KR20190065397A - 개선된 면역 세포들 치료를 위한 타겟인 유전자 삽입 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 적응 세포 면역요법의 분야에 대한 것이다. 그것은 면역 세포들이 감염되거나 또는 악성인 세포들에 대항하여 그것들의 면역 반응을 향하게 하는 것을 돕는 외인성 코딩 서열(들)의 유전적 삽입을 제공한다. 이들 외인성 코딩 서열들은 더욱 특히 면역 세포들 활성화에 민감성인 내생 유전자 프로모터들의 전사 조절 하에 삽입된다. 이러한 방법은 더 높은 치료 가능성의 더 안전한 면역 일차(primary) 세포들의 생산을 가능하게 한다.

Description

개선된 면역 세포들 치료를 위한 타겟인 유전자 삽입
본 발명은 적응(adaptive) 세포 면역요법(immunotherapy) 분야와 관련된다. 그것은 종양들과 같은 면역 저항을 발달시키는 병적 측면들에 대항하는 일차(primary) 면역 세포들의 기능성을 향상시켜, 이들 면역(immune) 세포들의 치료 가능성을 개선하는 것을 목적으로 한다. 본 발명의 방법은 면역 세포들이 감염되거나 또는 악성인 세포들에 대항하게 그것들의 면역 반응을 향하는 것을 돕는 외인성 코딩(conding) 서열(들)의 유전적 삽입을 제공한다. 이들 외인성 코딩 서열들은 더욱 특히, 면역 세포들 활성화에 민감하지 않은 프로모터들 또는 생명에 위협이 되는 염증성 질병들 또는 종양 미세환경에 따라 상향 또는 하향조절되는 내생(endogenous) 유전자 프로모터들의 전사 통제 하 삽입된다. 본 발명은 또한 상기 특정 자리들에서 이러한 타겟이 된 삽입들을 수행하기 위하여, AAV 벡터들와 같은, 기증자(donor) DNA 벡터들 및 서열-특이적(specific) 엔도뉴클레아제 시약들(reagents)을 제공한다. 본 발명의 방법은 세포 요법에서 그것들의 효율적인 사용을 위하여 조작된 일차(primary) 면역 세포들의 안전성 및 치료 가능성을 개선하는데 공헌한다.
조혈 세포 계통들(lineages)을 포함하는 일차(primary) 면역 세포 군집들(populations)의 효과적인 임상학적 적용이 특히 HIV 감염 및 백혈병인, 다양한 병적 측면들에 대항하여 10 년 이상 다수의 임상 시험들에 의하여 확립되어 왔다 (Tristen S.J. et al. (2011) Treating 암 with genetically engineered T cells. Trends in Biotechnology. 29(11):550-557).
그러나, 이들 임상 시험들의 대부분은 환자 자신들로부터 또는 약립가능한 기증자들로부터 수득된, 주로 NK 및 T-세포들인 면역 세포들을 이용하여 왔는데, 이는 환자의 면역 체계를 감소시키거나 또는 약화시키기 위한(get around) 전략들을 이미 세운 질병들을 극복하기 위하여, 이용가능한 면역 세포들의 수, 그것들의 적합함, 및 그것들의 효율에 대하여 일부 제한들을 가져왔다.
동종이계(allogeneic) 면역 세포들의 조달로의 주된 진전으로서, "기성품인(off-the-shelf)" 치료적 제품들로서 이용가능한, 보편적인 면역 세포들이 유전자 편집에 의하여 생산되어 왔다. (Poirot et al. (2015) Multiplex Genome-Edited T-cell Manufacturing Platform for “Off-the-Shelf” Adoptive T-세포 Immunotherapies Cancer Res. 75: 3853-64). 이들 보편적인 면역 세포들은 그것들의 자가-인식 유전적 결정 요인들인, 이중 사슬-깨짐에 의하여 방해의 효과와 함께, 기증자들로부터 유래한 면역 세포들 내로 특정 희귀(rare)-절단(cutting) 엔도뉴클레아제을 발현시킴으로써 수득가능하다.
처음에 메가뉴클레아제들(Meganucleases)이라고 불렸던 (Smith et al. (2006) A combinatorial approach to create artificial 호밍 endonucleases cleaving chosen 서열들. Nucl. Acids Res. 34 (22):e149.) 세기가 바뀔 때까지 첫 번째 프로그램 작동이 가능한 서열-특이적 시약들의 출현 이래, 다른 종류들의 서열-특이적 엔도뉴클레아제들 시약들이 개선된 특이성, 안전성 및 신뢰성을 제공하며 개발되어 왔다.
절단 촉매적 도메인과 TALE 결합 도메인의 융합들인 TALE-뉴클레아제들 (WO2011072246)은 말초(peripheral) 혈액(blood) 단핵(mononuclear) 세포 (PBMC)로부터 특히 T-세포인, 일차(primary) 면역 세포들에 성공적으로 적용되어 왔다. TALEN®의 이름으로 시장에 나온, 이러한 TALE-뉴클레아제들은 특히 그 안에서 CD52 및 TCR (T-세포 수용체)을 코드하는 유전자들이 방해되는 동종이계 치료적 T-세포들을 생산하기 위하여, 기증자들로부터 유래한 T-세포들에서, 유전자 서열들을 동시에 불활성화시키는데 현재 사용되는 것들이다. 이들 세포들은 암 환자들을 치료하기 위한 키메라(chimeric) 항원(antigen) 수용체들(receptors) (CAR)을 지니고 있다고 생각될 수 있다 (US2013/0315884). TALE-뉴클레아제들은 매우 특이적인 시약들인데, 이는 그것들이 절단 도메인 Fok-1의 다이머화를 얻기 위한 필수적인(obligatory) 헤테로다이머 형태로 쌍에 의하여 DNA에 결합할 필요가 있기 때문이다. 왼쪽 및 오른쪽 헤테로다이머 멤버들 각각은 30 내지 50 bp 전체적인 특이성의 타겟 서열들의 스패닝(spanning)과 함께 약 14 내지 20 bp의 다른 핵(necleic) 서열들을 인식한다.
다른 엔도뉴클레아제들 시약들이 박테리아 S. 피요게네스(pyogenes)의 타입 II 원핵세포의 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeats)의 요소들에 기초하여 개발되어 왔다. RNA-가이드된(guided) 뉴클레아제(nuclease) 시스템 Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012)으로 불리는 이들 멀티-요소 시스템은 몇몇 특정 게놈 서열들로 상기 뉴클레아제를 이끄는 능력을 가진 가이드 RNA 분자로 커플링된 Cas9 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제 패밀리들의 멤버들을 수반한다 (Zetsche et al. (2015). Cpf1는 박테리아에서 면역을 제공하는 단일 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제로 포유류 세포들에서 게놈 편집을 위하여 적응될 수 있다. Cell 163:759-771). 이러한 프로그램 작동이 가능한 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제들은 생산하기 쉬운데, 이는 절단 특이성이 쉽게 설계되고 저렴하게 생산될 수 있는 RNA 가이드의 서열에 의하여 결정되기 때문이다. CRISPR/Cas9의 특이성은 그러나 타겟인 유전적 서열에서 특정(particular) 모티프(motif) (PAM) 가까이에 위치되어야 하는, 약 10 pb의 TAL-뉴클레아제들보다 더 짧은 서열들에 기초한다. 유사한 시스템들이 아르고노트(Argonaute) 단백질들과 조합인 DNA 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 (DNA 가이드)를 이용하여 기재되어 왔다 (Gao, F. et al. DNA-guided 게놈 editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute (2016) doi:10.1038/nbt.3547).
징크-핑거 뉴클레아제들 또는 TAL-뉴클레아제 (예: MegaTAL)와 조합되거나 또는 그렇지 않은, 호밍(homing) 엔도뉴클레아제들 (예: I-OnuI, 또는 I-CreI)로부터 유래된 다른 엔도뉴클레아제 시스템들이 또한 특이성을 입증하였으나, 지금까지 그다지 확장되지 않았다.
동시에, 신규한 특이성들이 이식유전자를 가진 T-세포 수용체들 또는 소위 키메라 항원 수용체들 (CARs)를 통하여 면역 세포들에 부여될 수 있다 (Jena et al. (2010) Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric 항원 receptor. Blood. 116:1035-1044). CAR들은 단일 융합 분자에서 하나 이상의 신호전달(signaling) 도메인들과 관련된 타겟팅 모이어티을 포함하는 재조합 수용체들이다. 일반적으로, CAR의 결합 모이어티(moiety)는 가요성(flexible) 링커에 의하여 연결된 가벼운 그리고 무거운 가변 단편들을 포함하는 단일(single)-체인(chain) 항체(antibody) (scFv)의 항원-결합 도메인으로 구성된다. 수용체 또는 리간드 도메인들에 기초한 결합 모이어티들 또한 성공적으로 사용되어 왔다. 일 세대 CAR들을 위한 신호전달(signaling) 도메인들은 CD3제타(zeta) 또는 Fc 수용체 감마 체인들의 세포지리 영역으로부터 유래된다. 일 세대 CAR들은 T 세포 세포독성으로 성공적으로 방향전환(redirec)하는 것으로 보여져 왔으나, 그것들은 체내에서 항-종양 활성 및 연장된 확장을 제공하는데 실패하였다. CD28, OX-40 (CD134), ICOS 및 4-1BB (CD137)를 포함하는 공(co)-자극(stimulatory) 분자들로부터의 신호전달(signaling) 도메인들이 CAR 변형된 T 세포들의 생존을 향상시키고 증식을 증가시키기 위하여 단독으로 (이 세대) 또는 조합하여 (삼 세대) 첨가되어 왔다. CAR들은 T 세포들이 림프종들 및 고형 종양들을 포함하는 여러가지 악성종양들로부터의 종양 세포들의 표면에서 발현되는 항원들에 대항하여 방향전환되는 것을 성공적으로 가능하게 해왔다.
최근에 "UCART19" 제품으로도 불리는 키메라 항원 수용체 (CAR) 타겟팅 CD19 악성 항원을 가진 것으로 여겨지는, TALE-뉴클레아제들를 이용하여 그것들의 T-세포 수용체 (TCR)가 방해된 조작된 T-세포들은 난치성(refractory) 백혈병을 가진 적어도 두 명의 유아들에게서 치료 가능성을 보여주었다 (Leukaemia success heralds wave of gene-editing therapies (2015) Nature 527:146-147). 이러한 UCART19 세포들을 얻기 위하여, TALE-뉴클레아제는 TCR 유전자 파괴(disruption)를 작동하기 위하여 캡이 된(capped) mRNA의 전기천공으로 일시적으로 세포들 내로 발현시킨 반면, 키메라 항원 수용체 (CAR CD19)를 코드하는 카세트(cassette)가 레트로바이러스 벡터를 이용하여 게놈 내로 무작위로 도입되었다.
이 후자의 접근에서, 유전자 불활성화 및 키메라 항원 수용체를 발현시키는 단계들은 "엑스(ex)-비보(vivo)"에서 T-세포의 활성화를 유도한 후 독립적으로 수행된다.
그러나 일차(primary) 면역 세포들을 조작하는 것은 이러한 세포들의 성장/생리에 어떠한 결과도 없지 않다. 특히 하나의 도전은 그것들의 면역 반응 및 수명을 상당히 감소시키는 세포들 소진(exhaustion)/무반응(anergy)을 피하는 것이다. 이것은 환자 내로 그것들의 주입보다 빨리 세포들이 인공적으로 활성화될 때 발생할 가능성이 높다. 그것은 또한 세포가 너무 반응을 하는 CAR를 가진 것으로 여겨지는 경우이다.
이들 곤란들을 피하기 위하여, 본 발명자들은 면역 세포들의 치료 가능성을 증가시키는 외인성(exogenous) 유전적 서열들을 발현시키기 위하여 T-세포 활성화 동안 몇몇 주요 유전자들의 전사 조절의 이점을 취한 것에 대하여 생각하였다. 면역 세포 활성화 후 공(co)-발현되거나 또는 발현되는 외인성 유전적 서열들은 서열-특이적 엔도뉴클레아제 시약들을 이용하여 유전자 타겟이 된 삽입에 의하여 도입되어, 그것들의 코딩 서열들이 상기 자리들(loci)에 존재하는 내생(endogenous) 프로모터들의 통제 하 번역된다. 대체하여, 면역 세포 활성화 동안 발현되지 않는 자리들은 게놈의 어떠한 유해한 결과들 없이 발현 카세트들의 통합을 위한 "안전한-항구(harbor) 자리들"로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 이들 세포 조작 전략들은 세포 고갈을 제한함으로써와 더불어, 특히 그것들의 수명, 지속성 및 면역 활성에 의하여, 일반적으로 일차(primary) 면역 세포들의 치료 가능성(therapeutic potential)을 강화시키는 경향이 있다. 본 발명은 동종이계 치료 전략들의 부분으로서 기증자들로부터와 함께 자가조직의(autologous) 치료 전략들의 부분으로서 환자들로부터 유래된 일차 세포들로 수행될 수 있다.
도 1 : 특정 면역 세포 종류들에서 특이적으로 활성화되는 내생 프로모터들의 전사 조절 하 특정 자리들에서 외인성 서열들을 도입함으로써 조혈 줄기 세포들 (HSCs)을 조작하기 위한 전략들. 도면은 본 발명에 따라 원하는 조혈 계통들에서 발현을 위하여 외인성 코딩 서열(들)이 삽입될 수 있는 자리들인, 특정 내생 유전자들의 예들을 목록으로 한 것이다. 그 목표는 선택된 이식유전자들을 발현시킬, 그것들을 위하아ㅕ 인-비보에서 면역 세포들을 생산하기 위하여, 환자들 내로 이식되는 조작된 HSC들을 엑스-비보에서 생산하는 반면, 그것들이 원하는 계통으로 분화되는 것이다.
도 2: TRAC 자리에서 항-CD22 CAR 외인성 코딩 서열, 그리고 또한 CD25 및 PD1 자리들에서 IL-15 외인성 코딩 서열을 삽입하기 위하여 실험 섹션에서 사용된 기증자 서열들의 개략적인 대표. A: 면역 세포에 의하여 CD25 및 IL-15 폴리펩타이드들의 공동-전사를 수득하기 위하여 CD25 자리에서 IL-15의 부위 특이적 삽입을 위하여 설계된 기증자 주형 (지정된 IL-15m-CD25). 서열들은 실시예들에 상세히 기재되어 있다. B: PD1 내생 유전자의 프로모터의 전사 활성 하 IL-15의 전사를 수득하기 위하여 PD1 자리에서 IL-15의 부위 특이적 삽입을 위하여 설계된 기증자 주형 (지정된 IL-15m-PD1). PD1 오른쪽 및 왼쪽 경계 서열들은 PD1 내생 코딩 서열을 온전하거나 또는 방해된 것이 유지되도록 선택될 수 있다. 이 후자의 경우에서, PD1은 넉아웃되는 반면 IL-15은 넉인되고 전사된다. C: TCR 자리 (예: TRAC) 내로 키메라 항원 수용체 (예: 항-CD22 CAR)의 부위 특이적 삽입을 위하여 설계된 기증자 주형. 일반적으로 왼쪽 및 오른쪽 경계들은 환자들 내로 동종이계 이식에 적합한 [TCR]음성[CAR]양성 조작된 면역 세포들을 수득하기 위하여 TCR을 방해할 수 있도록 선택된다.
도 3: 유동세포 분석법은 항-CD22 CAR가 또한 TRAC TALEN®을 이용하여 TRAC 자리에서 통합되는 문맥에서, 각각 PD1 또는 CD25 TALEN®을 이용하여, PD1 또는 CD25 자리에서 IL-15m의 타겟된 통합의 빈도를 측정한다. 이들 결과들은 TRAC 자리에서 CAR 항-CD22와 함께 PD1 또는 CD25 자리들에서 IL-15 코딩 서열 둘 다의 효율적인 타겟이 된 통합을 보여준다. A: 가짜(mock) 형질주입된 일차 T-세포들. B: TCR 및 PDI 자리들에서 이중 통합을 위하여 특정 TALEN® 및 도 1 에 기재된 기증자 서열들로 형질주입된 일차 T-세포들 (B 및 C). C: TCR 및 CD25 자리들에서 이중 통합을 위한 특정 TALEN® 및 도 1에 기재된 기증자 서열들로 형질주입된 일차 T-세포들 (A 및 C).
도 4: 도 5 및 6에 보여진 결과들을 얻기 위하여 일차(primary) 면역 세포들을 형질주입하기 위한 실험 섹션에서 사용된 외인성 서열들의 개략적 대표도.
도 5 및 6: 유동세포 분석법은 항 CD3/CD28 비-특이적 활성화 (Dynabeads®) 및 종양 세포 활성화 (raji 종양 세포들)에 의존적인 CAR가 되면, 특정 TALEN® (TCR 및 CD25) 및 도 4의 기증자 주형들로 형질주입된 독자생존가능한 T-세포들 중 LNGFR 발현을 측정한다. 도 6에 보여지는 대로, LNGFR 발현은 CAR/종양 이용되면 [CAR 항-CD22] 양성 세포들에서 특이적으로 유도되었다.
도 7 및 8: 유동세포 분석법은 종양 세포 활성화 (raji 종양 세포들) 및 항CD3/CD28 비-특이적 활성화 (Dynabeads®)이 되면 특정 TALEN® (TCR 및 CD25) 및 도 4의 기증자 주형들로 형질전환된 독자생존가능한 T-세포들 중 CD25 발현을 측정한다. 도 8에 보여지는 대로, CD25 발현은 CAR/종양 이용되면 [CAR 항-CD22] 양성 세포들에서 특이적으로 유도되었다.
도 9: 도 11 및 12에 보여진 결과들을 얻기 위하여, 일차(primary) 면역 세포들을 형질주입하기 위하여 실험 섹션에서 사용된 외인성 서열들의 개략적 대표도.
도 10 및 11: 유동세포 분석법은 종양 세포 활성화 (raji 종양 세포들) 및 항CD3/CD28 비-특이적 활성화 (Dynabeads®)되면 특정 TALEN® (TCR 및 PD1) 및 도 9의 기증자 주형들로 형질주입된 독자생존가능한 T-세포들 중 LNGFR 발현을 측정한다. 도 11에 보여지는 대로, LNGFR 발현은 CAR/종양 이용되면 [CAR 항-CD22] 양성 세포들에서 특이적으로 유도되었다.
도 12: 유동세포 분석법은 TALEN® (TCR 및 PD1)를 이용하여 그리고 이용하는 것 없이, 종양 세포 활성화 (raji 종양 세포들) 및 항CD3/CD28 비-특이적 활성화 (Dynabeads®)되면 도 9의 기증자 주형들로 형질주입된 독자생존가능한 T-세포들 중에서 내생 PD1 발현을 측정한다. PD1은 TALEN 치료에 의하여 효율적으로 넉아웃되었다 (54 % 중 PD1의 8% 남아있는 발현).
도 13: PD1 자리 내로 IL-15 외인성 코딩 서열들의 삽입을 위한 TALEN® 및 도 2에 기재된 기증자 주형으로 형질주입된 본 발명에 따른 [CAR]양성 (CARm) 및 [CAR]음성 조작된 면역 세포들에서 IL-15 생산을 보여주는 도해. 전사가 내생 PD1 프로모터의 통제 하에 있었던 IL15이 종양 세포 활성화 (raji 종양 세포들) 및 항CD3/CD28 비-특이적 활성화 (Dynabeads®) 되면 효율적으로 유도되었고 배양 배지에서 분비되었다.
도 14: 본 발명에 따라 조작된 면역 세포들에 의하여 활성화 후 시간이 경과함에 따라(일) 분비된 IL-15의 양을 보여주는 그래프. A: 도 2A (IL-15m_CD25) 및/또는 2C (CARm)에 기재된 DNA 기증자 주형들을 이용하는, CD25 자리에서 IL-15 코딩 서열의 통합에 의하여 조작된 세포들. B: 도 2B (IL-15m_PD1) 및/또는 2C (CARm)에 기재된 DNA 기증자 주형들을 이용하여 PD1 자리에서 IL-15 코딩 서열의 통합에 의하여 조작된 세포들. 양 자리들에서 통합은 유사한 IL-15 분비 프로파일들을 보여준다. IL-15의 분비는 CAR의 종양 특이적 활성화에 의하여 상당히 증가된다.
도 15: 실시예 2에 기재된 대로 생존 분석 (순차적 사멸 분석)에서 시간 경과에 따른 CD22 항원 (루시페라제 신호)를 발현시키는 Raji-Luc 종양 세포들의 수를 보고하는 그래프. 면역 세포들 (PBMCs)은 PD1 (A) 또는 CD25 자리 (B)에서 IL-15 코딩 서열들을 통합하고 TCR 자리에서 항-CD22-CAR를 발현시켜 (이로써 TCR 발현을 방해하기 위하여) 조작되었다. 이 분석에서, 종양 세포들은 배양 배지에 정기적으로 첨가된 반면, CAR 양성 세포들에 의하여 부분적으로 또는 전체적으로 제거된다. PD1 또는 CD25 세포들에서 IL-15의 재-발현은 극적으로 CAR 양성 세포들에 의한 종양 세포들의 제거를 돕는다.
도 16: IL-12 및 gp130Fc을 코드하는 외인성 서열들을 PD1 자리에서 삽입하기 위하여 실험 섹션에서 사용된 기증자 서열들의 개략적 대표도. A: PD1 내생 코딩 서열을 방해하는 반면, IL-12a 및 IL-12b의 공동-전사를 얻기 위한 PD1 자리에서 IL-12a 및 IL-12b 코딩 서열들 (서열번호 :47 및 48)의 부위 특이적 삽입을 위하여 설계된 기증자 주형 (지명된 IL-12m-PD1). PD1 자리 서열들에 상동인 오른쪽 및 왼쪽 경계 서열들은 적어도 100pb 길이, 바람직하게는 적어도 200 pb 길이, 그리고 더욱 바람직하게는 적어도 300 pb 길이이며, 서열번호 :45 및 46을 포함한다. 서열들은 표 5에 상세히 기재된다. B: PD1 내생 코딩 서열을 방해하는 반면, PD1 프로모터 하 PD1 자리에서 전사를 얻기 위하여 gp130Fc 코딩 서열들 (서열번호 :51)의 부위 특이적 삽입을 위하여 설계된 기증자 주형 (지명된 gp130Fcm-PD1). PD1 자리 서열들에 상동인 오른쪽 및 왼쪽 경계 서열들은 적어도 100pb 길이, 바람직하게는 적어도 200 pb 길이, 그리고 더욱 바람직하게는 적어도 300 pb 길이이며, 서열번호 :45 및 46을 포함한다. 서열들은 표 5에 상세히 기재된다.
표 1: 다양한 바이러스들로부터의 ISU 도메인 변종들.
표 2: 자연 및 인공 기원들로부터의 FP 폴리펩타이드의 아미노산 서열들.
표 3: 본 발명에 따른 외인성 코딩 서열을 삽입함으로써 유리하게 변형 또는 불활성화될 수 있는 면역 세포들 억제 경로들 내에 관련된 유전자들의 목록.
표 4: 실시예 1에 언급된 서열들.
표 5: 실시예 2에 언급된 서열들.
표 6: 그 안에서 유전자 타겟이 된 삽입이 면역 세포들 치료 가능성을 개선하기 위하여 본 발명에 따라 추구되는, T-세포 활성화되면 상향조절되는 인간 유전자들의 목록(CAR 활성화 민감성 프로모터들).
표 7: (T-세포 활성화에 독립적이거나 의존적인) 면역 세포 활성화 동안 꾸준히 전사되는 유전자들의 선택.
표 8: T-세포 활성화되면 일시적으로 상향조절되는 유전자들의 선택.
표 9: T-세포 활성화되면 24 시간 초과 넘게 상향조절되는 유전자들의 선택.
표 10: 면역 세포 활성화되면 하향조절되는 유전자들의 선택.
표 11: T-세포 활성화 되면 침묵하는 유전자들의 선택 (안전한 항구 유전자 타겟이 된 통합 자리들).
표 12: 본 발명에 따라 외인성 코딩 서열들의 유전자 통합에 유용한 (다중 종양으로부터 엮어진) 종양 소모된 침윤성 림프구들에서 상향조절되는 유전자 자리들의 목록.
표 13: 본 발명에 따라 외인성 코딩 서열들의 유전자 통합에 유용한 혈중산소 감소된 종양 조건들에서 상향조절된 유전자 자리들의 목록.
발명의 개요
비(non)-상동(homologous) 말단(end)-연결(joining) (NHEJ) 및 상동성(homology)-향하는(directed) 수선(repair) (HDR)은 인 비보(in vivo)에서 DNA 손상들을 수선하는데 사용되는 두 개의 주된 경로들이다. 후자의 경로는 주형-의존적 방식으로 손상을 수선한다 (HDR은 DNA 수선 주형으로서 시스터 크로마티드(chromatid)를 자연발생적으로 이용한다). 상동 재조합은 외인성으로 공급된 기증자 주형을 이용하여 타겟이 된 DNA 변형들로 게놈들을 정확히 편집하기 위하여 수 십년 동안 사용되어 왔다. 희귀-절단 엔도뉴클레아제들을 이용한 타겟 위치에서 이중 가닥(double strand) 손상(break) (DSB)의 인공적인 생성은 상동 재조합의 효율을 상당히 향상시킨다 (예컨대 US 8,921,332). 또한 손상 부위와 상동인 DNA 서열들을 포함하는 기증자 주형과 함께 희귀-절단 엔도뉴클레아제의 공-전달은 또한 유전자 삽입 또는 유전자 수정(correction)과 같은 HDR-기반의 유전자 편집을 가능하게 한다. 그러나, 이러한 기술들은 몇몇 기술적 제한들 때문에, 일차(primary) 면역 세포들, 특히 CAR T-세포들에서 널리 이용되지 않아 왔다: 세포사를 이끄는 이러한 종류들의 세포들 내로 DNA를 형질주입(transfect)하는 것의 어려움, 면역 세포들은 제한된 수명 및 세대 수들을 갖는다, 상동 재조합은 보통 낮은 빈도로 발생한다.
지금까지 서열 특이적 엔도뉴클레아제 시약들은 NHEJ 경로를 이용하여 유전자 불활성화를 위하여 일차(primary) 면역 세포들에서 주로 사용되어 왔다 (예컨대 WO2013176915).
일반적인 측면에서, 본 발명은 내생 프로모터의 통제 하 통합된 유전자 전사를 갖기 위하여 타겟 세포에서 부위 특이적(site directed) 유전자 편집, 특히 유전자 삽입 (또는 복수 유전자 삽입들)을 수행하는 것에 의존한다.
일반적인 측면에서 본 발명은 기증자 주형에서 내부(internal) 리보솜(ribosome) 진입(entry) 부위(site) (IRES)의 또는 (예컨대 2A 시스(cis)-작용하는(acting) 하이드롤라제 요소들) 시스-조절 요소들의 사용을 통하여 원래의(native) 유전자의 발현을 유지하는 동안 내생 프로모터 하인 통합된 유전자들 전사를 갖도록 일차(primary) 면역 세포들에서 유전자 편집을 수행하는 것에 의존한다.
일반적인 측면에서 본 발명은, 제한되지 않는 예들로서, 종양에 의하여 제공되는 면역 억제를 차단하기 위하여 다른 보호 또는 억제 유전자들의, 또는 종양으로의 트래피킹(trafficking)을 조장하기 위하여 케모카인(chemokine) 수용체들의, 항-종양 반응을 이끌기 위하여 중요한 사이토카인들의, 키메라 항원 수용체들 (CAR)의, 주요(primary) T-세포들에서, 발현을 통제하는 것에, 의존한다. 과연, 본 발명의 하나의 주요 이점은, 전사 활성이 면역 세포들 활성화의 효과들에 의하여 감소되지 않는, 내생 프로모터들의 통제 하에, 이러한 외인성 서열들을 놓는 것이다.
예컨대 외인성 코딩 서열이 통합되었고 항시적 유전자 발현을 위한 TCR 자리(locus)에서 발현된, 치료적 면역 세포들을 조작하는 종래의 방법과의 대조에 의하여, 본 발명자들은 T-세포들 활성화 동안, 바람직하게는 CAR 의존적 방식으로, 특이적으로 T-세포 활성화 동안 전사되는 자리들에서 코딩 서열을 통합하였다.
한 측면에서, 본 발명은 면역 세포들 활성화로 상향조절되는 선택된 유전자 자리들에서 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현시키는 것에 의존한다. CAR를 코드하는 외인성 서열(들) 및 내생 유전자를 코드하는 서열(들)은, 예컨대 또한 도입되는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)에 의하여 또는 시스-조절 용소들 (예컨대 2A 시스-작용하는 하이드롤라제 요소들)에 의하여 분리되는 것에 의하여 공(co)-전사(transcribe)될 수 있다. 예컨대, CAR를 코드하는 외인성 서열들은 각각 종양들의 인접한 환경에서 제노바이오틱스(xenobiotics) 및 저산소증에 의도되는유전자 센서들인, 아릴(aryl) 탄화수소(hydrocarbon) 수용체 (AhR)또는 전사 인자 저산소증-유도 인자인, HIF1a와 같은 종양 미세환경에 의하여 활성화되는 내생 유전자들의 프로모터의 전사 통제 하 위치될 수 있다.
그러므로 본 발명은 종양 미세환경(microenvironment) (TME)에 의하여 영향을 받는 내생 T-세포 프로모터들의 통제 하 외인성 유전적 속성들(attributes)/순환들(circuits)을 통합시킴으로써 CAR T-세포 요법들의 치료적 결과를 개선하는데 유용하다. 비제한적 예들로서, 세포외 산과다증(acidosis)(락테이트 강화)와 더불어, 아르기닌, 시스테인, 트립토판 및 산소 박탈을 포함하는 TME 특징들이 특정 내생 유전자들을 상향조절하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에 따라 내생 유전자들의 상향조절은 특정 종양 미세환경에서 CAR T-세포들의 항종양 활성을 개선하기 위하여 관련된 외인성 코딩 서열들을 재-발현시키기 위하여 "하이잭(hijacked)될" 수 있다.
바람직한 예들에서, 본 발명의 방법은 바람직하게는 AAV6 based 벡터 내로 세팅된 DNA 수선 매트릭스의 존재 하, 제한되지 않는 예들로서, TALEN, ZFN 또는 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제들과 같은, 서열-특이적 뉴클레아제 시약들을 발현시킴으로써 종양 미세환경 하 높게 전사되는 자리에서 이중-가닥 손상을 일으키는 단계를 포함한다. 이 DNA 기증자 주형은 일반적으로 여기에서 외인성 코딩 서열들으로 가리켜진, (종결 코돈 및 폴리A 서열들) 조절 유전적 요소들 및 고유의 또는 복수 개의 오픈 리딩 프레임들을 끼워넣은 두 개의 상동성 암들(arms)을 포함한다.
또다른 측면에서, 상기 외인성 서열은 (넉-인에 의하여 넉-아웃) 상기 자리에 존재하는 내생 코딩 서열(들)을 변형 또는 결실시킴으로써 게놈 내로 도입된다.
타겟이 된 자리 및 면역 세포들 활성에서 그것의 수반에 의존하여, 타겟이 된 내생 유전자는 그것의 원래의 기능을 유지하거나 또는 불활성될 수 있다. 타겟이 된 유전자가 면역 세포들 활성에 필수적이라면, 이 삽입 절차는 유전자 불활성화 없이 단일 넉-인( knock-in) (KI)을 만들어낼 수 있다. 반대로, 만약 타겟이 된 유전자가 면역 세포들 억제/소진에 관련되는 것으로 간주된다면, 삽입 절차는, 바람직하게는 내생 서열을 넉-아웃시킴으로써, 내생 유전자의 발현을 예방하도록 설계되는 반면, 도입된 외인성 코딩 서열(들)의 발현을 가능하게 한다.
더 특정 측면들에서, 본 발명은 제한되지 않는 예로서, PD1, PDL1, CTLA-4, TIM3, LAG3, TNFa 또는 IFNg와 같은, 특정 자리들에서 (원래의 유전자 파괴 없이 또는 이와 함께) 타겟이 된 통합에 의하여 CAR 신호전달 경로의 활성화 후, 여러가지 동역학들로, 타겟 유전자 발현을 상향-조절하는 것에 의존한다.
더욱 더 특정 측면에서, 조작된 면역 세포들, 바람직하게는, 이들 자리들에 존재하는 내생 프로모터들의 통제 하 그것들의 발현을 위한 PD1, CD25 또는 CD69 내생 자리에서 통합되는, IL-15 또는 IL-12 폴리펩타이드(들)을 코드하는 외인성 서열들을 포함하는, 환자들 내로 주입을 위한 일차(primary) 면역 세포들이 여기에서 기재된다.
본 발명에 따른 면역 세포들은 치료적 조짐 들 및 받는 사람인 환자들에 의존하여, [CAR]양성,[CAR]음성,[TCR]양성일 수 있다. 하나의 바람직한 측면에서, 면역 세포들은 동종이계 이식을 위하여 [TCR]음성으로 더 만들어진다. 이는 특히 TRAC (TCR알파를 코드하는 자리)와 같은, TCR의 적어도 하나의 요소를 코드하는 적어도 하나의 내생 서열의 유전적 붕괴에 의하여, 바람직하게는 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 재조합 TCR, 또는 그것들의 요소(들)을 코드하는 외인성 서열의 통합에 의하여 활성화될 수 있다.
본 발명의 추가의 측면에 따라, 면역 세포들은 돌연변이된 GP130와 같은 IL-6 수용체 패밀리의 사이토카인 수용체과 관련되고 그리고 바람직하게는 이에 지장을 줄 수 있는 폴리펩타이드를 코드하는 외인성 서열으로 형질주입된다. 특히, 본 발명은 인터루킨-6 (IL-6) 신호 전달을 방해하고, 그리고 이상적으로는 차단함으로써 사이토카인 방출(release) 증후군(syndrome) (CRS)을 감소시키는 것을 목적으로, 용해성(soluble) 돌연변이된 GP130을 분비하는, 면역 세포들, 바람직하게는 T-세포들을 제공한다. CRS는 형질도입된(transduced) 면역 세포들이 CRS는 인-비보에서 활성이 되기 시작할 때, 자동 면역으로 이끄는 세포 면역요법의 잘 알려진 합병증이다. IL-6이 그것의 수용체 IL-6R에 결합한 후, 복합체는 GP130 서브유닛과 어울려, 염증 반응들의 카스케이드 및 신호 전달을 개시한다. 특정 측면에 따라, IgG1 항체 (sgp130Fc)의 Fc 부분에 융합된 GP130의 세포외 도메인을 포함하는 다이머 단백질은 조작된 면역 세포들에서 발현되어 IL-6의 트랜스 신호전달의 부분적 또는 완전한 차단을 달성하기 위하여 용해성 IL-R/IL-6 복합체에 특이적으로 결합한다. 그러므로 본 발명은 면역요법에서 CRS를 제한하기 위한 방법을 언급하며, 이때 면역 세포들은 sgp130Fc와 같은, IL-6 수용체 패밀리의 사이토카인 수용체와 관련되며 그리고 바람직하게는 이를 방해할 수 있는 용해성 폴리펩타이드를 발현시키기 위하여 유전적으로 변형된다. 바람직한 측면에 따라, IL-6 수용체 패밀리의 사이토카인 수용체과 관련되고 그리고 바람직하게는 이를 방해할 수 있는 상기 용해성 폴리펩타이드를 코드하는 이 서열은, 바람직하게는 표 6, 8 또는 9로부터 선택되는 하나, 더욱 특히 PD1, CD25 또는 CD69, 와 같은, T-세포들 활성화의 반응성이 하나의 자리에서, 내생 프로모터의 통제 하 통합된다. 벡터들의 폴리뉴클레오타이드 서열들, 외인성 코딩 서열들 및/또는 내생 자리들에 상동인 서열들을 포함하는 기증자 주형들, 그 결과인 조작된 세포들과 관련된 서열들을 비롯하여 상기 조작된 세포들의 검출을 가능하게 하는 그것들은 본 공개의 모든 부분이다.
일반적인 측면에서 본 발명은, 제한되지 않는 예들로서, 유전자들의 타겟이 된 통합에 의하여 생물학적 "논리 게이트들" ("및" 또는 "또는" 또는 "아닌" 또는 이들의 임의의 조합)의 요소들의 발현을 통제하는 것에 의존한다. 전자적 논리 게이트들과 유사하게, 다른 자리들에서 발현되는 세포 요소들은 예컨대, 면역 세포의 활성화의 조건들을 좌우하는 음성 및 양성 신호들을 변화시킬 수 있다. 이러한 요소는 제한되지 않는 예들로 T-세포 활성화 및 그 결과인, 그 안에서 그것들이 발현되는 조작된 T-세포들의 세포독성을 통제하는데 사용될 수 있는 양성 및 음성 키메라 항원 수용체들을 포함한다.
선호되는 예에 따라 본 발명은 제한되지 않는 예로서 ssDNA (제한되지 않는 예로서 올리고뉴클레오타이드들), dsDNA (제한되지 않는 예로서 플라스미드 DNA), 및 더욱 특히 아데노(adeno)-관련(associated) 바이러스(virus) (AAV)를 형질주입함으로써 타겟 유전자에 상동일 서열들 및 관심있는 유전자를 포함하는 기증자 주형 및/또는 서열 특이적 엔도뉴클레아제 시약을 도입하는 것에 의존한다.
본 발명은 또한 벡터들, 기증자 주형들, 시약들 및 상기 방법들에 적용되는 조작된 세포들을 비롯하여 치료에의 그것들의 사용에 대한 것이다.
본 발명의 자세한 기재
여기에서 특이적으로 정의되지 않는 한, 여기에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 유전자 치료, 생명화학, 유전학 및 분자생물학의 영역에서 당업자에 의하여 보통 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
여기에 기재된 것들과 유사하거나 또는 동등한 모든 방법들 및 물질들은, 여기에 기재된 적합한 물질들 및 방법들과 함께 본 발명의 시험 또는 실시에 사 용될 수 있다. 모든 문헌들, 특허 출원들, 특허들 및 여기에 언급된 다른 참고문헌들이 그 전체가 참고로서 포함된다. 모순되는 경우, 정의들을 포함하는 본 명세서가 우선될 것이다. 나아가 물질들, 방법들, 및 예들은 설명만을 위한 것이며, 다르게 특정하지 않는 한, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 실시는, 다르게 표시하지 않는 한, 기술 내인 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 유전자이식(transgenic) 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 현재 기술들을 이용할 것이다. 이러한 기술들은 문헌에서 완전히 설명된다.예컨대, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the series, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York), specifically, Vols.154 and 155 (Wu et al. eds.) and Vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); and Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986) 참조.
본 발명은 상기 면역 세포들의 염색체 DNA 내로 외인성 코딩 서열의 유전자 타겟인 통합을 수반하는, 세포 면역요법을 위한 일차(primary) 면역 세포들의 제조를 위한 일반적인 방법에 대한 것이다. 일부 측면들에 따라, 이 통합은 상기 코딩(coding) 서열이 상기 세포들에 내생인 적어도 하나의 프로모터의 전사 조절 하 놓이는 방식으로 수행되며, 상기 내생 프로모터는 바람직하게는, T-세포 수용체 알파 불변(constant) (TRAC - NCBI Gene ID #28755)을 전사하는 하나와 같은, 항시발현되는 프로모터가 아니다. 본 발명에 따른 항시발현되는 프로모터는 예컨대 CAR 활성화로부터 독립적으로 활성인 프로모터이다 - 예 : T-세포들이 아직 활성화되지 않은 때.
유전자 타겟이 된 통합에 의한 면역 세포들의 치료 가능성의 개선
희귀-절단 엔도뉴클레아제들과 같은 폴리뉴클레오타이드 서열-특이적 시약들을 이용한 유전자 편집 기술들은 일차(primary) 세포들 내로 유전적 변형들의 도입을 위한 그 분야의 상태가 되었다. 그러나 그것들은 지금까지 내생 프로모터들의 전사 조절 하 외인성 코딩 서열들을 도입하기 위하여 면역 세포들에서 사용되지 못하였다.
본 발명은 유전자 편집 기술들을 통하여, 특히 유전자 타겟이 된 통합에 의하여, 면역 세포들의 치료 가능성을 개선하는 것을 목적으로 한다.
"유전자 타겟인 통합"에 의하여 살아 있는 세포 내로 게놈 서열을 삽입, 대체 또는 수정하는 것을 가능하게 하는 임의의 알려진 부위-특이적 방법들이 의미된다. 본 발명의 선호되는 측면에 따라, 타겟이 된 유전자의 자리에서 상동 유전자 재조합을 수반하며, 이는 상기 유전자 타겟이 된 통합은 적어도 하나의 외인성 뉴클레오타이드, 바람직하게는 몇몇 뉴클레오타이드들 (즉 폴리뉴클레오타이드) 및 더욱 바람직하게는 코딩 서열의 삽입 또는 대체를 야기한다. "서열-특이적 시약"에 의하여 게놈 자리에, 상기 게놈 자리을 변형시키는 관점에서, 바람직하게는 적어도 9 bp, 더욱 바람직하게는 적어도 10 bp 그리고 더욱 더 바람직하게는 적어도 12 pb 길이의, 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 특이적으로 인식하는 능력을 가진 임의의 활성 분자가 의미된다. 본 발명의 선호되는 측면에 따라, 상기 서열-특이적 시약은 바람직하게는 서열-특이적 뉴클레아제 시약이다.
"면역 세포"에 의하여 보통 CD3 또는 CD4 양성 세포들과 같은, 선천적 그리고/또는 적응된 면역 반응의 개시 및/또는 수행에 기능적으로 수반되는 조혈 기원의 세포가 의미된다. 본 발명에 따른 면역 세포는 수지상 세포, 킬러 수지상 세포, 지방 세포, NK-세포, B-세포 또는 면역 T-림프구들, 세포독성 T-림프구들, 조절 T-림프구들 또는 헬퍼 T-림프구들로 구성되는 군으로부터 선택된 T-세포일 수 있다. 세포들은 종양 침윤성 림프구들과 같은 종양들로부터, 그리고 말초혈액 단핵 세포들, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수(ascites), 흉막 삼출, 비장 조직을 포함하는, 다수의 제한되지 않는 소스들로부터 수득될 수 있다. 몇몇 예들에서, 상기 면역 세포는 감염으로 진단된 환자로부터 또는 암으로 진단된 환자로부터, 건강한 기증자로부터 유래할 수 있다. 또다른 예에서, 상기 세포는 CD4, CD8 및 CD56 양성 세포들을 포함하는 것과 같은, 다른 표현형 특성들을 보이는 면역 세포들의 혼합된 군집의 부분이다.
"일차(primary) 세포" 또는 "일차 세포들"에 의하여 살아있는 조직 (예컨대 생검 물질)로부터 취해지고 제한된 시간 동안 인 비트로에서 성장을 위하여 확립된 세포들이 의미되며, 이는 그것들이 제한된 수의 군집 배증(doubling)들을 겪을 수 있다는 것을 의미한다. 일차(primary) 세포들은 연속적인 종양형성(tumorigenic) 또는 인공적으로 불멸화된 세포주들에 반대된다. 이러한 세포주들의 제한되지 않는 예들은 CHO-K1 세포들; HEK293 세포들; Caco2 세포들; U2-OS 세포들; NIH 3T3 세포들; NSO 세포들; SP2 세포들; CHO-S 세포들; DG44 세포들; K-562 세포들, U-937 세포들; MRC5 세포들; IMR90 세포들; Jurkat 세포들; HepG2 세포들; HeLa 세포들; HT-1080 세포들; HCT-116 세포들; Hu-h7 세포들; Huvec 세포들; Molt 4 세포들이다. 일차 세포들은 일반적으로 세포 요법에 사용되는데, 이는 그것들이 더욱 기능적이고 덜 종양형성적으로 간주되기 때문이다.
일반적으로, 일차(primary) 면역 세포들은, 예컨대 Schwartz J.et al. (Guidelines on the use of therapeutic apheresis in clinical practice-evidence-based approach from the Writing Committee of the American Society for Apheresis: the sixth special issue (2013) J Clin Apher. 28(3):145-284)에 의하여 리뷰된 백혈구성분채집 기술들에 의하여, 그 분야에 알려진 여러가지 방법들을 통하여 기증자들 또는 환자들로부터 제공된다.
본 발명에 따른 일차(primary) 면역 세포들은 또한 제대혈 줄기 세포들, 전구(progenitor) 세포들, 골수 줄기 세포들, 조혈(hematopoietic) 줄기 세포들 (HSC) 및 유도(induced) 만능(pluripotent) 줄기 세포들 (iPS)과 같은, 줄기 세포들로부터 분화될 수 있다.
"뉴클레아제 시약"에 의하여 그 자체에 의하여 또는 바람직하게는 핵산 서열의 절단을 이끄는, 가이드 RNA/Cas9와 같은 복합체의 서브유닛으로서, 바람직하게는 엔도뉴클레아제 반응인, 타겟 세포에서 뉴클레아제 촉매 반응에 공헌하는 핵산 분자가 의미된다.
본 발명의 뉴클레아제 시약들은 일반적으로 "서열-특이적 시약들"인데, 이는 그것들이 더 나아가 "타겟 유전자"로서 언급된, 미리 결정된 자리들에서 세포들에서 DNA 절단을 유도할 수 있다는 것을 의미한다. 서열 특이적 시약들에 의하여 인식되는 핵산 서열은 "타겟 서열"로 불린다. 상기 타겟 서열은 보통 세포의 게놈, 그리고 더욱 광범위하게 인간 게놈에서 희귀 또는 고유인 것이 선택는데, 이는 그것이 http://www.ensembl.org/index.html 와 같은, 인간 게놈 데이터베이스로부터 이용가능한 데이터 및 소프트웨어를 이용하여 결정될 수 있기 때문이다.
"희귀(rare)-절단(cutting) 엔도뉴클레아제들(endonucleases)"은 일반적으로 10 부터 50 까지의 연속적인 염기쌍들, 바람직하게는 12 부터 30 까지bp, 그리고 더욱 바람직하게는 14 부터 20 까지 bp의 범위인 그것들의 인식 서열들인 한, 선택되는 서열-특이적 엔도뉴클레아제 시약들이다.
본 발명의 선호되는 측면에 따라, 상기 엔도뉴클레아제 시약는 예컨대 Arnould S., et al. (WO2004067736)에 기재된 대로 호밍 엔도뉴클레아제와 같은 "조작된" 또는 "프로그램가능한" 희귀-절단 엔도뉴클레아제, 예컨대, Urnov F., et al. (Highly efficient 내생 인간 유전자 수정 using designed zinc-finger nucleases (2005) Nature 435:646-651)에 기재된 대로, 징크(zing) 핑거(finger) 뉴클레아제 (ZFN), 예컨대 Mussolino et al. (A novel TALE nuclease scaffold enables high genome editing activity in combination with low toxicity (2011) Nucl. Acids Res. 39(21):9283-9293)에 기재된 대로, TALE-뉴클레아제, 또는 예컨대 Boissel et al. (MegaTALs: a rare-cleaving nuclease architecture for therapeutic genome engineering (2013) Nucleic Acids Research 42 (4):2591-2601)에 기재된 대로 MegaTAL 뉴클레아제를 코드하는 핵산이다.
또다른 예에 따라, 엔도뉴클레아제 시약은 참조로서 여기에 포함되는, 그 중에서도 Doudna, J., and Chapentier, E., (The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9 (2014) Science 346 (6213):1077)에 의한 교시에 따라 Cas9 또는 Cpf1와 같은 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제와 함께 사용되는 RNA-가이드이다.
본 발명의 선호되는 측면에 따라, 엔도뉴클레아제 시약은 세포들 내로 일시적으로 발현되는데, 이는 상기 시약이 RNA, 더욱 특히 mRNA, 단백질들 또는 단백질들 및 핵산들의 복합체들 (예: 리보튜클레오단백질들)의 경우들과 같이, 오랜 기간 동안 지속되거나 또는 게놈 내로 통합되도록 되어 있지 않다는 것을 의미한다.
일반적으로 80% 엔도뉴클레아제 시약은 형질주입(transfection)후, 30 시간, 바람직하게는 by 24, 더욱 바람직하게는 by 20 시간까지는 분해된다.
mRNA 형태 하 엔도뉴클레아제는 바람직하게는, 예컨대, Kore A.L., et al. (Locked nucleic acid (LNA)-modified dinucleotide mRNA cap analogue: synthesis, enzymatic incorporation, and utilization (2009) J Am Chem Soc. 131(18):6364-5)에 기재된 대로, 그 분야에 잘 알려진 기술들에 따라 그것의 안정성을 향상시키기 위하여 캡과 함께 합성된다.
일반적으로, 면역 세포들을 형질주입하는데 사용되는 전기천공 단계들은 보통, 참조로서 여기에 포함되는 WO/2004/083379, 특히 23 페이지, 25줄 부터 29 페이지 11 줄까지에 기재된 대로 치료 체적을 통하여 대체로 균일한, 100 볼트/cm보다 크고 5,000 볼트/cm보다 작은 상기 평행 플레이트 전극들 사이의 펄스 자기장을 만드는 평행 플레이트 전극들을 포함하는 폐쇄 챔버들에서 수행된다. 하나의 이러한 전기천공 챔버는 바람직하게는 챔버 부피 (cm3)에 의하여 나뉜 전극 갭 스퀘어드(squared) (cm2)의 몫에 의하여 정의된 거리 계수(geometric factor (cm-1)를 갖고, 이때 거리계수는 0.1 cm-1 이하이고, 이때 서열-특이적 시약 및 세포들의 현탁액은 매질이 0.01 내지 1.0 밀리지멘스(milliSiemens) 스패닝 범위에서 도전율을 갖도록 조정된 매질 내에 있다. 일반적으로, 세포들의 현탁액은 하나 이상의 펄스된 전기장들을 갖는다. 그 방법으로, 현탁액의 치료 체적은 저울로 측정 가능하고, 챔버에서 세포들의 처리 시간은 대체로 균일하다.
그것들의 더 높은 특이성 때문에 TALE-뉴클레아제는 예컨대 Mussolino et al. (TALEN® facilitate targeted genome editing in human cells with high specificity and low cytotoxicity (2014) Nucl. Acids Res. 42(10): 6762-6773)에 의하여 보고된 대로, 즉 ("5'" 또는 "앞(forward)"으로도 언급되는) "오른쪽" 모노머 및 ("3'" 또는 "역(reverse"로도 언급되는) "왼쪽" 모노머의 쌍에 의하여 작동되는 - 특히 헤테로다이머 형태들 하 치료적 적용을 위한 적절한 서열 특이적 뉴클레아제 시약들인 것이 입증되었다.
전술한 바와 같이, 서열 특이적 시약은 바람직하게는 희귀 절단 엔도뉴클레아제 또는 그것의 서브유닛을 코드하는 DNA 또는 RNA 형태 하와 같은, 핵산들의 형태 하이나, 그것들은 소위 "리보뉴클레오단백질들"과 같은 폴리펩타이드(들) 및 폴리뉴클레오타이드(들)을 수반하는 콘쥬게이트들의 부분일 수 있다. 이러한 콘쥬게이트들은 그것들 각각의 뉴클레아제들과 복합체가 될 수 있는 RNA 또는 DNA 가이드들을 포함하는, etsche, B. et al. (Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System (2015) Cell 163(3): 759-771) 및 Gao F. et al. (DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute (2016) Nature Biotech)에 의하여 각각 최근에 기재된 대로 Cas9 또는 Cpf1 (RNA-가이드된 엔도뉴클레아제들) 또는 Argonaute (DNA-가이드된 엔도뉴클레아제들)과 함께 형성될 수 있다.
"외인성 서열"은 선택된 자리에 처음에 존재하지 않았던 임의의 뉴클레오타이드 또는 핵산 서열을 가리킨다. 이 서열은 세포 내로 도입되는 외래 서열에 상동 또는 그 카피, 게놈 서열일 수 있다. 반대 "내생 서열"에 의하여, 자리에 처음에 존재하는 세포 게놈 서열이 의미된다. 외인성 서열은 바람직하게는 발현이 자리에 이 외인성 서열을 통합하지 않은 시스터 세포들에 치료적 이점을 부여하는 폴리펩타이드을 코드한다. 다른 폴리펩타이드를 발현시키기 위하여, 본 발명의 방법에 따라 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 삽입에 의하여 편집된 유전자인 내생 서열은 외인성 코딩 서열로 널리 가리켜진다.
본 발명의 방법은 나노입자들을 이용하여 형질주입 또는 바이러스 형질도입(transduction) 과 같은 유전적 형질전환들의 물리적인 것(physical)을 수반하는 다른 방법들과 관련될 수 있고, 또한 다른 유전자 불활성화 및/또는 이식유전자 삽입들과 조합될 수 있다.
한 측면에 따라, 본 발명에 따른 방법은 하기 단계들을 포함한다:
- 일차(primary) 면역 세포들의 군집을 제공하는 단계;
- 상기 일차(primary) 면역 세포들의 일부 내로 도입하는 단계:
i) 상기 면역 세포들 군집의 치료 가능성을 개선하는 적어도 하나의 분자를 코드하기 위하여 선택된 내생 자리에서 통합되는 외인성 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산;
ii) 상기 선택된 내생 자리를 특이적으로 타겟으로 하는 적어도 하나의 서열-특이적 시약
이때 상기 외인성 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 상기 외인성 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 상기 내생 자리 내로 타겟이 된 유전자 통합에 의하여 삽입되어, 상기 외인성 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 상기 자리에 존재하는 내생 프로모터의 전사 조절 하 외인성 코딩 서열을 형성한다.
그 방법의 한 측면에 따라, 서열 특이적 시약은 뉴클레아제이고 타겟이 된 유전자 통합은 상기 면역 세포들 내로 상동 재조합 또는 NHEJ에 의하여 작동된다.
본 발명의 추가의 측면에 따라, 상기 내생 프로모터는 면역 세포 활성화 동안 활성인 것이 선택되고 바람직하게는 상향-조절된다.
더 특이적으로, 본 발명은 세포 면역요법을 위한 조작된 일차(primary) 면역 세포들을 제공하는 방법에 대한 것이고, 상기 방법은 하기를 포함한다:
- 일차 면역 세포들의 군집을 제공하는 단계;
- 상기 일차 면역 세포들의 일부 내로 도입하는 단계:
i) 상기 면역 세포들 군집의 치료 가능성을 향상시키는 적어도 하나의 분자를 코드하는 외인성 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 외인성 핵산;
ii) 면역 세포 활성화 동안 활성인 내생 프로모터의 통제 하에 있는 유전자를 특이적으로 타겟으로 하는 적어도 하나의 서열-특이적 뉴클레아제 시약;
이때 상기 코딩 서열은 타겟이 된 상동 재조합에 의하여 일차(primary) 면역 세포들 게놈 내로 도입되어, 상기 코딩 서열이 상기 유전자의 적어도 하나의 내생 프로모터의 전사 조절 하에 위치하게 된다.
"치료 가능성을 개선하는"에 의하여 조작된 면역 세포들이 그것들의 시스터 조작되지 않은 면역 세포들에 비하여 세포 요법에서 그것들의 사용을 위한 적어도 하나의 이로운 물성을 갖는 것이 의미된다. 본 발명에 의하여 추구되는 치료적 물성은 관련된 과학 문헌에서 언급된 대로 임의로 측정가능한 것일 수 있다.
개선된 치료 가능성은 더욱 특히 약물에 대한 면역 세포들의 내성, 인-비트로 또는 인-비보에서 그것들의 지속의 증가, 또는 치료적 조성물들 및 치료들의 제조 동안 더 안전하고/더 편리한 취급에 의하여 반영될 수 있다.
일반적으로 치료 가능성을 개선하는 상기 분자는 폴리펩타이드이지만, 그것은 또한 가이드-RNA들 또는 간섭(interference) RNA들과 같은, 다른 유전자들의 발현을 억제하거나 또는 향하게 하는 것이 가능한 핵산일 수 있다. 폴리펩타이드들은 신호 전달자들 또는 전사 조절자들과 같이 직접적 또는 간접적으로 작용할 수 있다.
본 발명의 한 예에 따라, 외인성 서열은 타겟이 되는 상동 재조합에 의하여 내생 염색체 DNA 내로 도입된다. 따라서, 면역 세포 내로 도입되는 외인성 핵산은 생리학적 조건들 하 내생 염색체 서열들과 혼성화할 수 있는 서열들과 마찬가지로, 적어도 하나의 코딩 서열(들)을 포함한다. 일반적으로 이러한 상동 서열들은 삽입 자리에 위치된 내생 유전자 서열들과 적어도 70 %, 바람직하게는 80% 그리고 더욱 바람직하게는 90% 서열 동일성(identity)을 보인다. 이들 상동 서열들은 예컨대 US 6,528,313에서 이미 교시된 대로 재조합의 정확성을 개선시키기 위하여 코딩 서열의 측면에 있을 수 있다(flank). 이용가능한 소프트웨어 및 온라인 게놈 데이터베이스들을 이용하여, 내생 유전자의 프로모터인 적어도 하나의 내생 프로모터의 전사 조절 하, 상기 서열(들)이 정확한 자리에서 도입되는 그러한 방식으로, 상기 코딩 서열 (들)을 포함하는 벡터들을 설계하는 것이 가능하다. 외인성 코딩 서열(들)은 그 다음에 바람직하게는 상기 내생 유전자와 "인 프레임(n frame)" 삽입된다. 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열(들)의 통합으로부터 생기는 서열들은 융합 단백질들, 태깅된(tagged) 단백질 또는 돌연변이된 단백질들을 포함하는 많은 다른 종류들의 단백질들을 코드할 수 있다. 융합 단백질들은 카스파제(caspase)-9 스위치와 같은, 상기 단백질의 활성을 켜거나 또는 끄는데 사용될 수 있는 다이머화 도메인과 같은, 세포에서 발현되는 단백질들에 새로운 기능적 도메인들을 추가하는 것을 가능하게 한다. 태깅된(tagged) 단백질들은 조작된 면역 세포들의 검출 및 상기 세포들로 치료된 환자들의 후속조치에 유리할 수 있다. 단백질들 내로 돌연변이를 도입하는 것은 하기에 추가로 기재되는, 면역 소모 제제들 또는 약물들에 내성을 부여할 수 있다.
면역 소모 제제들 또는 약물들에 대한 내성 부여
본 방법의 한 측면에 따라, 면역 세포들 게놈 자리 내로 통합된 외인성 서열은 약물에 상기 면역 세포들의 내성을 부여하는 분자를 코드한다.
선호되는 외인성 서열들의 예들은 메토트렉사트(methotrexate)와 같은 엽산(folate) 유사체들에 내성을 부여하는 디하이드로엽산(dihydrofolate) 환원효소(reductase) (DHFR)의 변종들, 마이코페놀산(mycophenolic acid) (MPA) 또는 그것의 프로드러그인 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil) (MMF)과 같은 IMPDH 억제제들에 내성을 부여하는 이노신(inosine) 모노포스페이트(monophosphate) 디하이드로게나제(dehydrogenase) 2 (IMPDH2)의 변종들, FK506 및/또는 CsA와 같은 칼시뉴린 억제제에 내성을 부여하는 메틸구아닌(methylguanine) 트랜스페라제(transferase) (MGMT) 또는 칼시뉴린의 변종들, 라파마이신(rapamycin)에 내성을 부여하는 mTORmut와 같은 mTOR의 변동들, 및 이마티닙(Imatinib) 및 글리벡(Gleevec)에 내성을 부여하는 Lckmut과 같은, Lck의 변종들이다.
용어 "약물"은 화합물 또는 그것의 유도체, 바람직하게는 암 세포와 상호작용하여 이로써 세포의 증식하는 또는 살아 있는 상태를 감소시키기 위하여 일반적으로 사용되는 표준 화학요법 제제를 가리키는 것으로 여기에서 사용된다. 화학요법 제제들의 예들은 알킬화제들 (예컨대, 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide)), 대사 길항제들(antagonists) (예컨대, 클로파라빈, 플루다라빈 또는 2'-디옥시아데노신, 메토트렉사트 (MTX), 5-플루오로우라실 또는 그 유도체들), 항종양 항생제들 (예컨대, 마이토마이신(mitomycin), 아드리아마이신(adriamycin)), 식물-유래 항종양 제제들 (예컨대, 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 탁솔(taxol)), 시스플라틴(cisplatine), 카보플라틴(carboplatine), 에토포사이드(etoposide) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 제제들은 항-암 제제들 TRIMETHOTRIXATE™ (TMTX), TEMOZOLOMIDE™, RALTRITREXED™, S-(4-나이트로벤질)-6-티오이노신 (NBMPR),6-benzyguanidine (6-BG), 비스(bis)-클로로니트로소우레아(chloronitrosourea) (BCNU) 및 CAMPTOTHECIN™, 또는 임의의 그것의 치료적 유도체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
여기에서 사용된 대로, 면역 세포는 상기 약물의 (변형되지 않은 세포(들) 또는 세포들의 군집에 대하여 결정된 상기 IC50) 반(half) 최대(maximal) 억제(inhibitory) 농도(concentration) (IC50)를 포함하는 배양 배지 내에, 적어도 인-비트로에서, 증식하는 것이 가능하도록 상기 세포, 또는 세포들의 군집이 변형될 때 약물에 대하여 "내성(resistant) 또는 용인(tolerant)"하도록 만들어진다.
특정 예에서, 상기 약물 내성은 적어도 하나의 "약물 내성 코딩 서열"의 발현에 의하여 면역 세포들에 부여될 수 있다. 상기 약물 내성 코딩 서열은 상기 언급된 화학요법 제제들 중 하나와 같은, 제제에 대한 "내성"을 부여하는 핵산 서열을 가리킨다. 본 발명의 약물 내성 코딩 서열은 항-대사산물, 메토트렉사트, 빈블라스틴, 시스플라틴, 알킬화 제제들, 안트라사이클린들(anthracyclines), 세포독성 항생제들, 항-이뮤노필린들(immunophilins), 그것들의 유사체들 또는 유도체들 등에 내성을 코드할 수 있다 (Takebe, N., S. C. Zhao, et al. (2001) "Generation of dual resistance to 4-hydroperoxycyclophosphamide and methotrexate by retroviral transfer of the human aldehyde dehydrogenase class 1 gene and a mutated dihydrofolate reductase gene". Mol. Ther. 3(1): 88-96), (Zielske, S. P., J. S. Reese, et al. (2003) "In vivo selection of MGMT(P140K) lentivirus-transduced human NOD/SCID repopulating cells without pretransplant irradiation conditioning." J. Clin. Invest. 112(10): 1561-70) (Nivens, M. C., T. Felder, et al. (2004) "Engineered resistance to camptothecin and antifolates by retroviral coexpression of tyrosyl DNA phosphodiesterase-I and thymidylate synthase" Cancer Chemother Pharmacol 53(2): 107-15), (Bardenheuer, W., K. Lehmberg, et al. (2005). "Resistance to cytarabine and gemcitabine and in vitro selection of transduced cells after retroviral expression of cytidine deaminase in human hematopoietic progenitor cells". Leukemia 19(12): 2281-8), ( Kushman, M. E., S. L. Kabler, et al. (2007) "Expression of human glutathione S-transferase P1 confers resistance to benzo[a]pyrene or benzo[a]pyrene-7,8-dihydrodiol mutagenesis, macromolecular alkylation and formation of stable N2-Gua-BPDE adducts in stably transfected V79MZ cells co-expressing hCYP1A1" Carcinogenesis 28(1): 207-14).
본 발명에 따라 면역 세포들에서 이러한 약물 내성 외인성 서열들의 발현은 더욱 특히 세포 요법 치료 계획들에서 상기 면역 세포들의 이용을 가능하게 하는데, 이때 세포 요법은 이들 약물들로 전에 치료받은 환자들 내로 또는 화학요법과 결합된다.
몇몇 약물 내성 코딩 서열들이 본 발명에 따른 약물 내성을 부여하기 위하여 잠재적으로 사용될 수 있는 것으로 확인되어 왔다. 약물 내성 코딩 서열의 한 예는 예컨대 디하이드로엽산(Dihydrofolate) 환원효소(reductase) (DHFR)의 돌연변이 또는 변형된 형태일 수 있다. DHFR은 세포에서 테트라하이드로폴레이트(tetrahydrofolate)의 양을 조절하는데 관여되는 효소이며, DNA 합성에 필수적이다. 메토트렉사트 (MTX)와 같은 엽산 유사체들은 DHFR을 억제하고, 이런 식으로 임상에서 항-신생 제제들로 사용된다. 치료에서 사용되는 항-엽산들에 의한 억제에 증가된 내성을 갖는 DHFR의 다른 돌연변이 형태들이 기재되어 왔다. 특정 예에서, 본 발명에 따른 약물 내성 코딩 서열은 인간 야생형 DHFR (GenBank: AAH71996.1)의 돌연변이 형태를 코드하는 핵산 서열일수 있는데, 이는 메토트렉사트와 같은 항-엽산 치료에 내성을 부여하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 특정 예에서, DHFR의 돌연변이 형태는 G15, L22, F31 또는 F34 위치에서, 바람직하게는 L22 또는 F31 위치들에서 적어도 하나의 돌연변이된 아미노산을 포함한다 (Schweitzer et al. (1990) "Dihydrofolate reductase as a therapeutic target" Faseb J 4(8): 2441-52; International application WO94/24277; 및 US patent US 6,642,043). 특정 예에서, 상기 DHFR 돌연변이 형태는 L22 및 F31 위치들에서 돌연변이된 두 개의 아미노산들을 포함한다. 여기에 기재된 아미노산 위치들의 관련성은 야생형 DHFR 폴리펩타이드의 형태의 아미노산들의 위치들의 면에서 자주 표현된다. 특정 예에서, 15 위치에서 세린 잔기은 바람직하게는 트립토판 잔기로 대체된다. 또다른 특정 예에서, 22 위치의 류신 잔기는 바람직하게는 항엽산제들에 대한 돌연변이 DHFR의 결합을 방해할 아미노산으로, 바람직하게는 페닐알라닌 또는 티로신과 같은 전하를 띠지 않은 아미노산 잔기들로 대체된다. 또다른 특정 예에서, 31 또는 34 위치들에서 페닐알라닌 잔기는 알라닌, 세린 또는 글리신과 같은 작은 친수성 아미노산으로 대체된다.
약물 내성 코딩 서열의 또다른 예는 또한 구아노신(guanosine 뉴클레오타이드들의 데노보(de novo) 합성에서의 속도(rate)-제한(limiting) 효소인, 이오니신(ionisine)-5'-모노포스페이트(monophosphate) 디하아드로게나제(dehydrogenase) II (IMPDH2)의 돌연변이 또는 변형된 형태일 수 있다. IMPDH2의 돌연변이 또는 변형된 형태는 IMPDH 억제제 내성 유전자이다. IMPDH 억제제들은 마이코페놀산(mycophenolic acid) (MPA) 또는 그것의 프로드러그인 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil) (MMF)일 수 있다. 돌연변이 IMPDH2는 IMPDH 억제제에 대하여 상당히 증가된 내성을 이끄는 야생형 인간 IMPDH2 (Genebank: NP_000875.2)의 MAP 결합 부위에서 적어도 하나, 바람직하게는 두 개의 돌연변이들을 포함할 수 있다. 이들 변종들의 돌연변이들은 바람직하게는 T333 및/또는 S351 위치들에서이다 (Yam, P., M. Jensen, et al. (2006) "Ex vivo selection and expansion of cells based on expression of a mutated inosine monophosphate dehydrogenase 2 after HIV vector transduction: effects on 림프구들, monocytes, and CD34+ stem cells" Mol. Ther. 14(2): 236-44)(Jonnalagadda, M., et al. (2013) "Engineering human T cells for resistance to methotrexate and mycophenolate mofetil as an in vivo cell selection strategy." PLoS One 8(6): e65519).
또다른 약물 내성 코딩 서열은 칼시뉴린(calcineurin)의 돌연변이 형태이다. 칼시뉴린(PP2B - NCBI: ACX34092.1)은 많은 생물학적 과정에 관여되는 아주 흔하게 발현되는 세린/트레오닌 단백질 포스파타제이며, T-세포 활성화의 중심이다. 칼시뉴린은 촉매성 서브유닛 (CnA; 세 개의 아이소형태들(isoforms)) 및 조절성 서브유닛 (CnB; 두 개의 아이소형태들)로 이루어진 헤테로다이머이다. T-세포 수용체의 참여 후, 칼시뉴린은 전사 인자 NFAT을 탈인산화하는데, 이는 그것이 핵 및 IL2와 같은 활성화된 주요 타겟 유전자로 이동하는 것을 가능하게 한다. FKBP12와 복합체인 FK506, 또는 CyPA와 복합체인 사이클로스포린(cyclosporine) A (CsA)는 NFAT가 칼시뉴린의 활성 부위로 접근하는 것을 막아, 그것의 탈인산화를 방지하고, 이로써 T-세포 활성화를 억제한다 (Brewin et al. (2009) "Generation of EBV-특이적 cytotoxic T 세포들 that are resistant to 칼시뉴린 inhibitors for the treatment of posttransplantation lymphoproliferative disease" Blood 114(23): 4792-803). 특정 예에서, 상기 돌연변이 형태는 위치들: V314, Y341, M347, T351, W352, L354, K360에서 야생형 칼시뉴린 헤테로다이머 a의 적어도 하나의 돌연변이된 아미노산, 바람직하게는 T351 및 L354 또는 V314 및 Y341 위치들에서 이중 돌연변이들을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 341 위치의 발린 잔기는 리신 또는 알기닌 잔기로 대체될 수 있고, 341 위치의 티로신 잔기는 페닐알라닌 잔기로 대체될 수 있고, 347 위치의 메티오닌은 글루탐산, 알기닌 또는 트립토판(tryptophane) 잔기로 대체될 수 있고, 351 위치의 트레오닌은 글루탐산 잔기로 대체될 수 있고, 352 위치의 트립토판(tryptophane) 잔기는 시스테인, 글루탐산 또는 알라닌 잔기로 대체될 수 있고, 353 위치의 세린은 히스티딘 또는 아스파라긴들 잔기로 대체될 수 있고, 354 위치의 류신은 알라닌 잔기로 대체될 수 있고; 360 위치의 리신은 알라닌 또는 페닐알라닌 잔기로 대체될 수 있다. 또다른 특정 예에서, 상기 돌연변이 형태는 V120, N123, L124 또는 K125 위치들에서 야생형 칼시뉴린 헤테로다이머 b의 적어도 하나의 돌연변이된 아미노산을, 바람직하게는 L124 및 K125 위치들에서 바람직하게는 이중 돌연변이들을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 아미노산 서열에서 120 위치의 발린은 세린, 아스파르트산, 페닐알라닌 또는 류신 잔기로 대체될 수 있고; 123 위치의 아스파라긴은 트립토판, 리신, 페닐알라닌, 알기닌, 히스티딘 또는 세린으로 대체될 수 있고; 124 위치의 류신은 트레오닌 잔기로 대체될 수 있고; 125 위치의 리신은 알라닌, a 글루탐산, 트립토판으로 대체될 수 있거나, 또는 류신-알기닌 또는 이소류신-글루탐산과 같은 두 개 잔기들이 125 위치의 리신 뒤에 첨가될 수 있다. 여기에 기재된 아미노산 위치들의 관련성은 야생형 인간 칼시뉴린 헤테로다이머 b 폴리펩타이드 (NCBI: ACX34095.1)의 형태의 아미노산들의 위치들의 면에서 자주 표현된다.
또다른 약물 내성 코딩 서열은 인간 알킬(alkyl) 구아닌(guanine) 트랜스페라제(transferase) (hAGT)를 코드하는 0(6)-메틸구아닌(methylguanine) 메틸트랜스페라제(methyltransferase) (MGMT- UniProtKB: P16455) 이다. AGT는 니트로소우레아들(nitrosoureas) 및 테모졸로미드(temozolomide) (TMZ)와 같은 알킬화제들의 세포독성 효과들에 내성을 부여하는 DNA 수선 단백질이다. 6-벤질구아닌(benzylguanine) (6-BG)은 니트로소우레아 독성을 강하게 하는 AGT의 억제제이며, 이 제제의 세포독성 효과들을 강하게 하기 위하여 TMZ와 함께 공-투여된다. AGT의 변종들을 코드하는 MGMT의 몇몇 돌연변이 형태들은 6-BG에 의한 불활성화에 매우 내성이지만, DNA 손상을 수선하는 그것들의 능력을 유지한다 (Maze, R. et al. (1999) "Retroviral-mediated expression of the P140A, but not P140A/G156A, mutant form of O6-methylguanine DNA methyltransferase protects hematopoietic cells against O6-benzylguanine sensitization to chloroethylnitrosourea treatment" J. Pharmacol. Exp. Ther. 290(3): 1467-74). 특정 예에서, AGT 돌연변이 형태는 야생형 AGT P140 위치의 돌연변이된 아미노산을 포함할 수 있다. 바람직한 예에서, 140 위치에서 상기 프롤린은 리신 잔기로 대체된다.
또다른 약물 내성 코딩 서열은 다중약물(multidrug) 내성(resistance) 단백질 (MDR1) 유전자이다. 이 유전자는 세포 막을 가로지르는 대사 부산물들의 이동에 관여되는 P-당단백질(glycoprotein) (P-GP)로 알려진 막 당단백질을 코드한다. P-Gp 단백질은 몇몇 구조적으로 관련없는 화학요법 제제들을 향한 넓은 특이성을 보인다. 이런 식으로, 약물 내성은 MDR-1 (Genebank NP_000918)을 코드하는 핵산 서열의 발현에 의하여 세포들에 부여될 수 있다.
또다른 약물 내성 코딩 서열은 ble 또는 mcrA 유전자들로부터의 그것들과 같은, 세포독성 항생제들의 생선에 공헌할 수 있다. 면역 세포에서 ble 유전자 또는 mcrA의 이소성(ectopic) 발현은 각각 화학치료 제제들 블레오마이신(bleomycine) 및 미토마이신(mitomycin) C에 노출될 때 선택적 이점을 준다 (Belcourt, M.F. (1999) “Mitomycin resistance in mammalian cells expressing the bacterial mitomycin C resistance protein MCRA”. PNAS. 96(18):10489-94).
또다른 약물 내성 코딩 서열은 Lorenz M.C. et al. (1995) “TOR Mutations Confer Rapamycin Resistance by Preventing Interaction with FKBP12-Rapamycin” The Journal of Biological Chemistry 270, 27531-27537에 기재된 것과 같이 라파마이신에 내성을 부여하는 mTOR의 돌연변이된 변종들 (mTOR mut), 또는 Lee K.C. et al. (2010) “Lck is a key target of imatinib and dasatinib in T-cell activation”, Leukemia, 24: 896-900에 기재된 대로 글리벡에 내성을 부여하는 Lck의 특정 돌연변이된 변종들 (Lckmut)과 같은 약물 타겟들의 돌연변이된 버젼을 코드하는 유전자들로부터 올 수 있다.
전술한 바와 같이, 방법의 유전적 변형 단계는 적어도 내생 유전자 및 외인성 핵산 사이에 발생하는 상동 재조합과 같은 내생 유전자의 부분 및 약물 내성 코딩 서열을 코드하는 서열을 포함하는 외인성 핵산의 세포들 내로의 도입 단계를 포함할 수 있다. 특정 예에서, 상기 내생 유전자는 야생형 "약물 내성" 유전자일 수 있어, 상동 재조합 후, 야생형 유전자는 약물에 내성을 부여하는 유전자의 돌연변이 형태에 의하여 대체된다.
인-비보에서 면역 세포들의 지속성 향상
본 방법의 한 측면에 따라, 면역 세포들 게놈 자리 내로 통합되는 외인성 서열은 면역 세포들의 지속성, 특히 종양 환경에서 인-비보 지속성을 향상시키는 분자를 코드한다.
"지속성을 향상시키는" 것에 의하여 특히 조작된 면역 세포들이 환자 내로 주사되면, 수명의 면에서 면역 세포들의 생존이 연장되는 것이 의미된다. 예컨대, 변형된 세포들의 평균 생존이 변형되지 않은 세포들의 그것보다 상당히, 적어도 10%, 바람직하게는 20%, 더욱 바람직하게는 30%, 더욱 더 바람직하게는 50%로, 길어지면, 지속성이 향상된다.
이것은 특히 면역 세포들이 동종이계일 때 관련된다. 이것은 세포막에서 또는 이를 통하여 면역억제성 폴리펩타이드들을 이소성으로(ectopically) 발현 및/또는 분비하는 코딩 서열들을 도입함으로써 국소적 면역 보호를 만들어냄으로써 이루어질 수 있다. 이러한 폴리펩타이드들의 여러가지 패널 특히 면역 체크포인트들의 길항제들, 바이러스 외피로부터 유래된 면역억제성 펩타이드들 또는 NKG2D 리간드는 환자들 내로 동종이계 면역 세포들의 이식(engraftment) 및/또는 지속성을 향상시킬 수 있다.
한 예에 따라, 상기 외인성 코딩 서열에 의하여 코드되는 면역억제성 폴리펩타이드는 세포독성(Cytotoxic) T-림프구(Lymphocyte) 항원(Antigen) 4 (CD152로도 불리는 CTLA-4, GenBank accession number AF414120.1)의 리간드이다. 상기 리간드 폴리펩타이드는 바람직하게는 CTLA-4a Ig 및 CTLA-4b Ig 또는 그것의 기능적 변종과 같은 항-CTLA-4 면역글로불린이다.
한 예에 따라, 상기 외인성 코딩 서열에 의하여 코드되는 면역억제성 폴리펩타이드는 Ig V-유사(like) 도메인, Ig C-유사 도메인, 소수성 막관통 도메인 및 30 아미노산들의 세포질 꼬리로 구성되는 290 아미노산들의 타입 I 막관통 단백질을 코드하는, PD-L1 (다른 명칭: CD274, 프로그램된 세포사 1 리간드; 인간 폴리펩타이드 서열 Q9NZQ7에 대한 ref. UniProt)와 같은, PD1의 길항제이다. PD-L1 리간드의 이러한 막-결합된 형태는 예컨대 하나 이상의 돌연변이(들)을 갖고, 또는 세포내 도메인의 제거에 의하여, 와 같은 뭉툭한(truncated) 형태 또는 원래의 형태 (야생형) 하 본 발명에서 의미된다 (Wang S et al., 2003, J Exp Med. 2003; 197(9): 1083-1091).. 중요하게, PD1은 본 발명에 따른 PD-L1 리간드의 막-결합된 형태로 고려되지 않는다. 또다른 예에 따라, 상기 면역억제성 폴리펩타이드는 분비된 형태 하이다. 이러한 재조합 분비된 PD-L1 (또는 용해성 PD-L1)은 면역글로불린의 Fc 부분에 PD-L1의 세포외 도메인을 융합시킴으로써 만들어질 수 있다 (Haile ST et al., 2014, Cancer Immunol. Res. 2(7): 610-615; Song MY et al., 2015, Gut. 64(2):260-71). 이 재조합 PD-L1은 PD-1을 중화시키고 PD-1-mediated T-세포 억제를 파기할 수 있다. PD-L1 리간드 는 둘 다의 향상된 지속성을 위하여도 CTLA4 Ig와 공-발현될 수 있다.
또다른 예에 따라, 외인성 서열은 예컨대 HIV-1, HIV-2, SIV, MoMuLV, HTLV-I, -II, MPMV, SRV-1, Syncitin 1 또는 2, HERV-K 또는 FELV로부터 유래된, 바이러스 외피 면역억제성(immusuppressive) 도메인 (ISU)을 포함하는 폴리펩타이드를 코드한다.
하기 표 1은 본 발명에서 발현될 수 있는 다양한 바이러스로부터의 ISU 도메인의 변종들을 보여준다.
Figure pct00001
표 1: 다양한 바이러스들로부터의 ISU 도메인 변종들
또다른 예에 따라, 외인성 서열은 gp41과 같은 FP 폴리펩타이드를 코드한다. 하기 표 2는 자연적 그리고 인공적 기원들로부터 몇몇 FP 폴리펩타이드를 나타낸다.
Figure pct00002
표 2: 자연적 그리고 인공적 기원들로부터 FP 폴리펩타이드의 아미노산 서열들
또다른 예에 따라, 외인성 서열은 Margalit A. et al. (2003) “Chimeric β2 microglobulin/CD3ζ polypeptides expressed in T cells convert MHC class I peptide ligands into T cell activation receptors: a potential tool for specific targeting of pathogenic CD8+ T cells” Int. Immunol. 15 (11): 1379-1387에 의하여 기재된 것과 같이 비-인간 MHC 상동체(homolog), 특히 바이러스 MHC 상동체, 또는 키메라 β2m 폴리펩타이드를 코드한다.
한 예에 따라, 외인성 서열은 NKG2D 리간드를 코드한다. 사이토메갈로바이러스들과 같은 몇몇 바이러스들은 NKG2D 리간드들에 결합할 수 있고 그것들의 표면 발현을 방지할 수 있는 단백질을 분비함으로써 NK 세포 매개 면역 감시를 피하고 NKG2D 경로를 간섭하는 메커니즘을 수득하였다 (Welte, S.A et al. (2003) “Selective intracellular retention of virally induced NKG2D ligands by the human cytomegalovirus UL16 glycoprotein”. Eur. J. Immunol., 33, 194?203). In tumors cells, some mechanisms have evolved to evade NKG2D response by secreting NKG2D ligands such as ULBP2, MICB or MICA (Salih HR, Antropius H, Gieseke F, Lutz SZ, Kanz L, et al. (2003) Functional expression and release of ligands for the activating immunoreceptor NKG2D in leukemia. Blood 102: 1389-1396). 종양들 세포들에서, 몇몇 메커니즘들은 ULBP2, MICB 또는 MICA와 같은 NKG2D 리간드들을 분비함으로써 NKG2D 반응을 피하도록 진화하였다 (Salih HR, Antropius H, Gieseke F, Lutz SZ, Kanz L, et al. (2003) Functional expression and release of ligands for the activating immunoreceptor NKG2D in leukemia. Blood 102: 1389-1396).
한 예에 따라, 외인성 서열은 IL-12 수용체와 같은 사이토카인 수용체를 코드한다. IL-12는 면역 세포들 활성화의 잘 알려진 활성자(activator)이다 (Curtis J.H. (2008) “IL-12 Produced by Dendritic Cells Augments CD8+ T Cell Activation through the Production of the Chemokines CCL1 and CCL171”. The Journal of Immunology. 181 (12): 8576-8584.
한 예에 따라 외인성 서열은 억제성 펩타이드들 또는 단백질들에 대항하여 향해지는 항체를 코드한다. 상기 항체는 바람직하게는 면역 세포들에 의하여 용해성 형태로 분비된다. 상어 및 낙타들로부터의 나노바디들은 이 관점에서 유리한데, 이는 그것들이 단일 체인 항체들로서 구조화되기 때문이다 (Muyldermans S. (2013) “Nanobodies: Natural Single-Domain Antibodies” Annual Review of Biochemistry 82: 775-797). 몇몇은 또한 단일 폴리펩타이드들의 분비 및 용해성 친수성 도메인들과 쉽게 융합하는 것으로 간주된다.
세포들의 지속성을 향상시키기 위한 상기 개발된 다른 측면들은, 외인성 코딩 서열이 추가로 기재되는 것과 같이 또다른 MHC 요소 또는 β2m을 코드하는 내생 유전자를 붕괴시킴으로써 유도될 때 특히 선호된다.
면역 세포들의 치료적 활성의 향상
본 방법의 한 측면에 따라 면역 세포들 게놈 자리 내로 통합되는 외인성 서열은 면역 세포들의 치료적 활성을 향상시키는 분자를 코드한다.
"치료적 활성을 향상"시키는 것에 의하여, 본 발명에 따라 조작된, 면역 세포들, 또는 세포들의 군집이 타겟 세포들의 선택된 종류에 대하여 조작되지 않은 세포들 또는 세포들의 군집보다 더 공격적으로 된다. 상기 타겟 세포들은 일반적으로, 바람직하게는 공통의 표면 마커(들)에 의하여 특징된, 정의된 종류들의 세포들, 또는 세포들의 군집에 속한다. 본 명세서에서, "치료 가능성(potential)"은 인-비트로 실험들을 통하여 측정된 대로, 치료적 활성을 반영한다. 일반적인 민감한 암에서, Daudi 세포들과 같은, 세포주들은 면역 세포들 세퍼 용해 또는 성장 감소 측정들을 수행함으로써 상기 세포들을 향하여 더 또는 덜 활성인지 여부를 평가하는데 사용된다. 이것은 또한 케모카인들 또는 면역 세포들의 탈과립화 및 사이토카인들 생산의 수준들을 측정함으로써 평가될 수 있다. 실험들은 또한 종양 세포들의 주사로, 그리고 그 결과인 종양 확장의 모니터링에 의하여 마우스들에서 수행될 수 있다. 활성의 향상은 이들 실험들에서 발달하는 세포들의 수가 면역 세포들에 의하여 10% 초과, 바람직하게는 20% 초과, 더욱 바람직하게는 30 % 초과, 더욱 더 바람직하게는 50 % 초과로, 감소될 때 중요한 것으로 간주된다.
본 발명의 한 측면에 따라, 상기 외인성 서열은 IL-12와 같은 사이토카인 또는 케모카인을 코드한다. 그것은 특히 IL-12를 발현시키는데 유리한데, 이는 이 사이토카인이 면역 세포 활성화를 촉진하는 것으로 널리 문헌에서 언급되기 때문이다 (Colombo M.P. et al. (2002) “Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy” Cytokine Growth Factor Rev. 13(2):155-68).
본 발명의 선호되는 측면에 따라, 외인성 코딩 서열은 상기 면역 세포들에 대한 그것들의 억제 효과를 경감시키기 위하여, T-조절 세포들과 같은, 면역 세포들의 다른 군집들에 작용하는 분비된 인자들을 촉진하거나 또는 코드한다.
본 발명의 한 측면에 따라, 조절 T-세포 활성의 억제제를 코드하는 상기 외인성 서열은 포크헤드(forkhead)/윙드(winged) 헬릭스(helix) 전사 인자 3 (FoxP3)의 폴리펩타이드 억제제이고 더욱 바람직하게는, P60로 언급된 것과 같이, FoxP3의 세포-관통 펩타이드 억제제이다 (Casares N. et al. (2010) “A peptide inhibitor of FoxP3 impairs regulatory T cell activity and improves vaccine efficacy in mice.” J Immunol 185(9):5150-9).
"조절 T-세포들 활성의 억제제"에 의하여 T-세포들에 의하여 분비되는 분자또는 상기 분자의 전구체가 의미되며, 이는 T-세포들이 조절 T-세포들에 의하여 발휘되는 하향 조절 활성을 피하는 것을 가능하게 한다. 일반적으로, 조절 T-세포 활성의 이러한 억제제는 상기 세포들에서 FoxP3 전사 활성을 감소시키는 효과를 가진다.
본 발명의 한 측면에 따라, 상기 외인성 서열은 CCR2/CCL2 중화 제제와 같은, 종양(Tumor) 관련(Associated) 대식세포들(Macrophages) (TAM)의 분비되는 억제제를 코드한다. 종양-관련 대식세포들 (TAMs)은 종양 미세환경의 중요한 조절자들이다. 임상병리학적 연구들은 종양들에서 TAM 축적이 빈약한 임상 결과와 관련이 있다는 것을 제안하였다. 그 증거와 일치하여, 실험적 및 동물 연구들은 TAM들이 종양 발달 및 진행을 촉진하기 위하여 선호되는 미세환경을 제공할 수 있다는 개념을 뒷받침하였다 (Theerawut C. et al. (2014) “Tumor-Associated Macrophages as Major Players in the Tumor Microenvironment” Cancers (Basel) 6(3): 1670-1690). 단핵구(monocyte) 화학유인물질(chemoattractant) 단백질 1 (MCP1 - NCBI NP_002973.1)으로도 불리는 케모카인 리간드 2 (CCL2)은 단핵구들, 림프구들 및 호염기성 세포들에 화학유인을 생산하는, 대식세포들에 의하여 분비되는 CC 케모카인 패밀리에 속하는 작은 사이토카인이다. CCR2 (C-C 케모카인 수용체 타입 2 - NCBI NP_001116513.2)는 CCL2의 수용체이다.
면역 세포들의 안전성 및 특이성 향상
키메라 항원 수용체들 (CAR)을 발현시키는 것은 종양들 또는 감염된 세포들을 치료하기 위한 NK-세포들 및 T-세포들과 같은, 일차(primary) 면역 세포들의 특이성을 개선하거나 또는 이로 향하게 하기 위한 최신식이 되었다. 이들 면역 세포들에 의하여 발현된 CAR들은 인-비보에서 이들 세포들을 파괴하기 위하여 상기 면역 세포들을 더 돕는, 병적인 세포들의 표면에서 항원 마커들을 특이적으로 타겟으로 한다 (Sadelain M. et al. “The basic principles of chimeric antigen receptor design” (2013) Cancer Discov. 3(4):388-98). CAR들은 보통 (소위 양성 CAR인) 특정 항원에 대한 결합에 반응하여 면역 세포들을 자극하는 활성화 도메인들을 포함하도록 설계되나, 그것들은 (소위 음성 CAR인) 반대 효과를 가진 억제 도메인 또한 포함할 수 있다 (Fedorov, V. D. (2014) “Novel Approaches to Enhance the Specificity and Safety of Engineered T Cells” Cancer Journal 20 (2):160-165. 양성 및 음성 CAR들은 타겟 세포들의 표면에 존재하는 여러가지 항원들에 의존적인 세포들 면역 특이성을 미세하게 조정하도록 조합되거나 또는 공-발현될 수 있다.
CAR들을 코드하는 유전적 서열들은 일반적으로 증가된 형질도입 효율을 가지지만 무작위 위치들에서 통합되는 레트로바이러스 벡터들을 이용하여 세포들 게놈 내로 도입된다. 여기에서, 본 발명에 따라, 키메라 항원 수용체 (CAR)의 요소들은 타겟이 된 유전자 재조합에 의하여 더욱 특히 내생 프로모터들의 통제 하, 선택된 자리들에서 도입될 수 있다.
한 측면에 따라, 양성 CAR가 바이러스 벡터에 의하여 면역 세포 내로 도입되는 반면, 음성 CAR는 타겟이 된 유전자 삽입 및 그 반대에 의하여 도입될 수 있고, 바람직하게는 면역 세포들 활성화 동안만 활성일 수 있다. 따라서, 억제 (즉 음성) CAR는 보존될 필요가 있는 주어진 세포 종류를 공격하기 위하여 면역 세포들을 방지함으로써 개선된 특이성에 기여할 수 있다. 여전히 이 측면에 따라, 상기 음성 CAR은 세포자멸사(apoptosis) CAR일 수 있는데, 이는 상기 CAR가 세포사를 유도하는 신호를 전달하는, FasL (CD95 - NCBI: NP_000034.1)과 같은 세포자멸사 도메인 또는 그것의 기능적 변종을 포함한다는 것을 의미한다 (Eberstadt M; et al. "NMR structure and mutagenesis of the FADD (Mort1) death-effector domain" (1998) Nature. 392 (6679): 941-5).
따라서, 본 발명에 따라 삽입되는 외인성 코딩 서열은 다른 화합물(들)을 활성화시킴으로써, 또는 그와 조합하여, 직접적으로, 세포사를 유도하는 능력을 갖는 인자를 코드할 수 있다.
일차(primary) 면역 세포들의 사용의 안전성을 향상시키는 또다른 방법으로서, 외인성 코딩 서열은 다른 외인성 기질들 또는 약물들에 면역 세포들의 민감도를 부여하는 분자들을 코드할 수 있다. 이러한 분자들은 사이클로포스파미드(cyclophosphamide) 및/또는 이소포스파미드(isophosphamide)와 같은, 약물에 대한 면역 세포들의 과민증을 부여하는, P450 패밀리(Preissner S et al. (2010) “SuperCYP: a comprehensive database on Cytochrome P450 enzymes including a tool for analysis of CYP-drug interactions”. Nucleic Acids Res 38 (Database issue): D237-43),CYP2D6-1 (NCBI - NP_000097.3), CYP2D6-2 (NCBI - NP_001020332.2), CYP2C9 (), CYP3A4 (NCBI - NP_000762.2), CYP2C19 (NCBI - NP_000760.1) 또는 CYP1A2 (NCBI - NP_000752.2.) 으로부터의 것과 같은, 사이토크롬(들)일 수 있다.
본 발명의 추가적 측면에 따라, 외인성 서열은 잠재적 사이토카인(Cyokine) 방출(Release) 증후군(Syndrome) (CRS)의 측면에서 IL-6 또는 IL-8 트랜스 신호전달을 감소시키기 위하여, 특히 인 비보에서, 그것의 발현을 위하여 면역 세포들에 도입된다.
이러한 외인성 서열은 예컨대 그것들의 수용체들 IL-6R 또는 IL-8R에 대항하여 또는 IL-6 또는 IL-8 에 대항하여 향해지는 항체들을 코드할 수 있다.
선호되는 측면에 따라 상기 외인성 서열은 서열번호 61과 적어도 80% 동일성을 보이는 것과 같은, GP130의 용해성 세포외 도메인을 코드할 수 있다.
GP130의 이러한 용해성 세포외 도메인은 예컨대 Rose-John S. [The Soluble Interleukine Receptor: Advanced Therapeutic Options in Inflammation (2017) Clinical Pharmacology & Therapeutics, 102(4):591-598]에 의하여 기재되며, sgp130Fc (서열번호 62)와 같은 면역글로불린들의 단편들과 융합될 수 있다. 전술한 바와 같이, 상기 외인성 서열은, (즉 서열 특이적 뉴클레아제 시약들을 이용하여) 부위 특이적 돌연변이유발에 의하여 게놈 내로 안정적으로 통합될 수 있고, 표 6, 8 또는 9에 목록된 것과 같이, 면역 세포 활성화 동안 활성인 자리에서 내생 프로모터의 전사 활성 하 위치될 수 있고, 그리고 바람직하게는 CAR 의존적이거나 또는 CAR 활성화에 상향조절될 수 있다.
더 선호되는 예에 따라, 외인성 서열은 서열번호 : 31과 같은 항-CD22 CAR T-세포 폴리뉴클레오타이드 서열을 발현시키는 것과 같은, CAR 양성 면역 세포 내로 도입된다. 몇몇 더 특이적인 예들에 따라, GP130의 상기 용해성 세포외 도메인과 같은, IL-6 수용체 패밀리의 사이토카인 수용체와, 어울리고, 바람직하게는 간섭할 수 있는 폴리펩타이드를 코드하는 상기 외인성 서열은 PD1, CD25 또는 CD69 자리에서 통합된다. 본 발명에 따라, PD1 자리를 코드하는 내생 서열은 바람직하게는 상기 외인성 서열에 의하여 붕괴된다.
그러므로 본 발명은 세포 면역요법에서 CRS을 치료 또는 감소시키는 방법을 제공하고, 이때 세포들 또는 그것의 치료적 조성물은 환자들에게 투여되고, 상기 세포들은 GP130, sGP130Fc, 항-IL-6 또는 항-IL6R 항체, 항-IL-8 또는 항-IL8R 항체, 또는 그것의 임의의 융합을 포함하는 폴리펩타이드(들)을 분비하도록 유전적으로 변형된다.
조작된 면역 세포들의 선호되는 표현형들의 예들은 하기와 같다:
- [CAR]양성[GP130]양성
- [CAR]양성[GP130]양성
- [CAR]양성[TCR]음성 [GP130]양성 [PD1]음성
- [CAR]양성[TCR] 음성 [GP130]양성 [PD1]음성
- [CAR]양성[GP130]양성 [CD25]음성
- [CAR]양성[TCR] 음성 [GP130]양성 [CD25]음성
AAV 벡터들을 이용하여 일차(primary) 면역 세포들에서 유전자 타겟이 된 삽입의 효율 개선
본 명세서는 상기 자리들에서 상기 외인성 서열들의 적절한 삽입의 검출을 위한 서열들 및 수단들과 더불어, 내생 프로모터들, 특히 PD1 및 CD25과 프레임 내인 코딩 서열의 효율적 삽입을 수행하는데 유용한 도면들에 묘사된 대로 서열 특이적 시약들 및 기증자 주형들을 제공한다.
본 발명에 따른 기증자 주형들은 일반적으로 엔도뉴클레아제 시약들은 일반적으로 NHEJ 또는 상동 재조합에 의하여 게놈 내로의 그것들의 부위 특이적 삽입을 수득하기 위하여 활성화되는 때에, 핵 내로 기증자 주형들를 전달하기에 적합하게 그 분야에서 기재된 여러가지 벡터들 내로 포함될 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열들이다.
특별히, 본 발명은 하기 서열들 중 하나 또는 몇몇을 포함하는 PD1 자리에서 IL-15 (서열번호 59)의 발현을 위한 특정 기증자 폴리뉴클레오타이드들을 제공한다:
- 서열번호 :50과 동일성을 보이는 것과 같은, IL-15을 코드하는 서열;
- 바람직하게는 서열번호 :45 및 서열번호 :46의 폴리뉴클레오타이드 서열들을 포함하는, PD1 자리에 상동인 (왼쪽 및 오른쪽으로도 불리는) 업스트림 및 다운스트림 서열들;
- 선택적으로, 서열번호 :50과 동일성을 보이는 것과 같은, IL-15 수용체 (sIL-15R)의 용해성 형태를 코드하는 서열;
- 선택적으로, 서열번호 :53 (F2A), 서열번호 :54 (P2A) 및/또는 서열번호 :55 (T2A) 중 하나와 같은, 적어도 하나의 2A 펩타이드 절단 부위,
특별히, 본 발명은 하나 또는 몇몇의 하기 서열들을 포함하는 PD1 자리에서 IL-12 (서열번호 :58)의 발현을 위한 특정 기증자 폴리뉴클레오타이드들을 제공한다:
- 서열번호 :47과 동일성을 보이는 것과 같은, IL-12a를 코드하는 서열;
- 바람직하게는 서열번호 :45 및 서열번호 :46의 폴리뉴클레오타이드 서열들을 포함하는, PD1 자리에 상동인 (왼쪽 및 오른쪽으로도 불리는) 업스트림 및 다운스트림 서열들;
- 선택적으로, 서열번호 :48과 동일성을 보이는 것과 같은, IL-12b를 코드하는 서열;
- 선택적으로, 서열번호 :53 (F2A), 서열번호 :54 (P2A) 및/또는 서열번호 :55 (T2A) 중 하나와 같은 적어도 하나의 2A 펩타이드 절단 부위,
특별히, 본 발명은 하기 서열들 중 하나 또는 몇몇을 포함하는 PD1 자리에서 (서열번호 61을 포함하는) 용해성 GP130 의 발현을 위한 특정 기증자 폴리뉴클레오타이드들을 제공한다:
- 용해성 GP130, 바람직하게는 서열번호 :62과 동일성을 보이는 것과 같은, Fc에 융합된 용해성 gp130를 코드하는 서열;
- 바람직하게는 서열번호 :45 및 서열번호 :46의 폴리뉴클레오타이드 서열들을 포함하는, PD1 자리에 상동인 (왼쪽 및 오른쪽으로도 불리는) 업스트림 및 다운스트림 서열들;
- 선택적으로, 서열번호 :53 (F2A), 서열번호 :54 (P2A) 및/또는 서열번호 :55 (T2A) 중 하나와 같은, 적어도 하나의 2A 펩타이드 절단 부위,
특별히 본 발명은 하기 서열들 중 하나 또는 몇몇을 포함하는 CD25 자리에서 IL-15 (서열번호 59)의 발현을 위한 특정 기증자 폴리뉴클레오타이드들을 제공한다:
- 서열번호 :50과 동일성을 보이는 것과 같은 IL-15를 코드하는 서열;
- 바람직하게는 서열번호 :43 및 서열번호 :44의 폴리뉴클레오타이드 서열들을 포함하는, CD25 자리에 상동인 (왼쪽 및 오른쪽으로도 불리는) 업스트림 및 다운스트림 서열들;
- 선택적으로, 서열번호 :50과 동일성을 보이는 것과 같은, IL-15 수용체 (sIL-15R)의 용해성 형태를 코드하는 서열;
- 선택적으로, 서열번호 :53 (F2A), 서열번호 :54 (P2A) 및/또는 서열번호 :55 (T2A) 중 하나와 같은, 적어도 하나의 2A 펩타이드 절단 부위,
특별히, 본 발명은 하기 서열들 중 하나 또는 몇몇을 포함하는, CD25 자리에서 IL-12 (서열번호 :58)의 발현을 위한 특정 기증자 폴리뉴클레오타이드들을 제공한다:
- 서열번호 :47과 동일성을 보이는 것과 같은, IL-12a을 코드하는 서열;
- 바람직하게는 서열번호 :43 및 서열번호 :44의 폴리뉴클레오타이드 서열들을 포함하는, CD25 자리에 상동인 (왼쪽 및 오른쪽으로도 불리는) 업스트림 및 다운스트림 서열들;
- 선택적으로, 서열번호 :48과 동일성을 보이는 것과 같은, IL-12b를 코드하는 서열;
- 선택적으로, 서열번호 :53 (F2A), 서열번호 :54 (P2A) 및/또는 서열번호 :55 (T2A) 중 하나와 같은 적어도 하나의 2A 펩타이드 절단 부위,
특별히, 본 발명은 하기 서열들 중 하나 또는 몇몇을 포함하는 CD25 자리에서 (서열번호 61을 포함하는) 용해성 GP130의 발현을 위한 특정 기증자 폴리뉴클레오타이드들을 제공한다:
- 용해성 GP130, 바람직하게는 서열번호 :62와 동일성을 보이는 것과 같은, Fc에 융합된 용해성 gp130을 코드하는 서열;
- 바람직하게는 서열번호 :43 및 서열번호 :44의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 CD25 자리에 상동인 (왼쪽 및 오른쪽으로도 불리는) 업스트림 및 다운스트림 서열들;
- 선택적으로, 서열번호 :53 (F2A), 서열번호 :54 (P2A) 및/또는 서열번호 :55 (T2A) 중 하나와 같은 적어도 하나의 2A 펩타이드 절단 부위,
여기에서 실시예들에서 묘사된 대로, 본 발명자들은 AAV 벡터들, 특히 AAV6 패밀리로부터의 벡터들을 이용함으로써 인간 세포들 내로 유전자 타겟된 삽입의 비율을 상당히 개선시켰다.
그러므로 본 발명의 한 넓은 측면은 이들 세포들에서 상동 재조합 이벤트들을 증가시키기 위한, 더욱 바람직하게는 mRNA 형태로 도입되는, TALE 엔도뉴클레아제들과 같은, 서열 특이적 엔도뉴클레아제 시약들의 발현과 함께, 인간 일차(primary) 면역 세포들에서 AAV 벡터들의 형질도입이다.
이 발명의 한 측면에 따라, 서열 특이적 엔도뉴클레아제 시약들은 형질주입, 더욱 바람직하게는 TALE 뉴클레아제들과 같은, 상기 서열 특이적 엔도뉴클레아제 시약들을 코드하는 mRNA의 전기천공에 의하여 세포들 내로 도입될 수 있다.
그럼에도 이 넓은 측면에 따라, 본 발명은, 더욱 특히 적어도 하기 단계들을 포함하는, 세포에서 내생 폴리뉴클레오타이드 서열 내로 외인성 핵산 서열의 삽입의 방법을 제공한다:
- 타겟인 내생 DNA 서열에 상동인 서열들 및 상기 외인성 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터를 상기 세포 내로 형질도입하는(transducing) 단계, 및
- 서열 특이적 엔도뉴클레아제 시약의 발현을 유도하여 삽입 자리에서 상기 내생 서열을 절단하는 단계.
외인성 핵산 서열의 수득된 삽입은 유전 물질의 도입, 더욱 바람직하게는 수득된 삽입 그 자리에서 내생 유전자 서열들에 대하여 "프레임 내인" 내생 서열의 수정 또는 대체를 야기할 수 있다.
본 발명의 또다른 측면에 따라, 105 부터 107 까지, 바람직하게는 106 부터 107 까지, 더욱 바람직하게는 약 5.106의 바이러스 게놈들이 세포 당 형질도입된다.
본 발명의 또다른 측면에 따라, 세포들은 상동 재조합을 더 돕기 위하여 보르테조밉(Bortezomib)과 같은 프로테아좀 억제제들로 처리될 수 있다.
본 발명의 한 목적으로서, 본 방법에서 사용되는 AAV 벡터는 본 명세서에서 목록화된 것들 중 선택되는 하나의 자리들에서 내생 프로모터의 통제 하 놓이기 위하여, 이 명세서에서 언급된 것들 중 임의의 것으로서, 프로모터가 없는 외인성 코딩 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 목적으로서, 본 방법에서 사용되는 AAV 벡터는 2A 펩타이드 절단 부위를 포함하고 외인성 코딩 서열을 형성하는 cDNA (시작 서열 마이너스)가 이어진다.
본 발명의 한 목적으로서, 상기 AAV 벡터는 키메라 항원 수용체, 특히 항-CD19 CAR, 항-CD22 CAR, 항-CD123 CAR, 항-CS1 CAR, 항-CCL1 CAR, 항-HSP70 CAR, 항-GD3 CAR 또는 항-ROR1 CAR를 코드하는 외인성 서열을 포함한다.
그러므로 본 발명은 여기에 기재된 방법을 수행하도록 설계된 임의의 AAV 벡터들, 특히 표 4에서 언급된 T-세포 활성화에 반응성인 내생 유전자 중 임의의 것 내에 위치된 삽입 자리에 상동인 서열을 포함하는 벡터들을 포함한다.
플라스미드들, 에피솜(episomal) 벡터들, 선형 DNA 매트릭스들, 등...과 같은, 그 분야에 알려진 많은 다른 벡터들이 본 방ㄹ명에 대한 교시에 따라 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따라 사용되는 DNA 벡터는 바람직하게는 하기를 포함한다: (1) 상동 재조합에 의하여 삽입되는 외인성 코딩 서열을 포함하는 상기 외인성 핵산, 및 (2) 상기 삽입을 촉진하는 서열 특이적 엔도뉴클레아제 시약을 코드하는 서열. 더 선호되는 측면에 따라, (1) 하, 상기 외인성 핵산은 어떠한 프로모터 서열을 포함하지 않는 반면, (2) 하 서열은 그것 자체의 프로모터를 갖는다. 더욱 더 선호되는 측면에 따라, (1) 하 핵산은 내부 리보솝 진입 부위 (IRES) 또는 T2A, P2A, E2A 또는 F2A와 같은 "자가-절단" 2A 펩타이드들을 vhg마하여, 외인성 코딩 서열이 삽입되는 내생 유전자가 멀티-시스트론(cistronic)이 된다. 2A 펩타이드의 IRES는 상기 외인성 코딩 서열보다 앞서거나 이를 따를 수 있다.
본 발명의 선호되는 벡터들은 실험 섹션 및 도면들에서 묘사되거나 또는 여기에서 전술된 대로 기증자 폴리뉴클레오타이드들을 포함하는, AAV6로부터 유래된 벡터들이다. 본 발명에 따른 벡터들의 예들은 서열번호 :37 (CD25 자리 내로 IL-15를 코드하는 서열의 통합을 위한 매트릭스), 서열번호 :38 (PD1 자리 내로 IL-15를 코드하는 서열의 통합을 위한 매트릭스) 서열번호 :39 (CD25 자리 내로 IL-12를 코드하는 서열의 통합을 위한 매트릭스) 및 서열번호 :40 (PD1 자리 내로 IL-12를 코드하는 서열의 통합을 위한 매트릭스) 서열들과 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드들로 구성되거나 또는 이를 포함한다.
내생 프로모터들의 전사 조절 하 면역 세포들에서 유전자 타겟된 통합
본 발명은, 그것의 주된 측면들 중 하나에서, 그것들의 치료 가능성을 개선하는 외인성 서열들을 발현시키기 위한 면역 세포들의 내생 전사 활성의 이점을 갖는다.
본 발명은 본 발명을 수행하는데 유용한 프로모터 자리들의 선택 및 내생 프로모터들의 전사 활성의 프로파일에 기초한 몇몇 예들을 제공한다. 선호되는 자리들은, 세포들이 CAR들를 지닌 것으로 여겨질 때, 일반적으로 면역 세포 활성화하면, 특히 CAR 활성화 (CAR-민감성 프로모터들) 에 반응으로, 전사 활성이 높다.
따라서, 본 발명은 TCR 자리에서 CAR를 코드하는 첫 번째 외인성 서열을 발현시킴으로써 동종이계 치료적 면역 세포들을 생산하여, 이로써 TCR 발현을 방해하고, 내생 자리의 전사 활성 하 두 번째 외인성 코딩 서열을 발현시키는 방법을 제공하며, 바람직하게는 하기에 의존한다:
- 예컨대 세포들 확장을 촉진하는데 유용한 다이나비드들(dynabead)과 같은 CD3/CD28 활성화;
- 예컨대 정확한 면역 세포들 기능들을 활성화사키는데 유용한 CD3zeta 경로를 통하는 것과 같은, CAR 활성화;
- 예컨대 나쁜 기관들에서 인-시츄로 세포들을 활성화시키는데 유용한 분자 마커 또는 질병 증후군이 나타나는 것에 연결된 전사 활성.
- 예컨대 조혈 세포들이 그것들의 면역 기능들을 얻을 때, 특정 계통 내로 단백질을 발현시키거나 (도 1 참조) 또는 분화의 주어진 수준에서 세포들에 치료적 물성들을 부여하는데 유용한, 세포 분화; 및/또는
- 특정 종양 상태들(저산소증, 낮은 글루코오스...)에 대한 그것들의 증폭(amplification) 및 세포들 활성의 방향을 바꾸거나, 또는 활성화의 유지 및/또는 소모의 방지를 위한 TME (종양(Tumor) 미세환경(microoenvironment));
- CAR T-세포 활성과 관련된 부작용들을 완화시키는데 유용한 CRS (사이토카인 방출 증후군)
본 발명자들은 본 발명에 따른 타겟이 된 유전자 재조합을 적용하는데 특히 적합한 것으로 발견된 내생 유전자들의 첫 번째 목록을 확정하였다 (표 6). 이 목록을 그리기 위하여, 그들은 몇몇 전사체 뮤린 데이터베이스들, 특히 난백 알부민(ovalbumin) 항원들에 반응하여, T-세포 활성화 되면 여러가지 유전자들의 전사 수준들을 비교하는 것을 가능하게 하는, Best J.A. et al. (2013) “Transcriptional insights into the CD8(+) T cell response to infection and memory T cell formation” Nat. Immunol.. 14(4):404-12에 언급된 면역학적(Immunological) 게놈(Genome) 프로젝트(Project) 컨소시엄(Consortium)으로부터의 것을 발견하였다. 또한 인간 T-세포 활성화와 관련하여 이용가능한 데이터들이 매우 적기 때문에, 그들은 인간 유전자들에 대한 이용가능한 문헌들을 연구함으로써 인간 상황과의 비교 및 이들 데이터들로부터의 분석 및 일부 외삽법들을 만들어야 했다. 선택된 자리들은 특히 CAR들을 코드하는 서열들의 삽입에 대한 것이다. 표 6의 첫 번째 선택에 기초하여, 그들은 그들의 예상된 발현 프로파일들에 기초한 유전자들의 그 다음의 선택들을 만들었다 (표 7 내지 10).
다른 한 편으로는, 본 발명자들은 외인성 프로모터들의 전사 조절 하 외인성 코딩 서열을 발현시키기 위하여 발현 카세트(들)을 삽입시키기에 가장 적합할, 주로 불활성인 전사 자리들의 선택을 확인하였다. 이들 자리들은 특히 T-세포 활성화 동안 주로 전사적으로 불활성인 것들로, "안전한 항구 자리들"로 언급된다. 그것들은 면역 세포들의 게놈 발현의 방해 위험을 최대로 감소시킴으로써 코딩 서열을 통합하는데 유용하다.
면역 세포 활성화 동안 꾸준히 활성인 내생 프로모터들의 통제 하 유전자 타겟인 삽입
이 예에 관련된 내생 유전자 자리들의 선택은 표 7에 목록이 되어 있다.
본 발명의 방법에 따라, 바람직하게는 CD3G, Rn28s1, Rn18s, Rn7sk, Actg1, β2m, Rpl18a, Pabpc1, Gapdh, Rpl17, Rpl19, Rplp0, Cfl1 및 Pfn1로부터 선택되는 내생 유전자로부터의, 면역 세포 활성화 동안 끊임없이 활성인 내생 프로모터의 통제 하 유전자 타겟된 삽입을 수행하는 단계가 제공된다.
"꾸준히 활성"에 의하여, 일차(primary) 면역 세포에서 이들 프로모터들에 대하여 관찰된 전사 활성이 면역 세포의 활성화가 되면 음성 조절에 의하여 영향을 받지 않는다는 것이 의미된다.
다른 곳에서 보고된 바와 같이, (Acuto, O. (2008) “Tailoring T-cell receptor signals by proximal negative feedback mechanisms”. Nature Reviews Immunology 8:699-712), TCR 자리에 보여지는 프로모터들은 TCR 이용이 되면서 다른 음성 피드백 메커니즘에 가해지고 그러므로 본 발명의 방법을 위한 동안 상향 조절되거나 또는 꾸준히 활성이 아닐 수 있다. 본 발명은 어느 정도는 T-세포 활성화 동안 발현되는 외인성 코딩 서열들을 위한 가능한 삽입 부위로서 TCR 자리를 이용하는 것을 피하도록 설계된다. 그러므로, 본 발명의 한 측면에 따라, 외인성 코딩 서열의 타겟이 된 삽입은 TCR알파 또는 TCR베타 유전자 자리에서 수행되지 않는다.
꾸준히 활성인 내생 프로모터들의 통제 하 이러한 자리들에 유리하게 도입될 수 있는 외인성 코딩 서열의 예들은 사이토카인, 케모카인 수용체, 약물에 대한 내성을 부여하는 분자, 4-1BRL 및 OX40L와 같은 공-자극 리간드 또는 분비된 항체의 생산을 양성 조절하거나 또는 코드하는 것들이다.
면역 세포 활성화에 의존적이거나 또는 CAR 활성화에 의존적인 내생 프로모터들 하 유전자 통합
전술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 내생 프로모터의 통제 하 유전자 타겟된 삽입을 수행하는 단계를 포함하며, 이는 일시적으로 또는 10일 초과로, 전사 활성은, 바람직하게는 면역 세포 활성화되면 상향조절된다.
"면역 세포 활성화"에 의하여 주어진 종류의 면역 세포들에 대하여 문헌 내에서 흔히 확립되고 일반적으로 기재된 메커니즘에 따른 면역 반응의 생산이 의미된다. T-세포에 대하여, 예컨대, T-세포 활성화는 일반적으로 CD69, CD71 및 CD25 (또한 Treg 세포들에 대한 마커)를 포함하는 여러가지 단백질들, 및 HLA-DR (인간 T 세포 활성화의 마커)의 생산, 퍼포린(perforin), 그랜자임들(granzymes) 및 그래뉼리신(granulysin) (탈과립화)의 방출, 또는 사이토카인 효과기들(effectors) IFN-γ, TNF 및 LT-알파의 생산에 의하여 세포 표면 발현을 구성하는 변화들 중 하나에 의하여 특징된다.
본 발명의 선호되는 예에 따라, 내생 유전자의 전사 활성은, 특히 CAR에 의한 활성화에 반응하여 면역 세포에서 상향-조절된다. CAR는 면역 세포에서 독립적으로 발현될 수 있다. "독립적으로 발현"되는 것에 의하여 예컨대, 렌티바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터를 이용하여, 또는 이러한 CAR를 코드하는 전기천공에 의하여 캡이 된 메신저 RNA들의 형질주입에 의하여, 도입된 외인성 발현 카세트로부터 CAR가 면역 세포에서 전사될 수 있다는 것이 의미된다. 예컨대 (REF.)에 기재된 대로 면역 세포 내로 CAR를 발현시키는 것으로 그 분야에 알려져 있다.
전사 활성이 상향 조절되는 상기 내생 유전자는 IL-12 및 IL-15와 같은 사이토카인(들), 면역원성(immunogenic) 펩타이드(들), 또는 항-IDO1, 항-IL10, 항-PD1, 항-PDL1, 항-IL6 또는 항-PGE2 항체와 같은 분비된 항체를 코드하기 위한 외인성 서열들의 통합에 특히 적합하다.
본 발명의 선호되는 예에 따라, 내생 프로모터는 CAR 활성화에 반응하여, 그리고 더욱 바람직하게는 독립적인, 그것의 전사 활성에 대하여 선택된다.
여기에서 보여진 바와 같이, CD69, CD25 및 PD1은, 특히 CAR 양성 면역 세포들 내로 면역 세포들이 활성화될 때, 발현되는 외인성 코딩 서열들의 발현의 삽입에 적합한 이러한 자리들이다.
그러므로 본 발명은 자리에서 외인성 코딩 서열의 부위 특이적 삽입을 수행하는 단계와 면역 세포 내로 CAR를 발현시키는 임의의 방법들을 조합하며, 그 전사 활성은 종양 항원과 상기 CAR의 이용에 반응성이거나 또는 독립적이다. 특히, 그 방법은 CAR 양성 또는 재조합 TCR 양성 면역 세포 내로 PD1, CD25 및 CD69 프로모터들로부터 선택되는 하나의 프로모터의 전사 조절 하 IL-12 또는 IL-15을 코드하는 외인성 서열을 도입하는 단계를 포함한다.
특히, CAR 양성 세포들은 면역 세포, 바람직하게는 a 일차(primary) 세포, 그리고 더욱 바람직하게는 일차 T- 세포 내로 CAR를 코드하는 적어도 하나의 외인성 서열 및 그 전사 활성이 PD1, CD25 또는 CD71와 같은 상기 CAR에 독립적인 것에 의존적인 내생 프로모터 하에 위치된 또다른 외인성 서열을 공-발현시키는 단계들을 따름으로써 수득될 수 있다.
"상기 CAR에 의존적인" 발현은 상기 내생 프로모터의 전사 활성이, 일반적으로, 항원들이 세포 표면에 존재하는 CAR들의 수를 초과하고, 세포 표면에서 발현되는 CAR들의 수가 세포 당 10 초과, 바람직하게는 100 초과, 그리고 더욱 바람직하게는 세포 당 1000 분자들 초과인, 상황에서, 그것의 동계(cognate) 항원과 CAR의 참여(engagement)의 결과로서, 필연적으로 10% 초과로, 바람직하게는 20 % 초과로, 더욱 바람직하게는 50% 초과로 그리고 더욱 더 바람직하게는 80 % 초과로 증가된다.
그러므로 본 발명이 바람직하게는 TCR 자리에 삽입되고 항시 발현되는 CAR 서열의 발현을 교시하는 반면, 또다른 자리에 통합되는 또다른 외인성 서열은 상기 CAR와 그것의 동계 항원의 참여(engagement)에 의존적으로 또는 이에 반응하여, 공-발현된다. 상기 또다른 자리는 예컨대 CD25, PD1 또는 CD71 또는 CAR 활성화되면 특이적으로 전사되는 임의의 자리들이다.
다시 말해서, 본 발명은 CAR 및 적어도 하나의 외인성 코딩 서열의 공-발현을 제공하고, 상기 외인성 서열의 발현은 그 전사 활성이 CAR 활성에 의하여 영향을 받는 내생 프로모터의 통제 하에 있고, 이는 더 좋은 면역 반응을 제공하는 조작된 면역 세포들을 수득하는 것을 고려하여 이루어진다.
전술한 바와 같이, 이는 상기 게놈 영역들에 상동인 서열들을 포함하는 기증자 주형들과 함께 특이적으로 CAR 의존적인 이러한 자리들의 코딩 영역들을 타겟으로 하는 서열-특이적 뉴클레아제 시약들로 세포들을 형질주입함으로써 수행될수 있다. 서열 특이적 뉴클레아제 시약들은 기증자 주형들이 상동 재조합 또는 NHEJ에 의하여 통합되는 것을 돕는다.
선호되는 예에 따라, 외인성 코딩 서열이 내생 유전자와 프레임 내로 통합되어, 상기 내생 유전자의 발현이 보존된다. 이는 예컨대 여기의 실험 섹션의 적어도 하나의 예에서 CD25 및 CD69에 대한 케이스이다.
선호되는 예에 따라, 외인성 서열은 특히 이 발현이 면역 세포 기능들에 부정적인 영향을 가질 때, 말하자면 여기의 실험 섹션에서 PD1으로 하는 케이스에서, 유전자의 내생 코딩 서열을 방해하여 하나의 내생 코딩 서열의 그것의 발현을 방지한다.
더욱 더 선호되는 예들에 따라, 내생 유전자 서열을 방해하는 외인성 코딩 서열은 내생 프로모터와 프레임 내에 위치되어, 그것의 발현이 실험 섹션에 보여진 바와 같이, 내생 프로모터에 의존적으로 만들어진다.
본 발명은 또한 그것들의 각각의 타겟 및 RVD 서열들과 더불어, 특히 CD25 자리에서 부위 특이적 삽입을 가능하게 하는 것들 (서열번호 :18 및 19)인, 본 특허 출원에서 예시된 다른 TAL-뉴클레아제들을 코드하는 폴리펩타이드 서열들 및 폴리뉴클레오타이드에 대한 것이다.
본 발명은 또한 서열-특이적 엔도뉴클레아제 시약을 코드하는 폴리뉴클레오타이드들 및 상기 시약들에 의하여 타겟이 된 자리에서 외인성 서열을 통합하도록 설계된 기증자 서열들을 포함하는 면역 세포들 형질주입을 위한 키트들을 포함한다. 이러한 키트들의 예들은 PD1 자리를 타겟으로 하는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 코드하는 mRNA (예: PD1 TALEN®) 및 IL-12을 코드하는 외인성 서열을 포함하는 AAV 벡터를 포함하는 키트, PD1 자리를 타겟으로 하는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 코드하는 mRNA (예: PD1 TALEN®) 및 IL-15를 코드하는 외인성 서열을 포함하는 AAV 벡터를 포함하는 키트, CD25 자리를 타겟으로 하는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 코드하는 mRNA (예: CD25 TALEN®) 및 IL-12를 코드하는 외인성 서열을 포함하는 AAV 벡터를 포함하는 키트, CD25 자리를 타겟으로 하는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 코드하는 mRNA (예: CD25 TALEN®) 및 IL-15를 코드하는 외인성 서열을 포함하는 AAV 벡터를 포함하는 키트, PD1 자리를 타겟으로 하는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 코드하는 mRNA (예: PD1 TALEN®) 및 용해성 gp130를 코드하는 외인성 서열을 포함하는 AAV 벡터를 포함하는 키트, CD25 자리를 타겟으로 하는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 코드하는 mRNA (예: CD25 TALEN®) 및 용해성 gp130를 코드하는 외인성 서열을 포함하는 AAV 벡터를 포함하는 키트, 및 본 명세서에 언급된 코딩 서열의 도입을 위한 기증자 매트릭스 및 표 6에 목록으로 된 유전자를 타겟으로 하는 엔도뉴클레아제 시약들을 수반한 임의의 키트들이다.
본 발명의 한 측면에 따라, 내생 유전자는 약한 상향조절을 위하여 선택된다. 전사 활성이 약하게 상향 조절되는 상기 내생 유전자 내로 도입된 외인성 코딩 서열은 유리하게, 그 발현 수준이 일반적으로 양성 CAR의 그것보다 더 낮게 남아 있어야 하는, 세포자멸사의(apoptotic) CAR의, 또는 억제 CAR의 구성성분(constituent)일 수 있다. 예컨대 바이러스 벡터로 형질도입된 하나와 본 발명에 따라 도입된 다른 하나인, CAR 발현의 이러한 조합은 CAR 면역 세포들의 특이성 또는 안전성을 크게 개선할 수 있다.
몇몇 내생 프로모터들은 내생 유전자 자리들 Spata6, Itga6, Rcbtb2, Cd1d1, St8sia4, Itgae and Fam214a (표 8)로부터 선택된 것들과 같이, 일시적으로, 가끔 면역 세포 활성화되면 12 시간 미만 후, 상향-조절된다. 다른 내생 프로모터들은 내생 유전자 자리들 IL3, IL2, Ccl4, IL21, Gp49a, Nr4a3, Lilrb4, Cd200, Cdkn1a, Gzmc, Nr4a2, Cish, Ccr8, Lad1 및 Crabp2 (표 9)로부터 선택된 것들과 같이, 면역 세포 활성화되면 24 시간 미만 후, 상향-조절되고, 다른 것들은 면역 세포 활성화 되면, 24 시간 초과, 더 일반적으로 10일 초과이다. Gzmb, Tbx21, Plek, Chek1, Slamf7, Zbtb32, Tigit, Lag3, Gzma, Wee1, IL12rb2, Eea1 및 Dtl (표 9)로부터 선택된 것들과 같다.
대체하여, 본 발명자들은 면역 세포 활성화되면 하향-조절되는 프로모터들의 전사 조절 하 내생 유전자가 또한 본 발명에 따른 방법을 위하여 흥미있을 수 있다는 것을 발견하였다. 과연 그들은 Bcl2 패밀리, BclXL, NF-kB, 서바이빈(Survivin), 또는 CAR 항-FAP의 구성성분과 같은, 항-FAP (섬유아세포 활성화 단백질)과 같은, 항-세포자멸사 인자들을 코드하는 외인성 코딩 서열들이 상기 자리들에서 도입될 수 있다는 것을 생각하였다. 면역 세포 활성화되면 하향-조절되는 프로모터들의 전사 조절 하 상기 내생 유전자는 더욱 특히 Slc6a19, Cd55, Xkrx, Mturn, H2-Ob, Cnr2, Itgae, Raver2, Zbtb20, Arrb1, Abca1, Tet1, Slc16a5 및 Ampd3 (표 10)으로부터 선택될 수 있다.
종양 미세환경 (TME) 상황들 하 활성화되는 내생 프로모터들 하 유전자 통합
본 발명의 한 측면은 더욱 특히 종양 미세환경 (TME) 상황에서 면역 세포들 소모를 방지하기 위한 방법들에 대한 것이다. 면역 세포들은 종양 저항성을 돕는, 종양의 미소환경에서 발견되는 분자적 신호들 또는 영양 고갈에 반응하여 자주 고갈된다. 그 방법은 아르기닌, 시스테인, 트립토판 및 산소 부족과 더불어 산과다증(acidosis)(락테이트 강화) 하 상향-조절되는 내생 프로모터들의 통제 하 외인성 코딩 서열들을 통합함으로써 면역 세포들을 조작하는 단계들을 포함한다.
이러한 외인성 서열들은 면역 세포들 기능 또는 활성화를 강화하거나 그리고/또는 치료적 이점을 부여하기 위하여 이 명세서에서 다른 곳에 주어진 임의의 폴리펨타이드, 인터루키ㅌ들 또는 키메라 항원 수용체들을 코드할 수 있다.
본 발명자들은 표 12 및 13에 목록으로 된 많은 수의 고갈된 종양 침투(infiltrating) 림프구들(lymphocytes) (TIL)에서 상향조절되는 것이 발견된 다수의 자리들을 목록화하였다. 본 발명은 종양 미세환경에서, 면역 세포들, 특히 T-세포들의 고갈을 방지하기 위하여 이들 선호되는 자리들에서 외인성 코딩 서열들을 통합하는 단계를 제공한다.
예컨대, CAR를 코드하는 외인성 서열들은 HIF1a, 전사 인자 저산소증-유도 인자, 또는 아릴(aryl) 탄화수소(hydrocarbon) 수용체 (AhR)와 같은 종양 미세환경에 의하여 활성화되는 내생 유전자들의 프로모터의 전사 조절 하에 놓여질 수 있다. 이들 유전자은 종양들의 폐쇄 환경에서 저산소증 및 제노바이오틱스에 의하여 각각 유도되는 센서들이다.
그러므로 본 발명은 종양 미세환경 (TME)에 의하여 영향을 받는 내생 T-세포 프로모터들의 통제 하, 외인성 코딩 서열들, 더욱 일반적으로 유전적 속성들(attributes)/순환들(circuits),을 통합함으로써 CAR T-세포 요법들의 치료적 결과를 개선하는데 유용하다.
본 발명에 의하여, 내생 유전자들의 상향조절는 특정 종양 미세환경에서 CAR T-세포들의 항종양 활성을 개선하기 위하여 관련 외인성 코딩 서열들을 재-발현시키기 위하여 "하이잭"될 수 있다.
조혈(Hematopoietic) 줄기(Stem) 세포들(Cells) (HSCs)에서 유전자 타겟된 삽입 및 발현
본 발명의 한 측면은 더욱 특히 조혈 줄기 세포들 (HSCs) 내 이식유전자들의 삽입에 대한 것이다.
조혈 줄기 세포들 (HSCs)은 다능성이며, 이로부터 모든 분화된 혈액 세포 종류들이 조혈 작용 과정 동안 발생하는, 자가-재생 전구 세포들이다. 이들 세포들은 림프구들, 과립구들 및 면역 체계의 대식세포들과 더불어 순환하는 에리스로사이트들 및 혈소판들을 포함한다. 전통적으로, HSC들은 두 개의 계통-제한적인, 림프(lymphoid) 및 골수(myelo)-적혈구를 만드는(erythroid) 올리고포텐트(oligopotent) 전구 세포들로 분화하는 것으로 생각된다. HSC 자가-재생 및 분화를 통제하는 메커니즘들은 사이토카인들, 케모카인들, 수용체들, 및 세포내 신호전달 분자들의 다양한 세트에 의하여 영향을 받는 것으로 생각된다. HSC들의 분화는, 부분적으로는 성장 인자들 및 세포내 신호전달 경로들을 활성화시키는 인터루킨들 (ILs) 및 콜로니-자극(colony-stimulating) 인자들(factors) (CSFs)을 포함하는 사이토카인들에 의하여 조절된다. 하기 표시된 인자들은 HSC 다분화능, 증식 및 계통(lineage) 투입(commitment)에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. HSC들 및 그것들의 분화된 자손은 조혈 줄기 세포들 내로 사이토카인 수용체들 및 분화 (CD) 단백질들의 클러스터와 같은 특정 세포 표면 계통 마커들의 발현에 의하여 확인될 수 있다.
HSC들을 이용한 유전자 요법은 면역 질환들을 포함하는 조혈계의 질환들을 치료하는 거대한 잠재력을 가진다. 이 접근에서, HSC들은 환자로부터 수집되고, 레트로바이러스 벡터들을 통합하여 엑스-비보에서 유전자 변형되고, 그 다음에 환자 내로 주입된다. 지금까지 레트로바이러스 벡터들은 HSC 유전자 요법을 위한 유일하게 효과적인 유전자 전달 시스템이었다. 벡터들을 통합하는 것을 이용함으로써 HSC들에의 유전자 전달은 이로써 HSC-유래 성숙 조혈 세포들에 효과적인 전달을 가능하게 한다. 그러나, 환자 내로 주입된 유전자-변형된 세포들은 이들 돌연변이들의 몇몇 증식/생존 이점 때문에 증폭될 수 있는 많은 부정적(adverse) 돌연변이들을 야기할 수 있는, 다른 세포들이 다른 염색체 위치들에서 통합된 벡터 프로바이러스들을 갖는, 폴리클론 군집이다 (Powers and Trobridge (2013) “Identification of Hematopoietic Stem Cell Engraftment Genes in Gene Therapy Studies” J Stem Cell Res Ther S3:004. doi:10.4172/2157-7633.S3-00).
HSC들은 보통 동원(mobilization) 후 말초혈액으로부터 수확된다 (환자들은 재조합 인간 과립구-콜로니(ranulocyte-colony) 자극(stimulating) 인자(factor) (G-CSF)를 받는다). 환자의 말초혈액은 수집되고 CD34+ 마커에 의하여 HSC들에 대하여 강화된다. HSC들은 그 다음에 엑스 비보에서 배양되고 바이러스 벡터들에 노출된다. 엑스 비보 배양 기간은 1 일부터 4일까지 다양하다. 유전자-변형된 HSC들의 주입 전에, 환자들은 이식 효율을 향상시키는 것을 돕기 위하여 방사선 또는 화학치료 제제들로 치료될 수 있다. 유전자-변형된 HSC들은 환자 내로 정맥주사로 재-주입된다. 세포들은 최종적으로 동양혈관들(sinusoids) 및 혈관주위 조직에서 살기 전에 골수 내로 이동한다. 호밍 및 조혈작용은 둘 다 이식의 필수적인 측면들이다. 호밍을 통하여 줄기 세포 틈(niche)에 도달한 세포들은 각 혈액 계통으로부터 성숙 골수 및 림프 세포들을 생산하는 것을 시작한다. 조혈작용은 환자의 성숙 혈액 세포들의 평생 발생 동안 자가-재생, 특히, 감염된 그리고 악성인 세포들을 제거하기 위한 주요 면역 세포들인, T 세포들 및 NK 세포들과 같은 보통의 림프 전구 세포들의 생산이 가능한 장기 HSC들의 작용을 통하여 지속된다.
본 발명은 내생 프로모터들, 특히 특정 조혈 계통의 세포들 내로 특이적으로 활성화되는 유전자들의 내생 프로모터들의 통제 하, 또는 특정 분화 단계, 바람직하게는 분화의 후기 단계에서, 외인성 코딩 서열들을 도입하기 위하여 HSC들에서 유전자 타겟이 된 삽입을 수행하는 것을 제공한다. 앞 문단에서 언급된 바와 같이 엑스-비보 치료 동안 HSC들은 AAV 벡터와 같은 폴리뉴클레오타이드 벡터 (기증자 주형)으로 형질도입되는 반면, 서열 특이적 뉴클레아제 시약은 선택된 자리에서 코딩 서열들의 삽입을 촉진하도록 발현된다. 그 결과인 조작된 HSC들은 그 다음에 상기 외인성 코딩 서열들을 포함할 조작된 면역 세포들의 장기 인-비보 생산을 위하여 이를 필요로 하는 환자 내로 이식된다. 선택된 내생 프로모터의 활성에 의존하여, 코딩 서열들은 인-비보에서 면역 세포들의 국소적 환경에 반응하여 또는 특정 계통들에서 선택적으로 발현할 것이고, 이로써 입양(adoptive) 면역요법을 제공한다.
본 발명의 하나의 선호되는 측면에 따라, 외인성 코딩 서열들은 전사 활성이 CD34, CD43, Flt-3/Flk-2, IL-7 R 알파/CD127 및 Neprilysin/CD10와 같은 보통의 림프 전구 세포들에서 특이적으로 유도되는, 유전자의 프로모터들의 통제 하에 위치된다.
더 선호적으로, 외인성 코딩 서열들은 전사 활성이 CD161, CD229/SLAMF3, CD96, DNAM-1/CD226, Fc 감마 RII/CD32, Fc 감마 RII/RIII (CD32/CD16), Fc 감마 RIII (CD16), IL-2 R 베타, 인테그린 알파 2/CD49b, KIR/CD158, NCAM-1/CD56, NKG2A/CD159a, NKG2C/CD159c, NKG2D/CD314, NKp30/NCR3, NKp44/NCR2, NKp46/NCR1, NKp80/KLRF1, Siglec-7/CD328 및 TIGIT와 같이 NK 세포들에서 특이적으로 유도되는, 또는 CCR7, CD2, CD3, CD4, CD8, CD28, CD45, CD96, CD229/SLAMF3, DNAM-1/CD226, CD25/IL-2 R 알파, L-Selectin/CD62L 및 TIGIT와 같이 T-세포들에서 유도되는, 유전자의 프로모터들의 통제 하에 위치된다.
본 발명은 바람직하게는 HSC에서 발현되지 않는 유전자의, 더욱 바람직하게는 상기 HSC에 의하여 생산되는 조혈 세포들에서만 발현되는 유전자의, 그리고 더욱 더 바람직하게는 NK 세포들 또는 T-세포들에서만 발현되는 유전자의, 프로모터의 전사 조절 하, HSC들 내로 CAR를 코드하는 외인성 서열 또는 그것의 요소의 도입을 바람직한 측면으로서 포함한다.
흉선 장벽을 통과하기 위한 HSC들에서 조건부 CAR 발현
본 발명의 특정 측면은 외인성 코딩 서열들, 특히 CAR 또는 그 요소를 발현시키는, T-세포들 또는 NK-세포들와 같은, 조혈 면역 세포들의 상기 조작된 HSC들에 의한 인-비보 생산에 대한 것이다.
조작된 HSC들에 의ㅎ나 조혈 CAR 양성 세포들의 하나의 주요한 장애물은 예컨대, 면역 체계 그 자체, 특히 흉선에 의한 CAR 양성 세포들의 거부이다. 혈액-흉선 장벽은 흉선 및 순환계 사이의 물질들의 교환을 조절하고, 미성숙 T 세포들이 발달하기 위한 격리된 환경을 제공한다. 장벽은 또한 미성숙 T 세포들이 외부 항원들과 접촉하는 것을 방지한다 (이 단계에서 항원들과의 접촉은 T 세포들이 세포자멸사에 의하여 죽는 것을 야기할 것이기 때문이다)
본 발명에 의하여 제공되는 하나의 해법은 그것들이 흉선 장벽을 통과할 때 조혈 세포들 내로 상당히 전사되지 않는 프로모터들의 전사 조절 하에 HSC들에서 CAR 요소들을 코드하는 서열들을 위치시키는 것이다. 흉선에서 감소되거나 상당하지 않은 전사 활성으로 조혈 세포들 내로 CAR의 조건부 발현을 제공하는 유전자의 한 예는 LCK 이다 (Uniprot: P06239).
본 발명의 선호되는 측면에 따라, CAR, 또는 그것으 요소를 코드하는 외인성 서열이 T-세포들 또는 NK 세포들에서, 바람직하게는이들 타입들의 세포들 만에서, 특이적으로 발현되는 것으로 기재된 유전자의 전사 조절 하 HSC 내로 도입된다.
이로써 본 발명은 선택된 조혈 계통(들)에서 배타적으로 발현되는 외인성 코딩 서열들을 포함하는 HSC들을 생산하는 방법을 제공하고, 상기 코딩 서열들은 면역 체계를 자극하기 위하여 바람직하게는 항원의 또는 CAR의 적어도 하나의 요소를 코드한다.
더 넓게, 본 발명은 상기 HSC들에 의하여 생산되는 조혈 세포들에서 선택적으로 발현되는 외인성 코딩 서열들의 유전자 타겟이 된 삽입에 의하여 HSC들을 조작하는 방법을 제공한다. 선호되는 예로서, 상기 조작된 HSC들에서 생산된 상기 조혈 세포들은 치료 가능성을 개선하기 위하여 인-비보 자극들 또는 선택된 환경 인자들에 반응하여 상기 외인성 코딩 서열들을 발현시킨다.
내생 게놈 서열들의 불활성화와 면역 세포들에서 타겟된 서열 삽입(들)의 조합
본 발명의 하나의 특정 관점은 그 발현이 상기 조작된 세포들의 치료 가능성을 개선하는, 상기 자리에서 외인성 코딩 서열을 통합함으로써 자리에서 일차(primary) 면역 세포들에서 유전자 불활성화를 수행하는 것이다. 본 발명에 따라 삽입될 수 있는 관련 외인성 코딩 서열들의 예들은 세포들의 치료 가능성에 대한 그것들의 긍정적인 효과들과 연관하여 상기에 제시되었다. 여기에서는 하기에 바람직하게는 유전자 타겟이 된 삽입에 의하여 타겟이 되는 내생 유전자 및 그것들의 불활성화와 관련된 이점들이 보여진다.
본 발명의 선호되는 측면에 따라, 코딩 서열의 삽입은 받는 사람(recipient) 환자 내로 동종이계 세포들의 도입이 되면 면역 거부 또는 숙주(host) 대(versus) 이식편(graft) 질환(disease) (GVHD) 거부를 감소시키기 위하여 자가 및 비-자가 인식에 수반되는 유전자들의 발현을 감소 또는 방지하는 효과를 갖는다. 예컨대, 본 발명에서 사용되는 서열-특이적 시약들 중 하나는 TCR-알파 또는 TCR-베타를 코드하는 유전자들과 같은, 일차 T-세포들에서 TCR의 발현을 감소 또는 방지할 수 있다.
또다른 선호되는 측면으로써, 하나의 유전자 편집 단계는 β2m 단백질 및/또는 HLA 단백질들과 같은, MHC 인식에서 또는 C2TA (Uniprot P33076)와 같은 그것의 조절에 관여하는 또다른 단백질의 발현을 감소 또는 방지하기 위한 것이다. 이것은 조작된 면역 세포들이 환자들 내로 주입될 때 덜 동종반응성(alloreactive)이 되는 것을 가능하게 한다.
"동종반응성(alloreactive) 치료적 이용"에 의하여, 다른 하플로타입(haplotype)을 갖는 환자들 내로 주입되는 것을 고려하여 세포들이 기증자로부터 유래되는 것이 의미된다. 과연 본 발명은 숙주-이식편 상호작용 및 인식에 관련되는 여러가지 유전자 자리들에서 편집된 유전자일 수 있는, 일차(primary) 세포들을 수득하기 위한 효율적인 방법을 제공한다.
다른 자리들은 또한 활성을 개선시키는 것을 고려하여 편집될 수 있고, 여기에서 하기에 상세히 설명한 대로, 조작된 일차(primary) 세포들의 치료적 활성의 지속:
체크포인트 수용체들 및 면역 세포들 억제 경로의 불활성화:
본 발명의 선호되는 측면에 따라, 삽입된 외인성 코딩 서열은 면역 세포들 억제 경로들에서 관련된 단백질의, 특히 "면역 체크포인트"로 문헌에서 언급된 것들, 발현을 감소 또는 방지하는 효과를 갖는다 (Pardoll, D.M. (2012) The blockade of immune 체크포인트들 in 암 면역요법, Nature Reviews Cancer, 12:252-264). 본 발명의 뜻 그대로, "면역 세포들 억제 경로들"은 악성 또는 감염된 세포들을 향한 림프구들의 세포독성 활성의 감소를 이끌어내는 면역 세포들에서 임의의 유전자 발현을 의미한다. 이는 예컨대 (T-세포 활성을 조정하는) T 세포들 상에 Tregs의 활성을 이끄는 것으로 알려진, FOXP3의 발현에 관련되는 유전자일 수 있다.
"면역 체크포인트들"은 면역 세포의 활성화의 신호을 올리거나 (공-자극 분자들) 또는 신호를 낮추는 면역 체계 내 분자들이다. 본 발명에 따라, 면역 체크포인트들 더욱 특히 (펩타이드-주요(major) 조직적합성(histocompatibility) 복합체(complex) (MHC) 분자에 의하여 매개되는) 항원에 대한 T 세포 반응을 조절하는 항원-제시(presenting) 세포들 (APCs) 및 T 세포들 사이의 리간드-수용체 상호작용들에 관여되는 지명된 표면 단백질들. 이들 상호작용들은 (주요 APC들이 수지상 세포들인) 림프절들 또는 (효과기 반응들이 조절되는) 종양들 또는 말초 조직들에서 T 세포 반응들의 개시 때 발생할 수 있다. 공-자극 및 억제 수용체들 둘다에 결합하는 막-결합된 리간드들의 하나의 중요한 패밀리는 B7 패밀리이다. B7 패밀리 멤버들 및 그것들의 알려진 리간드들 모두는 면역글로불린 수퍼패밀리에 속한다. 더욱 최근에 확인된 B7 패밀리 멤버들을 위한 수용체들 중 많은 수가 아직 확인되지 않았다. 동계 TNF 수용체 패밀리 분자들에 결합하는 종양 괴사 인자 (TNF) 패밀리 멤버들은 조절 기간드-수용체 상들의 두 번째 패밀리를 나타낸다. 이들 수용체들은 대개 그것들의 동계 리간드들에 의하여 이용될 때 공-자극 신호들을 전달한다. T 세포들의 활성화를 조절하는 또다른 주요 카테고리는 미세환경에서 용해성 사이토카인들에서 나온다. 다른 경우들에서, 활성화된 T 세포들은 APC들 상에서 동계 수용체들을 이용하는 CD40L과 같은 리간드들을 상향조절한다. A2aR, 아데노신 A2a 수용체; B7RP1, B7-관련된 단백질 1; BTLA, B 및 T 림프구 감쇠기(attenuator); GAL9, 갈렉틴(galectin) 9; HVEM, 헤르페스바이러스 진입(entry) 중재자(mediator); ICOS, 유도가능한 T 세포 공-자극자; IL, 인터루킨; KIR, 킬러 세포 면역글로불린-유사 수용체; LAG3, 림프구 활성화 유전자 3; PD1, 프로그램된 세포사 단백질 1; PDL, PD1 리간드; TGFβ, 형질전환(transforming) 성장(growth) 인자(factor)-β; TIM3, T 세포 막 단백질 3.
그 발현이 본 발명에 따른 조작된 면역 세포들에서 활성화를 높이기 위하여 감소 또는 억제될 수 있는 추가의 내생 유전자들의 예들이 표 3에 목록으로 되어 있다.
예컨대, 삽입된 외인성 코딩 서열(들)은 PD1 (Uniprot Q15116), CTLA4 (Uniprot P16410), PPP2CA (Uniprot P67775), PPP2CB (Uniprot P62714), PTPN6 (Uniprot P29350), PTPN22 (Uniprot Q9Y2R2), LAG3 (Uniprot P18627), HAVCR2 (Uniprot Q8TDQ0), BTLA (Uniprot Q7Z6A9), CD160 (Uniprot O95971), TIGIT (Uniprot Q495A1), CD96 (Uniprot P40200), CRTAM (Uniprot O95727), LAIR1 (Uniprot Q6GTX8), SIGLEC7 (Uniprot Q9Y286), SIGLEC9 (Uniprot Q9Y336), CD244 (Uniprot Q9BZW8), TNFRSF10B (Uniprot O14763), TNFRSF10A (Uniprot O00220), CASP8 (Uniprot Q14790), CASP10 (Uniprot Q92851), CASP3 (Uniprot P42574), CASP6 (Uniprot P55212), CASP7 (Uniprot P55210), FADD (Uniprot Q13158), FAS (Uniprot P25445), TGFBRII (Uniprot P37173), TGFRBRI (Uniprot Q15582), SMAD2 (Uniprot Q15796), SMAD3 (Uniprot P84022), SMAD4 (Uniprot Q13485), SMAD10 (Uniprot B7ZSB5), SKI (Uniprot P12755), SKIL (Uniprot P12757), TGIF1 (Uniprot Q15583), IL10RA (Uniprot Q13651), IL10RB (Uniprot Q08334), HMOX2 (Uniprot P30519), IL6R (Uniprot P08887), IL6ST (Uniprot P40189), EIF2AK4 (Uniprot Q9P2K8), CSK (Uniprot P41240), PAG1 (Uniprot Q9NWQ8), SIT1 (Uniprot Q9Y3P8), FOXP3 (Uniprot Q9BZS1), PRDM1 (Uniprot Q60636), BATF (Uniprot Q16520), GUCY1A2 (Uniprot P33402), GUCY1A3 (Uniprot Q02108), GUCY1B2 (Uniprot Q8BXH3) 및 GUCY1B3 (Uniprot Q02153)로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 조작된 면역 세포에 의하여, 발현이 감소 또는 방지되는 효 과를 가질 수 있다. 상기 단백질들을 코드하는 유전자들에 도입된 유전자 편집은 바람직하게는 CAR T 세포들에서 TCR의 불활성화와 조합된다.
선호는 PD-L1 리간드 및/또는 CTLA-4 Ig와 같은, 비-내생 면역억제성 폴리펩타이드의 발현과 조합하여, PD1 및/또는 CTLA4의 불활성화에 주어진다 (표 1 및 2의 펩타이드들 또한 참조).
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표 3: 면역 세포들 억제 경로들 내에 관련된 유전자들의 목록
억제성 사이토카인들/대사산물들의 억제
본 발명의 또다른 측면에 따라, 삽입된 외인성 코딩 서열은, 특히 TGFbeta (Uniprot:P01137), TGFbR (Uniprot:P37173), IL10 (Uniprot:P22301), IL10R (Uniprot: Q13651 및/또는 Q08334), A2aR (Uniprot: P29274), GCN2 (Uniprot: P15442) 및 PRDM1 (Uniprot: O75626)인, 억제성(suppressive) 사이토카인들 또는 대사산물들 또는 그것의 수용체들을 양성 조절하거나 또는 코드하는 유전자들의 발현을 감소 또는 방지하는 효과를 갖는다.
그 안에서 IL-2, IL-12 또는 IL-15를 코드하는 서열이 상기 내생 유전자들 중 적어도 하나의 서열을 대체하는, 조작된 면역 세포들이 선호된다.
화학요법 약물들에 대한 내성 유도
본 발명의 또다른 측면에 대하여, 삽입된 외인성 코딩 서열은 화학요법에서 흔히 사용되는 약물들 퓨린(purine) 뉴클레오타이드 유사체들(analogs) (PNA) 또는 6-메르캅토퓨린(Mercaptopurine) (6MP) 및 6 티오(thio)-구아닌(guanine) (6TG)과 같은, 암 또는 감염의 관리(care) 치료들의 표준에서 사용되는 화합물들에 대한 면역 세포들의 민감도의 원인이 되는 유전자의 발현을 감소 또는 방지하는 효과를 갖는다. ("약물 민감성 유전자"로도 불리는) 이러한 화합물들의 작용의 모드 내에 관련된 유전자들을 감소 또는 불활성화시키는 것은 이에 대한 면역 세포들의 내성을 개선한다.
약물 민감성 유전자의 예들은 항엽산제 약물들, 특히 메토트렉사트의 활성에 대하여 GGH (Uniprot Q92820) 및, 6MP 및 6TG와 같은 퓨린 대사길항물질들의 활성에 대하여 HPRT (Uniprot P00492), 플루다라빈(fludarabine) 및 사이클로파라빈(clorofarabine)과 같은, PNA의 활성에 대하여 DCK (Uniprot P27707)를 코드하는 것들이다.
이것은 세포들이 종래 항암 화학요법들과 조합하여 또는 그 이후에 사용되는 것을 가능하게 한다.
면역-억제성 치료들에 대한 내성
본 발명의 또다른 측면에 따라, 삽입된 외인성 코딩 서열은 약물 타겟들인, 수용체들 또는 단백질의 발현을 감소 또는 방지하는 효과를 갖는데, 이는 상기 세포들을 면역-고갈 약물 치료들에 대하여 내성으로 만든다. 이러한 타겟은 조작된 면역 세포들을 많은 암 치료들에서, CD52 양성 면역 세포들을 소모시키는데 사용되는, 알렘투주맙(Alemtuzumab)과 같은, 항체들을 이용한 면역 소모 치료들 또는 글루코코르티코이드들에 내성으로 만들기 위하여, 글루코코르티코이드들 수용체들 또는 항원들일 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 CD52 (Uniprot P31358) 및/또는 GR (NR3C1 - Uniprot P04150으로도 불리는 글루코코르티코이드들 수용체)의 발현을 조절하거나 또는 코드하는 내생 유전자(들) 내 유전자 타겟이 된 삽입을 포함할 수 있다.
CAR 양성 면역 세포들 활성 및 생존의 개선
본 발명의 또다른 측면에 따라, 삽입된 외인성 코딩 서열은 BCMA, CS1 및 CD38와 같은, 표면 항원의 발현을 감소 또는 방지하는 효과를 가질 수 있고, 이때 이러한 항원은 상기 면역 세포들에 의하여 발현되는 CAR에 의하여 타겟되는 것이다.
이 예는 감염된 또는 악성인 세포들의 표면에 존재하나, 또한 어느 정도는 면역 세포 자체에 의하여 발현되는, CAR를 타겟으로 하는 항원들의 문제를 해결할 수 있다.
선호되는 예에 따라, CAR 또는 그것의 구성성분들 중 하나를 코드하는 외인성 서열은 면역 세포들의 자가-파괴를 피하기 위하여 상기 CAR에 의하여 타겟되는 항원을 코드하는 유전자 내로 통합된다.
조작된 면역 세포들 및 면역 세포들의 군집들
본 발명은 또한 세포들의 군집들의 부분으로서 또는 분리된 형태 하 전에 기재된 방법 중 하나에 따라 수득가능한 여러가지 조작된 면역 세포들에 대한 것이다.
본 발명의 선호되는 측면에 따라, 조작된 세포들은, 일반적으로 다른 종류들의 세포들에 관련될 수 있는 세포들의 군집들의 부분인, T-세포들 또는 NK 세포들과 같은, 일차(primary) 면역 세포들이다. 일반적으로, PBMC (말초혈액(peripheral blood) 단핵세포들(mononuclear cells))로부터 백혈구성분채집술에 의하여 분리된 환자들 또는 기증자들로부터 유래된 군집.
본 발명의 선호되는 측면에 따라, 상기 군집에 포함되는 면역 세포들의 50% 초과가 TCR 음성 T-세포들이다. 본 발명의 더욱 선호되는 측면에 따라, 상기 군집에 포함되는 면역 세포들의 50% 초과가 CAR 양성 T-세포들이다.
본 발명은 각각 독립적으로 상기 기재된, 유전자 불활성화 및 다른 외인성 코딩 서열들의 임의의 조합들을 포함하는 면역 세포들을 포함한다. 이들 조합들 중에서 특히 바람직하게는 상기 활성화와 독립적으로, 면역 세포 활성화 동안 꾸준히 활성인 내생 프로모터의 전사 조절 하 CAR의 발현 및 면역 세포 활성화 동안 상향조절되는 프로모터의 전사 조절 하, IL-2, IL-12 또는 IL-15과 같은 사이토카인을 코드하는 외인성 서열의 발현을 조합하는 것들이 선호된다.
또다른 선호되는 조합은 저산소증-유도 인자 1 유전자 프로모터 (Uniprot: Q16665)의 전사 통제 하 CAR 또는 그것의 구성성분들 중 하나를 코드하는 외인성 서열의 삽입이다.
본 발명은 또한, 감염 또는 암의 치료를 위하여 앞서 기재된 대로, 조작된 일차(primary) 면역 세포 또는 면역 세포 군집을 포함하는 약학적 조성물 및 이를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법에 대한 것으로, 상기 방법은 하기를 포함한다:
- 전술된 대로 본 발명의 방법에 따라 조작된 일차(primary) 면역 세포들의 군집을 준비하는 단계;
- 선택적으로, 상기 조작된 일차 면역 세포들을 정제 또는 분류하는 단계;
- 상기 환자 내로 상기 세포들의 주입 후 또는 주입되면, 조작된 일차(primary) 면역 세포들의 상기 군집을 활성화시키는 단계.
T 세포들의 활성화 및 확장
유전적 변형 전 또는 후에, 본 발명에 따른 면역 세포들은, 비록, 그것들이 항원 결합 메커니즘들에 독립적으로 증식 또는 활성화될 수 있다고 하더라도, 활성화되거나 또는 확장될 수 있다. 특히, 예컨대, U.S. Patents 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; and U.S. Patent Application Publication No. 20060121005에 기재된 대로의 방법들을 이용하여 활성화되거나 또는 확장될 수 있다. T 세포들은 인 비트로 또는 인 비보에서 확장될 수 있다. T 세포들은 일반적으로 T 세포를 위한 활성화 신호를 만들기 위하여, T-세포들의 표면 상 공-자극 분자 및 CD3 TCR 복합체를 자극하는 제제와의 접촉에 의하여 확장된다. 예를 들어, 칼슘 이노포어(ionophore) A23187, 포르볼(phorbol) 12-미리스테이트(myristate) 13-아세테이트(acetate) (PMA), 또는 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin) (PHA) 같은 분열촉진(mitogenic) 렉틴들(lectins)과 같은 화학물질들이 T-세포의 활성화 신호를 만들기 위하여 사용될 수 있다.
제한되지 않는 예들로서, T-세포 군집들(populations)은 항-CD3 항체 또는 그것의 항원-결합 단편과의 접촉에 의한 것과 같이 인 비트로로, 또는 표면에 고정된 항-CD2 항체, 또는 칼슘 이노포어와 함께 단백질 키나아제 C 활성화제(activator) (예컨대, 브리오스타틴(bryostatin))과의 접촉에 의하여, 자극될 수 있다. T-세포들의 표면에서 악세서리(accessory) 분자의 공-자극을 위하여, 악세서리 분자에 결합되는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T-세포들의 군집은 T-세포들의 증식을 자극하기에 적합한 조건들 하, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. T 세포 배양에 적합한 조건들은 혈청 (예컨대, 소태아 또는 인간 혈청), 인터루킨-2 (IL-2), 인슐린, IFN-g, 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, - 2, 1L-15, TGFp, 및 TNF- 또는 당업자에게 알려진 세포들의 성장을 위한 다른 임의의 첨가제들을 포함하는, 증식 및 생존 능력에 필요한 인자들을 포함할 수 있는, 적합한 배지(예컨대, 최소(Minimal) 필수(Essential) 배지(Media) 또는 RPMI Media 1640 또는, X-vivo 5, (Lonza))를 포함한다. 세포들의 성장을 위한 다른 첨가제들은 계면활성제, 플라스마네이트(plasmanate) 및 N-아세틸-시스테인(cysteine) 및 2-머캅토에탄올(mercaptoethanoi)과 같은 환원제들을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 배지는 RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1, 및 X-Vivo 20, 및 첨가된 아미노산들과 함께, Optimizer, 나트륨(sodium) 피루베이트(pyruvate) 및 비타민들, 혈청-없이, 또는 적합한 양의 혈청(또는 혈장)이 보충되어, 또는 호르몬들의 정의된 세트, 및/또는 T-세포들의 성장 및 확장에 충분한 양의 사이토카인(들)을 포함할 수 있다. 예컨대, 페니실린 및 스트렙토마이신과 같은 항생제들이 실험 배양에만 포함되고, 대상에 주입되는 세포들의 배양에는 포함되지 않는다. 타겟 세포들은 성장을 지지하는데 필요한 조건들, 예컨대, 적당한 온도 (즉, 37 ℃) 및 대기 (즉, 공기 플러스 5% C02) 하 유지된다. 여러가지 자극 시간들에 노출되어 온 T 세포들은 다른 특성들을 보일 수 있다.
또다른 특정 예에서, 상기 세포들은 조직 또는 세포들과 공-배양함으로써 확장될 수 있다. 상기 세포들은 또한 인 비보, 예를 들어 대상 내로 상기 세포를 투여한 후 대상의 혈액에서 확장될 수 있다.
치료적 조성물들 및 적용들
상기 기재된 본 발명의 방법은 약 15 내지 30 일, 바람직하게는 15 일 및 20 일 사이, 그리고 가장 바람직하게는 18일 및 20일 사이의 제한된 시간 프레임 내에 조작된 일차(primary) 면역 세포들을 생산하는 것을 가능하게 하여, 특히 그것들의 세포독성 활성에 대하여 그것들이 그것들의 완전한 면역 치료 가능성을 유지하게 된다.
이들 세포들은 세포들의 군집을 형성하는데, 이는 바람직하게는 단일의 기증자 또는 환자로부터 유래된다. 이들 세포들의 군집들은 가장 높은 제조 관리기준 요구들을 지키기 위하여 폐쇄된 배양 받는 사람들 하에 확장될 수 있고, 환자 내로 주입 전에 동결될 수 있어, 이로써 "기성품(off the shelf)" 또는 "즉각 사용되는(eady to use)" 치료적 조성물들을 제공한다.
본 발명에 따라, 동일한 백혈구성분채집술로부터 유래되는 세포들의 상당한 수가 수득될 수 있는데, 이는 환자를 치료하기 위하여 충분한 투여량을 얻는데 중요하다. 여러가지 기증자들로부터 유래된 세포들의 군집들 사이의 변형들이 관찰될 수 있는 것에도 불구하고, 백혈구성분채집술에 의하여 입수되는 면역 세포들의 수는 일반적으로 PBMC의 약 108 부터 1010까지의 세포들이다. PBMC는 몇몇 종류들의 세포들을 포함한다: 과립구들, 단핵구들 및 림프구들, T-세포들 중 30 부터 60 % 까지의 것 들 중, 이는 일반적으로 한 명의 기증자로부터의 일차 T-세포들의 108 내지 109 사이를 나타낸다. 본 발명의 방법은 일반적으로 결국 일반적으로 약 108 T-세포들 초과, 더 일반적으로 약 109 T-세포들 초과, 더욱 더 일반적으로 약 1010 T-세포들 초과, 그리고 보통 1011 T-세포들 초과에 도달하는 조작된 세포들의 군집과 함께 한다.
그러므로 본 발명은 더욱 특히 일차(primary) 면역 세포들의 치료적으로 효과적인 군집에 대한 것으로, 이때 상기 군집 내 세포들의 적어도 30 %, 바람직하게는 50 %, 더욱 바람직하게는 80 %는 여기에 기재된 방법들 중 임의의 하나에 따라 변형된다. 본 발명에 따라, 일차(primary) 면역 세포들의 상기 치료적으로 효과적인 군집은 표 6에 기재된 유전자들의 적어도 하나로부터의 내생 프로모터의 전사 조절 하 통합된 적어도 하나의 외인성 유전적 서열을 갖는 면역 세포들을 포함한다.
그러므로 이러한 조성물들 또는 세포들의 군집들은 이를 필요로 하는 환자에 있어서, 특히 암 치료를 위하여, 특히 림프종, 그러나 또한 흑색종들, 신경아세포종들, 신경교종들, 또는 폐, 유방, 대장, 전립선 또는 난소 종양들과 같은 상피성 암들(carcinoma)과 같은 고형 종양들의 치료를 위하여: 의약들로서 사용될 수 있다.
본 발명은 더욱 특히 단일 기증자로부터 유래된 일차 TCR 음성 T-세포들의 군집에 대한 것으로 이때, 상기 군집 내 세포들의 적어도 20 %, 바람직하게는 30 %, 더욱 바람직하게는 50 %는 적어도 둘, 바람직하게는 세 개의 자리들에서 서열-특이적 시약들을 이용하여 변형되었다.
또다른 측면에서, 본 발명은 그것을 필요로 하는 환자들을 치료하는 방법들에 의존하며, 상기 방법은 하기 단계들 중 적어도 하나를 포함한다:
(a) 환자들 종양들 생검들의 표면에 존재하는 특정 항원 마커들을 결정하는 단계;
(b) 상기 특정 항원 마커들에 대항하여 향해진 CAR를 발현시키는, 전술된 본 발명의 방법들 중 하나에 의하여 조작된, 조작된 일차(primary) 면역 세포들의 군집을 제공하는 단계;
(c) 상기 환자에게 조작된 일차(primary) 면역 세포들의 상기 조작된 군집을 투여하는 단계,
일반적으로, 세포들의 상기 군집들은 주로 T-세포들과 같은, CD4 및 CD8 양성 면역 세포들을 포함하는데, 이는 활발한(robust) 인 비보 T 세포 확장을 겪을 수 있고 인-비트로 및 인-비보에서 확장된 시간 동안 지속될 수 있다.
본 발명에 따른 조작된 일차(primary) 면역 세포들을 수반하는 치료는 개선, 치유 또는 예방일 수 있다. 그것은 자가 면역요법의 일부 또는 동종이계(allogenic) 면역요법 치료의 일부일 수 있다. 자가에 의하여, 환자들을 치료하는데 사용되는 세포들, 세포주 또는 세포들의 군집이 상기 환자로부터 또는 인간(Human) 백혈구(Leucocyte) 항원(Antigen) (HLA) 양립성(compatible) 기증자로부터 유래된다는 것이 의미된다. 동종이계에 의하여, 환자들을 치료하는데 사용되는 세포들, 또는 세포들의 군집이 상기 환자가 아닌 기증자로부터 유래된다는 것이 의미된다.
또다른 예에서, 본 발명에 따른 상기 분리된 세포 또는 상기 분리된 세포로부터 유래된 세포주는 액상(liquid) 종양들, 바람직하게는 T-세포 급성 림프모구(lymphoblastic) 백혈형(leukemia)의 치료에 사용될 수 있다.
성인 종양들/암들 및 소아 종양들/암들 또한 포함된다.
본 발명에 따른 조작된 면역 세포들로 하는 치료는 항체들 치료, 화학요법, 사이토카인들 치료, 수지상 세포 치료, 유전자 치료, 호르몬 치료, 레이저 광 치료 및 방사선 요법의 군으로부터 선택되는 암에 대항한 하나 이상의 치료들과 조합일 수 있다.
본 발명의 바람직한 예에 따라, 상기 치료는 면역억제제 치료를 겪는 환자들에게 투여될 수 있다. 정말로, 본 발명은 바람직하게는 이러한 면역억제 제제와 같은 수용체를 코드하는 유전자의 불활성화 때문에 적어도 하나의 면역억제 제제에 내성으로 만들어진, 세포들 또는 세포들의 군집에 의존한다. 이 측면에서, 면역억제 치료는 선택 및 환자 내에서 본 발명에 따른 T-세포들의 확장을 도와야 한다.
본 발명에 따른 세포들 또는 세포들의 군집의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 투입(transfusion), 임플란트(implantation) 또는 이식(transplantation)을 포함하는, 임의의 종래 방식으로 수행될 수 있다. 여기에서 기재된 조성물들은 환자에게 피하로, 피내로, 종양내로, 절내로(intranodally), 척수내로(intramedullary), 근육내로, 정맥 또는 림프절(intralymphatic) 주사에 의하여, 또는 복강내로 환자에게 투여될 수 있다. 한 예에서, 본 발명의 세포 조성물들은 바람직하게는 정맥 주사에 의하여 투여된다.
세포들 또는 세포들의 군집의 투여는 kg 체중 당 104-109 세포들, 바람직하게는 그 범위 내 세포 수들의 모든 정수 값들을 포함하는 105 내지 106 세포들/kg 체중의 투여로 구성될 수 있다. 그러므로 본 발명은 단일 기증자의 또는 환자의 샘플링으로부터 유래된 106 내지 108 사이의 유전자 편집된 세포들을 포함하는, 10 초과의, 일반적으로 50 초과의 더 일반적으로 100 초과의 그리고 보통 1000 초과의 투여량들을 제공할 수 있다.
세포들 또는 세포들의 군집은 하나 이상의 투여량으로 투여될 수 있다. 또다른 예에서, 상기 효과적인 양의 세포들은 일회량으로 투여된다. 또다른 예에서, 상기 효과적인 양의 세포들은 일정 시간의 기간 동안 한 복용량보다 많이 투여된다. 투여 타이밍은 담당 의사의 판단 내이며, 환자의 임상적 상태에 의존한다. 세포들 또는 세포들의 군집은 혈액 은행 또는 기증자와 같은, 임의의 소스로부터 수득될 수 있다. 개인의 필요들이 다른 반면, 그 분야에서 특정 질병 또는 질환들에 대한 정해진 세포 타입의 효과적인 양의 최적 범위의 결정. 효과적인 양은 치료적 또는 예방적(prophylactic) 이점을 제공하는 양을 의미한다. 투여되는 복용량은 받는 사람(recipient)의 연령, 건강 및 무게, 함께 이루어지는 치료의 종류, 만약 있다면, 치료의 빈도 및 바람직한 효과의 특성에 의존할 것이다.
또다른 예에서, 상기 효과적인 양의 세포들 또는 그 세포들을 포함하는 조성물은 비경구로 투여된다. 상기 투여는 정맥 투여일 수 있다. 상기 투여는 종양 내로 주사에 의하여 직접적으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 특정 예들에서, 세포들은 항바이러스 치료, 시도포비르 및 인터루킨-2와 같은 제제들로 하는 치료, MS 환자들을 위한 나탈리지맙(nataliziimab) 또는 시트라빈 (ARA-C로도 알려짐) 치료 또는 건선 환자들을 위한 에팔리즈티맙(efaliztimab) 치료 또는 PML 환자들을 위한 다른 치료들을 포함하나 이에 제한되지 않는 많은 관련 치료 양식들과 함께 (예컨대, 그 전, 동시에 또는 그 후) 환자에게 투여된다. 추가의 예들에서, 본 발명의 T 세포들은 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉사트, 마이코페놀레이트(mycophenolate), 및 FK506, 항체들과 같은, 면역억제 제제들, 방사선, 화학요법, 또는 CAMPATH과 같은 다른 면역제거 제제들, 항-CD3 항체들 또는 다른 항체 요법들, 사이톡신, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신(rapamycin), 마이코프리에놀산(mycoplienolic acid), 스테로이드들, FR901228, 사이토카인들, 및 방사선요법과 조합하여 사용될 수 있다. 이들 약물들은 칼슘 의존적 포스파타제 칼시뉴린 (사이클로스포린 및 FK506)을 억제하거나 또는 성장인자 유도된 신호전달에 중요한 p70S6 키나제 (라파마이신)을 억제한다 (Henderson, Naya et al. 1991; Liu, Albers et al. 1992; Bierer, Hollander et al. 1993). 추가의 예에서, 본 발명의 세포 조성물들은 플루다라빈과 같은 화학요법 제제들, 외부-빔 방사 요법(XRT), 사이클로포스파미드, 또는 CAMPATH 또는 OKT3와 같은 항체들을 이용한 T 세포 제거 요법, 골수 이식과 함께 (예컨대, 그 전, 동시에 또는 그 후) 환자에 투여된다. 또다른 예에서, 본 발명의 세포 조성물들은 CD20와 반응하는 제제들과 같은, 예컨대, Rituxan, B-세포 제거 요법 후 투여된다. 예를 들어, 한 예에서, 대상은 고용량 화학요법으로 표준 치료를 겪을 수 있고 뒤이어 말초혈액 줄기 세포 이식이 이어진다. 특정 예들에서, 이식 후, 대상은 본 발명의 확장된 면역 세포들의 주입을 받는다. 추가적인 예에서, 확장된 세포들은 수술 전 또는 후에 투여된다.
본 발명의 특정 예들에서, 세포들은 항바이러스 치료, 시도포비르 및 인터루킨-2와 같은 제제들로 하는 치료, MS 환자들을 위한 나탈리지맙(nataliziimab) 또는 시트라빈 (ARA-C로도 알려짐) 치료 또는 건선 환자들을 위한 에팔리즈티맙(efaliztimab) 치료 또는 PML 환자들을 위한 다른 치료들을 포함하나 이에 제한되지 않는 많은 관련 치료 양식들과 함께 (예컨대, 그 전, 동시에 또는 그 후) 환자에게 투여된다. 추가의 예들에서, 본 발명의 T 세포들은 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉사트, 마이코페놀레이트(mycophenolate), 및 FK506, 항체들과 같은, 면역억제 제제들, 방사선, 화학요법, 또는 CAMPATH과 같은 다른 면역제거 제제들, 항-CD3 항체들 또는 다른 항체 요법들, 사이톡신, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신(rapamycin), 마이코프리에놀산(mycoplienolic acid), 스테로이드들, FR901228, 사이토카인들, 및 방사선요법과 조합하여 사용될 수 있다. 이들 약물들은 칼슘 의존적 포스파타제 칼시뉴린 (사이클로스포린 및 FK506)을 억제하거나 또는 성장인자 유도된 신호전달에 중요한 p70S6 키나제 (라파마이신)을 억제한다 (Henderson, Naya et al. 1991; Liu, Albers et al. 1992; Bierer, Hollander et al. 1993). 추가의 예에서, 본 발명의 세포 조성물들은 플루다라빈과 같은 화학요법 제제들, 외부-빔 방사 요법(XRT), 사이클로포스파미드, 또는 CAMPATH 또는 OKT3와 같은 항체들을 이용한 T 세포 제거 요법, 골수 이식과 함께 (예컨대, 그 전, 동시에 또는 그 후) 환자에 투여된다. 또다른 예에서, 본 발명의 세포 조성물들은 예컨대, 리툭산(Rituxan)인, CD20와 반응하는 제제들과 같은, B-세포 제거 요법 후 투여된다. 예를 들어, 한 예에서, 대상은 고용량 화학요법으로 표준 치료를 겪을 수 있고 뒤이어 말초혈액 줄기 세포 이식이 이어진다. 특정 예들에서, 이식 후, 대상은 본 발명의 확장된 면역 세포들의 주입을 받는다. 추가적인 예에서, 확장된 세포들은 수술 전 또는 후에 투여된다.
CAR들이 본 발명에 따른 면역 세포들의 군집들 또는 면역 세포들에서 발현될 때, 선호되는 CAR들은 CD22, CD38, CD123, CS1, HSP70, ROR1, GD3, 및 CLL1로부터 선택되는 적어도 하나의 항원을 타겟으로 하는 것들이다.
CD22를 타겟으로 하는 변형된 TCR 또는 CAR을 지닌 것으로 여겨지는, 본 발명에 따른 조작된 면역 세포들은 바람직하게는 급성 림프모구 백혈병 (ALL)과 같은 백혈병을 치료하는데 사용되며, CD38을 타겟으로 하는 변형된 TCR 또는 CAR을 지닌 것으로 여겨지는 것들은 바람직하게는 T-세포 급성 림프모구 백혈병 (T-ALL) 또는 다발성 골수종(multiple myeloma) (MM)과 같은 백혈병을 치료하는데 사용되고, CD123을 타겟으로 하는 변형된 TCR 또는 CAR을 지닌 것으로 여겨지는 것들은 바람직하게는 급성 골수성(myeloid) 백혈병(leukemia) (AML), 및 분아형(blastic) 플라스마사이토이드(plasmacytoid) 수지상(dendritic) 세포들(cells) 신생물(neoplasm) (BPDCN)과 같은 백혈병을 치료하는데 사용되고, CS1을 타겟으로 하는 변형된 TCR 또는 CAR을 지닌 것으로 여겨지는 것들은 바람직하게는 다발성 골수종 (MM)을 치료하는데 사용된다.
본 발명은 또한 특히 서열번호 :36 내지 40에 의하여 나타내어지는 임의의 서열들을 혼성화하는 프라이머들 또는 프로브들을 이용함으로써, 특히 PD1, CD25, CD69 및 TCR 자리들에서, 본 명세서에서 언급된 내생 자리들에서 외인성 코딩 서열들의 삽입들을 검출하는 PCR 방법들을 이용하는 단계들을 수행함으로써, 원하는 유전적 삽입들을 포함하는 본 발명의 조작된 세포들을 검출하기 위한 수단들을 포함한다.
면역학적 분석들은 또한 이러한 유전자들이 넉아웃되거나 또는 그것들의 발현이 감소되는 세포들에서 TCR, PD1, IL-6 또는 IL-8의 발현의 감소 또는 부재를 체크하기 위하여, GP130, CAR들의 조작된 세포들에 의한 발현을 검출하기 위하여 수행될 수 있다.
다른 정의들
- 폴리펩타이드 서열에서 아미노산 잔기들은 한-문자 코드에 따라 여기에 설계되며, 여기에서 예를 들어, Q는 Gln 또는 글루타민(Glutamine) 잔기를 의미하고, R은 Arg 또는 알기닌(Arginine) 잔기를 의미하고 그리고 D는 Asp 또는 아스파르트산(Aspartic acid) 잔기를 의미한다.
- 아미노산 치환은 하나의 아미노산 잔기의 또다른 것으로의 대체를 의미하며, 예를 들어 펩타이드 서열에서 알기닌 잔기의 글루타민 잔기로의 대체는 아미노산 치환이다.
- 뉴클레오타이드들은 하기와 같이 설계된다: 일-문자 코드가 뉴클레오사이드의 염기를 지시하는데 사용된다: a는 아데닌, t는 티민, c는 사이토신 그리고 g는 구아닌이다. 축퇴된 뉴클레오타이드들에 대하여, r은 g 또는 a (퓨린 뉴클레오타이드들)을 나타내고, k는 g 또는 t를 나타내고, s는 g 또는 c를 나타내고, w는 a 또는 t를 나타내고, m은 a 또는 c를 나타내고, y는 t 또는 c (피리미딘 뉴클레오타이드들)를 나타내고, d는 g, a 또는 t를 나타내고, v는 g, a 또는 c를 나타내고, b는 g, t 또는 c를 나타내고, h는 a, t 또는 c를 나타내고, 그리고 n은 g, a, t 또는 c를 나타낸다.
- 여기에서 사용된 대로, "핵산" 또는 "폴리뉴클레오타이드들"은 디옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA), 올리고뉴클레오타이드들, 폴리메라제 체인 반응 (PCR)에 의하여 만들어지는 단편들, 라이게이션, 분리(scission), 엔도뉴클레아제 작용, 및 엑소뉴클레아제 작용 중 임의의 것에 의하여 만들어진 단편들과 같은, 뉴클레오타이드들 및/또는 폴리뉴클레오타이드들을 가리킨다. 핵산 분자들은 (DNA 및 RNA와 같은) 자연적으로-발생하는 뉴클레오타이드들, 또는 자연적으로-발생하는 뉴클레오타이드들 (예컨대, 자연적으로-발생하는 뉴클레오타이드들의 거울상이성질체 형태들), 또는 그 둘의 조합인 모노머들로 이루어질 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드들은 당 모이어티들 및/또는 피리미딘 또는 퓨린 염기 모이어티들에서 변형을 가질 수 있다. 당 변형들은 예를 들어, 하나 이상의 하이드록실기들의 할로겐들, 알킬기들, 아민들, 및 아다이도(azido) 기들로의 대체를 포함하고, 또는 당들은 에테르 또는 에스터들과 같이 기능적일 수 있다. 게다가, 전체 당 모이어티는 아자(aza)-당들 및 카르복실 당 유사체들과 같은, 입체구조적으로 그리고 전기적으로 유사한 구조들로 대체될 수 있다. 염기 모이어티에서의 변형들의 예들은 알킬화된 퓨린들 및 피리미딘들, 아크릴화된 퓨린들 또는 피리미딘들, 또는 다른 잘 알려진 헤테로사이클릭 치환들을 포함한다. 핵산 모노머들은 포스포다이에스터 연결들 또는 이러한 연결들의 유사체들에 의하여 연결될 수 있다. 핵산들은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
- 용어 "엔도뉴클레아제"는 DNA 또는 RNA 분자, 바람직하게는 DNA 분자 내 핵산들 사이의 결합들의 가수분해 (절단)을 촉매화할 수 있는 임의의 야생형 또는 변종 효소들을 가리킨다. 엔도뉴클레아제들은 그것의 서열에 상관 없이 DNA 또는 RNA 분자를 절단하지 않으나, "타겟 서열들" 또는 "타겟 부위들"로 더 언급되는 특정 폴리뉴클레오타이드 서열들에서 DNA 또는 RNA 분자를 인식하고 절단한다. 엔도뉴클레아제들은 보통 10 염기쌍들 (bp) 길이보다 더 큰, 더욱 바람직하게는 14-55 bp의 폴리뉴클레오타이드 인식 부위를 가질 때 희귀-절단 엔도뉴클레아제들로 분류될 수 있다. 희귀-절단 엔도뉴클레아제들은 정의된 자리에서 DNA 이중-가닥 손상들(breaks) (DSBs)을 유도함으로써 상동 재조합을 상당히 증가시켜, 이로써 유전자 수선 또는 유전자 삽입 요법들을 가능하게 한다 (Pingoud, A. and G. H. Silva (2007). Precision 게놈 surgery. Nat. Biotechnol. 25(7): 743-4.).
- "DNA 타겟", "DNA 타겟 서열", "타겟 DNA 서열", "핵산 타겟 서열". "타겟 서열" 또는 "가공 부위"에 의하여 본 발명에 따른 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의하여 타겟되고 가공될 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열이 의도된다. 이들 용어들은, 제한되지 않는 예로서, 특이적 DNA 위치, 바람직하게는 에서 게놈 위치, 그리고 또한 플라스미드들, 에피좀(episomes), 바이러스, 트랜스포존들(transposons) 또는 미토콘드리아와 같은 세포기관들에서 유전적 물질의 주요 부분에 독립적으로 존재할 수 있는 유전적 물질의 부분을 가리킨다. RNA 가이드된 타겟 서열들의 제한되지 않는 예들로서, RNA 가이드된 엔도뉴클레아제를 원하는 자리(locus)로 방향을 향사게 하는 가이드 RNA를 혼성화할 수 있는 그것들 게놈 서열들이다.
- "돌연변이"에 의하여 폴리뉴클레오타이드 (cDNA, 유전자) 또는 폴리펩타이드 서열에서 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열, 열하나, 열둘, 열셋, 열넷, 열다섯, 스물, 스물다섯, 서른, 마흔, 쉰, 또는 그보다 많은 뉴클레오타이드들/아미노산들의 치환, 결실, 삽입이 의도된다. 돌연변이는 유전자의 코딩 서열 또는 그것의 조절 서열에 영향을 미칠 수 있다. 그것은 또한 코드된 mRNA의 구조/안정성 또는 게놈 서열의 구조에 영향을 미칠 수 있다.
- "벡터"에 의하여 그것이 연결된 또다른 핵산을 이동시킬 수 있는 핵산 분자가 의미된다. 본 발명에서 "벡터"는 염색체, 비(non) 염색체, 반-합성 또는 합성 핵산들로 구성될 수 있는 선형 또는 원형 DNA 또는 RNA 분자, 바이러스 벡터, a 플라스미드, a RNA 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 벡터들은 그것들이 연결되는 핵산들의 발현 (발현 벡터들) 및/또는 자동적인 복제 (에피솜 벡터)가 가능한 것들이다. 많은 수의 적당한 벡터들이 당업자들에게 알려져 있고 상업적으로 이용가능하다. 바이러스 벡터들은 예컨대, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 파보바이러스 (예컨대 아데노관련 바이러스들 (AAV)), 코로나바이러스, 오르소믹소바이러스(orthomyxovirus) (예컨대, 인플루엔자 바이러스)와 같은 음성 가닥 RNA 바이러스들, 랍도바이러스(rhabdovirus) (예컨대, 광견병 및 수포성 구내염(vesicular stomatitis) 바이러스), 파라믹소바이러스(paramyxovirus) (예컨대 홍역 및 센다이), 피코르나바이러스 및 알파바이러스와 같은 양성 가닥 RNA 바이러스들, 및 including 아데노바이러스 헤르페스바이러스 (예컨대, 헤르페스 심브ㅍ렉스 바이러스 타입들 1 및 2을 포함하는 이중 가닥 DNA 바이러스들, 엡스타인(Epstein)-바(Barr) 바이러스, 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus)), 및 수두 방이러스 (예컨대, 우두, 계두 및 카나리아두창)을 포함한다. 다른 바이러스들은 노워크(Norwalk) 바이러스, 토가바이러스 플라비바이러스, 레오바이러스들(reociruses), 파포바바이러스(papovavirus), 헤파드나바이러스(hepadnavirus), 및 간염 바이러스를 포함한다. 레트로바이러스들의 예들은 하기를 포함한다: 새의 백혈증 육종, 포유류 C-타입, B-타입 바이러스들, D 타입 바이러스들, HTLV-BLV 그룹, 렌티바이러스, 스푸마바이러스(spumavirus)(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruseses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).
- 여기에서 사용된 대로, 용어 "자리(locus)"는 게놈 내로의 DNA 서열의 (예컨대 유전자의) 특정 물리적 위치이다. 용어 "자리(locus)"는 감염 제제의 게놈 서열 상 또는 크로모좀 상 희귀-절단 엔도뉴클레아제 타겟 서열의 특정 물리적 위치를 가리킬 수 있다. 이러한 자리는 본 발명에 따른 서열-특이적 엔도뉴클레아제에 의하여 인식 및/또는 절단되는 타겟 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 관심있는 자리는 세포의 (즉 크로모좀에서) 유전적 물질의 주요 부분에 존재하는 핵산 서열 뿐 아니라, 제한되지 않는 예들로서, 플라스미드들, 에피좀들, 바이러스, 트랜스포존들, 또는 미토콘드리아와 같은 세포기관들에서 유전적 물질의 부분을 수식하는 것으로 이해된다.
- 용어 "절단"은 폴리뉴클레오타이드의 공유 백본(backbone)의 파손을 가리킨다. 절단은 인산이에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하나, 이에 제한되지 않는 여러가지 방법들에 의하여 개시될 수 있다. 단일-가닥 절단 및 이중-가닥 절단 둘 다 가능하며, 이중-가닥 절단은 두 개의 구별되는 단일-가닥 절단 이벤트들의 결과로서 발생할 수 있다. 이중 가닥 DNA, RNA, 또는 DNA/RNA 혼성 절단은 뭉툭한 말단들 또는 엇갈린(staggered) 말단들의 생산을 야기할 수 있다.
- "동일성"은 두 핵산 분자들 또는 폴리펩타이드들 사이의 서열 동일성(identity)이 가리킨다. 동일성은 비교 목적으로 정렬될 수 있는 각 서열에서의 위치의 비교에 의하여 결정될 수 있다. 비교되는 서열에서의 위치가 동일 염기에 의하여 차지될 때, 그러면 분자들은 그 위치에서 동일하다. 핵산 또는 아미노산 서열들 사이에서 유사도(similarity) 또는 동일성(identity)의 정도는 핵산 서열들에 의하여 공유되는 위치들에서 동일하거나 또는 매칭되는 뉴클레오타이드들의 수의 기능이다. 여러가지 정렬 알고리즘들 및/또는 프로그램들이 두 서열들 사이의 동일성을 계산하는데 사용될 수 있고, GCG 서열 분석 패키지의 부분으로서 이용가능한 BLAST 또는 FASTA를 포함하고 (University of Wisconsin, Madison, Wis.), 에컨대, 디폴트 세팅으로 사용될 수 있다. 예컨대, 여기에 기재된 특정 폴리펩타이드들에 적어도 70%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성을 갖고 바람직하게는 이러한 폴리펩타이드들를 코드하는 폴리뉴클레오타이드와 더불어, 대체로 동일한 기능들을 보여주는 폴리펩타이드들이 고려된다.
여기에서 사용된 대로 용어 "대상" 또는 "환자"는 인간이 아닌 영장류들 및 인간들을 포함하는 동물계의 모든 멤버들을 포함한다.
본 발명의 상기 기재된 기재는 그것을 만들고 이용하는 공정 및 방식을 제공하여, 당업자가 이를 만들고 사용하는 것을 가능하게 하는 것이며, 이 구현은 특히 원래 기재의 부분을 이루는, 첨부된 특허청구범위의 주제를 위하여, 제공된다.
숫자 제한 또는 범위가 여기에 기재될 때, 그 단점들(endpoints)이 포함된다. 또한 숫자 제한 또는 범위 내 모든 값들 및 하위범위들은 명백히 적혀있는 것처럼, 특이적으로 포함된다.
이 발명에 일반적으로 기재된 것, 추가의 이해가 특정 특이적 예들을 참조로 하여 수득될 수 있는데, 이는 설명 목적을 위하여만 여기에 제공되는 것이며, 청구된 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예들
실시예 1: 내생 유전자의 넉아웃과 함께 내생 프로모터들의 통제 하 여러가지 자리들에서 인간 일차(primary) T-세포들에서 AAV 주도의 상동 재조합
도입
원하는 자리들에서 게놈 내 이중-가닥 손상들 (DSBs)의 부위-특이적 유도를 가능하게 하는 TALEN® (Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 PARIS)와 같은 서열 특이적 엔도뉴클레아제 시약들. 세포 효소들에 의한 DSB들의 수선은 두 경로들을 통하여 주로 발생한다: 비상동(non-homologous) 말단(end) 연결(joining) (NHEJ) 및 상동성(homology) 향하는(directed) 수선(repair) (HDR). HDR은 재조합에 의한 DSB를 수선하기 위하여 DNA (주형 DNA)의 상동성 조각을 이용하며, 주형 DNA에 포함되는 임의의 유전적 서열을 도입하는데 이용될 수 있다. 거기에서 보여진 대로, 상기 주형 DNA는 부위-특이적 DSB을 도입하기 위하여 TALEN®과 같은 조작된 뉴클레아제와 함께 재조합 아데노(adeno)-관련(associated) 바이러스(virus) (rAAV)에 의하여 전달될 수 있다.
통합 매트릭스들의 설계
1.1. 내생 PD1 유전자 코딩 서열의 넉아웃과 함께 조절되지 않은 자리에서 세포자멸사 CAR의 삽입
TALEN 타겟 부위의 위치는 타겟이 된 내생 PDCD1 유전자 (PD1 - Uniprot # Q15116으로 불린 프로그램된(Programmed) 세포사(cell death) 단백질 1)에 위치되도록 설계되었다. TALEN 타겟들의 1000bp 업스트림 및 다운스트림을 포함하는 서열은 서열번호 1 및 서열번호 2에 주어진다. TALEN (서열번호: 서열번호 3 및 4)의 타겟 서열들이 서열번호 5에 주어진다. 통합 매트릭스는 TALEN 부위의 내생 유전자 업스트림에 상동성인 서열 (300 bp)(서열번호 1), 뒤이어 2A 조절 요소 (서열번호 6), 뒤이어 시작 코돈 없이 세포자멸사를 유도하는 CAR를 코드하는 서열 (서열번호 7), 뒤이어 STOP 코돈 (TAG), 뒤이어, 폴리아데닐화 서열 (서열번호 8), 뒤이어 TALEN 부위의 내생 유전자 다운스트림에 상동인 서열 (1000bp) (서열번호 2))을 포함하도록 설계된다. 삽입 매트릭스는 그 다음에 프로모터 없는 rAAV 벡터 내로 클로닝되고 AAV6를 생산하는데 이용된다.
1.2 내생 유전자의 넉아웃과 함께 조절되지 않은 자리에서 인터루킨의 삽입
TALEN 타겟 부위의 위치는 타겟이 된 내생 PDCD1 유전자 (프로그램된 세포사 단백질 1, PD1)에 위치되도록 설계된다. TALEN 타겟들의 1000bp 업스트림 및 다운스트림을 포함하는 서열이 서열번호 1 및 서열번호 2에 주어진다. TALEN의 타겟 서열들 (서열번호: 서열번호 3 및 서열번호 4)가 서열번호 5에 주어진다. 통합 매트릭스는 TALEN 부위의 내생 유전자 업스트림에 상동인 서열 (300 bp) (서열번호 1), 뒤이어 2A 조절 요소 (서열번호 6), 뒤이어 조작된 단일-체인의 인간 IL-12 p35 (서열번호 9) 및 p40 (서열번호 10) 서브유닛 융합 단백질을 코드하는 서열, 뒤이어 STOP 코돈 (TAG), 뒤이어 폴리아데닐화 서열 (서열번호 8), 뒤이어 TALEN 부위의 내생 유전자 다운스트림에 상동인 서열 (1000bp) (서열번호 2)을 포함하도록 설계된다. 삽입 매트릭스는 그 다음에 프로모터 없는 rAAV 벡터 내로 클로닝되고 AAV6를 생산하는데 사용된다.
1.3 내생 유전자 - N-말단 삽입의 넉아웃 없이 약하게 발현되는 자리에서 세포자멸사 CAR의 삽입
TALEN 타겟 부위의 위치는 타겟이 된 LCK 유전자 (LCK, LCK 프로토(proto)-종양유전자(oncogene), Src 패밀리 티로신 키나제 [호모 사피엔스 (인간)])의 시작 코돈에 가능한 한 접근하여 위치되도록 설계된다. 시작 코돈의 1000bp 업스트림 및 다운스트림을 포함하는 서열은 서열번호 11 및 서열번호 12에 주어진다. 통합 매트릭스는 시작 코돈의 내생 유전자 업스트림에 상동인 서열 (1000bp), 뒤이어 시작 코돈을 포함하는 세포자멸사를 유도하는 CAR를 코드하는 서열 (서열번호 13), 뒤이어 2A 조절 요소 (서열번호 8), 뒤이어 시작 코돈의 내생 유전자 다운스트림에 상동인 서열 (1000bp) (서열번호 12)을 포함하도록 설계된다. 그 다음에 삽입 매트릭스는 프로모터 없는 rAAV 벡터 내로 클로닝되고 AAV6을 생산하는데 사용된다.
1.4 내생 유전자 - C-말단 삽입의 넉아웃 없이 약하게 발현되는 자리에서 세포자멸사 CAR의 삽입
TALEN 타겟 부위의 위치는 타겟이 된 내생 LCK 유전자 (LCK, LCK 프로토-종양유전자, Src 패밀리 티로신 키나제 [호모 사피엔스 (인간)])의 종결 코돈에 가능한 한 인접하게 위치되도록 설계된다. 종결 코돈의 1000bp 업스트림 및 다운스트림을 포함하는 서열이 서열번호 14 및 서열번호 15에 주어진다. 통합 매트릭스는 종결 코돈의 내생 유전자 업스트림에 상동인 서열(1000bp), 뒤이어 2A 조절 요소 (서열번호 8), 뒤이어 시작 코돈 없이 세포자멸사를 유도하는 CAR를 코드하는 서열, 뒤이어 STOP 코돈 (TAG), 뒤이어 종결 코돈의 내생 유전자 다운스트림에 상동인 서열 (1000bp) (서열번호 15)을 포함하도록 설계된다. 삽입 매트릭스는 그 다음에 프로모터 없는 rAAV 벡터 내로 클로닝되고 AAV6를 생산하는데 이용된다.
형질도입된 세포들에서 서열-특이적 뉴클레아제 시약들의 발현
TALEN® mRNA는 mMessage mMachine T7 Ultra 키트 (Thermo Fisher Scientific, Grand Island, NY)를 이용하여 합성되는데, 이는 각 TALEN 이 T7 프로모터의 클로닝된 다운스트림이고, RNeasy 칼럼들 (Qiagen, Valencia, CA)을 이용하여 정제되고, "cytoporation medium T" (Harvard Apparatus, Holliston, MA)에서 용출되기 때문이다. 인간 T-세포들은 20 ng/ml 인간 IL-2 (Miltenyi Biotech, San Diego, CA), 5% 인간 AB 혈청 (Gemini Bio-Products, West San Francisco, CA) 및 1:1 비드:세포 비율에서 다이나비드들(Dynabeads) 인간 T-활성자(activator) CD3/CD28 (Thermo Fisher Scientific, Grand Island, NY)로 보충된 X-Vivo-15 배지 (Lonza, Basel, Switzerland)에서 ALLCELLS (Alameda, CA)에 의하여 공급된 전체(whole) 말초혈액으로부터 수집되고 활성화된다. 비드들은 3일 후 제거되고, 5 x 106 세포들이 3,000 V/cm 에서 두 번의 0.1 mS 펄스들을 적용하고 뒤어어 최종 부피 200 μl 의 "cytoporation medium T" (BTX Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts)에서 0.4 cm 갭(gap) 큐벳들(cuvettes)에서 네 번의 0.2 mS 펄스들이 이어짐으로써 Cytopulse (BTX Harvard Apparatus, Holliston, MA)를 이용하여 두 개의 적합한 TALEN®의 각각의 10 μg mRNA으로 전기천공된다. 세포들은 즉시 20 ng/mL IL-2 로 X-Vivo-15 배지에서 희석되고 5% CO2와 37℃에서 배양된다. 두 시간 후, 세포들은 세포 당 3 x 10^5 바이러스 게놈들 (vg)에서 AAV6 입자들과 배양된다 (37 ℃, 16 시간). 세포들은 각각 삽입된 유전자 서열들의 발현을 위하여 유동세포분석법에 의하여 시험될 때까지 20 ng/mL IL-2 및 5% 인간 AB 혈청으로 보충된 X-Vivo-15 배지에서 계대되고(passaged) 유지된다.
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표 4: 실시예 1에 언급된 서열들
실시예 2: T-세포들에서 매트릭스들을 코드하는 CAR 및 IL-15의 TALEN®-매개된 이중 타겟된 통합
물질들
X-vivo-15는 Lonza (cat#BE04-418Q)로부터, IL-2는 Miltenyi Biotech (cat#130-097-748)로부터, 인간 혈청 AB는 Seralab (cat#GEM-100-318)로부터, 인간 T 활성인자(activator) CD3/CD28는 Life Technology (cat#11132D)로부터, QBEND10-APC는 R&D Systems (cat#FAB7227A)로부터, 비오블루(vioblue)-표지된 항-CD3, PE-표지된 항-LNGFR, APC-표지된 항-CD25 및 PE-표지된 항-PD1는 Miltenyi (cat# 130-094-363, 130-112-790, 130-109-021 및 130-104-892) 48 웰들 처리된 플레이트들 (CytoOne, cat#CC7682-7548)로부터, 인간 IL-15 Quantikine ELISA 키트는 R&D systems (cat#S1500)로부터, ONE-Glo는 Promega (cat#E6110)로부터 수득되었다. 다른 매트릭스들을 포함하는 AAV6 배치들은 Virovek로부터 수득되었고, PBMC 세포들은 Allcells, (cat#PB004F)로부터 수득되었고 Raji-루시페라제 세포들은 ATCC (cat#CCL-86)로부터의 Raji 세포들의 반딧불 루시페라제-코드하는 렌티바이러스 입자들 형질도입 후 수득되었다.
방법들
2.1-형질주입-형질도입
TRAC 및 PD1 또는 CD25 자리들에서 이중 타겟된 통합이 하기와 같이 수행되었다. PBMC 세포들이 처음에 해동되고, 세척되고, 재현탁되고, 그리고 X-vivo-15 완전 배지 (X-vivo-15, 5% AB 혈청, 20 ng/mL IL-2)에서 배양되었다. 하루 후 세포들은 Dynabeads 인간 T 활성제(activator) CD3/CD28 (25 uL의 비드들/1E6 CD3 양성 세포들)에 의하여 활성화되었고 5% CO2의 존재에서 37 ℃에서 X-vivo 완전 배지에서 3 일 동안 1E6 세포들/mL의 밀도에서 배양되었다. 그 다음에 세포들은 신선한 완전 배지에서 나뉘어 하기 절차에 따라 다음 날 형질도입/형질주입되었다. 형질도입-형질주입 날, 세포들은 먼저 자력 분리 (EasySep)에 의하여 비드들이 제거되었고, Cytoporation buffer T (BTX Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts)에서 두 번 세척되었고 동일한 용액에서 최종 농도 28E6 세포들/mL에서 재현탁되었다. 세포 현탁물은 최종 부피 200 μl에서 (각각 서열번호 :18 및 19 및 서열번호 :20 및 21) CD25 또는 PD1 TALEN®의 암들을 코드하는 15 μg mRNA의 부재 EH는 존재 하 TRAC TALEN® 암들(arms) (서열번호 :16 및 17)을 코드하는 5 μg mRNA과 혼합되었다. TALEN®은 Fok-1와 함께 TALE의 융합으로부터 야기되는 TALE-뉴클레아제들의 표준 구성방식이다. 형질주입은 3,000 V/cm에서 두 번의 0.1 mS 펄스들을 적용하고, 뒤이어 최종 부피 200 μl Cytoporation buffer T (BTX Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts) 및 0.4 cm 갭 큐벳들에서 325 V/cm에서 네 번의 0.2 mS 펄스들이 이어짐으로써, 펄스(Pulse) 아질(Agile) 기술을 이용하여 수행되었다. 그 다음에 전기천공된 세포들은 즉시 예열된(prewarm) X-vivo-15 무혈청 배지를 포함하는 12-웰 플레이트로 이동되었고 37℃에서 15 분 동안 배양되었다. 그 다음에 세포들은 48 웰들 주기적으로 처리된 플레이트들에서 기증자 매트릭스들을 포함하는 AAV6 입자들 (MOI=3E5 vg/세포들)의 존재 하 250 μL의 동일한 배지에서 8E6 세포들/mL로 농축되었다. 30℃에서 배양 2 시간 후, 10% AB 혈청이 보충된 Xvivo-15 배지 250 μL 및 40 ng/ml IL-2이 세포 현탁액에 첨가되었고 그 혼합물은 동일한 배양 조건들에서 24 시간 배양되었다. 하루 후, 세포들은 완전 X-vivo-15 배지에서 1E6 세포들/mL에서 접종(seed)되엇고, 5% CO2의 존재 하 37 ℃에서 배양되었다.
2.2-IL15의 분비 및 ΔLNGFR의 활성화-의존적 발현
조작된 T-세포들은 앞서 기재된 형질주입-형질도입 공정으로부터 회수되었고 1E6 세포들/mL 단독에서 또는 완전 X-vivo-15 배지의 최종 부피 100 μL에서 Dynabeads (12.5 uL/1E6 세포들) 또는 Raji 세포들 (E:T=1:1)의 존재 하 접종되었다. 세포들은 회수되기 전에 48 시간 동안 배양되었고, 표지되었고, 유동세포분석법에 의하여 분석되었다. 세포들은 두 개의 독립적인 세트들의 항체들로 표지되었다. ΔLNGFR, CAR 및 CD3 세포들의 존재를 검출하는 것을 목표로 하는 항체들의 첫 번째 세트들은 QBEND10-APC (1/10 희석됨), 바이오블루(vioblue)-표지된 항 CD3 (1/25 희석됨) 및 PE-표지된 항-ΔLNGFR (1/25 희석됨)로 구성된다. 내생 CD25 및 PD1의 발현을 검출하는 것을 목표로 하는 항체들의 두 번째 세트들은 APC-표지된 항-CD25 (1/25 희석됨) 및 바이오블루-표지된 항 PD1 (1/25 희석됨)으로 구성된다.
동일한 실험적 셋업이 배지에서 IL-15 분비를 연구하기 위하여 사용되었다. 세포들 혼합물은 IL-15 특이적 ELISA 키트를 이용하여 상청액 수집 및 분석 전 2, 4, 7 및 10 일 동안 공-배양으로 유지되었다.
2.3-순차적 사멸 분석
조작된 CAR T-세포들의 항종양 활성을 평가하기 위하여 순차적 사멸(killing) 분석이 수행되었다. 이 분석의 원리는 변함없는 양의 종양 세포들의 매일 첨가에 의하여 매일 CAR T-세포 항종양 활성을 요구하는 것이다. 종양 세포 증식, 통제 및 재발은 종양 세포주들에 안정적으로 통합된 루시페라제 마커 덕분에 형광 판독(read out)을 통하여 모니터링될 수 있다.
보통 CAR T-세포들은 최종 부피 1 mL의 Xivo 5% AB, 20 ng/uL IL-2에서 여러가지 E:T 비율 (E:T=5:1 또는 1:1)에서 2.5x105 Raji-luc 종양 세포들의 현탁액에 혼합된다. 혼합물은 ONE-Glo 시약을 이용하여 세포 현탁액 25 μL의 발광을 결정하기 전에 24 시간 배양된다. 세포들 혼합물은 그 다음에 스핀다운되고, 오래된 배지는 폐기되고 2.5x105 Raji-Luc 세포들을 포함하는 1 mL의 신선한 완전 X-vivo-15 배지로 치환되고, 그 결과인 세포 혼합물은 24 시간 동안 배양된다. 이 프로토콜은 4 일 반복된다.
실험들 및 결과들
이 실시예는 PD1 및 CD25 유전자들을 조절하는 내생 T-세포 프로모터들의 통제 하 IL-15/용해성 IL-15 수용체 알파 헤테로다이머 (IL15/sIL15rα) 발현 카세트를 통합함으로써 CAR T-세포 요법들의 치료적 결과를 개선하기 위하여 방법들을 기재한다. 유전자들 둘 다 CAR T-세포들에 의하여 종양 이용되면 상향조절되는 것으로 알려져있기 때문에, 그것들은 종양의 부근에서만 IL- IL15/sIL15rα을 재-발현시키기 위하여 하이잭될 수 있다. 이 방법은 IL15/sIL15rα 침투성(systemic) 분비의 잠재적인 부작용들을 감소시키고, 반면 활성화 유도된 T-세포 죽음 (AICD)을 감소시키고, T-세포 생존을 촉진하고, T-세포 항종양 활성을 향상시키고 그리고 T-세포 면역성결여(anergy)를 역전시키는 그것의 능력을 유지하는 것을 목표로 한다.
방법은 AAV6에 의하여 벡터화된 DNA 손상 매트릭스의 존재 하 TALEN을 이용하여 양 자리들에서 이중-가닥 손상을 만들어내는 것으로 구성되는 PD1 및 CD25 자리들에서 IL15/sIL15rα을 통합하기 위하여 발달하였다. 이 매트릭스는 2A 작용하는 요소들 및 조절 요소들 (종결 코돈 및 폴리A 서열들)에 의하여 분리된 두 개의 상동성 암들이 박힌(embedding) IL15/sIL15rα 코딩 영역들으로 구성된다. T-세포 활성에서 그것의 관련 및 타겟이 된 자리에 의존하여, 타겟인 내생 유전자는 특이적 매트릭스 설계를 통하여 불활성화되거나 또는 그렇지 않을 수 있다. CD25 유전자가 타겟인 자리로 고려되었을 때, 삽입 매트릭스은 불활성화시키는 CD25 없이 넉인(knock-in) (KI) IL15/sIL15rα로 설계되는데, 이는 이 유전자의 단백질 산물이 T-세포 기능에 필수적으로 여겨지기 때문이다. 반면, PD1 T-세포 억제/T-세포들 소모에 관련되기 때문에, 삽입 매트릭스는 그것의 발현을 방지하는 반면 IL15/sIL15rα의 발현 및 분비를 가능하게 하도록 설계되었다.
이 접근을 묘사하고 일차 T-세포들에서 이중 타겟된 삽입의 실행가능성을 입증하기 위하여, 세 가지 다른 매트릭스들이 설계되었다 (도 2A, 2B 및 2C). 서열번호 :36 에 의하여 나타내어지는 CARm로 명칭된 첫 번째 것은 TRAC TALEN®의 TRAC 자리에서 항-CD22 CAR cDNA을 삽입하도록 설계되었다 (서열번호 :16 및 17). 두 번째 것, IL-15_CD25m (서열번호 :37)은 CD25 TALEN®을 이용하여 CD25 내생 코딩 서열 (서열번호 :18 및 19)의 종결 코돈 바로 전에 2A 시스-작용하는 요소들에 의하여 분리된 ΔLNGFR cDNA들로 명칭된 표면 마커, IL15 및 sIL15rα을 통합하도록 설계되었다. 세 번째 것, IL-15_PD1m (서열번호 :38)은 동일한 발현 카세트를 포함하였고, PD1 TALEN®을 이용하여 PD1 오픈 리딩 프레임의 중간에 통합하도록 설계되었다 (서열번호 :20 및 21). 세 개의 매트릭스들은 타겟이 된 내생 유전자를 가진 CAR 및 IL15/sIL15rα의 공-발현을 가능하게 하도록 추가적인 2A 시스-작용하는 요소 위치된 업스트림 발현 카세트들을 포함한다.
우리는 처음에 CAR를 코드하는 것과 함께 IL15/sIL15rα 매트릭스들을 코드하는 AAV6 중 하나로 그것들을 형질도입함으로써 T-세포들에 이중 타겟된 삽입의 효율을 평가하였고 (서열번호 :41; pCLS30519), 그 다음에 상응하는 TALEN®으로 형질주입하였다. TRAC TALEN® (서열번호 :22 및 23) 및 PD1 TALEN® (서열번호 :24 및 25) 또는 CD25 TALEN® (서열번호 :26 및 27)를 코드하는 mRNA의 존재 하 매트릭스들의 AAV6-도움된 벡터화는 조작된 T-세포들의 46%까지에서 항 CD22 CAR의 발현을 가능하게 하였다 (도 3).
CD25 및 PD1 자리에서 IL15m 통합의 한도를 결정하기 위하여, 조작된 T-세포들은 항CD3/CD28 코팅된 비드들로 또는 CD22 발현시키는 Raji 종양 세포들로 활성화되었다. 활성화 2 일 후, 세포들은 회수되었고 IL15/sIL15rα 분비 대리(surrogate)로서 LNGFR 발현을 이용하여 FACS에 의하여 분석되었다 (도 4 및 5). 우리의 결과들은 항CD3/CD28 코팅된 비드들이 항 CD22 CAR의 존재에 독립적으로, IL-15m_CD25 또는 IL-15m_PD1을 포함하는 T-세포들에 의하여 ΔLNGFR의 발현을 유도하였다는 것을 보여주었다 (도 4A-B). 그러나 종양 세포들은 CARm 및 IL-15m 둘 다에 의하여 처리된 T-세포에 의하여 ΔLNGFR의 발현만을 유도하였다. 이것은 ΔLNGFR의 발현이 CAR에 의한 종양 세포 이용을 통하여 특이적으로 유도될 수 있다는 것을 나타내었다 (도 5 및 6).
예상된 대로 내생 CD25 유전자은 여전히 활성화된 처리된 T-세포들에서 발현되었던 반면(도 7 및 8), PD1 발현은 강하게 손상되었다 (도 12).
ΔLNGFR의 발현이 배지에서 IL15 의 발현과 관련되었다는 것을 입증하기 위하여, ΔLNGFR 및 항-CD22 CAR을 발현시키는 T-세포들이 총 10일 동안 CD22 발현시키는 Raji 종양 세포들 (E:T 비율 = 1:1)의 존재 하 배양되었다. 상청액은 2, 4, 7 및 10 일에 회수되었고 IL15의 존재는 ELISA 분석에 의하여 정량화었다. 우리의 결과들은 IL15이 상응하는 TALEN®과 함께 CARm 및 IL15m 매트릭스들 둘 다에 의하여 함께 처리된 T-세포들에 의하여만 배지에서 분비되었다는 것을 보여주었다 (도 13). 이들 매트릭스들 중 하나로 처리된 T-세포는 T-세포들을 그대로 두는 것(rest)과 관련하여 임의의 상당한 수준의 IL15을 분비하는 것이 불가능하였다. 흥미롭게도 IL-15 분비 수준은 4 일에 최고 피크로 집중되어 일시적인 것으로 발견되었다 (도 14).
분비된 IL-15 (서열번호 :59)의 수준이 CAR T-세포 활성에 영향을 줄 수 있는지 여부를 평가하기 위하여 CAR T-세포는 4 일 동안 5:1의 E:T 비율에서 종양 세포들의 존재 하 공-배양되었다. 그것들의 항종양 활성은 펠렛을 함으로써 매일 요구되었고 신선한 종양 세포들을 포함하고 IL-2가 부족한 배양 배지에서 현탁되었다. CAR T-세포의 항종양 활성은 루시페라제를 발현시키는 남아있는 Raji 종양 세포들의 발광을 측정함으로써 매일 모니터링되었다. 우리의 결과들은 IL-15을 공-발현시키는 CAR T-세포들이 고려된 모든 점들에서 IL15가 부족한 것들보다 더 높은 항종양 활성을 가졌다는 것을 보여주었다 (도 15).
그러므로 우리의 결과들과 함께, 우리는 TRAC 및 CD25 또는 PD1 자리들에서 IL15 cDNA 및 CAR의 동시의 타겟이 된 삽입들을 가능하게 하는 방법을 개발하였다. 이 이중 타겟된 삽입은 배지에서 IL15의 분비 및 항CD22 CAR의 활발한 발현을 이끌었다. 분비된 IL15의 수준들은 CAR T-세포들의 활성을 향상시키는데 충분하였다.
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표 5: 실시예 2에 언급된 서열들
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표 6; T-세포 활성화에 반응성인 선호되는 인간 내생 유전자 자리들
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표 7: (T-세포 활성화에 독립적이거나 또는 의존적인) 면역 세포 활성화 동안 끊임없이 활성인 선호되는 내생 유전자들의 선택
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표 8: T-세포 활성화 되면 일시적으로 상향조절되는 유전자들의 선택
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표 9: T-세포 활성화 되면 24 시간 초과 넘게 상향조절되는 유전자들의 선택
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표 10: 면역 세포 활성화 되면 하향조절되는 유전자들의 선택
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표 11: T-세포 활성화 되면 침묵하는 인간 유전자들의 선택 (더 안 전한 항구 유전자 타겟이 된 통합 자리들).
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표 12: 본 발명에 따라 외인성 코딩 서열들의 유전자 통합에 유용한 (다중 종양으로부터 엮어진) 종양 소모된 침윤성 림프구들에서 상향조절되는 유전자 자리들의 목록.
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표 13: 본 발명에 따라 외인성 코딩 서열들의 유전자 통합에 유용한 혈중산소 감소된 종양 조건들에서 상향조절된 유전자 자리들의 목록.
<110> Cellectis <120> TARGETED GENE INSERTION FOR IMPROVED IMMUNE CELLS THERAPY <130> P81604915PCT00 <150> US62/410,187 <151> 2016-10-19 <150> PA201670840 <151> 2016-10-27 <160> 67 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PD1 left homology <400> 1 ccaagccctg accctggcag gcatatgttt caggaggtcc ttgtcttggg agcccagggt 60 cgggggcccc gtgtctgtcc acatccgagt caatggccca tctcgtctct gaagcatctt 120 tgctgtgagc tctagtcccc actgtcttgc tggaaaatgt ggaggcccca ctgcccactg 180 cccagggcag caatgcccat accacgtggt cccagctccg agcttgtcct gaaaaggggg 240 caaagactgg accctgagcc tgccaagggg ccacactcct cccagggctg gggtctccat 300 gggcagcccc ccacccaccc agaccagtta cactcccctg tgccagagca gtgcagacag 360 gaccaggcca ggatgcccaa gggtcagggg ctggggatgg gtagccccca aacagccctt 420 tctgggggaa ctggcctcaa cggggaaggg ggtgaaggct cttagtagga aatcagggag 480 acccaagtca gagccaggtg ctgtgcagaa gctgcagcct cacgtagaag gaagaggctc 540 tgcagtggag gccagtgccc atccccgggt ggcagaggcc ccagcagaga cttctcaatg 600 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aatttatctg atgttgactt gagtaaatat 1680 atcaccacta ttgctggagt catgacacta agtcaagtta aaggctttgt tcgaaagaat 1740 ggtgtcaatg aagccaaaat agatgagatc aagaatgaca atgtccaaga cacagcagaa 1800 cagaaagttc aactgcttcg taattggcat caacttcatg gaaagaaaga agcgtatgac 1860 acattgattg cagatctcaa aaaagccaat ctttgtactc ttgcagagaa aattcagact 1920 atcatcctca aggacattac tagtgactca gaaaattcaa acttcagaaa tgaaatccag 1980 agcttggtcg aa 1992 <210> 14 <211> 1000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lck left homology <400> 14 ctcataacaa ttctatgagg taggaacagt tatttactct attttccaaa taaggaaact 60 gggctcgccc aaggttccac aactaacatg tgtgtattat tgagcattta atttacacca 120 gggaagcagg ttgtggtggt gtgcacctgt tgtccagcta tttaggaggc tgaggtgaaa 180 ggatcacttg aacggaggag ttcaaatttg caatgtgcta tgattgtgcc tgtgaacagc 240 tgctgcactc cagcctgggc aacatagtga gatcccttat ctaaaacatt ttttttaagt 300 aaataatcag gtgggcacgg tggctcacgc ctgtaatcca gcactttggg aggctgaggc 360 gggcggatca cctgaggtca ggagttcaag accagcctga ccaacatgga gaaacccgtc 420 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Sequence <220> <223> TALEN TRAC <400> 16 Met Gly Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ile Asp Tyr Pro Tyr Asp 1 5 10 15 Val Pro Asp Tyr Ala Ile Asp Ile Ala Asp Leu Arg Thr Leu Gly Tyr 20 25 30 Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys Val Arg Ser Thr Val 35 40 45 Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly Phe Thr His Ala His 50 55 60 Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala Val 65 70 75 80 Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro Glu Ala Thr His Glu Ala 85 90 95 Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ala 100 105 110 Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu Asp 115 120 125 Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala Val 130 135 140 Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu Asn 145 150 155 160 Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys 165 170 175 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 180 185 190 His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn 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tccagggatg acattgtgta tgtgcctgag ccaatgacct actggagagt gctaggagcc 4200 tctgagacca ttgccaacat ctacaccacc cagcacaggc tggaccaggg agaaatctct 4260 gctggagatg ctgctgtggt gatgacctct gcccagatca caatgggaat gccctatgct 4320 gtgactgatg ctgttctggc tcctcacatt ggaggagagg ctggctcttc tcatgcccct 4380 ccacctgccc tgaccctgat ctttgacaga caccccattg cagccctgct gtgctaccca 4440 gcagcaaggt acctcatggg ctccatgacc ccacaggctg tgctggcttt tgtggccctg 4500 atccctccaa ccctccctgg caccaacatt gttctgggag cactgcctga agacagacac 4560 attgacaggc tggcaaagag gcagagacct ggagagagac tggacctggc catgctggct 4620 gcaatcagaa gggtgtatgg actgctggca aacactgtga gatacctcca gtgtggaggc 4680 tcttggagag aggactgggg acagctctct ggaacagcag tgccccctca aggagctgag 4740 ccccagtcca atgctggtcc aagaccccac attggggaca ccctgttcac cctgttcaga 4800 gcccctgagc tgctggctcc caatggagac ctgtacaatg tgtttgcctg ggctctggat 4860 gttctagcca agaggctgag gtccatgcat gtgttcatcc tggactatga ccagtcccct 4920 gctggatgca gagatgctct gctgcaacta acctctggca tggtgcagac ccatgtgacc 4980 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ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt 5880 gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt 5940 taacaaaata ttaacgctta caatttaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc 6000 cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc 6060 tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc 6120 gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg 6180 gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat 6240 ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc 6300 acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa 6360 ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa 6420 aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt 6480 gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct 6540 tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat 6600 gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg 6660 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gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420 tgcatctaga tgactcccca gacaggccct ggaacccccc caccttctcc ccagccctgc 480 tcgtggtgac cgaaggggac aacgccacct tcacctgcag cttctccaac acatcggaga 540 gcttcgtgct aaactggtac cgcatgagcc ccagcaacca gacggacaag ctggccgcct 600 tccccgagga ccgcagccag cccggccagg actgccgctt ccgtgtcaca caactgccca 660 acgggcgtga cttccacatg agcgtggtca gggcccggcg caatgacagc ggcacctacc 720 tctgtggggc cggttctggc gtgaaacaga ctttgaattt tgaccttctc aagttggcgg 780 gagacgtgga gtccaaccca gggcccatgt ggccccctgg gtcagcctcc cagccaccgc 840 cctcacctgc cgcggccaca ggtctgcatc cagcggctcg ccctgtgtcc ctgcagtgcc 900 ggctcagcat gtgtccagcg cgcagcctcc tccttgtggc taccctggtc ctcctggacc 960 acctcagttt ggccagaaac ctccccgtgg ccactccaga cccaggaatg ttcccatgcc 1020 ttcaccactc ccaaaacctg ctgagggccg tcagcaacat gctccagaag gccagacaaa 1080 ctctagaatt ttacccttgc acttctgaag agattgatca tgaagatatc acaaaagata 1140 aaaccagcac agtggaggcc tgtttaccat tggaattaac caagaatgag agttgcctaa 1200 attccagaga gacctctttc ataactaatg ggagttgcct ggcctccaga aagacctctt 1260 ttatgatggc cctgtgcctt agtagtattt atgaagactt gaagatgtac caggtggagt 1320 tcaagaccat gaatgcaaag cttctgatgg atcctaagag gcagatcttt ctagatcaaa 1380 acatgctggc agttattgat gagctgatgc aggccctgaa tttcaacagt gagactgtgc 1440 cacaaaaatc ctcccttgaa gaaccggatt tttataaaac taaaatcaag ctctgcatac 1500 ttcttcatgc tttcagaatt cgggcagtga ctattgatag agtgatgagc tatctgaatg 1560 cttccggaag cggagctact aacttcagcc tgctgaagca ggctggagac gtggaggaga 1620 accctggacc tatgtgtcac cagcagttgg tcatctcttg gttttccctg gtttttctgg 1680 catctcccct cgtggccata tgggaactga agaaagatgt ttatgtcgta gaattggatt 1740 ggtatccgga tgcccctgga gaaatggtgg tcctcacctg tgacacccct gaagaagatg 1800 gtatcacctg gaccttggac cagagcagtg aggtcttagg ctctggcaaa accctgacca 1860 tccaagtcaa agagtttgga gatgctggcc agtacacctg tcacaaagga ggcgaggttc 1920 taagccattc gctcctgctg cttcacaaaa aggaagatgg aatttggtcc actgatattt 1980 taaaggacca gaaagaaccc aaaaataaga cctttctaag atgcgaggcc aagaattatt 2040 ctggacgttt cacctgctgg tggctgacga caatcagtac tgatttgaca ttcagtgtca 2100 aaagcagcag aggctcttct gacccccaag gggtgacgtg cggagctgct acactctctg 2160 cagagagagt cagaggggac aacaaggagt atgagtactc agtggagtgc caggaggaca 2220 gtgcctgccc agctgctgag gagagtctgc ccattgaggt catggtggat gccgttcaca 2280 agctcaagta tgaaaactac accagcagct tcttcatcag ggacatcatc aaacctgacc 2340 cacccaagaa cttgcagctg aagccattaa agaattctcg gcaggtggag gtcagctggg 2400 agtaccctga cacctggagt actccacatt cctacttctc cctgacattc tgcgttcagg 2460 tccagggcaa gagcaagaga gaaaagaaag atagagtctt cacggacaag acctcagcca 2520 cggtcatctg ccgcaaaaat gccagcatta gcgtgcgggc ccaggaccgc tactatagct 2580 catcttggag cgaatgggca tctgtgccct gcagtgaggg cagaggcagc ctgctgacct 2640 gcggcgacgt cgaggagaac cccgggccca tgggggcagg tgccaccggc cgcgccatgg 2700 acgggccgcg cctgctgctg ttgctgcttc tgggggtgtc ccttggaggt gccaaggagg 2760 catgccccac aggcctgtac acacacagcg gtgagtgctg caaagcctgc aacctgggcg 2820 agggtgtggc ccagccttgt ggagccaacc agaccgtgtg tgagccctgc ctggacagcg 2880 tgacgttctc cgacgtggtg agcgcgaccg agccgtgcaa gccgtgcacc gagtgcgtgg 2940 ggctccagag catgtcggcg ccgtgcgtgg aggccgatga cgccgtgtgc cgctgcgcct 3000 acggctacta ccaggatgag acgactgggc gctgcgaggc gtgccgcgtg tgcgaggcgg 3060 gctcgggcct cgtgttctcc tgccaggaca agcagaacac cgtgtgcgag gagtgccccg 3120 acggcacgta ttccgacgag gccaaccacg tggacccgtg cctgccctgc accgtgtgcg 3180 aggacaccga gcgccagctc cgcgagtgca cacgctgggc cgacgccgag tgcgaggaga 3240 tccctggccg ttggattaca cggtccacac ccccagaggg ctcggacagc acagccccca 3300 gcacccagga gcctgaggca cctccagaac aagacctcat agccagcacg gtggcaggtg 3360 tggtgaccac agtgatgggc agctcccagc ccgtggtgac ccgaggcacc accgacaacc 3420 tcatccctgt ctattgctcc atcctggctg ctgtggttgt gggtcttgtg gcctacatag 3480 ccttcaagag gtgatctaga gggcccgttt aaacccgctg atcagcctcg actgtgcctt 3540 ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg 3600 ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt 3660 gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca 3720 atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatgactag tggcgaattc ggcgcagatc 3780 aaagagagcc tgcgggcaga gctcagggtg acaggtgcgg cctcggaggc cccggggcag 3840 gggtgagctg agccggtcct ggggtgggtg tcccctcctg cacaggatca ggagctccag 3900 ggtcgtaggg cagggacccc ccagctccag tccagggctc tgtcctgcac ctggggaatg 3960 gtgaccggca tctctgtcct ctagctctgg aagcacccca gcccctctag tctgccctca 4020 cccctgaccc tgaccctcca ccctgacccc gtcctaaccc ctgacctttg atcggatccc 4080 gggcccgtcg actgcagagg cctgcatgca agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt 4140 cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag 4200 tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg 4260 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Claims (71)

  1. 세포 면역요법을 위하여 조작된 일차(primary) 면역 세포들을 준비하는 방법으로, 상기 방법은 하기 단계들을 포함하는 방법:
    - 일차 면역 세포들의 군집을 제공하는 단계;
    - 상기 일차 면역 세포들의 부분 내로 도입하는 단계;
    i) 상기 면역 세포들 군집의 치료 가능성을 개선하는 적어도 하나의 분자를 코드하기 위하여 선택된 내생 자리에서 통합되는 외인성 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산;
    ii) 상기 선택된 내생 자리를 특이적이로 타겟으로 하는 적어도 하나의 서열-특이적 시약,
    이때 상기 외인성 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 상기 내생 자리 내로 타겟이 된 유전자 통합에 의하여 삽입되어, 상기 외인성 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열이 상기 자리에 존재하는 내생 프로모터의 전사 조절 하 외인성 코딩 서열을 형성하는,
    방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 서열 특이적 시약은 뉴클레아제인 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 타겟이 된 유전자 통합은 상기 면역 세포들 내로 상동 재조합 또는 NHEJ에 의하여 작동되는 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 내생 프로모터는 면역 세포 활성화 동안 활성으로 선택되는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 코딩 서열에 의하여 코드되는 상기 분자는 RNAi와 같은 RNA 전사체, 또는 기능성 단백질과 같은 폴리펩타이드인, 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료 가능성 활성을 개선하는 상기 분자 또는 일차(primary) 면역 세포들의 상기 군집은 약물에 대하여 면역 세포들의 내성을 부여하고, (인-비보 또는 인-비트로에서) 면역 세포들의 지속성 또는 그것의 안전성을 증가시키는, 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    일차(primary) 면역 세포들의 지속성을 향상시키는 상기 분자는 사이토카인 수용체, 약물에 대한 내성을 부여하는 단백질 또는 억제성 펩타이드들 또는 단백질들에 대항하여 향해진 분비된 항체로부터 선택되는 방법.
  8. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 코딩 서열은 IL-2, IL-12 또는 IL-15를 코드하는 방법.
  9. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    약물 내성을 부여하는 상기 외인성 코딩 서열은 디하이드로엽산(dihydrofolate) 환원효소(reductase) (DHFR), 이노신(inosine) 모노포스페이트(monophosphate) 디하이드로게나제(dehydrogenase) 2 (IMPDH2), 칼시뉴린 또는 메틸구아닌(methylguanine) 트랜스페라제(transferase) (MGMT), mTORmut 및 Lckmut을 코드하는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 서열은 IL-2, IL-12 및 IL-15과 같은 사이토카인 또는 케모카인을 코드하는 방법.
  11. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료적 활성을 향상시키는 상기 외인성 서열은 FOXP3의 억제제를 코드하는 방법.
  12. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    T-세포의 치료적 활성을 향상시키는 상기 외인성 서열은 CCR2/CCL2 중화 제제와 같은, 종양(Tumor) 관련(Associated) 대식세포들(Macrophages)(TAM)의 분비된 억제제를 코드하는 방법.
  13. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    일차(primary) 면역 세포의 안전성을 향상시키는 상기 외인성 서열은 키메라 항원 수용체 (CAR)의 요소를 코드하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 CAR는 주어진 세포 종류에 대항하여 면역 세포의 개선된 특이성에 기여하는 억제성 CAR인 방법.
  15. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    일차(primary) 면역 세포의 안전성을 향상시키는 상기 외인성 서열은 다른 화합물(들)을 활성화시킴으로써 또는 이와 조합하여, 직접적으로, 세포를 죽이는 능력을 가진 인자를 코드하는 방법.
  16. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    일차(primary) 면역 세포의 안전성을 향상시키는 상기 외인성 서열은 세포자멸사 CAR의 요소를 코드하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 세포자멸사 CAR는 FasL (CD95)을 포함하는 방법.
  18. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    일차(primary) 면역 세포의 안전성을 향상시키는 상기 외인성 서열은 사이클로포스파미드 및/또는 이소포스파미드와 같은, 약물에 대한 상기 면역 세포들의 과민증을 부여하는, 사이토크롬(들)P450, CYP2D6-1, CYP2D6-2, CYP2C9, CYP3A4, CYP2C19 또는 CYP1A2을 코드하는 방법.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유전자는 면역 세포 활성화 동안 끊임없이 활성인 내생 프로모터으이 전사 조절 하에 있는 방법.
  20. 제 19항에 있어서,
    상기 유전자는 CD3G, Rn28s1, Rn18s, Rn7sk, Actg1, β2m, Rpl18a, Pabpc1, Gapdh, Rpl17, Rpl19, Rplp0, Cfl1 및 Pfn1로부터 선택되는 방법.
  21. 제 19항에 있어서,
    상기 내생 프로모터의 전사 활성은 면역 세포 활성화에 독립적이고 안정적인 방법.
  22. 제 21항에 있어서,
    면역 세포 활성화에 독립적이고 안정적인 상기 내생 프로모터의 통제 하 상기 유전자는 CD3인 방법.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 유전자 내로 도입된 상기 서열은, 선택적으로 폴리펩타이드 CD3, CD28 또는 4-1BB과의 융합에서, TCR 결합 도메인을 코드하는 방법.
  24. 제 21항에 있어서,
    면역 세포 활성화에 독립적이고 안정적인 활성을 가진 상기 내생 프로모터의 통제 하 상기 유전자 내로 도입되는 상기 코딩 서열은 사이토카인, a 케모카인 수용체, 산물에 대한 내성을 부여하는 분자, 4-1BRL 및 OX40L와 같은, 공-자극 리간드, 또는 분비된 항체를 코드하는 방법.
  25. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 내생 프로모터의 전사 활성은 면역 세포 활성화에 독립적인 방법.
  26. 제 25항에 있어서,
    상기 내생 프로모터의 상기 전사 활성은 면역 세포 활성화되면 일시적인 방법.
  27. 제 25항에 있어서,
    상기 내생 프로모터의 상기 전사 활성은 상향조절되는 방법.
  28. 제 27항에 있어서,
    상기 전사 활성은 강하게 상향조절되는 방법.
  29. 제 28항에 있어서,
    그 전사 활성이 강하게 상향조절되는 상기 유전자 내로 도입되는 상기 외인성 서열은 더욱 특히 사이토카인(들), 면역원성 펩타이드(들) 또는 항-IDO1, 항-IL10, 항-PD1, 항-PDL1, 항-IL6 또는 항-PGE2 항체와 같은, 분비된 항체를 코드하는 방법.
  30. 제 27항에 있어서,
    상기 전사 활성은 약하게 상향조절되는 방법.
  31. 제 30항에 있어서,
    그 전사 활성이 일시적이거나 또는 약하게 상향조절되는 상기 유전자 내로 도입되는 상기 서열은 더욱 특히 상기 면역 세포들의 안전성의 특이성을 개선하기 위하여 억제성 CAR 또는 세포자멸사성 CAR의 구성성분을 코드하는 방법.
  32. 제 26항에 있어서,
    상기 프로모터는 면역 세포 활성화되면 12 시간 미만 넘게 상향조절되는 방법.
  33. 제 32항에 있어서,
    상기 유전자는 Spata6, Itga6, Rcbtb2, Cd1d1, St8sia4, Itgae 및 Fam214a로부터 선택되는 방법.
  34. 제 26항에 있어서,
    상기 프로모터는 면역 세포 활성화되면 24 시간 미만 넘게 상향조절되는 방법.
  35. 제 34항에 있어서,
    상기 유전자는 IL3, IL2, Ccl4, IL21, Gp49a, Nr4a3, Lilrb4, Cd200, Cdkn1a, Gzmc, Nr4a2, Cish, Ccr8, Lad1 및 Crabp2로부터 선택되는 방법.
  36. 제 26항에 있어서,
    상기 유전자는 면역 세포 활성화되면 24 시간 초과가 넘게 상향조절되는 방법.
  37. 제 36항에 있어서,
    상기 유전자는 Gzmb, Tbx21, Plek, Chek1, Slamf7, Zbtb32, Tigit, Lag3, Gzma, Wee1, IL12rb2, Eea1 및 Dtl으로부터 선택되는 방법.
  38. 제 1항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어성,
    키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 변형된 TCR은 형질주입된 면역 세포들에서 독립적으로 발현되는 방법.
  39. 제 42항에 있어서,
    상기 CAR는 CD22 항원에 대항하여 향해지는 방법.
  40. 제 38항 또는 제 39항에 있어서,
    상기 내생 프로모터 활성은 형질주입된 면역 세포들 내로 발현되는 상기 CAR에 의존적인 방법.
  41. 제 1항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 특이적 엔도뉴클레아제 시약은 Cas9 또는 Cpf1와 같은, RNA 또는 DNA-가이드된 엔도뉴클레아제, RNA 또는 DNA 가이드, TAL-엔도뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 호밍 엔도뉴클레아제 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 방법.
  42. 제 1항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 특이적 엔도뉴클레아제 시약은, 세포 내로 번역되는 mRNA 하, 또는 폴리펩타이드로서 전기천공에 의하여 도입되는 방법.
  43. 제 42항에 있어서,
    상기 코딩 서열을 코드하는 상기 외인성 핵산은 DNA 벡터에 포함되는 방법.
  44. 제 43항에 있어서,
    상기 DNA 벡터는 AAV 벡터와 같은 바이러스 벡터인 방법.
  45. 제 43항에 있어서,
    상기 외인성 핵산 및 상기 서열-특이적 엔도뉴클레아제 시약을 코드하는 핵산은 둘 다 상기 DNA 벡터 내로 포함되는 방법.
  46. 제 1항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 세포 내로 도입되는 유전자 서열이, 내생 유전자의 적어도 하나의 부분과 함께 상기 유전자 서열의 전사를 가능하게 하기 위하여 2A 펩타이드를 코드하는 서열이 뒤따르거나 또는 이에 앞서는 방법.
  47. 제 1항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전자 서열은 상기 유전자에 처음에 존재하는 적어도 하나의 내생 게놈 서열의 발현을 불활성화시키는 효과와 함께 도입되는 방법.
  48. 제 1항 내지 제 47항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 내생 프로모터는 TCR 유전자의 전사 활성을 통제하지 않는 방법.
  49. 제 47항에 있어서,
    불활성화되는 상기 내생 게놈 서열은 TGFb, TGFbR, IL-10, IL-10R, GCN2 또는 PRDM1과 같은 억제성(suppressive) 사이토카인들, 키나제들 또는 그것의 그것들의 수용체들을 코드하는 방법.
  50. 제 49항에 있어서,
    불활성화되는 상기 내생 게놈 서열은 PD1, PDL1, CTLA4, TIM3 또는 LAG3과 같은, 면역 체크포인트로서 작용하는 단백질을 코드하는 방법.
  51. 제 47항에 있어서,
    불활성화되는 상기 내생 게놈 서열은 DCK, HPRT 또는 GGH과 같은 프로드러그를 활성화시키는 효소를 발현시키는 방법.
  52. 제 47항에 있어서,
    불활성화되는 상기 내생 게놈 서열은 글루코코르티코이드 수용체들 및 CD52와 같은 면역 소모(depletion) 치료들에 대한 수용체를 발현시키는 방법.
  53. 제 47항에 있어서,
    불활성화되는 상기 내생 게놈 서열은 상기 면역 세포 또는 면역 세포들의 상기 군집으로부터의 또다른 면역 세포에 의하여 발현되는 CAR와의 친화도를 갖는 표면 항원을 발현시키는 방법.
  54. 제 1항 내지 제 53항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포는 조혈 줄기 세포 HSC인 방법.
  55. 제 1항 내지 제 53항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포는 T-세포 또는 NK 세포인 방법.
  56. 제 1항 내지 제 55항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 수득가능한 조작된 일차(primary) 면역 세포.
  57. 내생 유전자 프로모터의 전사 조절 하 외인성 코딩 서열을 포함하는, 조작된 일차(primary) 면역 세포.
  58. 제 56항 또는 제 57항에 있어서,
    상기 내생 유전자 프로모터는 상기 면역 세포의 활성화 동안 활성인, 조작된 일차(primary) 면역 세포.
  59. 제 56항 내지 제 58항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 내생 유전자 프로모터는 상기 면역 세포의 활성화에 반응성이고, 바람직하게는 상향조절되는, 조작된 일차(primary) 면역 세포.
  60. 제 56항 내지 제 60항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 내생 유전자는 표 6에 목록화된 것들 중에서 선택되는, 조작된 일차(primary) 면역 세포.
  61. 제 56항 내지 제 60항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 일차(primary) 면역 세포는 T-세포 또는 NK-세포인, 조작된 일차(primary) 면역 세포.
  62. 제 56항 내지 제 61항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 일차(primary) 세포는 키메라 항원 수용체를 지닌 것으로 여겨지는 조작된 일차(primary) 면역 세포.
  63. 제 62항에 있어서,
    상기 내생 유전자 프로모터의 상기 전사 조절은 상기 키메라 항원 수용체 (CAR)의 신호 활성화에 반응성인, 조작된 일차(primary) 면역 세포.
  64. 제 56항 내지 제 63항 중 어느 한 항에 따른 세포들 중 적어도 30 %, 바람직하게는 50 %, 더욱 바람직하게는 80 %을 포함하는, 일차(primary) 면역 세포들의 치료적으로 효과적인 군집.
  65. 제 64항에 있어서,
    세포들 중 적어도 30 %, 바람직하게는 50 %, 더욱 바람직하게는 80 %는 기증자, 바람직하게는 하나의 단일 기증자로부터 유래되는, 일차(primary) 면역 세포들의 군집.
  66. 제 64항에 있어서,
    상기 면역 세포들의 50% 초과가 TCR 음성 T-세포들인, 일차(primary) 면역 세포들의 군집.
  67. 제 64항 내지 제 66항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포들 중 50% 초과가 AR 양성 세포들인, 일차(primary) 면역 세포들의 군집.
  68. 제 56항 내지 제 67항 중 어느 한 항에 따른 면역 세포 군집 또는 조작된 일차(primary) 면역 세포를 포함하는 약학적 조성물.
  69. 그것을 필요로 하는 환자를 치료하기 위한 방법으로, 상기 방법은 하기를 포함하는 방법:
    - 제 56항 내지 제 67항 중 어느 한 항에 따른 조작된 일차(primary) 면역 세포들의 군집을 준비하는 단계;
    - 선택적으로, 상기 조작된 일차 면역 세포들을 정제 또는 분류하는 단계;
    - 상기 환자 내로 상기 세포들의 주입 후 또는 주입되면 조작된 일차(primary) 면역 세포들의 상기 군집을 활성화시키는 단계.
  70. 제 69항에 있어서,
    상기 환자는 암에 대하여 치료되는 방법.
  71. 제 69항에 있어서,
    상기 환자는 감염에 대하여 치료되는 방법.

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