430] Quando a tela de Volume de Produto Final [Final Product Volume] (Volume de Retentado, [Retentate Volume]) é apresentada, usar o valor de Células Nucleadas Totais (TNC, Total Nucleated Cells) da Tabela 15, determinado o volume alvo de produto final na tabela abaixo (Tabela 16). Inserido o Volume de Produto Final (mL) associado àquele da Faixa Numérica de Células (Cell Range) durante a configuração do Procedimento LOVO [LOVO Procedure]. TABELA 22. Determinação do Volume Alvo de Produto Final. Volume de Produto Final Faixa Numérica de Células (Cell Range) Alvo (Retentado) (mL) 0 < Células Totais (Viáveis + Mortas) ≤ 7,1E10 150 7,1E10 < Células Totais (Viáveis + Mortas) ≤ 1,1E11 200 1,1E11 < Células Totais (Viáveis + Mortas) ≤ 1,5E11 250 TABELA 23. Volume Alvo de Produto. Células Nucleadas Totais (TNC)×106 Volume de Produto Final Alvo (Retentado) (mL)
[00431] Para selecionar o volume especificado da Tabela 16, tocado o campo de entrada de Volume Final de Produto [Final Product Volume] (mL). Um teclado numérico é mostrado. Inserir o Volume de Produto Final [Final Product Volume] em unidade de mL.
[00432] Feita anotação dos volumes mostrados para Filtrado (Filtrate) e Solução 1 (Solution 1) (leitura PlasmaLyte). Feita uma anotação dos volumes mostrados para Filtrado e Solução 1 (leitura PlasmaLyte).
[00433] Pré-revestida a bolsa IP. Misturada a bolsa Fonte. Durante o procedimento LOVO, o sistema automaticamente pausou para permitir que o
297 / 509 operador interagisse com bolsas diferentes. Diferentes telas mostradas durante as diferentes pausas. Seguidas as instruções correspondentes para cada tela. Pausa para Enxague da Fonte
[00434] Após drenagem da bolsa Fonte, o procedimento LOVO adicionou o tampão de lavagem à bolsa Fonte para lavar a bolsa. Após configurado o volume de tampão de lavagem que havia sido adicionado à bolsa Fonte, o procedimento LOVO pausou automaticamente e mostrou a Tela Pausada para Enxágue da Bolsa Fonte (“Source Rinse Paused Screen”).
[00435] O procedimento LOVO processou o fluido de enxágue da bolsa Fonte, então continuou com o procedimento automático. Pausa da mistura da bolsa IP
[00436] Para preparar as células para outra passagem através da unidade de membrana rotativa (spinner), a bolsa IP bag foi diluída com tampão de lavagem. Após adicionar o tampão de lavagem à bolsa IP, o LOVO pausou automaticamente e mostrou a Tela de Pausa “Mix IP bag”.
[00437] Quando a Tela de Pausa “Mix IP bag” é mostrada, o operador inverteu várias vezes a bolsa IP para completamente misturar a suspensão de células. Seguir as instruções para continuar o processamento LOVO do fluido da bolsa IP. Pausa para massagem dos cantos da bolsa IP (Massage IP corners pause)
[00438] Durante o ciclo de lavagem final do procedimento LOVO, as células foram bombeadas da bolsa IP, através da unidade de membrana rotativa (spinner), e para bolsa de Retentado (Retentate, Final Product). Quando a bolsa IP estava vazia, 10mL de tampão de lavagem foram adicionados à porta de fundo da bolsa IP para enxaguar a bolsa. Após a adição do fluido de enxágue, o LOVO pausou automaticamente e mostrou a Tela de Pausa “Massage IP corners”.
[00439] Quando a Tela de Pausa “Massage IP corners” foi mostrada, o operador massageou os cantos da bolsa para colocar quaisquer células
298 / 509 residuais em suspensão. Continuado o procedimento LOVO para bombear o fluido de enxágue para fora da bolsa IP.
[00440] No término do procedimento LOVO, é mostrada a Tela Remover Produtos (Remove Products Screen).
[00441] Registrados os dados dos resultados, conforme formatados na Tabela 17. TABELA 24. Tabela de resumo dos resultados de LOVO. Tempo de Tempo de Tempo de Volume de Volume de Volume de Volume de Processamento Processamento Pausa Fonte (Source Retentado Filtrado Solução 1 Decorrido de Fonte (Pause Volume) (mL) (Retentate (Filtrate (Solution 1 (Elapsed Decorrido Time) Volume) (mL) Volume) Volume) Processing Time) (Elapsed Source (mL) (mL) (parênteses nº) Processing Time) (parênteses nº) A. B. C. D. E. F. G.
[00442] Parada, procedimento de parada do processamento LOVO
[00443] Registrado o volume de produto formulado final. Calculada a quantidade de IL-2 requerida a partir da tabela de produto final.
[00444] Determinados o número de Criobolsas e Volume de Retenção. A. Calculada a quantidade de IL-2 necessária para produto final. (300 UI/mL de produto final de IL- 2): volume de produto final (mL) [Volume de Produto de Células Formulado a partir da Tabela de Volume de Produto Formulado Final] x 300 UI/mL = UI de IL-2 requerida _______________mL X 300 UI = ______________UI de IL-2 requerida B. UI de IL-2 requerida ÷ diluição de solução de estoque de trabalho (Concentração de 6×104 UI/mL) preparada na etapa de preparação de IL-2 = Volume (mL) de IL-2 a adicionar ao produto final. _____________ UI de IL-2 requerida a partir do valor acima] ÷ 60.000 UI/mL = __________mL de solução de estoque de trabalho de IL-2
[00445] Marcado o volume Alvo e reter na tabela abaixo, o número de bolsas de criopreservação e o volume de amostra de retenção para produto.
[00446] Cálculo de volume alvo/bolsa: (Volume formulado final – Ajuste de volume devido a não alcançar recuperação de 100%=10mL)/Nº de bolsas.
[00447] Células preparadas com 1:1 (vol:vol) CS10 (CryoStor 10, BioLife Solutions) e IL-2.
[00448] Preparadas células com IL-2 e conectado o aparelho. Colocados células e aparelho em bolsa de transporte e deixado a 2-8°C
299 / 509 durante ≤ 15 min. Adição de CS10
[00449] Retirada a quantidade de CS10 frio determinada na tabela de “Volume de Produto Formulado Final”. Lentamente e com misturação suave, adicionado CS10 (1:1, vol:vol) às células.
[00450] Adição de Produto de Célula Formulado às Criobolsas.
[00451] Substituir seringa por seringa de tamanho apropriado para volume de células a ser colocado dentro de cada criobolsa. Misturado o produto de células. Aberto o clampe que conduz para a bolsa de produto de células e retirado o volume apropriado. Registrar o volume de produto final
[00452] Usando porta sem agulha e seringa de tamanho apropriado, puxada a quantidade de retenção previamente determinada. Manter retida em tubo cônico de 50mL e rotulado “Retenção”. Usando a seringa acoplada no cabo de ligações, removido todo o ar da bolsa puxando as células a cerca de 1 in (2,5 cm) para fora da bolsa para dentro da tubulação. Deixado a 2-8°C. Misturadas as células na bolsa de produto de células e repetir as etapas 3-8 para as bolsas CS750 restantes usando uma seringa nova na torneira e uma seringa nova para obter retenção de células. As células retidas devem ser reservadas para processamento logo que o produto estiver em CRF. Procedimento do Congelador com Velocidade de Congelamento Controlada (CRF, Controlled-Rate Freezer) (consulte também o Exemplo 16)
[00453] O congelador foi mantido a 4°C até pronto para adicionar as amostras. Adicionadas as amostras ao CRF.
[00454] Esperado até que CRF retorne para 4°C. Logo que a temperatura foi alcançada, seguir o programa do CRF para criopreservar. Realizada uma inspeção visual das criobolsas para os seguintes (Nota: não inspecionado para enchimento excessivo ou enchimento insuficiente): integridade do recipiente, integridade da porta, integridade da vedação,
300 / 509 presença de aglutinações de células, e presença de partículas.
[00455] Colocadas as criobolsas dentro de cassetes pré-condicionados e transferidos para o CRF. Uniformemente distribuídos os cassetes no rack no CRF. Aplicada fita termopar no cassete central, ou posicionada bolsa simulada na posição central.
[00456] Fechada a porta do CRF. Logo que a temperatura da câmara alcançou 4°C +/- 1,5°C, registradas a hora e a temperatura da câmara do CRF para a qual o produto foi transferido. Processamento da amostra de controle de qualidade.
[00457] Assepticamente transferidos os seguintes materiais, conforme a necessidade, e rotulados de acordo com o QC e a Tabela de Retenção 25. 1- Tubo de Contagem de Células, 1- Tudo de Endotoxina, 1- Tubo de Micoplasma, 1- Tubo de Cepa Gram, 1- Tubo de Reestimulação, e 1- Tubo de Citometria de Fluxo (Fluxo) para QC para teste imediato. Os tubos em duplicata restantes foram colocados dentro do Congelador com Velocidade de Congelamento Controlada. TABELA 25. Testes e instruções de armazenamento. Teste Frasco Contagem de células e viabilidade Criofrascos. de células Micoplasma Criofrasco armazenado a 4°C até teste completado. Inocular 0,5mL para dentro de um frasco de cultura anaeróbica e Esterilidade 0,5mL para dentro de um frasco de cultura aeróbica. Cepa Gram Criofrasco armazenado a 4°C até teste completado. Endotoxina Criofrasco armazenado a 4°C até teste completado. Citometria de Fluxo Criofrasco armazenado a 4°C até teste completado. Criopreservar para teste futuro: Consiste em 5 Frascos Satélites, 1- Tubo para Contagem de Células, 1- Tudo de Endotoxina, 1- Tubo de Retenção Pós-Formulação Micoplasma, 1- Tubo de Cepa Gram, e 1- Tubo de Citometria de Fluxo (Fluxo) para QC para teste imediato. Amostra é distribuída à temperatura ambiente e o ensaio precisa ser Reestimulação iniciado dentro de 30 minutos a partir dos resultados de contagem de células.
Contagem de células.
[00458] Realizada uma contagem de células individuais em cada amostra e registrados os dados e ligados os dados brutos de contagem ao registro de batelada. Documentar o programa de contagem do Cellometer®.
301 / 509 Verificado se a diluição correta foi inserida no Cellometer®.
[00459] Criopreservação de Células de Retenção de Pós-Formulação: Colocadas no CRF. Movidas para o local de armazenamento após a completitude do congelamento e registrados a data e a hora de colocação no CFR. Registradas a data e a hora quando movido para o LN2.
[00460] Teste de microbiologia: Solicitado o teste para esterilidade aeróbica e esterilidade anaeróbica. Pós-Criopreservação de Bolsas de Produto de Células
[00461] Desligado o congelador após a completitude do processamento de congelamento. Removidas as criobolsas do cassete. Transferidos os cassetes para a fase vapor de LN2. EXEMPLO 7: USO DE COQUETEL DE CITOCINAS IL-2, IL-15, E IL-21
[00462] Este exemplo descreve o uso de citocinas IL-2, IL-15, e IL-21, que servem como fatores de crescimento de células-T adicionais, em combinação com o processo de TILs dos Exemplos 1 a 10.
[00463] Usando o processo dos Exemplos 1 a 10, os TILs foram crescidos a partir de tumor colorretal, melanoma, tumor cervical, tumor de mama triplo negativo, tumor de pulmão e tumor renal na presença de IL-2 em um braço do experimento e, no lugar de IL-2, uma combinação de IL-2, IL- 15, e IL-21 em outro braço do experimento no início da cultura. Na completitude de pre-REP, as culturas foram ensaiadas para expansão, fenótipo, função (CD107a+ e IFN-γ) e repertório de TCR Vβ. IL-15 e IL-21 são descritas aqui alhures e em Gruijl, et al., IL-21 promove a expansão de linfócitos infiltrantes de tumor CD27+CD28+ com alto potencial citotóxico e baixa expansão colateral de células-T regulatórias, Santegoets, S. J., J. Transl. Med., 2013, 11:37 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/).
[00464] Os resultados mostraram que expansões de TILs intensificadas
302 / 509 (>20%), em ambas as células CD4+ e CD8+ nas condições tratadas com IL-2, IL-15, e IL-21, foram observadas em múltiplas histologias em relação às condições com apenas IL-2. Houve um desvio para uma população predominantemente CD8+ com um repertório TCR Vβ desviado nos TILs obtidos das culturas tratadas com IL-2, IL-15, e IL-21 em relação às culturas com apenas IL-2. IFN-γ e CD107a foram avaliados nos TILs tratados com IL- 2, IL-15, e IL-21, em comparação com os TILs tratados com apenas IL-2. EXEMPLO 8: ESTUDO MULTICÊNTRICO, COM TRÊS COORTES, EM FASE 2 EM MELANOMA
[00465] Este estudo multicêntrico, com três coortes, em Fase 2, é desenhado para avaliar a segurança e a eficácia de uma terapia com TILs fabricados de acordo com o processo 1C (conforme aqui descrito) em paciente com melanoma metastásico. As coortes um e dois alistarão até 30 pacientes, cada, e a coorte três é uma coorte de retratamento para uma segunda infusão de TILs em até dez pacientes. As primeiras duas coortes são para avaliação de dois processos de fabricação diferentes: processos 1C e uma modalidade do processo 2A (descritos nos Exemplos 1 a 10, respectivamente). Os pacientes na coorte um recebem TILs frescos, não criopreservados, e na coorte dois os pacientes recebem o produto fabricado mediante o processo descrito nos Exemplos 1 a 10, que produz um produto criopreservado. O desenho do estudo é mostrado na Figura 26. O estudo é um estudo multicêntrico, com três coortes, em Fase 2, para avaliar a segurança e a eficácia de TILs autólogos para o tratamento de subpopulações de pacientes com melanoma metastásico. Os critérios de inclusão importantes incluem: melanoma metastásico mensurável e ≥ 1 lesão ressecionável para geração de TILs; pelo menos uma linha prévia de terapia sistêmica; idade ≥ 18; e estado de desempenho ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group) de 0-1. As coortes de tratamento incluem produto de TIL não criopreservado (preparado usando o processo 1C), produto de TIL criopreservado (preparado usando
303 / 509 uma modalidade do processo 2A), e produto de retratamento com TIL para pacientes sem resposta ou que progridem após resposta inicial. O desfecho primário é segurança e o desfecho secundário é eficácia, definida como taxa de resposta objetiva (ORR, Objective Response Rate), taxa de remissão completa (CRR, Complete Remission Rater), sobrevida isenta de progressão (PFS, Progression Free Survival), duração de resposta (DOR, Duration of Response), e sobrevida total (OS, Overall Survival). EXEMPLO 9: QUALIFICAÇÃO DE LOTES INDIVIDUAIS DE
CÉLULAS MONONUCLEARES PERIFÉRICAS IRRADIADAS COM RADIAÇÃO GAMA
[00466] Este Exemplo descreve um procedimento novo abreviado para qualificar os lotes individuais de células mononucleares periféricas (PBMCs, também conhecidas como MNC) irradiadas com radiação gama para uso como células alimentadoras alogeneicas nos métodos exemplificadores aqui descritos.
[00467] Cada lote de MNC alimentadoras irradiadas foi preparado a partir de um doador individual. Cada lote ou doador foi testado para sua capacidade para expandir TIL no REP na presença de anticorpo anti-CD3 (clone OKT3) purificado e interleucina-2 (IL-2). Além disso, cada lote de células alimentadoras foi testado sem a adição de TIL para verificar se a dose recebida de radiação gama foi suficiente para torná-las incompetentes em replicação. Fundamentos
[00468] Células MNC alimentadoras, paradas no crescimento, irradiadas com radiação gama, foram requeridas para REP de TIL. Receptores de membrana sobre as MNCs alimentadoras ligam-se ao anticorpo anti-CD3 (clone OKT3) e realizam ligação cruzada com TILs no frasco REP, estimulando os TILs para expandirem. Lotes de células alimentadoras foram preparados a partir de leucaferese de sangue inteiro retirado de doadores
304 / 509 individuais. O produto de leucaferese foi submetido à centrifugação sobre Ficoll-Hypaque®, lavado, irradiado, e criopreservado sob condições de GMP (Good Manufacturing Practice, Boa Prática de Fabricação).
[00469] É importante que os pacientes que receberam a terapia com TILs não sejam infundidos com células alimentadoras viáveis porque isto pode resultar em Doença do Enxerto-contra-Hospedeiro (GVHD, Graft- Versus-Host Disease). As células alimentadoras são, por conseguinte, paradas no crescimento pela dosagem das células com irradiação gama, resultando em quebras de DNA de fita dupla e na perda de viabilidade celular das células após recultura. Critérios de Avaliação e Configuração Experimental
[00470] Os lotes de células alimentadoras foram avaliados com base em dois critérios: 1) a capacidade delas para expandir TIL em cocultura >100 vezes e 2) a incompetência em replicação delas.
[00471] Os lotes de células alimentadoras foram testados no formato mini-REP utilizando duas linhagens primárias de pre-REP TIL crescidas em frascos de cultura de tecido T25 verticais. Os lotes de células alimentadoras foram testados contra duas linhagens de TIL diferentes, porque cada linhagem de TIL é peculiar em sua capacidade para se proliferar em resposta à ativação em um REP. Como um controle, um lote de células MNC alimentadoras irradiadas, que têm sido mostradas historicamente que atendem aos critérios acima, foi processado ao lado dos lotes de teste.
[00472] Para garantir que todos os lotes testados em um experimento único recebessem teste equivalente, soluções de estoque suficientes das mesmas linhagens de pre-REP TIL estavam disponíveis para todas as condições de teste e todos os lotes de células alimentadoras.
[00473] Para cada lote de células alimentadoras testado, houve um total de seis frascos T25: Linhagem Pre-REP TIL nº 1 (2 frascos); Linhagem Pre- REP TIL nº 2 (2 frascos); e Células Alimentadoras de Controle (2 frascos). Os
305 / 509 frascos contendo as linhagens de TIL nº 1 e nº 2 foram avaliados para a capacidade do lote de células alimentadoras para expandir TIL. Os frascos com células alimentadoras de controle foram avaliados para incompetência em replicação do lote de células alimentadoras.
PROTOCOLO EXPERIMENTAL Dias -2/3, Descongelamento de Linhagens de TIL
[00474] Preparado meio CM2. Aquecido CM2 em banho de água a 37ºC. Preparados 40mL de CM2 suplementado com 3.000 UI/mL de IL-2. Manter quente até o uso. Adicionados 20mL de CM2 preaquecido sem IL-2 a cada um de dois tubos cônicos de 50mL rotulados com os nomes das linhagens de TIL usadas. Removidas as duas linhagens de pre-REP TIL designadas do armazenamento em LN2 e transferidas para os frascos para a sala de cultura de tecido. Descongelados os frascos pela colocação deles dentro de uma bolsa de zíper de armazenamento vedada em um banho de água a 37ºC até que permanecesse uma quantidade pequena de gelo.
[00475] Usando uma pipeta de transferência estéril, transferidos imediatamente os conteúdos do frasco para dentro de 20mL de CM2 no tubo cônico de 50 mL rotulado, preparado. QS para 40mL usando CM2 sem IL-2 para lavar as células. Centrifugado a 400 x CF durante 5 minutos. Aspirado o sobrenadante e ressuspensas as células em 5mL de CM2 quente suplementado com 3.000 UI/mL de IL-2.
[00476] Removida alíquota pequena (20µL) em duplicata para contagem de células usando um contador de células automático. Registradas as contagens. Enquanto se contavam as células, colocado o tubo cônico de 50mL com as células TIL dentro de uma incubadora umidificada a 37ºC, 5% de CO2, com a tampa afrouxada para permitir a troca de gás. Determinada a concentração de células e os TILs foram diluídos para 1×106 células/mL em CM2 suplementado com IL-2 a 3.000 UI/mL.
[00477] Cultivadas em 2mL/poço de uma placa de cultura de tecido de
306 / 509 24 poços em tantos poços quanto necessários em uma incubadora umidificada a 37ºC até o Dia 0 do mini-REP. Cultivadas as diferentes linhagens de TIL em placas de cultura de tecido de 24 poços separadas para evitar confusão e contaminação cruzada potencial. Dia 0, Início de Mini-REP
[00478] Preparado meio CM2 suficiente para o número de lotes de células alimentadoras a serem testados (por exemplo, para testar 4 lotes de células alimentadoras ao mesmo tempo, preparados 800mL de meio CM2). Aliquotada uma porção do CM2 preparado acima e suplementando-a com
3.000 UI/mL de IL-2 para a cultura das células. (por exemplo, para testar 4 lotes de células alimentadoras ao mesmo tempo, preparar 500mL de meio CM2 com 3.000 UI/mL de IL-2).
[00479] Trabalhando com cada linhagem de TIL separadamente para prevenir contaminação cruzada, removida a placa de 24 poços com cultura de TIL da incubadora e transferida para um BSC.
[00480] Usando uma pipeta de transferência estéril ou um Pipetador de 100-1.000µL e ponta, removido cerca de 1mL de meio de cada poço de TIL a ser usado e colocado em um poço não usado da placa de cultura de tecido de 24 poços.
[00481] Usando uma pipeta de transferência estéril nova ou um Pipetador de 100-1.000µL e ponta, misturado o meio restante com TIL em poços e ressuspensas as células e então transferida a suspensão de células para um tubo cônico de 50mL rotulado com o nome de TIL e registrado o volume.
[00482] Lavados os poços com o meio reservado e transferido aquele volume para o mesmo tubo cônico de 50mL. Centrifugadas as células a 400 x CF para coletar o pélete de célula. Aspirado o sobrenadante do meio e ressuspensa o pélete de células em 2-5mL de meio CM2 contendo 3.000 UI/mL de IL-2, volume a ser usado com base no número de poços colhidos e no pélete – volume deve ser suficiente para garantir uma concentração de
307 / 509 >1,3×106 células/mL.
[00483] Usando uma pipeta sorológica, misturada completamente a suspensão de células e registrado o volume. Removidos 200µL para uma contagem de célula usando um contador de células automático. Enquanto de realizava a contagem, colocado o tubo cônico de 50mL com as células TIL dentro de uma incubadora umidificada a 37°C, 5% de CO2, com a tampa afrouxada para permitir a troca de gás. Registradas as contagens.
[00484] Removido o tubo cônico de 50mL contendo as células TIL da incubadora e ressuspensas as células a uma concentração de 1,3×106 células/mL em CM2 quente suplementado com 3.000 UI/mL de IL-2. Retornado o tubo cônico de 50mL para a incubadora com uma tampa afrouxada.
[00485] Repetidas as etapas acima para a segunda linhagem de TIL.
[00486] Imediatamente antes da adição dos TILs aos frascos T25 para o experimento, os TILs foram diluídos1:10 para uma concentração final de 1,3×105 células/mL de acordo com a descrição abaixo. Preparo de Solução de Trabalho de MACS GMP CD3 Puro (OKT3)
[00487] Retirar a solução de estoque de OKT3 (1mg/mL) do refrigerador a 4°C e colocar em BSC. Uma concentração final de 30ng/mL de OKT3 foi usada no meio do mini-REP.
[00488] 600ng e OKT3 foram necessários para 20mL em cada frasco T25 do experimento; isto foi o equivalente de 60µL de uma solução 10µg/mL para cada 20mL, ou 360µL para todos os 6 frascos testados para cada lote de células alimentadoras.
[00489] Para cada lote de células alimentadoras testado, preparado 400µL de uma diluição 1:100 de 1mg/mL de OKT3 para uma concentração de trabalho de 10µg/mL (por exemplo, para testar 4 lotes de células de alimentação ao mesmo tempo, preparar 1.600µL de uma diluição 1:100 de 1mg/mL de OKT3: 16µL de 1mg/mL de OKT3 + 1,584mL de meio CM2
308 / 509 com 3.000 UI/mL de IL-2.) Preparo de Frascos T25
[00490] Rotulado cada frasco e enchido cada frasco com o meio CM2 antes do preparo das células alimentadoras. Colocados os frascos em incubadora umidificada a 37°C, 5% de CO2, para manter o meio quente enquanto se espera a adição dos componentes restantes. Logo que as células alimentadoras foram preparadas, os componentes serão adicionados ao meio CM2 em cada frasco. TABELA 26: Soluções Componente Volume em frascos de Volume em frascos de cocultura controle (apenas com células alimentadoras) MC2 + 300 UI/mL de IL-2 18mL 19mL MNC: 1,3×10⁷/mL em CM2 + 3.000 UI de IL-2 1mL 1mL (concentração final 1,3×10⁷/frasco) OKT3: 10μg/mL em CM2 + 3.000 UI de IL-2 60μL 60μL TIL: 1,3×10⁵/mL em CM2 com 3.000 UI de IL-2 1mL 0 (concentração final 1,3×10⁵/frasco) Preparo de Células Alimentadoras
[00491] Um mínimo de 78×106 células alimentadoras foi necessário por lote testado para este protocolo. Cada frasco de 1mL congelado por SDBB (“San Diego Blood Bank”, Banco de Sangue de San Diego) tinha 100×106 células viáveis após o congelamento. Assumindo uma recuperação de 50% após o descongelamento do armazenamento em LN2, foi recomendado descongelar pelo menos dois frascos de 1mL de células alimentadoras por lote dando uma estimativa de 100×106 células viáveis para cada REP. Alternativamente, se fornecido em frascos de 1,8mL, apenas um frasco proporcionaria células alimentadoras suficientes.
[00492] Antes do descongelamento de células alimentadoras, preaquecidos aproximadamente 50mL de CM2 sem IL-2 para cada lote de células alimentadoras a ser testado. Removidos os frascos de lote de células alimentadoras designados do armazenamento em LN2, colocados em bolsa de zíper de armazenamento, e a bolsa colocada sobre gelo. Descongelados os frascos dentro da bolsa de zíper de armazenamento por imersão em um banho
309 / 509 de água a 37°C. Removidos os frascos da bolsa de zíper, borrifados ou esfregados com EtOH 70% e transferidos os frascos para a BSC.
[00493] Usando uma pipeta de transferência, imediatamente transferidos os conteúdos dos frascos de células alimentadoras para dentro de 30 mL de CM2 quente em um tubo cônico de 50mL. Lavado o frasco com um volume pequeno de CM2 para remover quaisquer células residuais no frasco. Centrifugado 400 x CF durante 5 minutos. Aspirado o sobrenadante e ressuspensas as células em 4mL de CM2 quente mais 3.000 UI/mL de IL-2. Removidos 200 µL para contagem de células o Contador de Células Automático. Registradas as contagens.
[00494] Ressuspensa 1,3×107 células/mL em CM2 quente mais 3.000 UI/mL de IL-2. Diluídas as células TIL das 1,3×106 células/mL para 1,3×105 células/mL. Configuração da Cocultura Diluídas as células TIL das 1,3×106 células/mL para 1,3×105 células/mL. Adicionados 4,5mL de meio CM2 a um tubo cônico de 15mL. Removidas as células TIL da incubadora e ressuspensas bem usando uma pipeta sorológica de 10mL. Removido 0,5mL de células da suspensão de 1,3×106 células TIL/mL e adicionado aos 4,5mL de meio no tubo cônico de 15mL. Retornada o frasco de estoque de TIL para a incubadora. Misturado bem. Repetido para a segunda linhagem de TIL.
[00495] Transferidos frascos com meio preaquecidos para um lote de células alimentadoras único da incubadora para a BSC. Misturadas as células alimentadoras por pipetação para cima e para baixo várias vezes com uma ponta de pipeta de 1 mL e transferido 1mL (1,3×107 células) para cada frasco para aquele lote de células alimentadoras. Adicionados 60µL de solução de estoque de trabalho de OKT3 (10µg/mL) a cada frasco. Retornados dois frascos de controle para a incubadora.
[00496] Transferido 1 mL (1,3×105 células) de cada lote de TIL para o
310 / 509 frasco T25 correspondentemente rotulado. Retornados os frascos para a incubadora e incubados na vertical. Não foram perturbados até Dia 5.
[00497] Repetido para todos os lotes de células alimentadoras testados. Dia 5, Troca de Meio
[00498] Preparado CM2 com 3.000 UI/mL de IL-2. 10mL são necessários para cada frasco. Com uma pipeta de 10mL, transferidos 10mL de CM2 quente com 3.000 UI/mL de IL-2 para cada frasco. Retornados os frascos para a incubadora e incubados na vertical até Dia 7. Repetido para todos os lotes de células alimentadoras testados. Dia 7, Colheita
[00499] Removidos os frascos da incubadora e transferidos para a BSC, tomando-se o cuidado para não perturbar a camada de células sobre o fundo do frasco. Sem perturbar as células crescendo sobre o fundo dos frascos, removidos 10mL de meio de cada frasco de teste e 15mL de meio de cada um dos frascos de controle.
[00500] Usando uma pipeta sorológica de 10mL, ressuspensas as células no meio restante e misturar bem para desagrupar quaisquer agrupamentos de células. Após misturação completa da suspensão de células por pipetação, removidos 200µL para contagem de células. Contados os TILs usando o procedimento de operação padrão apropriado juntamente com o contador de células automático. Registradas as contagens no Dia 7.
[00501] Repetido para todos os lotes de células alimentadoras testados.
[00502] Os frascos de controle de células alimentadoras foram avaliados para incompetência em replicação e os frascos contendo TIL foram avaliados para a expansão em vezes a partir do Dia 0 de acordo com a Tabela TT abaixo. Dia 7, Continuação de Frascos de Controle de Células Alimentadoras até Dia 14
[00503] Após a completitude das contagens no Dia 7 dos frascos de
311 / 509 controle de células alimentadoras, adicionados 15mL de meio CM2 fresco contendo 3.000 UI/mL de IL-2 a cada um dos frascos de controle. Retornados os frascos de controle para a incubadora e incubados em uma posição vertical até o Dia 14. Dia 14, Não proliferação Prolongada de Frascos de Controle de Células Alimentadoras
[00504] Removidos os frascos da incubadora e transferidos para a BSC, cuidado foi tomado para não perturbar a camada de células sobre o fundo do frasco. Sem perturbar as células crescendo sobre o fundo dos frascos, removidos aproximadamente 17mL de meio de cada um dos frascos de controle. Usando uma pipeta sorológica de 5mL, ressuspensas as células no meio restante e misturadas bem para desagrupar quaisquer agrupamentos de células. Registrados os volumes de cada frasco.
[00505] Após misturação completa da suspensão de células por pipetação, removidos 200µL para contagem de células. Contados os TILs usando o procedimento de operação padrão apropriado juntamente com o equipamento de contagem de células automático. Registradas as contagens.
[00506] Repetido para todos os lotes de células alimentadoras testados.
RESULTADOS E CRITÉTIOS DE ACEITAÇÃO Resultados
[00507] A dose de irradiação gama foi suficiente para tornar as células alimentadoras incompetentes em replicação. Foi suposto que todos os lotes atendem aos critérios de avaliação e também demonstraram uma redução no número total de células alimentadoras viáveis restando no Dia 7 da cultura REP em comparação com o Dia 0.
[00508] Foi suposto que todos os lotes de células alimentadoras atendem aos critérios de avaliação de expansão de 100 vezes de TILs crescidos pelo Dia 7 da cultura REP.
[00509] Foi suposto que as contagens no Dia 14 dos frascos de controle
312 / 509 de células alimentadoras continuam a tender a serem não proliferativas vistas no Dia 7. Critérios de Aceitação
[00510] Os seguintes critérios de aceitação foram atendidos por cada linhagem de TIL replicada testada para cada lote de células alimentadoras.
[00511] Aceitação foi duas vezes, como segue (descrito na Tabela 27 abaixo). TABELA 27: Critérios de Aceitação Teste Critérios de Aceitação Irradiação de MNC / Incompetência em Replicação Sem crescimento observado em 7 e 14 dias Pelo menos uma expansão de 100 vezes de cada Expansão de TIL TIL (mínimo de 1,3×10⁷ células viáveis)
[00512] Avaliado se a dose de radiação foi suficiente para tornar as células MNC alimentadoras incompetentes em replicação quando cultivadas na presença de 30ng/mL de anticorpo OKT3 e 3.000 UI/mL de IL-2. A incompetência em replicação foi avaliada pela contagem de células viáveis totais (TVC) conforme determinada pela contagem de células automática no Dia 7 e no Dia 14 do REP.
[00513] O critério de aceitação foi “Sem Crescimento”, significando que o número total de células viáveis não cresceu no Dia 7 e no Dia 14 a partir do número de células viáveis inicial posto em cultura no Dia 0 do REP.
[00514] Avaliada a capacidade das células alimentadoras para sustentarem a expansão de TILs. O crescimento de TILs foi medido em termos de expansão em vezes de células viáveis a partir do início de cultura no Dia 0 do REP até o Dia 7 do REP. No Dia 7, as culturas de TIL alcançaram um mínimo de expansão de 100 vezes, (isto é, maior que 100 vezes o número de células TIL viáveis totais postas em cultura no Dia 0 de REP), conforme avaliado pela contagem de células automática. Teste de Contingência de Lotes de Células MNC Alimentadoras que não Atendem aos Critérios de Aceitação
[00515] No caso no qual um lote de células MNC alimentadoras não
313 / 509 atendeu a nenhum dos critérios de avaliação descritos acima, as seguintes etapas serão realizadas para testar de novo o lote para excluir erro simples do experimentador como sua causa.
[00516] Se houver dois ou mais frascos de teste satélites restantes do lote, então o lote foi testado de novo. Se houver um ou nenhuns frascos de teste satélites restantes, então o lote foi reprovado de acordo com os critérios de aceitação listados acima.
[00517] Com o propósito de serem qualificados, o lote em questão e o lote de controle tiveram que alcançar os critérios de aceitação acima. Após atender a estes critérios, o lote foi então liberado para uso. EXEMPLO 10: QUALIFICAÇÃO DE LOTES INDIVIDUAIS DE
CÉLULAS MONONUCLEARES DO SANGUE PERIFÉRICO IRRADIADAS COM RADIAÇÃO GAMA
[00518] Este Exemplo descreve um procedimento novo abreviado para qualificar lotes individuais de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) irradiadas com radiação gama para uso como células alimentadoras alogeneicas nos métodos exemplificadores aqui descritos. Este exemplo provê um protocolo para a avaliação de lotes de células PBMC irradiadas para uso na produção de lotes clínicos de TIL. Cada lote de células PBMC irradiadas foi preparado a partir de um doador individual. Ao longo do curso de mais que 100 protocolos de qualificação, foi mostrado que, em todos os casos, lotes de células PBMC irradiadas do SDBB (“San Diego Blood Bank”, Banco de Sangue de San Diego) expandiram TIL >100 vezes no Dia 7 de um REP. Este protocolo de qualificação modificado foi pretendido para aplicar em lotes de células PBMC irradiadas de doador do SDBB que foram, então, adicionalmente testados para verificar se a dose recebida de radiação gama foi suficiente para torná-las incompetentes em replicação. Logo que demonstrado que se mantiveram incompetentes em replicação ao longo do curso de 14 dias, os lotes de célula PBMC de doador foram considerados “qualificados” para
314 / 509 uso para produzir lotes clínicos de TIL. Fundamentos
[00519] PBMCs paradas em crescimento, irradiadas com radiação gama, foram requeridas para o REP padrão atual de TIL. Receptores de membrana sobre as PBMCs ligam-se ao anticorpo anti-CD3 (clone OKT3) e realizam ligação cruzada com TILs em cultura, estimulando os TILs para expandirem. Lotes de PBMC foram preparados a partir da leucaferese de sangue inteiro retirado de doadores individuais. O produto de leucaferese foi submetido à centrifugação sobre Ficoll-Hypaque®, lavado, irradiado, e criopreservado sob condições de GMP.
[00520] É importante que os pacientes que receberam a terapia com TILs não sejam infundidos com PBMCs viáveis porque isto pode resultar em Doença do Enxerto-contra-Hospedeiro (GVHD). As PBMCs de doador são, por conseguinte, paradas no crescimento pela dosagem das células com irradiação gama, resultando em quebras de DNA de fita dupla e na perda de viabilidade celular das PBMCs após recultura. Critério de Avaliação
[00521] O critério de avaliação para os lotes de PBMCs irradiadas foi sua incompetência em replicação. Configuração Experimental
[00522] Os lotes de células alimentadoras foram testados no formato de mini-REP como se elas fossem para ser cocultivadas com TIL, usando frascos de cultura de tecido T25 na vertical. Lote de controle: Um lote de PBMCs irradiadas, que havia historicamente mostrado que atende ao critério acima, foi processado ao lado dos lotes experimentais como um controle. Para cada lote de PBMCs irradiadas de doador testado, foram testados frascos em duplicata. Protocolo Experimental Dia 0
315 / 509
[00523] Preparados ~90mL de meio CM2 para cada lote de PBMC de doador a ser testado. Mantido CM2 quente em banho de água a 37°C. Descongelada uma alíquota de 6×106 UI/mL de IL-2. Retornado o meio CM2 para a BSC, esfregando com EtOH 70% antes de colocação na cabine de biossegurança. Para cada lote de PBMC testado, removidos cerca de 60mL de CM2 para um frasco estéril separado. Adicionada IL-2 da solução de estoque de 6×106 UI/mL descongelada para este meio para uma concentração final de
3.000 UI/mL. Rotulado este frasco como “CM2/IL2” (ou similar) para distingui-lo do CM2 não suplementado. Preparo de OKT3
[00524] Retirada a solução de estoque de anticorpo anti-CD3 (OKT3) do refrigerador a 4°C e colocada na BSC. A concentração final de 30ng/mL OKT3 foi usada no meio do mini-REP. Preparada uma solução de trabalho de 10µg/mL de anticorpo anti-CD3 (OKT3) a partir da solução de estoque a 1mg/mL. Deixada no refrigerador até necessária.
[00525] Para cada lote de PBMC testado, preparar 150µL de uma diluição 1:100 da solução de estoque de anticorpo anti-CD3 (OKT3). Por exemplo, para testar 4 lotes de PBMC ao mesmo tempo, preparar 600µL de solução de 10µg/mL de anticorpo anti-CD3 (OKT3) pela adição de 6µL da solução de estoque a 1mg/mL aos 594µL de CM2 suplementado com 3.000 UI/mL de IL-2. Preparo dos Frascos
[00526] Adicionados 19mL por frasco de CM2/IL-2 aos frascos T25 rotulados e colocados os frascos em incubadora umidificada, a 37°C, 5% de CO2 enquanto se preparam as células. Preparo de PBMC Irradiada
[00527] Coletados os frascos de lotes de PBMC a serem testados do armazenamento em LN2. Estes foram deixados a -80°C ou mantidos sobre gelo antes do descongelamento. Adicionados 30mL de CM2 (sem suplemento
316 / 509 de IL-2) aos tubos cônicos de 50mL para cada lote a ser descongelado. Rotulado cada tubo com os diferentes números de lote da PBMC a ser descongelado. Tubos hermeticamente tampados e deixados em banho de água a 37°C antes do uso. Conforme a necessidade, retornados os tubos cônicos de 50mL para a BSC, esfregando com EtOH 70% antes de colocar na cabine de biossegurança.
[00528] Removido um frasco de PBMC do armazenamento frio e colocado em um rack de tubos flutuante em um banho de água a 37°C para descongelar. Permitido o descongelamento prosseguir até que uma pequena quantidade de gelo permanecesse no frasco. Usando uma pipeta de transferência estéril, imediatamente transferidos os conteúdos do frasco para dentro de 30mL de CM2 no tubo cônico de 50mL. Removido cerca de 1mL de meio do tubo para enxaguar o frasco; retornado o enxágue para o tubo cônico de 50mL. Hermeticamente tampado e remoinhado suavemente para lavar as células.
[00529] Centrifugado a 400 x g durante 5min à temperatura ambiente. Aspirado o sobrenadante e ressuspenso o pélete de células em 1mL de meio quente CM2/IL-2 usando uma ponta de pipeta de 1.000µL. Alternativamente, antes da adição do meio, ressuspenso o pélete de células pelo arrasto do tubo tampado ao longo do rack de tubos vazio. Após ressuspensão do pélete de células, completado o volume para 4mL usando meio CM2/IL-2. Registrado o volume.
[00530] Removida uma alíquota pequena (por exemplo, 100µL) para contagem de células usando um contador de células automático. Realizadas as contagens em duplicata de acordo com o contador de células automático específico SOP. Provavelmente foi necessário realizar uma diluição da PBMC antes da realização da contagem de células. Uma diluição inicial recomendada foi de 1:10, mas esta variou dependendo do tipo do contador de células usado. Registradas as contagens.
317 / 509
[00531] Ajustada a concentração de PBMC para 1,3×107 células/mL usando o meio CM2/IL-2. Misturado bem por remoinho suave e por aspiração suave para cima e para baixo usando uma pipeta sorológica. Configuração dos Frascos de Culturas
[00532] Retornados dois frascos T25 rotulados da incubadora de cultura de tecido para a BSC. Retornado o frasco de 10µg/mL de anticorpo anti-CD3/OKT3 para a BSC. Adicionado 1mL da suspensão de 1,3×107 células PBMC a cada frasco. Adicionados 60µL da solução de 10µg/mL de anticorpo anti-CD3/OKT3 a cada frasco. Retornados os frascos tampados para as incubadoras de cultura de tecido, e deixados nas mesmas durante 14 dias de crescimento sem perturbação. Colocado o frasco de anticorpo anti- CD3/OKT3 de volta no refrigerador até ser necessário para o lote seguinte. Repetido para cada lote de PBMC a ser avaliado. Dia 14, Medição de Não Proliferação de PBMC
[00533] Retornados os frascos T25 em duplicada para a BSC. Para cada frasco, usando uma pipeta sorológica de 10mL nova, removidos ~17mL de cada um dos frascos, então cuidadosamente aspirado o meio restante para medir o volume restante nos frascos.
[00534] Misturada bem a amostra por pipetação para cima e para baixo usando a mesma pipeta sorológica.
[00535] Removida uma amostra de 200µL de cada frasco para contagem. Células contadas usando um contador de células automático. Repetidas as etapas 7.4.26 – 7.4.31 para cada lote de PBMC sendo avaliado.
RESULTADOS E CRITÉRIO DE ACEITAÇÃO Resultados
[00536] Foi suposto que a dose de irradiação gama foi suficiente para tornar as células alimentadoras incompetentes em replicação. Foi suposto que todos os lotes atendem ao critério de avaliação, demonstrando uma redução no minério total de células alimentadoras viáveis restando no Dia 14 da
318 / 509 cultura REP em comparação com o Dia 0. Critério de Aceitação
[00537] O seguinte critério de aceitação foi atendido por cada lote de PBMC irradiada de doador a ser testado: “Sem Crescimento” – significa que o número total de células viáveis no Dia 14 foi menor que o número inicial de células viáveis postas em cultura no Dia 0 do REP. Teste de Contingência de Lotes de PBMC que não Atendem ao Critério de Aceitação.
[00538] No caso no qual um lote de células PBMC irradiadas de doador não atendeu ao critério de avaliação acima, as seguintes etapas foram realizadas para testar de novo o lote para excluir erro simples do experimentador como a causa de sua reprovação. Se houve dois ou mais frascos satélites restantes do lote, então o lote foi testado de novo. Se houver um ou nenhuns frascos satélites restantes, então o lote foi reprovado de acordo com o critério de aceitação acima.
[00539] Para ser qualificado, um lote de PBMC passando pelo teste de contigência teve tanto o lote de controle quanto ambas as réplicas do lote em questão que alcançar o critério de aceitação acima. Após atender a este critério, o lote foi então liberado para uso. EXEMPLO 11: PREPARAÇÃO DE SOLUÇÃO DE ESTOQUE DE IL-2
[00540] Este Exemplo descreve o processo de dissolução de interleucina-3 humana recombinante, purificada, liofilizada, em amostras de estoque adequadas para uso em outros protocolos de cultura de tecido, incluindo todos aqueles descritos no presente pedido e Exemplos, incluindo aqueles que envolvem o uso de rhIL-2. Procedimento
[00541] Preparada solução de Ácido Acético (HAc) 0,2%. Transferidos 29mL de água estéril para um tubo cônico de 50mL. Adicionado 1mL de solução de ácido acético 1N ao tubo cônico de 50mL. Misturado bem por
319 / 509 inversão do tubo 2 a 3 vezes. Esterilizada a solução de HAc por filtração usando um filtro Steriflip®.
[00542] Preparar HSA 1% em PBS. Adicionados 4mL de solução de estoque de HSA 25% a 96mL de PBS em uma unidade de filtro estéril de 150mL. Filtrada a solução. Armazenada a 4°C. Para cada frasco de rhIL-2 preparado, preencher os formulários.
[00543] Preparada a solução de estoque de rhIL-2 (concentração final de 6×106 UI/mL). Cada lote de rhIL-2 foi diferente e requereu informação encontrada no Certificado de Análise (COA, Certificate of Analysis) do fabricante, como: 1) Massa de rhIL-2 por frasco (mg), 2) Atividade específica de rhIL-2 (UI/mg) e 3) Volume de reconstituição de solução de HAc 0,2% recomendado (mL).
[00544] Calculado o volume de solução de HSA 1% requerido para o lote de rhIL-2 pelo uso da equação abaixo:
[00545] Por exemplo, de acordo com o COA do lote 10200121 de rhIL-2 da CellGenix, a atividade específica para o frasco de 1mg é de 25×106 UI/mg. Ele recomenda reconstituir a rhIL-2 em 2mL de HAc 0,2%.
[00546] Esfregada a rolha de borracha do frasco de IL-2 com lenço de álcool. Usando uma agulha 16G acoplada a uma seringa de 3mL, injetado o volume recomendado de HAc 0,2% ao frasco. Tomar cuidado para não deslocar a rolha quando a agulha é retirada. Invertido o frasco 3 vezes e remoinhado até que todo o pó esteja dissolvido. Cuidadosamente removida a rolha e reservada sobre um lenço de álcool. Adicionado o volume calculado de HSA 1% ao frasco.
[00547] Armazenamento da solução de rhIL-2. Para armazenamento de
320 / 509 curta duração (<72h), armazenado o frasco a 4°C. Para armazenamento de longa duração (>72h), aliquotados volumes menores do frasco e armazenados em criofrascos a -20°C até prontos para uso. Evitados ciclos de congelamento/descongelamento. Expirados 6 meses após a data de preparação. Rótulos de rh-IL-2 incluíram vendedor e número de catálogo, número do lote, data de vencimento, iniciais do operador, concentração e volume de alíquota. EXEMPLO 12: PREPARAÇÃO DE MEIOS PARA PROCESSOS PRE-
REP E REP
[00548] Este Exemplo descreve o procedimento para a preparação de meios de cultura de tecido para uso em protocolos envolvendo a cultura de linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) derivados de vários tipos de tumor incluindo, mas não se limitando a, melanoma metastásico, carcinoma de células escamosas da cabeça e do pescoço (HNSCC), carcinoma ovariano, carcinoma de mama triplo negativo, e adenocarcinoma de pulmão. Estes meios podem ser usados para a preparação de qualquer um dos TILs descritos no presente pedido e nos Exemplos. Preparação de CM1
[00549] Removidos os seguintes reagentes do armazenamento frio e aquecidos em um banho de água a 37°C: (RPMI1640, Soro AB Humano, L- glutamina 200mM). Preparado meio CM1 de acordo com Tabela 28 abaixo pela adição de cada um dos ingredientes à seção de topo de uma unidade de filtro de 0,2µm apropriada para o volume a ser filtrado. Armazenar a 4°C. TABELA 28: Preparação de CM1 Ingrediente Concentração Final Volume Final 500mL Volume Final IL RPMI 1640 NA 450mL 900mL Soro AB Humano, inativado com 50mL 100mL calor, 10% L-Glutamina 200mM 2mM 5mL 10mL BME 55mM 55µM 0,5mL 1mL Sulfato de gentamicina 50mg/mL 50µg/mL 0,5mL 1mL
[00550] No dia de uso, quantidade preaquecida requerida de CM1 em banho de água a 37°C e adicionar 6.000 UI/mL de IL-2.
321 / 509
[00551] Suplementação adicional - conforme a necessidade de acordo com a Tabela 29. TABELA 29: Suplementação adicional de CM1, conforme a necessidade. Suplemento Concentração de Estoque Diluição Concentração Final GlutaMAX™ 200mM 1:100 2mM Penicilina/estreptomicina 10.000 U/mL penicilina 1:100 100 U/mL penicilina
10.000 µg/mL 100 μg/mL estreptomicina estreptomicina Anfotericina B 250µg/mL 1:100 2,5µg/mL Preparação de CM2
[00552] Removido do refrigerador o CM1 preparado ou preparar CM1 fresco de acordo com a Seção 7.3, acima. Removido do refrigerador AIM-V® e preparada a quantidade de CM2 necessária por misturação de CM1 preparado com um volume igual de AIM-V® em um frasco de meio estéril. Adicionados 3.000 UI/mL de IL-2 ao meio CM2 no dia de uso. Preparada quantidade suficiente de CM2 com 3.000 UI/mL de IL-2 no dia de uso. Rotulado o frasco de meio CM2 com seu nome, as iniciais da pessoa preparadora, a data que foi filtrado/preparado, o prazo de validade de duas semanas e armazenar a 4°C até necessário para cultura de tecido. Preparação de CM3
[00553] Preparado CM3 no dia que foi requerido para uso. CM3 foi o mesmo que o meio AIM-V®, suplementado com 3.000 UI/mL de IL-2 no dia de uso. Preparada uma quantidade de CM3 suficiente para as necessidades experimentais pela adição de solução de estoque de IL-2 diretamente ao frasco ou à bolsa de AIM-V®. Misturado bem por agitação suave. Rotular o frasco com “3.000 UI/mL de IL-2” imediatamente após a adição ao AIM-V®. Se houve excesso de CM3, armazená-lo em frascos a 4°C rotulados com o nome do meio, e seu prazo de validade (7 dias após a preparação). Descartado o meio suplementado com IL-2 após 7 dias de armazenamento a 4°C. Preparação de CM4
[00554] CM4 foi o mesmo que CM3, com o suplemento adicional de GlutaMAX™ 2mM (concentração final). Para cada 1L de CM3, adicionados
322 / 509 10mL de GlutaMAX™ 200mM. Preparada uma quantidade de CM4 suficiente para as necessidades experimentais pela adição de solução de estoque de IL-2 e de solução de estoque de GlutaMAX™ diretamente ao frasco ou à bolsa de AIM-V®. Misturado bem por agitação suave. Rotulado o frasco com “3.000 UI/mL de IL-2 e G1utaMAX” imediatamente após a adição ao AIM-V®. Se houve excesso de CM4, armazená-lo em frascos a 4°C rotulados com o nome do meio, “GlutaMAX™”, e seu prazo de validade (7 dias após a preparação). Descartado o meio suplementado com IL-2 após 7 dias de armazenamento a 4°C. EXEMPLO 13: AVALIAÇÃO DE MEIO ISENTO DE SORO PARA USO NO PROCESSO 2A
[00555] Este exemplo provê dados mostrando a avaliação da eficácia de meio isento de soro como uma substituição dos meios padrão CM1, CM2, e CM4 que são atualmente usados no processo 2A. Este estudo testou a eficácia de meio isento de soro (SFM, Serum-Free Media) disponível e de alternativas isentas de soro como uma substituição em três fases: Fase-1: Comparada a eficácia de expansão de TILs (n = 3) usando meio padrão versus meio isento de soro CTS Optimizer ou Prime T CDM ou Xvivo-20 com ou sem lisado de plaquetas ou reposição de soro.
[00556] Fase-2: Testada a condição de meio isento de soro candidato em processo 2A em miniescala usando G-Rex-5M (n=3).
INFORMAÇÃO BÁSICA
[00557] Embora a combinação de meios atual usada em cultura Pre- REP e Post-REP tenha sido comprovada como eficaz, falhas de REP podem ocorrer com o AIM-V®. Se uma alternativa isenta de soro eficaz for identificada, ela tornaria o processo mais fácil e simples para ser realizado em CMOs pela redução do número de tipos de meios usados de 3 para 1. Adicionalmente, SFM reduz a possibilidade de doença adventícia pela eliminação do uso de soro humano. Este exemplo provê dados que mostram
323 / 509 sustentação do uso de meio isento de soro nos processos 2A. TABELA 30: ABREVIAÇÕES µL microlitro CM1,2,4 Meios Completos 1,2,4 CTS OpTimizer SFM Meio Isento de Soro “Cell Therapy System OpTimizer Serum Free Media” g Gramas h Hora IFU Instruções para Uso IL-2 Citocina Interleucina-2 Min Minuto mL Mililitro ºC graus Celsius PreREP Protocolo de Pré-Expansão Rápida REP Protocolo de Expansão Rápida RT Temperatura Ambiente SR Reposição de Soro TIL Linfócitos infiltrantes de tumor
DESENHO DO EXPERIMENTO
[00558] Os PreREPs e REPs foram iniciados conforme mencionado em LAB-008. A visão geral destas 3 fases de experimento é mostrada no diagrama abaixo:
[00559] Conforme provido no diagrama acima, o projeto envolveu testar os meios isentos de soro e suplementos em duas etapas.
[00560] Etapa 1. Seleção de fornecedor de meio isento de soro. preREP e post-REP foram configurados para imitar o processo 2A em placa de 24 poços G-Rex. PreREP foram iniciados pela cultura de cada fragmento/poço da placa de 24 poços G-Rex em triplicatas ou quadruplicatas de acordo com as condições. REP foram iniciados no Dia 11 pela cultura de 4×105 TILs/poço de placa de 24 poços G-Rex, separação no Dia 16, colheita no Dia 22. CTS OpTimizer, X-Vivo 20, e Prime T-CDM foram usados como alternativas de
324 / 509 meios isentos de soro potenciais para uso no PreREP e no REP. Reposição de soro “CTS Immune SR Serum Replacement” (Life Technologies) ou soro de lisado de Plaquetas (SDBB) foram adicionados a 3% ao SFM. Cada uma das condições foi planejada para testar com pelo menos 3 tumores tanto em preREP quanto em postREP para imitar o processo 2A.
[00561] Etapa 2. Os candidatos identificados foram adicionalmente testados em processos 2A em miniescala de acordo com o protocolo (TP-17- 007). Resumidamente, preREP foram iniciados pela cultura de 2 fragmentos/frasco G-Rex-5M em triplicatas de acordo com a condição. REP foram iniciados no Dia 11 usando 2×106 TILs/frasco G-Rex-5M, separação no Dia 16, colheita no Dia 22.
[00562] Nota: Alguns tumores foram processados e configurados para medir múltiplos parâmetros em um experimento.
OBSERVAÇÕES
[00563] Observados resultados equivalentes ou estatisticamente melhores em crescimento de células quando se compara um meio isento de soro com o meio padrão usado no processo 2A.
[00564] Observado fenótipo similar, produção de IFN-γ similar, e análise de metabólito similar do crescimento de TILs em meio isento de soro quando comparado com o crescimento de TILs no meio padrão usado no processo 2A.
RESULTADOS Teste da eficácia de meio isento de soro em expansão de TILs em pre- REP e post-REP.
[00565] CTS Optimizer + SR (Serum Replacement, Reposição de Soro) mostrou expansão intensificada de TIL em preREP e expansão comparável de TIL em REP. CTS OpTimizer, X-Vivo 20, e Prime T-CDM foram adicionados com ou sem 3% de CTS Immune CTS SR, foram testados contra a condição padrão. Em M1079 e L4026, a condição de CTS OpTimizer
325 / 509 + CSR mostrou expansão de preREP TIL significativamente intensificada (p <0,05) quando comparada com as condições padrão (CM1, CM2, CM4). Inversamente, CTS Optimizer sem CSR não auxiliou a expansão de preREP TIL (Apêndices-1,2,3). CTS Optimizer + CSR mostrou expansão de TIL comparável em PostREP nos dois tumores dos 3 testados (Figura-2B). Uma grande quantidade de variação ocorreu em preREP e postREP com as condições X-Vivo 20 e Prime T-CDM, enquanto que CTS Optimizer foi relativamente consistente entre quadruplicatas. Além disso, lisado de plaquetas adicionado ao SFM não intensificou a expansão de preREP TIL e postREP TIL quando comparado com os meios padrão. Estas revelações sugerem que a reposição de soro é certamente necessária para prover um crescimento comparável com o nosso meio padrão, CTS Optimizer +CSR podem ser um candidato.
[00566] Teste de condição de candidato no G-Rex 5M mini.
[00567] Análise fenotípica de Post-REP TIL. Consulte, a Tabela 31 abaixo. TABELA 31: Desvio de CD8 com CTS OpTimizer Média % CD8+ Meio Padrão CTS M1078 11 34 M1079 29,3 43,85 M1080 33,67 54,37 L4020 0,02 0,17 EP11020 28,67 25,07 L4030 0,13 0,09 L4026 9,45 34,06 M1092 5,75 52,47 T6030 66 52,6
[00568] Compatibilidade com interferon-gama.
[00569] ELISA para interferon-gama (Quantikine®). A produção de IFN-γ foi medida usando o kit Quantikine® ELISA de R&D Systems. CTS+SR produziu quantidades comparáveis de IFN-γ quando comparado com a nossa condição padrão. EXEMPLO 14: COQUETEL DE FATORES DE CRESCMENTO DE CÉLULAS-T IL-2/IL-15/IL-21 INTENSIFICA A EXPANSÃO E A
326 / 509 FUNÇÃO EFETORA DE CÉLULAS-T INFILTRANTES DE TUMOR
[00570] Terapia adotiva de células-T com linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) autólogos tem demonstrado eficácia clínica em pacientes com melanoma metastásico e carcinoma cervical. Em alguns estudos, melhores evoluções clínicas têm sido positivamente correlacionadas com o número total de células infundidas e/ou a percentagem de células-T CD8+. Os regimes de produção mais atuais apenas utilizam IL-2 para promover o crescimento de TIL. A expansão intensificada de linfócitos tem sido relatada usando regimes contendo IL-15 e IL-21. Este estudo descreve os efeitos positivos da adição de IL-15 e IL-21 para o protocolo de IL-2-TIL de segunda geração recentemente implementado na clínica. Materiais e Métodos
[00571] O processo de geração de TILs inclui um Protocolo de pré- Expansão Rápida (pre-REP, pre-Rapid Expansion Protocol), no qual fragmentos de tumor de tamanho de 1-3 mm3 são colocados em meio contendo IL-2. Durante o pre-REP, os TILs emigram para fora dos fragmentos de tumor e se expandem em resposta à estimulação por IL-2.
[00572] Para estimulação adicional do crescimento de TILs, os TILs são expandidos mediante um período de cultura secundária chamado de o Protocolo de Expansão Rápida (REP, Rapid Expansion Protocol) que inclui PBMCs alimentadoras irradiadas, IL-2 e anticorpo anti-CD3. Neste estudo, um protocolo de expansão pre-REP e REP encurtada foi desenvolvido para expandir TILs enquanto se mantém os atributos fenotípicos e funcionais do produto TIL final.
[00573] Este protocolo de produção de TIL encurtada foi usado para avaliar a influência de IL-2 sozinha em comparação com uma combinação de IL2/IL-15/IL-21. Estes dois regimes de cultura foram comparados para a produção de TIL crescido a partir de tumor colorretal, melanoma, tumor cervical, tumor de mama triplo negativo, tumor de pulmão e tumor renal. Na
327 / 509 completitude do pre-REP, os TILs cultivados foram avaliados para expansão, fenótipo, função (CD107a+ e IFNγ) e repertório de TCR Vβ.
[00574] Culturas de pre-REP foram iniciadas usando o protocolo padrão com IL-2 (600 UI/mL), ou com IL-15 (180 UI/mL) e IL-21 (UI/mL) adicionalmente à IL-2. As células foram avaliadas para expansão na completitude do pre-REP. Um cultura foi classificada como tendo uma expansão aumentada sobre a IL-2 se o crescimento total foi intensificado em pelo menos 20%. Os estudos fenotípicos e funcionais de melanoma e tumor de são apresentados aqui. Consulte, a Tabela 32 abaixo. TABELA 32: Intensificação da expansão durante o pre-REP com IL- 2/IL-15/IL-21 em múltiplas indicações Histologia Tumoral Nº de IL-2 versus Nº de estudos demonstrando estudos com IL- intensificação >20% de crescimento 2/IL-15/IL-21 usando IL-2/IL-15/IL-21 (comparadas com IL-2) Melanoma 5 1/5(20%) Pulmão 8 3/8 (38%) Colorretal 11 7/11 (63%) Cervical 1 1/1 (100%) Pancreático 2 2/2 (100%) Glioblastoma 1 1/1 (100%) Mama Triplo Negativo 1 1/2 (50%)
[00575] Estes dados demonstram um rendimento de produto TIL aumentado quando TILs foram cultivados com IL-2/IL15/IL-21 em comparação com IL-2 sozinha, adicionalmente às diferenças fenotípicas e funcionais em tumor de pulmão.
[00576] O efeito do coquetel triplo sobre a expansão de TILs foi específico para a indicação e beneficiou a maioria dos tumores de baixo rendimento.
[00577] A razão de células-T CD8+/célula-T CD4+ foi aumentada pelo tratamento de NSCLC com produto TIL.
[00578] A atividade de célula-T pareceu intensificada pela adição de
328 / 509 IL-15 e IL-21 a IL-2, conforme avaliada pelos níveis de expressão de CD107a tanto em melanoma quanto em NSCLC.
[00579] Os dados aqui providos mostram que a expansão de TILs usando um processo mais curto, mais robusto, como o processo 2A aqui descrito no pedido e em outros exemplos, pode ser adaptada para abranger o coquetel de citocinas IL-2/IL-15/IL-21, provendo, assim, um meio para adicionalmente promover a expansão de TILs em particularmente em indicações específicas.
[00580] Experimentos contínuos estão adicionalmente avaliando os efeitos de IL-2/IL-15/IL-21 sobre a função de TIL.
[00581] Experimentos adicionais avaliarão o efeito do coquetel triplo durante o REP (primeira expansão).
[00582] Estas observações são especialmente relevantes para a otimização e a estandardização de regimes de cultura de TILs necessários para a fabricação em grande escala de TILs com as amplas aplicabilidade e disponibilidade requeridas de uma terapia anticâncer predominante. EXEMPLO 15: AVALIAÇÃO DE UMA FAIXA DE RAZÕES DE CÉLULAS ALIMENTADORAS ALOGENEICAS : TIL DE 100:1 A 25:1
[00583] Este estudo testou a proliferação de TIL a 25:1 e 50:1 contra a razão de controle de 100:1 de células alimentadoras alogeneicas para TIL atualmente utilizada em Processo 1C.
[00584] Estudos publicados pelo “Surgery Branch at the National Cancer Institute” [Departamento de Cirurgia do Instituto Nacional do Câncer] têm mostrado o limiar para ativação ótima de TIL no frasco G-Rex 100 a 5×106 células alimentadoras alogeneicas por cm2 no início do REP(1). Isto tem sido verificado mediante modelagem matemática, e, com o mesmo modelo, previu que, com uma camada de células alimentadoras otimizada para contato de célula:célula por área unitária, a proporção de células alimentadoras
329 / 509 alogeneicas relativas ao TIL pode ser decrescida para 25:1 com efeito mínimo sobre as ativação e expansão de TIL.
[00585] Este estudo confirmou uma densidade ótima de células alimentadoras por área unitária no início de REP, e validou a faixa eficaz de razões de células alimentadoras alogeneicas no início de REP necessárias para decrescer e normalizar a quantidade de células alimentadoras usadas por lote clínico. O estudo também validou o início do REP com menos que 200×106 TILs cocultivados com um número fixo de células alimentadoras.
[00586] A. Volume de uma célula-T (diâmetro de 10 µm): V = (4/3) πr3 = 523,6 µm3 B. Coluna de G-Rex-100 (M) com uma altura de 40 µm (4 células): V = (4/3) πr3 = 4×1012 µm3 C. Número de células requerido para encher a coluna B: 4×1012 µm3/523,6 µm3 = 7,6×108 µm3 * 0,64 = 4,86×108 D. Número de células que podem ser otimamente ativadas em espaço 4D (quadrimensional): 4,86×108/24 = 20,25×106 E. Número de células alimentadoras e de TIL extrapolado para G-Rex-500: TIL: 100×106 e Células Alimentadoras: 2,5×109
[00587] Equação 1. Aproximação do número de células mononucleares requeridas para prover uma geometria icosaédrica para ativação de TIL em um cilindro com uma base de 100 cm2. O cálculo deriva-se do resultado experimental de ~5×108 para ativação limiar de células-T que rigorosamente corresponde aos dados experimentais de NCI.(1) (C) O multiplicador (0,64) é a densidade de empacotamento aleatório para esferas equivalentes conforme (2) calculada por Jaeger e Nagel em 1992 . (D) O divisor 24 é o número de esferas equivalentes que poderia ser colocada em contato com um objeto similar no espaço quadrimensional “o número de Newton”(3). Referências (1)
[00588] Jin, Jianjian, et al., “Simplified Method of the Growth of
330 / 509 Human Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL) in Gas-Permeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment”. J. Immunother. 2012 Apr; 35(3): 283–292. (2)
[00589] Jaeger HM, Nagel SR. “Physics of the granular state”. Science. 1992 Mar 20;255(5051):1523-31. (3)
[00590] O. R. Musin (2003). “The problem of the twenty-five spheres”. Russ. Math. Surv. 58 (4): 794–795. EXEMPLO 16: PRODUÇÃO DE UMA TERAPIA COM CÉLULAS-T
CRIOPRESERVADAS USANDO UM SISTEMA FECHADO
[00591] Este exemplo descreve a fabricação cGMP da Iovance Biotherapeutics, Inc. Processo de Terapia com Células TIL em Frascos G-Rex de acordo com as atuais Boas Práticas Teciduais e atuais Boas Práticas de Fabricação. Este material será fabricado sob “US FDA Good Manufacturing Practices Regulations” (21 CFR Part 210, 211, 1270, e 1271), e padrões ICH Q7 para Fase I até Material Comercial.
[00592] O resumo do processo é provido na Tabela 33 abaixo. TABELA 33: Resumo do Processo Dia Estimado Atividade Critérios Alvo Frascos Previstos Volume Total (pós-semeadura) Estimado (mL) 0 Dissecação de ≤ 50 fragmentos de 1 frasco G-Rex- ≤1.000 Tumor tumor desejáveis por G- 100MCS Rex-100MCS 11 Semeadura de 5–200×106 células 1 frasco G-Rex- ≤5.000 REP viáveis por G-Rex- 500MCS 500MCS 16 Separação em 1×109 células viáveis ≤5 frascos G-Rex- ≤25.000 REP por G-Rex-500MCS 500MCS 22 Colheita Células disponíveis 3-4 bolsas CS-750 ≤530 totais
[00593] Em todo este Exemplo, assumir 1,0mL/L = 1,0 g/kg, a não ser que seja especificado de outro modo. Logo que abertos, os seguintes prazos de validade aplicam-se 2°C-8°C: Soro Humano, tipo AB (HI) Gemini, 1 mês; 2-mercaptoetanol, 1 mês. Sulfato de gentamicina, solução de estoque 50mg/mL pode ser mantida à temperatura ambiente durante 1 mês. Bolsas contendo 10L de meio AIM-V® podem ser aquecidas à temperatura ambiente
331 / 509 apenas uma vez durante até 24 horas antes do uso. Durante o Dia 22 a colheita com duas bombas GatheRex™ pode ser usada para colher TIL dos frascos G- Rex-500MCS. Preparação de Meio CM1 Dia 0
[00594] Preparado o Meio RPMI 1640. Na BSC, usando uma pipeta de tamanho apropriado, removidos 100,0mL de 1.000mL de Meio RPMI 1640 e adicionados a um recipiente de tamanho apropriado rotulado “Resíduo”.
[00595] Na BSC, adicionados os reagentes ao frasco de Meio RPMI
1640. Adicionados os seguintes reagentes ao frasco de Meio RPMI 1640 conforme mostrado na tabela. Registrados os volumes adicionados. Quantidade adicionada por frasco: Soro AB humano inativado com calor (100,0mL); GlutaMAX™ (10,0mL); Sulfato de gentamicina, 50 mg/mL (1,0mL); 2-mercaptoetanol (1,0mL).
[00596] Tampado o frasco de Meio RPMI 1640 e remoinhado o frasco para garantir que os reagentes sejam completamente misturados. Filtrado o Meio RPMI 1640 da Etapa 8.1.6 através de uma unidade de filtro de 1L de 0,22 micrometro. Rotulado o frasco de meio filtrado. Assepticamente tampado o frasco de meio filtrado com a seguinte informação.
[00597] Descongelada uma alíquota de 1,1mL de IL-2 (6×106 UI/mL) (BR71424) até que todo o gelo tenha derretido. Registrada solução de IL-2: Lote nº e Prazo de Validade. Transferida solução de estoque de IL-2 para o meio. Na BSC, transferido 1,0mL da solução de estoque de IL-2 para o frasco de Meio CM1 Dia 0 preparado na Etapa 8.1.8. Adicionado Meio CM1 Dia 0 a 1 frasco e 1,0mL de IL-2 (6×106 UI/mL). Tampado e remoinhado o frasco para misturar o meio contendo IL-2. Rotular de novo como “Meio Completo CM1 Dia 0”.
[00598] Removidos 20,0mL de meio usando uma pipeta de tamanho apropriado e dispensados para dentro de um tubo cônico de 50mL. Na BSC, transferidos 25,0mL de “Meio Completo CM1 Dia 0” (preparado na Etapa
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8.1.13) para um tubo cônico de 50mL. Rotulado o tubo como “Pedaços de Tecido”. Assepticamente passado o G-Rex-100MCS (W3013130) para dentro da BSC. Na BSC, fechados todos os clampes no G-Rex-100MCS, deixando aberto o clampe de filtro de respiro. Conectada a linha vermelha do frasco G- Rex-100MCS na extremidade de diâmetro maior do conjunto de transferência de fluido de bomba Repeater™ (W3009497) via a conexão Luer. Montada a bomba Baxa™ perto da BSC. Removida a seção tubular da bomba do conjunto de transferência de fluido de bomba Repeater™ da BSC e instalada na bomba Repeater™. Dentro da BSC, removida a seringa do Sistema de Dispensação de Líquido Pumpmatic™ (PLDS, Pumpmatic™ Liquid- Dispensing System) (W3012720) e descartada.
[00599] Conectada a pipeta do PLDS na extremidade de diâmetro menor do conjunto de transferência de fluido de bomba Repeater™ via conexão Luer e posicionada a ponta da pipeta dentro de “Meio Completo CM1 Dia 0” para aspiração. Abertos todos os clampes entre meio e G-Rex- 100MCS. Bombeado o Meio Completo CM1 para dentro de frasco G-Rex- 100MCS. Ajustada a velocidade da bomba em “High” (Alta) e “9” e bombeado todo o Meio Completo CM1 Dia 0 para dentro do frasco G-Rex- 100MCS. Logo que todo o meio foi transferido, limpada a linha e desligada a bomba.
[00600] Desconectada a bomba do frasco. Garantido que todos os clampes foram fechados no frasco, exceto no filtro de respiro. Removido o conjunto de transferência de fluido de bomba Repeater™ da linha de meio vermelha, e posicionada uma tampa vermelha (W3012845) sobre a linha de meio vermelha. Removido o frasco G-Rex-100MCS da BSC, lacrada com calor a tampa vermelha da linha vermelha próxima do Luer terminal. Rotulado o frasco G-Rex-100MCS com QA provido com rótulo “Dia 0” em processo. Fixado o rótulo “Dia 0” de amostra preparada abaixo. Parâmetros da incubadora: 37,0°C±2,0°C; Percentagem de CO2: 5,0%±1,5% de CO2.
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[00601] Deixado o tubo cônico de 50mL na incubadora durante ≥ 30 minutos de aquecimento. Dia 0 - Preparação de Meio de Lavagem de Tumor
[00602] Adicionada Gentamicina à HBSS. Na BSC, adicionados 5,0mL de gentamicina (W3009832 ou W3012735) a 1 frasco de 500mL de Meio HBSS (W3013128). Registrados os volumes. Adicionados por frasco: HBSS (500,0mL); Sulfato de gentamicina, 50 mg/mL (5,0mL). Misturados completamente os reagentes. Filtrada HBSS contendo gentamicina preparada na Etapa 8.2.1 através de uma unidade de filtro de 1L de 0,22 micrometro (W1218810). Assepticamente tampado o frasco com meio filtrado e rotulado com a seguinte informação. Dia 0 - Processamento de Tumor
[00603] Obtido espécime de tumor e transferido para dentro de suíte a 2°C-8°C imediatamente para processamento e registrada a informação de tumor. Rotulados três tubos cônicos de 50mL: o primeiro como “Fórceps”, o segundo como “Escalpelo”, o terceiro como “Meio de Lavagem de Tumor Fresco”. Rotuladas placas de Petri de 5mm x 10mm como “Lavagem 1”, “Lavagem 2”, “Lavagem 3”, “Armazenamento”, e “Desfavorável”. Rotulada uma placa de 6 poços como “Fragmentos Intermediários Favoráveis”.
[00604] Usando uma pipeta de tamanho apropriado, transferidos 5,0mL de “Meio de Lavagem de Tumor” para dentro de cada poço de uma placa de 6 poços para fragmentos intermediários favoráveis de tumor (30,0mL total). Usando uma pipeta de tamanho apropriado, transferidos 50,0mL de “Meio de Lavagem de Tumor” preparado na Etapa 8.2.4 para dentro de cada placa de Petri de 100mm para “Lavagem 1”, “Lavagem 2”, “Lavagem 3”, e “Armazenamento” (200,0mL total). Usando uma pipeta de tamanho apropriado, transferir 20,0mL de “Meio de Lavagem de Tumor” preparado na Etapa 8.2.4 para dentro de cada tubo cônico de 50mL (60,0mL total). Assepticamente removidas as tampas de duas placas de 6 poços. As tampas
334 / 509 foram utilizadas para pedaços de tumor selecionados. Assepticamente passado o tumor para dentro da BSC. Registrada a hora de início do processamento.
[00605] Lavagem de Tumor 1: Usando fórceps, removido o tumor do frasco de espécime e transferido para a placa de “Lavagem 1”. Usando fórceps, suavemente lavado o tumor e registrar a hora. Transferidos 20,0mL (ou volume disponível) de solução do frasco de espécime de tumor para dentro de um frasco cônico de 50mL de acordo com plano de amostra. Rotulada e armazenada a amostra de biocarga coletada a 2-8ºC até submetida ao teste.
[00606] Lavagem de Tumor 2: Usando um conjunto novo de fórceps, removido o tumor da placa de “Lavagem 1” e transferido para a placa de “Lavagem 2”. Usando fórceps, lavado o espécime de tumor por agitação suave durante ≥ 3 minutos e permitido-o repousar. Registrada a hora.
[00607] Usando uma pipeta de transferência, transferidas 4 gotas individuais de Meio de Lavagem de Tumor do frasco cônico para dentro de cada um dos 6 círculos sobre as tampas viradas para cima das placas de 6 poços (2 tampas). Colocada uma gota extra sobre dois círculos para um total de 50 gotas.
[00608] Lavagem de Tumor 3: Usando fórceps, removido o tumor da placa de “Lavagem 2” e transferido para a placa de “Lavagem 3”. Usando fórceps, lavado o espécime de tumor por agitação suave e permitido-o repousar durante ≥ 3 minutos. Registrada a hora.
[00609] Posicionada uma régua sob a tampa da placa de 150mm. Usando fórceps, assepticamente transferido o espécime de tumor para a tampa de placa de dissecação de 150mm. Dispostos todos os pedaços de tumor em uma fila com as extremidades tocando-se e registrado o comprimento total aproximado e o número de fragmentos. Avaliado o tumor para tecido necrótico/tecido adiposo. Avaliado se >30% da área de tumor inteira observada é de tecido necrótico e/ou de tecido adiposo; se sim, garantir que
335 / 509 tumor seja de tamanho apropriado se assim processado. Avaliado se <30% da área de tumor inteira observada é de tecido necrótico ou tecido adiposo; se sim, prosseguido.
[00610] Dissecação de Limpeza. Se o tumor foi grande e >30% do exterior do tecido foi observado que é necrótico/adiposo, realizar “dissecação de limpeza” pela remoção de tecido necrótico/tecido adiposo enquanto que se preserva a estrutura interna do tumor usando uma combinação de escalpelo e/ou fórceps. Para manter a estrutura interna do tumor, usada apenas pressão de corte vertical. Não cortado com escalpelo em movimento de serradura.
[00611] Usando uma combinação de escalpelo e/ou fórceps, cortado o espécime de tumor em fragmentos uniformes, de tamanho apropriado (até 6 fragmentos intermediários). Para manter a estrutura interna do tumor, usar apenas pressão de corte vertical. Não cortado com escalpelo em movimento de serradura. Garantido manter os fragmentos intermediários não dissecados completamente submersos no “Meio de Lavagem de Tumor”. Transferido cada fragmento intermediário para a placa de “armazenamento”.
[00612] Manipulado um fragmento intermediário de cada vez, dissecado o fragmento de tumor intermediário na placa de dissecação em pedaços de tamanho de aproximadamente 3x3x3mm, minimizando a quantidade de tecido hemorrágico, tecido necrótico, e/ou tecido adiposo em cada pedaço. Para manter a estrutura interna de tumor, usada apenas pressão de corte vertical. Não cortado com escalpelo em movimento de serradura.
[00613] Selecionados até oito (8) pedaços de tumor sem tecido hemorrágico, tecido necrótico, e/ou tecido adiposo. Usada a régua para referência. Dissecação continuada até que tenham sido obtidos 8 pedaços de fragmento favoráveis, ou que o fragmento intermediário inteiro tenha sido dissecado. Transferido cada pedaço selecionado para uma das gotas de “Meio de Lavagem de Tumor”.
[00614] Após seleção de até oito (8) pedaços do fragmento
336 / 509 intermediário, posicionados os fragmentos intermediários restantes dentro de um poço único novo da placa de 6 poços de “Fragmentos Intermediários Favoráveis”.
[00615] Se tecido desejável permanece, selecionados Pedaços de Tumor Favoráveis adicionais da placa de 6 poços de “fragmentos intermediários favoráveis” para encher as gotas com um máximo de 50 pedaços. Registrado o número total de pedaços dissecados criados.
[00616] Removido da incubadora o tubo cônico de 50mL com “Pedaços de Tecido”. Garantido que o tubo cônico fosse aquecido durante ≥30 min. Passado o tubo cônico de 50mL com “Pedaços de Tecido” para dentro da BSC, garantindo para não comprometer a esterilidade das superfícies de processamento abertas.
[00617] Usando uma pipeta de transferência, um escalpelo, fórceps ou combinação, transferidos os 50 melhores fragmentos de tumor selecionados das tampas de placa com fragmentos favoráveis para o tubo cônico de 50mL com “Pedaços de Tecido”. Se um pedaço de tumor caiu durante a transferência e tecido desejável permanece, foram adicionados pedaços adicionais dos poços de fragmentos intermediários de tumor favoráveis. Registrados os números de pedaços.
[00618] Removido da incubadora o frasco G-Rex-100MCS contendo meio. Assepticamente passado o frasco G-Rex-100MCS para dentro da BSC. Quando transferido o frasco, não foi segurado na tampa ou no fundo do frasco. Transferido o frasco manuseando-o pelos lados. Na BSC, levantada a tampa do frasco G-Rex-100MCS, garantindo que a esterilidade da tubulação interna fosse mantida. Remoinhado o frasco cônico com pedaços de tumor para suspender e rapidamente derramados os conteúdos para dentro do frasco G-Rex-100MCS. Garantido que os pedaços de tumor foram uniformemente distribuídos sobre toda a membrana do frasco. Suavemente inclinado o frasco para trás e para frente, se necessário, para uniformemente distribuir os
337 / 509 pedaços de tumor. Registrado o número de fragmentos de tumor sobre a membrana de fundo do frasco e o número observado de pedaços flutuando dentro do frasco. NOTA: Se o número de fragmentos semeados NÃO foi equivalente ao número de fragmentos coletados, contatado o Gerente da Área, e documentar na Seção 10.0.
[00619] Incubados os frascos G-Rex-100MCS com os seguintes parâmetros: Frasco G-Rex incubado: Mostrador LED de Temperatura: 37,0°C±2,0°C; Percentagem de CO2: 5,0%±1,5% de CO2. Realizados os cálculos para determinar a hora apropriada para remover os frascos G-Rex- 100MCS da incubadora no Dia 11. Cálculos: Tempo de incubação; limite inferior = hora de incubação + 252 horas; limite superior = hora de iniciação + 276 horas. Dia 11 – Preparação de Meio
[00620] Monitorada a Incubadora. Parâmetros da incubadora: Mostrador LED de Temperatura: 37,0°C±2,0°C; Percentagem de CO2: 5,0%±1,5% de CO+. Aquecidos 3 frascos de 1.000mL de Meio RPMI 1640 (W3013112) e 3 frascos de 1.000mL de AIM-V® (W3009501) em uma incubadora durante ≥ 30 minutos. Registrada a hora. Meios: RPMI 1640 e AIM-V®. Posicionado 1 frasco de 1.000mL de Meio AIM-V® (W3009501) adicional à temperatura ambiente para uso posterior.
[00621] Removido o Meio RPMI 1640 quando o tempo foi alcançado. Registrado a hora de término de incubação na Etapa 8.4.4. Garantir que o meio foi aquecido durante ≥30 min. Na BSC, removidos 100,0mL de cada um dos três frascos de 1.000mL de Meio RPMI 1640 preaquecidos e posicionados dentro de um recipiente de tamanho apropriado rotulado “Resíduo”. Na BSC, adicionados os seguintes reagentes a cada um dos três frascos de Meio RPMI 1640 e registrados os volumes adicionados a cada frasco. Soro Humano GemCell™, Soro Tipo AB Inativado por Calor (100,0mL), GlutaMAX™ (10,0mL), Sulfato de gentamicina, 50 mg/mL
338 / 509 (1,0mL), 2-mercaptoetanol (1,0mL).
[00622] Tampados os frascos e remoinhados para garantir que os reagentes foram completamente misturados. Filtrado cada frasco de meio através de uma unidade de filtro separada de 1L de 0,22 micrometro. Assepticamente tampados os frascos com meio filtrado e rotulado cada frasco com Meio CM1 Dia 11. Descongeladas 3 alíquotas de 1,1mL de IL-2 (6×106 UI/mL) (BR71424) até que todo o gelo tivesse derretido. Registrada a solução de IL-2: Lote nº e Prazo de Validade.
[00623] Removidos da incubadora os três frascos de Meio AIM-V®. Registrada a hora de término da incubação. Garantido que todo o meio havia sido aquecido durante ≥ 30 minutos. Usando uma micropipeta, adicionados 3,0mL de solução de IL-2 descongelada para dentro de um frasco de 1L de Meio AIM-V® preaquecido. Enxaguar a ponta de micropipeta com meio após dispensar a solução de IL-2. Usar uma ponta nova estéril de micropipeta para cada alíquota. Registrado o volume total adicionado. Rotulado o frasco como “AIM-V® Contendo IL-2”. Assepticamente transferidos uma bolsa Labtainer™ de 10L e um conjunto de transferência de bomba Repeater™ para dentro da BSC. Fechadas todas as linhas em uma bolsa Labtainer™ de 10L. Conectada a extremidade da tubulação de diâmetro maior de um conjunto de transferência de bomba Repeater™ na porta fêmea intermediária da Bolsa Labtainer™ de 10L via conexão Luer-lock.
[00624] Montada a bomba Baxa™ perto da BSC. Alimentada a tubulação de conjunto de transferência através da bomba Baxa™. Ajustada a velocidade da bomba Baxa™ para “High” (Alta) e “9”. Removida a seringa do Sistema de Dispensação de Líquido Pumpmatic™ (PLDS) e descartada. Garantido para não comprometer a esterilidade da pipeta do PLDS.
[00625] Conectada a pipeta do PLDS na extremidade de diâmetro menor do conjunto de transferência de fluido de bomba Repeater™ via conexão Luer e posicionada a ponta da pipeta dentro do frasco de Meio AIM-
339 / 509 V® contendo IL-2 (preparado na Etapa 8.4.13) para aspiração. Abertos todos os clampes entre o frasco de meio e a bolsa Labtainer™ de 10L.
[00626] Usando o PLDS, transferir meio AIM-V® preaquecido contendo IL-2 preparado, e também dois frascos de AIM-V® adicionais para dentro da bolsa Labtainer™ de 10L. Adicionados os três frascos de Meio CM1 Dia 11 filtrado. Após a adição do frasco final, limpada a linha para a bolsa. NOTA: Desligada a bomba entre a adição de cada frasco de meio. Removido o PLDS do conjunto de transferência e colocada uma tampa vermelha sobre o Luer da linha na BSC. Massageada suavemente a bolsa para misturar. Rotulada a bolsa de meio com a seguinte informação. Prazo de validade foi de 24 horas a partir da data de preparação.
[00627] Conectada uma seringa de 60mL na porta fêmea disponível da bolsa de “Meio Completo CM2 Dia 11”. Removidos 20,0mL de meio e adicionados a um tubo cônico de 50mL. Colocada uma tampa vermelha na porta fêmea da Bolsa de “Meio Completo CM2 Dia 11”. Rotulada e armazenada a Amostra de Retenção de Meio a 2-8ºC até submetida ao teste. Lacrada com calor a tampa vermelha na linha de conjunto de transferência, fechar a tampa vermelha. Manter o conjunto de transferência sobre a bolsa.
[00628] Na BSC, adicionados 4,5mL de Meio AIM-V® que havia sido rotulado com “Para Diluições para Contagem de Células” e número do lote para quatro tubos cônicos de 15mL. Rotulados os tubos com o número do lote e o número do tubo (1-4). Rotulados 4 criofrascos “Células Alimentadoras” e número do frasco (1-4). Transferidos quaisquer 2-mercaptoetanol, GlutaMAX™, e soro humano restantes da BSC para 2-8°C.
[00629] Do lado de fora da BSC, soldar uma Bolsa de Transferência de 1L no conjunto de transferência conectada na bolsa de “Meio Completo CM2 Dia 11” preparada. Rotulado o pacote de transferência como “Meio CM2 de Células Alimentadoras” e número do lote. Aplicar uma marca sobre a tubulação da Bolsa de Transferência de 1L umas poucas polegadas longe da
340 / 509 bolsa. Colocar a Bolsa de Transferência vazia sobre a balança de modo que a tubulação permaneça sobre a balança até o ponto da marca. Tarada a balança e deixar a Bolsa de Transferência vazia sobre a balança.
[00630] Ajustada a velocidade da bomba Baxa™ em “Medium” (Média) e “4”. Bombeados 500,0mL ±5,0mL de “Meio Completo CM2 Dia 11” preparado na Etapa 8.4.22 para dentro do pacote de transferência “Meio de Células CM2”. Medido em peso e registrado o volume de Meio Completo CM2 adicionado ao Pacote de Transferência.
[00631] Logo que cheia, vedar com calor a linha. Separada a bolsa de Meio CM2 Dia 11 com conjunto de transferência da Bolsa de Transferência de Meio de Células Alimentadoras, manter a solda no pacote de transferência de 1L. Deixado na incubadora até o uso, o “Meio Completo CM2 Dia 11” preparado. Dia 11 - Colheita de TIL
[00632] Parâmetros da incubadora: Mostrador LED de Temperatura: 37,0°C±2,0°C; Percentagem de CO2: 5,0%±1,5% de CO2. Realizada checagem para garantir que os parâmetros de incubação são atendidos antes da remoção de G-REX-100MCS da incubadora. Os limites inferiores são os mesmos conforme descritos acima.
[00633] Registrada a Hora de Remoção da incubadora. Cuidadosamente removido G-Rex-100MCS da incubadora e garantido que todos os clampes estavam fechados exceto da linha de filtro grande. Registrada a hora de início de processamento.
[00634] Rotulada uma Bolsa de Transferência de 300mL como “Suspensão de TILs”. Esterilmente soldada a linha de transferência de Suspensão de TILs (linha única) de um Filtro de Sangue por Gravidade. Posicionada a Bolsa de Transferência de 300mL sobre uma balança e registrado o peso seco. Rotulada a Bolsa de Transferência de 1L como “Sobrenadante”.
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[00635] Esterilmente soldada a linha vermelha de remoção de meio do G-Rex-100MCS no pacote de transferência de “Sobrenadante”. Esterilmente soldada a linha de remoção de células limpa do G-Rex-100MCS em uma das duas linhas de ponta perfurante (spike) no topo do filtro de sangue conectado no pacote de transferência de “Suspensão de TILs”. Posicionado G-Rex- 100MCS no lado esquerdo da bomba GatheRex™ e as bolsas de transferência de “Sobrenadante” e de “Suspensão de TILs” no lado direito.
[00636] Instalar a linha vermelha de remoção de meio do G Rex- 00MCS no clampe de superior (marcada com uma linha vermelha) e guias de tubulação na bomba GatheRex™. Instalada a linha de colheita limpa do G- Rex-100MCS no clampe de fundo (marcada com uma linha azul) e guias de tubulação na bomba GatheRex™. Ligada a linha de gás da bomba GatheRex™ no filtro estéril do frasco G-Rex-100MCS. Antes de remover o sobrenadante do frasco G-Rex-100MCS, garantido que todos os clampes nas linhas de remoção de células estavam fechados. Transferidos ~900mL de sobrenadante de cultura do G-Rex-100MCS para a Bolsa de Transferência de 1L. Visualmente inspecionado o frasco G-Rex-100MCS para garantir que o frasco está nivelado e o meio tem sido reduzido até o fim do tubo de imersão de aspiração.
[00637] Após a remoção do sobrenadante, fechados todos os clampes para a linha vermelha.
[00638] Aplicadas pancadas vigorosas no frasco e remoinhado o meio para soltar as células. Realizada uma inspeção do frasco para garantir que todas as células têm sido soltas. NOTA: Gerente da área contatado se as células não se soltaram. Inclinado o frasco para longe da tubulação de colheita e permitido que os pedados de tumor se sedimentassem ao longo da borda. Lentamente inclinado o frasco na direção da tubulação de colheita de modo que os pedaços permanecessem sobre o lado oposto do frasco. Se o canudo de colheita de células não estiver na junção da parede e membrana de fundo, a
342 / 509 aplicação de pancadas no frasco enquanto inclinado em um ângulo de 45 graus é habitualmente suficiente para apropriadamente posicionar o canudo.
[00639] Soltados todos os clampes que conduzem para o pacote de transferência de Suspensão de TILs. Usando a bomba GatheRex™, transferida a suspensão de células através do filtro de sangue para dentro do pacote de transferência de 300mL. Mantida a borda inclinada até que todas as células e o meio tenham sido coletados. Inspecionada a membrana para células aderentes. Enxaguado o fundo do frasco G-Rex-100MCS. Cobrir ~1/4 da membrana de troca de gás com meio de enxágue. Garantido que todos os clampes estão fechados. Vedado com calor (conforme a Nota 5.12 de Processo) o pacote de transferência de Suspensão de TILs o mais próximo possível da solda de modo que o comprimento de tubulação total permaneça aproximadamente o mesmo. Vedado com calor o pacote de transferência de “Sobrenadante”. Mantida linha suficiente para solda. Registrado o peso do pacote de transferência de Suspensão de TILs e calculado o volume de suspensão de células.
[00640] Soldado um conjunto de transferência de plasma de 4 in (10 cm) no pacote de transferência de “Sobrenadante”, retendo a conexão Luer no conjunto de transferência de plasma de 4 in (10 cm), e transferido para dentro da BSC. Soldado o conjunto de transferência de plasma de 4 in (10 cm) no pacote de transferência de “Suspensão de TILs” de 300mL, mantida a conexão Luer no conjunto de transferência de plasma de 4 in (10 cm), e transferido para dentro da BSC.
[00641] Retirado aproximadamente 20,0mL de sobrenadante do pacote de transferência de “Sobrenadante” de 1L e dispensar para dentro de um tubo cônico estéril de 50mL rotulado “Bac-T”. Removida uma amostra de 1,0mL do tubo cônico de 50mL BacT usando uma seringa de tamanho apropriado e inoculado o frasco anaeróbico.
[00642] Rotulados 4 criofrascos com o número do frasco (1-4). Usando
343 / 509 seringas de 3 mL separadas, aspirar 4 amostras de 1,0mL, para contagem de células, da Bolsa de Transferência de “Suspensão de TILs” usando a conexão Luer, e adicionadas aos respectivos criofrascos. Colocar uma tampa vermelha (W3012845) na linha. Deixada a Bolsa de Transferência de TILs na incubadora até necessária. Realizadas contagens de células e realizados os cálculos. Realizadas contagens de células iniciais não diluídas. Se diluição não é necessária, “Amostra [µL]” = 200, “Diluição [µL]” = 0.
[00643] Registradas as contagens de células e registrados os números de TILs. Se Células TIL Viáveis Totais são < 5×106 células, prosseguido para “Semeadura e Enchimento de G-Rex no Dia 11”. Se Células TIL Viáveis Totais são > 5×106 células, prosseguido para “Cálculo para Citometria de Fluxo”. Cálculo para Citometria de Fluxo.
[00644] Se a contagem de Células TIL Viáveis Totais foi ≥ 4,0×107, calculado o volume para obter 1,0×107 células para a amostra para citometria de fluxo. Células viáveis totais requeridas para citometria de fluxo: 1,0×107 células. Volume de células requerido para citometria de fluxo: Concentração de células viáveis dividida por 1,0×107 células.
[00645] Se aplicável: Recalculadas as células viáveis totais e recalculado o volume para citometria de fluxo. Calculadas as células viáveis totais restantes e calculado o volume restante após a remoção da amostra de citometria de fluxo abaixo. Criopreservação de Amostra de TILs
[00646] Se aplicável: Calculado o volume para criopreservação. Calculado o volume de células requerido para obter 1×107 células para criopreservação. TABELA 34: Cálculo para criopreservação Células TIL viáveis totais requeridas para Concentração de células Volume de células criopreservação viáveis requerido para criopreservação C=A÷B A. 1×107 células B. células/mL C. mL
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[00647] Se aplicável: Removida a amostra para Criopreservação. Removido o volume calculado do pacote de transferência de Suspensão de TILs. Colocado em um tubo cônico de tamanho apropriado e rotular como “Amostra para Criopreservação de 1×107 células”, datado, e número do lote. Colocada uma tampa vermelha (W3012845) no pacote de transferência de Suspensão de TILs.
[00648] Centrifugada a “Amostra para Criopreservação de 1×107 células” de acordo com os seguintes parâmetros: Velocidade: 350 x g, Tempo: 10:00 minutos, Temperatura: Ambiente, Frenagem: Máxima (9); Aceleração: Máxima (9).
[00649] Adicionado CS-10. Em BSC, assepticamente aspirar o sobrenadante. Aplicadas batidas suaves no fundo do tubo para ressuspender as células no fluido restante. Adicionado CS-10. Lentamente adicionado 0,5mL de CS10. Registrado o volume adicionado. Frascos de Amostra para Criopreservação cheios até ~0,5mL. Dia 11 - Células Alimentadoras
[00650] Obtidas 3 bolsas células alimentadoras com pelo menos dois números de lote diferentes do congelador de LN2. Mantidas as células sobre gelo seco até prontas para descongelamento. Registrada a informação de células alimentadoras. Confirmado que pelo menos dois lotes diferentes de células alimentadoras foram obtidos. Colocadas as bolsas de Células Alimentadoras dentro de bolsas superiores de zíper individuais, baseado no número de Lote, e descongeladas em banho de água a 37,0°C±2,0°C ou Cytotherm™ durante ~3-5 minutos ou até que o gelo tenha completamente desaparecido.
[00651] Preparação de cabo de ligações de células alimentadoras. Conectado 4S-4M60 a uma Conexão de Célula CC2 (W3012820), substituindo uma ponta perfurante (spike) única do aparelho de Conexão de Célula pela extremidade de 4 pontas perfurantes (spikes) do manifolde 4S-
345 / 509 4M60. Soldado conforme a necessidade.
[00652] Conectado o pacote de transferência de meio. Soldado o pacote de transferência de “Meio CM2 de Células Alimentadoras” em um Luer CC2. A bolsa será conectada no lado do cabo de ligações com a ponta de injeção sem agulha. Transferida a montagem contendo o Meio Completo CM2 Dia 11 para dentro da BSC.
[00653] Agrupar as células alimentadoras descongeladas. Dentro da BSC, aspirar 10mL de ar para dentro de uma seringa de 100mL. Usada esta para substituir a seringa de 60mL na CC2. Esfregada cada porta sobre as bolsas de células alimentadoras com uma almofada de álcool antes de remover a cobertura. Perfurar as três bolsas de células alimentadoras usando três dos spikes da CC2. Mantida pressão constante enquanto se gira a ponta perfurante (spike) em uma direção. Garantir para não perfurar o lado da porta. Aberta a torneira de modo que a linha das bolsas de células alimentadoras seja aberta e a linha para a porta de injeção sem agulha seja fechada. Puxar os conteúdos das bolsas de células alimentadoras para dentro de uma seringa. Todas as três bolsas são drenadas ao mesmo tempo. Logo que as bolsas de células alimentadoras haviam sido drenadas, enquanto se mantém a pressão sobre a seringa, desconectada por clampe a linha para as bolsas de células alimentadoras. Não soltada a seringa abaixo. a seringa do cabo de ligações. Registrado o volume total de células alimentadoras na seringa.
[00654] Adicionadas as células alimentadoras ao pacote de transferência. Girada a torneira de modo que a linha para a bolsa de células alimentadoras fosse fechada e a linha para a Bolsa de Transferência de meio fosse aberta. Garantido que a linha para o pacote de transferência de meio esteja não fechada. Dispensadas as células alimentadoras da seringa para dentro do pacote de transferência de “Meio CM2 de Células Alimentadoras”. Desconectada por clampe a linha para o pacote de transferência contendo as células alimentadoras e deixar a seringa acoplada no cabo de ligações.
346 / 509 Massageada a bolsa para misturar as células alimentadoras agrupadas no pacote de transferência. Rotulada a bolsa como “Suspensão de Células Alimentadoras”.
[00655] Calculado o volume total de suspensão de células alimentadoras. Removidas as amostras para contagem de células. Usando uma seringa de 3mL separada para cada amostra, puxadas 4 amostras de 1,0mL para contagem de células da Bolsa de Transferência de Suspensão de Células Alimentadoras usando a porta de injeção sem agulha. Aliquotada cada amostra para dentro de criofrascos rotulados.
[00656] Realizada a Contagem de Células e realizados os cálculos utilizando NC-200 e Nota de Processo 5.14. Diluídas as amostras para contagem de células pela adição de 0,5mL de suspensão de células a 4,5mL de meio AIM-V® rotulado com p número do lote e “Para Diluições para Contagem de Células”. Isto fornecerá uma diluição de 1:10.
[00657] Registada a Contagem de Células e registrados os volumes de amostra. Se Células Viáveis Totais são < 5×109, prosseguido. Se células viáveis totais são ≥ 5×109, prosseguido, conforme acima, para contagens de células mais altas. Obtidas células alimentadoras adicionais, conforme a necessidade, e adicionadas ao pacote de transferência conforme discutido acima. Calculado o volume de Suspensão de Células Alimentadoras que foi requerido para obter 5×109 células alimentadoras viáveis. Calculado o volume de excesso de células alimentadoras para remover. Arredondado para baixo para o número inteiro mais próximo.
[00658] Removido o excesso de células alimentadoras. Em uma seringa de 100mL nova, aspirados 10mL de ar e acoplada a seringa no cabo de ligações. Aberta a linha para o pacote de transferência de “Suspensão de Células Alimentadoras”. Usando a seringa, puxar o volume de células alimentadoras calculado mais um adicional de 10,0mL da Bolsa de Transferência para dentro de uma seringa de 100mL. Fechada a linha o pacote
347 / 509 de transferência de Suspensão de Células Alimentadoras logo que é removido o volume de células alimentadoras. Não foi removida a seringa final. Logo que uma seringa havia sido cheia, substituída a mesma por uma seringa nova. Múltiplas seringas puderam ser usadas para remover o volume total. Com cada seringa nova, puxados 10mL de ar. Registrado o volume total (incluindo os 10mL adicionais) de células alimentadoras removido.
[00659] Adicionado OKT3. Na BSC, usando uma seringa de 1,0mL e agulha 16G, puxado 0,15mL de OKT3. Assepticamente removida a agulha da seringa e acoplada a seringa à porta de injeção sem agulha. Injetado o OKT3. Aberta a torneira para o pacote de transferência de “Suspensão de Células Alimentadoras” e adicionados 10mL de células alimentadoras removidos previamente para fluir OKT3 através da linha. Virada a seringa para baixo e empurrado ar através da linha limpa para o pacote de transferência de Suspensão de Células Alimentadoras. Deixada a suspensão de células alimentadoras restante na seringa. Fechados todos os clampes e remover o cabo de ligações da BSC. Vedado com calor o pacote de transferência de Suspensão de Células Alimentadoras, deixando tubulação suficiente para soldar. Dia 11, Semeadura e Enchimento de Frasco G-Rex
[00660] Configurado o frasco G-Rex-500MCS. Removido um frasco G-Rex-500MCS da embalagem e inspecionado o frasco para quaisquer fissuras ou torções na tubulação. Garantidos que todas as conexões Luer estavam estanques e todos os fechos Luer estavam estanques. Fechados todos os clampes nas linhas de G-Rex-500MCS exceto para a linha do filtro de respiro. Usando um marcador, traçada uma linha na graduação de 4,5L. Removido o “Meio Completo CM2 Dia 11”, da incubadora.
[00661] Preparado para bombear o meio. Soldada a linha vermelha do G-Rex-500MCS no conjunto de transferência de bomba Repeater™ acoplado ao Meio Completo CM2 Dia 11. Pendurada a bolsa de “Meio Completo CM2
348 / 509 Dia 11” em uma haste de suporte IV. Alimentada a tubulação de bomba através da bomba Baxa™. Bombeado o meio para dentro do frasco G-Rex- 500MCS. Ajustada a velocidade da bomba Baxa™ para “High” (Alta) e “9”. Bombeados 4,5L de meio para dentro do frasco G-Rex-500MCS, enchendo até a linha marcada no frasco na graduação de 4,5L. Vedada com calor a linha vermelha do frasco G-Rex-500MCS próxima à solda. Rotulado o frasco com o rótulo “Dia 11”. Soldada a Bolsa de Transferência de Suspensão de Células Alimentadoras: O pacote de transferência de suspensão soldada no frasco. Esterilmente soldada a linha vermelha do frasco G-Rex-500MCS no pacote de transferência de “Suspensão de Células Alimentadoras”.
[00662] Adicionadas Células Alimentadoras ao frasco G-Rex- 500MCS. Abertos todos os clampes entre a bolsa de Suspensão de Células Alimentadoras e o frasco G-Rex-500MCS e adicionada a Suspensão de Células Alimentadoras ao frasco por alimentação por gravidade. Vedada por calor a linha vermelha próxima à solda. Soldado o pacote de transferência de Suspensão de TILs no frasco. Esterilmente soldada a linha vermelha do frasco G-Rex-500MCS no pacote de transferência de “Suspensão de TILs”.
[00663] Adicionados TILs ao frasco G-Rex-500MCS. Abertos todos os clampes entre a bolsa de Suspensão de TILs e o frasco G-Rex-500MCS e adicionada a Suspensão de TILs ao frasco por alimentação por gravidade. Vedada com calor a linha vermelha próxima à solda para remover a bolsa de suspensão de TILs.
[00664] Incubado o frasco G-Rex-500MCS. Checado se todos os clampes no frasco G-Rex-500MCS estavam fechados exceto na linha de filtro grande e colocado na incubadora. Parâmetros da incubadora: Mostrador LED de Temperatura: 37,0°C±2,0°C, Percentagem de CO2: 5,0%±1,5% de CO2.
[00665] Calculada a janela de incubação. Realizados cálculos para determinar a hora apropriada para remover o frasco G-Rex-500MCS da incubadora no Dia 16. Limite inferior: Hora de incubação + 108 horas. Limite
349 / 509 superior: Hora de incubação + 132 horas. Dia 11, Criopreservação de Excesso de TILs
[00666] Congelados os frascos com excesso de TILs. Registrado e verificado o número total de frascos colocados no Congelador com Velocidade de Congelamento Controlada (CRF, Control Rate Freezer). Após a completitude do congelamento, transferir os frascos do CRF para o recipiente de armazenamento apropriado. Dia 16, Preparação de Meio
[00667] Preaquecido o Meio AIM-V®. Removidas três bolsas de meio CTS AIM V de 10L de 2-8°C pelo menos 12 horas antes do uso e colocadas à temperatura ambiente protegidas da luz. Rotulada cada bolsa. Registradas a data e a hora do início do aquecimento. Garantido que todas as bolsas haviam sido aquecidas no decorrer de uma duração entre 12 e 24 horas.
[00668] Acoplada a extremidade de diâmetro maior de um conjunto de transferência de fluido a uma das portas fêmeas de uma bolsa Labtainer™ de 10L usando os conectores Luer. Configurada a bolsa Labtainer™ de 10L para Sobrenadante. Rotulada como “Sobrenadante”. Configurada a bolsa Labtainer™ de 10L para Sobrenadante. Garantido que todos os clampes estavam fechados antes da remoção da BSC.
[00669] Descongeladas 5 alíquotas de 1,1mL de IL-2 (6×106 UI/mL) (BR71424) por bolsa de meio CTS AIM V até que todo o gelo tivesse descongelado. Aliquotados 100,0mL de GlutaMAX™ para dentro de um recipiente de tamanho apropriado. Registrado o volume adicionado a cada recipiente e rotulado cada recipiente como “GlutaMAX™”.
[00670] Adicionada IL-2 a GlutaMAX™. Usando uma micropipeta, adicionados 5,0mL de IL-2 a cada recipiente de GlutaMAX™. Garantido o enxágue da ponta de acordo com a Nota 5.18 de Processo e usada uma ponta nova de pipeta para cada mL adicionado. Registrado o volume adicionado a cada recipiente de GlutaMAX™ e rotulado cada recipiente como
350 / 509 “GlutaMAX™ + IL-2” e número do recipiente.
[00671] Preparada bolsa de meio CTS AIM V para formulação. Garantido que a bolsa de meio CTS AIM V de 10L (W3012717) fosse aquecida à temperatura ambiente e protegida da luz durante 12-24 horas antes do uso. Registrada a hora do término da incubação. Na BSC, fechada o clampe em um conjunto de transferência de plasma de 4 in (10 cm), então conectado à bolsa usando as portas de ponta perfurante (spike). Mantida a pressão constante enquanto se girava a ponta perfurante (spike) em uma direção. Garantido para não perfurar o lado da porta. Conectada a extremidade de diâmetro maior de um conjunto de transferência de fluido de bomba Repeater™ ao conjunto de transferência de plasma de 4 in (10 cm) via Luer.
[00672] Montada a bomba Baxa™ perto da BSC. Removida a seção tubular de conjunto de transferência de fluido de bomba Repeater™ da BSC e instalada na bomba Repeater™.
[00673] Preparado o meio de formulação. Na BSC, removida a seringa do Sistema de Dispensação de Líquido Pumpmatic™ (PLDS) e descartada. Garantido para não comprometer a esterilidade da pipeta do PLDS. Conectada a pipeta do PLDS na extremidade de diâmetro menor do conjunto de transferência de fluido de bomba Repeater™ via conexão Luer e posicionada a ponta da pipeta dentro de “GlutaMAX™ + IL-2” preparado, acima, para aspiração. Abertos todos os clampes entre o recipiente e a bolsa de 10L.
[00674] Bombeado GlutaMAX™ +IL-2 para dentro da bolsa. Ajustada a velocidade da bomba para “Medium” (Média) e “3” e bombeado todo “GlutaMAX™ + IL-2” para dentro da bolsa de meio CTS AIM V de 10L. Logo que nenhuma solução restar, limpar a linha e desligar a bomba. Registrado o volume de GlutaMAX™ contendo IL-2 adicionado a cada bolsa AIM V abaixo.
[00675] Removido o PLDS. Garantido que todos os clampes estavam
351 / 509 fechados, e removida a pipeta do PLDS do conjunto de transferência de fluido de bomba Repeater™. Removido o conjunto de transferência de fluido de bomba Repeater™ e colocada tampa vermelha no conjunto de transferência de plasma de 4 in (10 cm).
[00676] Rotulado cada bolsa de “Meio Completo CM4 Dia 16” preparado.
[00677] Removida a Retenção de Meio de acordo com o Plano de Amostra. Usando uma seringa de 30mL, removidos 20,0mL de “Meio Completo CM4 Dia 16” pelo acoplamento da seringa ao conjunto de transferência de plasma de 4 in (10 cm) e dispensada a amostra para dentro de um tubo cônico de 50mL. Garantir que o conjunto de transferência de plasma de 4 in (10 cm) quer estava fechado por clampe quer estava fechado com tampa vermelha após a remoção da seringa.
[00678] Acoplado novo conjunto de transferência de fluido de bomba Repeater™. Acoplada a extremidade de diâmetro maior de um novo conjunto de transferência de fluido de bomba ao conjunto de transferência de plasma de 4 in (10 cm) que estava conectado à bolsa de “Meio Completo CM4 Dia 16”. Rotulado com rótulo de inventário de plano de amostra e armazenada a amostra de retenção de meio a 2-8ºC até ser submetida ao teste.
[00679] Monitorada a Incubadora. Se aplicável, monitorar as bolsas individuais preparadas. Parâmetros da incubadora: Mostrador LED de Temperatura: 37,0°C±2,0°C, Percentagem de CO2: 5,0%±1,5% de CO2.
[00680] Aquecido o Meio Completo CM4 Dia 16. Aquecida a primeira bolsa de Meio Completo CM4 Dia 16 na incubadora durante ≥ 30 minutos até pronta para uso. Se aplicável, aquecidas bolsas adicionais.
[00681] Preparadas Diluições. Na BSC, adicionados 4,5mL de Meio AIM-V® que havia sido rotulado com “Para Diluições para Contagem de Células” a cada um de 4 tubos cônicos de 15mL. Rotulados os tubos cônicos. Rotulados os 4 criofrascos.
352 / 509 Dia 16, Separação em REP
[00682] Monitorada a Incubadora. Parâmetros da incubadora: Mostrador LED de Temperatura: 37,0°C±2,0°C, Percentagem de CO2: 5,0%±1,5% de CO2.
[00683] Removido o frasco G-Rex-500MCS da incubadora. Realizada checagem, abaixo, para garantir que os parâmetros de incubação são atendidos antes da remoção do frasco G-Rex-500MCS da incubadora: limite superior, limite inferior, hora de remoção. Removido o frasco G-Rex- 500MCS da incubadora.
[00684] Vedado com calor o pacote de transferência de 1L (W3006645), deixando ~12 in (30,5 cm) de linha. Rotulado o pacote de transferência de 1L como “Suspensão de TILs”. Posicionar o pacote de transferência de 1L, incluindo a linha inteira, sobre uma balança e registrar o peso seco.
[00685] Configuração da bomba GatheRex™. Esterilmente soldada a linha vermelha de remoção de meio do frasco G-Rex-500MCS no conjunto de transferência de bomba Repeater™ na bolsa Labtainer™ de 10L de “Sobrenadante” preparada acima. Esterilmente soldada a linha de remoção de células limpa do G-Rex-500MCS no pacote de transferência de Suspensão de TILs preparada acima. Posicionado o frasco G-Rex-500MCS no lado esquerdo da bomba GatheRex™. Posicionadas a bolsa de sobrenadante Labtainer™ e o pacote de transferência de suspensão de TILs no lado direito. Instalada a linha vermelha de remoção de meio do frasco G-Rex-500MCS no clampe superior (marcada com uma linha vermelha) e guias de tubulação na bomba GatheRex™. Instalada a linha de colheita limpa do frasco G-Rex- 500MCS no clampe inferior (marcada com linha azul) e guias de tubulação na bomba GatheRex™. Acoplada a linha de gás da bomba GatheRex™ ao filtro estéril do frasco G-Rex-500MCS. NOTA: Antes da remoção do sobrenadante do frasco G-Rex-500MCS, garantido que todos os clampes nas linhas de
353 / 509 remoção de células estavam fechados.
[00686] Redução do volume do frasco G-Rex-500MCS. Transferidos ~4,5L de sobrenadante de cultura do frasco G-Rex-500MCS para o Labtainer™ de 10L de acordo com SOP-01777. Visualmente inspecionar o frasco G-Rex-500MCS para garantir que o frasco esteja nivelado e o meio tenha sido reduzido até a extremidade do tubo de imersão de aspiração.
[00687] Preparado o frasco para Colheita de TILs. Após a remoção do sobrenadante, fechados todos os clampes para a linha vermelha.
[00688] Início da Colheita de TILs. Registrada a hora de início da colheita de TILs. Aplicação de pancadas vigorosas no frasco e remoinhar o meio para soltar as células. Realizada uma inspeção do frasco para garantir que todas as células estavam soltas. Inclinado o frasco para garantir que a mangueira esteja na borda do frasco. Se o canudo de colheita de células não estiver na junção da parede e membrana de fundo, aplicação de pancada no frasco enquanto inclinado em um ângulo de 45 graus é habitualmente suficiente para apropriadamente posicionar o canudo.
[00689] Colheita de TILs. Soltos todos os clampes que conduzem para o pacote de transferência de Suspensão de TIL. Usando a bomba GatheRex™ transferida a suspensão de células para dentro do pacote de transferência de Suspensão de TIL. NOTA: Certifique-se de manter a borda inclinada até que todas as células e o meio sejam colhidos. Inspecionada a membrana para células aderentes.
[00690] Enxaguada a membrana do frasco. Enxaguado o fundo do frasco G-Rex-500MCS. Cobrir ~1/4 da membrana de troca de gás com meio de enxágue. Fechados todos os clampes no frasco G-Rex-500MCS. Garantido que todos os clampes foram fechados no frasco G-Rex-500MCS.
[00691] Vedado com calor. Vedada com calor a Bolsa de Transferência contendo os TILs o mais próximo possível da solda de modo que o comprimento da tubulação total permaneça aproximadamente o mesmo.
354 / 509 Vedado com calor o 10L Labtainer™ de 10L contendo o sobrenadante e passado para dentro da BSC para colheita de amostra.
[00692] Registrado o peso da Bolsa de Transferência com a suspensão de células e calcular o volume de suspensão. Preparada o pacote de transferência para remoção de amostra. Soldado um conjunto de transferência de plasma de 4 in (10 cm), no pacote de transferência de Suspensão de TILs, acima, deixando a extremidade Luer fêmea acoplada tão próxima quanto possível da bolsa.
[00693] Removidas as amostras de teste do sobrenadante de células. Na BSC, remover 10,0mL de sobrenadante do 10L Labtainer™ usando porta Luer fêmea e seringa de tamanho apropriado. Adicionado a um tubo cônico de 15mL e rotulado como “BacT” e reter o tubo de amostra BacT. Usando uma seringa separada, removido 10,0mL de sobrenadante e adicionados em um tubo cônico de 15mL. Retido o tubo para amostra de microplasma para teste. Rotulado o tubo como “Diluente para Micoplasma”. Fechada a bolsa de sobrenadante. Colocada uma tampa vermelha na porta Luer para fechar a bolsa, e remover da BSC.
[00694] Removida as Amostras para Contagem de Células. Na BSC, usando seringas de 3mL separadas para cada amostra, removidas 4 amostras de 1,0mL para contagem de células do pacote de transferência de “Suspensão de TILs” usando a conexão Luer. Adicionadas as amostras a criofrascos preparados acima.
[00695] Removidas as Amostras de Micoplasma. Usando uma seringa de 3mL, removido 1,0mL do pacote de transferência de Suspensão de TILs e adicionado a frasco cônico de 15mL rotulado “Diluente para Micoplasma” preparado acima. Rotulada e armazenada a amostra de Micoplasma a 2-8ºC até submetida ao teste.
[00696] Preparada Bolsa de Transferência para Semeadura. Na BSC, acoplada a extremidade de diâmetro grande de um conjunto de transferência
355 / 509 de fluido de bomba Repeater™ ao adaptador Luer no pacote de transferência contendo os TILs. Aplicado clampe na linha próxima ao pacote de transferência usando um hemostato. Colocada uma tampa vermelha na extremidade do conjunto de transferência.
[00697] Posicionado os TILs na incubadora. Removida a suspensão de células da BSC e colocada em incubadora até ser necessária. Registrada a hora.
[00698] Realizada a Contagem de Células. Realizada a contagem de células e os cálculos utilizando NC-200. Diluídas as amostras para contagem de células inicialmente pela adição de 0,5mL de suspensão de células a 4,5mL de meio AIM-V® preparado acima. Isto forneceu uma diluição de 1:10.
[00699] Calculado os frascos para subcultura. Calculado o número total de frascos para semeadura. NOTA: Arredondado o número de frascos G-Rex- 500MCS para cima até o número inteiro mais próximo. TABELA 35: Cálculo do número de frascos Contagem de Células Viáveis Totais Células Alvo Requeridas por Número de frascos G- A frasco Rex-500MCS para B semeadura C = A÷B células 1,0×109 células/frasco frascos
[00700] O número máximo de frascos G-Rex-500MCS para semeadura foi cinco. Se o número calculado de frascos para semeadura ultrapassou cinco, apenas cinco foram semeados USANDO O VOLUME INTEIRO DE SUSPENSÃO DE CÉLULAS DISPONÍVEL.
[00701] Determinado o número de bolsas de meio adicionais necessárias. Calculado o número de bolsas de meio requeridas adicionalmente à bolsa preparada acima. Arredondado o número de bolsas de meio requeridas para cima até o número inteiro mais próximo. TABELA 36: Cálculo do número de bolsas de meio Número de Frascos G-Rex- Número de Bolsas de Meio Número de Bolsas Número de Bolsas 500MCS para Semeadura Requeridas Preparadas Acima Adicionais a A B = A÷2* C Preparar D = B-C 1
356 / 509
[00702] Preparado meio adicional conforme a necessidade. Preparada uma bolsa de 10L de “Meio CM4 Dia 16” para cada dois frascos G-Rex- 500M necessários calculados acima. Prosseguido e semeado o(s) primeiro(s) frasco(s) GREX-500M enquanto que o meio adicional é preparado e aquecido.
[00703] Preparadas bolsas de meio adicionais conforme a necessidade. Preparado e aquecido o número calculado de bolsas de meio adicionais determinado acima.
[00704] Enchido o frasco G-Rex-500MCS. Aberto um frasco G-Rex- 500MCS sobre a bancada e inspecionado para fissuras no frasco ou torções na tubulação. Garantido que todas as conexões Luer e todos os fechos Luer estavam estanques. Traçada com um marcador uma marca na linha de
4.500mL sobre o lado externo do frasco. Fechados todos os clampes no frasco G-Rex-500MCS exceto na linha de filtro grande. Esterilmente soldada a linha de meio vermelha de um frasco G-Rex-500MCS no conjunto de transferência de fluido no frasco de meio preparado acima.
[00705] Preparado para bombear meio. Pendurada bolsa de “Meio CM4 Dia 16” em uma haste de suporte IV. Alimentada a tubulação da bomba através da bomba Baxa™.
[00706] Bombeado o meio para dentro do frasco G-Rex-500MCS. Ajustar a bomba Baxa™ em “High” (Alta) e “9” e bombear 4.500mL de meio para dentro do frasco. Bombeados 4,5L de “Meio CM4 Dia 16” para dentro do frasco G-Rex-500MCS, enchendo até a linha marcada no frasco conforme acima. Logo que 4,5L de meio haviam sido transferidos, desligada a bomba.
[00707] Vedada com calor. Vedada com calor a linha de meio vermelha do frasco G-Rex-500MCS, próxima à solda criada, removendo a bolsa de meio.
[00708] Repetido enchimento. Repetir as etapas de enchimento e vedação para cada frasco calculado conforme acima à medida que o meio é
357 / 509 aquecido e preparado para uso. Múltiplos frascos podem ser enchidos ao mesmo tempo usando enchimento por gravidade ou múltiplas bombas. Encher apenas dois frascos por bolsa de meio.
[00709] Registrado(s) e rotulado(s) o(s) frasco(s) cheio(s). Rotulado cada frasco alfabeticamente e com rótulos de “Dia 16”.
[00710] Incubado frasco conforme a necessidade. Mantido o frasco na incubadora enquanto se aguarda a semeadura com TIL. Registrado o número total de frascos cheios.
[00711] Calculado o volume de suspensão de células a adicionar. Calculado o volume alvo de suspensão de TILs a adicionar aos novos frascos G-Rex-500MCS. TABELA 37: Volume de suspensão de células Volume total de suspensão de Número de frasco(s) cheio(s) Volume alvo de suspensão de TILs B células a transferir para cada A frasco C= A÷B mL mL
[00712] Se o número de frascos ultrapassar cinco, apenas cinco serão semeados, USANDO O VOLUME INTEIRO DE SUSPENSÃO DE CÉLULAS.
[00713] Preparados frascos para semeadura. Removidos os frascos G- Rex-500MCS da Etapa 8.10.70 da incubadora.
[00714] Preparado para bombeamento. Fechados todos os clampes no frasco G-Rex-500MCS exceto na linha de filtro grande. Alimentada a tubulação da bomba através da bomba Baxa™.
[00715] Removidos TILs da incubadora. Removido o pacote de transferência de “Suspensão de TILs” da incubadora e registrada a hora do término da incubação.
[00716] Preparada a suspensão de célula para semeadura. Esterilmente soldado o pacote de transferência de “Suspensão de TILs”, acima, na linha de entrada da bomba.
[00717] Posicionada a bolsa de suspensão de TILs sobre uma balança.
358 / 509 Imprimada a linha desde a bolsa de suspensão de TILs até a solda usando a bomba Baxa™ ajustada em “Low” (Baixa) e “2”. Tarada a balança.
[00718] Semeado o frasco com a Suspensão de TILs. Ajustada a bomba Baxa™ em “Medium” (Média) e “5”. Bombear o volume de suspensão de TILs, calculado acima, para dentro do frasco. Registrar o volume de Suspensão de TILs adicionado a cada frasco.
[00719] Vedada com calor. Vedado com calor o pacote de transferência de “Suspensão de TILs”, deixando tubulação suficiente para solda no frasco seguinte.
[00720] Enchidos os frascos restantes. Entre cada frasco semeado, garantida mistura do pacote de transferência de “Suspensão de TILs” e repetir as etapas de enchimento e vedação de todos os frascos restantes.
[00721] Monitorada a Incubadora. Se os frascos precisam ser separados dentre duas incubadoras, garantir a monitoração de ambos. Parâmetros da incubadora: Mostrador LED de Temperatura: 37,0°C±2,0°C, Percentagem de CO2: 5,0%±1,5% de CO2. Registrada a hora que cada frasco é posicionado na incubadora.
[00722] Calculada a janela de incubação. Realizados os cálculos, abaixo, para determinar a faixa de tempo para remover G-Rex-500MCS da incubadora no Dia 22. Limite interior: hora +132 horas; limite superior: hora + 156 horas. Dia 22, Preparação de Tampão de Lavagem
[00723] Preparada Bolsa Labtainer™ de 10L. Na BSC, conectar um conjunto de transferência de plasma de 4 in (10 cm) a uma Bolsa Labtainer™ de 10L via conexão Luer. Preparada a Bolsa Labtainer™ de 10L. Rotular como “Sobrenadante”, número do lote, e data do início. Fechados todos os clampes antes de remover da BSC. NOTA: Preparada uma Bolsa Labtainer™ de 10L para cada dois frascos G-Rex-500MCS a serem colhidos.
[00724] Soldado o conjunto de transferência de fluido. No lado de fora
359 / 509 da BSC, fechados todos os clampes em 4S-4M60. Soldado o conjunto de transferência de fluido de bomba Repeater™ a uma das extremidades de Luer macho de 4S-4M60.
[00725] Passados PlasmaLyte-A™ e Albumina Humana 25% para dentro da BSC. Passada montagem de 4S-4M60 e conjunto de transferência de fluido de bomba Repeater™ para dentro da BSC. TABELA 38: Componentes Descrição do Componente Quantidade Necessária PlasmaLyte-A™ 3.000,0mL Albumina Humana 25% 120,0mL 4S-4M60 com Conjunto de Transferência 1 Aparelho de Bomba Repeater™ Etapa 8.11.7 TABELA 39: PlasmaLyte-A™ Látex: Não fabricado com látex de borracha natural Tipo de recipiente: VIAFLEX PVC: Contém PVC DEHP: Contém DEHP Volume: 500 mL Calorias totais: 21 kcal/L Sódio: 140 mEq/L Potássio: 5 mEq/L Magnésio: 3 mEq/L Acetato: 27 mEq/L Cloreto: 98 mEq/L Gliconato: 23 mEq/L Osmolaridade (mOsmol/L): 294 Gravidade Específica: 1,01 pH: 7,4 Faixa de Volume de Enchimento (mL): 530-565 Prazo de Validade a partir da Fabricação: 15 meses Contém Conservante: Não Recomendações de Armazenamento: Armazenar à temperatura ambiente (25°C/77°F); exposição breve a até 40°C/104°F não afeta adversamente o produto. Embalagem: Pacote Único Rx Apenas: Sim **Conforme comercialmente disponível junto a http://ecatalog.baxter.com/ecatalog/loadproduct.html?cid= 20016&lid=1.0001&hid=2.0001&pid=821874.
[00726] Bombeado PlasmaLyte-A™ para dentro de bolsa de 3.000mL. Perfuradas três bolsas de PlasmaLyte-A™ no conjunto Conector 4S-4M60. NOTA: Esfregar a cobertura da porta com uma zaragatoa de álcool (W3009488) antes da remoção. NOTA: Manter pressão constante enquanto se gira a ponta perfurante (spike) em uma direção. Garantir não perfuração no lado da porta. Conectada bolsa de colheita de 3.000mL Origen™ via conexão
360 / 509 Luer à extremidade de diâmetro maior do conjunto de transferência de bomba Repeater™. Fechados os clampes nas linhas não usadas da Bolsa Origen™ de
3.000mL. Montada a bomba Baxa™ perto da BSC. Alimentada a tubulação do conjunto de transferência através da bomba Baxa™ situada fora da BSC. Ajustar a bomba em “High” (Alto) e “9”. Abertos todos os clampes da Bolsa PlasmaLyte-A™ para a Bolsa Origen™ de 3.000mL. Bombeado todo o PlasmaLyte-A™ para dentro da bolsa Origin de 3.000mL. Logo que todo o PlasmaLyte-A™ foi bombeado, desligada a bomba. Se necessário, remover o ar da bolsa Origin™ de 3.000mL pela reversão da bomba e manipulação da posição da bolsa. Fechados todos os clampes.
[00727] Remover a bolsa de 3.000mL do conjunto de transferência de fluido de bomba Repeater™ via conexão Luer e colocada uma tampa vermelha (W3012845) na linha para a bolsa.
[00728] Adicionada Albumina Humana 25% à Bolsa de 3.000mL. Aberta a miniponta perfurante mini-spike® ventilada. Sem comprometer a esterilidade da ponta perfurante (spike), garantido que a tampa azul está seguramente apertada. Perfurado o septo de um frasco de Albumina Humana 25% com a miniponta perfurante mini-spike® ventilada. NOTA: Garantido para não comprometer a esterilidade da ponta perfurante (spike). Repetido duas vezes para um total de três (3) frascos de Albumina Humana 25% perfurados. Removida a tampa azul de uma miniponta perfurante mini-spike® ventilada e acoplada uma seringa de 60mL ao frasco de Albumina Humana 25%. Puxados 60mL de Albumina Sérica Humana 25%. Pode ser necessário usar mais que um frasco de Albumina Sérica Humana 25%. Se necessário, desconectar a seringa da miniponta perfurante mini-spike® ventilada e conectá-la à seguinte miniponta perfurante mini-spike® ventilada em um frasco de Albumina Sérica Humana 25%. Logo que 60mL têm sido obtidos, remover a seringa da miniponta perfurante mini-spike® ventilada. Acoplar a seringa à porta de injeção sem agulha na bolsa Origin™ de 3.000mL cheia
361 / 509 com PlasmaLyte-A™. Dispensada toda a Albumina Humana 25%. Repetido para obter um volume final de 120,0mL de Albumina Humana 25%. Misturado suavemente a bolsa até que toda a Albumina Humana 25% tenha sido adicionada. Rotulado como “Tampão de Lavagem LOVO” e atribuir o prazo de validade de 24 horas.
[00729] Preparado Diluente para IL-2. Usando uma seringa de 10mL, removidos 5,0mL de Tampão de Lavagem LOVO usando a porta de injeção sem agulha na bolsa de Tampão de Lavagem LOVO. Dispensado o tampão de lavagem LOVO para dentro de um tubo cônico de 50mL e rotular como “Diluente para IL-2”.
[00730] Tampão de Lavagem LOVO de Bolsa em Branco de CRF Aliquotado. Usando uma seringa de 100mL, puxados 70,0mL de Tampão de Lavagem LOVO da porta de injeção sem agulha. NOTA: Esfregada a porta de injeção sem agulha com uma almofada de álcool antes de cada uso. Colocada uma tampa vermelha na seringa e rotular como “criobolsa em branco” e o número do lote. NOTA: Mantida a seringa à temperatura ambiente até necessária na Etapa 8.14.3.
[00731] Completada a Preparação do Tampão de Lavagem. Fechados todos os clampes na bolsa de Tampão de Lavagem LOVO.
[00732] Descongelada solução de IL-2. Descongelada uma alíquota de 1,1mL de IL-2 (6×106 UI/mL), até que todo o gelo tenha derretido. Registrar número do lote de IL-2 e o prazo de validade. NOTA: Garantido que o rótulo IL-2 está fixado.
[00733] Preparação de IL-2. Adicionados 50µL de solução de estoque de IL-2 (6×106 UI/mL) ao tubo cônico de 50mL rotulado “Diluente para IL- 2”.
[00734] Preparação de IL-2. Rotular de novo tubo cônico como “IL-2 6×104”, a data, o número do lote, e o prazo de validade de 24 horas. Tampar e armazenar a 2°C-8°C.
362 / 509
[00735] Preparação para Criopreservação. Deixados 5 criocassetes a 2°C-8°C para pré-condicionamento deles para a criopreservação do produto final.
[00736] Preparadas as Diluições para Contagem de Células. Na BSC, adicionados 4,5mL de Meio AIM-V, que está rotulado com o número do lote e “Para Diluições para Contagem de Células”, a 4 tubos cônicos de 15mL separados e rotulados os tubos.
[00737] Preparadas Contagens de Células. Rotulados 4 criofrascos com o número do frasco (1-4). Dia 22, Colheita de TILs
[00738] Monitorada a incubadora. Parâmetros da incubadora: Mostrador LED de Temperatura: 37°C±2,0°C, Percentagem de CO2: 5%±1,5%.
[00739] Removidos os Frascos G-Rex-500MCS da Incubadora. Checados os frascos e confirmados que os parâmetros de incubação eram atendidos antes da remoção dos frascos G-Rex-500MCS da incubadora (tempo de incubação).
[00740] Preparada bolsa de colheita de TILs. Rotulada uma bolsa de colheita de 3.000mL como “Suspensão de TILs”, número do lote, e data de início.
[00741] Lacradas conexões extras. Lacradas com calor duas conexões Luer na bolsa de colheita próxima à extremidade de cada conexão.
[00742] Configuração de GatheRex™. Esterilmente soldada (conforme a Nota 5.11 de Processo) a linha vermelha de remoção de meio do frasco G- Rex-500MCS na bolsa Labtainer™ de 10L preparada acima. NOTA: Consultada a Nota 5.16 de Processo para uso de múltiplos dispositivos GatheRex™. Esterilmente soldada (conforme a Nota 5.11 de Processo) a linha de remoção de células limpa do G-Rex-500MCS na bolsa de colheita de Suspensão de TILs preparada acima. Posicionado o frasco G-Rex-500MCS no
363 / 509 lado esquerdo do GatheRex™. Posicionada a bolsa Labtainer™ de sobrenadante e a bolsa de colheita de suspensão de TILs agrupados no lado direito. Instalada a linha vermelha de remoção de meio do G-Rex-500MCS no clampe superior (marcada com uma linha vermelha) guias de tubulação no GatheRex™. Instalada a linha de colheita limpa do G-Rex-500MCS no clampe inferior (marcado com uma linha azul) e guias de tubulação no GatheRex™. Acoplada a linha de gás do GatheRex™ no filtro estéril do G- Rex-500MCS. Antes da remoção do sobrenadante do G-Rex-500MCS, garantido que todos os clampes nas linhas de remoção de células estavam fechados.
[00743] Redução de Volume. Transferidos ~4,5L de sobrenadante do G-Rex-500MCS para bolsa de Sobrenadante. Visualmente inspecionado o frasco G-Rex-500MCS para garantir que o frasco está nivelado e o meio foi reduzido para a extremidade do tubo de imersão de aspiração. Repetida a etapa se necessário.
[00744] Preparado o frasco para Colheita de TILs. Após a remoção do sobrenadante, fechados todos os clampes para a linha vermelha.
[00745] Iniciada a colheita de TILs. Registrada a hora de início da colheita de TILs. Aplicadas pancadas vigorosas no frasco e remoinhado o meio para soltar as células. Realizada uma inspeção do frasco para garantir que todas as células haviam soltado. Posicionada a bolsa de colheita de
3.000mL de “Suspensão de TILs” sobre panos secos sobre uma superfície plana. Inclinado o frasco para garantir que a mangueira estivesse na borda do frasco. NOTA: Se a mangueira de colheita de células não estava na junção da parede e membrana de fundo, aplicação de pancadas no frasco enquanto inclinado em um ângulo de 45° é habitualmente suficiente para apropriadamente posicionar a mangueira.
[00746] Colheita de TILs. Soltos todos os clampes que conduzem para a bolsa de colheita de suspensão de TILs. Usando a bomba GatheRex™,
364 / 509 transferida a suspensão de TILs para dentro da bolsa de colheita de 3.000mL. NOTA: Mantida a borda inclinada até que todas as células e o meio fossem colhidos. Inspecionar a membrana para células aderentes.
[00747] Enxaguada a membrana do frasco. Enxaguado o fundo do frasco G-Rex-500MCS. Coberto ~1/4 da membrana de troca de gás com meio de enxágue.
[00748] Fechados os clampes em G- Rex-500MCS. Garantir que todos os clampes estão fechados.
[00749] Vedada com calor. Vedar com calor a bolsa de colheita contendo os TILs o mais próximo possível da solda de modo que o comprimento de tubulação total seja mantido aproximadamente o mesmo. Vedada com calor a bolsa de Sobrenadante.
[00750] Completada a colheita dos frascos G-Rex-500MCS restantes. Repetir as etapas acima, agrupando todos os TILs na mesma bolsa de colheita. Se for necessário, substituir a bolsa de sobrenadante de 10L após cada 2º frasco.
[00751] Preparada bolsa fonte LOVO. Obtida uma nova bolsa de colheita de 3.000mL. Rotulada como “Bolsa Fonte LOVO”, número do lote, e Data do Início. Vedada com calor a tubulação na “Bolsa Fonte LOVO”, removendo os Luers fêmeas, deixando linha suficiente para soldar.
[00752] Pesada a Bolsa Fonte LOVO. Posicionada uma caixa de plástico de tamanho apropriado sobre a balança e tarada. Posicionar a Bolsa Fonte LOVO, incluindo portas e linhas, na caixa e registrado o peso seco.
[00753] Transferida a suspensão de células para dentro da Bolsa Fonte LOVO. Fechados todos os clampes de um filtro de sangue de 170 µm por gravidade.
[00754] Transferida a suspensão de células para dentro da Bolsa Fonte LOVO. Esterilmente soldada a extremidade terminal longa do filtro de sangue por gravidade na Bolsa Fonte LOVO. Esterilmente soldada uma das duas
365 / 509 linhas de fonte do filtro na bolsa de colheita de “Suspensão de TILs agrupados”. Logo que a solda foi completada, vedada com calor a linha não usada no filtro para removê-la. Abertos todos os clampes necessários e elevar a suspensão de TILs pendurando a bolsa de colheita em uma haste de suporte IV para iniciar a transferência, por gravidade, de TILs através do filtro de sangue e para dentro da Bolsa Fonte LOVO. Suavemente girada ou amassada a bolsa de Suspensão de TILs enquanto se drenava com o propósito de manter os TILs em suspensão uniforme.
[00755] Fechados todos os clampes. Logo que todos os TILs foram transferidos para bolsa fonte LOVO, fechados todos os clampes.
[00756] Vedado com calor. Vedado com calor (conforme Nota 5.12 de Processo) o mais próximo possível da solda para remover o filtro de sangue por gravidade.
[00757] Removidas as Amostras para Contagens de Células. Na BSC, usando seringas de 3mL separadas para cada amostra, removidas 4 amostras de 1,0 mL para contagem de células da bolsa fonte LOVO usando a porta de injeção sem agulha. Posicionadas as amostras nos criofrascos preparados na Etapa 8.11.36.
[00758] Realizadas as Contagens de Células. Realizadas as contagens de células e realizados os cálculos utilizando NC-200. Diluídas as amostras para contagem de células inicialmente pela adição de 0,5mL de suspensão de células a 4,5mL de meio AIM-V® preparado acima. Isto forneceu uma diluição de 1:10.
[00759] Registrada a Contagem de Células e registrado os Volumes das Amostras. Calculadas as Células TIL Viáveis. Se Células Viáveis Totais ≥ 1,5×109 células, prosseguido. Calcular as Células Nucleadas Totais.
[00760] Preparado o Diluente para Micoplasma. Na BSC, removidos 10,0mL de uma bolsa de sobrenadante bia uma porta Luer de amostra e adicionados a um tubo cônico de 15mL. Rotular o tubo cônico de 15mL com
366 / 509 “Diluente para Micoplasma”.
LOVO
[00761] Ligar o LOVO e iniciado o protocolo “TIL G-Rex Harvest” e seguidos os prompts na tela. Tipo de tampão foi PlasmaLyte. Seguidos os prompts da tela de toque LOVO.
[00762] Determinado o volume alvo de produto final. Usando o valor de células nucleadas totais (TNC, Total Nucleated Cells) e a tabela abaixo, determinado o volume alvo de produto final e registrado (mL). TABELA 40: Calcular o volume de produto final Faixa Numérica de Células (Cell Range) Volume Alvo de Produto Final (Retentado) (mL) 0 < Células Totais (Viáveis + Mortas) ≤ 7,1 ×1010 165 7,1×1010 < Células Totais (Viáveis + Mortas) ≤ 1,1×1011 215 1,1×1011 < Células Totais (Viáveis + Mortas) ≤ 1,5×1011 265
[00763] Seguidos os prompts da tela de toque LOVO.
[00764] Carregado o kit descartável. Antes de carregar o kit descartável, esfregar a porta de sensor de pressão com um lenço de álcool seguido por um pano isento de felpas. Carregado o kit descartável. Seguir as orientações na tela sobre o carregamento do kit descartável.
[00765] Removida a bolsa de filtrado. Quando o kit descartável LOVO padrão havia sido carregado, tocada a tecla “Next” (Avançar). Mostradas “Container Information” (Informação do Recipiente) e “Location Screen” (Tela de Localização). Removida a bolsa de filtrado da balança.
[00766] Garantido que o recipiente de Filtrado era Novo e “Off-Scale” (Fora de Escala).
[00767] Inserida a Capacidade de Filtrado. Esterilmente soldada uma Bolsa Ancilar LOVO na linha de Luer macho da Bolsa de Filtrado existente. Garantido que todos os clampes estão abertos e a passagem de fluido está limpa. Tocar o campo de inserção de “Filtrate Container Capacity” (Capacidade de Recipiente de Filtrado). É mostrado um teclado numérico. Inserir a nova capacidade total de Filtrado (5.000mL). Tocar a tecla para
367 / 509 aceitar a inserção. NOTA: Volume de Filtrado estimado não deve ultrapassar
5.000mL.
[00768] Posicionado o recipiente de Filtrado sobre a bancada. NOTA: Se a tubulação foi removida do clampe F durante a soldagem, posicionada a tubulação de volta no clampe. Posicionado o novo recipiente de Filtrado sobre a bancada. NÃO POSICIONADA a bolsa de Filtrado sobre a balança de pesagem nº 3. A balança de pesagem nº 3 estará vazia durante o procedimento.
[00769] Seguidos os prompts da tela de toque de LOVO após as alterações no recipiente de filtrado.
[00770] Garantido que o kit foi apropriadamente carregado. “Overlay” (sobreposição) de “Disposable Kit Dry Checks” (Checagens de Secagem de Kit Descartável) é mostrada. Checados se o kit foi apropriadamente carregado e todos os clampes estavam abertos. Checada toda tubulação para torções ou outras obstruções e corrigir se possível. Garantido que o kit foi apropriadamente instalado e checar todos os clampes de Robert. Pressionado a tecla “Yes” (Sim). Todos os clampes mecânicos de LOVO fechados automaticamente e a tela “Checking Disposable Kit Installation” é mostrada. O LOVO passou por uma série de etapas de pressurização para checar o kit.
[00771] Resultados de Checagem de Kit. Se a Checagem de Kit foi aprovada, prosseguido para a etapa seguinte. *Se Não, uma segunda Checagem de Kit pôde ser realizada após as checagens terem sido completadas. *Se Não, Checada toda a tubulação para torções ou outros tipos de obstruções e corrigir. *Se Não, Garantido que kit foi apropriadamente instalado e checados todos os clampes de Robert. Se a 2ª checagem de kit foi reprovada: Entrar em contato com o gerente da área e preparar a instalação de novo kit na Seção 10.0. Repetir as Etapa 8.13.23-Etapa 8.13.30 necessárias.
[00772] Acoplado PlasmaLyte. A tela “Connect Solutions” é mostrada. O valor de lavagem sempre seria 3.000mL. Inserido este valor na tela.
368 / 509
[00773] Esterilmente soldada a bolsa de 3.000mL de PlasmaLyte na tubulação que passa através do Clampe 1. Pendurada a bolsa de PlasmaLyte em uma haste de suporte IV colocando ambas as alças do canto da bolsa no gancho.
[00774] Verificado se o PlasmaLyte foi acoplado. Abertos quaisquer clampes de plástico. Verificado se a inserção de “Solution Volume” (Volume de Solução” foi de 3.000mL. Tocada a tecla “Next” (Avançar). A “Overlay” (sobreposição) de “Disposable Kit Prime” é mostrada. Verificado se o PlasmaLyte foi acoplado e quaisquer soldas e clampes de plástico na tubulação que conduzem para a bolsa de PlasmaLyte estavam abertos, então tocada a tecla “Yes” (Sim).
[00775] Observado se o PlasmaLyte está movendo. Iniciar “Disposable Kit Prime” e a Tela “Priming Disposable Kit Screen” é mostrada. Visualmente observado se o PlasmaLyte está se movendo através da tubulação conectada à bolsa de PlasmaLyte. Se fluido não estiver se movendo, pressionada a Tecla “Pause” (Pausa) sobre a tela e determinado se um clampe ou uma solda ainda estava fechado(a). Logo que o problema é resolvido, pressionar a tecla “Resume” (Continuar) sobre a tela para continuar o “Disposable Kit Prime”. Seguidos os prompts da tela de toque de LOVO.
[00776] Acoplado o recipiente Fonte à tubulação. Esterilmente soldada a Bolsa Fonte LOVO preparada na Etapa 8.12.31 à tubulação que passa através do Clampe S conforme a Nota 5.11 de Processo. Poderia ser necessário remover a tubulação do clampe. Nota: Certifique-se de reposicionar a tubulação fonte para dentro do clampe S se removida.
[00777] Pendurada a bolsa Fonte. Pendurada a bolsa Fonte na haste de suporte IV colocando ambas as alças do canto da bolsa no gancho. NÃO COLOCADA a bolsa fonte sobre a balança de pesagem nº 1. Abertos todos os clampes para a bolsa fonte.
[00778] Verificado se a bolsa fonte estava acoplada. Tocada a tecla
369 / 509 “Next” (Avançar). A “Overlay” (sobreposição) de “Source Prime” (Imprimação da Fonte) é mostrada. Verificado se a bolsa Fonte estava acoplada ao kit descartável, e se quaisquer soldas e clampes de plástico na tubulação que conduz para a bolsa Fonte estavam abertos. Tocada a tecla “Yes” (Sim).
[00779] Confirmado se PlasmaLyte estava se movendo. “Source Prime” (Imprimação da Fonte) iniciada e tela “Priming Source Screen” (Tela Imprimação da Fonte) mostrada. Visualmente observado se o PlasmaLyte está se movendo através da tubulação acoplada à bolsa Fonte. Se fluido não estiver se movendo, pressionar a Tecla “Pause” (Pausa) sobre a tela e determinar se um clampe ou uma solda ainda está fechado(a). Logo que o problema foi solucionado, pressionada a tecla “Resume” (Continuar) sobre a tela para continuar a “Source Prime” (Imprimação da Fonte).
[00780] Iniciada a “Procedure Screen” (Tela de Procedimento). Quando a “Source Prime” (Imprimação da Fonte) termina com sucesso, a “Start Procedure Screen” (Tela de Iniciar Procedimento) é mostrada. Pressionado “Start” (Iniciar), a tela de pausa do “Pre-Wash Cycle 1” (Ciclo de Pré-Lavagem 1) aparece imediatamente após pressionar iniciar.
[00781] Invertida “In Process Bag” (Bolsa Em Processo). Removida a “In Process Bag” (Bolsa em Processo) da balança de pesagem nº 2 (pode também remover a tubulação da guia de tubulação da “In Process top port” (porta superior Em Processo) e manualmente invertê-la para permitir que o tampão de lavagem adicionado durante a etapa “Disposable Kit Prime” (Imprimação do Kit Descartável) revista todas as superfícies internas da bolsa. Reposicionar a “In Process Bag” (Bolsa Em Processo) sobre a balança de pesagem nº 2 (o rótulo sobre a bolsa estava faceando para a esquerda). Reposicionar a tubulação de porta superior no guia de tubulação, se ela foi removida.
[00782] Invertida a Bolsa Fonte. Antes de pressionar a tecla “Start”
370 / 509 (Iniciar), misturada a bolsa Fonte sem removê-la da haste de suporte IV por massagem dos cantos da bolsa e agitação suave das células para criar uma suspensão de células homogênea. Pressionada a tecla “Resume” (Continuar). O LOVO iniciou o processamento do fluido da bolsa Fonte e a Tela “Wash Cycle 1” (Ciclo de Lavagem 1) é mostrada.
[00783] Pausa do Enxágue da Bolsa Fonte. A tela “Rinse Source Pause” (Pausa do Enxágue da Bolsa Fonte) é mostrada logo que a bolsa fonte foi drenada e o LOVO havia adicionado tampão de lavagem à bolsa Fonte. Sem remover a bolsa Fonte da haste de suporte IV, massageados os cantos da bolsa e bem misturado. Pressionado “Resume” (Continuar).
[00784] Pausa de “Mixed In Process Bag” (Misturada Bolsa Em Processo). Para preparar as células para outra passagem através do módulo de membrana rotativa (spinner), a “In Process Bag” (Bolsa Em Processo) foi diluída com tampão de lavagem. Após adição do tampão de lavagem à “In Process Bag” (Bolsa Em Processo), o LOVO pausa automaticamente e mostra a Tela de Pausa “Mix In Process Bag” (Misturar Bolsa Em Processo). Sem remoção da bolsa da balança de pesagem, misturado bem o produto por espremedura suave da bolsa. Pressionar “Resume” (Continuar).
[00785] Pausa de Massageados os Cantos da Bolsa Em processo (“In Process Corners Pause”). Quando a “In Process Bag” (Bolsa Em Processo) estava vazia, o tampão de lavagem foi adicionado à porta inferior da “In Process Bag” (Bolsa Em Processo) para enxaguar a bolsa. Após a adição do fluido de enxágue, o LOVO pausou automaticamente e mostrou a Tela de Pausa “Massage IP corners”. Quando a Tela de Pausa “Massage IP corners” é mostrada, NÃO REMOVER a bolsa da balança de pesagem nº 2, massagear os cantos da bolsa para colocar quaisquer células residuais em suspensão. Garantido que a bolsa não estava oscilando sobre a balança de pesagem e pressionada a tecla “Resume” (Continuar).
[00786] Esperado pela Tela “Remove Products” (Remover Produtos).
371 / 509 No término do procedimento LOVO, é mostrada a Tela “Remove Products” (Remover Produtos). Quando esta Tela é mostrada, todas as bolsas no kit LOVO puderam ser manipuladas. Nota: Não tocar em quaisquer bolsas até que seja mostrada a tela “Remove Products” (Remover Produtos).
[00787] Removida a bolsa de retentado. Posicionado um hemostato na tubulação muito próxima à porta da Bolsa de Retentado para evitar que a suspensão de células se sedimente para dentro da tubulação. Vedado com calor (conforme Nota 5.12 de Processo) abaixo do hemostato, certificando-se para manter linha suficiente para soldar na Etapa 8.13.48. Removida a bolsa de retentado.
[00788] Preparada bolsa de retentado para formulação. Soldada a extremidade de Luer-lock fêmea de um conjunto de transferência de plasma de 4 in (10 cm) na bolsa de retentado. Transferida a bolsa de retentado.
[00789] Removido os Produtos. Seguidas as instruções na Tela “Remove Produtcts” (Remover Produtos). Fechados todos os clampes no kit LOVO kit para prevenir movimentação de fluido.
[00790] Removidos Produtos. Tocada a tecla “Next” (Avançar). Todos os clampes mecânicos de LOVO são abertos e a Tela “Remove Kit” (Remover Kit” é mostrada.
[00791] Gravados os Dados. Seguidas as instruções na tela “Remove Kit” (Remover Kit). Tocada a tecla “Next” (Avançar). Todos os clampes mecânicos do LOVO fecham-se e é mostrada a Tela “Results Summary” (Sumário dos Resultados). Gravados os dados da tela de sumário dos resultados. Desligadas todas as bombas e o suporte de filtro. Removido o kit quando solicitado pelo LOVO. Todas as Horas foram registradas diretamente do LOVO. Formulação Final e Enchimento
[00792] Cálculo de volume alvo/bolsa. A partir da tabela DDD abaixo, selecionado o número de bolsas CS750 a serem enchidas, o volume de
372 / 509 enchimento alvo por bolsa, o volume removido para retenção por bolsa, e o volume alvo final por bolsa que corresponde ao Volume de Retentado LOVO de acima. TABELA 41: Cálculo de volume alvo/bolsa Volume de Volume de Volume Final Número de Volume de Volume Volume Produto CS10 a ser Predito de bolsas a Enchimento removido Alvo Final LOVO Adicionado ao Produto serem Alvo por Bolsa para por Bolsa Produto Formulado enchidas retenção por bolsa 165mL 165mL 330mL 3 107mL 7mL 100mL 215mL 215mL 430mL 4 105mL 5mL 100mL 265mL 265mL 530mL 4 130mL 5mL 125mL
[00793] Preparado Branco de CRF. Calculado o volume de CS-10 e de tampão de lavagem LOVO para formular a bolsa em branco. TABELA 42: Volumes calculados. Volume Alvo Final por Bolsa Volume de Tampão de Volume de CS-10 em A Lavagem LOVO em Branco Branco (mL) B=A/2 C=B mL mL mL
[00794] Preparada “CRF Blank” (Bolsa em Branco para CRF). Fora da BSC, usando a seringa de Tampão de Lavagem LOVO preparada acima, adicionado o volume calculado a uma bolsa CS750 vazia via a conexão Luer. Nota: A formulação de bolsa CS750 em branco não precisa ser preparada assepticamente. Usando uma seringa de tamanho apropriado, adicionado o volume de CS-10 calculado para a mesma bolsa CS750 preparada acima. Colocada uma tampa vermelha na bolsa CS750. Removido o máximo de ar possível da bolsa CS-750. Vedada com calor a bolsa CS750 o mais próximo possível da bolsa, removendo a tubulação. Rotular a bolsa CS750 com “CRF Blank” (Bolsa em Branco para CFR), número do lote, e data de início. Posicionada a “CRF Blank” (Bolsa em Branco para CRF) sobre bolsas frias até que seja colocada dentro do CRF.
[00795] Calculado o volume requerido de IL-2. Calculado o volume de IL-2 a adicionar ao Produto Final. TABELA 43: Volume de IL-2 calculado Parâmetro Fórmula Resultado Volume de Retentado Final Etapa 8.13.51 A. mL Volume Formulado Final B=Ax2 B. mL
373 / 509 Concentração Final de IL-2 desejada (UI/mL) 300 UI/mL C. 300 UI/mL UI de IL-2 Requerida D=BxC D. UI Solução de Estoque de Trabalho de IL-2 da 6×104 UI/mL E. 6×104 UI/mL Etapa 8.11.33 Volume de IL-2 a Adicionar ao Produto Final F=D÷E F. mL
[00796] Montado o aparelho de conexão. Esterilmente soldado um 4S- 4M60 a uma Conexão de Célula CC2 substituindo uma ponta perfurante (spike) única do aparelho de Conexão de Célula pela extremidade de 4 pontas perfurantes (spikes) do manifolde 4S-4M60.
[00797] Montado o aparelho conectado. Esterilmente soldadas as Criobolsas CS750 no cabo de ligações preparado acima, substituindo uma das quatro extremidades Luer macho (E) por cada bolsa. Soldadas (conforme a Nota 5.11 de Processo) bolsas CS-10 nas pontas perfurantes (spikes) do 4S- 4M60. Mantidas frias as bolsas CS-10 pelo posicionamento das bolsas entre duas bolsas frias condicionadas a 2-8°C.
[00798] Preparado TIL com IL-2. Usando uma seringa de tamanho apropriado, removida quantidade de IL-2, determinada acima, da alíquota de “IL-2 6×104”. Conectar a seringa à bolsa de retentado preparada acima via a conexão Luer e injetar IL-2. Limpar a linha pelo jorro de ar da seringa através da linha.
[00799] Rotulada a Bolsa de TILs Formulados. Fechado o clampe no conjunto de transferência e rotular a bolsa como “TILs Formulados” e remover a bolsa da BSC.
[00800] Adicionada a bolsa de TILs Formulados ao aparelho. Logo que IL-2 foi adicionada, soldada a bolsa de “TILs Formulados” na ponta perfurante (spike) restante no aparelho.
[00801] Adicionado CS10. Transferido o aparelho montado com a bolsa de TILs Formulados, CS-750, e CS-10 para dentro da BSC. NOTA: A bolsa CS-10 e todas as bolsas CS-750 não foram posicionadas entre duas bolsas frias pré-condicionadas a 2°C-8°C. Não foi posicionada a bolsa de TILs Formulados sobre bolsas frias. Garantido que todos os clampes estavam fechados no aparelho. Girada a torneira de modo que a seringa fosse fechada.
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[00802] Trocadas Seringas. Aspirar ~10mL de ar para dentro de uma seringa de 100mL e substituída a seringa de 60mL no aparelho.
[00803] Adicionado CS10. Girada a torneira de modo que a linha para as bolsas CS750 seja fechada. Abertos os clampes para as bolsas CS-10 e empurrado o volume, calculado acima, para dentro da seringa. NOTA: Múltiplas seringas serão usadas para adicionar o volume apropriado de CS-
10. Fechados os clampes para CS-10 e abertos os clampes para a bolsa de TILs Formulados e adicionado o CS-10. Adicionar primeiro 10,0mL de CS10 a aproximadamente 10,0mL/minuto. Adicionar o CS-10 restante à vazão aproximada de 1,0mL/s. Nota: Múltiplas seringas foram usadas para adicionar o volume apropriado de CS-10. Registrado o tempo. NOTA: O tempo alvo desde a primeira adição de CS-10 para início do congelamento é de 30 minutos. Registrado o volume de cada adição de CS10 e o volume total adicionado. Fechados todos os clampes para as bolsas CS10.
[00804] Preparadas bolsas CS-750. Girada a torneira de modo que a seringa fosse aberta. Abertos os clampes para a bolsa de TILs Formulados e aspirada suspensão parando exatamente antes de a suspensão alcançar a torneira. Fechados os clampes para a bolsa de TILs Formulados. Girada a torneira de modo que ela fosse aberta para as bolsas de produto final CS750 vazias. Usando uma seringa nova, removido o máximo de ar possível das bolsas de produto final CS750 por extração do ar para fora. Enquanto se mantém a pressão sobre o êmbolo da seringa, as bolsas são fechadas com clampes. Aspirar ~20mL de ar para dentro de seringa nova de 100mL e conectar ao aparelho. NOTA: Cada bolsa de produto final CS-750 deve estar entre duas bolsas frias para manter fria a suspensão de TILs formulada.
[00805] Dispensadas as células. Girada a torneira de modo que a linha para as bolsas de produto final fosse. Empurrado o volume, calculado acima, da bolsa de TILs Formulados para dentro da seringa. NOTA: Múltiplas seringas puderam ser usadas para obter o volume correto. Girada a torneira de
375 / 509 modo que a linha para a bolsa de TILs Formulados fosse fechada. Trabalhar com uma bolsa de produto final de cada vez, dispensar as células para dentro de uma bolsa de produto final. Registrado o volume de células adicionado a cada bolsa CS750 acima. Limpada a linha com ar da seringa de modo que células estejam niveladas com o topo da porta da ponta perfurante (spike). Fechado o clampe na bolsa cheia. Repetidas as etapas para cada bolsa de produto final, misturando suavemente a bolsa de TILs Formuladas entre cada etapa. Registrado o volume de TIL adicionado a cada bolsa de produto final abaixo.
[00806] Removido ar das bolsas de produto final e retido. Logo que a última bolsa de produto final foi cheia, fechados todos os clampes. Aspirados 10mL de ar para dentro de uma seringa nova de 100mL e substituir a seringa no aparelho. Manipulando uma bolsa única de cada vez, aspirar todo o ar de cada bolsa de produto final mais o volume de produto para retenção determinado acima. NOTA: Após a remoção do volume de amostra, invertida a seringa e usado o ar para limpar a linha para a porta superior da bolsa de produto. Fechada com clampe a linha para a bolsa logo que o volume retido e o ar foram removidos.
[00807] Registrado o volume de retenção removido de cada bolsa.
[00808] Dispensado Volume de Retenção. Dispensado o volume de retenção para dentro de um tubo cônico de 50mL e rotular o tubo como “Retenção” e número do lote. Repetir para cada bolsa.
[00809] Preparado o produto final para criopreservação. Como um hemostato, fechadas com clampes as linhas próximas às bolsas. Removidas a resinga e a conexão Luer de tampa vermelha no aparelho no qual estava a seringa. Retirado o aparelho da BSC. Vedado com calor (conforme Nota 5.12 de Processo) em F, removendo a bolsa de retentado vazia e as bolsas CS-10. NOTA: Retida a conexão Luer para seringa no aparelho. Descartadas as Bolsas de retentado e CS-10 vazias.
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[00810] Rotuladas as bolsas de produto final. Fixado rótulo em produto final de amostra abaixo.
[00811] Preparado produto final para criopreservação. Mantidas as criobolsas sobre bolsa fria ou a 2-8°C até a criopreservação.
[00812] Removida a Amostra para Contagem de Células. Usando uma pipeta de tamanho apropriado, remover 2,0mL de volume de retenção removido acima e adicionados a um tubo cônico de 15mL a ser usado para contagens de células.
[00813] Realizadas Contagens de Células. Realizadas as contagens de células e realizados os cálculos utilizando o NC-200. NOTA: Diluída apenas uma amostra para a diluição apropriada para verificar se a diluição é suficiente. Diluídas amostras adicionais para o fator de diluição apropriado e prosseguido com as contagens. Registrados os volumes de Amostras para Contagens de Células. NOTA: Se diluição não é necessária, “Amostra [µL]” = 200, “Diluição [µL]”=0. Determinada a Média de Concentração de Células Viáveis e de Viabilidade de Células das contagens de células realizadas.
[00814] Calculada Amostra para Citometria de Fluxo. Realizado o cálculo para garantir concentração de células suficiente para amostragem para citometria de fluxo. TABELA 44: Cálculo de concentração de células para citometria de fluxo Concentração de Células Volume Alvo Requerido para 6×107 É B ≤ 1,0mL? (Sim/Não**) Viáveis TVC A B = 6×107 células/A mL
[00815] Calculado IFN-γ. Cálculo de amostra realizado para garantir concentração de células suficiente para amostragem de IFN-γ.
[00816] Vedado com calor. Logo que os volumes de amostra haviam sido determinados, vedadas com calor as Bolsas de Produto Final o mais próximo possível das bolsas para remover do aparelho. TABELA 745: Colheita e rotulagem de amostras
377 / 509 Amostra Número de Volume de Amostra a Tipo de Recipiente Recipientes ser Adicionado a Cada Recipiente *Micoplasma 1 1,0mL Tubo Cônico de 15mL Endotoxina 2 1,0mL Criofrasco de 2mL Cepa Gram 1 1,0mL Criofrasco de 2mL IFN-γ 1 1,0mL Criofrasco de 2mL Citometria de Fluxo 1 1,0mL Criofrasco de 2mL **Esterilidade Bac-T 2 1,0mL Frasco Bac-T Retenção QC 4 1,0mL Criofrasco de 2mL Frascos Satélites 10 0,5mL Criofrasco de 2mL
[00817] Para a amostra de Micoplasma, adicionado o volume de suspensão de células formuladas ao tubo cônico de 15mL rotulado “Diluente para Micoplasma” acima. Esterilidade & BacT. Amostragem-Teste. Na BSC, remover uma amostra de 1,0mL da suspensão de células retida colhida acima usando uma seringa de tamanho adequado e inocular o frasco anaeróbico. Repetir a etapa acima para o frasco aeróbico.
[00818] Rotuladas e armazenadas as amostras. Rotuladas todas as amostras com os rótulos de inventário de plano de amostra e armazenar apropriadamente até transferência. Prosseguido para as etapas seguintes para criopreservação de produto final e amostras. Criopreservação de Produto Final
[00819] Preparado o Congelador com Velocidade de Congelamento Controlada (Controlled Rate Freezer, VFR). Verificado se o CRF havia sido configurado antes do congelamento. Registrado o Equipamento CRF. Criopreservação é realizada.
[00820] Configuradas as sondas de CRF. Perfurado o septo da bolsa em branco para CRF. Inserida sonda de temperatura em frasco de 6mL.
[00821] Posicionado o produto final e as amostras em CRF. Posicionada a bolsa em branco dentro de cassete pré-condicionado e transferido para dentro do centro aproximado do rack do CRF. Transferidos os cassetes de produto final para dentro do rack do CRF e os frascos para dentro do rack de frascos do CRF. Transferidos os racks de produto e os racks de frascos para dentro do CRF. Registrada a hora que o produto é
378 / 509 transferido para dentro do CRF e a temperatura da câmara.
[00822] Determinado o tempo necessário para alcançar 4°C±1,5°C e prosseguida com a operação do CRF. Logo que a temperatura da câmara alcançou 4°C±1,5°C, iniciada a operação. Registrada a hora.
[00823] Completado e Armazenado. Desligado o CRF após a completitude da operação. Remover os cassetes e os frascos do CRF. Transferidos os cassetes e frascos para LN2 em fase vapor para armazenamento. EXEMPLO 17: GERAÇÃO DE PRODUTOS DE TIL ENRIQUECIDOS EM CÉLULAS-T ESPECÍFICAS PARA ANTÍGENOS DE TUMOR
COM ATIVIDADE TERAPÊUTICA INTENSIFICADA
[00824] Objetivo: Gerar produtos de TIL enriquecidos em células-T específicas para antígenos de tumor com atividade terapêutica intensificada. Fundamentos:
[00825] Células-T associadas às lesões malignas são tipicamente disfuncionais e falham em controlar/prevenir o crescimento de tumor (Schietinger et al. Immunity 2016). Todas as referências neste exemplo são incorporadas em suas totalidades como referências para todos os propósitos.
[00826] Os linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) podem ser extraídos, ativados, e propagados ex vivo e induzem uma resposta antitumoral eficaz após reinfusão in vivo (Rosenberg et al. Clin. Cancer Res. 2011). A abordagem de transferência adotiva de células-T, primeiro demonstrada em pacientes sofrendo de melanoma metastásico, está sendo testada em histologias de tumores sólidos adicionais. A atividade clínica de terapia com TIL em melanoma, e câncer de cabeça e pescoço e câncer cervical tem sido relatada (SITC, 2017). Dessa forma, TILs específicos para tumor podem ser resgatados do microambiente tumoral inibitório e recondicionados e/ou amplificados para números suficientes para eficazmente se direcionarem para o tumor alvo.
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[00827] Análises retrospectivas de testes clínicos com TIL sugerem que células-T reativas a tumor menos diferenciadas com capacidades proliferativa e sobrevivente robustas conferem superior eficácia antitumoral relativas às células-T efetoras e células-T efetoras de memória e que as novas gerações de produtos de TIL devem consistentemente compreender teores elevados de células-T menos diferenciadas (Klebanoff et al. J. Immunother. 2012).
[00828] As células-tronco-T de memória (TSCM) são progenitoras iniciais de células-T de memória central antígeno-experientes; elas apresentam as capacidades de sobrevida de longa duração, autorrenovação, e multipotência que definem as células-tronco; e são, dessa forma, consideradas as mais desejáveis para a geração de produtos de TIL eficazes. TSCMs têm mostrado atividade antitumoral intensificada com outros subconjuntos de células-T em modelos em camundongo de transferência adotiva de células (Gattinoni et al. Nat. Med. 2009, 2011; Gattinoni, Nature Rev. Cancer, 2012; Cieri et al. Blood 2013).
[00829] Estratégias que desviam a composições de TIL para uma proporção alta de TSCM são necessárias para garantir ótima atividade antitumoral.
[00830] Rejuvenescimento de células-T antígeno-experientes foi alcançado usando ferramentas de reprogramação desenvolvidas mediante tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) (Nishimura et al. Cell Stem Cell 2012; Vizcardo et al. Cell Stem Cell 2012). Esta abordagem requer diferenciação ex vivo adicional das iPSCs para população(ões) de células-T melhor adaptada(s) para combater o tumor, tornando-a um processo demorado de 2 etapas propenso a se restringir ao repertório de receptores de células-T (TCR) originais. Consulte também, Stewart, et al. 538:183-192 (2016) relacionado às estratégias de distribuição in vitro e in vivo para distribuição intracelular de materiais.
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[00831] Tem sido mostrado que as vias de sinalização incluindo Wnt, NOTCH, e Myb comprovam a geração de células do tipo TSCM diretamente de células-T naïve e/ou antígeno-experientes (Gattinoni et al. Nat. Med. 2009, Kondo et al. Nat. Comm. 2017, Gautam et al. SITC 2017).
[00832] A reprogramação de morte celular requer exposição transiente aos fatores de transcrição (TFs) apropriados. No caso dos TILs, esta exposição precisa direcionar uma grande fração de células-T para preservar o repertório de TCR derivado de tumor.
[00833] A plataforma microfluídica isenta de vetor SQZ representa uma estratégia de distribuição intracelular avançada; ela tem demonstrado a capacidade para distribuir proteínas, incluindo fatores de transcrição, para uma variedade de células humanas primárias, incluindo células-T (Sharei et al. PNAS 2013, e também Sharei et al. PLOS ONE 2015 e Greisbeck et al. The J. of Immunology vol. 195, 2015). Consulte também, Publicações de Patente Internacionais WO 2013/059343A1, WO 2017/008063A1, e WO 2017/123663A1, todas as quais são aqui incorporadas em suas totalidades como referências. Tais métodos, conforme descritos em Publicações de Patente Internacionais WO 2013/059343A1, WO 2017/008063A1, e WO 2017/123663A1, podem ser utilizados com a presente invenção com o propósito de expor uma população de TILs aos fatores de transcrição (TFs) e/ou a outras moléculas capazes de induzir expressão transiente de proteína, em que os TFs e/ou as outras moléculas capazes de induzir expressão transiente de proteína proveem expressão aumentada de antígenos de tumor e/ou um aumento no número de células-T específicas para antígenos de tumor na população de TILs, resultando, dessa forma, em reprogramação da população de TIL e um aumento em eficácia terapêutica da população de TILs reprogramados em comparação com uma população de TILs não reprogramados. ESTRATÉGIA:
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[00834] É proposto o uso da tecnologia de distribuição de proteína TF intracelular SQZ para comparar a capacidade de várias estratégias de reprogramação para gerar produtos de TIL enriquecidos em células-T específicas para antígenos de tumor com atividade terapêutica intensificada.
[00835] Plano de trabalho para incluir os seguintes pontos/as seguintes questões:
1. Tipo(s) de Tumor Melanoma
2. Condições de distribuição ótimas Protocolo otimizado para célula-T humana SQZ + condições adicionais Monitorar eficiência de distribuição
3. Escolha de TFs TCF-1 NOTCH1/2 ICD MYB +/- prévio coquetel de iPSC para reprogramação ‘máxima’?
4. Estágio de ativação/expansão no qual tem-se como alvos os TILs REP Dia 0 Outros?
5. Cinética de reprogramação Dias 7, 11, 14, 18…
6. Subconjunto(s) de TILs como alvos em massa inicialmente Separados subconjuntos individuais (TCM, TEM, TEFF, TEMRA) para serem comparados mais tarde.
7. Fatores adicionais necessários em meio de cultura
382 / 509 IL7 RSPO3/WNT3A Outros?
8. Leituras Fenotipificação estendida de pre-REP TIL e post-REP TIL com painéis 1, 2, e 3 (modificados?) Avaliações de função efetora de Post-REP TIL (ensaios de produção de marcador de ativação e/ou citocina) Avaliações de atividade tumoral de post-REP TIL (ensaios de cocultura de células tumorais autólogas) Análises de repertório de TCR (citometria de fluxo e/ou RNA-seq) Ensaio metabólico de células vivas como Seahorse • Considerações Adicionais
1. Produção de Proteína TF
2. Aprovisionamento de Tumores
3. Logística (expedições de células) Tabela 46: Processo Tarefas ● Optimização de condições de distribuição de proteína para TILs: ● Amostras de melanoma pre-REP congeladas armazenadas serão usadas para triar condições ● Reagente de teste distribuído será…… ● Condições incluirão…….. ● Leitura será……. ● Condições selecionadas serão confirmadas em 2-3 pre-REPs novos Produção de proteína TF: ● Um vendedor será identificado e contrato será estabelecido para a produção de materiais suficientes para 10 experimentos em escala de mini-REP ● ~7 Proteínas TF selecionadas serão preparadas em nível de pureza requerido
383 / 509 Experimentos de reprogramação: ● Será usado um mínimo de 6 amostras de pre-REP congeladas e/ou frescas para as quais está disponível uma linhagem de tumor autóloga ● As seguintes combinações de TF serão distribuídas, usando protocolo otimizado de SQZ ● coquetel de iPSC ● TCF-1 ● NOTCH1/2 ICD ● MYB ● iPSCs serão confirmadas e rediferenciação será tentada usando qualquer uma das condições publicadas e/ou distribuição SQZ dos TFs acima ● Reprogramação de TIL será monitorada ao longo do tempo, usando citometria de fluxo ● Mini-REPs serão configurados para cada condição durante 11 dias, usando adjuvantes potenciais para o meio de cultura Avaliações fenotípicas de post-REP TILs Avaliações funcionais de post-REP TILs EXEMPLO 18: PROCESSO DE CRIOPRESERVAÇÃO
[00836] Este exemplo descreve o método de processo de criopreservação para os TILs preparados com o procedimento abreviado, fechado descrito no Exemplo 16 usando o Congelador com Temperatura de Congelamento Controlada “CryoMed Controlled Rate Freezer, Model 7454” (Thermo Scientific).
[00837] O equipamento usado foi como segue: rack suportador de cassetes de alumínio (compatível com bolsas CS750 de congelador), cassetes para crioarmazenamento para bolsas de 750mL, tanque de nitrogênio líquido de baixa pressão (22 psi, 152 kPa), refrigerador, sensor de termopar (tipo fita para bolsas), e Bolsas para Congelamento “CryoStore CS750” (OriGen Scientific).
[00838] O processo de congelamento provê uma velocidade de esfriamento de 0,5°C a partir da nucleação até -20°C e 1°C por minuto até a temperatura final de -80°C. Os parâmetros de programação são como segue: Etapa 1 - esperar a 4°C; Etapa 2: 1,0°C/min (temperatura da amostra) para - 4°C; Etapa 3: 20,0°C/min (temperatura da câmara) até -45°C; Etapa 4: 10,0°C/min (temperatura da câmara) até -10,0°C; Etapa 5: 0,5°C/min (temperatura da câmara) até -20°C; e Etapa 6: 1,0°C/min (temperatura da amostra) até -80°C.
[00839] Uma representação do procedimento deste exemplo é provida juntamente com o processo do Exemplo 16.
384 / 509 EXEMPLO 19: PROCEDIMENTO PARA GERAÇÃO DE PRODUTOS DE TIL ENRIQUECIDOS EM CÉLULAS-T ESPECÍFICAS PARA
ANTÍGENOS DE TUMOR COM ATIVIDADE TERAPÊUTICA
INTENSIFICADA Fase 1a: Aprovisionamento de um sd-RNAfm validado para silenciamento eficaz e específico
[00840] A fase inicial envolverá o aprovisionamento de um sd-RNAfm validado para silenciamento eficaz e específico dos seguintes 3 genes: PD-1 (também conhecido como PDCD1), TIM3, e CBLB. Fase 1b: Identificação de sequência para o silenciamento potente de LAG3 e
CISH
[00841] Até 20 sd-RNAs serão desenhados para novos alvos. O silenciamento gênico será avaliado em células HeLa em alvos exógenos e em células-T primárias ativadas em alvos endógenos. Um a dois protótipo(s) será(ão) selecionado(s) por gene de interesse que reduz os níveis de expressão em mais que 80%, incluindo PD-1 e LAG-3. Serão geradas versões completamente modificadas do sd-RNA selecionado.
[00842] É suposto que serão gerados um a dois sd-RNAfm específicos para LAG3 e CISH. São preferidos RNAs reconhecedores de alvo (targeting RNAs) por genes alvos. Fase 2: Validação do silenciamento gênico mediado por sd-RNA em pre-REP TILs.
[00843] Até 6 linhagens de melanoma congeladas/outras linhagens pre- REP congeladas serão usadas para validar os alvos de sd-RNA (incluindo PD- 1, TIM3, CBLB, LAG3, e CISH). As condições testarão concentrações de sd- RNA, sincronização temporal (timing) após descongelamento, distribuição de repetições/sequências, e condições de cultura. Leitura será % de silenciamento gênico, conforme avaliada por citometria de fluxo e/ou qPCR. A influência da distribuição de RNA sobre o crescimento de TIL e a
385 / 509 persistência de silenciamento ao longo do tempo será avaliada pelos TILs expandidos.
[00844] É suposto que 80% de silenciamento 24 horas após colheita de REP será obtido com o(s) protótipo(s). O número de células totais estará dentro de 10% de controles não tratados. Fase 3: Implementação de silenciamento gênico mediado por sd-RNA para processo 2A.
[00845] O silenciamento gênico será otimizado em 3-6 preparações de TILs frescos em escala de pesquisa. As condições testarão as concentrações de sd-RNA, a sincronização temporal (timing), as distribuições de repetições/de sequências, e as condições de cultura. A leitura será % de silenciamento gênico em post-REP TILs, conforme avaliado por citometria de fluxo e/ou qPCR. A influência de silenciamento gênico sobre o fenótipo e a função de TIL será avaliada usando ensaios de citometria de fluxo. Experimentos de resgate opcionais e/ou análises de expressão gênica opcionais serão conduzidos(as) para verificar a especificidade dos efeitos (por exemplo, extensão e influência do silenciamento potencial em alvo diferente do previsto). Pelo menos 2 pares de alvo/sd-RNA serão selecionados para trabalho adicional. Os fenótipos de TIL serão então distinguidos. Atividade de TIL específica e não específica equivalente àquela ou mais alta que aquela dos TILs de controle será avaliada para determinar os ótimos alvos/sd-RNAs. Fase 4: Implementação de protocolo(s) de silenciamento otimizado(s) para preparação de TIL em escala máxima
[00846] Uma preparação de TIL em escala máxima será realizada por gene alvo. Os produtos de TIL com as características novas definidas na Fase 3 serão desenvolvidos adicionalmente àqueles requeridos para liberação. EXEMPLO 20: PREPARAÇÃO E USO DE SD-RNA
EXEMPLIFICADOR Desenho de sd-RNA
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[00847] Aproximadamente 2 a 20 sequências de sd-RNA serão geradas para um dado alvo. Em alguns casos, as sequências de sd-RNA serão selecionadas com base em um algoritmo de seleção (comercialmente disponível junto à Advirna LLC, Worcester, MA, EUA), planejado com base em uma triagem funcional de mais 500 sequências de sd-RNA. Análise de regressão será usada para estabelecer uma correlação entre a frequência de ocorrência de nucleotídeo específico e a modificação em qualquer posição específica no duplex de sd-RNA e sua funcionalidade em ensaio de supressão gênica. As sequências selecionadas serão sintetizadas comercialmente (por exemplo, pela TriLink Biotechnologies) em uma escala de 0,2-μmol e dissolvidas em água estéril para injeção isenta de RNase, isenta de DNase (comercialmente disponível junto à CalBiochem, 4.86505). Os dúplices podem ser anelados por aquecimento até 95°C durante 5 min e esfriamento gradual para a temperatura ambiente. Distribuição Direta de sd-RNA (Absorção Passiva)
[00848] Oligonucleotídeos, incluindo sd-RNA que tem como alvo genes aqui descritos, podem ser diluídos em meio isento de soro e dispensados em placa de cultura de 96 poços em triplicatas. As células podem ser semeadas em meio de cultura apropriado contento FBS reduzido na placa com compostos pré-diluídos durante o tempo indicado. As células HeLa podem ser transfectadas em meio EMEM com 3% de FBS a 10.000 células/poço. As células-T humanas primárias (AllCells, CA, EUA) podem ser cultivadas em meio completo AIM-V® (Gibco) contendo 500 UI/mL de IL2 (ProSpec). As células podem ser ativadas com anti-CD3/CD28 Dynabeads (Gibco, 11131) de acordo com as instruções do fabricante durante pelo menos 4 dias antes da transfecção. As células-T podem ser transfectadas em FBS 5% a 100.000 células/poço sem remoção das Dynabeads, a não ser que seja especificado de outro modo. Imagens fluorescentes podem ser obtidas das células vivas transfectadas com sd-RNA conjugado com Cy3
387 / 509 usando microscópio Olympus BX-60 com o propósito de confirmar a eficiência de transfecção. Coloração nuclear pode ser obtida pelo uso de Hoechst 33342 (Molecular Probes, H1398) adicionado às células transfectadas durante 30 minutos e as imagens processadas. Identificação de Composto de sd-RNA Prototípico
[00849] Protótipos descritos no Exemplo 18 podem ser identificados usando este protocolo. Plasmídeo repórter luciferase pode ser construído pela inserção de regiões reconhecedoras de PDCD1 em plasmídeo psiCheck2 (Promega, C8021) a jusante da sequência de luciferase de Renilla. Para comparação, uma sequência de MAP4K4 sd-RNA previamente validada pode ser inserida como um controle positivo.
[00850] Para a triagem, células HeLa podem ser transfectadas com o plasmídeo clonado usando Fugene HD (Promega, E2311) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células podem ser semeadas a 2,5 ×106 células/10 cm2 de placa 390 em meio EMEM (ATCC, 30-2003) sem antibióticos e transfectadas 6 horas mais tarde com o plasmídeo em razão de FuGENE:DNA de 2,5:1. As células podem ser incubadas durante 16-18 horas, lavadas 3 vezes com PBS, tripsinizadas e semeadas em placa de 96 poços com compostos de sd-RNA pré-diluídos à concentração final de 1 μM de sd-RNA/10.000 células/100 μL de EMEM com 3% de FBS. As células podem ser tratadas com sd-RNA durante 48 h para facilitar a absorção passiva de compostos, lisadas com tampão de lise Glo (Promega, E266A) e podem ser ensaiadas para expressão de luciferase de Renilla e de luciferase de Pirilampo. Para isto, alíquotas de 20 μL de cada lisado foram adicionadas a placas de 96 poços opacas em duplicata e misturadas com quer tampão de ensaio Matthews 59397 (para Luciferase de Renilla) quer com tampão de ensaio 398 para luciferase de Pirilampo (25 mM de glicilglicina, 15 mM de MgSO4, 4 mM de EGTA, 1 mM de DTT, 2 mM de ATP, 15 mM de K2PO4 399, pH 7,8 e 1 mM de D-Luciferina). Os substratos D-Luciferina (Promega, E1605) e h-
388 / 509 Coelenterazina (NanoLight, 301) foram adicionados imediatamente antes do uso. Luminescência pode ser medida em SpectraMax i3 (Molecular Devices), normalizada (Luciferase de Renilla/Luciferase de Pirilampo) e expressada como uma percentagem das células de controle não tratadas. Quantificação de mRNA por qPCR
[00851] RNA total pode ser isolado das células transfectadas usando o Kit de Purificação PureLink™ Pro96 (Invitrogen, 12173-011A) de acordo com as recomendações do fabricante. Diluições de células não transfectadas (NT) de 1:5 e 1:25 podem ser preparadas para uma geração de curva padrão. Expressão gênica foi analisada em uma qPCR 407 multiplex de uma etapa pela misturação de 20-40 ng de RNA purificado com Quanta qScript RT- qPCR ToughMix (VWR, 89236672) e sondas Taqman – PDCD1-FAM (Taqman, Hs015.50088_m1) e GAPDH-VIC (Applied Biosystems, 4326317E) na mesma reação. As amostras podem ser amplificadas usando os ajustes recomendados por Quanta em uma máquina StepOnePlus qPCR (Applied Biosystems). A expressão de PDCD1 pode ser normalizada para GAPDH, ajustada para a curva padrão e expressada como uma percentagem das células transfectadas de controle não direcionadas (NTC, Non-Targeting Control). Ensaio de Viabilidade de Células
[00852] Os TILs expandidos de acordo com a presente invenção podem ser transfectados com oligonucleotídeos de sd-RNA em várias doses durante 72 h. As células foram lavadas e incubadas com reagente CellTiter- Blue (Promega, G808A) diluído 1:10 durante 1 h a 37°C. As placas foram esfriadas para a temperatura ambiente, e a fluorescência foi registrada em excitação a 530 nm/emissão a 590 nm. Faixa linear pode ser confirmada pela colocação de 4 séries de diluições duplas de células nas mesmas condições e representação gráfica das leituras de fluorescência. Isolamento de Linfócitos Infiltrantes de Tumor
389 / 509
[00853] Linfócitos infiltrantes de tumor podem ser preparados conforme aqui descrito, por exemplo conforme descrito na Figura 8, e também na Figura 14. Expansão de TILs
[00854] Os TILs podem ser semeados em frascos conforme aqui descrito e qualquer uma de uma primeira etapa de expansão e/ou uma segunda etapa de expansão pode ser realizada. O sd-RNA pode ser adicionado durante a primeira expansão, por exemplo Etapa B, após a primeira expansão, por exemplo, durante a Etapa C, antes da ou durante a segunda expansão, por exemplo antes da ou durante a Etapa D, após a Etapa D e antes da colheita na Etapa E, durante e após a colheita na Etapa F, antes da ou durante a formulação final e/ou transferência para Bolsa de infusão na Etapa F, e também antes de qualquer etapa de criopreservação opcional na Etapa F. Além disso, o sd-RNA pode ser adicionado após o descongelamento de qualquer etapa de criopreservação na Etapa F. Ensaio de Incorporação de Timidina
[00855] Uma amostra de TIL pode ser colhida durante qualquer uma das etapas de expansão e semeada em triplicata em uma placa de 96 poços (104.443 células/poço) em meio CellGro suplementado com 2% de soro AB humano. Após 1 hora, 1 μCi/poço de [metil-3H]-timidina (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA) pode ser adicionado a cada poço e incubado durante quatro. As células podem ser então colhidas e a incorporação de 3H-timidina pode ser medida em um contador de cintilação em líquido Trilux 1450 microBeta (“Trilux 1450 microBeta Liquid Scintillation Counter”) (Wallac) para examinar o crescimento de TIL. Secreção de IFN-γ das Células Tratadas com sd-RNA
[00856] A produção de IFN-γ pelas células-T estimuladas pode ser medida no sobrenadante usando o Kit de Desenvolvimento ELISA para IFN-γ Humano (“Human IFN-γ ELISA Development Kit”) (Mabtech) de acordo
390 / 509 com as instruções do fabricante. Os TILs podem ser preparados conforme aqui provido e tratados com, por exemplo, 2 μM de sd-RNA durante um número de dias, em alguns casos quatro dias. Após este período, o sobrenadante pode ser coletado para análise ELISA para determinar os teores de produção de IFN- γ. Tratamento com TILs
[00857] Os TILs que têm sido tratados com sd-RNA podem ser utilizados, conforme aqui descrito, nos métodos para tratamento de pacientes com câncer. EXEMPLO 21: MÉTODOS DE ELETROPORAÇÃO
EXEMPLIFICADORES
[00858] Os TILs foram preparados de acordo com qualquer um dos métodos aqui descritos. Os seguintes métodos de transfecção serão testados: Lipofecção com Lipofectin™ e Lipofectamin™, eletroporação usando Bio- Rad Gene Pulser II™ ou aparelho BTX ECM 830™ com aplicação de pulso de ondas quadradas, eletroporação com aplicação de pulso de ondas exponencialmente decrescentes usando Eppendorf Multiporator™, e também Amaxa Nucleofector™. Todos os métodos serão inicialmente baseados nas recomendações dos fabricantes com modificações potenciais conforme a necessidade. O protocolo de nucleofecção de Amaxa pode produzir a eficiência mais alta de transfecção. O procedimento de Amaxa será otimizado usando combinações diferentes de uma das três soluções (V, R, e T) e 8 programas de eletroporação. Consulte, também os métodos descritos no Pedido de Patente Norte-Americana nº 2016/0230188 e na Patente Norte- Americana nº 8.859.229, ambos os quais são aqui incorporados em suas totalidades como referências. A eletroporação pode ser também realizada de acordo com os métodos descritos por Menger et al., Cancer Res., 2016 Apr 15; 76(8):2087-93, cuja descrição é aqui incorporada como referência, usando um Sistema Agile Pulse BTX™ (Harvard Apparatus). As células
391 / 509 eletroporadas podem ser expandidas por métodos de pre-REP e de REP descritos aqui alhures. Podem também ser usados os métodos de eletroporação conhecidos na técnica, como aqueles descritos em Patentes Norte-Americana nºs 6.010.613 e 6.078.490, cujas descrições são aqui incorporadas como referências. A otimização de eletroporação pulsada pode ser realizada utilizando os métodos descritos que usam os seguintes programas ou as seguintes modificações dos mesmos: Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Program Pulso V Duraçã Intervalo Pulso V Duraçã Intervalo Pulso V Duraçã Intervalo a s o (ms) (ms) s o (ms) (ms) s o (ms) (ms) 1 1 600 0,1 0,2 1 600 0,1 100 4 13 0,2 2 0 2 1 900 0,1 0,2 1 900 0,1 100 4 13 0,2 2 0 3 1 1200 0,1 0,2 1 1200 0,1 100 4 13 0,2 2 0 4 1 1200 0,1 10 1 900 0,1 100 4 13 0,2 2 0 5 1 900 0,1 20 1 600 0,1 100 4 13 0,2 2 0
[00859] Os TILs podem ser eletroporados em cubeta com abertura de arco de 0,4 cm (na ordem de cerca de 106 células/mL) com cerca de 20 μg de plasmídeos que codificam GFP e plasmídeos de controle pUC usando diferentes programas ou métodos de eletroporação. Cerca de 24 horas após a eletroporação, a expressão de GFP foi analisada por citometria de fluxo em células eletroporadas para determinar a eficiência de transfecção. A voltagem mínima requerida para eletroporação de plasmídeos em TILs tem sido previamente relatada em Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO 2014/184744 e Publicação de Pedido de Patente Norte-Americana nº US 2013/0315884 A1, cujas descrições são aqui incorporadas como referências. EXEMPLO 22: PROTOCOLO DE TRANSFECÇÃO TRANSIENTE
PARA A PREPARAÇÃO DE PRODUTOS DE TIL ENRIQUECIDOS EM CÉLULAS-T ESPECÍFICAS PARA ANTÍGENOS DE TUMOR COM ATIVIDADE TERAPÊUTICA INTENSIFICADA
[00860] Os experimentos neste exemplo estudarão os efeitos de duas diferentes estratégias de aprimoramento de TIL. Estratégia 1: Expressão
392 / 509 transiente de IL-2 ou uma forma de IL-15 ligada à membrana (mb-IL15). Estratégia 2: Reprogramação de TIL mediada por NOTCH. Em algumas modalidades, a reprogramação mediada por NOTCH inclui a expressão por mRNA do domínio intracelular (ICD, Intracellular Domain) de NOTCH1 ou de NOTCH2. Em algumas modalidades, a reprogramação mediada por NOTCH inclui a expressão por mRNA de ligante DLL1 de NOTCH.
[00861] Os tipos de tumor serão melanoma, tumor de pulmão, sarcoma, e também outros.
[00862] Os TILs serão gerados usando os processos conforme descritos aqui acima, incluindo, por exemplo, pelos processos descritos no Exemplo 16.
[00863] As moléculas de RNA serão distribuídas usando os métodos descritos, por exemplo, no Exemplo 21 (consulte, também os métodos descritos no Pedido de Patente Norte-Americana nº 2016/0230188 e na Patente Norte-Americana nº 8.859.229, ambos os quais são aqui incorporados em suas totalidades como referências).
[00864] As condições de distribuição serão determinadas, incluindo, por exemplo, validação de reagente mRNA, sincronização temporal (timing) de transfecção transiente e de reprogramação, compatibilidade da sincronização temporal (timing) de eletroporação com processos de TIL usados, eficiência (incluindo eficiência de transfecção), e escalabilidade.
[00865] As leituras dos experimentos incluirão o fenótipo de TIL (citometria de fluxo), funções efetoras de TIL (ensaios de produção de citocinas), reatividade de TIL ao tumor (ensaios de cocultura de células tumorais autólogas), análises de repertório de TCR (citometria de fluxo e/ou RNA-seq), e estado metabólico de TIL (ensaio metabólico de célula viva como Seahorse) ou qualquer um dos outros parâmetros descritos aqui acima. Resultados Supostos
[00866] As condições de distribuição serão planejadas para resultar em alta expressão da proteína de interesse em post-REP TILs. Amostras de
393 / 509 melanoma pre-REP congelado serão usadas para condições de triagem. Reagente distribuído para experimentos de otimização serão GFP mRNA. As condições testarão vários protocolos de eletroporação e métodos de ativação de TIL. A leitura será viabilidade de célula e % de células positivas para GFP relativas às células de controle não eletroporadas, conforme avaliado por citometria de fluxo. As condições selecionadas serão confirmadas em 2-3 preparações de TIL frescas de histologias disponíveis. Em algumas modalidades, a eficiência de transfecção (ET) pode ser determinada aproximadamente 3, 6, 9, 12, 15, e/ou 18 horas após a transfecção por separação de células ativadas por fluorescência (FACS, Fluorescence Activated Cell Sorting). Em alguns experimentos os transfectantes podem ser adicionalmente analisados a cada 12 horas a 24 horas até que a GFP não possa mais ser detectada. Em algumas modalidades, a viabilidade de célula pode ser determinada pela exclusão com corante azul tripano. É suposto que este protocolo resultará em >80% de viabilidade e >70% de eficiência de transfecção.
[00867] mRNAs que codificam IL-2 humana e IL-15 ligada à membrana serão gerados e a funcionalidade será testada. As condições validadas serão usadas para transfectar até 6 culturas de TIL de várias histologias. As leituras serão eficiência de transfecção, fenótipo de TIL, funções efetoras de TIL. É suposto que este protocolo resultará em >80% de viabilidade, >70% de eficiência de transfecção, fenótipos de TIL comparáveis ou aprimorados relativos ao controle, e funções efetoras de TIL significativamente aumentadas.
[00868] As condições de distribuição serão planejadas, conforme a necessidade, para resultar em reprogramação de células-T. Amostras de melanoma pre-REP congeladas armazenadas em Iovance serão usadas para triar as condições. O reagente distribuído será NOTCH1 ICD mRNA ou NOTCH2 ICD mRNA. As condições testarão vários métodos de ativação de
394 / 509 TIL e sincronização temporal (timing) de eletroporação. As leituras serão viabilidade de célula, eficiência de transfecção e % de células-tronco-T de memória (TSCM) relativas às células de controle não eletroporadas, conforme avaliado por citometria de fluxo. As condições selecionadas serão confirmadas em 2-3 preparações de TIL frescas de histologias disponíveis. É suposto que este protocolo resultará em >80% de viabilidade, >70% de eficiência de transfecção e um aumento significativo em frequência de TSCM.
[00869] Os experimentos de reprogramação serão realizados em até 6 preparações de TIL de várias histologias, usando as condições de transfecção determinadas acima. As leituras serão eficiência de transfecção, fenótipo de TIL, repertório de TCR, e funções efetoras de TIL. É suposto que este protocolo resultará em um aumento significativo da frequência de TSCM, permitirá a manutenção do repertório de TCR do subconjunto de TSCM relativo ao TIL inteiro, e permitirá as funções efetoras mantidas relativas às células de controle. EXEMPLO 23: APROVISIONAMENTO E VALIDAÇÃO DE SD- RXRNAs
[00870] Os experimentos neste exemplo proveem dados relacionados aos construtos de sd-rxRNA para 5 alvos de interesse: PDCD1, TIM3, CBLB, LAG3, e CISH.
[00871] Fase 1: Aprovisionamento de sd-rxRNAs para os 5 alvos de interesse.
[00872] Fase 2: Validação de silenciamento gênico mediado por sd- rxRNA em pre-REP TIL (8 semanas).
[00873] Até 6 linhagens de melanoma/outras linhagens pre-REP. Determinação das condições experimentais.
[00874] Leituras: • % de silenciamento: suposto ≥ 80%
395 / 509 • Persistência de silenciamento • Crescimento de TIL: suposto dentro de 10% de células de controle • Função de TIL: suposta produção aumentada de citocinas
[00875] Fase 3: Implementação de silenciamento gênico mediado por sd-rxRNA para processo Ger 2 e/ou Ger 3 (3 meses) • 3-6 Preparações de TIL FRESCO em escala de pesquisa • Mesmas leituras como acima • Fenótipo de TIL • Reatividade de TIL ao tumor • Pelo menos 2 pares de alvo/sd-rxRNA serão selecionados para trabalho adicional
[00876] Fase 4: Implementação de protocolo(s) de silenciamento otimizado(s) para preparação de TIL em escala máxima (8 semanas).
[00877] • Uma preparação em escala máxima por gene alvo. Fundamento lógico
[00878] No microambiente tumoral (TME, Tumor MicroEnvironment), os TILs expressam várias moléculas inibitórias que negativamente regulam a função efetora deles.
[00879] A funcionalidade pode ser restaurada após a cultura dos TILs ex vivo, mas a supressão imune será encontrada de novo após a reinfusão.
[00880] Garantindo que as vias inibitórias de células-T permaneçam silenciadas durante pelo menos uns poucos dias após a reinfusão, pode-se melhorar a potência dos TILs para ACT (Adoptive Cell Transfer, Transferência Adotiva de Células).
[00881] siRNAs autodistribuíveis (self-delivering siRNAs) (sd- rxRNAs) proveem um método eficaz para atenuar genes de células-T. Consulte, por exemplo, Ligtenberg, et al., Mol. Therapy, 26(6):1482-1493 (2018).
396 / 509 Objetivo
[00882] Para reestabelecer as funções efetoras de TIL, pelo silenciamento as vias inibitórias. Estratégia
[00883] Atenuação transiente de 1) PDCD1, 2) TIM3, 3) CBLB, 4) LAG3, e 5) CISH usando sd-rxRNA durante o protocolo de expansão rápida. Foco específico em atenuação transiente de PD1 usando sd-rxRNA durante o protocolo de expansão rápida. Procedimento
[00884] Validação de silenciamento gênico mediado por sd-rxRNA em TIL submetido ao REP (eficiência e persistência de KD (Knock-Down, Atenuação); viabilidade de célula-T).
[00885] Influência do silenciamento gênico sobre o fenótipo e a função (reatividade ao tumor) de TIL. Resumo dos Resultados
[00886] Adição de sd-rxRNAs direcionados durante o REP resultou em KD (atenuação) gênica bem sucedida para 3 dos 5 alvos, incluindo mais que 80% (>80%) de atenuação de PD1.
[00887] • PD1: >80% • TIM3: ~70% • LAG3: ~70% • CISH: ~40% • CBLB: não detectável
[00888] KD (knock-down, atenuação) de PD-1 esteve associada à viabilidade decrescida. KD de PD-1 esteve associada à expansão decrescida de TILs.
[00889] Alterações fenotípicas significativas estiveram associadas à KD (Atenuação) de PD1 e de TIM3 o que sugere nível mais alto de ativação (expressão intensificada de CD25, CCR7, CD56, 4-1BB, e OX40). Em
397 / 509 particular, alterações fenotípicas significativas estiveram associadas à KD (Atenuação) de PD1 o que sugere nível mais alto de ativação (expressão intensificada de CD25, CCR7, 4-1BB, e OX40, relativa ao controle NTC).
[00890] Nenhuns dos sd-rxRNAs resultaram em secreção aumentada de citocinas em resposta à reestimulação (INF-γ/IL-2/TNF-α) nestes experimentos. Em particular, a exposição de TIL ao PDCD1 sd-rxRNA não aumentou a mobilização de CD107a ou a secreção de citocinas (INFγ/IL- 2/TNF-α) em resposta à reestimulação. Consulte, por exemplo, a Figura 54.
[00891] KD (knock-down, atenuação) de PD1 aumentou a capacidade de extermínio in vitro dos TILs (consulte, por exemplo, a Figura 49). Métodos:
[00892] • Dia 0: Pre-REP iniciado. Meio mais IL-2 adicionada.
[00893] • Dia 11: REP iniciado pre-REP Descongelado/Fresco + sd- rxRNA (isto é, segunda expansão iniciada) com meio compreendendo IL-2 mais PBMCs.
[00894] • Dia 14: meio alterado + sd-rxRNA, com IL-2, (opcionalmente OKT3 e células alimentadoras (PBMCs)); contudo, realizado com apenas IL-2 (por exemplo, sd-rxRNA com meio com IL-2).
[00895] • Dia 17: meio alterado + sd-rxRNA (adição de sd-rxRNA adicional) (por exemplo, sd-rxRNA com meio com IL-2).
[00896] • Dia 21: meio alterado + sd-rxRNA (adição de sd-rxRNA adicional) (por exemplo, sd-rxRNA com meio com IL-2).
[00897] • Dia 22: TILs colhidos conforme descrito acima.
[00898] o Células contadas e determinada a viabilidade.
[00899] o Determinada a eficiência de KD (knock-down, atenuação) (Q-PCR, citometria de fluxo).
[00900] o Realizados ensaios de fenótipo para caracterizar TILs, conforme descrito acima.
[00901] o Examinados os marcadores de ativação (CD107a, IFN-γ)
398 / 509 (consulte, por exemplo, a Figuras 45, marcadores inibitórios/de exaustão, e Figura 46, IFN-γ).
[00902] Este experimento foi realizado em cinco tipos de tumor: melanoma, tumor de mama, tumor de pulmão, sarcoma, e tumor ovariano, conforme provido na Figura 40. EXEMPLO 24: MODALIDADES VARIANTES DO EXEMPLO 23
[00903] De acordo com os métodos discutidos no Exemplo 23, são descritos métodos de expandir TILs em combinação com alteração transiente de expressão de proteína. Este exemplo provê modalidades adicionalmente variadas de acordo com os métodos descritos no Exemplo 23.
[00904] Em algumas modalidades do método descrito acima, o método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs pode compreender: (i) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente; (ii) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2, e opcionalmente OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs; (iii) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com adicionais IL- 2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é pelo menos 100 vezes maior em número que a segunda população de TILs, e em que a segunda expansão é realizada durante pelo menos 14 dias com o propósito de obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs; e (iv) expor a segunda e/ou terceira população de TILs a fatores de transcrição (TFs) e/ou outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína entre dias 11 e 21, em que os TFs e/ou as outras
399 / 509 moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína proveem expressão alterada de antígenos de tumor e/ou uma alteração no número de células-T específicas para antígenos de tumor na população terapêutica de TILs; e (v) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (iv) no dia 22 ou após, em que; e (vi) opcionalmente, transferir a população colhida de TILs da etapa (v) para uma bolsa de infusão.
[00905] Em algumas modalidades variantes, as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína compreendem sd- RNAs, incluindo, por exemplo, mas não se limitando a, sd-rxRNAs. Em algumas modalidades, os TILs são expostos aos sd-RNAs no Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd- RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 70% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 75% em expressão do gene alvo.
[00906] Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 80% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 85% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 90% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 95%
400 / 509 em expressão do gene alvo.
Em algumas modalidades, as sequências de sd- RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 99% em expressão do gene alvo.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM a cerca de 10 µM, em algumas modalidades, cerca de 0,25 µM a cerca de 4 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA
401 / 509 usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 4,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 5,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 6,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 7,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 8,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração
402 / 509 de cerca de 9,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 10,0 µM. Em qualquer uma das modalidades supracitadas, as concentrações especificadas podem ser determinadas com respeito ao meio de cultura de TIL antes ou depois da troca de meio.
[00907] Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 70% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 75% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 80% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 85% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 90% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 95% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 99% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,25 µM a cerca de 10 µM, em algumas modalidades, cerca de 0,25 µM a cerca de 4 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,25 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,5 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma
403 / 509 concentração de cerca de 0,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD- 1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma
404 / 509 redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,75 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 4,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 5,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 6,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 7,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 8,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 9,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 10,0 µM. Em qualquer uma das modalidades supracitadas, as concentrações especificadas podem ser determinadas com respeito ao meio de cultura de TIL antes ou depois da troca de meio.
[00908] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14,
405 / 509 Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00909] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00910] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00911] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de 2 µM. Em algumas modalidades variantes,
406 / 509 os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00912] Em algumas modalidades, o sd-RNA no Dia 11 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA, IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 14 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 17 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 21 é adicionado ao meio compreendendo sd- RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 14 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 17 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 21 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 14. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 17. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA é adicionado à mesma concentração no Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA é adicionado a uma concentração diferente no Dia 11, Dia 14, Dia 17 e/ou Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
407 / 509 EXEMPLO 25: MODALIDADES VARIANTES DO EXEMPLO 23
[00913] De acordo com os métodos discutidos no Exemplo 23, são descritos métodos de expandir TILs em combinação com alteração transiente de expressão de proteína. Este exemplo provê modalidades adicionalmente variadas de acordo com os métodos descritos no Exemplo 23.
[00914] Em algumas modalidades do método descrito acima, o método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs pode compreender: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2, e opcionalmente OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3 a 14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (b) para a etapa (c) ocorre sem abrir o sistema; (d) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com adicionais IL- 2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d)
408 / 509 ocorre sem abrir o sistema; (e) expor a segunda e/ou terceira população de TILs aos fatores de transcrição (TFs) e/ou a outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína entre dias 11 e 21, em que os TFs e/ou as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína proveem expressão alterada de antígenos de tumor e/ou uma alteração no número de células-T específicas para antígenos de tumor na população terapêutica de TILs; (f) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (d) no dia 22 ou após, em que a transição da etapa (d) para a etapa (e) ocorre sem abrir o sistema; e (g) transferir a população colhida de TILs da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (e) para a etapa (f) ocorre sem abrir o sistema.
[00915] Em algumas modalidades variantes, as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína compreendem sd- RNAs, incluindo, por exemplo, mas não se limitando a, sd-rxRNAs. Em algumas modalidades, os TILs são expostos aos sd-RNAs no Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd- RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00916] Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 70% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 75% em expressão do gene alvo. Em algumas
409 / 509 modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 80% em expressão do gene alvo.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 85% em expressão do gene alvo.
Em algumas modalidades, as sequências de sd- RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 90% em expressão do gene alvo.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 95% em expressão do gene alvo.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 99% em expressão do gene alvo.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM a cerca de 10 µM, em algumas modalidades, cerca de 0,25 µM a cerca de 4 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd- RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo
410 / 509 quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 4,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 5,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 6,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA
411 / 509 usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 7,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 8,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 9,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 10,0 µM. Em qualquer uma das modalidades supracitadas, as concentrações especificadas podem ser determinadas com respeito ao meio de cultura de TIL antes ou depois da troca de meio.
[00917] Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 70% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 75% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 80% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 85% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 90% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 95% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 99% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,25 µM a cerca de 10 µM, em algumas modalidades, cerca de 0,25 µM a cerca de 4 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na
412 / 509 invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD- 1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,0 µM.
Em algumas
413 / 509 modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,25 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,5 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,75 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 4,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 5,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 6,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 7,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 8,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 9,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 10,0 µM. Em qualquer uma das modalidades supracitadas, as concentrações especificadas podem ser determinadas com respeito ao meio de cultura de TIL antes ou depois da troca de meio.
[00918] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos
414 / 509 sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00919] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00920] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca
415 / 509 de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00921] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00922] Em algumas modalidades, o sd-RNA no Dia 11 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA, IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 14 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 17 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 21 é adicionado ao meio compreendendo sd- RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 14 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 17 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 21 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 14. Em algumas
416 / 509 modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 17. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA é adicionado à mesma concentração no Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA é adicionado a uma concentração diferente no Dia 11, Dia 14, Dia 17 e/ou Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1. EXEMPLO 26: MODALIDADES VARIANTES DO EXEMPLO 23
[00923] De acordo com os métodos discutidos no Exemplo 23, são descritos métodos de expandir TILs em combinação com alteração transiente de expressão de proteína. Este exemplo provê modalidades adicionalmente variadas de acordo com os métodos descritos no Exemplo 23.
[00924] Em algumas modalidades do método descrito acima, um método para tratar um indivíduo com câncer é provido e um tal método compreende administrar linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) expandidos compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor resseccionado de um indivíduo pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2, e opcionalmente OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3 a 14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (b) para a etapa (c) ocorre sem abrir o sistema; (d) realizar uma segunda expansão pela suplementação do
417 / 509 meio de cultura de células da segunda população de TILs com adicionais IL- 2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema; (e) expor a segunda e/ou terceira população de TILs aos fatores de transcrição (TFs) e/ou a outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína entre dias 11 e 21, em que os TFs e/ou as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína proveem expressão aumentada de antígenos de tumor e/ou um aumento no número de células-T específicas para antígenos de tumor na população terapêutica de TILs; (f) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (d), em que a transição da etapa (d) para a etapa (e) ocorre sem abrir o sistema; e (g) transferir a população colhida de TILs da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (e) para a etapa (f) ocorre sem abrir o sistema; (h) opcionalmente criopreservar a bolsa de infusão compreendendo a população colhida de TILs da etapa (f) usando um processo de criopreservação; e (i) administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz da terceira população de TILs da bolsa de infusão na etapa (g) ao paciente.
[00925] Em algumas modalidades variantes, as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína compreendem sd- RNAs, incluindo, por exemplo, mas não se limitando a, sd-rxRNAs. Em algumas modalidades, os TILs são expostos aos sd-RNAs no Dia 11, Dia 14,
418 / 509 Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd- RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00926] Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 70% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 75% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 80% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 85% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd- RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 90% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 95% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 99% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM a cerca de 10 µM, em algumas modalidades, cerca de 0,25 µM a cerca de 4 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd- RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,5 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA
419 / 509 usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração
420 / 509 de cerca de 3,5 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,75 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 4,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 5,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 6,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 7,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 8,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 9,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 10,0 µM. Em qualquer uma das modalidades supracitadas, as concentrações especificadas podem ser determinadas com respeito ao meio de cultura de TIL antes ou depois da troca de meio.
[00927] Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 70% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 75% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 80% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as
421 / 509 sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 85% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 90% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 95% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 99% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,25 µM a cerca de 10 µM, em algumas modalidades, cerca de 0,25 µM a cerca de 4 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD- 1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando
422 / 509 distribuída a uma concentração de cerca de 2,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 4,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 5,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 6,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 7,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas
423 / 509 na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 8,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 9,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 10,0 µM. Em qualquer uma das modalidades supracitadas, as concentrações especificadas podem ser determinadas com respeito ao meio de cultura de TIL antes ou depois da troca de meio.
[00928] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00929] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca
424 / 509 de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00930] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00931] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00932] Em algumas modalidades, o sd-RNA no Dia 11 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA, IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 14 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em
425 / 509 algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 17 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 21 é adicionado ao meio compreendendo sd- RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 14 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 17 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 21 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 14. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 17. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA é adicionado à mesma concentração no Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA é adicionado a uma concentração diferente no Dia 11, Dia 14, Dia 17 e/ou Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1. EXEMPLO 27: MODALIDADES VARIANTES DO EXEMPLO 23
[00933] De acordo com os métodos discutidos no Exemplo 23, são descritos métodos de expandir TILs em combinação com alteração transiente de expressão de proteína. Este exemplo provê modalidades adicionalmente variadas de acordo com os métodos descritos no Exemplo 23.
[00934] Em algumas modalidades do método descrito acima, pode ser provida uma população de TILs expandidos para uso no tratamento de um indivíduo com câncer, em que a população de TILs expandidos é uma terceira população de TILs obtenível por um método compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor resseccionado de um indivíduo pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor;
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(b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2, e opcionalmente OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3 a 14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (b) para a etapa (c) ocorre sem abrir o sistema; (d) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com adicionais IL- 2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema; (e) expor a segunda e/ou terceira população de TILs aos fatores de transcrição (TFs) e/ou a outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína entre dias 11 e 21, em que os TFs e/ou as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína proveem expressão aumentada de antígenos de tumor e/ou um aumento no número de células-T específicas para antígenos de tumor na população terapêutica de TILs; (f) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (d), em que a transição da etapa (e) para a etapa (f) ocorre sem abrir o sistema; e (g) transferir a população colhida de TILs da etapa (e) para
427 / 509 uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (f) para a etapa (g) ocorre sem abrir o sistema; e (h) opcionalmente criopreservar a bolsa de infusão compreendendo a população colhida de TILs da etapa (f) usando um processo de criopreservação.
[00935] Em algumas modalidades variantes, as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína compreendem sd- RNAs, incluindo, por exemplo, mas não se limitando a, sd-rxRNAs. Em algumas modalidades, os TILs são expostos aos sd-RNAs no Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd- RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00936] Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 70% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 75% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 80% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 85% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd- RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 90% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 95% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 99% em expressão do gene alvo. Em algumas
428 / 509 modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM a cerca de 10 µM, em algumas modalidades, cerca de 0,25 µM a cerca de 4 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd- RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA
429 / 509 usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 4,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 5,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 6,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 7,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 8,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 9,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração
430 / 509 de cerca de 10,0 µM. Em qualquer uma das modalidades supracitadas, as concentrações especificadas podem ser determinadas com respeito ao meio de cultura de TIL antes ou depois da troca de meio.
[00937] Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 70% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 75% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 80% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 85% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 90% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 95% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 99% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,25 µM a cerca de 10 µM, em algumas modalidades, cerca de 0,25 µM a cerca de 4 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,25 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,5 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,75 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD- 1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,0 µM. Em algumas
431 / 509 modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando
432 / 509 distribuída a uma concentração de cerca de 4,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 5,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 6,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 7,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 8,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 9,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 10,0 µM. Em qualquer uma das modalidades supracitadas, as concentrações especificadas podem ser determinadas com respeito ao meio de cultura de TIL antes ou depois da troca de meio.
[00938] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM
433 / 509 a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00939] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00940] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00941] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos
434 / 509 dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00942] Em algumas modalidades, o sd-RNA no Dia 11 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA, IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 14 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 17 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 21 é adicionado ao meio compreendendo sd- RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 14 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 17 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 21 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 14. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 17. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA é adicionado à mesma concentração no Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA é adicionado a uma concentração diferente no Dia 11, Dia 14, Dia 17 e/ou Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1. EXEMPLO 28: MODALIDADES VARIANTES DO EXEMPLO 23
[00943] De acordo com os métodos discutidos no Exemplo 23, são descritos métodos de expandir TILs em combinação com alteração transiente
435 / 509 de expressão de proteína. Este exemplo provê modalidades adicionalmente variadas de acordo com os métodos descritos no Exemplo 23.
[00944] Em algumas modalidades do método descrito acima, é provido um método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs que compreende: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 e opcionalmente compreendendo um anticorpo agonista de 4-1BB durante cerca de 2 a 5 dias; (d) adicionar OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 1 a 3 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema; (e) repousar a segunda população de TILs durante cerca de 1 dia; (f) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com IL-2 adicional, opcionalmente anticorpo OKT-3, opcionalmente um anticorpo OX40, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 11 dias para obter a terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial
436 / 509 permeável a gás, e em que as transições da etapa (c) para a etapa (f) ocorrem sem abrir o sistema; (g) colocar a segunda população de TILs durante qualquer uma das etapas (d), (e), e/ou (f), incluindo entre dias 11 e 21, em contato com pelo menos um sd-RNA, em que o sd-RNA é adicionado a uma concentração de 0,1 μM de sd-RNA, 0,5 μM de sd-RNA, 0,75 μM de sd-RNA, 1 μM de sd- RNA, 1,25 μM de sd-RNA, 1,5 μM de sd-RNA, 2 μM de sd-RNA, 5 μM de sd-RNA, ou 10 μM de sd-RNA, e em que o sd-RNA é para inibir a expressão de uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, e combinações das mesmas; (h) opcionalmente realizar uma etapa de eletroporação estéril na segunda população de TILs, em que a etapa de eletroporação estéril medeia a transferência do pelo menos um sd-RNA; (i) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapas (g) ou (h) para prover uma população colhida de TILs, em que as transições da etapa (g) para a etapa (i) ocorrem sem abrir o sistema, a população colhida de TILs é uma população terapêutica de TILs; e (j) transferir a população colhida de TILs da etapa (i) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (i) para a etapa (j) ocorre sem abrir o sistema.
[00945] Em algumas modalidades variantes, as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína compreendem sd- RNAs, incluindo, por exemplo, mas não se limitando a, sd-rxRNAs. Em algumas modalidades, os TILs são expostos aos sd-RNAs no Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd- RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos
437 / 509 dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00946] Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 70% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 75% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 80% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 85% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd- RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 90% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 95% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 99% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM a cerca de 10 µM, em algumas modalidades, cerca de 0,25 µM a cerca de 4 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd- RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,5 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,75 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA
438 / 509 usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração
439 / 509 de cerca de 4,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 5,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 6,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 7,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 8,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 9,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 10,0 µM. Em qualquer uma das modalidades supracitadas, as concentrações especificadas podem ser determinadas com respeito ao meio de cultura de TIL antes ou depois da troca de meio.
[00947] Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 70% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 75% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 80% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 85% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 90% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 95% na expressão de PD-1. Em algumas
440 / 509 modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 99% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,25 µM a cerca de 10 µM, em algumas modalidades, cerca de 0,25 µM a cerca de 4 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD- 1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando
441 / 509 distribuída a uma concentração de cerca de 2,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 4,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 5,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 6,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 7,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 8,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 9,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas
442 / 509 na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 10,0 µM. Em qualquer uma das modalidades supracitadas, as concentrações especificadas podem ser determinadas com respeito ao meio de cultura de TIL antes ou depois da troca de meio.
[00948] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00949] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00950] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a
443 / 509 uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00951] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00952] Em algumas modalidades, o sd-RNA no Dia 11 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA, IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 14 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 17 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 21 é adicionado ao meio compreendendo sd- RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs
444 / 509 (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 14 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 17 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 21 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 14. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 17. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA é adicionado à mesma concentração no Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA é adicionado a uma concentração diferente no Dia 11, Dia 14, Dia 17 e/ou Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1. EXEMPLO 29: MODALIDADES VARIANTES DO EXEMPLO 23
[00953] De acordo com os métodos discutidos no Exemplo 23, são descritos métodos de expandir TILs em combinação com alteração transiente de expressão de proteína. Este exemplo provê modalidades adicionalmente variadas de acordo com os métodos descritos no Exemplo 23.
[00954] Em algumas modalidades do método descrito acima, é provido um método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs que compreende: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 e opcionalmente compreendendo um anticorpo agonista de 4-1BB durante cerca de 2 a 5 dias; (d) adicionar OKT-3, para produzir uma segunda população de
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TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 1 a 3 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema; (e) repousar a segunda população de TILs durante cerca de 1 dia; (f) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com IL-2 adicional, opcionalmente anticorpo OKT-3, opcionalmente um anticorpo OX40, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 11 dias para obter a terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que as transições da etapa (c) para a etapa (f) ocorrem sem abrir o sistema; (g) colocar a segunda população de TILs durante qualquer uma das etapas (d), (e), e/ou (f), incluindo entre dias 11 e 21, em contato com pelo menos um sd-RNA, em que o sd-RNA é adicionado a uma concentração de 2 μM de sd-RNA and em que o sd-RNA é para inibir a expressão de uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, e combinações das mesmas; (h) opcionalmente realizar uma etapa de eletroporação estéril na segunda população de TILs, em que a etapa de eletroporação estéril medeia a transferência do pelo menos um sd-RNA; (i) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapas (g) ou (h) para prover uma população colhida de TILs, em que as transições da etapa (g) para a etapa (i) ocorrem sem abrir o sistema, a população colhida de
446 / 509 TILs é uma população terapêutica de TILs; e (j) transferir a população colhida de TILs da etapa (i) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (i) para a etapa (j) ocorre sem abrir o sistema.
[00955] Em algumas modalidades variantes, as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína compreendem sd- RNAs, incluindo, por exemplo, mas não se limitando a, sd-rxRNAs. Em algumas modalidades, os TILs são expostos aos sd-RNAs no Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd- RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00956] Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 70% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 75% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 80% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 85% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd- RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 90% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 95% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 99% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma
447 / 509 redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,0 µM. Em qualquer uma das modalidades supracitadas, as concentrações especificadas podem ser determinadas com respeito ao meio de cultura de TIL antes ou depois da troca de meio.
[00957] Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 70% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 75% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 80% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 85% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 90% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 95% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 99% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,0 µM. Em qualquer uma das modalidades supracitadas, as concentrações especificadas podem ser determinadas com respeito ao meio de cultura de TIL antes ou depois da troca de meio.
[00958] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14,
448 / 509 Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00959] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00960] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,75 µM a cerca de 2,25 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-
1.
[00961] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a
449 / 509 uma concentração de sd-RNA de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00962] Em algumas modalidades, o sd-RNA no Dia 11 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA, IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 14 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 17 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 21 é adicionado ao meio compreendendo sd- RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 14 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 17 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 21 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 14. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 17. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA é adicionado à mesma concentração no Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA é adicionado a uma concentração diferente no Dia 11, Dia 14, Dia 17 e/ou Dia 21, em que a
450 / 509 concentração de sd-RNA é adicionada em cerca de 2 µM em pelo menos um dia. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1. EXEMPLO 30: MODALIDADES VARIANTES DO EXEMPLO 23
[00963] De acordo com os métodos discutidos no Exemplo 23, são descritos métodos de expandir TILs em combinação com alteração transiente de expressão de proteína. Este exemplo provê modalidades adicionalmente variadas de acordo com os métodos descritos no Exemplo 23.
[00964] Em algumas modalidades do método descrito acima, é provido um método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs que compreende: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 e opcionalmente compreendendo um anticorpo agonista de 4-1BB durante cerca de 2 a 5 dias; (d) adicionar OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 1 a 3 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema; (e) repousar a segunda população de TILs durante cerca de 1 dia; (f) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com IL-2 adicional,
451 / 509 opcionalmente anticorpo OKT-3, opcionalmente um anticorpo OX40, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 11 dias para obter a terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que as transições da etapa (c) para a etapa (f) ocorrem sem abrir o sistema; (g) colocar a segunda população de TILs durante qualquer uma das etapas (d), (e), e/ou (f), incluindo entre dias 11 e 21, em contato com pelo menos um sd-RNA, em que o sd-RNA é adicionado a uma concentração de 0,1 μM de sd-RNA, 0,5 μM de sd-RNA, 0,75 μM de sd-RNA, 1 μM de sd- RNA, 1,25 μM de sd-RNA, 1,5 μM de sd-RNA, 2 μM de sd-RNA, 5 μM de sd-RNA, ou 10 μM de sd-RNA, e em que o sd-RNA é para inibir a expressão de uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, e combinações das mesmas; (h) opcionalmente realizar uma etapa de eletroporação estéril na segunda população de TILs, em que a etapa de eletroporação estéril medeia a transferência do pelo menos um sd-RNA; (i) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapas (g) ou (h) para prover uma população colhida de TILs, em que as transições da etapa (g) para a etapa (i) ocorrem sem abrir o sistema, a população colhida de TILs é uma população terapêutica de TILs; (j) transferir a população colhida de TILs da etapa (i) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (i) para a etapa (j) ocorre sem abrir o sistema; e (k) criopreservar a população colhida de TILs usando um meio de criopreservação baseado em sulfóxido dimetílico.
[00965] Em algumas modalidades variantes, as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína compreendem sd-
452 / 509 RNAs, incluindo, por exemplo, mas não se limitando a, sd-rxRNAs. Em algumas modalidades, os TILs são expostos aos sd-RNAs no Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd- RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00966] Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 70% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 75% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 80% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 85% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd- RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 90% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 95% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 99% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM a cerca de 10 µM, em algumas modalidades, cerca de 0,25 µM a cerca de 4 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd- RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma
453 / 509 redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,25 µM.
Em algumas
454 / 509 modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,5 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,75 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 4,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 5,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 6,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 7,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 8,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 9,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 10,0 µM. Em qualquer uma das modalidades supracitadas, as concentrações especificadas podem ser determinadas com respeito ao meio de cultura de TIL antes ou depois da troca de meio.
[00967] Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 70% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 75% na expressão de PD-1. Em algumas
455 / 509 modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 80% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 85% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 90% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 95% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 99% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,25 µM a cerca de 10 µM, em algumas modalidades, cerca de 0,25 µM a cerca de 4 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD- 1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de
456 / 509 cerca de 1,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 4,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 5,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 6,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma
457 / 509 redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 7,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 8,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 9,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 10,0 µM. Em qualquer uma das modalidades supracitadas, as concentrações especificadas podem ser determinadas com respeito ao meio de cultura de TIL antes ou depois da troca de meio.
[00968] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00969] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades
458 / 509 variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00970] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00971] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00972] Em algumas modalidades, o sd-RNA no Dia 11 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA, IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia
459 / 509 14 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 17 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 21 é adicionado ao meio compreendendo sd- RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 14 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 17 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 21 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 14. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 17. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA é adicionado à mesma concentração no Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA é adicionado a uma concentração diferente no Dia 11, Dia 14, Dia 17 e/ou Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1. EXEMPLO 31: MODALIDADES VARIANTES DO EXEMPLO 23
[00973] De acordo com os métodos discutidos no Exemplo 23, os métodos de expandir TILs em combinação com alteração transiente de expressão de proteína são descritos. Este exemplo provê modalidades adicionalmente variadas de acordo com os métodos descritos no Exemplo 23.
[00974] Em algumas modalidades do método descrito acima, é provido um método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs que compreende: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor
460 / 509 obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 e opcionalmente compreendendo um anticorpo agonista de 4-1BB durante cerca de 2 a 5 dias; (d) colocar a primeira população de TILs em contato com pelo menos um sd-RNA entre dias 11 e 21, em que o sd-RNA é adicionado a uma concentração de 0,1 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 0,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 0,75 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1,25 μM de sd- RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 2 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 5 μM de sd- RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, ou 10 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, e em que o sd-RNA é para inibir a expressão de uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, e combinações das mesmas; (e) opcionalmente realizar uma etapa de eletroporação estéril na primeira população de TILs, em que a etapa de eletroporação estéril medeia a transferência do pelo menos um sd-RNA; (f) adicionar OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 1 a 3 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que as transições da etapa (c) para a etapa (f) ocorrem sem abrir o sistema; (g) repousar a segunda população de TILs durante cerca de 1 dia;
461 / 509 (h) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com IL-2 adicional, opcionalmente anticorpo OKT-3, opcionalmente um anticorpo OX40, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 11 dias para obter a terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que as transições da etapa (c) para a etapa (h) ocorrem sem abrir o sistema; (i) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (h) para prover uma população colhida de TILs, em que a transição da etapa (h) para a etapa (i) ocorre sem abrir o sistema, a população colhida de TILs é uma população terapêutica de TILs; (j) transferir a população colhida de TILs da etapa (i) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (i) para a etapa (j) ocorre sem abrir o sistema; e (k) criopreservar a população colhida de TILs usando um meio de criopreservação baseado em sulfóxido dimetílico.
[00975] Em algumas modalidades variantes, as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína compreendem sd- RNAs, incluindo, por exemplo, mas não se limitando a, sd-rxRNAs. Em algumas modalidades, os TILs são expostos aos sd-RNAs no Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd- RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
462 / 509
[00976] Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 70% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 75% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 80% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 85% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd- RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 90% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 95% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 99% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM a cerca de 10 µM, em algumas modalidades, cerca de 0,25 µM a cerca de 4 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd- RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,5 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,75 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,25 µM. Em algumas
463 / 509 modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 4,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo
464 / 509 quando distribuídas a uma concentração de cerca de 5,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 6,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 7,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 8,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 9,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 10,0 µM. Em qualquer uma das modalidades supracitadas, as concentrações especificadas podem ser determinadas com respeito ao meio de cultura de TIL antes ou depois da troca de meio.
[00977] Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 70% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 75% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 80% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 85% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 90% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 95% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 99% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as
465 / 509 sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,25 µM a cerca de 10 µM, em algumas modalidades, cerca de 0,25 µM a cerca de 4 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD- 1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma
466 / 509 redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 4,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 5,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 6,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 7,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 8,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 9,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 10,0 µM.
Em qualquer uma das
467 / 509 modalidades supracitadas, as concentrações especificadas podem ser determinadas com respeito ao meio de cultura de TIL antes ou depois da troca de meio.
[00978] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00979] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00980] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo
468 / 509 menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00981] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00982] Em algumas modalidades, o sd-RNA no Dia 11 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA, IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 14 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 17 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 21 é adicionado ao meio compreendendo sd- RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 14 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2.
469 / 509 Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 17 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 21 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 14. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 17. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA é adicionado à mesma concentração no Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA é adicionado a uma concentração diferente no Dia 11, Dia 14, Dia 17 e/ou Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1. EXEMPLO 32: MODALIDADES VARIANTES DO EXEMPLO 23
[00983] De acordo com os métodos discutidos no Exemplo 23, os métodos de expandir TILs em combinação com alteração transiente de expressão de proteína são descritos. Este exemplo provê modalidades adicionalmente variadas de acordo com os métodos descritos no Exemplo 23.
[00984] Em algumas modalidades do método descrito acima, é provido um método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs que compreende: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 e opcionalmente compreendendo um anticorpo agonista de 4-1BB durante cerca de 2 a 5 dias; (d) colocar a primeira população de TILs em contato com pelo menos um sd-RNA entre dias 11 e 21, em que o sd-RNA é adicionado a uma concentração de 0,1 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 0,5 μM de sd-RNA/10.000
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TILs, 0,75 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1,25 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 2 μM de sd- RNA/10.000 TILs, 5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, ou 10 μM de sd- RNA/10.000 TILs, e em que o sd-RNA é para inibir a expressão de uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, e combinações das mesmas; (e) opcionalmente realizar uma etapa de eletroporação estéril na primeira população de TILs, em que a etapa de eletroporação estéril medeia a transferência do pelo menos um sd-RNA; (f) adicionar OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 1 a 3 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que as transições da etapa (c) para a etapa (f) ocorrem sem abrir o sistema; (g) repousar a segunda população de TILs durante cerca de 1 dia; (h) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com IL-2 adicional, opcionalmente anticorpo OKT-3, opcionalmente um anticorpo OX40, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 11 dias para obter a terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que a transição da etapa (g) para a etapa (h) ocorre sem abrir o sistema; (i) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (h) para prover uma população colhida de TILs, em que a transição da etapa (h)
471 / 509 para a etapa (i) ocorre sem abrir o sistema, a população colhida de TILs é uma população terapêutica de TILs; (j) transferir a população colhida de TILs da etapa (i) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (i) para a etapa (j) ocorre sem abrir o sistema; e (k) criopreservar a população colhida de TILs usando um meio de criopreservação baseado em sulfóxido dimetílico.
[00985] Em algumas modalidades variantes, as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína compreendem sd- RNAs, incluindo, por exemplo, mas não se limitando a, sd-rxRNAs. Em algumas modalidades, os TILs são expostos aos sd-RNAs no Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd- RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00986] Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 70% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 75% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 80% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 85% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd- RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 90% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 95% em expressão do gene alvo. Em
472 / 509 algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 99% em expressão do gene alvo.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM a cerca de 10 µM, em algumas modalidades, cerca de 0,25 µM a cerca de 4 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd- RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma
473 / 509 redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 4,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 5,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 6,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 7,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 8,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 9,0 µM.
Em algumas
474 / 509 modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 10,0 µM. Em qualquer uma das modalidades supracitadas, as concentrações especificadas podem ser determinadas com respeito ao meio de cultura de TIL antes ou depois da troca de meio.
[00987] Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 70% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 75% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 80% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 85% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 90% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 95% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 99% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,25 µM a cerca de 10 µM, em algumas modalidades, cerca de 0,25 µM a cerca de 4 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,25 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,5 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,75 µM. Em algumas modalidades, as sequências
475 / 509 de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD- 1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de
476 / 509 cerca de 3,75 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 4,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 5,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 6,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 7,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 8,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 9,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 10,0 µM. Em qualquer uma das modalidades supracitadas, as concentrações especificadas podem ser determinadas com respeito ao meio de cultura de TIL antes ou depois da troca de meio.
[00988] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca
477 / 509 de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00989] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00990] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00991] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14,
478 / 509 Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00992] Em algumas modalidades, o sd-RNA no Dia 11 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA, IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 14 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 17 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 21 é adicionado ao meio compreendendo sd- RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 14 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 17 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 21 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 14. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 17. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA é adicionado à mesma concentração no Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA é adicionado a uma concentração diferente no Dia 11, Dia 14, Dia 17 e/ou Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1. EXEMPLO 33: MODALIDADES VARIANTES DO EXEMPLO 23
479 / 509
[00993] De acordo com os métodos discutidos no Exemplo 23, os métodos de expandir TILs em combinação com alteração transiente de expressão de proteína são descritos. Este exemplo provê modalidades adicionalmente variadas de acordo com os métodos descritos no Exemplo 23.
[00994] Em algumas modalidades do método descrito acima, é provido um método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs que compreende: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 e opcionalmente compreendendo um anticorpo agonista de 4-1BB durante cerca de 2 a 5 dias; (d) adicionar OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 1 a 3 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema; (e) repousar a segunda população de TILs durante cerca de 1 dia; (f) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com IL-2 adicional, opcionalmente anticorpo OKT-3, opcionalmente um anticorpo OX40, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7
480 / 509 a 11 dias para obter a terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que as transições da etapa (c) para a etapa (f) ocorrem sem abrir o sistema; (g) colocar a segunda população de TILs durante qualquer uma das etapas (d), (e), e/ou (f), incluindo entre dias 11 e 21, em contato com pelo menos um sd-RNA, em que o sd-RNA é adicionado a uma concentração de 0,1 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 0,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 0,75 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1,25 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 2 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, ou 10 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, e em que o sd-RNA é para inibir a expressão de uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, e combinações das mesmas; (h) opcionalmente realizar uma etapa de eletroporação estéril na segunda população de TILs, em que a etapa de eletroporação estéril medeia a transferência do pelo menos um sd-RNA; (i) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapas (g) ou (h) para prover uma população colhida de TILs, em que as transições da etapa (g) para a etapa (i) ocorrem sem abrir o sistema, a população colhida de TILs é uma população terapêutica de TILs; (j) transferir a população colhida de TILs da etapa (i) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (i) para a etapa (j) ocorre sem abrir o sistema; e (k) criopreservar a população colhida de TILs usando um meio de criopreservação baseado em sulfóxido dimetílico.
[00995] Em algumas modalidades variantes, as outras moléculas
481 / 509 capazes de transientemente alterar a expressão de proteína compreendem sd- RNAs, incluindo, por exemplo, mas não se limitando a, sd-rxRNAs. Em algumas modalidades, os TILs são expostos aos sd-RNAs no Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd- RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00996] Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 70% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 75% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 80% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 85% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd- RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 90% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 95% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 99% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM a cerca de 10 µM, em algumas modalidades, cerca de 0,25 µM a cerca de 4 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd- RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM. Em algumas
482 / 509 modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo
483 / 509 quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,25 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,5 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,75 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 4,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 5,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 6,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 7,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 8,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 9,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 10,0 µM. Em qualquer uma das modalidades supracitadas, as concentrações especificadas podem ser determinadas com respeito ao meio de cultura de TIL antes ou depois da troca de meio.
[00997] Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 70% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção
484 / 509 apresentam uma redução de 75% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 80% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 85% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 90% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 95% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 99% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,25 µM a cerca de 10 µM, em algumas modalidades, cerca de 0,25 µM a cerca de 4 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD- 1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma
485 / 509 redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 4,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 5,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 6,0 µM.
Em algumas
486 / 509 modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 7,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 8,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 9,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 10,0 µM. Em qualquer uma das modalidades supracitadas, as concentrações especificadas podem ser determinadas com respeito ao meio de cultura de TIL antes ou depois da troca de meio.
[00998] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[00999] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de
487 / 509 sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[001000] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[001001] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[001002] Em algumas modalidades, o sd-RNA no Dia 11 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA, IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por
488 / 509 exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 14 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 17 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 21 é adicionado ao meio compreendendo sd- RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 14 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 17 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 21 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 14. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 17. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA é adicionado à mesma concentração no Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA é adicionado a uma concentração diferente no Dia 11, Dia 14, Dia 17 e/ou Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1. EXEMPLO 34: MODALIDADES VARIANTES DO EXEMPLO 23
[001003] De acordo com os métodos discutidos no Exemplo 23, os métodos de expandir TILs em combinação com alteração transiente de expressão de proteína são descritos. Este exemplo provê modalidades adicionalmente variadas de acordo com os métodos descritos no Exemplo 23.
[001004] Em algumas modalidades do método descrito acima, é provido um método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs que compreende: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor
489 / 509 ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 e opcionalmente compreendendo um anticorpo agonista de 4-1BB durante cerca de 2 a 5 dias; (d) adicionar OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 1 a 3 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema; (e) repousar a segunda população de TILs durante cerca de 1 dia; (f) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com IL-2 adicional, opcionalmente anticorpo OKT-3, opcionalmente um anticorpo OX40, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 11 dias para obter a terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que as transições da etapa (c) para a etapa (f) ocorrem sem abrir o sistema; (g) colocar a segunda população de TILs durante qualquer uma das etapas (d), (e), e/ou (f), incluindo entre dias 11 e 21, em contato com pelo menos um sd-RNA, em que o sd-RNA é adicionado a uma concentração de 0,1 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 0,5 μM de sd-RNA/10.000
490 / 509 TILs/100 μL de meio, 0,75 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1,25 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 2 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, ou 10 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, e em que o sd-RNA é para inibir a expressão de uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, e combinações das mesmas; (h) opcionalmente realizar uma etapa de eletroporação estéril na segunda população de TILs, em que a etapa de eletroporação estéril medeia a transferência do pelo menos um sd-RNA; (i) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapas (g) ou (h) para prover uma população colhida de TILs, em que as transições da etapa (g) para a etapa (i) ocorrem sem abrir o sistema, a população colhida de TILs é uma população terapêutica de TILs; (j) transferir a população colhida de TILs da etapa (i) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (i) para a etapa (j) ocorre sem abrir o sistema; e (k) criopreservar a população colhida de TILs usando um meio de criopreservação baseado em sulfóxido dimetílico.
[001005] Em algumas modalidades variantes, as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína compreendem sd- RNAs, incluindo, por exemplo, mas não se limitando a, sd-rxRNAs. Em algumas modalidades, os TILs são expostos aos sd-RNAs no Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd- RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos
491 / 509 dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[001006] Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 70% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 75% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 80% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 85% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd- RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 90% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 95% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 99% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM a cerca de 10 µM, em algumas modalidades, cerca de 0,25 µM a cerca de 4 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd- RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,5 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,75 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA
492 / 509 usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração
493 / 509 de cerca de 4,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 5,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 6,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 7,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 8,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 9,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 10,0 µM. Em qualquer uma das modalidades supracitadas, as concentrações especificadas podem ser determinadas com respeito ao meio de cultura de TIL antes ou depois da troca de meio.
[001007] Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 70% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 75% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 80% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 85% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 90% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 95% na expressão de PD-1. Em algumas
494 / 509 modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 99% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,25 µM a cerca de 10 µM, em algumas modalidades, cerca de 0,25 µM a cerca de 4 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD- 1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando
495 / 509 distribuída a uma concentração de cerca de 2,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 4,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 5,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 6,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 7,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 8,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 9,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas
496 / 509 na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 10,0 µM. Em qualquer uma das modalidades supracitadas, as concentrações especificadas podem ser determinadas com respeito ao meio de cultura de TIL antes ou depois da troca de meio.
[001008] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[001009] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[001010] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a
497 / 509 uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[001011] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[001012] Em algumas modalidades, o sd-RNA no Dia 11 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA, IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 14 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 17 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 21 é adicionado ao meio compreendendo sd- RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs
498 / 509 (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 14 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 17 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 21 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 14. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 17. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA é adicionado à mesma concentração no Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA é adicionado a uma concentração diferente no Dia 11, Dia 14, Dia 17 e/ou Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1. EXEMPLO 35: MODALIDADES VARIANTES DO EXEMPLO 23
[001013] De acordo com os métodos discutidos no Exemplo 23, os métodos de expandir TILs em combinação com alteração transiente de expressão de proteína são descritos. Este exemplo provê modalidades adicionalmente variadas de acordo com os métodos descritos no Exemplo 23.
[001014] Em algumas modalidades do método descrito acima, é provido um método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs que compreende: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 e opcionalmente compreendendo um anticorpo agonista de 4-1BB durante cerca de 2 a 5 dias; (d) adicionar OKT-3, para produzir uma segunda população de
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TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 1 a 3 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema; (e) repousar a segunda população de TILs durante cerca de 1 dia; (f) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com IL-2 adicional, opcionalmente anticorpo OKT-3, opcionalmente um anticorpo OX40, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 11 dias para obter a terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que a transição da etapa (e) para a etapa (f) ocorre sem abrir o sistema; (g) colocar a segunda população de TILs durante qualquer uma das etapas (d), (e), e/ou (f), incluindo entre dias 11 e 21, em contato com pelo menos um sd-RNA, em que o sd-RNA é adicionado a uma concentração de 0,1 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 0,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 0,75 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1,25 μM de sd- RNA/10.000 TILs, 1,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 2 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, ou 10 μM de sd-RNA/10.000 TILs, e em que o sd-RNA é para inibir a expressão de uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, e combinações das mesmas; (h) opcionalmente realizar uma etapa de eletroporação estéril na segunda população de TILs, em que a etapa de eletroporação estéril
500 / 509 medeia a transferência do pelo menos um sd-RNA; (i) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapas (g) ou (h) para prover uma população colhida de TILs, em que as transições da etapa (e) para a etapa (h) ocorrem sem abrir o sistema, a população colhida de TILs é uma população terapêutica de TILs; (j) transferir a população colhida de TILs da etapa (i) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (h) para a etapa (i) ocorre sem abrir o sistema; e (k) criopreservar a população colhida de TILs usando um meio de criopreservação baseado em sulfóxido dimetílico.
[001015] Em algumas modalidades variantes, as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína compreendem sd- RNAs, incluindo, por exemplo, mas não se limitando a, sd-rxRNAs. Em algumas modalidades, os TILs são expostos aos sd-RNAs no Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd- RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[001016] Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 70% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 75% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 80% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 85% em expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, as sequências de sd-
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RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 90% em expressão do gene alvo.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 95% em expressão do gene alvo.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 99% em expressão do gene alvo.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM a cerca de 10 µM, em algumas modalidades, cerca de 0,25 µM a cerca de 4 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd- RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 0,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 1,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA
502 / 509 usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 2,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 3,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 4,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 5,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 6,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 7,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração
503 / 509 de cerca de 8,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 9,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução em expressão do gene alvo quando distribuídas a uma concentração de cerca de 10,0 µM. Em qualquer uma das modalidades supracitadas, as concentrações especificadas podem ser determinadas com respeito ao meio de cultura de TIL antes ou depois da troca de meio.
[001017] Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 70% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 75% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 80% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 85% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 90% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 95% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução de 99% na expressão de PD-1. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,25 µM a cerca de 10 µM, em algumas modalidades, cerca de 0,25 µM a cerca de 4 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,25 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,5
504 / 509 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 0,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD- 1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 1,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,5 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 2,75 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,0 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,25 µM.
Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando
505 / 509 distribuída a uma concentração de cerca de 3,5 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 3,75 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 4,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 5,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 6,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 7,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 8,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 9,0 µM. Em algumas modalidades, as sequências de sd-RNA usadas na invenção apresentam uma redução na expressão de PD-1 quando distribuída a uma concentração de cerca de 10,0 µM. Em qualquer uma das modalidades supracitadas, as concentrações especificadas podem ser determinadas com respeito ao meio de cultura de TIL antes ou depois da troca de meio.
[001018] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de
506 / 509 sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 0,75 µM a cerca de 3 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[001019] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,0 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[001020] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 1,5 µM a cerca de 2,5 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[001021] Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos
507 / 509 sd-RNAs em pelo menos dois dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em pelo menos três dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e/ou Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, os TILs são expostos aos sd-RNAs em todos dentre Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21 a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades variantes, o sd-RNA é adicionado junto com uma troca de meio a uma concentração de sd-RNA de cerca de 2 µM. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[001022] Em algumas modalidades, o sd-RNA no Dia 11 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA, IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 14 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 17 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 21 é adicionado ao meio compreendendo sd- RNA e opcionalmente inclui um ou mais dentre IL-2, OKT3 e APCs (incluindo, por exemplo, PBMCs). Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 14 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 17 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, o sd-RNA adicionado no Dia 21 é adicionado ao meio compreendendo sd-RNA e IL-2. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 14. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 17. Em algumas modalidades, mais sd-RNA é adicionado no Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA é adicionado à mesma concentração no Dia 11, Dia 14, Dia 17, e Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA é adicionado a
508 / 509 uma concentração diferente no Dia 11, Dia 14, Dia 17 e/ou Dia 21. Em algumas modalidades, o sd-RNA tem como alvo PD-1.
[001023] Os exemplos descritos acima são providos para fornecer àquelas pessoas versadas na técnica uma descrição completa e uma descrição completa de como preparar e usar as modalidades das composições, dos sistemas e dos métodos da invenção, e não são pretendidas para limitarem o escopo do que os inventores consideram como a invenção deles. Modificações dos modos descritos acima para realização da invenção que são óbvias para as pessoas versadas na técnica são pretendidas para estarem dentro do escopo das reivindicações a seguir. Todas as patentes e publicações mencionadas no relatório descritivo são indicativas dos níveis de conhecimento daquelas pessoas versadas na técnica à qual pertence a invenção.
[001024] Todos os cabeçalhos e designações de seção são usados apenas para propósitos de clareza e de referência e não são considerados em nenhuma maneira como limitadores. Por exemplo, aquelas pessoas versadas na técnica reconhecerão a utilidade da combinação de vários aspectos dos diferentes cabeçalhos e das diferentes seções, conforme apropriado, de acordo com o espírito e o escopo da invenção aqui descrita.
[001025] Todas as referências aqui citadas são pelo presente documento aqui incorporadas em suas totalidades como referências e para todos os propósitos na mesma extensão como se cada publicação ou patente ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicada(o) para ser incorporada(o) como referência em sua totalidade para todos os propósitos.
[001026] Muitas modificações e variações deste pedido podem ser feitas sem se desviarem de seus espírito e escopo, como será evidente para aquelas pessoas versadas na técnica. As modalidades específicas e os exemplos específicos aqui descritos(as) são oferecidos(as) apenas à guisa de exemplo, e o pedido não é para ser limitado apenas pelos termos das reivindicações
509 / 509 anexadas, juntamente com o escopo completo de equivalentes aos quais as reivindicações têm direito.

Claims (70)

1 / 26 REIVINDICAÇÕES
1. Método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente; (ii) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2, e opcionalmente OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs; (iii) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com IL-2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs) adicionais, para produzir uma terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é pelo menos 100 vezes maior em número que a segunda população de TILs, e em que a segunda expansão é realizada durante pelo menos 14 dias com o propósito de obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs; e (iv) expor a segunda e/ou terceira população de TILs aos fatores de transcrição (TFs) e/ou a outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína, em que os TFs e/ou as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína proveem expressão alterada de antígenos de tumor e/ou uma alteração no número de células-T específicas para antígenos de tumor na população terapêutica de TILs.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente: (v) realizar uma segunda expansão adicional antes ou depois da etapa (iv) pela suplementação do meio de cultura de células da terceira população de TILs com IL-2 adicional, OKT-3 adicional, e APCs adicionais,
2 / 26 em que a segunda expansão adicional é realizada durante pelo menos 14 dias para obter uma população terapêutica de TILs maior que a obtida na etapa (iii), em que a população terapêutica maior de TILs apresenta uma alteração no número de células-T específicas para antígenos de tumor.
3. Método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2, e opcionalmente OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3 a 14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (b) para a etapa (c) ocorre sem abrir o sistema; (d) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com IL-2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs) adicionais, para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema;
3 / 26 (e) expor a segunda e/ou terceira população de TILs aos fatores de transcrição (TFs) e/ou a outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína, em que os TFs e/ou as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína proveem expressão alterada de antígenos de tumor e/ou uma alteração no número de células-T específicas para antígenos de tumor na população terapêutica de TILs; (f) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (d), em que a transição da etapa (d) para a etapa (e) ocorre sem abrir o sistema; e (g) transferir a população colhida de TIL da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (e) para a etapa (f) ocorre sem abrir o sistema.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de criopreservar a bolsa de infusão compreendendo a população colhida de TIL na etapa (f) usando um processo de criopreservação.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o processo de criopreservação é realizado usando uma razão de 1:1 entre a população colhida de TIL e o meio de criopreservação.
6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as células apresentadoras de antígenos são células mononucleares do sangue periférico (PBMCs).
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que as PBMCs são irradiadas e alogeneicas.
8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que as PBMCs são adicionadas à cultura de células em qualquer um dos dias 9 até 14 na etapa (d).
9. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que as células apresentadoras de antígenos são células apresentadoras
4 / 26 de antígenos artificiais.
10. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a colheita na etapa (e) é realizada usando um sistema de processamento de células baseado em membrana.
11. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a colheita na etapa (e) é realizada usando um sistema de processamento de células LOVO.
12. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os múltiplos fragmentos compreendem de cerca de 4 a cerca de 50 fragmentos, em que cada fragmento tem um volume de cerca de 27 mm3.
13. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os múltiplos fragmentos compreendem de cerca de 30 a cerca de 60 fragmentos com um volume total de cerca de 1.300 mm3 a cerca de
1.500 mm3.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que os múltiplos fragmentos compreendem de cerca de 50 fragmentos com um volume total de cerca de 1.350 mm3.
15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os múltiplos fragmentos compreendem de cerca de 50 fragmentos com uma massa total de cerca de 1 grama a cerca de 1,5 gramas.
16. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura de células é provido em um recipiente selecionado a partir do grupo consistindo em um recipiente-G e uma bolsa de células Xuri.
17. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura de células na etapa (d) compreende adicionalmente IL-15 e/ou IL-21.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1
5 / 26 a 17, caracterizado pelo fato de que a concentração de Il-2 é cerca de 10.000 UI/mL a cerca de 5.000 UI/mL.
19. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a concentração de IL-15 é de cerca de 500 UI/mL a cerca de 100 UI/mL.
20. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a concentração de IL-12 é de cerca de 20 UI/mL a cerca de 0,5 UI/mL.
21. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a bolsa de infusão na etapa (f) é uma bolsa de infusão contendo HypoThermosol.
22. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o meio de criopreservação compreende sulfóxido dimetílico (DMSO).
23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o meio de criopreservação compreende 7% a 10% de DMSO.
24. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o primeiro período na etapa (c) e o segundo período na etapa (e) são, cada um, independentemente, realizados dentro de um período de 10 dias, 11 dias, ou 12 dias.
25. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o primeiro período na etapa (c) e o segundo período na etapa (e) são, cada um, independentemente, realizados dentro de um período de 11 dias.
26. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 22 dias.
27. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de
6 / 26 cerca de 20 dias a cerca de 22 dias.
28. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 15 dias a cerca de 20 dias.
29. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 20 dias.
30. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 15 dias.
31. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as etapas (a) até (f) são realizadas em 22 dias ou menos.
32. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as etapas (a) até (f) são realizadas em 20 dias ou menos.
33. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as etapas (a) até (f) são realizadas em 15 dias ou menos.
34. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as etapas (a) até (f) são realizadas em 10 dias ou menos.
35. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que as etapas (a) até (f) e a criopreservação são realizadas em 22 dias ou menos.
36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 35, caracterizado pelo fato de que a população terapêutica de TILs colhida na etapa (e) compreende TILs suficientes para uma dosagem terapeuticamente eficaz dos TILs.
37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o número de TILs suficientes para uma dosagem terapeuticamente eficaz é de cerca de 2,3×1010 a cerca de 13,7×1010.
38. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3
7 / 26 a 37, caracterizado pelo fato de que as etapas (b) até (e) são realizadas em um recipiente único, em que a realização das etapas (b) até (e) em um recipiente único resulta em um aumento no rendimento de TIL por tumor resseccionado em comparação com a realização das etapas (b) até (e) em mais que um recipiente.
39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 38, caracterizado pelo fato de que as células apresentadoras de antígenos são adicionadas aos TILs durante o segundo período na etapa (d) sem abrir o sistema.
40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 39, caracterizado pelo fato de que a terceira população de TILs na etapa (d) provê uma produção de interferon-gama de pelo menos 5 vezes ou mais quando administrada a um indivíduo.
41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 40, caracterizado pelo fato de que o risco de contaminação microbiana é reduzido em comparação com um sistema aberto.
42. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 41, caracterizado pelo fato de que os TILs da etapa (f) ou (g) são infundidos em um paciente.
43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 42, caracterizado pelo fato de que os múltiplos fragmentos compreendem cerca de 4 fragmentos.
44. Método para tratar um indivíduo com câncer, caracterizado o método pelo fato de que compreende administrar linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) expandidos compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor resseccionado de um indivíduo pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado;
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(c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2, e opcionalmente OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3 a 14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (b) para a etapa (c) ocorre sem abrir o sistema; (d) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com adicionais IL- 2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema; (e) expor a segunda e/ou terceira população de TILs aos fatores de transcrição (TFs) e/ou a outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína, em que os TFs e/ou as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína proveem expressão aumentada de antígenos de tumor e/ou um aumento no número de células-T específicas para antígenos de tumor na população terapêutica de TILs; (f) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (d), em que a transição da etapa (d) para a etapa (e) ocorre sem abrir o sistema; e (g) transferir a população colhida de TIL da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (e) para a etapa (f) ocorre sem
9 / 26 abrir o sistema; (h) opcionalmente criopreservar a bolsa de infusão compreendendo a população colhida de TIL da etapa (f) usando um processo de criopreservação; e (i) administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz da terceira população de TILs da bolsa de infusão na etapa (g) ao paciente.
45. População de linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) expandidos para uso no tratamento de um indivíduo com câncer, caracterizada pelo fato de que a população de TILs expandidos é uma terceira população de TILs obtenível por um método compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor resseccionado de um indivíduo pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2, e opcionalmente OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3 a 14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (b) para a etapa (c) ocorre sem abrir o sistema; (d) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com adicionais IL- 2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs, em que a segunda
10 / 26 expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema; (e) expor a segunda e/ou terceira população de TILs aos fatores de transcrição (TFs) e/ou a outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína, em que os TFs e/ou as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína proveem expressão aumentada de antígenos de tumor e/ou um aumento no número de células-T específicas para antígenos de tumor na população terapêutica de TILs; (f) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (d), em que a transição da etapa (e) para a etapa (f) ocorre sem abrir o sistema; e (g) transferir a população colhida de TIL da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (f) para a etapa (g) ocorre sem abrir o sistema; e (h) opcionalmente criopreservar a bolsa de infusão compreendendo a população colhida de TIL da etapa (f) usando um processo de criopreservação.
46. População de linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) para uso para tratar um indivíduo com câncer como definido na reivindicação 44 ou 45, caracterizada pelo fato de que o método compreende adicionalmente uma ou mais das características como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 43.
47. Método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs, caracterizado pelo fato de que compreende expor TILs aos fatores de transcrição (TFs) e/ou a outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína com o propósito de gerar uma população terapêutica de TILs, em que os TFs e/ou as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína
11 / 26 proveem expressão aumentada de antígenos de tumor e/ou um aumento no número de células-T específicas para antígenos de tumor na população terapêutica de TILs.
48. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 47, caracterizado pelo fato de que a alteração transiente de expressão de proteína resulta em indução de expressão de proteína.
49. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 48, caracterizado pelo fato de que a alteração transiente de expressão de proteína resulta em uma redução de expressão de proteína.
50. Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que um ou mais sd-RNA(s) é utilizado para reduzir a expressão transiente de proteína.
51. Método para avaliar fatores de transcrição (TFs) e/ou outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína, caracterizado pelo fato de que o método compreende expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs, expor os TILs aos fatores de transcrição (TFs) e/ou a outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína com o propósito de gerar uma população terapêutica de TILs, em que os TFs e/ou as outras moléculas capazes de transientemente alterar a expressão de proteína proveem expressão alterada de antígenos de tumor e/ou uma alteração no número de células-T específicas para antígenos de tumor na população terapêutica de TILs.
52. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 51, caracterizado pelo fato de que a alteração transiente de expressão de proteína tem como alvo um gene selecionado a partir do grupo consistindo em PD-1, TGFBR2, CBLB (CBL-B), CISH, CCRs (receptores coestimulatórios quiméricos), IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, NOTCH 1/2 ICD, TIM3, LAG3, TIGIT, TGFβ, CCR2, CCR4, CCR5, CXCR1, CXCR2, CSCR3, CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP1-β), CCL5 (RANTES),
12 / 26 CXCL1/CXCL8, CCL22, CCL17, CXCL1/CXCL8, VHL, CD44, PIK3CD, SOCS1, e proteína-quinase A (PKA) dependente de cAMP.
53. Método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 e opcionalmente compreendendo um anticorpo agonista de 4-1BB durante cerca de 2 a 5 dias; (d) adicionar OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 1 a 3 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema; (e) realizar uma etapa de eletroporação estéril na segunda população de TILs, em que a etapa de eletroporação estéril medeia a transferência de pelo menos um RNA interferente curto ou um RNA mensageiro; (f) repousar a segunda população de TILs durante cerca de 1 dia; (g) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com IL-2 adicional, opcionalmente anticorpo OKT-3, opcionalmente um anticorpo OX40, e
13 / 26 células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 11 dias para obter a terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que a transição da etapa (f) para a etapa (g) ocorre sem abrir o sistema; (h) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (g) para prover uma população colhida de TIL, em que a transição da etapa (g) para a etapa (h) ocorre sem abrir o sistema, em que a população colhida de TILs é uma população terapêutica de TILs; (i) transferir a população colhida de TIL da etapa (h) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (h) para a etapa (i) ocorre sem abrir o sistema; e (j) criopreservar a população colhida de TIL usando um meio de criopreservação baseado em sulfóxido dimetílico, em que a etapa de eletroporação estéril compreende a distribuição de um RNA interferente curto para inibir a expressão de uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), e combinações das mesmas.
54. Método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 e
14 / 26 opcionalmente compreendendo um anticorpo agonista de 4-1BB durante cerca de 2 a 5 dias; (d) adicionar OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 1 a 3 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema; (e) realizar uma etapa de eletroporação estéril ou uma etapa de disrupção de membrana microfluídica SQZ na segunda população de TILs, em que a etapa de eletroporação estéril ou a etapa de disrupção de membrana microfluídica SQZ medeia a transferência de pelo menos um RNA interferente curto ou um RNA mensageiro; (f) repousar a segunda população de TILs durante cerca de 1 dia; (g) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com IL-2 adicional, opcionalmente anticorpo OKT-3, opcionalmente um anticorpo OX40, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 11 dias para obter a terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que a transição da etapa (f) para a etapa (g) ocorre sem abrir o sistema; (h) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (g) para prover uma população colhida de TILs, em que a transição da etapa (g) para a etapa (h) ocorre sem abrir o sistema, em que a população colhida de TILs é uma população terapêutica de TILs;
15 / 26 (i) transferir a população colhida de TIL da etapa (h) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (h) para a etapa (i) ocorre sem abrir o sistema; e (j) criopreservar a população colhida de TIL usando um meio de criopreservação baseado em sulfóxido dimetílico, em que a etapa de eletroporação compreende a distribuição de um RNA interferente curto para inibir a expressão de uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), e combinações das mesmas, e adicionalmente em que a molécula de adesão selecionada a partir do grupo consistindo em CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1, e combinações das mesmas é inserida por um método gamarretroviral ou lentiviral na primeira população de TILs, segunda população de TILs, ou população colhida de TILs.
55. Método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 e opcionalmente compreendendo um anticorpo agonista de 4-1BB durante cerca de 2 a 5 dias; (d) adicionar OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 1 a 3 dias para obter a segunda
16 / 26 população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema; (e) realizar uma etapa de eletroporação estéril na segunda população de TILs, em que a etapa de eletroporação estéril medeia a transferência de pelo menos um RNA interferente curto ou um RNA mensageiro; (f) repousar a segunda população de TILs durante cerca de 1 dia; (g) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com IL-2 adicional, opcionalmente anticorpo OKT-3, opcionalmente um anticorpo OX40, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 11 dias para obter a terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que a transição da etapa (f) para a etapa (g) ocorre sem abrir o sistema; (h) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (g) para prover uma população colhida de TIL, em que a transição da etapa (g) para a etapa (h) ocorre sem abrir o sistema, em que a população colhida de TILs é uma população terapêutica de TILs; (i) transferir a população colhida de TIL da etapa (h) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (h) para a etapa (i) ocorre sem abrir o sistema; e (j) criopreservar a população colhida de TIL usando um meio de criopreservação baseado em sulfóxido dimetílico, em que a etapa de eletroporação estéril compreende a distribuição de um RNA interferente curto para inibir a expressão de uma
17 / 26 molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, e combinações das mesmas.
56. Método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 e opcionalmente compreendendo um anticorpo agonista de 4-1BB durante cerca de 2 a 5 dias; (d) colocar a primeira população de TILs em contato com pelo menos um sd-RNA, em que o sd-RNA é adicionado a uma concentração de 0,1 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 0,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 0,75 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1,25 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 2 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, ou 10 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, e em que o sd-RNA é para inibir a expressão de uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, e combinações das mesmas; (e) opcionalmente realizar uma etapa de eletroporação estéril na primeira população de TILs, em que a etapa de eletroporação estéril medeia a transferência do pelo menos um sd-RNA; (f) adicionar OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que
18 / 26 provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 1 a 3 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que as transições da etapa (c) para a etapa (f) ocorrem sem abrir o sistema; (g) repousar a segunda população de TILs durante cerca de 1 dia; (h) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com IL-2 adicional, opcionalmente anticorpo OKT-3, opcionalmente um anticorpo OX40, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 11 dias para obter a terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que as transições da etapa (c) para a etapa (h) ocorrem sem abrir o sistema; (i) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (h) para prover uma população colhida de TIL, em que a transição da etapa (h) para a etapa (i) ocorre sem abrir o sistema, em que a população colhida de TILs é uma população terapêutica de TILs; (j) transferir a população colhida de TIL da etapa (i) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (i) para a etapa (j) ocorre sem abrir o sistema; e (k) criopreservar a população colhida de TIL usando um meio de criopreservação baseado em sulfóxido dimetílico.
57. Método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor
19 / 26 ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 e opcionalmente compreendendo um anticorpo agonista de 4-1BB durante cerca de 2 a 5 dias; (d) colocar a primeira população de TILs em contato com pelo menos um sd-RNA, em que o sd-RNA é adicionado a uma concentração de 0,1 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 0,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 0,75 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1,25 μM de sd- RNA/10.000 TILs, 1,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 2 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, ou 10 μM de sd-RNA/10.000 TILs, e em que o sd-RNA é para inibir a expressão de uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, e combinações das mesmas; (e) opcionalmente realizar uma etapa de eletroporação estéril na primeira população de TILs, em que a etapa de eletroporação estéril medeia a transferência do pelo menos um sd-RNA; (f) adicionar OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 1 a 3 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que as transições da etapa (c) para a etapa (f) ocorrem sem abrir o sistema; (g) repousar a segunda população de TILs durante cerca de 1 dia; (h) realizar uma segunda expansão pela suplementação do
20 / 26 meio de cultura de células da segunda população de TILs com IL-2 adicional, opcionalmente anticorpo OKT-3, opcionalmente um anticorpo OX40, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 11 dias para obter a terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que a transição da etapa (g) para a etapa (h) ocorre sem abrir o sistema; (i) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (h) para prover uma população colhida de TIL, em que a transição da etapa (h) para a etapa (i) ocorre sem abrir o sistema, em que a população colhida de TILs é uma população terapêutica de TILs; (j) transferir a população colhida de TIL da etapa (i) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (i) para a etapa (j) ocorre sem abrir o sistema; e (k) criopreservar a população colhida de TIL usando um meio de criopreservação baseado em sulfóxido dimetílico.
58. Método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 e opcionalmente compreendendo um anticorpo agonista de 4-1BB durante cerca de 2 a 5 dias; (d) adicionar OKT-3, para produzir uma segunda população de
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TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 1 a 3 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema; (e) repousar a segunda população de TILs durante cerca de 1 dia; (f) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com IL-2 adicional, opcionalmente anticorpo OKT-3, opcionalmente um anticorpo OX40, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 11 dias para obter a terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que as transições da etapa (c) para a etapa (f) ocorrem sem abrir o sistema; (g) colocar a segunda população de TILs durante qualquer uma das etapas (d), (e), e/ou (f) em contato com pelo menos um sd-RNA, em que o sd-RNA é adicionado a uma concentração de 0,1 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 0,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 0,75 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1,25 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 1,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 2 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, 5 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, ou 10 μM de sd-RNA/10.000 TILs/100 μL de meio, e em que o sd-RNA é para inibir a expressão de uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, e combinações das mesmas; (h) opcionalmente realizar uma etapa de eletroporação estéril
22 / 26 na segunda população de TILs, em que a etapa de eletroporação estéril medeia a transferência do pelo menos um sd-RNA; (i) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (g) ou (h) para prover uma população colhida de TIL, em que as transições da etapa (g) para a etapa (i) ocorrem sem abrir o sistema, em que a população colhida de TILs é uma população terapêutica de TILs; (j) transferir a população colhida de TIL da etapa (i) para uma bolsa de infusão, em que a transição da etapa (i) para a etapa (j) ocorre sem abrir o sistema; e (k) criopreservar a população colhida de TIL usando um meio de criopreservação baseado em sulfóxido dimetílico.
59. Método para expandir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em uma população terapêutica de TILs, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor ressecionado de um paciente pelo processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em múltiplos fragmentos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor a um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão pela cultura da primeira população de TILs em um meio de cultura de células compreendendo IL-2 e opcionalmente compreendendo um anticorpo agonista de 4-1BB durante cerca de 2 a 5 dias; (d) adicionar OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma primeira área superficial permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 1 a 3 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número que a primeira população de TILs, e em que a transição da etapa (c) para a etapa (d) ocorre sem abrir o sistema;
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(e) repousar a segunda população de TILs durante cerca de 1 dia; (f) realizar uma segunda expansão pela suplementação do meio de cultura de células da segunda população de TILs com IL-2 adicional, opcionalmente anticorpo OKT-3, opcionalmente um anticorpo OX40, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7 a 11 dias para obter a terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado que provê uma segunda área superficial permeável a gás, e em que a transição da etapa (e) para a etapa (f) ocorre sem abrir o sistema; (g) colocar a segunda população de TILs durante qualquer uma das etapas (d), (e), e/ou (f) em contato com pelo menos um sd-RNA, em que o sd-RNA é adicionado a uma concentração de 0,1 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 0,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 0,75 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1,25 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 1,5 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 2 μM de sd-RNA/10.000 TILs, 5 μM de sd- RNA/10.000 TILs, ou 10 μM de sd-RNA/10.000 TILs, e em que o sd-RNA é para inibir a expressão de uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB, e combinações das mesmas; (h) opcionalmente realizar uma etapa de eletroporação estéril na segunda população de TILs, em que a etapa de eletroporação estéril medeia a transferência do pelo menos um sd-RNA; (i) colher a população terapêutica de TILs obtida da etapa (g) ou (h) para prover uma população colhida de TIL, em que as transições da etapa (e) para a etapa (h) ocorrem sem abrir o sistema, a população colhida de TILs é uma população terapêutica de TILs; (j) transferir a população colhida de TIL da etapa (i) para uma
24 / 26 bolsa de infusão, em que a transição da etapa (h) para a etapa (i) ocorre sem abrir o sistema; e (k) criopreservar a população colhida de TIL usando um meio de criopreservação baseado em sulfóxido dimetílico.
60. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 59, caracterizado pelo fato de que o sd-RNA é adicionado à primeira população de células duas vezes por dia, um vez por dia, a cada dois dias, a cada três dias, a cada quatro dias, a cada cinco dias, a cada seis dias, ou a cada sete dias durante o primeiro período de expansão.
61. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 59, caracterizado pelo fato de que o sd-RNA é adicionado à segunda população de células duas vezes por dia, um vez por dia, a cada dois dias, a cada três dias, a cada quatro dias, a cada cinco dias, a cada seis dias, ou a cada sete dias durante o primeiro período de expansão.
62. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 61, caracterizado pelo fato de que dois sd-RNAs são adicionados para inibir a expressão de duas moléculas selecionadas a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB.
63. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 61, caracterizado pelo fato de que dois sd-RNAs são adicionados para inibir a expressão de duas moléculas, em que as duas moléculas são selecionadas a partir do grupo consistindo em: i. PD-1 e LAG-3, ii. PD-1 e TIM-3, iii. PD-1 e CISH, iv. PD-1 e CBLB, v. LAG-3 e TIM-3, vi. LAG-3 e CISH, vii. LAG-3 e CBLB,
25 / 26 viii. TIM-3 e CISH, ix. TIM-3 e CBLB, e x. CISH e CBLB.
64. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 62, caracterizado pelo fato de que mais que dois sd-RNAs são adicionados para inibir a expressão de mais que duas moléculas selecionadas a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB.
65. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 64, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB é reduzida em pelo menos 80%, 85%, 90%, ou 95% nos TILs colocados em contato com o pelo menos um sd-RNA.
66. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 64, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos uma molécula selecionada a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB é reduzida em pelo menos 80%, 85%, 90%, ou 95% durante pelo menos 12 horas, pelo menos 24 horas, ou pelo menos 48 horas, nos TILs colocados em contato com o pelo menos um sd-RNA.
67. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 64, caracterizado pelo fato de que os sd-RNAs são preparados por um método compreendendo realizar a transcrição in vitro a partir de um molde de DNA de fita dupla linear obtido pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e adequado para a transcrição in vitro do sd-RNA compreendendo de 5' a 3': um promotor de RNA-polimerase na fita codificante do DNA de fita dupla, uma região 5' não traduzida menor que 3.000 nucleotídeos em comprimento e eficaz para a tradução do mRNA em um polipeptídeo detectável após transfecção para dentro de uma célula eucariótica, uma matriz de leitura aberta que codifica o polipeptídeo, em que o polipeptídeo é heterólogo à célula a ser transfectada e em que o polipeptídeo é selecionado a partir do
26 / 26 grupo consistindo em um ligante ou um receptor de uma célula imune, um polipeptídeo que estimula ou inibe uma função do sistema imune, e um polipeptídeo que inibe a função de um polipeptídeo oncogênico, região-3' não traduzida eficaz para a tradução do mRNA em um polipeptídeo detectável após transfecção para dentro de uma célula eucariótica, e um trecho de poli(A) de 50-5.000 nucleotídeos na fita codificante do DNA de fita dupla, em que o promotor é heterólogo à matriz de leitura aberta, e em que o molde de DNA não está contido dentro de um vetor de DNA e termina com a extremidade 3' do trecho de poli(A).
68. Método de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que o promotor de RNA-polimerase compreende uma sequência consenso de ligação para uma RNA-polimerase selecionada a partir do grupo consistindo em T7, T3 ou SP6 RNA-polimerase.
69. Método de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que a matriz de leitura aberta codifica um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo em PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, e CBLB.
70. Método de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que o molde de DNA de fita dupla linear adicionalmente compreende um sítio de entrada ribossomal interno.
Processo 2A-Processo de 22 Dias, Colheita/Expedição 2-3 Dias Petição 870200103668, de 18/08/2020, pág. 543/606 Diâmetro Fragmentos De um dia G-Rex 100m ≤1,5 cm de 1-3 mm² para o outro Fechado TILs em massa Excisar 40 Fragmentos (5-200M) Tumor
P
O GM 1/62
ÇÃ DE Cultura de TIL Inicial (Pre-REP) = 11d Direcionar para
ICA ÇÃO REP-Dia 11
R Protocolo de Expansão Rápida (REP) = 11d
B
INS
FA TALA Descongelar Colheita e Infundir + IL2 LOVO- G-Rex 500m Crioexpedidor Congelar em Dia 22 Fechado-Dia Cocultura de TIL e Programado Alíquotas em LN2 16 Separação Células Alimentadoras Figura 1
Desenvolvimento de Processo Etapa Processo Atual-1 C Processo Novo-2A Influência Aumenta Amostra/Recipiente 4 Fragmentos/10 G-Rex 40 Fragmentos/1-G-Rex de Tumor, Encurta Cultura, 10-21 Dias 100 CS- (x2?) Reduz Etapas, Tratável em 11 Dias Sistema Fechado Congelar PreREP→Testar→Descongelar- Direcionar para REP Processo Encurtado, Reduz ~Dia 27→4e6TIL ~Dia 11-<20e6 Etapas, Elimina Teste 36 G-Rex 100-~Dia 30 4-5 G-Rex 500CS-TIL- Reduz Etapas, Sistema >5e6TIL - Separar-Dia 36 Separar Dia 16 Fechado, REP Encurtado Colheita ~>43 Dias Colheita Dia 22 Reduz Etapas, Automatizado, Colheita Por Lavador de Células Sistema Fechado Centrifugação Automático-LOVO Flexibilidade de Expedição, Bolsa de Infusão Única- Produto Criopreservado- Programação de Paciente, Produto Fresco- CS10 em LN2, Múltiplas Teste de Liberação Mais Hypothermosol Alíquotas Fácil, Testes Globais Tempo de Processo Retorno (Turnaround) para Paciente, Tempo de Processo >43 Dias de 22 Dias Produtividade Operacional (Throughput) de Sala Limpa, COGs Fragmentos De um dia para o outro de 2-3 mm² TIL em massa > 1x108 Cultura Inicial de TIL (Pre-REP) 1-3 Semanas Congelar
INSTALAÇÃO DE
FABRICAÇÃO GMP Protocolo de Expansão Rápida (REP) 2 Semanas Testar Descongelar Centrifugar G-Rex 100m (36 Frascos) Cocultura deTIL Bolsa de Infusão Expandir e de Células Rápido para Alimentadoras 1,5-150x109 Figura 2
Linha do Tempo - Processo 1C - Processo Atual
Liberação:
Petição 870200103668, de 18/08/2020, pág. 545/606 Cepa Gram Dia 7 Esterilidade Dia 7 Micoplasma Dia 14 Endotoxina REP Dia 14 Dia 14 Contagem CD3 REP Dia 7 Colheita Separação (Esterilidade, (Esterilidade, Micoplasma, Micoplasma, Contagem CD3, Alimentação/ Iniciação Contagem Cepa Gram, Alimentação/ Colheita REP Colheita Alimentação/ Descongelar Células) Endotoxina) 3/62
Alimentação/ Colheita Colheita REP Cirurgia Alimentação Reinfundir
Expedição Testar PreREP Iniciação (Fenótipo, Relatar PreREP Esterilidade) ao Sítio Quimioterapia de linfodepleção
Figura 3
Linha do Tempo de Terapia com TIL - v2A - Dia 16 REP >250e6
Petição 870200103668, de 18/08/2020, pág. 546/606 Liberação: Cepa Gram Dia 6 REP contagem >250e6 REP Dia 11 Dia 6 Esterilidade REP Dia 6 Colheita Dia 6 Micoplasma Separação (Esterilidade, Dia 11 Endotoxina (Esterilidade, Micoplasma, Dia 11 Contagem CD3 Micoplasma, Contagem CD3, Iniciação Contagem Cepa Gram, REP de Células) Endotoxina) Cirurgia 4/62
Reinfundir
Interleucina-2 Expedição Iniciação Colheita Relatar preREP preREP ao Sítio Quimioterapia de linfodepleção
Tempo total da terapia (operação → infusão) = 25 dias
Figura 4
Linha do Tempo de Terapia com TIL - v2A - Dia 16 REP >250e6
Petição 870200103668, de 18/08/2020, pág. 547/606 Liberação: Cepa Gram Dia 6 REP contagem >250e6 REP Dia 11 Dia 6 Esterilidade Colheita Dia 6 Micoplasma REP Dia 6 (Esterilidade, Dia 11 Endotoxina Separação Micoplasma, Dia 11 Contagem CD3 (Esterilidade, Contagem CD3, Micoplasma, Iniciação Cepa Gram, Contagem REP Endotoxina) Cirurgia de Células) 5/62
Reinfundir
Colheita Relatar Iniciação preREP preREP ao Sítio
Quimioterapia de linfodepleção
Tempo total da terapia (cirurgia → infusão) = 31 dias
Figura 5
Extração de Dia-1 Tumor e Expedição Dia 16 Redução do Volume Chegada para 500mL Dia 0 de Tumor Filtrar TIL para pacote 40 Frag- de mentos transferência
IL de Tumor Contagem/ AOPI/ Viabilidade Cellometer de Células K2 Conc. Final
6.000 UI/mL Il-2 Sistema de Prep tampão Filtração de Tampão de lavagem de Lavagem Incubar 7 Membrana (PlasmaLyte Dias a LOVO A + 1% HSA) 37°C, 5% CO2 Formulação (50% produto LOVO, 50% CS10) Desc- Lavar ongelar Células Se9 células Dia 7 Aliment- alimentadoras Células alogeneicas Alimen- adoras irradiadas tadoras uma vez Congelador em CM2 Velocidade
CRF Alimentar Congelamento Programa 6 TIL em Controlada Conc. Final Frasco (CRF) 30 ng/mL GREX- 500M α-CD3 (OKT3) Armaze- namento Conc. Final Incubar de Longa
3.000 UI/mL 9 dias Duração IL-2 (LN2) Figura 6
Dia 0 - Isolamento Tecido de Tumor em de Tumor Hypothermosol+50µg/mL Meio de Transporte de Gentamicina +2,5µg/mL Amostra de Biocarga Anfotericina B HBSS + 50µg/mL Sulfato de Isolamento Gentamicina Fragmentos de Tumor 3x3x3mm Semear ≤1X CM1 6.000 UI/mL G-Rex 100MCS Permanecer IL-2 1L/Frasco ≤50 fragmentos/ Amostra Tecido frasco 1L/frasco Dia 11 Iniciação REP Remoção Meio BacT Esterilidade Consumido Amostra 10mL meio 1XG-Rex consumido/unidade 100M colhido Transferir Contagem e 10E06 TIL para pacote Viabilidade de Viável para de transferência citometria de de 1L Células NC-200 TVC≥40E06? fluxo CD3/CD45 Reduzir Volume Células Alimentadoras, TILs≤2x108 Irradiadas ≥2 doadores, excesso TIL: Volume variável 400xg 10 min 3 bolsas 2,5x109/bolsa ≤100mL Descongelar Células Alimentadoras 35-39°C Criopreservar excesso TIL 1E08 mL em CS10 1mL/frasco 500mL CM2 3.000 Agrupar Células Contagem e UI/mL Il-2, 150µg Alimentadoras Viabilidade de OKT3 5E09 células Células NC-200 viáveis 4,5L CM2 Semear 1x G-Rex500MCS
3.000 5x106-2x108 TIL 5x109 UI/mL IL-2 células alimentadoras/frasco REP PD Processo PFD Página 1/3 Figura 7B Figura 7A
Figura 7A Dia 16 - Separação da Cultura BacT Esterilidade Amostra Combinado meio consumido Amostragem de Amostras 5mL.
Meio Consumido de Meio e Remoção 1x Consumido G-Rex500M 25mL Micoplasma PCR Amostra Diluente Combinado meio consumido 10mL (x2)
*Armazenar TILs Transferir Agrupados em suspensão de células Contagem de incubadora quando para pacote Células TIL não necessários para de transferência NC-200 amostragem ou semeadura de 1L*
Micoplasma PCR Sim Não Amostra Remover TVC≥2,5E09 1x106 células (x2) Amostras QC
Continuar processamento, Notificar cliente
Separar e Semear ≤ 5X G-Rex 500MCS ≤ 5L/frasco CM4 3.000 UI/mL IL-2 #Frascos: TVC ÷ (1x109 TVC/frasco) arredondado para cima para o número inteiro mais próximo
Culturas de REP ≤ 5 G- Rex 500MCS
Figura 7C
REP PD Processo PFD Página 2/3
Figura 7B
Figura 7B Dia 22 - Colheita de REP Combinar Micoplasma Remover Meio sobrenadante sobrenadante, Consumido ≤ PCR bolsa(s) de Amostra 5xG-Rex 500MCS Bioprocesso Diluente de 10L
Bolsa de cultura de células de 3L (Origen EV2000 ou equivalente)
Contagem e Viabilidade de células, NC-200, 4x amostra de 1 mL
Tampão de Redução do Volume LOVO, Formular 1:1 Lavagem 2 Ciclos, concentração 10:1, com CS10 frio* PL-A + 1% HSA 4000 RPM, 75 mL/min
IL-2 300 Adicionar IL2 UI/mL
*Formular Bolsa de Produto em massa armazenada a 2-8°C Preparo de Frasco Satélite entre as etapas de Remover Amostras para Teste processamento Amostra em para Liberação QC e Ar Frasco Satélite (Micoplasma, Endotoxina, Aliquotar para dentro Criopreservada Esterilidade, Cepa Gram, de criobolsas CD750 10 x 0,5mL/frasco Contagem de Células, 90-120mL/bolsa Viabilidade, Citometria de Fluxo, INF-γ, Retenção) (20mL)
Enchimento Congelador com Velocidade manual 0,5mL/ de Congelamento Controlada, Perfil Pré-ajustado-6 frasco
Inspecionar visualmente
Armazenar em LN em fase vapor
REP PD Processo PFD Página 3/3 Expedir*
Figura 7C
Figura 8 Processo 2A: cerca de 22 dias a partir das Etapas A - E
ETAPA A Obter Amostra de Tumor de Paciente
ETAPA B Fragmentação e Primeira Expansão 3 dias a 14 dias
ETAPA C Transição da Primeira Expansão para a Segunda Expansão Não Armazenamento e Sistema Fechado
ETAPA D Segunda Expansão IL-2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos Sistema Fechado
ETAPA E Colheita de TILS da Etapa D Sistema Fechado
ETAPA F Formulação Final e/ou Transferência para Bolsa de Infusão (opcionalmente criopreservar)
Tumor chega
Pre-REP Dia 0
Colheita de Análise de IL-2 Sobrenadante Estudos de Durante Todo Metabólitos Pre-REP
Pre-REP Dia 11/ REP Dia 0
Colheita de Análise de Sobrenadante Citocinas, de Desfecho Estudos de Metabólitos
Congelar Células REP Dia 11
Ensaios Análise de Estendidos REP Fresco RePEP durante 7 dias
Contagem/Viabilidade de células, Fenótipo por Citometria de Fluxo, Ensaios Análise de Ensaio de Extermínio Estendidos reREP Fresco Indireto, Produção de IFN-γ e Granzima B, Sequenciamento de TCR, Metabolismo Celular
Descon- ReREP Ensaios Análise de gelamento durante Estendidos ReREP de Células 7dias descongelado
Figura 9
Petição 870200103668, de 18/08/2020, pág. 554/606 +IL-2 ou IL-2/IL-15/IL-21
TILs em massa
Cultura de Fragmentos de Tumor (Pre-REP) 11 dias Direcionar para Excisar 12/62
Expansão Rápida Tumor Expansão Rápida (REP) 11 dias
Cocultura de TIL e Células Alimentadoras
Figura 10
Petição 870200103668, de 18/08/2020, pág. 555/606 diâmetro Cortar em ≤4,0 cm Expedição expressa do fragmentos cultura TILs em massa Sítio Clínico para CMO ≤50 ex vivo Fragmentos Excisar Tumor
P
GM
ÃO
Ç ÃO DE
A Cultura de Fragmentos de Tumor (Pre-REP) 11 dias Direcionar
RIC
S para REP 13/62 Expansão Rápida (REP) 11 dias
IN
FAB TALAÇ Terapia de pré-condicionamento NMA-LD Colheita Descongelar, Congelar com Aumentar Velocidade de Cocultura de TIL e administração Expedição escala de expressa em Congelamento Células Alimentadoras por Infusão Expansão + IL-2 crioexpedidor Controlada Produto ex vivo de CMO para de Infusão LN-144 Sítio Clínico criopreservado em LN2 Figura 11
Petição 870200103668, de 18/08/2020, pág. 556/606 Biorreator diâmetro Fragmentos de uso único ≤4,0 cm de 8-27 mm³ ≤50 TILs em massa ≤96 horas fechado Fragmentos Excisar Tumor
P
D
GM
ÃO
ÃO E Direcionar
Ç Cultura de Fragmentos de Tumor (Pre-REP) 11 dias
A para 14/62
T Expansão
RIC Expansão Rápida (REP) 11 dias Rápida
INS
FAB ALAÇ Descongelar e Colher/Lavar/ infundir + IL-2 Aumentar Congelar Formular/Aliquotar Crioexpedidor Escala Cocultura de Alíquotas Semiautomatizados programado TIL e Células em LN2 Alimentadoras Figura 12
Figura 13 Processo 1C: 43-55 Dias para Etapas A-E Processo 2A: cerca de 22 dias a partir das Etapas A-E
ETAPA A ETAPA A Obter Amostra de Tumor de Paciente Obter Amostra de Tumor de Paciente
ETAPA B ETAPA B Fragmentação e Primeira Expansão Fragmentação e Primeira Expansão 11 dias a 21 dias 3 dias a 14 dias
ETAPA C ETAPA C Transição da Primeira Expansão para a Transição da Primeira Expansão para a Segunda Expansão Segunda Expansão Armazenamento Opcional até Seleção Não Armazenamento, e Sistema Fechado
ETAPA D ETAPA D Segunda Expansão Segunda Expansão IL-2, OKT-3, células alimentadoras IL-2, OKT-3, e células alimentadoras apresentadoras de antígenos apresentadoras de antígenos Opcionalmente repetir uma ou mais vezes Sistema Fechado
ETAPA E
ETAPA E Colheita de TILs da Etapa D Colheita de TILs da Etapa D Sistema Fechado
ETAPA F ETAPA F Formulação Final e/ou Transferência Formulação Final e/ou Transferência para Bolsa de Infusão para Bolsa de Infusão (opcionalmente criopreservar)
Figura 14 Modalidade de Modalidade de Etapa de Vantagens Processo 1C Processo 2A Processo
• 40 fragmentos por • Fragmentos de tumor aumentados • 4 fragmentos por 10 1 frasco GREX-100M por frasco frascos GREX-10 • Tempo de cultura encurtado • duração de 11 dias • Número reduzido de etapas • duração de 11-21 dias • Tratável em sistema fechado
• Pre-REP TILs são • Processo encurtado de congelados até • Pre-REP TILs pre-REP-para-REP fetotipificados para diretamente movidos Transição seleção, então para REP no dia 11 • Número reduzido de etapas de Pre-REP descongelados para para REP serem prosseguidos • REP requer 25- 200X • Eliminada fenotipificação para para REP (~dia 30) 106TILS seleção
• REP requer >40x106 TILs • Tratável em sistema fechado
• 1 frasco GREX-500M • 6 frascos no dia 0 de REP no dia 11 • Número reduzido de etapas • 5x106 TILs e 5x108 • 25-200x106 TILs e 5x • Duração encurtada de REP Células PBMC alimentadoras 109 Células PBMC por frasco no dia 0 de REP alimentadoras no dia 11 • Transferência em sistema fechado de TILs entre frascos • Separar em 18-36 frascos • Separar em < 6 frascos no dia 7 de REP GREX- 500M no dia 16 • Trocas de meio em sistema fechado • duração de 14 dias • duração de 11 dias
• Número reduzido • TILs colhidos via • Lavagem de células automática Colheita • TILs colhidos sistema de lavagem • Sistema fechado via centrifugação de células automático • Perda reduzida de produto durante LOVO a lavagem
• Produto criopreservado • Produto fresco em em PlasmaLyte-A + 1% Hypothcrmosol de HSA e CS10 • Flexibilidade de expedição armazenado em LN2 Formulação Final • Bolsa de infusão única • Programação flexível de paciente • Múltiplas alíquotas • Estabilidade limitada • Teste de liberação mais rápido durante expedição • Estabilidade mais longa durante expedição
Tempo de Processo • 43-55 dias • Retorno (turnaround) mais rápido Estimado • 22 dias para o paciente Total
Petição 870200103668, de 18/08/2020, pág. 559/606 Fragmentação Cultura ex vivo
Excisar tumor
Cultura de Fragmentos de Tumor (Pre-REP - 11 dias) 17/62
Expansão Rápida (REP - 11 dias)
Terapia de pré-condicionamento NMA-LD Colheita Infusão de LN-144 Expansão Descongelar, ex vivo Cocultura de TIL e criopreservado em Administração Células Alimentadoras LN2 por Infusão + IL-2
Figura 15
Figura 16
ETAPA DE GER 1 GER 2 INFLUÊNCIA
PROCESSO Cultura de ≤ 21 dias, múltiplos ≤ 11 dias, biorreator Encurta cultura, Fragmentos biorreatores, múltiplas fechado único, sem reduz intervenções intervenções do intervenção operador Seleção de TIL TILs expandidos TIL em peso Reduz etapas, elimina induzidos por IL-1, direcionado teste, aumenta criopreservados, para cocultura diversidade clonal testados, seleção baseada em fenótipo, descongelamento, repouso, cocultura Colheita/ Lavagem Redução de volume Colheita e redução de Reduz intervenções e colheita manuais. volume semiautomatizadas do operador, reduz em sistema fechado. tempo de processa- Lavagem e mento, mantém concentração Lavagem e concentração funcionalidade do manuais automatizadas sistema fechado Formulação Produto hipotérmico Produto Permite testes globais fresco (2-8°C) criopreservado mediante flexibilidade em expedição e (≤ -150°C) programação de paciente Tempo de Fabricação Retorno (turnaround) Tempo de processo Tempo de processo para Paciente, Produti- de 38 dias de 22 dias vidade operacional (throughput) de Sala Limpa, Custos mais baixos de artigos
Petição 870200103668, de 18/08/2020, pág. 561/606 Fragmentação TILs em peso Cultura ex vivo Excisar tumor
P
GM
Ç ÃO DE Cultura de Fragmentos de Tumor (Pre-REP) 11 dias
A
RIC ÇÃO 19/62 Expansão Rápida (REP) 11 dias
INS
FAB TALA Terapia de pré-condicionamento NMA-LD Colheita Descongelar, Infusão de LN-144 Expansão Cocultura de TIL e Administração criopreservado em ex vivo Células Alimentadoras por Infusão + IL-2 LN2 a -190°C Figura 17
Petição 870200103668, de 18/08/2020, pág. 562/606 TIL Extra Congelado Dissecação G-Rex 100m em LN2 De um dia de Tumor Fechado TILs em Excisar para o outro massa Fragmentos Tumor
MP
OD
à OGE Cultura de TIL Inicial (Pre-REP) < 2 Semanas
Ç 20/62 Direcionar
ICA Protocolo de Expansão Rápida (REP) < 2 Semanas para REP
A BR LAÇÃ
INS
F TA Descongelar e Infundir + IL2 G-Rex 500m Crioexpedidor Congelar em Alíquotas em Fechado Cocultura de TIL e Programado Células Alimentadoras LN2 Figura 18
Figura 19
Figura 20
Soldar H em G
Figura 21
Figura 22
Figura 23
Figura 24
Soldar H em G
Figura 25
Figura 26
Figura 27
Figura 28 TIL Formulado
Figura 29 TIL Formulado
Dia 0 Dia 5 Dia 7 Dia 8 Dia 18 REP + células
Petição 870200103668, de 18/08/2020, pág. 574/606 Ativação de alimentadoras e células-T + OKT3 Repouso IL-2 (SEM OKT3)
Processamento Eletroporação Colheita de tumor Contagem de células
Fenótipo Viabilidade de células Repertório de TCR VB Eficiência de Transfecção Reatividade ao tumor 32/62
Reestimulação de células-T
Figura 30
Modalidade 1: Dia 0 Dia 11 Dia 22
Petição 870200103668, de 18/08/2020, pág. 575/606 Eletroporação Colheita Ativação de REP + células Modalidade 2: Dia 0 Dia 5 células-T + Dia 7 Dia 8 Dia 18 Rep- alimentadoras e OKT3 ouso? IL-2 (SEM OKT3)
Eletroporação Contagem de células Fenótipo Repertório de TCRVB Reatividade ao tumor Reestimulação de células-T 33/62
Modalidade 3: Dia 0 Dia 7 Dia 18
Processamento Eletroporação Viabilidade de células de tumor Eficiência de transfecção
Figura 31
Dia 11 Dia 22 Leituras: Contagem e Viabilidade de células
Eficiência de transfecção/silenciamento
Petição 870200103668, de 18/08/2020, pág. 576/606 Modalidade 5: Dia 0 Dia 18 Fenótipo
Repertório de TCRVB
Reatividade ao tumor
Restimulação de células-T
Processamento Distribuição Eletroporação de tumor passiva de de RNA sdRNA 34/62
Figura 32
Direcionamento ao tumor (tráfego)
Petição 870200103668, de 18/08/2020, pág. 577/606 Função efetora/ Sinalização de CCRs (induzível) TCR IL2, 12, ou 15 (lócus PD1) 35/62
Persistência
Direcionamento ao Neoantígeno-spe tumor (especificidade) TCRs
Figura 33
RECEPTOR DE QUIMIOCINA Figura 34
QUIMIOCINA
Quimiocinas Receptores de quimiocina superexpressadas superexpressados ● Células-T de doador saudável foram ativadas para superexpre- ssarem CCR1, CCR2, CCR5, CCR7, CXCR3, CXCR4.
● Células-T CXCR3+, CCR5+ mostraram recrutamento mais alto em ensaios Transwell. CCR4 (Células-T citotóxicas modificadas para expressarem CCR4 mostraram enxertia aumentada de tumor e extermínio aumentado de tumor) CCR4 (Células-T CAR CD30+ modificadas para expressarem CCR4 mostraram migração aprimorada e atividade antitumoral intensificada) CXCR2 (Células-T derivadas de PBMC modificadas para expressarem CXCR2 mostraram migração aprimorada e aumento na produção de IFN-γ) Figura 35
3' Col-TEG
Petição 870200103668, de 18/08/2020, pág. 580/606 2'-O-Metil-RNA Fosforotioato 2'-Fluoro-RNA 5'-Fosfato 2'-Hidroxil-RNA Colesterol Linker TEG 38/62
Figura 36
Petição 870200103668, de 18/08/2020, pág. 581/606 2'-Fluoro-RNA 39/62
2'-O-Metil-RNA
2'-O-R, onde R é modificação hidrofóbica
Fosfodiéster
Fosforotioato
Figura 37
T7 RNA-polimerase poli(A)-polimerase de E. coli
Figura 38
Gene alvo Sequência Reagente Rxi Método de de sd-rxRNA detecção de KD Não provida Provido Citometria de fluxo
Petição 870200103668, de 18/08/2020, pág. 583/606 Não provida Provido Citometria de fluxo
Não provida Provido qPCR, Citometria de fluxo, Transferência de Western Não provida Provido Citometria de fluxo
Não provida Provido qPCR, Citometria de fluxo, Transferência 41/62 de Western
Figura 39
Petição 870200103668, de 18/08/2020, pág. 584/606 Dia 0 Dia 11 Dia 14 Dia 17 Dia 21 Dia 22
Colheita de TIL Iniciação de Iniciação de REP Pre-REP Pre-REP Contagem de células, viabilidade de células
Descongelado/ Eficiência de KD (Q-PCR, Citometria de Fluxo) 42/62
Fresco + Troca de Meio Fenótipo sd-rxRNA + sd-rxRNA Ativação (CD107a, IFNγ)
Figura 40
Figura 41
% KD (de CD3)
Não estimulado
Petição 870200103668, de 18/08/2020, pág. 586/606 Estimulado 44/62
% Atenuação de PD1 Horas após a última adição de sd-rx-RNA
Figura 42
Figura 43
Alteração em vezes em relação à NTC (controle)
Figura 44 % Viabilidade
Contagem de Células Totais
Figura 45A
% de CD3
Figura 45B
% de CD3
Figura 46
Não estimulado Estimulado
% CD107a (de CD8) Não estimulado Estimulado
% CD107a (de CD8)
Petição 870200103668, de 18/08/2020, pág. 593/606 Não estimulado
Estimulado
% Atenuação de PD1
% KD (Atenuação) (de CD3) Dias após a última adição de sd-rx-RNA 51/62
Dias após a última adição de sd-rx-RNA
Figura 47C-D
% KD (Atenuação) de PD-1 (de CD3) Figura 47E-F Sem RXi
% PD-1 (de CD3)
Traçados de Extermínio de Células em Tempo Real Etapa 1 Proliferação de Células alvo Células alvo células alvo sozinhas aderentes Microeletrodos
Petição 870200103668, de 18/08/2020, pág. 595/606 Células Efetoras: Adição de Células Alvo células efetoras
Adesão de
Índice de Células Normalizado células alvo Etapa 2
+ Células Efetoras Tempo (Horas) não aderentes 53/62
% Citólise em Tempo Real Células Efetoras: Células Alvo
O = valores de KT50 para diferentes razões de E:T Etapa 3 (Células Efetoras:Células Alvo)
% Citólise
Células Alvo Mortas Células alvo sozinhas
Tempo (Horas)
Figura 48
Tempo (Hora)
Figura 49A % Citólise Tempo (Hora)
Índice de Células Normalizado
Petição 870200103668, de 18/08/2020, pág. 597/606 % Citólise Eficiência de KD % de Expressão de PD-1 (Atenuação em células de controle 55/62
Tempo (Horas)
Figura 49B
Petição 870200103668, de 18/08/2020, pág. 598/606 % KD (Atenuação) de PD-1 (de CD3) % KD (Atenuação) de TIM3 (de CD3) Figura 50 56/62
Figura 51A
Expressão Reativa
Figura 51B
Figura 52A
Alteração em vezes em relação à NTC (controle)
Figura 52B
Alteração em vezes em relação à NTC (controle)
Sem RXi
% Viabilidade Figura 53
Sem RXi
Expansão em vezes
Não estimulado Não estimulado
Estimulado Estimulado
Petição 870200103668, de 18/08/2020, pág. 604/606 % CD107a (de CD8) 62/62
Figura 54
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