KR102243062B1 - 예정된 사멸-1에 대한 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 예정된 사멸-1 (programmed death-1: PD-1) 단백질에 결합하는 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및 분리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 전술된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및 분리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 PD-1-결합제를 제공한다. 본 발명은 또한 관련 벡터, 조성물, 및 암 또는 감염성 질환을 치료하기 위해 PD-1-결합제를 이용하는 방법을 제공한다.

Description

예정된 사멸-1에 대한 항체{ANTIBODIES DIRECTED AGAINST PROGRAMMED DEATH-1 (PD-1)}
본 발명은 예정된 사멸-1 (programmed death-1: PD-1) 단백질에 결합하는 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및 분리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드에 관한 것이다.
발명의 배경
예정된 사멸 1 (Programmed Death 1: PD-1)(예정된 세포 사멸(Programmed cell Death 1)으로도 알려짐)은 세포자살을 겪는 마우스 T 세포주의 감산 혼성화 (subtractive hybridization)에 의해 처음으로 동정된 268 아미노산의 유형 I 막관통 단백질이다 (Ishida et al., Embo J., 11: 3887-95 (1992)). PD-1은 T-세포 조절자의 CD28/CTLA-4 패밀리의 일원이고, 활성화된 T-세포, B-세포 및 골수 계열 세포에서 발현된다 (Greenwald et al., Annu . Rev . Immunol ., 23: 515-548 (2005); 및 Sharpe et al., Nat . Immunol ., 8: 239-245 (2007)).
PD-1에 대해 2종의 리간드인, PD 리간드 1 (PD-L1) 및 PD 리간드 2 (PD-L2)가 동정되었고, 이들은 둘다 B7 단백질 수퍼패밀리에 속한다 (Greenwald et al., supra). PD-L1은 폐, 심장, 흉선, 비장, 및 신장의 세포를 포함한, 다양한 유형의 세포에서 발현된다 (예를 들어, Freeman et al., J. Exp . Med., 192(7): 1027-1034 (2000); 및 Yamazaki et al., J. Immunol ., 169(10): 5538-5545 (2002) 참조). PD-L1 발현은 리포폴리사카리드 (lipopolysaccharide: LPS) 및 GM-CSF 처리에 대한 반응으로 대식세포와 수지상 세포 (dendritic cell: DC)에서, 및 T-세포 및 B-세포 수용체를 통한 신호전달시 T-세포 및 B-세포에서 상향조절된다. PD-L1은 또한 다양한 쥐의 종양 세포주에서 발현된다 (예를 들어, Iwai et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 99(19): 12293-12297 (2002); 및 Blank et al., Cancer Res., 64(3): 1140-1145 (2004) 참조). 그에 반해서, PD-L2은 좀더 제한된 발현 패턴을 보이고 항원 제시 세포 (예를 들어, 수지상 세포 및 대식세포), 및 일부 종양 세포주에 의해 주로 발현된다 (예를 들어, Latchman et al., Nat . Immunol ., 2(3): 261-238 (2001) 참조). 종양에서 높은 PD-L1 발현은, 종양 미세환경 내의 종양 세포, 기질, 또는 기타 세포에서든, 아마 종양에서 효과기(effector) T 세포를 억제하고 조절성 T 세포 (regulatory T cell: Treg)를 상향조절함으로써, 좋지 못한 임상적 예후와 관련된다.
PD-1은 T-세포 활성화를 음성적으로 조절하고, 이 억제 기능은 세포질 도메인에서 면역수용체 티로신-기반 스위치 모티프 (immunoreceptor tyrosine-based switch motif: ITSM)과 연결된다 (예를 들어, Greenwald et al., supra; 및 Parry et al., Mol . Cell . Biol ., 25: 9543-9553 (2005) 참조). PD-1 결함은 자가면역으로 이어질 수 있다. 예를 들면, C57BL/6 PD-1 녹아웃 마우스는 루푸스-유사 증후군을 발병하는 것으로 나타났다 (예를 들어, Nishimura et al., 면역, 11: 141-1151 (1999) 참조). 인간에서, 상기 PD-1 유전자의 단일 뉴클레오티드 다형성은 전신 홍반성 루프스, 유형 1 당뇨, 류마티스 관절염, 및 다발성 경화증의 진행의 더 높은 발생율과 관련된다 (예를 들어, Nielsen et al., Tissue Antigens, 62(6): 492-497 (2003); Bertsias et al., Arthritis Rheum., 60(1): 207-218 (2009); Ni et al., Hum. Genet., 121(2): 223-232 (2007); Tahoori et al., Clin . Exp . Rheumatol ., 29(5): 763-767 (2011); 및 Kroner et al., Ann . Neurol ., 58(1): 50-57 (2005) 참조). 비정상적 PD-1 발현은 또한 여러 병리, 예를 들어 종양 면역 회피 및 만성 바이러스 감염에서 T-세포 기능장애에 연루되었다 (예를 들어, Barber et al., Nature, 439: 682-687 (2006); 및 Sharpe et al., supra 참조).
최근 연구들은 PD-1에 의해 유도된 T-세포 저해는 또한 항-종양 면역의 저해에 역할을 담당한다는 것을 입증한다. 예를 들면, PD-L1은 다양한 인간 및 마우스 종양에서 발현되고, 종양에서 PD-L1에 대한 PD-1의 결합은 T-세포 저해 및 종양 면역 회피 및 보호를 초래한다 (Dong et al., Nat . Med., 8: 793-800 (2002)). 종양 세포에 의한 PD-L1의 발현은 시험관 내에서(in vitro) 항-종양 T-세포에 의한 용해에 대한 그의 저항성과 직접 관련되었다 (Dong et al., supra; 및 Blank et al., Cancer Res ., 64: 1140-1145 (2004)). PD-1 녹아웃 마우스는 종양 시험(challenge)에 저항적이고 (Iwai et al., Int . Immunol., 17: 133-144 (2005)), 및 PD-1 녹아웃 마우스 유래 T-세포는 종양-함유 마우스에 양자로(adoptively) 전이된 경우 종양 거부(rejection)에 상당히 유효하다 (Blank et al., supra). 모노클론 항체를 이용한 PD-1 억제성 신호를 차단하는 것은 마우스에서 숙주 항-종양 면역을 강력하게 할 수 있고 (Iwai et al., supra; 및 Hirano et al., Cancer Res., 65: 1089-1096 (2005)), 및 종양에서 높은 수준의 PD-L1 발현은 많은 인간 암 유형에 대한 좋지 못한 예후와 관련된다 (Hamanishi et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 104: 3360-335 (2007), Brown et al., J. Immunol., 170: 1257-1266 (2003); 및 Flies et al., Yale Journal of Biology and Medicine, 84(4): 409-421 (2011)).
전술한 사항을 고려하면, 다양한 유형의 암을 치료기 위해 PD-1 활성을 억제하고 면역강화 (예를 들어, 감염성 질환을 치료함)를 위한 전략들이 개발되었다 (예를 들어, Ascierto et al., Clin . Cancer . Res ., 19(5): 1009-1020 (2013) 참조). 이 점에서, PD-1을 표적으로 하는 모노클론 항체가 암의 치료를 위해 개발되었다 (예를 들어, Weber, Semin . Oncol ., 37(5): 430-4309 (2010); 및 Tang et al., Current Oncology Reports, 15(2): 98-104 (2013) 참조). 예를 들면, 니보루맙(nivolumab)(BMS-936558로도 알려짐)은 I 상 임상 시험에서 비소세포 폐암, 흑색종, 및 신장암 (renal-cell carcinoma)에 완전 또는 일부 반응을 생성하였고 (예를 들어, Topalian, New England J. Med., 366: 2443-2454 (2012) 참조), 현재 III 상 임상 시험 중이다. MK-3575은 I 상 임상 시험에서 항종양 활성의 증거를 나타낸 PD-1에 대한 인간화된 모노클론 항체이다 (예를 들어, Patnaik et al., 2012 American Society of Clinical Oncology ( ASCO ) Annual Meeting, Abstract # 2512 참조). 또한, 최근 증거는 PD-1을 표적으로 하는 치료요법은 HIV와 같은 항원에 대한 면역 반응을 높일 수 있다는 것을 제안한다 (예를 들어, Porichis et al., Curr. HIV / AIDS Rep., 9(1): 81-90 (2012) 참조). 이 진보들에도 불구하고, 그러나 인간에서 이 잠재력있는 치료요법들의 효능은 제한될 수 있다.
그러므로, 높은 친화도로 PD-1에 결합하고 PD-1 활성을 유효하게 중화하는 PD-1-결합제 (예를 들어, 항체)에 대한 필요가 있다. 본 발명은 이러한 PD-1-결합제를 제공한다.
발명의 간단한 요약
본 발명은 서열번호 1의 상보성 결정 영역 (complementarity determining region: CDR) 1의 아미노산 서열, 서열번호 2의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 3의 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드로서, 선택적으로 (a) 서열번호 1의 9번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환되거나, (b) 서열번호 2의 7, 8, 및 9번 잔기 중 하나 이상이 상이한 아미노산 잔기와 치환되거나, (c) 서열번호 3의 1, 2, 및 5번 잔기 중 하나 이상이 상이한 아미노산 잔기와 치환되거나, 또는 (d) (a) 내지 (c)의 어느 한 조합인 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 서열번호 12의 상보성 결정 영역 (CDR) 1의 아미노산 서열, 서열번호 13의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 14의 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드로서, 선택적으로 (a) 서열번호 12의 9번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환되거나, (b) 서열번호 13의 8번 잔기 및/또는 9번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환되거나, (c) 서열번호 14의 5번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환되거나, 또는 (d) (a) 내지 (c)의 어느 한 조합인 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 서열번호 19의 상보성 결정 영역 (CDR) 1 아미노산 서열, 서열번호 20의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 21의 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 또한 서열번호 4 내지 11, 서열번호 15 내지 18, 및 서열번호 22 내지 25 중 어느 하나와 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 서열번호 26의 상보성 결정 영역 (CDR) 1 아미노산 서열 및 서열번호 27의 CDR2 아미노산 서열을 포함하는 분리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 서열번호 30의 상보성 결정 영역 (CDR) 1 아미노산 서열 및 서열번호 31의 CDR2 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 서열번호 30의 12번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환된 것인 분리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 서열번호 35의 상보성 결정 영역 (CDR) 1 아미노산 서열, 서열번호 36의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 37의 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 분리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드로서, 선택적으로 (a) 서열번호 36의 5번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환되고, 및/또는 (b) 서열번호 37의 4번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환된 것인 분리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 또는 서열번호 41과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 분리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 앞의 면역글로불린 폴리펩티드를 암호화하는 분리 또는 정제된 핵산 서열, 이러한 핵산 서열을 포함하는 벡터, 앞의 면역글로불린 폴리펩티드를 포함한 분리된 PD-1-결합제, 이러한 PD-1-결합제를 암호화하는 핵산 서열, 이러한 핵산 서열을 포함하는 벡터, 이러한 벡터를 포함하는 분리된 세포, 이러한 PD-1-결합제 또는 이러한 벡터를 약학적으로 허용한 가능한 담체와 포함하는 조성물, 및 유효량의 이러한 조성물을 포유동물에 투여함으로써 포유동물에서 암 또는 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
도 1은 실시예 1에 기재된 바와 같이 항-PD-1 모노클론 항체를 제조하는데 이용된 상이한 PD-1 항원 컨스트럭트를 개략적으로 묘사한 그림이다.
도 2는 낮은 수준의 항-PD-1 항체 APE2058의 존재에서 인간 CD4+ T-세포 MLR 분석에서 항-TIM-3 길항제 항체의 증가된 활성을 입증하는 실험 결과를 예를 들어 설명하는 그래프이다.
도 3은 낮은 수준의 항-PD-1 항체 APE2058의 존재에서 인간 CD4+ T-세포 MLR 분석에서 항-LAG-3 길항제 항체의 증가된 활성을 입증하는 실험 결과를 예를 들어 설명하는 그래프이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 분리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드, 또는 그의 단편 (예를 들어, 항원-결합 단편)을 제공한다. 상기 용어 "면역글로불린(immunoglobulin)" 또는 "항체(antibody)"는, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 척추동물의 혈액 또는 기타 체액에서 발견되는 단백질로서, 외래 물체, 예를 들어 세균 및 바이러스를 동정하고 중화하는 면역 시스템으로 이용된다. 상기 폴리펩티드는 그의 천연 환경으로부터 제거된 것으로 "분리(isolated)"된다. 바람직한 구체예에서, 면역글로불린 또는 항체는 하나 이상의 상보성 결정 영역 (complementarity determining region: CDR)을 포함하는 단백질이다. 상기 CDR은 항체의 "고도가변 영역(hypervariable region)"을 형성하고, 항원 결합에 책임이 있다 (하기에서 더 논의함). 전체(whole) 면역글로불린은 보통 4개의 폴리펩티드로 이루어진다: 2개의 동일한 카피의 중(heavy: H)쇄 폴리펩티드 및 2개의 동일한 카피의 경(light: L)쇄 폴리펩티드. 각각의 중쇄는 1개의 N-말단 가변 (VH) 영역 및 3개의 C-말단 불변 (CH1, CH2, 및 CH3) 영역을 함유하고, 각각의 경쇄는 1개의 N-말단 가변 (VL) 영역 및 1개의 C-말단 불변 (CL) 영역을 함유한다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여, 두 구별되는 유형인, 카파 (kappa: k) 또는 람다 (lambda: λ) 중 어느 하나로 할당될 수 있다. 보통의 면역글로불린에서, 각각의 경쇄는 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 두개의 중쇄는 이황화 결합에 의해 서로 연결된다. 경쇄 가변 영역은 중쇄의 가변영역과 정렬되고, 경쇄 불변 영역은 중쇄의 제1 불변 영역과 정렬된다. 중쇄의 남은 불변 영역은 서로 정렬된다.
중쇄 및 경쇄의 각 쌍의 가변 영역은 항체의 항원 결합 부위를 형성한다. VH 및 VL 영역은 4개의 프레임워크 (FW 또는 FR) 영역을 포함한 각 영역을 갖는, 같은 일반 구조를 갖는다. 상기 용어 "프레임워크 영역 (framework region)"은, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 고도가변 또는 상보성 결정 영역 (CDR) 사이에 위치된 가변 영역 내의 비교적 보존된 아미노산 서열을 말한다. 각 가변 도메인에 4개의 프레임워크 영역이 있고, 이것은 FR1, FR2, FR3, 및 FR4으로 명명된다. 상기 프레임워크 영역은 상기 가변 영역의 구조적 프레임워크를 제공하는 β 시트를 형성한다 (예를 들어, C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology , 5 th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001) 참조).
상기 프레임워크 영역들은 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에 의해 이어진다. 상기 논의된 바와 같이, CDR1, CDR2, 및 CDR3로 알려진 3개의 CDR은 항체의 "고도가변 영역(hypervariable region)"을 형성하고, 이것은 항원 결합에 책임이 있다. 상기 CDR은 상기 프레임워크 영역에 의해 형성된 베타-시트 구조를 연결하고, 일부 경우에서 그의 일부를 포함하는 루프(loop)를 형성한다. 상기 경쇄 및 중쇄의 불변 영역이 항체에 대한 항원의 결합에 직접 관련되지 않지만, 불변 영역은 가변 영역의 방향에 영향을 미칠 수 있다. 상기 불변 영역은 또한 다양한 효과기 기능, 예를 들어 효과기 분자와 세포의 상호작용을 통해 항체-의존적 보체-매개 용해 또는 항체-의존적 세포 독성에 참여를 보인다.
본 발명의 상기 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및 상기 분리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 바람직하게는 PD-1에 결합한다. 상기 논의된 바와 같이, 예정된 사멸 1(programmed death 1: PD-1) (예정된 세포 사멸 1로도 알려짐)은 268 아미노산의 유형 I 막관통 단백질이다 (Ishida et al., supra). PD-1은 T-세포 조절자의 CD28/CTLA-4 패밀리의 일원이고 활성화된 T-세포, B-세포, 및 골수 계열 세포에서 발현된다 (Greenwald et al., supra; 및 Sharpe et al., supra). PD-1은 세포외 IgV 도메인 그 다음의 짧은 세포외 줄기(stalk), 막관통 영역 및 세포내 꼬리를 포함한다. 상기 세포내 꼬리는 면역수용체 티로신-기반 억제성 모티프 및 면역수용체 티로신-기반 스위치 모티프에 위치된 2개의 인산화 부위를 함유하고, 이것은 T-세포 수용체 신호전달을 음성적으로 조절하는 PD-1의 능력에 역할을 담당한다 (예를 들어, Ishida et al., supra; 및 Blank et al., supra 참조). 상기 창의적인 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및 상기 창의적인 분리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 PD-1과 또다른 항원에 결합하는 작용제를 형성하여, "이중 반응성(dual reactive)" 결합제 (예를 들어, 이중 반응성 항체)를 초래할 수 있다. 예를 들면, 상기 작용제는 PD-1에 및 또다른 면역 시스템의 음성 조절자, 예를 들면, 림프구-활성화 유전자 3 (lymphocyte-activation gene 3: LAG-3) 및/또는 T-세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신(mucin) 도메인 3 단백질 (T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 3 protein: TIM-3)에 결합할 수 있다.
PD-1에 결합하는 항체, 및 그의 구성요소는 당해 기술분야에 알려져 있다 (예를 들어, U.S. Patent 8,168,757; Topalian et al., supra; 및 Patnaik et al., supra 참조). 항-PD-1 항체는 또한, 입수처, 예를 들면, Abcam (Cambridge, MA)으로부터 상업적으로 이용가능하다.
아미노산 "치환(replacement)" 또는 "대체(substitution)"는 폴리펩티드 서열 내 해당 위치 또는 잔기에서 다른 아미노산에 의한 같은 위치 또는 잔기에서 일 아미노산의 치환을 말한다.
아미노산은 크게 "방향족(aromatic)" 또는 "지방족(aliphatic)"으로 분류한다. 방향족 아미노산은 방향족 고리를 포함한다. "방향족" 아미노산의 예는 히스티딘 (H 또는 His), 페닐알라닌 (F 또는 Phe), 티로신 (Y 또는 Tyr), 및 트립토판 (W 또는 Trp)을 포함한다. 방향족이 아닌 아미노산은 크게 "지방족"으로 분류한다. "지방족" 아미노산의 예는 글리신 (G 또는 Gly), 알라닌 (A 또는 Ala), 발린 (V 또는 Val), 류신 (L 또는 Leu), 이소류신 (I 또는 Ile), 메티오닌 (M 또는 Met), 세린 (S 또는 Ser), 트레오닌 (T 또는 Thr), 시스테인 (C 또는 Cys), 프롤린 (P 또는 Pro), 글루탐산 (E 또는 Glu), 아스파르트산 (A 또는 Asp), 아스파라긴 (N 또는 Asn), 글루타민 (Q 또는 Gln), 리신 (K 또는 Lys), 및 아르기닌 (R 또는 Arg)을 포함한다.
지방족 아미노산은 4개의 하위-그룹으로 세분될 수 있다. "큰 지방족 비-극성 하위-그룹"은 발린, 류신, 및 이소류신으로 이루어진다. "지방족 약-극성 하위-그룹"은 메티오닌, 세린, 트레오닌, 및 시스테인으로 이루어진다. "지방족 극성/전하를 띤 하위-그룹"은 글루탐산, 아스파르트산, 아스파라긴, 글루타민, 리신, 및 아르기닌으로 이루어진다. "작은-잔기 하위-그룹"은 글리신과 알라닌으로 이루어진다. 전하를 띤/극성 아미노산의 그룹은 3개의 하위-그룹으로 세분될 수 있다: 리신 및 아르기닌으로 이루어진 "양으로-전하를 띤 하위-그룹", 글루탐산 및 아스파르트산으로 이루어진 "음으로-전하를 띤 하위-그룹", 및 아스파라긴 및 글루타민으로 이루어진 "극성 하위-그룹".
방향족 아미노산은 2개의 하위-그룹으로 세분될 수 있다: 히스티딘과및 트립토판으로 이루어진 "질소 고리 하위-그룹" 및 페닐알라닌과 티로신으로 이루어진 "페닐 하위-그룹".
상기 아미노산 치환 또는 대체는 보존적, 반-보존적, 또는 비-보존적일 수 있다. 상기 구 "보존적 아미노산 대체 (conservative amino acid substitution)" 또는 "보존적 돌연변이 (conservative mutation)"는 공통적 특성을 갖는 또다른 아미노산에 의한 일 아미노산의 치환을 말한다. 개별적인 아미노산 간의 공통된 특성을 규정하는 기능적 방식은 상동성 개체의 상응하는 단백질 간의 아미노산 변화의 정규화된 빈도를 분석하는 것이다 (Schulz and Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979)). 이러한 분석에 따르면, 아미노산의 그룹은 그룹 내의 아미노산들이 서로 우선적으로 교환되고, 따라서 전체 단백질 구조에서 그의 영향에서 대개 서로 닮는 것으로 규정될 수 있다 (Schulz and Schirmer, supra).
보존적 아미노산 대체의 예는 상기 기재된 하위-그룹 간의 아미노산의 대체, 예를 들면, 양전하가 유지될 수 있도록 아르기닌에 대해 리신 및 그 반대, 음전하가 유지될 수 있도록 아스파르트산에 대해 글루탐산 및 그 반대, 자유 -OH가 유지될 수 있도록 트레오닌에 대해 세린, 및 자유 -NH2가 유지될 수 있도록 아스파라긴에 대해 글루타민을 포함한다.
"반-보존적 돌연변이 (Semi-conservative mutation)"는 상기 열거된 같은 그룹 내이지만, 같은 하위-그룹 내는 아닌 아미노산들의 아미노산 대체를 포함한다. 예를 들면, 아스파라긴에 대한 아스파르트산, 또는 리신에 대한 아스파라긴의 대체는 같은 그룹 내이지만, 상이한 하위-그룹 내의 아미노산을 수반한다. "비-보존적 돌연변이 (Non-conservative mutation)"는 상이한 그룹 간의 아미노산 대체, 예를 들면, 트립토판에 대한 리신, 또는 세린에 대한 페닐알라닌, 등을 수반한다.
서열번호 1의 상보성 결정 영역 (CDR) 1의 아미노산 서열, 서열번호 2의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 3의 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 서열번호 1의 상보성 결정 영역 (CDR) 1의 아미노산 서열, 서열번호 2의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 3의 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어지거나, 또는 이것으로 필수적으로 이루어진 것으로서, 선택적으로 (a) 서열번호 1의 9번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환되거나, (b) 서열번호 2의 7, 8, 및 9번 잔기 중 하나 이상이 상이한 아미노산 잔기와 치환되거나, (c) 서열번호 3의 1, 2, 및 5번 잔기 중 하나 이상이 상이한 아미노산 잔기와 치환되거나, 또는 (d) (a) 내지 (c)의 어느 한 조합인 것이다. 상기 창의적인 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드가 서열번호 1의 CDR1의 아미노산 서열, 서열번호 2의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 3의 CDR3 아미노산 서열 및 선택적 아미노산 치환으로 필수적으로 이루어지는 경우, 상기 폴리펩티드에 물질적으로 영향을 미치지 않는, 추가적인 구성요소가 상기 폴리펩티드에 포함될 수 있다 (예를 들어, 정제 또는 분리를 촉진하는 비오틴과 같은 단백질 모이어티). 상기 창의적인 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드가 서열번호 1의 CDR1의 아미노산 서열, 서열번호 2의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 3의 CDR3 아미노산 서열 및 선택적 아미노산 치환으로 이루어지는 경우, 상기 폴리펩티드는 추가적인 구성요소 (즉, 상기 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드에 내인성이 아닌 구성요소)를 포함하지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 분리된 면역글로불린 폴리펩티드는 서열번호 1의 CDR1의 아미노산 서열, 서열번호 2의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 3의 CDR3 아미노산 서열을 포함하지만, 단 (a) 서열번호 1의 9번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환되거나, (b) 서열번호 2의 7, 8, 및 9번 잔기 중 하나 이상이 상이한 아미노산 잔기와 치환되거나, (c) 서열번호 3의 1, 2, 및 5번 잔기 중 하나 이상이 상이한 아미노산 잔기와 치환되거나, 또는 (d) (a) 내지 (c)의 어느 한 조합인 것이다. 예를 들면, 상기 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 서열번호 1의 CDR1 아미노산 서열, 서열번호 2의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 3의 CDR3 아미노산 서열을 포함할 수 있지만, 단 서열번호 1의 9번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환되고 서열번호 2의 7, 8, 및 9번 잔기 중 하나 이상이 상이한 아미노산 잔기와 치환된다. 대안적으로, 상기 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 서열번호 1의 CDR1 아미노산 서열, 서열번호 2의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 3의 CDR3 아미노산 서열을 포함할 수 있지만, 단 서열번호 1의 9번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환되고, 서열번호 2의 7, 8, 및 9번 잔기 중 하나 이상이 상이한 아미노산 잔기와 치환되고, 및 서열번호 3의 1, 2, 및 5번 잔기 중 하나 이상이 상이한 아미노산 잔기와 치환된다. 또다른 구체예에서, 상기 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 서열번호 1의 CDR1 아미노산 서열, 서열번호 2의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 3의 CDR3 아미노산 서열을 포함할 수 있지만, 단 서열번호 3의 1, 2, 및 5번 잔기 중 하나 이상이 상이한 아미노산 잔기와 치환된다. 각각의 서열번호 1의 9번 잔기, 서열번호 2의 7, 8, 및 9번 잔기, 및 서열번호 3의 1, 2, 및 5번 잔기는 각 위치에서 같거나 또는 상이한 것일 수 있는 적절한 아미노산 잔기와 치환될 수 있다. 예를 들면, 제1 위치의 상기 아미노산 잔기는 제1 상이한 아미노산 잔기와 치환될 수 있고, 및 제2 위치의 상기 아미노산 잔기는 제2 상이한 아미노산 잔기와 치환될 수 있고, 상기 제1 및 제2 상이한 아미노산 잔기는 같거나 또는 상이한 것이다.
일 구체예에서, 상기 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 서열번호 1의 CDR1 아미노산 서열, 서열번호 2의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 3의 CDR3 아미노산 서열을 포함하지만, 단 서열번호 1의 9번 잔기가 메티오닌 (M) 잔기와 치환된다. 또다른 구체예에서, 상기 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 서열번호 1의 CDR1 아미노산 서열, 서열번호 2의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 3의 CDR3 아미노산 서열을 포함하지만, 단 (a) 서열번호 2의 7번 잔기가 아스파라긴 (N) 잔기와 치환되거나, (b) 서열번호 2의 8번 잔기가 세린 (S) 잔기와 치환되거나, (c) 서열번호 2의 9번 잔기가 트레오닌 (T) 잔기와 치환되거나, 또는 (d) (a) 내지 (c)의 어느 한 조합인 것이다. 또다른 구체예에서, 상기 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 서열번호 1의 CDR1 아미노산 서열, 서열번호 2의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 3의 CDR3 아미노산 서열을 포함하지만, 단 (a) 서열번호 3의 1번 잔기가 글루탐산 (E) 잔기와 치환되거나, (b) 서열번호 3의 2번 잔기가 티로신 (Y) 잔기와 치환되거나, (c) 서열번호 3의 5번 잔기가 세린 (S) 잔기와 치환되거나, 또는 (d) (a) 내지 (c)의 어느 한 조합인 것이다.
상기 기재된 바와 같은 예시적인 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다: 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 또는 서열번호 11.
본 발명은 서열번호 12의 상보성 결정 영역 (CDR) 1의 아미노산 서열, 서열번호 13의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 14의 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이것으로 이루어진 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드로서, 선택적으로 (a) 서열번호 12의 9번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환되거나, (b) 서열번호 13의 8번 잔기 및/또는 9번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환되거나, (c) 서열번호 14의 5번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환되거나, 또는 (d) (a) 내지 (c)의 어느 한 조합인 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드를 제공한다. 상기 창의적인 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 서열번호 12의 CDR 1의 아미노산 서열, 서열번호 13의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 14의 CDR3 아미노산 서열 및 선택적 아미노산 치환으로 필수적으로 이루어지는 경우, 상기 폴리펩티드에 물질적으로 영향을 미치지 않는, 추가적인 구성요소가 상기 폴리펩티드에 포함될 수 있다 (예를 들어, 정제 또는 분리를 촉진하는 비오틴과 같은 단백질 모이어티). 상기 창의적인 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드가 서열번호 12의 CDR1의 아미노산 서열, 서열번호 13의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 14의 CDR3 아미노산 서열 및 선택적 아미노산 치환으로 이루어지는 경우, 상기 폴리펩티드는 추가적인 구성요소 (즉, 상기 창의적인 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드에 내인성(endogenous)이 아닌 구성요소)를 포함하지 않는다.
일 구체예에서, 상기 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 서열번호 12의 CDR 1의 아미노산 서열, 서열번호 13의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 14의 CDR3 아미노산 서열을 포함할 수 있지만, 단 (a) 서열번호 12의 9번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환되거나, (b) 서열번호 13의 8번 잔기 및/또는 9번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환되거나, (c) 서열번호 14의 5번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환되거나, 또는 (d) (a) 내지 (c)의 어느 한 조합인 것이다. 예를 들면, 상기 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 서열번호 12의 CDR 1의 아미노산 서열, 서열번호 13의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 14의 CDR3 아미노산 서열을 포함할 수 있지만, 단 서열번호 12의 9번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환되거나, 서열번호 13의 8번 잔기 및 9번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환된 것이다. 대안적으로, 상기 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 서열번호 12의 CDR 1의 아미노산 서열, 서열번호 13의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 14의 CDR3 아미노산 서열을 포함할 수 있지만, 단 서열번호 12의 9번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환되고 서열번호 14의 5번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환된 것이다. 또다른 구체예에서, 상기 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 서열번호 12의 CDR 1의 아미노산 서열, 서열번호 13의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 14의 CDR3 아미노산 서열을 포함할 수 있지만, 단 서열번호 12의 9번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환되고, 서열번호 13의 8번 잔기가 상이한 아미노산 잔기로 치환되고, 서열번호 13의 9번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환되고, 및 서열번호 14의 5번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환된 것이다. 각각의 서열번호 12의 9번 잔기, 서열번호 13의 8번 및 9번 잔기, 및 서열번호 14의 5번 잔기는 각 위치에서 같거나 또는 상이한 것일 수 있는 적절한 아미노산 잔기와 치환될 수 있다. 예를 들면, 제1 위치의 상기 아미노산 잔기는 제1 상이한 아미노산 잔기와 치환될 수 있고, 및 제2 위치의 상기 아미노산 잔기는 제2 상이한 아미노산 잔기와 치환될 수 있고, 상기 제1 및 제2 상이한 아미노산 잔기는 같거나 또는 상이한 것이다. 일 구체예에서, 상기 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 서열번호 12의 CDR 1의 아미노산 서열, 서열번호 13의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 14의 CDR3 아미노산 서열을 포함하지만, 단 서열번호 12의 9번 잔기가 류신 (L)과 치환된 것이다. 또다른 구체예에서, 상기 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 서열번호 12의 CDR 1의 아미노산 서열, 서열번호 13의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 14의 CDR3 아미노산 서열을 포함하지만, 단 (a) 서열번호 13의 8번 잔기가 티로신 (Y)과 치환되고, 및/또는 (b) 서열번호 13의 9번 잔기가 알라닌 (A) 잔기와 치환된 것이다. 또다른 구체예에서, 상기 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 서열번호 12의 CDR 1의 아미노산 서열, 서열번호 13의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 14의 CDR3 아미노산 서열을 포함하지만, 단 서열번호 14의 5번 잔기가 트레오닌 (T) 잔기와 치환된 것이다.
상기 기재된 바와 같은 예시적인 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다: 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 또는 서열번호 18.
본 발명은 서열번호 19의 상보성 결정 영역 (CDR) 1 아미노산 서열, 서열번호 20의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 21의 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이것으로 이루어진 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드를 제공한다. 상기 창의적인 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드가 서열번호 19의 CDR1의 아미노산 서열, 서열번호 20의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 21의 CDR3 아미노산 서열로 필수적으로 이루어지는 경우, 상기 폴리펩티드에 물질적으로 영향을 미치지 않는, 추가적인 구성요소가 상기 폴리펩티드에 포함될 수 있다 (예를 들어, 정제 또는 분리를 촉진하는 비오틴과 같은 단백질 모이어티). 상기 창의적인 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드가 서열번호 19의 CDR1의 아미노산 서열, 서열번호 20의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 21의 CDR3 아미노산 서열로 이루어지는 경우, 상기 폴리펩티드는 추가적인 구성요소 (즉, 상기 창의적인 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드에 내인성이 아닌 구성요소)를 포함하지 않는다. 상기 기재된 바와 같은 예시적인 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다: 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 또는 서열번호 25.
또한, 하나 이상의 아미노산이 전술된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드로 삽입될 수 있다. 얼마든지 적절한 아미노산이 상기 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드의 아미노산 서열로 삽입될 수 있다. 이 점에서, 하나 이상의 아미노산 (예를 들어, 2 이상, 5 이상, 또는 10 이상 아미노산)이지만, 20 아미노산 이하 (예를 들어, 18 이하, 15 이하, 또는 12 이하 아미노산)가 상기 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드의 아미노산 서열로 삽입될 수 있다. 바람직하게는, 1 내지 10 아미노산 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 아미노산)이 상기 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드의 아미노산 서열로 삽입된다. 이 점에서, 상기 아미노산(들)은 적절한 곳에서 전술된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 중 어느 하나로 삽입될 수 있다. 바람직하게는, 상기 아미노산(들)은 상기 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드의 CDR (예를 들어, CDR1, CDR2, 또는 CDR3)로 삽입된다.
본 발명은 서열번호 4 내지 11, 서열번호 15 내지 18, 및 서열번호 22 내지 25 중 어느 하나에 90% 이상 동일한(예를 들어, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일) 아미노산 서열을 포함하는 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드를 제공한다. 핵산 또는 아미노산 서열 "동일성(identity)"은, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 대상 핵산 또는 아미노산 서열을 참조 핵산 또는 아미노산 서열과 비교함으로써 결정될 수 있다. 퍼센트 동일성은 대상 서열과 참조 서열간의 같음 (즉, 동일한 것)인 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 수를 가장 긴 서열의 길이 (즉, 대상 서열 또는 참조 서열 중, 어느 것이든 더 긴 것의 길이)로 나눈 것이다. 둘 이상의 서열 간의 최적의 정렬을 수득하고 및 동일성을 산출하기 위한 다수의 수학적 알고리즘이 알려져 있고 여러 이용가능한 소프트웨어 프로그램으로 도입된다. 이러한 프로그램의 예는 CLUSTAL-W, T-Coffee, 및 ALIGN (핵산 및 아미노산 서열의 정렬용), BLAST 프로그램 (예를 들어, BLAST 2.1, BL2SEQ, 및 그의 후속 버전) 및 FASTA 프로그램 (예를 들어, FASTA3x, FASTM, 및 SSEARCH) (서열 정렬 및 서열 유사성 검색용)을 포함한다. 서열 정렬 알고리즘은 또한 예를 들면, Altschul et al., J. Molecular Biol., 215(3): 403-410 (1990), Beigert et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 106(10): 3770-3775 (2009), Durbin et al., eds., Biological Sequence Analysis : Probalistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press, Cambridge, UK (2009), Soding, Bioinformatics, 21(7): 951-960 (2005), Altschul et al., Nucleic Acids Res ., 25(17): 3389-3402 (1997), 및 Gusfield, Algorithms on Strings , Trees and Sequences, Cambridge University Press, Cambridge UK (1997))에 개시된다.
본 발명은 서열번호 26의 상보성 결정 영역 (CDR) 1 아미노산 서열 및 서열번호 27의 CDR2 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 분리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 26의 CDR 1 아미노산 서열 및 서열번호 27의 CDR2 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이것으로 이루어진다. 상기 창의적인 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드가 서열번호 26의 CDR1의 아미노산 서열 및 서열번호 27의 CDR2 아미노산 서열로 필수적으로 이루어지는 경우, 상기 폴리펩티드에 물질적으로 영향을 미치지 않는, 추가적인 구성요소가 상기 폴리펩티드에 포함될 수 있다 (예를 들어, 정제 또는 분리를 촉진하는 비오틴과 같은 단백질 모이어티). 상기 창의적인 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드가 서열번호 26의 CDR1의 아미노산 서열 및 서열번호 27의 CDR2 아미노산 서열로 이루어지는 경우, 상기 폴리펩티드는 추가적인 구성요소 (즉, 상기 창의적인면역글로불린 경쇄 폴리펩티드에 내인성이 아닌 구성요소)를 포함하지 않는다. 상기 기재된 바와 같은 예시적인 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 28 또는 서열번호 29를 포함할 수 있다.
본 발명은 서열번호 30의 상보성 결정 영역 (CDR) 1 아미노산 서열 및 서열번호 31의 CDR2 아미노산 서열을 포함하는 분리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 분리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 30의 CDR 1 아미노산 서열 및 서열번호 31의 CDR2 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어지거나, 또는 이것으로 필수적으로 이루어지는 것으로서, 선택적으로 서열번호 30의 12번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환되는 것이다. 상기 창의적인 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드가 서열번호 30의 CDR1의 아미노산 서열 및 서열번호 31의 CDR2 아미노산 서열 및 선택적 아미노산 치환으로 필수적으로 이루어지는 경우, 상기 폴리펩티드에 물질적으로 영향을 미치지 않는, 추가적인 구성요소가 상기 폴리펩티드에 포함될 수 있다 (예를 들어, 정제 또는 분리를 촉진하는 비오틴과 같은 단백질 모이어티). 상기 창의적인 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드가 서열번호 30의 CDR1의 아미노산 서열 및 서열번호 31의 CDR2 아미노산 서열 및 선택적 아미노산 치환으로 이루어지는 경우, 상기 폴리펩티드는 추가적인 구성요소 (즉, 상기 창의적인 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드에 내인성이 아닌 구성요소)를 포함하지 않는다.
이 점에서, 예를 들면, 상기 분리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 30의 CDR1의 아미노산 서열 및 서열번호 31의 CDR2 아미노산 서열을 포함할 수 있지만, 단 서열번호 30의 12번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환된 것이다. 서열번호 30의 12번 잔기는 적절한 아미노산 잔기와 치환될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 분리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 30의 CDR1의 아미노산 서열 및 서열번호 31의 CDR2 아미노산 서열을 포함할 수 있지만, 단 서열번호 30의 12번 잔기가 트레오닌 (T) 잔기와 치환된 것이다. 상기 기재된 바와 같은 예시적인 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다: 서열번호 32, 서열번호 33, 또는 서열번호 34.
본 발명은 서열번호 35의 상보성 결정 영역 (CDR) 1 아미노산 서열, 서열번호 36의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 37의 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 분리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 35의 CDR 1 아미노산 서열, 서열번호 36의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 37의 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이것으로 이루어진 것으로서, 선택적으로 (a) 서열번호 36의 5번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환되고, 및/또는 (b) 서열번호 37의 4번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환된 것이다. 상기 창의적인 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드가 서열번호 35의 CDR1의 아미노산 서열, 서열번호 36의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 37의 CDR3 아미노산 서열 및 선택적 아미노산 치환으로 필수적으로 이루어지는 경우, 상기 폴리펩티드에 물질적으로 영향을 미치지 않는, 추가적인 구성요소가 상기 폴리펩티드에 포함될 수 있다 (예를 들어, 정제 또는 분리를 촉진하는 비오틴과 같은 단백질 모이어티). 상기 창의적인 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드가 서열번호 35의 CDR1의 아미노산 서열, 서열번호 36의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 37의 CDR3 아미노산 서열 및 선택적 아미노산 치환으로 이루어지는 경우, 상기 폴리펩티드는 추가적인 구성요소 (즉, 상기 창의적인 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드에 내인성이 아닌 구성요소)를 포함하지 않는다. 이 점에서, 예를 들면, 상기 분리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 35의 CDR1의 아미노산 서열, 서열번호 36의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 37의 CDR3 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 분리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 35의 CDR1의 아미노산 서열, 서열번호 36의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 37의 CDR3 아미노산 서열을 포함할 수 있지만, 단 (a) 서열번호 36의 5번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환되고, 및/또는 (b) 서열번호 37의 4번 잔기가 상이한 아미노산 잔기와 치환된 것이다. 각각의 서열번호 36의 5번 잔기 및 서열번호 37의 4번 잔기는 각 위치에서 같거나 또는 상이할 수 있는 적절한 아미노산 잔기와 치환될 수 있다. 예를 들면, 제1 위치의 상기 아미노산 잔기는 제1 상이한 아미노산 잔기와 치환될 수 있고, 및 제2 위치의 상기 아미노산 잔기는 제2 상이한 아미노산 잔기와 치환될 수 있고, 상기 제1 및 제2 상이한 아미노산 잔기는 같거나 또는 상이한 것이다.
일 구체예에서, 상기 분리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 35의 CDR1의 아미노산 서열, 서열번호 36의 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 37의 CDR3 아미노산 서열을 포함하지만, 단 (a) 서열번호 36의 5번 잔기가 류신 (L) 잔기와 치환되고, 및/또는 (b) 서열번호 37의 4번 잔기가 아스파라긴 (N) 잔기와 치환된 것이다. 상기 기재된 바와 같은 예시적인 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다: 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 또는 서열번호 41.
또한, 하나 이상의 아미노산이 전술된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드로 삽입될 수 있다. 얼마든지 적절한 아미노산이 상기 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드의 아미노산 서열로 삽입될 수 있다. 이 점에서, 하나 이상의 아미노산 (예를 들어, 2 이상, 5 이상, 또는 10 이상 아미노산)이지만, 20 아미노산 이하 (예를 들어, 18 이하, 15 이하, 또는 12 이하 아미노산)가 상기 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드의 아미노산 서열로 삽입될 수 있다. 바람직하게는, 1 내지 10 아미노산 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 아미노산)이 상기 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드의 아미노산 서열로 삽입될 수 있다. 이 점에서, 상기 아미노산(들)은 적절한 곳에서 전술된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드의 어느 하나로 삽입될 수 있다. 바람직하게는, 상기 아미노산(들)은 상기 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드의 CDR (예를 들어, CDR1, CDR2, 또는 CDR3)로 삽입된다.
본 발명은 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 및 서열번호 41 중 어느 하나에 90% 이상 동일한(예를 들어, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일) 아미노산 서열을 포함하는 분리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 제공한다. 핵산 또는 아미노산 서열 "동일성(identity)"은, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 결정될 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 상기 창의적인 분리된 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이것으로 이루어진 분리된 예정된 사멸-1 (programmed death-1: PD-1)-결합제를 제공한다. "예정된 사멸 1-결합제 (programmed death 1 (PD-1)-binding agent)"는 상기 예정된 사멸 1 단백질 (PD-1)에 특이적으로 결합하는 분자, 바람직하게는 단백질성 분자로 의미된다. 바람직하게는, 상기 PD-1-결합제는 항체 또는 그의 단편 (예를 들어, 면역성 단편)이다. 본 발명의 상기 분리된 PD-1-결합제는 상기 창의적인 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 상기 창의적인 분리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 포함하거나, 이것으로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이것으로 이루어진다. 일 구체예에서, 상기 분리된 PD-1-결합제는 상기 창의적인 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 또는 상기 창의적인 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 포함하거나, 이것으로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이것으로 이루어진다. 또다른 구체예에서, 상기 분리된 PD-1-결합제는 상기 창의적인 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및 상기 창의적인 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 포함하거나, 이것으로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이것으로 이루어진다.
본 발명은 본 명세서에 개시된 구체적인 아미노산 잔기의 치환, 삽입, 및/또는 결실을 갖는 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 경쇄 폴리펩티드를 포함하거나, 이것으로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이것으로 이루어진 분리된 PD-1-결합제에 한정되지 않는다. 사실, 상기 창의적인 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 상기 창의적인 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드의 임의의 아미노산 잔기는, 상기 PD-1-결합제의 생물학적 활성이 상기 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실의 결과로서 높아지거나 또는 향상되는 한, 임의의 조합으로, 상이한 아미노산 잔기와 치환될 수 있거나, 또는 결실 또는 삽입될 수 있다. PD-1-결합제의 상기 "생물학적 활성 (biological activity)"은 예를 들면, PD-1 또는 특정 PD-1 에피토프에 대한 결합 친화도, 리간드 PD-L1 및 PD-L1에 대한 PD-1 단백질 결합의 중화 또는 억제, 생체 내에서 (in vivo) PD-1 단백질 활성의 중화 또는 억제(예를 들어, IC50), 약물동력학, 및 교차-반응성 (예를 들어, 상기 PD-1 단백질의 인간이 아닌 상동체 (homolog) 또는 이종상동체 (ortholog)와, 또는 기타 단백질 또는 조직과)을 말한다. 당해 기술분야에서 인정된 항원-결합제의 다른 생물학적 특성 또는 특징은 예를 들면, 결합활성 (avidity), 선택도 (selectivity), 용해도, 접힘 (folding), 면역독성 (immunotoxicity), 발현 및 제제 (formulation)를 포함한다. 전술된 특성 및 특징은 ELISA, 경쟁적 ELISA, 표면 플라스몬 공명 분석법 (BIACORE™), 또는 KINEXA™, 시험관 내 (in vitro) 또는 생체 내에서 (in vivo) 중화 분석, 수용체-리간드 결합 분석, 시토킨 (cytokine) 또는 성장 인자 생성 및/또는 분비 분석, 및 신호 전달 및 면역조직화학 분석을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 표준 기법을 이용하여 관찰되고, 측정되고, 및/또는 평가될 수 있다.
상기 용어 "억제 (inhibit)" 또는 "중화 (neutralize)"는 PD-1-결합제의 상기 활성에 관해 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들면, PD-1 단백질의 생물학적 활성, 또는 PD-1 단백질과 관련된 질환 또는 증상의 진행 또는 중증도를 실질적으로 길항하거나, 금지하거나, 예방하거나, 저지하거나, 느리게 하거나, 방해하거나, 변경하거나, 제거하거나, 멈추거나, 또는 역전시키는 능력을 말한다. 본 발명의 상기 분리된 PD-1-결합제는 바람직하게는 PD-1 단백질의 상기 활성을 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 또는 앞의 값들 중 2개에 의해 규정된 범위로 억제하거나 또는 중화한다.
본 발명의 상기 분리된 PD-1-결합제는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 전체 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 상기 용어 "항체의 단편 (fragment of an antibody)", "항체 단편 (antibody fragment)", 및 "항체의 기능적 단편 (functional fragment of an antibody)"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 의미하는 것으로 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다 (일반적으로, Holliger et al., Nat . Biotech ., 23(9): 1126-1129 (2005) 참조). 상기 분리된 PD-1 결합제는 임의의 PD-1-결합 항체 단편을 함유할 수 있다. 상기 항체 단편은 바람직하게는 예를 들면, 하나 이상의 CDR, 가변 영역 (또는 그의 일부분), 불변 영역 (또는 그의 일부분), 또는 그의 조합을 포함한다. 항체 단편의 예는 (i) VL, VH, CL, 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 (monovalent) 단편인 Fab 단편, (ii) 힌지 영역에 이황화 다리에 의해 연결된 두개의 Fab 단편을 포함하는 2가 (bivalent) 단편인 F(ab')2 단편, (iii) 항체의 단일 팔 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (iv) 순한 환원 조건을 이용한 F(ab')2 단편의 이황화 다리를 끊은 것으로 야기된 Fab'단편, (v) 이황화-안정화된 Fv 단편 (dsFv), 및 (vi) 항원에 특이적으로 결합하는 항체 단일 가변 영역 도메인 (VH 또는 VL) 폴리펩티드인 도메인 항체 (dAb)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
상기 분리된 PD-1-결합제가 상기 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드의 단편을 포함하는 구체예에서, 상기 단편은 상기 단편이 PD-1 단백질에 결합하고, 바람직하게는 그의 활성을 억제하는 한 임의의 크기의 것일 수 있다. 이 점에서, 상기 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드의 단편은 바람직하게는 약 5 내지 18 (예를 들어, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 앞의 값들 중 2개에 의해 규정된 범위의) 아미노산을 포함한다. 유사하게, 상기 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드의 단편은 바람직하게는 약 5 내지 18 (예를 들어, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 앞의 값들 중 2개에 의해 규정된 범위의) 아미노산을 포함한다.
상기 PD-1-결합제가 항체 또는 항체 단편인 경우, 상기 항체 또는 항체 단편은 바람직하게는 임의의 적절한 종류의 중쇄 불변 영역 (Fc)을 포함한다. 바람직하게는, 상기 항체 또는 항체 단편은 야생형 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 항체, 또는 그의 변이체에 기반한 중쇄 불변 영역을 포함한다.
상기 PD-1-결합제는 또한 단쇄 항체 단편일 수 있다. 단쇄 항체 단편의 예는 (i) 두 도메인을 단일 폴리펩티드 사슬로 합성될 수 있는 합성 링커에 의해 결합된 (joined) Fv 단편의 두 도메인 (즉, VL 및 VH)으로 이루어진 1가 분자인 단쇄 Fv (scFv)(예를 들어, Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 85: 5879-5883 (1988); 및 Osbourn et al., Nat . Biotechnol., 16: 778 (1998) 참조) 및 (ii) 폴리펩티드 사슬의 이량체로서, 각 폴리펩티드 사슬이 너무 짧아서 같은 폴리펩티드 사슬에서 VH와 VL 간의 쌍을 이룰 수 없고, 그에 의해 상이한 VH -VL 폴리펩티드 사슬에 상동성 도메인들 간의 쌍을 도출하여 두 기능적 항원 결합 부위를 갖는 이량체 분자를 생산하는, 펩티드 링커에 의해 VL에 이어진 VH 를 포함한 것인 디아바디 (diabody)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 항체 단편들이 당해 기술분야에 알려지고 예를 들어, 미국 특허 공개 2009/0093024 A1에 좀더 상세히 기재된다.
상기 분리된 PD-1-결합제는 또한 인트라바디 (intrabody) 또는 그의 단편일 수 있다. 인트라바디는 발현되고 세포내적으로 기능을 하는 항체이다. 인트라바디는 보통 이황화 결합이 결여되고 표적 유전자의 발현 또는 활성을 그의 특이적 결합 활성을 통해 조정할 수 있다. 인트라바디는 단일 도메인 단편 예를 들어 분리된 VH 및 VL 도메인 및 scFv를 포함한다. 인트라바디는 인트라바디의 N 또는 C 말단에 부착된 세포-이하 수송 신호를 포함하여 표적 단백질이 위치된 세포-이하의 구획에서 높은 농도의 발현을 가능하게 할 수 있다. 표적 유전제와 상호작용하면, 인트라바디는 표적 단백질 기능을 조정하고 및/또는 표적 단백질 분해를 가속화하고 생리적이 아닌 세포-이하 구획에서 표적 단백질을 격리시키는 것과 같은 메카니즘에 의해 표현형적/기능적 녹아웃을 달성한다. 인트라바디-매개된 유전자 불활성화의 다른 메카니즘은 표적 단백질에서 촉매 부위에, 또는 단백질-단백질, 단백질-DNA, 또는 단백질-RNA 상호작용에 수반된 에피토프에의 결합과 같이, 상기 인트라바디가 지시된(directed) 에피토프에 의존할 수 있다.
상기 분리된 PD-1-결합제는 또한 항체 접합체일 수 있다. 이 점에서, 상기 분리된 PD-1-결합제는 (1) 항체, 대안적인 스캐폴드, 또는 그의 단편, 및 (2) 상기 PD-1-결합제를 포함하는 단백질 또는 비-단백질 (non-protein) 모이어티의 접합체일 수 있다. 예를 들면, 상기 PD-1-결합제는 펩티드, 형광 분자, 또는 화학치료요법제에 접합된 항체의 전부 또는 일부일 수 있다.
상기 분리된 PD-1-결합제는 인간 항체, 인간이 아닌 항체, 또는 키메라 항체이거나, 또는 이로부터 수득될 수 있다. "키메라 (chimeric)"는 인간 및 비-인간 (non-human) 영역 둘다를 포함한 항체 또는 그의 단편으로 의미된다. 바람직하게는, 상기 분리된 PD-1-결합제는 인간화된 항체이다. "인간화된 (humanized)"는 인간 항체 스캐폴em, 및 비-인간 항체로부터 수득되거나 또는 유래된 하나 이상의 CDR을 포함하는 모노클론 항체이다. 비-인간 항체는 예를 들면, 설치류 (예를 들어, 마우스 또는 래트)와 같은, 비-인간 동물로부터 분리된 항체를 포함한다. 인간화된 항체는 비-인간 항체로부터 수득되거나 또는 유래된 1개, 2개, 또는 3개의 CDR을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 창의적인 PD-1-결합제의 CDRH3는 마우스 모노클론 항체로부터 수득되거나 또는 유래되고, 반면에 상기 창의적인 PD-1-결합제의 나머지 가변 영역 및 불변 영역은 인간 모노클론 항체로부터 수득되거나 또는 유래된다.
인간 항체, 비-인간 항체, 키메라 항체, 또는 인간화된 항체는 시험관 내 (in vitro) 기원 (예를 들어, 항체를 재조합으로 생성하는 하이브리도마 또는 세포주) 및 생체 내 (in vivo) 기원 (예를 들어, 설치류)을 포함한, 임의의 수단에 의해 수득될 수 있다. 항체를 생산하는 방법은 당해 기술분야에 알려져 있고 예를 들면, Kohler and Milstein, Eur . J. Immunol., 5: 511-519 (1976); Harlow and Lane (eds.), Antibodies : A Laboratory Manual, CSH Press (1988); 및 Janeway et al. (eds.), Immunobiology , 5 th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001))에 기재된다. 특정 구체예에서, 인간 항체 또는 키메라 항체는 형질전환 동물 (예를 들어, 마우스)를 이용하여 생산될 수 있는 것으로 하나 이상의 내인성 면역글로불린 유전자가 하나 이상의 인간 면역글로불린 유전자와 치환된 것이다. 내인성 항체 유전자가 인간 항체 유전자와 유효하게 치환된 것인 형질전환 마우스의 예는 메다렉스 (Medarex) HUMAB-MOUSE™, 키린 (Kirin) TC MOUSE™, 및 쿄와 키린 (Kyowa Kirin) KM-MOUSE™을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다 (예를 들어, Lonberg, Nat. Biotechnol., 23(9): 1117-25 (2005), 및 Lonberg, Handb . Exp . Pharmacol ., 181: 69-97 (2008) 참조). 인간화된 항체는 당해 기술분야에 알려진 적절한 방법을 이용하여 생산될 수 있고 (예를 들어, An, Z. (ed.), Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey (2009) 참조), 예를 들어, 인간 항체 스캐폴드로 비-인간 CDR의 이식 (grafting)을 포함한 방법(예를 들어, Kashmiri et al., Methods, 36(1): 25-34 (2005); 및 Hou et al., J. Biochem., 144(1): 115-120 (2008) 참조)을 포함한다. 일 구체예에서, 인간화된 항체는 예를 들어, 미국 특허 공개 2011/0287485 A1에 기재된 방법을 이용하여 생성될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 상기 PD-1-결합제는 PD-L1에 대한 PD-1의 결합을 차단하는 PD-1 단백질의 에피토프에 결합한다. 본 발명은 또한 간접적 또는 입체적 다른 자리 (allosteric) 방식으로 PD-L1에 대한 PD-1의 결합을 차단하는 PD-1 단백질의 분리 또는 정제된 에피토프를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 창의적인 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드, 상기 창의적인 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드, 및 상기 창의적인 PD-1-결합제를 암호화하는 하나 이상의 분리 또는 정제된 핵산 서열을 제공한다.
상기 용어 "핵산 서열 (nucleic acid sequence)"은 DNA 또는 RNA의 중합체 즉, 폴리뉴클레오티드를 포괄하는 것으로 의도되고, 이것은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고 비-천연 또는 변질된(altered) 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 상기 용어 "핵산 (nucleic acid)" 및 "폴리뉴클레오티드 (polynucleotide)"는 본 명세서에 사용된 바와 같이 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체의 형태이고, 리보뉴클레오티드 (RNA) 또는 데옥시뉴클레오티드 (DNA) 중 어느 하나를 말한다. 이 용어들은 상기 분자의 1차 구조를 말하고, 따라서 이중- 및 단일-가닥 DNA, 및 이중- 및 단일-가닥 RNA를 포함한다. 상기 용어는, 균등물로서, 뉴클레오티드 유사체로부터 만들어진 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체, 및 예를 들어 메틸화된 및/또는 모자씌워진 (capped) 폴리뉴클레오티드이지만, 이에 한정되지 않는 변형된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 핵산은 인산 결합을 통해 보통 연결되어 핵산 서열 또는 폴리뉴클레오티드를 형성하지만, 많은 다른 결합들이 당해 기술분야에 알려져 있다 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 보라노포스페이트, 기타등등). 상기 창의적인 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 예를 들면, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 및 서열번호 55을 포함한다. 상기 창의적인 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 예를 들면, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 및 서열번호 64를 포함한다.
본 발명은 또한 상기 창의적인 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드, 상기 창의적인 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드, 및/또는 상기 창의적인 PD-1-결합제를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 예를 들면, 플라스미드, 에피솜 (episome), 코스미드, 바이러스성 벡터 (예를 들어, 레트로바이러스성 또는 아데노바이러스성), 또는 파지 (phage)일 수 있다. 벡터 제조의 적절한 벡터 및 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다 (예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning , a Laboratory Manual , 3 rd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994) 참조).
상기 창의적인 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드, 상기 창의적인 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드, 및/또는 상기 창의적인 PD-1-결합제를 암호화하는 핵산 서열에 추가로, 상기 벡터는 바람직하게는 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현을 위해 제공하는 발현 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결자, 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry sites: IRES), 기타 등등을 포함한다. 예시적인 발현 조절 서열은 당해 기술분야에 알려져 있고 예를 들면, Goeddel, Gene Expression Technology : Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)에 기재된다.
구성적 (constitutive), 유도성, 및 억제성 (repressible) 프로모터를 포함하는, 다양한 상이한 기원으로부터의 다수의 프로모터가 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 프로모터의 대표적인 기원은 예를 들면, 바이러스, 포유동물, 곤충, 식물, 효모, 및 세균을 포함하고, 이 기원으로부터의 적절한 프로모터는 쉽게 이용가능하거나, 또는 예를 들면, 다른 상업적 또는 개인적 입수처뿐만 아니라 ATCC와 같은 기탁기관으로부터 공개적으로 이용가능한 서열에 근거하여, 합성적으로 만들 수 있다. 프로모터는 단일방향성 (즉, 한 방향으로 전사를 개시함) 또는 양-방향성 (즉, 3' 또는 5' 방향 중 어느 하나에서 전사를 개시함)일 수 있다. 프로모터의 한정되지 않는 예는 예를 들면, T7 세균 발현 시스템, pBAD (araA) 세균 발현 시스템, 세포거대바이러스 (cytomegalovirus: CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터는 예를 들면, Tet 시스템 (미국 특허 5,464,758 및 5,814,618), 엑디손 (Ecdysone) 유도성 시스템(No et al., Proc . Natl . Acad . Sci., 93: 3346-3351 (1996)), T-REX™ 시스템 (Invitrogen, Carlsbad, CA), LACSWITCH™ 시스템 (Stratagene, San Diego, CA), 및 Cre-ERT 타모목시펜 (tamoxifen) 유도성 재조합효소 시스템 (Indra et al., Nuc . Acid . Res ., 27: 4324-4327 (1999); Nuc . Acid . Res ., 28: e99 (2000); U.S. Patent 7,112,715; 및 Kramer & Fussenegger, Methods Mol . Biol ., 308: 123-144 (2005))을 포함한다.
상기 용어 "인핸서 (enhancer)"는 본 명세서에 사용된 바와 같이, 예를 들면, 작동적으로 연결된 핵산 서열의 전사를 증가시키는 DNA 서열을 말한다. 인핸서는 상기 핵산 서열의 코딩 영역으로부터 수 킬로베이스 떨어져 위치될 수 있고 조절 인자의 결합, DNA 메틸화의 패턴, 또는 DNA 구조의 변화를 매개할 수 있다. 다양한 상이한 기원으로부터의 다수의 인핸서가 당해 기술분야에 잘 알려져 있고 클로닝된 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 다른 상업적 또는 개인적 입수처뿐만 아니라 ATCC와 같은 기탁기관 유래)로서 또는 이내에서 이용가능하다. 프로모터(예를 들어 흔히-이용된 CMV 프로모터)를 포함하는 여러 폴리뉴클레오티드가 또한 인핸서 서열을 포함한다. 인핸서는 코딩 서열의 상류, 안에, 또는 하류에 위치될 수 있다.
상기 벡터는 또한 "선별가능한 마커 유전자 (selectable marker gene)"를 포함할 수 있다. 상기 용어 "선별가능한 마커 유전자"는 본 명세서에 사용된 바와 같이, 상기 핵산 서열을 발현하는 세포를 상응하는 선택적 작용제의 존재에서, 특이적으로 이를 위해 또는 대항하여 선별되게 하는 핵산 서열을 말한다. 적절한 선별가능한 마커 유전자는 당해 기술분야에 알려져 있고, 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 1992/008796 및 WO 1994/028143; Wigler et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 77: 3567-3570 (1980); O'Hare et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 78: 1527-1531 (1981); Mulligan & Berg, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 78: 2072-2076 (1981); Colberre-Garapin et al., J. Mol . Biol., 150: 1-14 (1981); Santerre et al., Gene, 30: 147-156 (1984); Kent et al., Science, 237: 901-903 (1987); Wigler et al., Cell, 11: 223-232 (1977); Szybalska & Szybalski, Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 48: 2026-2034 (1962); Lowy et al., Cell, 22: 817-823 (1980); 및 미국 특허 5,122,464 및 5,770,359에 기재된다.
일부 구체예에서, 상기 벡터는 "에피솜 발현 벡터 (episomal expression vector)" 또는 "에피솜 (episome)"이고, 이것은 숙주 세포에서 복제 가능하고, 적합한 선별 압력의 존재에서 숙주 세포 내에서 DNA의 염색체외 분절로서 지속된다 (예를 들어, Conese et al., Gene Therapy, 11: 1735-1742 (2004) 참조). 대표적인 상업적으로 이용가능한 에피솜 발현 벡터는 엡스테인 바 핵 항원 1 (Epstein Barr Nuclear Antigen 1: EBNA1) 및 엡스테인 바 바이러스 (Epstein Barr Virus: EBV) 복제 기점 (origin of replication: oriP)을 이용하는 에피솜 플라스미드를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. Invitrogen 사 (Carlsbad, CA)의 벡터 pREP4, pCEP4, pREP7, 및 pcDNA3.1, 및 Stratagene 사 (La Jolla, CA)의 pBK-CMV는 EBNA1 및 oriP 대신에 T-항원 및 SV40 복제기점을 이용하는 에피솜 벡터의 한정되지 않는 예를 대표한다.
다른 적절한 벡터는 통합성(integrating) 발현 벡터를 포함하고, 이것은 숙주 세포의 염색체로 무작위적으로 통합되거나, 또는 상기 발현 벡터와 숙주 세포의 염색체 간의 특이적 재조합을 가능하게 하는 재조합 부위를 포함할 수 있다. 이러한 통합성 발현 벡터는 숙주세포의 염색체의 내인성 발현 조절 서열을 이용하여 원하는 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 부위 특이적 방식으로 통합하는 벡터의 예는 예를 들면, Invitrogen 사 (Carlsbad, CA)의 flp-in 시스템 (예를 들어, pcDNA™5/FRT), 또는 예를 들어 Stratagene 사 (La Jolla, CA)의 pExchange-6 코어 벡터에서 발견될 수 있는 것과 같은 cre-lox 시스템의 구성요소를 포함한다. 숙주 세포 염색체에 무작위적으로 통합하는 벡터의 예는 예를 들면, Invitrogen 사 (Carlsbad, CA)의 pcDNA3.1 (T-항원의 부재시 도입되는 경우), Millipore 사 (Billerica, MA)의 UCOE, 및 Promega 사 (Madison, WI)의 pCI 또는 pFN10A (ACT) FLEXI™을 포함한다.
바이러스성 벡터가 또한 사용될 수 있다. 대표적인 상업적으로 이용가능한 바이러스성 발현 벡터는 Crucell, Inc. (Leiden, 네덜란드)로부터 이용가능한 아데노바이러스-기반 Per.C6 시스템, Invitrogen 사(Carlsbad, CA)의 렌티바이러스성-기반 pLP1, 및 Stratagene 사 (La Jolla, CA)의 레트로바이러스성 벡터 pFB-ERV 플러스 pCFB-EGSH를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
상기 창의적인 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열은 같은 벡터에서 (즉, 시스 (cis)로) 세포에 제공될 수 있다. 단일방향성 프로모터가 각 핵산 서열의 발현을 조절하는데 이용될 수 있다. 또다른 구체예에서, 양방향성 및 단일방향성 프로모터의 조합이 다중의 핵산 서열의 발현을 조절하는데 이용될 수 있다. 상기 창의적인 아미노산 서열 상기 창의적인 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열은 대안적으로 별개의 벡터에서 (즉, 트랜스(trans)로) 세포의 군집에 제공될 수 있다. 별개의 벡터의 각각 중 각각의 핵산 서열은 같거나 또는 상이한 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 별개의 벡터는 동시에 또는 순차로 세포에 제공될 수 있다.
상기 창의적인 아미노산 서열을 암호화하는 핵산(들)을 포함하는 벡터(들)는은 적절한 원핵 또는 진핵 세포를 포함하는, 그에 의해 암호화된 폴리펩티드를 발현할 수 있는 숙주 세포로 도입될 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 상기 창의적인 벡터를 포함하는 분리된 세포를 제공한다. 바람직한 숙주 세포는 쉽고 신뢰할 수 있게 성장될 수 있고, 합리적으로 빠른 성장율을 갖고, 잘 특징화된 발현 시스템을 갖고, 및 쉽고 효율적으로 형절전환 또는 형질감염될 수 있는 것이다.
적절한 원핵 세포의 예는 바실러스 (예를 들어, 바실러스 서브틸러스 및 바실러스 브레비스), 에스케리치아 (예를 들어, 대장균), 슈도모나스, 스트렙토미세스, 살모넬라, 및 에르위니아 속으로부터의 세포를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특히 유용한 원핵 세포는 다양한 스트레인의 대장균 (예를 들어, K12, HB101 (ATCC 번호 33694), DH5α, DH10, MC1061 (ATCC 번호 53338), 및 CC102)을 포함한다.
바람직하게는, 상기 벡터는 진핵 세포로 도입된다. 적절한 진핵 세포는 당해 기술분야에 알려져 있고 예를 들면, 효모 세포, 곤충 세포, 및 포유동물 세포를 포함한다. 적절한 효모 세포의 예는 클루이베로미세스, 피치아, 리노 - 스포리디움 (Rhino-sporidium), 사카로미세스, 및 스키조사카로미세스 속으로부터의 것을 포함한다. 바람직한 효모 세포는 예를 들면, 사카로미세스 세레비사에 및 피치아 파스토리스를 포함한다.
적절한 곤충 세포는 예를 들면, Kitts et al., Biotechniques, 14: 810-817 (1993); Lucklow, Curr . Opin . Biotechnol ., 4: 564-572 (1993); 및 Lucklow et al., J. Virol ., 67: 4566-4579 (1993)에 기재된다. 바람직한 곤충 세포는 Sf-9 및 HI5 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 포함한다.
바람직하게는, 포유동물 세포가 본 발명에 이용된다. 여러 적절한 포유동물 숙주 세포는 당해 기술분야에 알려져 있고, 다수가 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)로부터 이용가능하다. 적절한 포유동물 세포의 예는 중국 햄스터 난소 세포 (Chinese hamster ovary: CHO) (ATCC 번호 CCL61), CHO DHFR-세포 (Urlaub et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 97: 4216-4220 (1980)), 인간 배아 신장 (human embryonic kidney: HEK) 293 또는 293T 세포 (ATCC 번호 CRL1573), 및 3T3 세포 (ATCC 번호 CCL92)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 적절한 포유동물 세포주는 원숭이 COS-1 (ATCC 번호 CRL1650) 및 COS-7 세포주 (ATCC 번호 CRL1651), 뿐만 아니라 CV-1 세포주 (ATCC 번호 CCL70)이다. 더 예시적인 포유동물 숙주 세포는 형질전환된 세포주를 포함한, 영장류 세포주 및 설치류 세포주를 포함한다. 일반 이배체 세포, 1차 조직의 시험관 내 배양으로부터 유래된 세포 스트레인, 뿐만아니라 1차 조직절편(explant)도 적절하다. 다른 적절한 포유동물 세포주는 마우스 신경아세포종 N2A 세포, HeLa, 마우스 L-929 세포, 및 BHK 또는 HaK 햄스터 세포주를 포함하지만, 이에 한정되지 않고, 이들 모두는 ATCC로부터 이용가능하다. 적절한 포유동물 숙주 세포를 선별하는 방법 및 세포의 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝, 및 정제를 위한 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다.
가장 바람직하게는, 상기 포유동물 세포는 인간 세포이다. 예를 들면, 상기 포유동물 세포는 인간 림프구 또는 림프구 유래 세포주, 예를 들어 전(pre)-B 림프구 기원의 세포주일 수 있다. 인간 림프구 세포주의 예는 RAMOS (CRL-1596), Daudi (CCL-213), EB-3 (CCL-85), DT40 (CRL-2111), 18-81 (Jack et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 85: 1581-1585 (1988)), Raji 세포 (CCL-86), 및 그의 유도체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
상기 창의적인 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열은 "형질감염 (transfection)", "형질전환 (transformation)", 또는 "형질유도 (Transfection)"에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. "형질감염", "형질전환", 또는 "형질유도"는, 본 명세서 기재된 바와 같이, 물리적 또는 화학적 방법을 이용함으로써 숙주 세포 내로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드의 도입을 말한다. 많은 형질감염 기법이 당해 기술분야에 알려져 있고, 예를 들면, 칼슘 인산염 DNA 공-침전 (예를 들어, Murray E.J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol . 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991) 참조); DEAE-덱스트란; 전기천공법; 양이온성 리포좀-매개 형질감염; 텅스텐 입자-촉진된 미세입자 충격 (microparticle bombardment)(Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); 및 스트론튬 인산염 DNA 공-침전 (Brash et al., Mol . Cell Biol ., 7: 2031-2034 (1987))을 포함한다. 파지 또는 바이러스성 벡터는 적절한 패키징 세포에서 감염성 임자의 성장 후, 숙주 세포로 도입될 수 있고, 이들 중 다수가 상업적으로 이용가능하다.
본 발명은 상기 창의적인 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드, 상기 창의적인 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드, 상기 창의적인 PD-1-결합제, 앞의 것 중 어느 하나를 암호화하는 상기 창의적인 핵산 서열, 또는 상기 창의적인 핵산 서열을 포함하는 상기 창의적인 벡터의 유효량을 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 (예를 들어, 생리적으로 허용가능한) 조성물이고, 이것은 담체, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 (예를 들어, 생리적으로 허용가능한) 담체, 및 상기 창의적인 아미노산 서열, 항원-결합제, 또는 벡터를 포함한다. 임의의 적절한 담체는 본 발명의 맥락 내에서 사용될 수 있고, 이러한 담체는 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 담체의 선택은, 부분적으로, 상기 조성물이 투여될 수 있는 특정 부위 및 상기 조성물이 투여되는데 이용된 특정 방법에 의해 결정될 것이다. 상기 조성물은 선택적으로 멸균될 수 있다. 상기 조성물은 보관을 위해 냉동 또는 동결건조될 수 있고 사용 전 적절한 멸균 담체에서 재구성될 수 있다. 상기 조성물은 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy , 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2001)에 기재된 통상적인 기법에 따라 생산될 수 있다.
본 발명은 PD-1 단백질의 부적절한 발현 (예를 들어, 과발현) 또는 증가된 활성이 질환의 병리학적 효과를 야기하거나 또는 이에 기여하거나, 또는 PD-1 단백질 수준 또는 활성의 감소가 포유동물, 바람직하게는 인간에 치료요법적 혜택을 갖는 것인 임의의 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 더 제공한다. 본 발명은 또한 포유동물에서 암 또는 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 암 또는 감염성 질환에 걸린 포유동물에 전술된 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 그 결과 상기 암 또는 감염성 질환이 포유동물에서 치료된다. 본 명세서에서 논의된 바와 같이, PD-1은 다양한 암에서 비정상적으로 발현되고 (예를 들어, Brown et al., J. Immunol., 170: 1257-1266 (2003); 및 Flies et. al., Yale Journal of Biology and Medicine, 84: 409-421 (2011) 참조), 및 일부 신장암 환자에서 PD-L1 발현은 종양 침해성 (aggressiveness)과 상호관련된다. 상기 창의적인 방법은 당해 기술분야에 알려진 임의의 유형의 암, 예를 들면, 흑색종, 신장암, 폐암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 담낭암, 후두암, 간암, 갑상선암, 위암, 침샘암, 전립선암, 췌장암, 또는 메르켈 세포암(Merkel cell carcinoma)을 치료하는데 이용될 수 있다 (예를 들어, Bhatia et al., Curr . Oncol . Rep ., 13(6): 488-497 (2011) 참조). 상기 창의적인 방법은 임의의 유형의 감염성 질환 (즉, 세균, 바이러스, 균류, 또는 기생충에 의해 야기된 질환 또는 장애)을 치료하는데 이용될 수 있다. 상기 창의적인 방법에 의해 치료될 수 있는 감염성 질환의 예는 인간 면역결핍 바이러스 (human immunodeficiency virus: HIV), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus: RSV), 인플루엔자 바이러스, 뎅기(dengue) 바이러스, B형 간염 바이러스 (hepatitis B virus: HBV), 또는 C형 간염 바이러스 (hepatitis C virus: HCV)에 의해 야기된 질환을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 상기 창의적인 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드, 상기 창의적인 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드, 상기 창의적인 PD-1-결합제, 앞의 것 중 어느 하나를 암호화하는 상기 창의적인 핵산 서열, 또는 상기 창의적인 핵산 서열을 포함한 상기 창의적인 벡터를 포함한 조성물의 투여는 포유동물에서 암 또는 감염성 질환에 대한 면역 반응을 유도한다. "면역 반응 (immune response)"은 예를 들면, 항체 생성 및/또는 면역 효과기 세포 (예를 들어, T-세포)의 활성화를 동반할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "치료 (treatment 또는 treating 등)"은 요구된 약리적 및/또는 생리적 효과를 수득하는 것을 말한다. 바람직하게는, 상기 효과는 치료요법적이고, 즉 상기 효과는 질환 및/또는 상기 질환에 기여할 수 있는 역 증상을 부분적으로 또는 완전히 고친다. 이것을 위하여, 상기 창의적인 방법은 상기 PD-1-결합제의 "치료요법적으로 유효한 양"을 투여하는 단계를 포함한다. "치료요법적으로 유효한 양 (therapeutically effective amount)"은 바람직한 치료요법적 결과를 달성하기 위해, 필요한 투여량 및 기간 동안에의, 유효한 양을 말한다. 상기 치료요법적으로 유효한 양은 개인의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 개인의 바람직한 반응을 이끌어내는 상기 PD-1-결합제의 능력과 같은 인자들에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 PD-1-결합제의 치료요법적으로 유효한 양은 인간에서 PD-1 단백질 생체활성을 감소시키고 및/또는 암 또는 감염성 질환에 대한 면역 반응을 높이는 양이다.
대안적으로, 상기 약리적 및/또는 생리적 효과는 예방적일 수 있고, 즉 상기 효과는 질환 또는 그의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다. 이 점에서, 상기 창의적인 방법은 상기 PD-1-결합제의 "예방적으로 유효한 양 (prophylactically effective amount)"을 투여하는 단계를 포함한다. "예방적으로 유효한 양"은 바람직한 예방적 결과를 달성하기 위해, 필요한 투여량 및 기간 동안에의, 유효한 양을 말한다.
보통의 용량은 예를 들면, 동물 또는 인간 체중의 1 pg/kg 내지 20 mg/kg의 범위일 수 있다; 그러나, 이 예시적인 범위의 아래 또는 위의 용량은 본 발명의 범위 내이다. 일일 비경구 용량은 총 체중의 약 0.00001 ㎍/kg 내지 약 20 mg/kg (예를 들어, 약 0.001 ㎍/kg, 약 0.1 ㎍/kg , 약 1 ㎍/kg, 약 5 ㎍/kg, 약 10 ㎍/kg, 약 100 ㎍/kg, 약 500 ㎍/kg, 약 1 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 또는 앞의 값들 중 2개에 의해 규정된 범위), 바람직하게는 총 체중의 약 0.1 ㎍/kg 내지 약 10 mg/kg (예를 들어, 약 0.5 ㎍/kg, 약 1 ㎍/kg, 약 50 ㎍/kg, 약 150 ㎍/kg, 약 300 ㎍/kg, 약 750 ㎍/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 5 mg/kg, 또는 앞의 값들 중 2개에 의해 규정된 범위의), 더 바람직하게는 총 체중의 약 1 ㎍/kg 내지 5 mg/kg (예를 들어, 약 3 ㎍/kg, 약 15 ㎍/kg, 약 75 ㎍/kg, 약 300 ㎍/kg, 약 900 ㎍/kg, 약 2 mg/kg, 약 4 mg/kg, 또는 앞의 값들 중 2개에 의해 규정된 범위의), 및 좀더 바람직하게는 1일 당 약 0.5 내지 15 mg/kg 체중 (예를 들어, 약 1 mg/kg, 약 2.5 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 9 mg/kg, 약 11 mg/kg, 약 13 mg/kg, 또는 앞의 값들 중 2개에 의해 규정된 범위의)일 수 있다. 치료요법적 또는 예방적 효능은 치료된 환자의 주기적 평가에 의해 모니터링될 수 있다. 여러 날 또는 더 오래 반복된 투여를 위해, 조건에 따라, 치료는 질환 증상의 바람직한 저해가 일어날때까지 반복될 수 있다. 그러나, 다른 투여량 계획이 유용할 수 있고 본 발명의 범위에 속한다. 상기 바람직한 투여량은 상기 조성물의 볼루스 (bolus) 투여, 상기 조성물의 다중 볼루스 투여, 또는 상기 조성물의 계속적인 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
상기 창의적인 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드, 상기 창의적인 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드, 상기 창의적인 PD-1-결합제, 앞의 것 중 어느 하나를 암호화하는 상기 창의적인 핵산 서열, 또는 상기 창의적인 핵산 서열을 포함하는 상기 창의적인 벡터의 유효량을 포함하는 조성물은 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비강내, 구강, 설하, 또는 좌제 투여를 포함한, 표준 투여 기법을 이용하여 포유동물에 투여될 수 있다. 상기 조성물은 바람직하게는 비경구 투여용에 적합하다. 상기 용어 "비경구 (parenteral)"는, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질, 및 복강내 투여를 포함한다. 더 바람직하게는, 상기 조성물은 정맥내, 복강내, 또는 피하 주사에 의해 말초 전신성 전달을 이용하여 포유동물에 투여된다.
포유동물 (예를 들어, 인간)에 투여되면, 상기 창의적인 PD-1-결합제의 생물학적 활성은 당해 기술분야에 알려진 적절한 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 상기 생물학적 활성은 특정 PD-1-결합제의 안정성을 결정함으로써 평가될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 PD-1-결합제 (예를 들어, 항체)는 약 30 분 내지 45 일 (예를 들어, 약 30 분, 약 45 분, 약 1 시간, 약 2 시간, 약 4 시간, 약 6 시간, 약 10 시간, 약 12 시간, 약 1 일, 약 5 일, 약 10 일, 약 15 일, 약 25 일, 약 35 일, 약 40 일, 약 45 일, 또는 앞의 값들 중 2개에 의해 규정된 범위)의 생체 내 (in vivo) 반감기를 갖는다. 또다른 구체예에서, 상기 PD-1-결합제는 약 2 시간 내지 20 일 (예를 들어, 약 5 시간, 약 10 시간, 약 15 시간, 약 20 시간, 약 2 일, 약 3 일, 약 7 일, 약 12 일, 약 14 일, 약 17 일, 약 19 일, 또는 앞의 값들 중 2개에 의해 규정된 범위)의 생체 내 반감기를 갖는다. 또다른 구체예에서, 상기 PD-1-결합제는 약 10 일 내지 약 40 일 (예를 들어, 약 10 일, 약 13 일, 약 16 일, 약 18 일, 약 20 일, 약 23 일, 약 26 일, 약 29 일, 약 30 일, 약 33 일, 약 37 일, 약 38 일, 약 39 일, 약 40 일, 또는 앞의 값들 중 2개에 의해 규정된 범위)의 생체 내 반감기를 갖는다.
특정 PD-1-결합제의 생물학적 활성은 또한 PD-1 단백질 또는 그의 에피토프에 대한 그의 결합 친화도를 결정함으로써 평가될 수 있다. 상기 용어 "친화도 (affinity)"는 두 작용제의 가역적 결합에 대한 평형 상수를 말하고 해리 상수 (dissociation constant: KD)로 표현된다. 리간드에 대한 결합제의 친화도, 예를 들어 에피토프에 대한 항체의 친화도는 예를 들면, 약 1 피코몰 (picomolar: pM) 내지 약 100 마이크로몰 (micromolar: μM) (예를 들어, 약 1 피코몰 (pM) 내지 약 1 나노몰 (nM), 약 1 nM 내지 약 1 마이크로몰 (μM), 또는 약 1 μM 내지 약 100 μM)일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 PD-1-결합제는 1 나노몰 이하 (예를 들어, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.1 nM, 0.05 nM, 0.025 nM, 0.01 nM, 0.001 nM, 또는 앞의 값들 중 2개에 의해 규정된 범위)의 KD로 PD-1 단백질에 결합할 수 있다. 또다른 구체예에서, 상기 PD-1-결합제는 200 pM 이하 (예를 들어, 190 pM, 175 pM, 150 pM, 125 pM, 110 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 75 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, 또는 앞의 값들 중 2개에 의해 규정된 범위)의 KD로 PD-1 단백질에 결합할 수 있다. 대상 항원 또는 에피토프에 대한 면역글로불린 친화도는 임의의 당해 기술분야에 인정된 분석을 이용하여 측정될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들면, 형광 활성화된 세포 분류기 (fluorescence activated cell sorting: FACS), 분리가능한 비드 (예를 들어, 자성 비드), 표면 플라스몬 공명 (surface plasmon resonance: SPR), 용액 상(phase) 경쟁법 (KINEXA™), 항원 패닝 (panning), 및/또는 ELISA (예를 들어, Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5th ed., Garland Publishing, New York, NY, 2001 참조)를 포함한다.
본 발명의 PD-1-결합제는 단독 또는 다른 약물 (예를 들어, 아쥬반트)와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 PD-1-결합제는 본 명세서에 개시된 질환의 치료 또는 예방을 위해 다른 작용제와 조합하여 투여될 수 있다. 이 점에서, 상기 PD-1-결합제는 예를 들면, 당해 기술분야에 알려진 화학치료요법제, 이온화 방사선, 소분자 항암제, 암 백신, 생물학적 치료요법 (예를 들어, 다른 모노클론 항체, 암-살해(killing) 바이러스, 유전자 치료요법, 및 양자 (adoptive) T-세포 전달), 및/또는 수술을 포함한 하나 이상의 다른 항암제와 조합하여 이용될 수 있다. 상기 창의적인 방법이 감염성 질환을 치료할 경우, 상기 PD-1-결합제는 하나 이상의 항균제 또는 하나 이상의 항-바이러스제와 조합하여 투여될 수 있다. 이 점에서, 상기 항균제는 당해 기술분야에 알려진 적절한 항생제일 수 있다. 상기 항-바이러스제는 특정 바이러스를 특이적으로 표적으로 하는 적절한 유형의 임의의 백신일 수 있다 (예를 들어, 약독화된 (live-attenuated) 백신, 서브유닛 백신, 재조합 벡터 백신, 및 소분자 항-바이러스 치료요법 (예를 들어, 바이러스 복제 억제제 및 뉴클레오시드 유사체).
또다른 구체예에서, 상기 창의적인 PD-1 결합제는 면역 체크포인트 경로를 억제하는 다른 작용제와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 창의적인 PD-1 결합제는 CTLA-4, TIM-3 또는 LAG-3 경로를 억제 또는 길항하는 작용제와 조합하여 투여될 수 있다. 2 이상의 이 면역 체크포인트 경로를 동시에 표적으로 하는 조합 치료는 향상되고 잠재적으로 상승적 항종양 활성을 입증하였다 (예를 들어, Sakuishi et al., J. Exp . Med., 207: 2187-2194 (2010); Ngiow et al., Cancer Res., 71: 3540-3551 (2011); 및 Woo et al., Cancer Res ., 72: 917-927 (2012) 참조). 일 구체예에서, 상기 창의적인 PD-1 결합제는 TIM-3에 결합하는 항체 및/또는 LAG-3에 결합하는 항체와 조합하여 투여된다. 이 점에서, 포유동물에서 암 또는 감염성 질환을 치료하는 상기 창의적인 방법은 (i) TIM-3 단백질에 결합하는 항체 및 (ii) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물 또는 (i) LAG-3 단백질에 결합하는 항체 및 (ii) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 포유동물에 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다.
치료요법적 용도에 추가하여, 본 명세서에 기재된 상기 PD-1-결합제는 진단 및 연구 적용에 이용할 수 있다. 이 점에서, 상기 PD-1-결합제는 암 또는 감염성 질환을 진단하는 방법에 이용될 수 있다. 유사한 방식으로, 상기 PD-1-결합제는 비정상 PD-1 발현과 관련된 질환 또는 장애를 위해 검사되는 개체에서 PD-1 단백질 수준을 모니터링하는 분석에 이용될 수 있다. 연구 적용은 예를 들면, 시료 예를 들어, 인간 체액 또는 세포 또는 조직 추출물에서 PD-1 단백질을 검출하기 위해 상기 PD-1-결합제 및 표지를 이용하는 방법을 포함한다. 상기 PD-1-결합제는 검출가능한 모이어티와 공유 또는 비공유 표지와 같은 변형을 갖거나 또는 없이 이용될 수 있다. 예를 들면, 상기 검출가능한 모이어티는 방사성동위원소 (예를 들어, 3H, 14C, 32P, 35S, 또는 125I), 형광 또는 화학발광 화합물 (예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 또는 루시페린), 효소 (예를 들어, 알카리 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 호스라디쉬 퍼옥시다제), 또는 보결분자단 (prosthetic group)일 수 있다. 검출가능한 모이어티에 항원-결합제 (예를 들어, 항체)를 별개로 접합하기 위한 당해 기술분야에 알려진 방법이 본 발명의 맥락에서 채용될 수 있다 (예를 들어, Hunter et al., Nature, 194: 495-496 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014-1021 (1974); Pain et al., J. Immunol . Meth ., 40: 219-230 (1981); 및 Nygren, J. Histochem . and Cytochem ., 30: 407-412 (1982) 참조).
PD-1 단백질 수준은 상기 창의적인 PD-1-결합제를 이용하여 당해 기술분야에 알려진 임의의 적절한 방법에 의해 측정될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들면, 방사성면역분석 (radioimmunoassay: RIA), 및 FACS를 포함한다. PD-1 단백질의 정상 또는 표준 발현 값는 임의의 적절한 기법을 이용하여, 예를 들어, 항원-항체 복합체를 형성하기에 적절한 조건 하에서 PD-1 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 포함하는 것으로 의심되는 시료를 PD-1-특이적 항체와 조합함으로써 확립될 수 있다. 상기 항체는 결합된 또는 결합되지 않은 항체의 검출을 촉진하기 위해 검출가능한 물질로 직접 또는 간접적으로 표지된다. 적절한 검출가능한 물질은 다양한 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질, 및 방사성 물질을 포함한다 (예를 들어, Zola, Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) 참조). 시료 중 발현된 PD-1 폴리펩티드의 양은 그 후 표준 값와 비교된다.
상기 PD-1-결합제는 키트 즉, 진단 분석을 수행하기 위해 지시와 함께 미리 결정된 양으로 시약의 패키징된 조합으로 제공될 수 있다. 상기 PD-1-결합제가 효소로 표지된다면, 상기 키트는 바람직하게 상기 효소에 요구된 기질 및 보조인자 (예를 들어, 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함한다. 또한, 다른 첨가제, 예를 들어 안정화제, 완충제 (예를 들어, 차단 완충제 또는 용해 완충제) 등이 상기 키트에 포함될 수 있다. 다양한 시약의 상대적인 양은 달라져서 상기 분석의 민감도를 실질적으로 최적화하는 시약의 용액의 농도로 제공할 수 있다. 상기 시약은 용해 (dissolution)에서 적당한 농도를 갖는 시약 농도를 제공할 첨가제를 포함하는, 건조 분말 (보통 동결건조됨)로 제공될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 더 예를 들어 설명하지만, 물론, 그 범위를 한정하는 방식으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1
이 실시예는 인간 PD-1에 대한 모노클론 항체를 생산하는 방법을 입증한다.
인간 PD-1 및 그의 리간드 PD-L1 및 PD-L2를 암호화하는 여러 형태의 유전자 를 마우스 면역화, 하이브리도마 스크리닝, 및 CDR-이식된 (grafted) 항체의 친화도 성숙에 이용하기 위한 항체로서 생산하고, 및 도 1에 개략적으로 묘사한다. 전장 (full-length) 인간 및 시노몰구스 (cynomolgus) 원숭이 PD-1 유전자는 히그로미신 (hygromycin) 선별자를 갖는 유비퀴터스 크로마틴 오프닝 요소 (ubiquitous chromatin opening element: UCOE) 단일 발현 벡터 (Millipore, Billerica, MA)를 이용하여 그의 본래 리더 (leader) 서열을 갖지만 추가된 태그 없이 발현시켰다. CHO-K1 세포를 제조자의 지시에 따라 리포펙타민 LTX (Life Technologies, Carlsbad, CA)로 안정하게 형질감염시켰다. 히그로미신으로 선별한 후, 상기 세포 표면에 PD-1을 발현하는 세포를 인간 PD-1에 대한 PE-접합된 마우스 항체(BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ)를 이용한 유세포 분석법으로 동정하고 서브클로닝하였다. 서브클론을 그 후 높은-수준 및 균일한 PD-1 발현으로 선별하였다.
인간 및 시노몰구스 원숭이 PD-1의 세포외 도메인 (extracellular domain: ECD)의 가용성 단량체 형태를 암호화하는 핵산 서열을 도 1에 표시된 바와 같이 상기 ECD의 C-말단에 덧붙인 His 태그와 또는 마우스 IgG2a Fc를 갖는 가용성 이량체 융합 단백질로서 구성하였다. 인간 PD-L1 및 PD-L2의 상기 ECD의 가용성 이량체 형태를 암호화하는 핵산 서열을 도 1에 표시된 바와 같이 마우스 IgG1 Fc를 갖는 융합 단백질로서 구성하였다. 가용성 단백질을 표준 기법을 이용하여 HEK 293 세포 또는 안정한 CHO 세포주에서 일시적으로 발현시켰다. His-태그된 단백질을 Ni-친화도 컬럼 크로마토그래피 그 후 크기 배제 크로마토그래피를 통해 세포 배양 상층액으로부터 정제하였다. IgG-Fc 융합 단잭질을 단백질 A/G 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE 및 크기 배제 크로마토그래피로 분석하여 동종성을 보증하였다. 추가적으로, 동정 및 크기를 질량 분석법으로 확정하였다.
FACS 분류 실험을 위해, 정제된 단백질을 표준 기법을 이용하여 NHS 에스테르 가교링커 (crosslinker) (Thermo-Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) 또는 형광 염료 DyLight 650 (Thermo-Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA)을 사용하여 비오틴으로 표지하였다.
마우스를 세포 표면에 전장 PD-1을 발현하는 CHO 세포 또는 상기 PD-1 ECD His 단백질 중 어느 하나로 면역화하였다. 구체적으로, 암컷 BALB/c 마우스 (7 주령)를 Harlan Laboratories, Inc. (Indianapolis, IN)로부터 구입하고 두 그룹으로 나누었다. 6 일의 순응 후, 일 그룹의 동물을 TITERMAX GOLD™ (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)와 1:1 에멀젼으로서, 50 ㎍/마우스로 정제된 인간 PD-1 ECD-His의 주당 4회 용량으로 면역화하였다. 면역화를 겨드랑이와 서혜부 영역 부근에 피하로 수행하였다. 두번째 그룹의 동물에 서혜부 영역 부근에 피하로 전장 인간 PD-1를 안정하게 발현하는 CHO-K1 세포 (5 x 106 세포/마우스)의 주당 4회 용량으로 주사하였다. 10 일 후, 동물을 PD-1에 대한 혈청 타이터의 측정을 위해 채혈하고 각 그룹으로부터 1 동물을 3 주 휴식 후 가용성 인간 PD-1으로 증폭 (boost)하였다. 3 일 후, 비장, 겨드랑이/상완 림프절, 및 서혜부 림프절을 각 동물로부터 수집하였다. 동물 둘 다로부터 수집된 모든 조직으로부터 세포의 단일 세포 현탁액을 풀링(pool)하고 표준 기법을 이용한 세포 융합에 의해 하이브리도마의 생산에 이용하였다. 두 상이한 골수종 세포주인 F0 (de St. Groth and Scheidegger, J. Immunol . Methods, 35: 1-21 (1980)에 기재된 바와 같음) 및 P3X63Ag8.653 (Kearney et al., J. Immunol., 123: 1548-1550 (1979)에 기재된 바와 같음)을 융합에 이용하였다.
10 개의 96-웰 플레이트의 하이브리도마 상층액을, 전장 인간 PD-1을 암호화하는 핵산 서열으로 안정하게 형질감염된 CHO-K1 세포 클론에 결합시켜 스크리닝하고, 형질감염되지 않은 CHO-K1 세포에의 결합과 비교하였다. 특이적으로, 하이브리도마 상층액을 PBS/2% FBS로 1:1 희석시키고 동일한 부피의 PD-1 CHO-K1 세포 (PBS, 2% FBS 중 2.5x105 세포)로 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 원심분리하고, PBS/1% FBS로 1회 세척하고, APC-접합된 염소 항-마우스 IgG (H+L) (Southern Biotechnology, Birmingham, AL)로 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS/2% FBS로 2회 세척하고, PBS, 2% FBS, 1% 파라포름알데히드에 현탁하고, BD FACSARRAY™ Bioanalyzer (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)에서 형광 분석하였다. 마우스 IgG 수준을 ELISA에 의해 정량하였다.
PD-1 CHO 세포에의 강한 결합에 근거하여, 46 부모 웰을 확장시키고, 상층액을 PD-1 CHO 세포에 대한 DyL650-표지된 PD-L1-mIgG1 Fc 융합 단백질의 결합을 차단하는 능력을 검사하였다. 구체적으로, 분리된 마우스 모노클론 항체를 PD-L1-DyL650의 EC30 농도 (10 nM)를 갖는 용량 반응으로 인큐베이션하고, 저해를 유세포 분석법에 의해 정량하였다. 가장 좋은 PD-L1 차단 활성 및 가장 높은 수준의 마우스 IgG를 보이는 웰의 세포를 정제와 중쇄 및 경쇄 (VH 및 VL) 시퀀싱을 포함하는 추가 분석을 위해 서브클로닝하였다. PD-1/PD-L1 상호작용의 가장 강한 차단제 11개를 서브클로닝을 위해 선별하였다. PD-1 결합 및 PD-L1 차단의 재-확정 후, 선별된 서브클론을 규모를 확대하고, 상층액을 항체 정제하였다. 정제된 항체를 인간 및 시노몰구스 원숭이 PD-1 둘다에 대한 결합 및 PD-L1 차단 활성에 대해 확인하였다. KD 값를 BIACORE™ T200 기기 (GE Healthcare, Waukesha, WI)에서 표면 플라스몬 공명에 의해 결정하고, 동력학적 상수를 BIACORE™ T200 평가 소프트웨어 (GE Healthcare, Waukesha, WI)를 이용하여 결정하였다. 이 점에서, 항체를 GE 항-마우스 IgG가 커플링된 BIACORE™ CM5 칩에 포획하였다. PD-1-His 단량체를 가장 높은 농도로 500 nM에서 시작하는 두배 또는 세배 순차 희석을 이용하여 포획된 항체 위로 흘렸다. 결과로 얻은 센소그램 (sensorgram)을 온 (on)- 및 오프 (off)-속도 및 그 다음의 친화도 (KD)를 산출하기 위해 1:1 결합 모델을 이용하여 전반적으로 피팅(fit)하였다.
본 실시예의 결과는 인간 및 시노몰구스 원숭이 PD-1에 결합하고 PD-1 리간드 결합을 차단하는 모노클론 항체를 생성하는 방법을 입증한다.
실시예 2
이 실시예는 CDR-이식되고 키메라인 항-PD-1 모노클론 항체의 고안 및 생산을 기재한다.
실시예 1에 기재된 바와 같이 PD-L1 차단 활성을 갖는 PD-1-결합 항체를 생성하는 하이브리도마의 서브클론을 이소타이핑(isotype)하고, 상기 항체 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 클로닝하기 위해 RT-PCR하고, 및 시퀀싱하였다. 구체적으로, RNA를 RNEASY™ 키트 (Qiagen, Venlo, Netherlands)를 이용하여 하이브리드 클론의 세포 펠렛 (5 x 105 세포/펠렛)으로부터 분리하고, cDNA를 올리고-dT-프라이밍된 (primed) SUPERSCRIPT™ III First-Strand Synthesis System (Life Technologies, Carlsbad, CA)을 이용하여 준비하였다. 상기 VL의 PCR 증폭은 9 또는 11 축퇴 (degenerate) 마우스 VL 정방향 프라이머들 (Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer-Verlag, Berlin (2001) 참조)의 풀 (pool) 및 마우스 κ 불변 영역 역방향 프라이머를 이용하였다. 상기 VH의 PCR 증폭은 SUPERSCRIPT™ III First-Stand Synthesis System (Life Technologies, Carlsbad, CA)에서 추천된 프로토콜로, 12 축퇴 마우스 VH 정방향 프라이머들 (Kontermann and Dubel, supra)의 풀 및 마우스 γ1 또는 γ2a 불변 영역 역방향 프라이머 (각 클론으로부터 정제된 항체의 이소타이핑에 근거함)를 이용하였다. PCR 산물을 정제하고 pcDNA3.3-TOPO (Life Technologies, Carlsbad, CA)으로 클로닝하였다. 각 세포 펠렛 유래 각 콜로니 (24 중쇄 및 48 경쇄)를 선별하고 표준 Sanger 시퀀싱 방법론 (Genewiz, Inc., South Plainfield, NJ)을 이용하여 시퀀싱하였다. 가변 영역 서열을 시험하고 가장 가까운 인간 중쇄 또는 경쇄 V-영역 생식세포계열 (germline) 서열과 정렬하였다. 세 항체를 CDR-이식을 위해 선별하였다: (1) 서열번호 4의 VH 및 서열번호 28의 VL을 포함하는 9A2, (2) 서열번호 15의 VH 및 서열번호 32의 VL을 포함하는 10B11, 및 (3) 서열번호 22의 VH 및 서열번호 38의 VL을 포함하는 6E9.
CDR-이식된 항체 서열을 각각의 상기-기재된 마우스 항체로부터 가장 가까운 인간 생식세포계열 상동체로 CDR 잔기를 이식함으로써 고안하였다. CDR-이식된 항체 가변 영역을 합성하고 분석을 위해 인간 IgG1/κ 불변 영역과 발현시켰다. 또한, 마우스:인간 키메라 항체를 인간 IgG1/κ 불변 영역에 연결된 상기 기재된 마우스 항체의 가변 영역을 이용하여 구성하였다. 키메라 및 CDR-이식된 항체를 상기 기재된 바와 같은 인간 및 시노몰구스 원숭이 PD-1 항원에 대한 결합 및 PD-1/PD-L1 차단 분석에서 활성에 대해 특징화하였다.
키메라이고 CDR-이식된 항체의 기능적 길항제 활성을 또한, 항-PD-1 항체의 존재에서 CD4+ T-세포의 활성화를 IL-2 분비를 측정함으로써 평가하는, 인간 CD4+ T-세포 혼합된 림프구 반응 (mixed lymphocyte reaction: MLR) 분석에서 검사하였다. PD-1은 T-세포 기능의 음성 조절자이기 때문에, PD-1의 길항작용은 증가된 IL-2 생성에 의해 측정된 바와 같이 증가된 T-세포 활성화를 초래할 것으로 기대되었다. 상기 9A2, 10B11, 및 6E9 CDR-이식된 항체는 길항적 활성을 입증하였고 친화도 성숙을 위해 선별되었다.
이 실시예의 결과는 PD-1에 특이적으로 결합하고 억제하는, 키메라이고 CDR-이식된 모노클론 항체를 생산하는 방법을 입증한다.
실시예 3
본 실시예는 PD-1에 대한 모노클론 항체의 친화도 성숙을 입증한다. 처음의 쥐 모노클론 항체로부터 유래된 CDR-이식된 항체 (9A2, 10B11, 및 6E9)를 시험관 내에서 체세포 과돌연변이를 통해서 친화도 성숙하게 하였다. 각 항체는 SHM-XEL 탈락성 (deciduous) 시스템 (Bowers et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 108: 20455-20460 (2011); 및 미국 특허 공개 2013/0035472 참조)을 이용하여 HEK 293c18 세포의 표면에 전시되었다. 안정한 에피솜 주(line)의 확립 후, 활성화-유도된 시토신 탈아미노효소 (activation-induced cytosine deaminase: AID)의 발현용 벡터를 상기 세포에 형질감염하여 Bowers et al., supra에 기재된 바와 같이 체세포 과돌연변이를 개시하였다. 항원 결합 엄격성을 증가시키는 조건 하에서 여러번의 FACS 분류 후, 각 항체의 가변 영역에서 여러 돌연변이를 동정하고 재조합하여 향상된 특성을 갖는 성숙한 인간화된 항체를 생성하였다.
6 종의 친화도-성숙된 인간화된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열의 패널을 짝을 맞추고 (APE1922, APE1923, APE1924, APE1950, APE1963 및 APE2058로 표시됨) 특징화하기 위해 선별하였고, 이를 표 1에 제시하였다. 이 항체 서열들 각각의 PD-1 결합 특성을 표면 플라스몬 공명 (surface plasmon resonance: SPR) 및 용액 기반-친화도 분석법을 이용하여 분석하였다. 항체를 인간 IgG1 항체로서 HEK 293 세포에서 발현시켰고 참조 항체인, BMS로 명명된, BMS-936558의 인간 IgG1 버전과 비교하였다.
SPR 분석법은 BIACORE™ T200 기기를 이용하여 수행하였고, 동력학적 상수는 BIACORE™ T200 평가 소프트웨어를 이용하여 결정하였다. 실험적 파라미터는 포화도가 가장 높은 항원 농도에 도달할 것이고 R최대 값이 30 RU 아래로 유지될 것을 보장하도록 선택하였다. GE 항-인간 IgG (Fc-특이적, 약 7,000 RU)를 EDC-활성화된 아민 커플링 화학법을 이용하여 BIACORE™ CM5 칩에 고정하였다. 항체 (0.5 ㎍/mL, 60 초 포획 시간)를 그 후 이 표면을 이용하여 포획하였다. 그 다음, 단량체의 가용성 인간 PD1-Avi-His을 500 nM로부터 2 nM까지의 3배 순차 희석 시리즈를 이용하여 포획된 항체 위로 흘려주었다 (300 초 결합, 300 초 해리). 포획된 항체 및 항원은 항원의 각 농도에 대한 신선한 결합 표면을 보장하기 위해 3 M MgCl2 (60 초 접촉 시간)을 이용하여 각 사이클 사이에 제거되었다. 결과로 얻은 센소그램을 온- 및 오프-속도 (각각, ka 및 kd), 뿐만 아니라 친화도 (KD)를 산출하기 위해 1:1 결합 모델을 이용하여 전반적으로 피팅(fit)하였다.
용액-기반 친화도 분석법은 KINEXA™ 3000 분석 (Sapidyne Instruments, Boise, Idaho)을 이용하여 수행하였고, KINEXA™ Pro Software 3.2.6를 이용하여 결과를 분석하였다. 완충액 단독의 비특이적 결합 신호를 최대 신호의 10% 미만으로 한정하면서, 실험적 파라미터는 0.8 내지 1.2 V의 항체 단독의 최대 신호에 도달하도록 선별하였다. 아즐락톤 (Azlactone) 비드 (50 mg)를 50 mM Na2CO3 중 PD-1-Avi-His (1 mL 중 50 ㎍/mL)의 용액에 희석시킴으로써 항원으로 코팅하였다. 상기 용액을 실온에서 2 시간 동안 회전시키고, 비드를 피코퓨즈 (picofuge)에서 펠렛으로 만들고 블로킹 용액 (10 mg/mL BSA, 1 M Tris-HCl, pH 8.0)으로 2회 세척하였다. 비드를 블로킹 용액 (1 mL)에 현탁시키고, 실온에서 1 시간 동안 회전시키고, 및 25 부피의 PBS/0.02% NaN3에 희석시켰다. 친화도 측정을 위한, 2차 항체는 ALEXFLUOR™ 647 염료-항-인간 IgG (500 ng/mL)였다. 시료 항체 농도는 일정하게 두고 (50 pM 또는 75 pM), 반면에 항원 PD1-Avi-His은 1 μM로부터 17 pM까지의 3배 희석 시리즈를 이용하여 적정하였다. 모든 시료는 PBS, 0.2% NaN3, 1 mg/mL BSA에서 희석하고 실온에서 30 시간 동안 평형화하게 하였다. 추가적으로, 항체만 및 완충액만 함유하는 시료는 각각 최대 신호 및 비특이적 결합 신호를 결정하기 위해 검사하였다. 친화도 분석법의 결과를 표 1에 제시한다. 선별된 항체 모두가 BMS 참조 항체보다 PD-1에 대해 더 높은 친화도를 보였고, 가장 높은 친화도 항체는 APE2058이다.
항체 V H 서열번호 V L 서열번호 BIACORE ™
k a ( Ms ) -1 		BIACORE ™
k d (s -1 ) 		BIACORE ™
K D ( nM ) 		KINEXA ™
K D ( nM )
BMS n/a n/a 8.8 x 104 2.1 x 10-3 23 2
APE1922 6 29 1.3 x 105 1.8 x 10-3 15 -
APE1923 7 29 1.9 x 105 1.7 x 10-3 9 1
APE1924 8 29 1.8 x 105 1.8 x 10-3 10 -1
APE1950 9 29 1.5 x 105 2.5 x 10-3 17 -
APE1963 10 29 5.8 x 104 1.0 x 10-3 17 -
APE2058 23 40 3.0 x 105 6.4 x 10-4 2 0.2
세포 표면 PD-1에 대한 상기 항체의 결합을 평가하기 위해, 인간 또는 시노몰구스 (cnyomolgus) 원숭이 PD-1 중 어느 하나를 발현하는 CHO 세포에 대한 결합을 상기 기재된 바와 같이 유세포 분석법에 의해 결정하였다. 또한, 상기 PD-1/PD-L1 상호작용의 차단은 상기 기재된 바와 같이 DyL650 표지된 PD-L1 (마우스 IgG1 Fc 융합 단백질) 및 PD-1-발현 CHO 세포를 이용하여 평가하였다. 세포-표면 PD-1에 대한 높은 결합 친화도가 검사된 모든 친화도-성숙된 항체 서열에서 인간의 3 내지 4배의 비율 (factor) 내에서 시노몰구스 원숭이 PD-1에 대한 반응성으로, 관찰되었다. 상기 PD-1/PD-L1 상호작용의 차단은 낮은 nM 범위에서의 IC50 값으로, 또한 검사된 친화도-성숙된 항체 서열 모두에서 효율적이었다. 이 결과들은 세포 표면 EC50 값뿐만 아니라 BIACORE™ 및 KINEXA™ 시스템에 의해 둘다 분석된 결합 친화도와 일치하였다.
선별된 항체의 열 안정성은 McConnell et al., Protein Eng . Des . Sel., 26: 151 (2013)에 기재된 바와 같은 열형광 (Thermofluor) 분석을 이용하여 평가하였다. 이 분석은 단백질이 접히지 않기 때문에 노출된 단백질 표면에서 소수성 패치에 결합하는 소수성 형광 염료의 능력을 통해 안정성을 평가한다. 50%의 단백질이 접히지 않는 온도를 열 안정성 (Tm)을 측정하여 결정하였다. 이 분석은 검사된 친화도-성숙된 항체 서열 모두가 높은 열 안정성을 갖고, 모두가 상기 참조 항체보다 더 안정하다는 것을 입증하였다. APE2058은 BMS-936558의 IgG1 버전의 Tm 보다 10℃ 넘게 더 큰 Tm을 나타내는, 가장 안정한 항체였다.
검사된 항체의 생체 내 약물동력학에 관련된 잠재적 문제들의 위험을 제거 (De-risking)하는 것은 (a) 표적 음성 세포에 대한 비-특이적 결합의 평가 (예를 들어, Hotzel et al., mAbs, 4: 753-760 (2012) 참조) 및 (b) 차등적인 신생아의 Fc 수용체 (FcRn) 해리 특성의 측정 (예를 들어, Wang et al., Drug Metab . Disp ., 39: 1469-1477 (2011) 참조)를 통해 착수하였다. 비-특이적 결합을 평가하기 위해, 항체는 유세포 분석-기반 분석을 이용하여 HEK 293f 세포에의 결합을 검사하였다.검사된 항체를 2종의 FDA-승인된 항체인, 인플리시맙 (infliximab)과 데노수맙 (denosumab)과 비교하였다. 그 결과는 비-특이적 결합이 항체 모두에 대해 낮았다는 것을 표시하였다. FcRn 결합 및 해리를 평가하기 위해, 인간 FcRn 및 시노몰구스 FcRn 둘다를 BIACORE™-기반 분석에서 검사하였다. 항체를 pH 6.0에서 FcRn에 결합시키고, 7.4으로 pH 조정 후, 잔여 결합된 항체를 결정하였다. 이 분석의 결과를 표 2에 나타낸다.
항체 pH 7.4에서 잔여 결합 %
인간 FcRn 시노( Cyno ) FcRn
BMS 2.0 1.7
APE1922 2.7 2.9
APE1923 4.0 5.0
APE1924 3.6 4.0
APE1950 34.0 36.5
APE1963 9.0 11.9
APE2058 2.1 2.0
본 실시예의 결과는 열안정성 및 PD-1에 대해 높은 친화도를 보이는, 상기 창의적인 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 생산하는 방법을 입증한다.
실시예 4
이 실시예는 시험관 내에서 상기 창의적인 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 활성을 입증한다.
실시예 3에 기재된 VH 및 VL의 서열의 기능적 길항제 활성을 상기 기재된 바와 같이 인간 CD4+ T-세포 MLR 분석으로 검사하였다. 기능적 잠재력을 결정하기 위해, 각 항체의 EC50을 상이한 인간 공여자를 이용한 5회의 별개의 실험에서 결정하였다. 이 결과를 표 3에 나타내고, 이것은 참조 항체의 활성과 구분되지 않는, 각각의 선별된 항체에 대한 강력한 활성을 입증한다.
Figure 112015116638690-pct00001
본 실시예의 결과는 상기 창의적인 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드가 PD-1 신호전달을 길항하여, 증가된 T-세포 활성화를 초래할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 5
이 실시예는 상기 창의적인 PD-1 결합제와, 항-LAG-3 항체 또는 항-TIM-3 항체 중 어느 하나의 조합이 시험관 내에서 T-세포 활성화를 높인다는 것을 입증한다.
조합 연구에 대한 파라이터를 확립하기 위해, 상기 항-PD-1 항체 APE2058를 상기 기재된 인간 CD4+ T-세포 MLR 분석의 용량 반응에서 적정하였다. PD-1 신호전달의 길항작용은 증가된 T-세포 활성화 및 IL-2의 생성에서 상응하는 4- 내지 5-배 증가를 초래하였다.
다중의 MLR 분석에서 상기 APE2058 항체를 적정한 결과에 근거하여, 20 ng/mL의 EC50 값 및 약 EC10 값을 제시하는 10배 더 낮은 농도 (2 ng/mL)를 TIM-3 또는 LAG-3 체크포인트 분자에 대한 길항제 항체와의 조합 연구를 위해 선별하였다.
완전 인간 항-TIM-3 항체는 낮은 수준의 항-CD3 및 항-CD28 항체의 존재에서 증가된 IL-2 생성에 의해 측정었기 때문에 길항제 활성을 갖는 것으로 CD4+ T 세포 시험관 내 분석에서 특징화되었다. 상기 항-TIM-3 항체는 도 2 및 표 4에 나타난 바와 같이, 약 0.3 ㎍/mL의 EC50 수치를 갖는 MLR 분석에서의 활성을 입증하였고, 이것은 항-PD-1 APE2058 항체 단독 (EC50 약 0.02 ㎍/mL) 보다 약 15배 낮은 활성이다. 0.02 ㎍/mL의 APE2058와 조합에서, 상기 항-TIM-3 길항제 항체는 APE2058 또는 항-TIM-3 단독과 비교하여 증가된 양의 IL-2 생성을 자극하여, 도 2 및 표 4에 나타난 바와 같이, EC50 수치의 10배 감소를 초래하였다. 이 결과는 높아진 T-세포 활성화가 PD-1과 TIM-3 체크포인트 경로의 조합 저해로 일어난다는 것을 증명한다.
완전 인간 길항제 항-LAG-3 항체 (미국 특허 공개 2011/0150892에 기재됨)는 MHC 종류 II 양성 세포에서 재조합 가용성 LAG-3의 결합을 차단하는 강력한 활성을 입증하였다. 본 명세서에서 APE03109로 명명된, 이 항체를 인간 CD4+ T-세포 MLR 분석에서 기능적 활성에 대해 평가하였다. APE03109는 도 3 및 표 4에 나타난 바와 같이, 약 0.05 ㎍/mL의 EC50 값을 갖는 MLR에서의 활성을 입증하였고, 이것은 항-PD-1 항체 단독의 활성과 유사하였다. 0.02 ㎍/mL의 항-PD-1 APE2058 항체와 조합에서, 상기 APE03109 항체는 APE2058 또는 APE03109 단독에 비해 증가된 양의 IL-2 생성을 자극하여, EC50 값의 5배 감소를 초래하였다.
항-LAG-3 APE03109 항체 단독 및 APE2058과 APE03109의 조합으로의 IL-2 생성의 시간 경과를 또한 인간 CD4+ MLR 분석에서 특징화하였다. 0.02 ㎍/mL APE2058과 APE03109의 조합에 대한 EC50 값의 유사한 감소가 도 3에 나타난 바와 같이, 배양 72 시간 후 관찰되었다. 배양 96 시간 후 EC50 값의 차이는 선언되지 않았지만; 그러나, 0.02 ㎍/mL의 항-PD-1 APE2058 항체 및 항-LAG-3 APE03109 항체로 처리된 배양에서 생성된 IL-2의 수준은 APE03109 단독으로 처리된 배양과 비교하여 거의 두배였다 (2,200 pg/mL 대 1,200 pg/mL). LAG-3 발현의 시간 경과와 일치하게, APE03109를 APE2058에 가한 것으로부터의 증가된 IL-2 생성은 24 시간 후 관찰되지 않았지만, APE2058 단독은 이 시간에 IL-2 생성에서 용량 반응적 증가를 생성하였다. 별개의 MLR 실험에서 APE2058과 APE03109의 조합이 48 시간 후 50% 넘게 T-세포 시토킨 IFN-γ의 생성의 수준을 높였다는 것이 또한 입증되었다.
CD4+ T-세포 MLR에서 항-TIM-3 항체 또는 항-LAG-3 항체의 조합된 효과가 표적 특이성 때문임을 입증하기 위해, 관계없는 인간 IgG1 항체인, APE0422를 0.02 ㎍/mL 항-PD-1 항체 APE2058와 조합하여 검사하였다. 검사된 가장 높은 농도에서 (30 ㎍/mL), 상기 APE0422 항체는 항-PD-1 단독에 비해 IL-2 생성에 효과가 없음을 보였다.
항체 MLR 분석 EC50
단일 작용제		 MLR 분석 EC50
2 ng/mL 항-PD-1과 함께		 MLR 분석 EC50
20 ng/mL 항-PD-1과 함께		 향상 배수
항-TIM-3 330 ng/mL 310 ng/mL 33 ng/mL 10
항-LAG-3 53 ng/mL 44 ng/mL 11 ng/mL 4.8
본 실시예의 결과는 TIM-3 또는 LAG-3에 대한 길항성 항체와 조합된 상기 창의적인 PD-1-결합제가 시험관 내에서 CD4+ T-세포 활성화를 높인다는 것을 입증한다.
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tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agttataccc tgtcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtc attagtagtg gtggtgatta cgcctactat 180 ccagacagtg tgcagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcac 300 tacggtacta gtcactttgc ttactggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcctcagca 360 tc 362 <210> 44 <211> 362 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 44 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agttatacca tgtcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtc attagtagtg gtggtgattc cgcctactat 180 ccagacagtg tgcagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagagcac 300 tacggtacta gtcactttgc ttactggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcctcagca 360 tc 362 <210> 45 <211> 362 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 45 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agttatacca tgtcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtc attagtagtg gtggtaattc cgcctactat 180 ccagacagtg tgcagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagagcac 300 tacggtacta gtcactttgc ttactggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcctcagca 360 tc 362 <210> 46 <211> 362 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 46 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agttatacca tgtcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtc attagtagtg gtggtaatta cgcctactat 180 ccagacagtg tgcagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagagcac 300 tacggtacta gtcactttgc ttactggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcctcagca 360 tc 362 <210> 47 <211> 362 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 47 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agttatacca tgtcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtc attagtagtg gtggtgattc cacctactat 180 ccagacagtg tgcagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagagcac 300 tacggtacta gtcactttgc ttactggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcctcagca 360 tc 362 <210> 48 <211> 362 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 48 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agttatacca tgtcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtc attagtagtg gtggtaattc cgcctactat 180 ccagacagtg tgcagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagagtac 300 tacggttcta gtcactttgc ttactggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcctcagca 360 tc 362 <210> 49 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 49 gacgtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaagtc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatacca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcagtc attagtagtg gtggtaattc cacctactat 180 ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtac aagagagcac 300 tacggtagta gtcactttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagcc 360 360 <210> 50 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 50 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatacca tgtcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtc attagtagtg gtggtaattc cacctactat 180 ccagacagtg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagagcac 300 tacggtagta gtcactttgc ttactggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcctcagca 360 360 <210> 51 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 51 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctataccc tgtcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtc attagtagtg gtggtaatta cgcctactat 180 ccagacagtg tgcagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagagcac 300 tacggtacta gtcactttgc ttactggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcctcagca 360 360 <210> 52 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 52 gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgaca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtggtg gtggtagtta cacctactat 180 caagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc ctccccttac 300 tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctcagc a 351 <210> 53 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 53 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgaca tgtcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaacc attagtggtg gtggtagtta cacctactat 180 caagacagtg tgaaggggcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gtccccttac 300 tatgctatgg actactgggg gcaagggacc acggtcaccg tctcctcagc a 351 <210> 54 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 54 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgaca tgtcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaacc attagtggtg gtggtagtta cacctactat 180 caagacagtg tgaaggggcg gttcatcatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gtccccttac 300 tatgctatgg actactgggg gcaagggacc acggtcaccg tctcctcagc a 351 <210> 55 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 55 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgaca tgtcttgggt ccgccgggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaacc attagtggtg gtggtagtta cacctactat 180 caagacagtg tgaaggggcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gtccccttac 300 tatgctatgg actactgggg gcaagggacc acggtcaccg tctcctcagc a 351 <210> 56 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 56 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atctcctgca gagccagcga aagtgttgat aattttggca ttagttttat gagctggttc 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa cccaggatcc 180 ggggtccctg ccaggtttag tggcagtgta tctgggacag acttcagcct caacatccat 240 cctatggagg aggatgatgc tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtac 300 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacgg 336 <210> 57 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 57 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gagccagcga aagtgttgat aattttggca ttagttttat gagctggtac 120 caacagaaac ctggccaggc tcccaggctc ctcatctatg ctgcatccaa cccaggatcc 180 ggcatcccag ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcactct caccatcagc 240 agcctagagc ctgaagattt tgcagtttat tactgtcagc aaagtaagga ggttccgtac 300 acgtttggcc aggggaccaa gctggagatc aaacgg 336 <210> 58 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 58 gacattgtgc tgacccaatc tccagattct ttggctgtgt ctctagggct gagggccacc 60 atctcctgca gagccagcga aagtgttgat aaatatggca ttagttttat gagctggttc 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa ccaaggatcc 180 ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240 cctatggagg aggatgatac tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtac 300 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacgg 336 <210> 59 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 59 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca gagccagcga aagtgttgat aaatatggca ttagttttat gagctggtac 120 cagcagaaac caggacagcc tcctaagctg ctcatttacg ctgcatccaa ccaaggatcc 180 ggggtccctg accgattcag tggcagcggg tctgggacag atttcactct caccatcagc 240 agcctgcagg ctgaagatgt ggcagtttat tactgtcagc aaagtaagga ggttccgtac 300 acgtttggcc aggggaccaa gctggagatc aaacgg 336 <210> 60 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 60 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca gagccagcga aagtgttgat aaatatggca ttacttttat gagctggtac 120 cagcagaaac caggacagcc tcctaagctg ctcatttacg ctgcatccaa ccaaggatcc 180 ggggtccctg accgattcag tggcagcggg tctgggacag atttcactct caccatcagc 240 agcctgcagg ctgaagatgt ggcagtttat tactgtcagc aaagtaagga ggttccgtac 300 acgtttggcc aggggaccaa gctggagatc aaacgg 336 <210> 61 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 61 gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60 atcacctgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120 gggcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tgtgcagtct 240 gaagacttgg cagattattt ctgtcagcat tatagcagct atccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaaac tggaaatcaa acgg 324 <210> 62 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 62 gacatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtatca gcaaaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattgg gcatccaccc ggcacactgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtcagcat tatagcagct atccgtggac gtttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa acgg 324 <210> 63 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 63 gacatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat atgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtatca gcaaaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattgg gcatccaccc tgcacactgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtcagcat tatagcagct atccgtggac gtttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa acgg 324 <210> 64 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 64 gacatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat atgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtatca gcaaaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattgg gcatccaccc ggcacactgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtcagcat tataacagct atccgtggac gtttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa acgg 324

Claims (52)

  1. 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1; 서열번호 36의 5번 잔기가 류신 (L) 잔기로 치환된 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2; 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 (VL) 영역; 및
    서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 (complementarity determining region: CDR) 1; 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2; 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 (VH) 영역을 포함하는, 예정된 사멸 1 (Programmed Death 1: PD-1) 결합제.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 VL 영역은 서열번호 40과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 VH 영역은 서열번호 23과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 PD-1 결합제.
  3. 서열번호 40과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 (VL) 영역으로서, 상기 VL 영역은 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 36의 5번 잔기가 류신 (L) 잔기로 치환된 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는, 면역글로불린 경쇄 가변 (VL) 영역; 및
    서열번호 23과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 (VH) 영역으로서, 상기 VH 영역은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는, 면역글로불린 경쇄 가변 (VL) 영역을
    포함하는 예정된 사멸 1 (PD-1) 결합제.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 VL 영역은 서열번호 40과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 PD-1 결합제.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 23과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 PD-1 결합제.
  6. 청구항 4 또는 5에 있어서, 서열번호 40의 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2, 및 경쇄 CDR3; 및 서열번호 23의 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 및 중쇄 CDR3을 포함하는 것인 PD-1 결합제.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 VL 영역은 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 것인 PD-1 결합제.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 것인 PD-1 결합제.
  9. 청구항 7 또는 8에 있어서, 상기 VL 영역은 서열번호 40을 포함하고, 상기 VH 영역은 서열번호 23을 포함하는 것인 PD-1 결합제.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 PD-1 결합제는 항체 또는 항원-결합 항체 단편인 것인 PD-1 결합제.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 PD-1 결합제는 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 중쇄 불변 영역 (Fc)을 포함하는 것인 PD-1 결합제.
  12. 청구항 1의 중쇄 면역글로불린 폴리펩티드 또는 경쇄 면역글로불린 폴리펩티드를 암호화하는 핵산.
  13. 청구항 1의 중쇄 면역글로불린 폴리펩티드 및 경쇄 면역글로불린 폴리펩티드를 암호화하는 핵산.
  14. 청구항 1의 PD-1 결합제를 암호화하는 핵산.
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 PD-1 결합제는 서열번호 23을 포함하는 중쇄 면역글로불린 폴리펩티드, 서열번호 40을 포함하는 경쇄 면역글로불린 폴리펩티드, 및 lgG4 중쇄 불변 영역 (Fc)을 포함하는 항체인 것인 PD-1 결합제.
  16. 청구항 12 내지 14 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  17. 청구항 16의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포인 것인 숙주 세포.
  19. 청구항 1 또는 15의 PD-1 결합제, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는, 면역 반응을 높이거나 또는 면역 세포의 활성을 증가시키기 위한 약학적 조성물.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 약학적 조성물은 비경구 투여를 위해 제제화되는 것인 약학적 조성물.
  21. 청구항 1 또는 15의 PD-1 결합제를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 시험관 내에서 상기 PD-1 결합제를 암호화하는 핵산을 세포에서 발현시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  22. 청구항 1 또는 15의 PD-1 결합제를 포함하는, 인간에서 암 치료용 약제로서 사용하기 위한 조성물.
  23. 청구항 1 또는 15의 PD-1 결합제를 포함하는, 감염 질환의 치료용 약제로서 사용하기 위한 조성물.
  24. 청구항 1 또는 15의 PD-1 결합제를 포함하는, 면역 반응을 높이거나 또는 면역 세포의 활성을 증가시키기 위한 약제로서 사용하기 위한 조성물.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 면역 반응 또는 활성은 세포-매개된 면역 반응인 것인 조성물.
  26. 청구항 24에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포인 것인 조성물.
  27. 청구항 24에 있어서, 상기 면역 반응 또는 활성은 T 세포 반응인 것인 조성물.
  28. 청구항 24에 있어서, 상기 면역 세포는 인간에 존재하는 것인 조성물.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 인간은 감염 질환을 갖는 것인 조성물.
  30. 청구항 28에 있어서, 상기 인간은 암을 갖는 것인 조성물.
  31. 청구항 22에 있어서, 상기 암은 PD-1 또는 PD-L1의 발현을 특징으로 하는 것인 조성물.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 암은 흑색종, 신장 세포암, 폐암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 담낭암, 후두암, 간암, 갑상선암, 위암, 침샘암, 전립선암, 췌장암, 및 메르켈 세포암(Merkel cell carcinoma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  33. 청구항 1 또는 15의 PD-1 결합제를 포함하는,
    항-TIM-3 결합제 또는 항-LAG-3 결합제와 조합하여, 면역 반응을 높이거나 또는 면역 세포의 활성을 증가시키기 위한 약제로서 사용하기 위한 조성물.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 항-TIM-3 결합제는 항체, 항체 접합체, 또는 그의 항원-결합 단편인 것인 조성물.
  35. 청구항 33에 있어서, 상기 항-LAG-3 결합제는 항체, 항체 접합체, 또는 그의 항원-결합 단편인 것인 조성물.
  36. 청구항 22에 있어서, 상기 PD-1 결합제의 반감기는 30분 내지 45일인 것인 조성물.
  37. 청구항 22에 있어서, 상기 PD-1 결합제는 1 피코몰(picomolar: pM) 내지 100 마이크로몰 (micromolar: μM)의 KD로 PD-1에 결합하는 것인 조성물.
  38. 청구항 1 또는 15의 PD-1 결합제를 생산하는 세포주.
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