KR101607715B1

KR101607715B1 - 면역 크로마토그래피법을 위한 전개액, 및 이를 이용한 측정 방법

Info

Publication number: KR101607715B1
Application number: KR1020107026706A
Authority: KR
Inventors: 다이수케 이토
Original assignee: 다나카 기킨조쿠 고교 가부시키가이샤
Priority date: 2008-07-14
Filing date: 2009-06-30
Publication date: 2016-03-30
Also published as: WO2010007734A1; EP2306194A1; CN102066932B; US20110097818A1; CN102066932A; JP2010019786A; EP2306194A4; KR20110033115A; EP2306194B1; JP4559510B2

Abstract

본 발명은 시료 중에 포함되는 피검출 물질 이외의 성분의 비특이적 흡착에 기인하는 의사 양성 반응을 억제하면서, 저농도의 피검출 물질이라도 충분히 검출할 수 있는 정확하고 고감도인 면역 크로마토그래피법에 이용되는 전개액을 제공하는 것이다. 본 발명은, 불용성 담체로 표지된 검출 시약을 이용하는 면역 크로마토그래피법에 있어서, 산소 원자 및 질소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머 및 비이온성 계면활성제를 함유하는 전개액에 관련된다.

Description

면역 크로마토그래피법을 위한 전개액, 및 이를 이용한 측정 방법{DEVELOPING SOLUTION FOR IMMUNOCHROMATOGRAPHY, AND MEASUREMENT METHOD USING SAME}

본 발명은, 면역 측정법의 하나인 면역 크로마토그래피법에 있어서 이동상을 구성하는 전개액에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 전개액을 이용하여 생체 시료 중에 포함되는 피검출 물질을 고감도로 검출할 수 있는 측정 방법에 관련된다.

항원과 이에 대한 항체에 의한 특이적 반응을 이용하여 특정의 항원 또는 항체로 이루어지는 피검출 물질을 검출하는 면역 측정법으로서, 시료 중의 피검출 물질과, 감작 처리에 의해 검출용 입자에 결합한 항체 또는 항원을 면역 반응에 의해 결합시키고, 이에 의해 발생되는 검출용 입자의 응집 상태를 측정하는 응집법이 간편한 방법으로 알려져 있으며, 특히 결과의 육안 판정이 가능하여 일반적으로 이용되고 있는 방법이다.

또한, 표지 물질에 의해 표지된 항체 또는 항원을 면역 반응에 의해 시료 중의 피검출 물질에 결합시키고, 이 결합 상태에 있는 표지 물질 등을 측정하는 방법도 알려져 있으며, 표지 물질로서 방사성 동위 원소를 이용하는 방사성 면역 측정법, 효소를 이용하는 효소 면역 측정법, 형광물질을 이용하는 형광 면역 측정법 등도 이용되고 있다.

이러한 면역 측정법에서는, 피검출 물질과 표지 물질에 의해 표지된 항체 등과의 반응 공정, 피검출 물질과 결합 상태에 있는 표지 물질과 결합 상태에 있지 않은 표지 물질과의 분리 공정이 필요한데, 이러한 공정을 크로마토그래피의 원리를 응용하여, 고정상과 이에 접하여 연속적으로 흐르는 이동상으로 이루어지는 계로 실시하는 방법으로서 면역 크로마토그래피법이 알려져 있다.

면역 측정의 형식에는, 샌드위치 형식 또는 경합 형식 등이 알려져 있는데, 전형적인 예로서 면역 크로마토그래피법에 의한 샌드위치 형식에서는, 예를 들어 시료 중의 항원으로 이루어지는 피검출 물질을 검출하는 경우, 다음과 같은 조작을 시행한다.

(1) 피검출 물질인 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 고정화 시약으로 하고, 이 고정화 시약을 크로마토그래피 매체의 소정 부위에 소정 형태로 도포하는 것 등에 의해, 크로마토그래피 매체의 임의 위치에 반응 부위를 형성한다.

(2) 한편, 피검출 물질과 특이적으로 결합하는 항체를 검출 시약으로 하고, 이 검출 시약을 효소 등의 표지 물질에 의해 표지한다, 또는, 검출 시약을 불용성 담체 등의 표지 물질로 감작하는 것에 의해, 표지된 검출 시약을 조제한다.

(3) 이동상을 구성하는 전개액을, 피검출 물질을 포함하는 시료 및 표지된 검출 시약과 함께 고정상인 크로마토그래피 매체 상에 전개시킨다.

이상의 조작에 의해, 크로마토그래피 매체에 형성된 반응 부위에서, 피검출 물질인 항원이 반응 부위에 고정된 고정화 시약인 항체와 결합하는 것에 의해 포착되는 동시에, 이 항원과 표지된 검출 시약인 항체에 의해 항원-항체 반응이 발생한 결과, 해당 반응 부위에서는 고정화 시약(고정된 항체) -피검출 물질(항원) -검출 시약(표지된 항체) 삼자의 샌드위치형 결합체가 생성하여, 시료 중에 피검출 물질이 존재할 경우 반응 부위에 간접적으로 표지 물질이 결합하는 것에 의해 소정의 신호가 나타나고, 이에 의해 피검출 물질의 검출을 실시할 수 있다.

이러한 면역 크로마토그래피법은 조작이 간편하고 단시간에 측정 가능하여, 임상 검사나 연구실에서 측정 시험 등으로 널리 이용되고 있다. 면역 크로마토그래피법의 표지 물질에는 일반적으로 효소 또는 불용성 담체가 이용되지만, 특별한 조작을 필요로 하지 않고 시각적으로 검출할 수 있는 불용성 담체(콜로이드상 금속 입자 또는 착색 라텍스 입자 등)를 표지 물질로 채용하는 것에 의해, 면역 크로마토그래피법의 특징인 간편한 검출 방법으로서의 이용가치가 한층 높아진다.

그러나, 불용성 담체를 표지 물질로 이용하여 검출 시약을 감작한 경우에는, 표지된 검출 시약이 응집하는 일 없이 크로마토그래피 매체 상을 확실히 전개 이동하여 반응 부위에 도달하는 것이 필요 불가결하다. 이를 위하여 면역 크로마토그래피법에서 전개액에는, 불용성 담체에 의해 표지된 검출 시약의 분산 상태를 안정화하기 위한 분산 안정제가 적량 첨가되어 있다. 이러한 분산 안정제로서는, 예를 들어 단백질, 다당류, 계면활성제 등이 이용되고 있고, 구체적으로는, 예를 들어 젤라틴, 카제인, 우혈청 알부민, 아라비아검, 덱스트란, 전분, 메틸 셀룰로오스, 폴리리진, 폴리프롤린, 폴리에틸렌글리콜 등이 알려져 있다. 그러나, 이러한 분산 안정제를 전개액에 첨가하면 통상 전개액의 점도가 증대하여, 전개 속도의 저하를 초래한다. 전개 속도의 저하는 측정 시간을 연장하고 측정 결과의 재현성을 저하할 뿐 아니라, 시료 중에 포함되는 피검출 물질 이외의 성분의 비특이적 흡착에 기인하는 의사 양성 반응도 일으킨다는 문제점이 있다.

또한, 불용성 담체를 표지 물질로 이용하는 경우에는, 효소를 표지 물질로 이용하는 경우에 비해 반응 부위에서 검출되는 신호가 약하다고 하는 문제점도 있다. 효소를 표지 물질로 이용하는 경우, 반응 부위에 효소 반응에 의해 생긴 불용성 물질이 축적되기 때문에 양성 신호의 증폭을 볼 수 있어 비교적 고감도의 측정이 가능해진다. 한편, 불용성 담체를 표지 물질로 이용하는 경우, 반응 부위에 포착된 불용성 담체의 수에 대응하는 양성 신호 밖에 얻지 못하고, 특히 체적이 작은 불용성 담체를 이용한 경우에는 이러한 문제점이 현저하다.

이러한 문제점과 관련하여, 전개액의 점성을 증대시키지 않는 분산 안정제로서 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머를 사용하는 것(예를 들어, 특허 문헌 1 참조), 피검출 물질 이외의 성분의 비특이적 흡착을 방지하기 위해, 피검출 물질을 포함한 시험액에 이온성 계면활성제 또는 글리신 유도체를 첨가하는 것(예를 들어, 특허 문헌 2 및 3 참조), 또는, 감도 증강제로서 포스포베타인 구조를 갖는 기를 측쇄로 갖는 폴리머를 사용하는 것(예를 들어, 특허 문헌 4 참조) 등이 제안되고 있다.

특허문헌 1: 일본 특개평5-133956호 공보 특허문헌 2: 일본 특개2005-291783호 공보 특허문헌 3: 일본 특개2005-291780호 공보 특허문헌 4: 일본 특개2003-344413호 공보

그러나, 어떠한 종래 기술에서도, 시료액 중에 포함되는 피검출 물질 이외의 성분이 비특이적으로 반응하는 것에 의한 의사 양성 반응을 억제하면서, 피검출 물질의 농도가 낮을 때에도 충분히 검출할 수 있는 고감도의 면역 크로마토그래피법으로서 만족할 수 있는 것은 없었다. 또한, 불용성 담체에 의해 표지된 검출 시약의 분산 상태를 충분히 높인 경우에는, 불용성 담체끼리 적정 거리를 유지하기 때문에 반응 부위에서 양성 신호의 증폭을 얻는 것은 불가능하여, 고감도의 측정 방법을 제공하는 것은 매우 곤란하였다.

본 발명자들은 예의 연구한 결과, 면역 크로마토그래피법을 이용한 피검출 물질의 측정에 있어서, 비닐계 수용성 폴리머 및 비이온성 계면활성제의 존재 하에 피검출 물질 및 불용성 담체로 표지된 검출 시약을 전개시키는 것에 의해, 비특이 반응을 억제하면서, 저농도의 피검출 물질이라도 고감도로 검출할 수 있음을 발견하여 본 발명의 완성에 이르렀다. 특히, 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 전개액으로 이동상을 구성하는 것에 의해, 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머 존재 하에서 적정 분산 상태에 있는 검출 시약을, 계면활성제가 결합 보조제로 되어 서로 끌어당겨 결합시키기 때문에, 반응 부위에 시각적으로 검출되는 양성 신호가 증폭되어 종래 달성할 수 없었던 신호 잡음비(S/N)를 얻는 것이 가능함을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 산소 원자 및 질소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머 및 비이온성 계면활성제를 포함하는, 면역 크로마토그래피법에 이용되는 전개액에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 전개액이 이동상을 구성하는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피법에 관한 것이다.

더욱이 본 발명은, 면역 크로마토그래피법에 있어서 크로마토그래피 매체, 및 상기 본 발명의 전개액을 포함하여 이루어지는 면역 크로마토그래피법에 의한 검출 키트에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 면역 크로마토그래피법에 있어서의 시료 희석액에 관한 것이다.

본 발명을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

(1) 산소 원자 및 질소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머 및 HLB 값이 13∼18인 비이온성 계면활성제를 포함하는, 불용성 담체로 표지된 검출 시약을 이용하는 면역 크로마토그래피법에 있어서의 전개액.

(2) 상기 불용성 담체가 콜로이드상 금속 입자인, 상기 (1)에 기재된 전개액.

(3) 상기 콜로이드상 금속 입자가 콜로이드상 금 입자인, 상기 (2)에 기재된 전개액.

(4) 이동상을 구성하는 전개액으로서 상기 (1)∼(3)의 어느 하나에 기재된 전개액을 사용하는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피법.

(5) 면역 크로마토그래피법에 있어서의 크로마토그래피 매체, 및 상기 (1)∼(3)의 어느 하나에 기재된 전개액을 포함하여 이루어지는 면역 크로마토그래피법에 따른 검출 키트.

(6) 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머 및 비이온성 계면활성제를 포함하는, 면역 크로마토그래피법에 있어서의 시료 희석액.

(7) 상기 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머가, 산소 원자 및 질소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머인, 상기 (6)에 기재된 시료 희석액.

(8) 비이온성 계면활성제가 HLB 값 13∼18인 비이온성 계면활성제인, 상기 (6) 또는 (7)에 기재된 시료 희석액.

본 발명에 따르면, 불용성 담체를 표지 물질로 이용한 면역 크로마토그래피법에 있어서, 시료 중에 포함되는 피검출 물질 이외의 성분의 비특이적 흡착에 기인하는 의사 양성 반응을 억제하면서, 저농도의 피검출 물질이라도 충분히 검출할 수 있는 정확하고 고감도인 면역 크로마토그래피법을 제공할 수 있다. 특히, 이동상인 전개액에 존재하는 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머가 불용성 담체로 표지된 검출 시약의 분산 상태의 안정성을 높이는 한편, 비이온성 계면활성제가 적절히 불용성 담체끼리 끌어당겨 결합시키는 것에 의해, 비특이적인 반응을 억제하면서 반응 부위에서 양성 신호의 증폭이 관찰된다. 이에 의해, 종래에는 달성할 수 없었던 신호 잡음비(S/N)를 얻는 것이 가능하다.

또한, 본 발명의 전개액은 전개액으로서 뿐만이 아니라 시료 희석액으로도 사용할 수 있어, 시료의 희석에 이용한 희석액을 그대로 면역 크로마토그래피법에서의 전개액으로 사용할 수 있다. 특히, 피검출 물질이 인플루엔자 바이러스 항원인 경우에는, 비강 또는 인두를 닦는 액 등의 시료 희석액으로 뿐만이 아니라, 바이러스 항원의 용해성이 우수한 피검출 물질을 포함하는 시료의 용해액으로 사용할 수 있다.

이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

크로마토그래피 매체

본 발명의 면역 크로마토그래피법에서 이용하는 크로마토그래피 매체는, 모세관 현상을 나타내는 미세 다공성 물질로 이루어지는 불활성의 것으로, 사용되는 검출 시약, 고정화 시약, 피검출 물질 등과 반응하지 않는 것이고, 단시간의 판정으로 충분한 감도를 얻을 수 있는 전개 속도를 갖는다면, 특히 그 소재가 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 크로마토그래피 매체로서는 실리카, 이산화티탄, 산화지르코늄, 세리아, 알루미나 등의 세라믹 미립자 또는 유기 고분자의 미립자, 폴리우레탄, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리염화비닐, 폴리불화비닐리덴, 나일론, 니트로셀룰로스 또는 초산셀룰로스 등의 셀룰로스 유도체 등으로 구성되는 섬유상 또는 부직섬유상 매트릭스, 막, 여과지, 유리 섬유 여과지, 직물(布), 면 등을 들 수 있다. 미립자는 그 자체가 다공성이 아니어도, 충전된 상태에서는 미립자 간에 공극이 생겨 크로마토그래피 매체로서 기능한다. 바람직한 것은 셀룰로스 유도체나 나일론의 막, 여과지, 유리 섬유 여과지 등이며, 보다 바람직한 것은 니트로셀룰로스 막, 혼합 니트로셀룰로스 에스테르(니트로셀룰로스와 초산셀룰로스의 혼합물) 막, 나일론 막, 여과지이다.

본 발명의 실시에 제공되는 크로마토그래피 매체의 형태 및 크기는 특히 제한되는 것이 아니고, 실제의 조작이라는 점 및 반응 결과의 관찰이라는 점에서 적절하다면 가능하다. 조작을 보다 간편하게 하기 위해서는, 반응 부위가 표면에 형성되어 있는 크로마토그래피 매체의 이면에, 플라스틱 등으로 이루어지는 지지체를 설치하는 것이 바람직하다. 이 지지체의 성상은 특히 제한되는 것은 아니지만, 육안 판정에 의해 측정 결과의 관찰을 실시하는 경우, 지지체는 표지 물질에 의해 초래되는 색채와 유사하지 않은 색채를 갖는 것이 바람직하고, 통상 무색 또는 백색인 것이 바람직하다.

반응 부위

본 발명에 있어서 이용되는 크로마토그래피 매체 상에는, 피검출 물질과 특이적으로 결합하는 물질, 예를 들어 항체가 고정화 시약으로서 임의의 위치에 고정된 반응 부위가 형성된다. 고정화 시약을 크로마토그래피 매체에 고정화하는 방법으로서는, 고정화 시약을 크로마토그래피 매체에 물리적 또는 화학적 수단에 의해 직접 고정화하는 방법과, 고정화 시약을 라텍스 입자 등의 미립자에 물리적 또는 화학적으로 결합하여, 이 미립자를 크로마토그래피 매체에 포착해 고정화하는 간접 고정화 방법이 있다.

직접적으로 고정화하는 방법으로서는, 물리적 흡착을 이용할 수도 있고 공유결합에 의할 수도 있다. 일반적으로 크로마토그래피프 매체가 니트로셀룰로스 막 또는 혼합 니트로셀룰로스 에스테르 막인 경우, 물리적 흡착을 실시할 수 있다. 공유결합에서 크로마토그래피 매체의 활성화에는 일반적으로 브롬화시안, 글루타르알데히드, 카보디이미드 등이 이용되며, 어느 방법이라도 이용할 수 있다. 간접적으로 고정화하는 방법으로는, 불용성 미립자에 고정화 시약을 결합한 후 크로마토그래피 매체에 고정화하는 방법이 있다. 불용성 미립자의 입경은 크로마토그래피 매체에 포착되지만 이동할 수 없는 크기의 것을 선택할 수 있고, 바람직한 것은 평균 입경 10 ㎛ 정도 이하의 미립자이다. 이러한 입자로서는 항원 항체 반응에 사용되는 것이 여러 가지 알려져 있으며, 본 발명에서도 이들 공지의 입자를 사용할 수 있다. 예를 들어, 폴리스티렌, 스티렌-부타디엔 공중합체, 스티렌-메타크릴산 공중합체, 폴리글리시딜메타크릴레이트, 아크롤레인-에틸렌글리콜디메타크릴레이트 공중합체 등 유화 중합법에 의해 얻을 수 있는 유기 고분자 라텍스 입자 등의 유기 고분자 물질의 미립자, 젤라틴, 벤토나이트, 아가로스, 가교 덱스트란 등의 미립자, 실리카, 실리카-알루미나, 알루미나 등의 무기 산화물이나, 무기 산화물에 실란 커플링 처리 등으로 관능기를 도입한 무기 입자 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, 감도 조정의 용이함 등으로 인해 직접 고정화하는 것이 바람직하다. 또한, 크로마토그래피 매체로의 고정화 시약의 고정화에는, 여러 가지 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어 마이크로시린지, 조절 펌프 부착 펜, 잉크 분사 인쇄 등, 여러 가지 기술이 사용 가능하다. 반응 부위의 형태는 특히 한정되지는 않지만, 원형의 점, 크로마토그래피 매체의 전개 방향으로 수직으로 뻗는 라인, 숫자, 문자나 ＋, － 등의 기호 등으로 고정화할 수도 있다.

고정화 시약을 고정화한 후, 비특이적인 흡착에 의해 분석의 정도가 저하하는 것을 방지하기 위해, 필요에 따라, 크로마토그래피 매체에 공지의 방법으로 블로킹 처리를 실시할 수 있다. 일반적으로 블로킹 처리에는 소혈청 알부민, 탈지우유, 카제인, 젤라틴 등의 단백질이 바람직하게 이용된다. 블로킹 처리 후, 필요에 따라, 트윈 20, 트리톤-X100, SDS 등의 계면활성제를 1 또는 2 이상 조합하여 세정할 수도 있다.

그밖에, 크로마토그래피 매체에는, 필요에 따라 피검출 물질을 포함하는 시료를 첨가하기 위한 시료 첨가 부위(샘플 패드 등), 시료 중 혈구 등의 고형 성분을 제거한 부위(혈구 분리 부위 등), 전개액을 첨가하기 위한 전개액 첨가 부위, 반응 부위에 포획되지 않았던 피검출 물질이나 전개액을 빨아 들이는 흡수 부위(흡수 패드 등), 측정이 정상적으로 행해진 것을 보여주는 대조 부위 등을 첨가할 수 있다. 이러한 부위의 재료는, 모세관 현상에 의해 시료액이나 전개액이 이동 가능하다면 특히 한정되지 않으며, 일반적으로는 니트로셀룰로스 막, 여과지, 유리 섬유 여과지 등의 복수의 다공성 물질로부터 그 목적에 따른 것을 선택하여 이용함으로써, 고정화 시약이 고정화된 크로마토그래피 매체와 모세관으로 연결되도록 배치할 수 있다.

표지 물질

본 발명에서 이용되는 검출 시약은, 피검출 물질과 특이적으로 결합하는 물질, 예를 들어 항체이고, 표지 물질에 의해 표지된다. 면역 크로마토그래피법에 있어서 검출 시약의 표지에는 일반적으로 효소 등도 사용되지만, 피검출 물질의 존재를 육안으로 판정하는 데 적합하다는 것으로부터, 본 발명의 표지 물질로서는 불용성 담체가 이용된다. 본 발명에서는, 검출 시약을 불용성 담체로 감작하는 것에 의해 표지된 검출 시약을 조제한다.

본 발명에서 이용되는 표지 물질로서의 불용성 담체에는, 금, 은, 백금과 같은 콜로이드상 금속 입자, 산화철과 같은 콜로이드상 금속 산화물 입자, 유황 등의 콜로이드상 비금속 입자 및 합성 고분자로 이루어지는 라텍스 입자 등을 이용할 수 있다.

불용성 담체는, 피검출 물질의 존재를 시각적으로 판정하는 데 적합한 표지 물질로, 육안에 의한 판정을 용이하게 하기 위해서는 유색인 것이 바람직하다. 콜로이드상 금속 입자 및 콜로이드상 금속 산화물 입자는, 그 자체가 입경에 따른 특정의 자연색을 나타내는 것으로, 그 색채를 표지로서 이용할 수 있다. 합성 고분자로 이루어지는 라텍스 입자는 자연 상태에서 백색이기 때문에 그대로는 표지 물질로 사용할 수 없지만, 예를 들어 유용성 염료에 의해, 특히 수계 매체 중의 라텍스 입자를 유용성 염료의 유성 유기 용제에 의한 용액의 에멀젼에 의해 염색하는 것에 의해, 원하는 색채를 원하는 농도로 갖게 할 수 있다.

본 발명에 있어서 표지 물질로서 이용할 수 있는 라텍스 입자는 여러 가지 모노머를 중합 또는 공중합 시키는 것에 의해서 얻을 수 있다. 여기에서 모노머로서는, 예를 들어 스티렌, 클로로스티렌,α-메틸스티렌, 디비닐벤젠, 비닐톨루엔 등의 중합성 불포화 방향족류, 예를 들어 (메타)아크릴산, 이타콘산, 말레인산, 푸마르산 등의 중합성 불포화 카르본산류, 예를 들어 (메타)아크릴산메틸, (메타)아크릴산에틸, (메타)아크릴산-n-부틸, (메타)아크릴산-2-히드록시에틸, (메타)아크릴산글리시딜, 에틸렌글리콜-디-(메타)아크릴산에스테르, (메타)아크릴산트리브로모페닐 등의 중합성 불포화 카르본산 에스테르류, (메타)아크릴로니트릴, (메타)아크롤레인, (메타)아크릴아미드, N-메틸올-(메타)아크릴아미드, 메틸렌비스(메타)아크릴아미드, 부타디엔, 이소프렌, 초산비닐, 비닐피리딘, N-비닐피롤리돈, 염화비닐, 염화비닐리덴, 브롬화비닐 등의 불포화 카르본산 아미드류, 중합성 불포화 니트릴류, 할로겐화 비닐류, 공역 디엔류 등을 들 수 있다. 이러한 모노머는 표지 물질로서 요구되는 표면 특성, 비중 등에 의하여 적의 선택되어 1종을 단독으로, 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 표지 물질로서 특히 바람직한 라텍스 입자로서는, 예를 들어 스티렌과 메타크릴산의 공중합체, 스티렌과 이타콘산의 공중합체 등을 들 수 있다. 이러한 공중합체를 얻기 위한 중합 반응을 위한 중합 개시제로서는, 과황산염 등을 이용할 수 있다. 표지 물질로서 사용되는 라텍스 입자의 평균 입경은 50∼500 ㎚ 범위 내인 것이 바람직하다.

한편, 본 발명에서 표지 물질로 이용할 수 있는 콜로이드상 금속 입자 및 콜로이드상 금속 산화물 입자에는, 예를 들어 콜로이드상 금 입자, 콜로이드상 은 입자, 콜로이드상 백금 입자, 콜로이드상 산화철 입자, 콜로이드상 수산화알루미늄 입자 등을 들 수 있다. 특히, 콜로이드상 금 입자와 콜로이드상 은 입자가 적절한 입경에서, 콜로이드상 금 입자는 적색, 콜로이드상 은 입자는 황색을 나타낸다는 점에서 바람직하다. 이러한 콜로이드상 금속 입자의 평균 입경은 1∼500 ㎚, 특히 강한 색조를 얻을 수 있는 10 ㎚∼150 ㎚, 더욱 바람직하게는 20∼100 ㎚ 범위 내의 것이 더욱 바람직하다.

이들 불용성 담체에 있어서는, 라텍스 입자 또는 콜로이드상 금속 입자의 어느 것이라도 그 표면이 음으로 하전되어 있는 것이 알려져 있다(예를 들어, 특개평5-133956호 공보 참조). 예를 들어, 콜로이드상 금속 입자에는, 그 제조 과정에서 첨가되는 환원제 유래의 음이온이 그 표면에 흡착되어 있어, 상호 응집을 방해할 수 있어 분산한 상태를 유지하고 있다. 그리고, 이 상태의 콜로이드상 금속 입자에, 표면 전하를 중화하지 않는 정도의 저농도 계면활성제를 첨가하면, 입자가 사슬 상으로 몇 개 정도 응집하는 것이 알려져 있다(특개 2006-58781호 공보). 이와 같이, 본 발명의 면역 크로마토그래피법에 있어서, 이동상을 구성하는 전개액에 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머 및 비이온성 계면활성제를 첨가하면, 크로마토그래피 매체 상의 반응 부위에 포착된 불용성 담체가 몇 개 정도 응집하는 것에 의해, 반응 부위에서 관찰되는 양성 신호의 증폭을 볼 수 있는 것으로 추정된다. 특히, 콜로이드상 금속 입자에 있어서는, 응집에 의해서 반응 부위에 축적하는 입자의 수가 증가하는 것에 의해, 육안 판정되는 신호량이 증가할 뿐만 아니라, 입자의 광흡수 스펙트럼 특성이 변화함으로써, 반응 부위에서 더욱 명료한 양성 신호를 얻는 것이 가능한 것으로 추정된다. 이와 같은 이점을 갖는다는 점에서, 콜로이드상 귀금속 입자, 특히 콜로이드상 금 입자는 본 발명의 표지 물질로서 바람직한 것이다.

콜로이드상 금속 입자로서, 예를 들어 콜로이드상 금 입자를 이용하는 경우에는 시판되는 것을 이용할 수 있다. 또는, 상법, 예를 들어 염화금산을 구연산나트륨으로 환원하는 방법에 의해 콜로이드상 금 입자를 조제할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 검출 시약을 콜로이드상 금속 입자로 감작하는 방법으로는 물리적 흡착이나 화학적 결합 등 공지의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 콜로이드상 금 입자로 항체를 감작한 검출 시약은, 금 입자가 콜로이드상에 분산된 용액에 항체를 가하여 물리적 흡착시킨 후, 우혈청 알부민 용액을 첨가하여 항체가 미결합인 입자 표면을 블로킹하는 것에 의해 조제한다.

실제의 면역 크로마토그래피법의 실시에 있어서, 불용성 담체에 의해 표지된 검출 시약은, 이동상을 구성하는 전개액에 분산해 적용할 수도 있고, 고정상을 구성하는 크로마토그래피 매체에 있어서 이동상의 전개 이동 경로상, 즉 크로마토그래피 매체의 이동상이 적용되는 단부와 반응 부위 사이의 영역에 존재시켜 적용할 수도 있다. 크로마토그래피 매체 상에 존재시키는 경우, 검출 시약이 전개액에 신속하게 용해하여 모세관 작용에 의하여 자유롭게 이동할 수 있도록 검출 시약을 지지시키는 것이 바람직하다. 지지시키는 부위로는, 검출 시약이 감작된 불용성 담체의 재용해성을 양호하게 하기 위해 사카로스, 말토스, 락토스 등의 당류, 만니톨 등의 당 알코올을 첨가하여 도포하거나, 이러한 물질을 미리 코팅해 둘 수도 있다. 검출 시약을 도포·건조 등에 의해 크로마토그래피 매체 상에 존재시키는 경우, 고정화 시약이 고정화된 크로마토그래피 매체에 직접, 도포·건조 등을 할 수도 있고, 다른 다공성 물질, 예를 들어 셀룰로스 여과지, 유리 섬유 여과지, 나일론 부직포에 도포·건조 등을 하여 검출 시약 보관 유지 부재를 형성한 후, 고정화 시약이 고정된 크로마토그래피 매체와 모세관으로 연결되도록 배치할 수도 있다.

피검출 물질

본 발명의 방법에 의해 검출되는 피검출 물질로는, 이에 특이적으로 결합하는 물질이 존재하는 것이라면 특히 한정되지 않으며, 단백질, 펩티드, 핵산, 당(특히, 당단백질의 당 부분, 당지질의 당 부분 등), 복합 당질 등을 예시할 수 있다. 본 발명에 있어서 「특이적으로 결합한다」라는 것은, 생체 분자가 갖는 친화력에 근거하여 결합하는 것을 의미한다. 이러한 친화력에 근거하는 결합으로서는, 항원과 항체의 결합, 당과 렉틴의 결합, 호르몬과 수용체의 결합, 효소와 저해제의 결합, 상보적 핵산끼리 및 핵산과 핵산 결합 단백질의 결합 등을 들 수 있다. 따라서, 피검출 물질이 항원성을 갖는 경우, 피검출 물질에 특이적으로 결합하는 물질로서는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 예시할 수 있다. 또, 피검출 물질이 당인 경우, 피검출 물질에 특이적으로 결합하는 물질로서는 렉틴 단백질을 예시할 수도 있다. 구체적인 피검출 물질로서는, 예를 들어 암태아성 항원(CEA), HER2 단백, 전립선 특이 항원(PSA), CA19-9, α-페토프로테인(AFP), 면역억제 산성 단백(IAP), CA15-3, CA125, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 변 잠혈, 트로포닌 I, 트로포닌 T, CK-MB, CRP, 인간 융모성 고나드트로핀(HCG), 황체 형성 호르몬(LH), 난포 자극 호르몬(FSH), 매독 항체, 인플루엔자 바이러스, 인간 헤모글로빈, 클라미디아 항원, A군 β용련균 항원, HBs 항체, HBs 항원, 로타 바이러스, 아데노 바이러스, 알부민, 당화 알부민 등을 들 수 있으나, 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 이들 중에서도 비이온성 계면활성제에 의해 가용화되는 항원이 바람직하고, 바이러스 핵단백질과 같이 자기 집합체를 형성하는 항원이 더욱 바람직하다.

상기 피검출 물질을 포함하는 시료로서는, 예를 들어 생체 시료, 즉, 전혈, 혈청, 혈장, 뇨, 타액, 객담, 비강 또는 인두 세척액, 골수액, 양수, 유두 분비액, 눈물, 땀, 피부로부터의 침출액, 조직이나 세포 및 변으로부터의 추출액 등을 들 수 있다. 이러한 시료는, 필요에 따라 피검출 물질과 검출 시약 또는 고정화 시약이 특이적인 결합 반응을 일으키기 쉬운 상태로 처리를 한다. 처리 방법은 산, 염기, 계면활성제 등의 각종 화학 약품 등을 이용한 화학적 처리 방법, 가열, 교반, 초음파 등을 이용한 물리적 처리 방법의 어느 것이라도 가능하며, 또한 양쪽 방법을 사용할 수도 있다. 특히, 인플루엔자 바이러스 NP 항원 등 통상 표면에 노출되어 있지 않은 영역을 이용하여 피검출 물질과 검출 시약 또는 고정화 시약의 결합 반응을 실시하는 경우에는, 계면활성제 등에 의한 처리를 실시하는 것이 바람직하다. 이러한 목적에 사용되는 계면활성제로서는, 특이적인 결합 반응, 예를 들어, 항원 항체 반응에 미치는 영향을 고려하여 비이온성 계면활성제를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 이들의 시료는, 필요에 따라 고정상인 크로마토그래피 매체에서 전개 가능하게 되도록 전개액으로 희석할 수도 있다.

실제의 면역 크로마토그래피법의 실시에 있어서, 반응 부위에 대한 시료의 적용은, 시료액을 크로마토그래피 매체 상에서 전개시켜 크로마토그래피적으로 이동시키는 것에 의하여 실시할 수 있다. 이 경우, 시료액의 전개는 이동상을 구성하는 전개액의 전개와 동시에 실시할 수도 있고, 또는 시료액을 앞서 전개하고, 그 후에 전개액을 전개할 수도 있다.

전개액

본 발명에서 이용되는 전개액은 면역 크로마토그래피법에 있어서 이동상을 구성하는 액체로, 고정상인 크로마토그래피 매체 상을 피검출 물질을 포함한 시료 및 표지된 검출 시약과 함께 이동한다.

또한, 본 발명의 전개액은 전개액으로서 뿐만 아니라 시료 희석액으로도 사용할 수 있어, 시료의 희석에 이용한 희석액을 그대로 면역 크로마토그래피법에서의 전개액으로 사용할 수 있다.

비닐계 수용성 폴리머

본 발명에서 이용되는 전개액은, 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머를 함유하는 점에 특징이 있다. 이러한 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머로서는, 비닐알코올, 비닐메틸에테르, (메타)아크릴산, 히드록시알킬(메타)아크릴레이트, (메타)아크릴아미드, 디메틸(메타)아크릴아미드, 비닐피롤리돈 등의 산소 원자 함유 극성기를 갖는 수용성 비닐계 모노머, 바람직하게는 산소 원자 및 질소 원자 함유 극성기를 갖는 수용성 비닐계 모노머, 더욱 바람직하게는 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비이온성 수용성 비닐계 모노머, 한층 더 바람직하게는 산소 원자 및 질소 원자 함유 극성기를 갖는 비이온성 수용성 비닐계 모노머의 이중 결합이 개열된 구조 단위를 갖는 폴리머를 들 수 있고, 특히 비닐피롤리돈의 이중 결합이 개열된 구조 단위를 갖는 폴리머가 바람직하다.

이러한 비닐계 수용성 폴리머는, 본 발명의 효과가 손상되지 않는 정도로, 초산비닐, 알킬(메타)아크릴레이트 등의 다른 비닐계 모노머가, 예를 들어 50 몰% 이하, 바람직하게는 30 몰% 이하, 특히 바람직하게는 15 몰% 이하의 비율로 공중합 된 것일 수 있다.

이들 비닐계 수용성 폴리머의 바람직한 구체적인 예로서는, 폴리비닐피롤리돈, 디메틸아크릴아미드/비닐피롤리돈 공중합체(디메틸아크릴아미드의 공중합 비율이 50 몰% 이하인 것), 비닐알코올/비닐피롤리돈 공중합체(비닐알코올의 공중합 비율이 50 몰% 이하인 것), 초산비닐/비닐피롤리돈 공중합체(초산비닐의 공중합 비율이 20 몰% 이하인 것) 등을 들 수 있다.

이들 비닐계 수용성 폴리머의 분자량은, 통상 1만∼100만, 특히 10만∼100만인 것이 바람직하고, 20만∼50만인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 전개액에서 해당 비닐계 수용성 폴리머의 농도는 0.01∼5.0 중량%인 것이 바람직하고, 0.1∼2.0 중량%인 것이 더욱 바람직하다.

비이온성 계면활성제

본 발명에 이용되는 전개액은, 상기 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머에 더하여 비이온성 계면활성제를 추가로 함유한다. 비이온성 계면활성제로서는, HLB 값이 10∼18, 한층 더 바람직하게는 HLB 값이 13∼18인 폴리옥시에틸렌계 계면활성제를 바람직하게 이용할 수 있다. 폴리옥시에틸렌계 계면활성제의 바람직한 예로서는, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르(상품명 「Tween」 시리즈), 폴리옥시에틸렌p-t-옥틸페닐에테르(상품명 「Triton」 시리즈), 폴리옥시에틸렌p-t-노닐페닐에테르(상품명 「Triton N」 시리즈) 등을 들 수 있으며, 보다 구체적으로 「Tween」 시리즈에서는, 특히 Tween 20(상품명, HLB 값 16.7), Tween 40(상품명, HLB 값 15.6), Tween 60(상품명, HLB 값 15.0), Tween 80(상품명, HLB 값 14.9), 「Triton」 시리즈에서는, 특히 Triton　X-100(상품명, HLB 값 13.5), Nonidet　P-40(상품명, HLB 값 13.1), Triton X-102(상품명, HLB 값 14.6), Triton X-165(상품명, HLB 값 15.8), Triton X-405(상품명, HLB 값 17.9), 「Triton N」 시리즈에서는, 특히 Triton N-101(상품명, HLB 값 13.5), Triton N-111(상품명, HLB 값 13.8), Triton N-150(상품명, HLB 값 15.0) 등을 들 수 있다. 비이온성 계면활성제는 단독으로도, 2종 이상을 혼합하여 이용할 수도 있다. 상기 비이온성 계면활성제의 함량은 특별히 한정되지는 않지만, 조성물 전체의 중량에 대해 0.01∼10 중량%의 범위, 바람직하게는 0.05∼5 중량%이다.

본 발명에서 이용되는 전개액은 통상 물을 용매로 하여, 상기의 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머 및 비이온성 계면활성제에 가하고, 완충제를 함유하는 것이 바람직하다. 완충제의 바람직한 예로서는, 인산염, 트리스히드록시메틸아미노메탄, 굳의 완충제 등을 들 수 있다. 또한, 이에 더하여 다른 성분으로서 소혈청 알부민(BSA) 등의 단백질 성분(함유량은 통상 0.01 중량%∼10 중량%)을 임의로 포함할 수도 있다.

본 발명의 한 태양으로서, 크로마토그래피 매체 상에서 이동상을 구성하는 전개액에, 미리 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머 및 비이온성 계면활성제를 첨가한 후, 전개액을 크로마토그래피 매체 상에서 전개시킬 수 있다.본 발명의 다른 태양으로서는, 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머 및 비이온성 계면활성제를, 고정상을 구성하는 크로마토그래피 매체에서 이동상의 전개 이동 경로상, 즉 크로마토그래피 매체의 이동상이 적용되는 단부와 반응 부위 사이의 영역에 존재하도록 하고, 전개액에 의해 이동상이 형성된 때에 용해시켜 첨가할 수도 있다. 또한, 본 발명의 다른 태양으로서는, 피검출 물질을 포함하는 시료액에 비이온성 계면활성제를 첨가하고 시료액의 전개를, 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머를 포함하는 용액의 전개와 동시에, 또는 선행하여 실시하는 것에 의해, 이동상의 전개 이동 경로 상에서 이동상을 구성하는 전개액에 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머 및 비이온성 계면활성제를 첨가할 수도 있다. 이 경우, 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머를 포함하는 용액은, 고정상을 이동하기 전에 비이온성 계면활성제를 함유하는 것일 필요는 없지만, 해당 비이온성 계면활성제를 함유하는 것일 수도 있다.

이하, 본 발명의 실시예에 대하여 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

1. 크로마토그래피 매체 상에서의 반응 부위의 제작

25×2.5 ㎝의 니트로셀룰로스 막(밀리포어사 제: HF120)에, 항체 도포기 (BioDot사 제)를 이용하여, 5 중량%의 이소프로필알코올을 포함하는 인산 완충액(pH 7.4)으로 1.0 ㎎/mL의 농도가 되도록 희석한 항인플루엔자 B 모노클로날 항체를 도포하고, 50 ℃에서 30분간 건조시켰다. 건조 후, 당해 니트로셀룰로스 막을, 0.5 중량%의 카제인(和光純藥工嶪社 제)을 포함하는 인산 완충액(pH 7.4) 200 mL에 30 ℃에서 30 분간 침지하여 블로킹을 실시하였다. 블로킹 후, 0.05 중량%의 Tween 20을 함유하는 세정액으로 세정하고, 실온에서 하룻밤 건조시켜 크로마토그래피 매체 상에 반응 부위를 제작하였다.

2. 표지 물질 용액의 제작

금 콜로이드 현탁액(田中貴金屬工嶪社 제: 평균 입자경 40 ㎚) 0.5 mL에, 인산 완충액(pH 7.4)으로 0.1 ㎎/mL의 농도가 되도록 희석한 항인플루엔자 B 모노클로날 항체를 0.1 mL 가하여 실온에서 10분간 정치하였다. 다음에, 10 중량%의 우혈청 알부민을 포함하는 인산 완충액(pH 7.4)을 0.1 mL 가하여 충분히 교반한 후, 8000×g에서 15분간 원심분리를 실시하였다. 상등액을 제거한 후, 1 중량%의 우혈청 알부민을 포함하는 인산 완충액(pH 7.4) 0.1 mL를 가하여 표지 물질 용액으로 하였다.

3. 크로마토그래피 매체의 제작

상기 제작한 표지 물질 용액을 유리 섬유제 패드에 균일하게 되도록 첨가한 후, 진공 건조기에서 건조시켜 검출 시약 보관 유지 부재로 하였다. 다음에, 배킹 시트로 이루어지는 기재에, 상기 조제한 크로마토그래피 매체, 검출 시약 보관 유지 부재, 시료를 첨가하는 부분에 이용하는 샘플 패드, 및 전개한 시료, 불용성 담체를 흡수하기 위한 흡수 패드를 접합하였다. 마지막으로, 재단기로 폭이 5 ㎜가 되도록 재단하여 크로마토그래피 매체를 제작하였다.

4. 측정

상기 제작한 크로마토그래피 매체를 이용하여, 이하의 방법으로 시료 중의 인플루엔자 B 바이러스의 존재 유무를 측정하였다. 즉, 0.5 중량% Tween 20, 0.6 중량% 폴리비닐피롤리돈(PVP) K-90(평균분자량 36만), 1.0 중량% 우혈청 알부민과 150 mM 염화나트륨을 포함하는 트리스 완충용액(pH 8.0)으로 이루어지는 전개액을 음성 검체시료로 하고, 여기에 불활성화 처리한 인플루엔자 B 바이러스를 가한 것을 양성 검체시료로 하여, 각각 150 μL를 크로마토그래피 매체의 샘플 패드 위에 놓고 전개시키고, 15 분 후에 육안으로 판정하였다. 반응 부위에서의 테스트 라인의 붉은 선을 매우 명확하게 확인할 수 있는 것을 「＋＋＋」, 붉은 선을 명확하게 확인할 수 있는 것을 「＋＋」, 붉은 선을 확인할 수 있는 것을 「＋」, 붉은 선은 확인할 수 있지만, 매우 색이 옅은 것을 「±」, 붉은 선을 확인할 수 없는 것을 「-」로 하였다. 표 1에 결과를 나타낸다.

비교예 1

실시예 1에서 제작한 크로마토그래피 매체를 이용하고, 전개액으로는 Tween 20을 포함하지 않는 것을 이용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 측정하였다. 표 1에 결과를 나타낸다. PVP　K-90 양을 2배로 하여도 동일한 결과를 얻을 수 있었다.

비교예 2

실시예 1에서 제작한 크로마토그래피 매체를 이용하고, 전개액으로는 PVP K-90을 포함하지 않는 것을 이용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 측정하였다. 표 1에 결과를 나타낸다. Tween 20 양을 2배로 하여도 동일한 결과를 얻을 수 있었다.

비교예 3

실시예 1에서 제작한 크로마토그래피 매체를 이용하고, 전개액으로는 Tween 20 및 PVP　K-90을 포함하지 않는 것을 이용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 측정하였다. 표 1에 결과를 나타낸다.

비교예 4

실시예 1에서 제작한 크로마토그래피 매체를 이용하고, 전개액으로는 PVP　K-90 대신 0.6 중량% 카복시메틸셀룰로스 나트륨(CMC·Na)(후르카사 제: 점도 400-1000 m㎩.s　2% in H₂O, 25 ℃)를 이용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 측정하였다. 표 1에 결과를 나타낸다.

실시예 2

실시예 1에서 제작한 크로마토그래피 매체를 이용하고, 전개액으로는 Tween 20 대신 0.3 중량% Triton　X-100을 이용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 측정하였다. 표 1에 결과를 나타낸다.

비교예 5

실시예 1에서 제작한 크로마토그래피 매체를 이용하고, 전개액으로는 PVP　K-90 대신 0.6 중량% 폴리에틸렌글리콜(PEG)(和光純藥工嶪社 제, 평균 분자량 2만)을, Tween 20 대신 0.3 중량% Triton　X-100을 이용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 측정하였다. 표 1에 결과를 나타낸다.

비교예 6

실시예 1에서 제작한 크로마토그래피 매체를 이용하고, 전개액으로는 Tween 20 대신 0.3 중량% 콜산나트륨을 이용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 측정하였다. 표 1에 결과를 나타낸다.

실시예 3

실시예 1에서 제작한 크로마토그래피 매체를 이용하고, 전개액으로는 0.5 중량% Tween 20 대신 0.05 중량% Tween 20 및 0.3 중량% Triton　X-100을 이용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 측정하였다. 표 1에 결과를 나타낸다.

블로킹 있음

	수용성 고분자	계면활성제	인플루엔자 B 바이러스 유래의 당해 단백 농도(ng/mL)	S/N
	수용성 고분자	계면활성제	0 5 10 50	S/N
실시예 1	PVP	Tween 20	－＋＋＋＋＋	＋＋＋
비교예 1	PVP	없음	－－ ± ＋＋	＋＋
비교예 2	없음	Tween 20	－－ ± ＋＋	＋＋
비교예 3	없음	없음	－－－＋	＋
비교예 4	CMC·Na	Tween 20	＋＋＋＋＋＋＋＋＋	＋
실시예 2	PVP	Triton X-100	－＋＋＋＋＋	＋＋＋
비교예 5	PEG	Triton X-100	＋＋＋＋＋＋＋＋＋	＋
비교예 6	PVP	콜산Na	－－ ± ＋	＋
실시예 3	PVP	Tween 20+Triton X-100	－＋＋＋＋＋＋	＋＋＋

상기 실시예 1∼3을 비교예 1∼3과 비교하면, 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머인 PVP 및 비이온성 계면활성제의 존재 하에서, 인플루엔자 B 바이러스 유래의 핵단백질이 고감도로 검출 가능한 것이 분명해졌다. 한편, 카복시메틸셀룰로스 나트륨(CMC·Na) 또는 폴리에틸렌글리콜을 수용성 폴리머로 이용했을 경우에는 음성 검체 시료에 대해도 비특이적 흡착을 볼 수 있었다(비교예 4 및 5).이온성 계면활성제인 콜산나트륨을 PVP와 함께 이용했을 경우, 고감도 검출은 달성할 수 없었다(비교예 6). 즉, 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머 및 비이온성 계면활성제를 함유하는 본 발명의 전개액을 면역 크로마토그래피법에 이용하는 것에 의해, 양호한 S/N치를 얻을 수 있는 것이 분명해졌다.

실시예 4

블로킹 및 세정 처리를 실시하지 않은 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 크로마토그래피 매체를 작성하였다. 전개액으로는, 0.5 중량 % Tween 20 대신 0.05 중량% Tween 20 및 0.3 중량% Triton　X-100을 이용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 측정하였다. 표 2에 결과를 나타낸다.

블로킹 없음

	수용성 고분자	계면활성제	인플루엔자 B 바이러스 유래의 당해 단백 농도(ng/mL)
			0 2.5 5 10
실시예 4	PVP	Tween 20+Triton X-100	－＋＋＋＋

산소 원자 함유극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머 및 비이온성 계면활성제의 존재 하에서, 인플루엔자 B 바이러스 유래 핵단백질의 검출은, 크로마토그래피 매체에 블로킹 처리를 실시하지 않아도, 시료 중에 포함되는 피검출 물질 이외의 성분에 의한 비특이적 흡착을 억제하여 고감도로 달성되었다. 이는, 본 발명에 따르면, 보다 간편한 조작으로 양호한 S/N치를 얻을 수 있는 것을 의미한다.

실시예 5

실시예 1에서 제작한 크로마토그래피 매체를 이용하고, 전개액으로 여러 가지 분자량의 PVP, 즉 0.6 중량% PVP　K-30(和光純藥工嶪社 제: 평균분자량 4만), 0.6 중량% PVP　K-60(東京化成工嶪社 제, 평균분자량 22만), 0.6 중량% PVP　K-90(和光純藥工嶪社 제: 평균분자량 36만)을 사용하고, 0.5 중량% Tween 20 대신 0.05 중량% Tween 20 및 0.3 중량% Triton　X-100을 이용하여, 실시예 1과 동일하게 측정하였다. 표 3에 결과를 나타낸다.

블로킹 있음

	수용성 고분자	계면활성제	인플루엔자 B 바이러스 유래의 당해 단백 농도(ng/mL)
	수용성 고분자	계면활성제	0 5 7.5 10
실시예 5	PVP K-30 평균분자량 40000	Tween 20+Triton X-100	－－ ± ＋
	PVP K-60 평균분자량 220000	Tween 20+Triton X-100	－ ± ＋＋＋
	PVP K-90 평균분자량 360000	Tween 20+Triton X-100	－＋＋＋＋＋

이 실시예로부터, 본 발명에 이용되는 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머의 분자량은 10만∼100만, 더욱 바람직하게는 20만∼50만이었다.

실시예 6

실시예 1에서 제작한 크로마토그래피 매체를 이용하고, 전개액으로는 여러 가지 사용량의 PVP　K-90(和光純藥工嶪社 제: 평균분자량 36만), 즉 0.1 중량%, 0.3 중량%, 0.6 중량%, 1.5 중량%를 사용하고, 0.5 중량% Tween 20 대신 0.05 중량% Tween 20 및 0.3 중량% Triton　X-100를 사용하여, 실시예 1과 동일하게 측정하였다. 표 4에 결과를 나타낸다.

블로킹 있음

	수용성 고분자	계면활성제	인플루엔자 B 바이러스 유래의 당해 단백 농도(ng/mL)
	수용성 고분자	계면활성제	0 5 7.5 10
실시예 6	PVP K-90 0.1%	Tween 20+Triton X-100	－－ ± ＋
	PVP K-90 0.3%	Tween 20+Triton X-100	－ ± ＋＋＋
	PVP K-90 0.6%	Tween 20+Triton X-100	－＋＋＋＋＋
	PVP K-90 1.5%	Tween 20+Triton X-100	－＋＋＋＋＋

이 실시예로부터, 본 발명에 이용되는 산소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머의 사용량은, 0.01∼5 중량%, 보다 바람직하게는 0.1∼2 중량%였다.

실시예 7

1. 크로마토그래피 매체 상에서의 반응 부위의 제작

25×2.5 ㎝의 니트로셀룰로스 막(밀리포어사 제: HF120)에, 항체 도포기 (BioDot사 제)를 이용하여, 5 중량%의 이소프로필알코올을 포함하는 인산 완충액(pH 7.4)으로 1.0 ㎎/mL의 농도가 되도록 희석한 항인간헤모글로빈 항체를 도포하고, 50 ℃에서 30분간 건조시켰다. 건조 후, 당해 니트로셀룰로스 막을, 0.5 중량%의 카제인(和光純藥工嶪社 제)을 포함하는 인산 완충액(pH 7.4) 200 mL에 30 ℃에서 30 분간 침지하여 블로킹을 실시하였다. 블로킹 후, 0.05 중량%의 Tween 20을 함유하는 세정액으로 세정하고, 실온에서 하룻밤 건조시켜 크로마토그래피 매체 상에 반응 부위를 제작하였다.

2. 표지 물질 용액의 제작

금 콜로이드 현탁액(田中貴金屬工嶪社 제: 평균 입자경 40 ㎚) 0.5 mL에, 인산 완충액(pH 7.4)으로 0.1 ㎎/mL의 농도가 되도록 희석한 항인간헤모글로빈 모노클로날 항체를 0.1 mL 가하여 실온에서 10분간 정치하였다. 다음에, 10 중량%의 우혈청 알부민을 포함하는 인산 완충액(pH 7.4)을 0.1 mL 가하여 충분히 교반한 후, 8000×g에서 15분간 원심분리를 실시하였다. 상등액을 제거한 후, 1 중량%의 우혈청 알부민을 포함하는 인산 완충액(pH 7.4) 0.1 mL를 가하여 표지 물질 용액으로 하였다. 실시예 1과 동일하게 크로마토그래피 매체의 제작을 실시하였다.

3. 측정

상기 제작한 크로마토그래피 매체를 이용하여, 이하의 방법으로 시료 중의 인간 헤모글로빈의 존재 유무를 측정하였다. 즉, 0.05 중량% Tween 20 및 0.3 중량% Triton X-100, 0.6 중량% 폴리비닐피롤리돈(PVP) K-90(평균분자량 36만), 1.0 중량% 우혈청 알부민과 150 mM 염화나트륨을 포함하는 트리스 완충용액(pH 8.0)으로 이루어지는 전개액을 음성 검체시료로 하고, 여기에 인간헤모글로빈을 가한 것을 양성 검체시료로 하여, 각각 150 μL를 크로마토그래피 매체의 샘플 패드 위에 놓고 전개시키고, 15 분 후에 육안으로 판정하였다. 반응 부위에서의 테스트 라인의 붉은 선을 매우 명확하게 확인할 수 있는 것을 「＋＋＋」, 붉은 선을 명확하게 확인할 수 있는 것을 「＋＋」, 붉은 선을 확인할 수 있는 것을 「＋」, 붉은 선은 확인할 수 있지만, 매우 색이 옅은 것을 「±」, 붉은 선을 확인할 수 없는 것을 「-」로 하였다. 표 5에 결과를 나타낸다.

블로킹 있음

	수용성 고분자	계면활성제	인간헤모글로빈 농도(ng/mL) 완충액 없음 10 50 100
실시예 7	PVP	Tween 20+Triton X-100	－＋＋＋＋＋＋＋＋

본 발명의 전개액을 갖는 면역 크로마토그래피법은, 인플루엔자 B 바이러스 유래의 핵단백질 뿐만 아니라, 피검출 물질이 인간 헤모글로빈일 경우에도 고감도로 검출하는 것이 가능하였다.

산업상 이용 가능성

본 발명의 전개액 및 이를 이용한 면역 크로마토그래피법은, 생체 시료 중에 포함되는 피검출 물질을 고감도로 검출할 수 있으므로, 임상 검사 등에 있어서의 면역 측정법으로 널리 이용된다.

Claims

산소 원자 및 질소 원자 함유 극성기를 갖는 분자량이 1만 ~ 100만의 비닐계 수용성 폴리머 및 HLB 값이 13∼18인 비이온성 계면활성제를 포함하는, 그 표면이 음으로 하전되어 있는 불용성 담체로 표지된 검출 시약을 이용하는 면역 크로마토그래피법에 있어서의 양성 신호를 증폭하는 전개액.
제 1 항에 있어서, 상기 불용성 담체가 콜로이드상 금속 입자인 것을 특징으로 하는 전개액.
제 2 항에 있어서, 상기 콜로이드상 금속 입자가 콜로이드상 금 입자인 것을 특징으로 하는 전개액.
제 1 항에 있어서, 산소 원자 및 질소 원자 함유 극성기를 갖는 비닐계 수용성 폴리머가 폴리비닐피롤리돈, 디메틸아크릴아미드/비닐피롤리돈 공중합체(디메틸아크릴아미드의 공중합 비율이 50 몰% 이하인 것), 비닐알코올/비닐피롤리돈 공중합체(비닐알코올의 공중합 비율이 50 몰% 이하인 것), 및 초산비닐/비닐피롤리돈 공중합체(초산비닐의 공중합 비율이 20 몰% 이하인 것)로 이루어지는 그룹에서 선택되는 폴리머인 전개액.
제 1 항에 있어서, HLB 값이 10∼18인 비이온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 p-t-옥틸페닐에테르, 및 폴리옥시에틸렌 p-t-노닐페닐에테르로 이루어지는 그룹에서 선택되는 비이온성 계면활성제인 전개액.
이동상을 구성하는 전개액으로서, 제 1 항 내지 제 5 항의 어느 한 항에 따른 전개액을 사용하는 것을 특징으로 하는 양성 신호가 증폭된 면역 크로마토그래피법.
면역 크로마토그래피법에 있어서의 크로마토그래피 매체, 및 제 1 항 내지 제 5 항의 어느 한 항에 따른 전개액을 포함하여 이루어지는 양성 신호가 증폭된 면역 로마토그래피법에 따른 검출 키트.
제 1 항 내지 제 5 항의 어느 한 항에 따른 전개액으로 이루어지는 면역 크로마토그래피법에 있어서의 시료 희석액.