JP6982129B2 - 抗水痘帯状疱疹ウイルス抗体、免疫学的測定方法及び免疫学的測定用装置 - Google Patents

抗水痘帯状疱疹ウイルス抗体、免疫学的測定方法及び免疫学的測定用装置 Download PDF

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Description

本発明は、水痘帯状疱疹ウイルスの検出のための抗水痘帯状疱疹ウイルス抗体又は該抗体断片、並びに該抗体又は該抗体断片を用いる、免疫学的測定方法及び免疫学的測定用装置に関する。
水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−Ｚｏｓｔｅｒ Ｖｉｒｕｓ、ＶＺＶ）は、α−ヘルペスウイルス亜科に属し、約１２５ｋｂｐの塩基配列からなる線状２本鎖ＤＮＡを有するウイルスである。このウイルスは、ヒトに対して初感染時に水痘（ｖａｒｉｃｅｌｌａ）を引き起こし、治癒後の非活動期は神経細胞周囲の外套細胞に潜伏しており、何らかの原因で免疫力が低下するとウイルスが再び活性化し、帯状疱疹（ｚｏｓｔｅｒ）を引き起こす。免疫抑制状態（免疫抑制剤使用、悪性腫瘍、免疫不全等の基礎疾患）のヒトがＶＺＶに初感染、あるいは再活性化した場合、重症化し、時に致命的になることもあり、早期治療を行うための迅速診断法の確立が望まれている。
特許文献１には、帯状疱疹後の神経痛等の予防または治療の手段として、水痘帯状疱疹ウイルスの前初期タンパク質ＩＥ６２を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する抗体を用いた、神経疾患の予防または治療剤が開示されている。
特許文献２には、ＤＮａｓｅＸタンパク質の機能を増強するエンドサイトーシス依存性ＤＮＡ取り込み抑制剤が開示されており、ヒトＤＮａｓｅＸを抗原として間接的に、水痘帯状疱疹ウイルス等に起因する病状を予知する方法が開示されている。
特許第５２７９５０４号明細書 特開２００８−２５３１８８号公報
しかしながら、特許文献１に記載の方法は、ＶＺＶによって引き起こされる神経痛の原因を検出、または治療する方法であって、ＶＺＶを特異的に検出するものではない。また、特許文献２に記載の方法においても、ＶＺＶそのものを直接検出するのではなく、ヒトＤＮａｓｅＸを抗原として間接的に病状を予知する方法である。このように、これまで、ＶＺＶを特異的に検出する方法は確立されておらず、迅速にＶＺＶの感染を診断することができなかった。
したがって、本発明は、迅速にＶＺＶの感染を診断する手段を提供することを目的とする。
ＶＺＶは、糖タンパク質であって、免疫グロブリンＧのＦｃ部位を捕捉する機能を持つ水痘帯状疱疹ウイルス糖タンパク質Ｅ（以下、ＶＺＶｇＥともいう）を有している。このＶＺＶｇＥは、他のα−ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ、ＢＨＶ、ＦｅＨＶ等）が有する糖タンパク質Ｅ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ、ｇＥ）と、アミノ酸配列において約５０％程度の相同性を有しており、それぞれのｇＥはその機能、構造ともに類似している。
本発明者らは、ＶＺＶを直接検出する手段として、上記ＶＺＶｇＥに着目し、鋭意研究した結果、ＶＺＶｇＥを認識する、重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ；以下、ＶＨと略記する）の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；以下ＣＤＲと略記する）１〜３及び軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ；以下、ＶＬと略記する）のＣＤＲ１〜３がそれぞれ特定のアミノ酸配列を含む抗体は、他のα−ヘルペスウイルスとは交差反応を示さず、ＶＺＶを特異的に検出できることを見出した。
そして、前記抗体を用いた免疫学的測定方法及び免疫学的測定用装置によれば、迅速に、そして簡易にＶＺＶのヒトへの感染を診断できることを見出し、本発明に至った。
したがって、本発明は以下の通りである。
１．水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−Ｚｏｓｔｅｒ Ｖｉｒｕｓ、以下、ＶＺＶと略記する）の糖タンパク質Ｅ（以下、ＶＺＶｇＥと略記する）に対する抗体又は該抗体断片であって、前記抗体が以下の（１ａ）〜（１ｃ）及び（２ａ）〜（２ｃ）のいずれか１である抗体又は該抗体断片。
（１ａ）重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ；以下、ＶＨと略記する）の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；以下ＣＤＲと略記する）１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号８、９および１０に記載されるアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ；以下、ＶＬと略記する）のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１１、１２および１３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体。
（１ｂ）（１ａ）の抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３及びＶＬのＣＤＲ１〜３の少なくともいずれか１において１から３個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ（１ａ）の抗体と同等の抗原結合性を有する抗体。
（１ｃ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号８、９および１０に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１１、１２および１３に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ（１ａ）の抗体と同等の抗原結合性を有する抗体。
（２ａ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１４、１５および１６に記載されるアミノ酸配列を含み、抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１７、１８および１９に記載されるアミノ酸配列を含む抗体。
（２ｂ）（２ａ）の抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３及びＶＬのＣＤＲ１〜３の少なくともいずれか１において１から３個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ（２ａ）の抗体と同等の抗原結合性を有する抗体。
（２ｃ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１４、１５および１６に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１７、１８および１９に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ（２ａ）の抗体と同等の抗原結合性を有する抗体。
２．配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち４８〜８８番目のアミノ酸配列を特異的に認識し、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、４８〜６７番目のアミノ酸配列、５４〜７２番目のアミノ酸配列、６２〜８１番目のアミノ酸配列および６９〜８８番目のアミノ酸配列を特異的に認識しない、前記１に記載の抗体又は該抗体断片。
３．前記抗体が、下記（ＩＡ）〜（ＩＣ）及び（ＩＩＡ）〜（ＩＩＣ）のいずれか１である、前記１または２に記載の抗体又は該抗体断片。
（ＩＡ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２０に記載されるアミノ酸配列であって、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２１に記載されるアミノ酸配列である抗体。
（ＩＢ）（ＩＡ）の抗体のＶＨ及びＶＬの少なくとも一方において１から３個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ（ＩＡ）の抗体と同等の抗原結合性を有する抗体。
（ＩＣ）抗体のＶＨが配列番号２０に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、抗体のＶＬがそれぞれ配列番号２１に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ（ＩＡ）の抗体と同等の抗原結合性を有する抗体。
（ＩＩＡ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２２に記載されるアミノ酸配列であって、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２３に記載されるアミノ酸配列である抗体。
（ＩＩＢ）（ＩＩＡ）の抗体のＶＨ及びＶＬの少なくとも一方において１から３個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ（ＩＩＡ）の抗体と同等の抗原結合性を有する抗体。
（ＩＩＣ）抗体のＶＨが配列番号２２に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、抗体のＶＬがそれぞれ配列番号２３に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ（ＩＩＡ）の抗体と同等の抗原結合性を有する抗体。
４．配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち４８〜８８番目のアミノ酸配列を特異的に認識し、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、４８〜６７番目のアミノ酸配列、５４〜７２番目のアミノ酸配列、６２〜８１番目のアミノ酸配列および６９〜８８番目のアミノ酸配列を特異的に認識しない、ＶＺＶｇＥに対する抗体又は該抗体断片。
５．前記抗体が、遺伝子組換え抗体である前記１〜４のいずれか１に記載の抗体又は該抗体断片。
６．Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる１の抗体断片である、前記１〜５のいずれか１に記載の抗体断片。
７．以下の（１ａ）〜（１ｃ）のいずれか１の抗体又は該抗体断片と、（２ａ）〜（２ｃ）のいずれか１の抗体又は該抗体断片とを用いる、免疫学的測定方法。
（１ａ）ＶＨのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号８、９および１０に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１１、１２および１３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体。
（１ｂ）（１ａ）の抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３及びＶＬのＣＤＲ１〜３の少なくともいずれか１において１から３個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ（１ａ）の抗体と同等の抗原結合性を有する抗体。
（１ｃ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号８、９および１０に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１１、１２および１３に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ（１ａ）の抗体と同等の抗原結合性を有する抗体。
（２ａ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１４、１５および１６に記載されるアミノ酸配列を含み、抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１７、１８および１９に記載されるアミノ酸配列を含む抗体。
（２ｂ）（２ａ）の抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３及びＶＬのＣＤＲ１〜３の少なくともいずれか１において１から３個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ（２ａ）の抗体と同等の抗原結合性を有する抗体。
（２ｃ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１４、１５および１６に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１７、１８および１９に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ（２ａ）の抗体と同等の抗原結合性を有する抗体。
８．酵素免疫測定方法又は免疫クロマト分析方法である、前記７に記載の免疫学的測定方法。
９．試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む、ＶＺＶを検出するための免疫学的測定用装置であって、前記標識物質保持部及び前記検出部が以下の（ｉ）又は（ｉｉ）である、前記１〜６のいずれか１に記載の抗体又は該抗体断片を含有する、免疫学的測定用装置。
（ｉ）前記標識物質保持部が前記（１ａ）〜（１ｃ）のいずれか１の抗体又は該抗体断片を含有し、且つ前記検出部が前記（２ａ）〜（２ｃ）のいずれか１の抗体又は該抗体断片を含有する。
（ｉｉ）前記標識物質保持部が前記（２ａ）〜（２ｃ）のいずれか１の抗体又は該抗体断片を含有し、且つ前記検出部が前記（１ａ）〜（１ｃ）のいずれか１の抗体又は該抗体断片を含有する。
１０．前記試料添加部に添加する試料が、水痘帯状疱疹ウイルスを含む水疱内容液である、前記９に記載の免疫学的測定用装置。
１１．前記９又は１０に記載の免疫学的測定用装置を用いて、検体中のＶＺＶを検出する方法であり、以下の工程（１）〜（４）を含む免疫学的測定方法。
（１）検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を前記試料添加部に添加する工程
（２）前記標識物質保持部に保持されている前記抗体又は該抗体断片により水痘帯状疱疹ウイルスを認識させる工程
（３）前記検体及び前記抗体又は該抗体断片を移動相として前記クロマトグラフ媒体部に展開させる工程
（４）展開された移動相中の水痘帯状疱疹ウイルスを前記検出部に含まれる前記抗体又は該抗体断片により検出する工程
１２．前記１〜６のいずれか１に記載の抗体又は該抗体断片をコードする塩基配列を含む核酸。
１３．前記１２に記載の核酸を含むベクターを含む形質転換細胞。
１４．前記１３に記載の形質転換細胞を培養し、培養液から前記１〜６のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片を採取することを含む、前記１〜６のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片の製造方法。
本発明は、水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−Ｚｏｓｔｅｒ Ｖｉｒｕｓ、ＶＺＶ）の糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）に結合する抗体または該抗体断片、該抗体または該抗体断片を用いた免疫学的測定方法、免疫学的測定用装置を提供する。本発明の抗体または該抗体断片を用いることによって、ＶＺＶを特異的に迅速かつ簡易に検出できる。すなわち、水痘、帯状疱疹の診断をより確実かつ迅速に行うことができる。
図１は、本発明の一実施形態の免疫学的測定用装置の構造を説明するための断面図である。 図２は、ＶＺＶｇＥの全長アミノ酸配列に対する各ペプチド断片の位置を示す模式図である。 図３は、競合阻害試験によるエピトープ解析の結果を示す図である。
以下に、本発明について詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
本発明における相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ［J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２［Nucleic Acids Res.,25, 3389 (1997)、Genome Res., 7, 649 (1997)、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.htmL］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。
デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（Cost to open gap）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、−Ｅ（Cost to extend gap）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、−ｑ（Penalty for nucleotide mismatch）が−３、−ｒ（reward for nucleotide match）が１、−ｅ（expect value）が１０、−Ｗ（wordsize）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、−ｙ［Dropoff(X)for blast extensions in bits］がｂｌａｓｔｎの場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、−Ｘ（X dropoff value for gapped alignment in bits）が１５および−Ｚ（final X dropoff value for gapped alignment in bits）がｂｌａｓｔｎの場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/htmL/blastcgihelp.htmL）。
＜ＶＺＶｇＥ＞
ＶＺＶは、α−ヘルペスウイルス亜科に属し、水痘及び帯状疱疹の病原媒体である。このＶＺＶが有する糖タンパク質の１つである、水痘帯状疱疹ウイルス糖タンパク質Ｅ（ＶＺＶｇＥ）は、配列番号１に示される６２３個のアミノ酸からなり、アミノ酸配列１−５４４番目にあたる細胞外領域（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｏｍａｉｎ）、アミノ酸配列５４５−５６２番目にあたる膜貫通領域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ；ＴＭ）、アミノ酸配列５６３−６２３番目にあたる細胞質尾部（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｔａｉｌ）から構成されている（Jurie K et al, Journal of Virology, Jan. 1997, p110-119）。
本発明において、ＶＺＶｇＥは、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＶＺＶｇＥの機能を有するポリペプチド、あるいは配列番号１に記載のアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成り、かつＶＺＶｇＥの機能を有するポリペプチドなどが挙げられる。
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、部位特異的変異導入法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、Nucleic acidsResearch, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)］などを用いて、例えば配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡに、部位特異的変異を導入することにより得ることができる。
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個〜数十個、例えば、１〜２０個、より好ましくは１個〜数個、例えば、１〜５個のアミノ酸である。
＜抗体およびその製造方法＞
本発明の抗体又は該抗体断片は、ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列（配列番号１）のうち４８〜８８番目のアミノ酸配列（配列番号３）を特異的に認識する。本発明の抗体又は該抗体断片の一態様としては、配列番号３で示されるアミノ酸配列を特異的に認識し、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、４８〜６７番目のアミノ酸配列（配列番号４）、５４〜７２番目のアミノ酸配列（配列番号５）、６２〜８１番目のアミノ酸配列（配列番号６）および６９〜８８番目のアミノ酸配列（配列番号７）を特異的に認識しない抗体が挙げられる。かかる反応性を示す理由としては、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなる立体構造を認識して結合していると考えられる。
ここで、本明細書において、抗体がある特定のアミノ酸配列を「認識する」とは、該特定のアミノ酸配列に対して、それ以外の他のアミノ酸配列よりも高い親和性をもって結合することを意味する。
上記したように、ＶＺＶｇＥは他のα−ヘルペスウイルスのｇＥと約５０％程度のアミノ酸配列の相同性を有する。本発明の抗体は、ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列のうち４８〜８８番目のアミノ酸配列を認識するため、相同性の高い他のα−ヘルペスウイルスとも交差反応なく特異的にＶＺＶを検出できる。
また、後述するように、例えば、標識物質保持部及び検出部を含む免疫学的測定用装置の標識物質保持部及び検出部にＶＺＶｇＥのアミノ酸配列のうち４８〜８８番目のアミノ酸配列を認識する抗体を含有させることにより、高い精度で効率的にＶＺＶを検出できる。
本発明の抗体としては、下記（１ａ）〜（１ｃ）及び（２ａ）〜（２ｃ）から選ばれる１の抗体が挙げられる。
（１ａ）ＶＨのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号８、９および１０に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１１、１２および１３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体。
（１ｂ）（１ａ）の抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３及びＶＬのＣＤＲ１〜３の少なくともいずれか１において１から３個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ（１ａ）の抗体と同等の抗原結合性を有する抗体。
（１ｃ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号８、９および１０に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１１、１２および１３に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ（１ａ）の抗体と同等の抗原結合性を有する抗体。
（２ａ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１４、１５および１６に記載されるアミノ酸配列を含み、抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１７、１８および１９に記載されるアミノ酸配列を含む抗体。
（２ｂ）（２ａ）の抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３及びＶＬのＣＤＲ１〜３の少なくともいずれか１において１から３個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ（２ａ）の抗体と同等の抗原結合性を有する抗体。
（２ｃ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１４、１５および１６に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１７、１８および１９に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ（２ａ）の抗体と同等の抗原結合性を有する抗体。
（ｄ）前記（１ａ）〜（１ｃ）及び（２ａ）〜（２ｃ）に記載の少なくとも１つの抗体と、ＶＺＶｇＥへの結合について競合する抗体。
（ｅ）前記（１ａ）〜（１ｃ）及び（２ａ）〜（２ｃ）に記載のいずれか１つの抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
本発明の抗体としては、上記（１ａ）〜（１ｃ）、（２ａ）〜（２ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）に記載されるいずれか１の抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３及びＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列と、それぞれ９０％以上の相同性を示す抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３及びＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を有する抗体を含む。９０％以上の相同性とは、具体的には９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の相同性などが挙げられる。
前記抗原結合性の一態様としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち４８〜８８番目のアミノ酸配列に特異的に結合する活性が挙げられる。抗原結合性の一態様としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち４８〜８８番目のアミノ酸配列を特異的に結合し、かつ配列番号４〜７でそれぞれ示されるアミノ酸配列を認識しないことが挙げられる。
本発明の抗体又は該抗体断片が「配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち４８〜８８番目のアミノ酸配列に特異的に結合する」とは、具体的には例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドと、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドとの実施例において後述するＥＬＩＳＡ法による競合阻害試験（競合阻害ＥＬＩＳＡ試験）を行ったときに、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体の反応が配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドの存在により競合阻害されることをいう。
検出感度及び特異性を高める観点から、競合阻害ＥＬＩＳＡ試験における吸光度が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体の反応について、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを添加しない場合（コントロール）の吸光度を１００％としたときに、５０％以下であることが好ましく、より好ましくは２５％以下であり、さらに好ましくは１２．５％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは５％以下である。
本発明の抗体又は該抗体断片は、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、配列番号４〜７でそれぞれ示されるアミノ酸配列を認識しないことが好ましい。このことにより、特異性及び検出感度をより向上できる。本発明において抗体が「アミノ酸配列を認識しない」とは、配列番号４〜７でそれぞれ示されるアミノ酸配列からなるペプチドとは実質的に反応性を示さないことが挙げられる。具体的には例えば、実施例において後述する競合阻害ＥＬＩＳＡ試験において、吸光度がコントロールに対し好ましくは−２５％以内、より好ましくは−２０％以内、さらに好ましくは−１５％以内、特に好ましくは−１０％以内の範囲であることをいう。
本発明の上記（ｄ）の抗体とは、上記（１ａ）〜（１ｃ）及び（２ａ）〜（２ｃ）の少なくとも１に記載の抗体を第１抗体とした時に、該第１抗体とＶＺＶｇＥとの結合を阻害する第２抗体をいう。本発明の上記（ｅ）の抗体とは、上記（１ａ）〜（１ｃ）及び（２ａ）〜（２ｃ）のいずれか１に記載の抗体を第１抗体、及び第１抗体が結合するエピトープを第１エピトープとした場合に、当該第１エピトープに結合する第２抗体をいう。
また、本発明の抗体として、具体的には、下記（Ｉ）または（ＩＩ）の抗体も挙げられる。
（Ｉ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２０に記載されるアミノ酸配列であって、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２１に記載されるアミノ酸配列である抗体。
（ＩＩ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２２に記載されるアミノ酸配列であって、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２３に記載されるアミノ酸配列である抗体。
本発明の抗体としては、上記（Ｉ）または（ＩＩ）の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列と、それぞれ９０％以上の相同性を示す抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を有する抗体を含む。９０％以上の相同性とは、具体的には９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の相同性などが挙げられる。
また、上記（Ｉ）および（ＩＩ）に記載される抗体の一態様として、それぞれ抗体９、抗体１８が挙げられる。
本発明の抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびオリゴクローナル抗体のいずれの抗体をも包含する。ポリクローナル抗体とは、異なるクローンの抗体産生細胞が分泌する抗体分子の集団をいう。モノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が分泌する抗体であり、ただ一つのエピトープ（抗原決定基ともいう）を認識し、モノクローナル抗体を構成するアミノ酸配列（一次配列）が均一である抗体をいう。オリゴクローナル抗体とは、複数の異なるモノクローナル抗体を混合した抗体分子の集団をいう。
本発明におけるモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより産生される抗体、または抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により産生される遺伝子組換え抗体をあげることができる。
エピトープとは、モノクローナル抗体が認識し、結合する単一のアミノ酸配列、アミノ酸配列からなる立体構造、翻訳後修飾により修飾されたアミノ酸配列および該アミノ酸配列からなる立体構造などが挙げられる。
翻訳後修飾により修飾されたアミノ酸配列としては、糖鎖がＯＨ置換基を有するＴｙｒおよびＳｅｒに結合したＯ結合型糖鎖、ＮＨ２置換基を有するＧｌｎおよびＡｓｎに結合したＮ結合型糖鎖ならびに硫酸分子がＯＨ置換基を有するＴｙｒに結合した硫酸基などが結合したアミノ酸配列が挙げられる。
本発明の抗体がＶＺＶｇＥに結合することは、ＶＺＶｇＥ発現細胞に対する本発明の抗体の結合性を、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーおよび表面プラズモン共鳴法などを用いて測定することにより確認することができる。また、公知の免疫学的検出法［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを組み合わせて確認することもできる。
本発明の抗体としては、特に遺伝子工学的に作製された組換えマウス抗体、組換えラット抗体、組換えラビット抗体、ヒト型キメラ抗体（以下、単にキメラ抗体とも略記する）、ヒト化抗体（ヒト型相補性決定領域ＣＤＲ移植抗体ともいう）およびヒト抗体などの遺伝子組換え抗体も含まれる。
キメラ抗体とは、ヒト以外の動物（非ヒト動物）の抗体のＶＨおよびＶＬと、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬからなる抗体を意味する。非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマとは、非ヒト動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、マウスなどに由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を産生する細胞をいう。したがって、ハイブリドーマが産生する抗体を構成する可変領域は、非ヒト動物抗体のアミノ酸配列からなる
ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産する非ヒト動物細胞由来のハイブリドーマより、該モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト化抗体とは、非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの対応するＣＤＲに移植した抗体をいう。ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ以外の領域はフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）と称される。
ヒト化抗体は、非ヒト動物抗体のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列と任意のヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列からなるＶＨのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡと、非ヒト動物抗体のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列と任意のヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列からなるＶＬのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体等も含まれる。
ヒト抗体は、ヒトイムノグロブリン遺伝子を保持するマウス（Tomizuka K. et. al., Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 722-7, 2000）に所望の抗原を免疫することにより、取得することが出来る。また、ヒト由来のＢ細胞から抗体遺伝子を増幅したｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙライブラリーを用いることにより、所望の結合活性を有するヒト抗体を選択することで、免疫を行わずにヒト抗体を取得することができる（Winter G. et. al., Annu Rev Immunol.12:433-55. 1994)。さらに、EBウイルスを用いてヒトB細胞を不死化することにより、所望の結合活性を有するヒト抗体を生産する細胞を作製し、ヒト抗体を取得することができる（Rosen A. et. al., Nature 267, 52-54.1977）。
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血から単離したリンパ球を、ＥＢウイルス等を感染させることによって不死化した後、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を得ることができ、該リンパ球を培養した培養物中より該抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖ等の抗体断片を表面に発現させたファージのライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が宿主動物の染色体内に組込まれた動物をいう。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニック動物を作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養物中にヒト抗体を産生蓄積させることができる。
本発明の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列としては、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列、非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列または非ヒト動物抗体のＣＤＲを、任意のヒト抗体のフレームワークに移植したヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列のいずれでもよい。
本発明の抗体におけるＣＬのアミノ酸配列としては、ヒト抗体のアミノ酸配列または非ヒト動物抗体のアミノ酸配列のいずれでもよいが、ヒト抗体のアミノ酸配列のＣκまたはＣλが好ましい。
本発明の抗体のＣＨとしては、イムノグロブリンに属すればいかなるものでもよいが、好ましくはＩｇＧクラスに属するサブクラス、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）およびγ４（ＩｇＧ４）のいずれも用いることができる。
本発明の抗体としては、Ｆｃと抗体断片とが結合したＦｃ融合タンパク質、Ｆｃと天然に存在するリガンドまたは受容体とが結合したＦｃ融合タンパク質（イムノアドヘシンともいう）、複数のＦｃ領域を融合させたＦｃ融合タンパク質等も本発明に包含される。また、抗体を安定化させるためおよび血中半減期を制御するために、アミノ酸残基を改変したＦｃ領域なども本発明の抗体に用いることができる。
本発明の抗体又は該抗体断片は、翻訳後修飾されたいかなるアミノ酸残基を含む抗体をも包含する。翻訳後修飾としては、例えば、Ｈ鎖のＣ末端におけるリジン残基の欠失［リジン・クリッピング（ｌｙｓｉｎｅ ｃｌｉｐｐｉｎｇ）］またはポリペプチドのＮ末端におけるグルタミン残基のピログルタミン（ｐｙｒｏＧｌｕ）への変換などが挙げられる［Beck et al, Analytical Chemistry, 85, 715-736（2013）］。
本発明において、抗体断片とは、ＶＺＶｇＥに結合し、抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明において抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖまたは複数のＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。Ｆａｂは、ＩｇＧ抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）で結合した、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のＳ−Ｓ結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のＳ−Ｓ結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを４個のＧｌｙおよび１個のＳｅｒ残基からなるリンカー（Ｇ４Ｓ）を任意の個数つなげたリンカーペプチドなどの適当なペプチドリンカー（Ｐ）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
Ｄｉａｂｏｄｙは、抗原結合特異性の同じまたは異なるｓｃＦｖが２量体を形成した抗体断片で、同じ抗原に対する２価の抗原結合活性または異なる抗原に対する特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のＳ−Ｓ結合を介して結合させたものをいう。
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、ＣＤＲ同士を直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。本発明の改変抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によって製造することもできる。
抗体または該抗体断片の製造方法は、特に制限されず、例えば、前述のアミノ酸配列情報に基づいて、遺伝子工学的に製造することができる。具体的には、例えば、以下のようにして行うことができる。なお、本発明は、この例示には限定されない。
まず、抗体における、前記各領域、前記重鎖、および／または軽鎖のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むベクターを宿主に導入し、形質転換体を得る。そして、形質転換体を培養し、ＶＺＶｇＥに結合する抗体を含む画分を回収し、得られた回収画分から、抗体を単離または精製する。
ベクターとしては、例えば、重鎖可変領域をコードする核酸配列を含むベクター、軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含むベクター、重鎖をコードする核酸配列を含むベクター、前記軽鎖をコードする核酸配列を含むベクター等があげられる。
形質転換体の培養方法は、特に制限されず、宿主の種類に応じて、適宜決定できる。抗体を含む画分は、例えば、培養した形質転換体を破砕し、液体画分として回収できる。抗体の単離または精製は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。
宿主は、特に制限されず、ベクターを導入でき、前記ベクター内の前記核酸配列を発現できるものであればよい。宿主としては、例えば、ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞等の哺乳類細胞等があげられる。前記ベクターを宿主に導入する方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。
抗体産生動物種としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等である。免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでもよい。
一実施態様において、免疫原としてのＶＺＶｇＥペプチドは、既知の一般的な製造方法によって製造することができる。すなわち、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＺＶから抽出精製したｇＥタンパク質またはクローニングされたｇＥタンパク質の遺伝子を大腸菌などの宿主で遺伝子工学的に発現させて抽出精製したｇＥタンパク質、さらにはｇＥタンパク質の一部を構成するポリペプチドを免疫原として用いることができる。
モノクローナル抗体は、常法に従って、上記免疫原で免疫したマウスの脾臓細胞と骨髄腫細胞をハイブリッドさせ、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを選択し、このハイブリドーマから産生されてくるモノクローナル抗体を収得する［例えば、ケーラーとミルスタインの技法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６（１９７５）４９５−４９７）を参照］。ポリクローナル抗体は、常法により、上記免疫原を産生動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等）に免疫して得た抗血清中から目的とする抗体を分離することにより得られる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の上記免疫原に対する反応性を、例えばＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定方法によって測定することにより行うことができる。
このハイブリドーマは、培地（例えば、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ）を用いて培養し、その培養液の遠心上清をモノクローナル抗体溶液とすることができる。また、本ハイブリドーマを由来する動物の腹腔に注入することにより、腹水を生成させ、得られた腹水をモノクローナル抗体溶液とすることができる。モノクローナル抗体は、単離および／または精製されることが好ましい。
ＶＺＶｇＥを認識する抗体のうち、ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列の特定部位を認識する抗体は、例えば、上記ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列の特定部位に相当するタンパク質の断片を用いたウェスタンブロッティング等により、上記ＶＺＶｇＥを認識する抗体を産生するハイブリドーマの中から、上記ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列の特定部位に対してより強い反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより得ることができる。
抗ＶＺＶｇＥ抗体のアミノ酸配列は常法に従って得ることができる。例えば、培養したハイブリドーマからフェノール／クロロホルムなどでｍＲＮＡを抽出し、その後ｍＲＮＡからｃＤＮＡに変換、抗体の定常領域またはＦＲ部分に相補的にデザインされたプライマーを使用しＰＣＲをおこない、増幅した遺伝子産物の遺伝子配列をサンガーシークエンス法などで得ることができる［例えばJournal of Immunological Methods 233, 167-177 (2000)を参照］。得られた遺伝子配列をアミノ酸配列に変換し、得られたアミノ酸配列をｉｇＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴなどで解析することによって抗体のアミノ酸配列を得ることができる。
具体的には実施例に示すように、例えばＶＺＶｇＥのアミノ酸配列のうち４８−８８番目のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体は、以下のようなスクリーニングを行うことによって得られる。例えば、実施例にて後述するように、ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列のうち４８−８８番目のアミノ酸配列からなるタンパク質の断片により、上記ＶＺＶｇＥを認識する抗体を産生するハイブリドーマの中から、ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列のうち４８−８８番目のアミノ酸配列に対してより強い反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
以上、本発明に使用する抗体の作製方法について記載したが、具体的には実施例にて詳述する。
＜免疫学的測定方法＞
本発明の抗体または該抗体断片を用いて、ＶＺＶｇＥを検出または測定することにより、ＶＺＶを診断することができる。ＶＺＶの診断は、例えば患者体内に存在するＶＺＶｇＥを免疫学的手法により検出または測定して行うことができる。また、免疫学的測定方法を用いて患者体内の細胞に発現しているＶＺＶｇＥを検出することにより診断を行うことができる。
免疫学的測定方法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。免疫学的測定方法としては、例えば、免疫クロマト分析方法、放射性物質標識免疫抗体法、酵素免疫測定方法、蛍光免疫測定方法、発光免疫測定方法、ウエスタンブロット法または物理化学的手法などが挙げられる。これらの中でも、免疫クロマト分析方法および酵素免疫測定方法が好ましい。
＜＜免疫学的測定用装置＞＞
免疫学的測定方法に用いる免疫学的測定用装置の一実施態様について説明する。本発明の免疫学的測定用装置は、その標識物質保持部及び検出部に本発明の抗体または該抗体断片を含有する。本発明の免疫学的測定用装置は、標識物質保持部及び検出部の一方に、上記した（１ａ）〜（１ｃ）のいずれか１の抗体又は該抗体断片を含有し、もう一方に上記した（２ａ）〜（２ｃ）のいずれか１の抗体又は該抗体断片を含有することが好ましい。
すなわち、本発明の免疫学的測定用装置の一実施態様は、標識物質保持部及び検出部が以下の（ｉ）又は（ｉｉ）であることが好ましい。
（ｉ）標識物質保持部が以下の（１ａ）〜（１ｃ）のいずれか１の抗体又は該抗体断片を含有し、且つ検出部が以下の（２ａ）〜（２ｃ）のいずれか１の抗体又は該抗体断片を含有する。
（ｉｉ）標識物質保持部が以下の（２ａ）〜（２ｃ）のいずれか１の抗体又は該抗体断片を含有し、且つ検出部が以下の（１ａ）〜（１ｃ）のいずれか１の抗体又は該抗体断片を含有する。
（１ａ）ＶＨのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号８、９および１０に記載されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１１、１２および１３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体。
（１ｂ）（１ａ）の抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３及びＶＬのＣＤＲ１〜３の少なくともいずれか１において１から３個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ（１ａ）の抗体と同等の抗原結合性を有する抗体。
（１ｃ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号８、９および１０に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１１、１２および１３に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ（１ａ）の抗体と同等の抗原結合性を有する抗体。
（２ａ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１４、１５および１６に記載されるアミノ酸配列を含み、抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１７、１８および１９に記載されるアミノ酸配列を含む抗体。
（２ｂ）（２ａ）の抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３及びＶＬのＣＤＲ１〜３の少なくともいずれか１において１から３個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ（２ａ）の抗体と同等の抗原結合性を有する抗原結合性を有する抗体。
（２ｃ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１４、１５および１６に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１７、１８および１９に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ（２ａ）の抗体と同等の抗原結合性を有する抗体。
標識物質保持部及び検出部の一方に、前記（１ａ）〜（１ｃ）のいずれか１の抗体又は該抗体断片を含有し、もう一方に前記（２ａ）〜（２ｃ）のいずれか１の抗体又は該抗体断片を含有することが好ましいのは、標識物質保持部に担持された抗体（以下、第一抗体ともいう）または該抗体断片が認識するＶＺＶｇＥの部位と、検出部に担持された抗体（以下、第二抗体ともいう）または該抗体断片が認識するＶＺＶｇＥ部位と、が異なることによって、抗体結合によりエピトープがマスクされることなく、または抗原の立体構造変化による影響等の相互作用を受けることなく、以下に示すようなサンドイッチ構造が形成され、検出感度が向上するからである。すなわち、まず、標識物質保持部に担持された抗体（第一抗体）または該抗体断片が、ＶＺＶｇＥの一部に結合する。続いて、検出部に固定化された抗体（第二抗体）または該抗体断片が、第一抗体または該抗体断片が結合した箇所とは別の箇所に結合することによって、ＶＺＶｇＥを抗体または該抗体断片同士で挟むようにしてサンドイッチの構造を形成し、ＶＺＶを検出する。
次に、図面を参照しながら本発明の免疫学的測定用装置の一実施形態について説明する。なお本明細書において、「固定」とは、抗体または該抗体断片が移動しないように膜等の担体に配置されていることを意味し、「担持」または「保持」とは、膜等の担体の中または表面を移動可能に配置されることを意味する。
本発明の免疫学的測定用装置の一実施形態としては、図１に示すように、試料添加部（サンプルパッドともいう）（１）、標識物質保持部（コンジュゲートパッドともいう）（２）、クロマトグラフ媒体部（３）、検出部（４）、吸収部（５）およびバッキングシート（６）から構成されている。
試料添加部（１）は、免疫学的測定用装置において、検体（サンプル）を滴下する部位である。試料添加部（１）では検体試料が迅速に吸収されるが、保持力は弱く、速やかに検体試料が移動していくような性質の多孔質シートで構成することができる。多孔質シートとしては、例えば、セルロース濾紙、ガラスファイバー濾紙、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、綿布等が挙げられる。
標識物質保持部（２）は、後述する標識物質（マーカー物質）を含有しており、該標識物質は抗体と結合した標識抗体として標識物質保持部（２）に担持されている。標識物質と結合する抗体（第一抗体）または該抗体断片は、上記したように、前記（１ａ）〜（１ｃ）のいずれか１の抗体又は該抗体断片、または前記（２ａ）〜（２ｃ）のいずれか１の抗体又は該抗体断片を含有することが好ましい。
標識物質保持部（２）に担持されている抗体が第一抗体または該抗体断片が前記（１ａ）〜（１ｃ）のいずれか１の抗体又は該抗体断片である場合、後述する検出部（４）に含有させる抗体（第二抗体）または該抗体断片は前記（２ａ）〜（２ｃ）のいずれか１の抗体又は該抗体断片とすることが好ましい。
標識物質保持部（２）に担持されている抗体が第一抗体または該抗体断片が前記（２ａ）〜（２ｃ）のいずれか１の抗体又は該抗体断片である場合、後述する検出部（４）に含有させる抗体（第二抗体）または該抗体断片は前記（１ａ）〜（１ｃ）のいずれか１の抗体又は該抗体断片とすることが好ましい。標識物質保持部内を検体が移動する際に、上記標識抗体（第一抗体）または該抗体断片と検体中のＶＺＶとが結合する。標識物質保持部（２）には、グラスファイバーまたはセルロースの膜が通常使用される。
標識物質保持部中の抗体（第一抗体）または該抗体断片の含有量は、通常０．０３〜０．５０μｇであり、好ましくは０．０５〜０．４μｇであり、より好ましくは０．１〜０．３μｇである。また、標識物質保持部の単位面積当たりの抗体（第一抗体）または該抗体断片の含有量は、通常０．０５〜１．０μｇ／ｃｍ２であり、好ましくは０．１〜０．８μｇ／ｃｍ２であり、より好ましくは０．１７〜０．６μｇ／ｃｍ２である。
免疫学的測定における検出試薬の標識には、一般に酵素等も使用されるが、被検出物質の存在を目視で判定するのに適していることから、標識物質としては不溶性担体を用いることが好ましい。抗体を不溶性担体に感作することにより標識化した検出試薬を調製することができる。なお、抗体を不溶性担体に感作する手段は、公知の方法に従えばよい。
標識物質としての不溶性担体には、金、銀もしくは白金のようなコロイド状金属粒子、酸化鉄のようなコロイド状金属酸化物粒子、硫黄などのコロイド状非金属粒子及び合成高分子よりなるラテックス粒子、またはその他を用いることができる。特に、金コロイド粒子が、検出が簡便であり、かつ凝集しづらく非特異的な発色が起こりにくい点で好ましい。金コロイドの粒子の平均粒径は、例えば１０ｎｍ〜２５０ｎｍ、好ましくは３５ｎｍ〜１２０ｎｍである。平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ：日本電子（株）製、ＪＥＭ−２０１０）により、撮影した投影写真を用いて無造作に１００個の粒子を粒子の投影面積円相当径を計測し、その平均値から算出することができる。標識物質保持部が含有する金コロイド粒子は、標識物質保持部の単位面積あたり、通常０．０２５〜１．５μｇ／ｃｍ２であり、好ましくは０．０５〜１．５μｇ／ｃｍ２であり、より好ましくは０．１〜１．０μｇ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは０．２〜０．６μｇ／ｃｍ２である。前記範囲に設定することによって、標識された粒子が分散したまま展開し、抗体の認識部位が阻害されず高感度化できるからである。
不溶性担体は、被検出物質の存在を視覚的に判定するのに適した標識物質であり、目視による判定を容易にするためには有色であることが好ましい。コロイド状金属粒子及びコロイド状金属酸化物粒子は、それ自体が粒径に応じた特定の自然色を呈するものであり、その色彩を標識として利用することができる。
クロマトグラフ媒体部（３）は、クロマトグラフの展開部位である。クロマトグラフ媒体部（３）は、毛細管現象を示す微細多孔性物質からなる不活性の膜である。クロマトグラフで使用される検出試薬、固定化試薬または被検出物質などと反応性を有しないという観点から、また、本発明の効果が向上するという観点から、例えば、ニトロセルロース製のメンブレン（以下、ニトロセルロースメンブレンともいう）や、酢酸セルロース製のメンブレン（以下、酢酸セルロースメンブレンともいう）が好ましく、ニトロセルロースメンブレンがさらに好ましい。なお、セルロース類メンブレン、ナイロンメンブレン及び多孔質プラスチック布類（ポリエチレン、ポリプロピレン）も使用可能である。
ニトロセルロースメンブレンとしては、ニトロセルロースが主体で含まれていればよく、純品またはニトロセルロース混合品などニトロセルロースを主材とするメンブレンを使用することができる。
ニトロセルロースメンブレンは、さらに毛細管現象を促進させる物質を含有させることもできる。該物質としては、膜面の表面張力を低下させ、親水性をもたらす物質が好ましい。例えば、糖類、アミノ酸の誘導体、脂肪酸エステル、各種合成界面活性剤またはアルコール等の両親媒性の作用を有する物質であって、被検出物質の移動に影響がなく、マーカー物質（例えば金コロイド粒子など）の発色に影響を及ぼさない物質が好ましい。
ニトロセルロースメンブレンは、多孔性であって、毛細管現象を示す。この毛細管現象の指標は、吸水速度（吸水時間：ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｆｌｏｗ ｔｉｍｅ）を測ることで確認できる。吸水速度は、検出感度と検査時間に影響する。
上記のようなニトロセルロースメンブレンや酢酸セルロースメンブレンに代表されるクロマトグラフ媒体部（３）の形態及び大きさは特に制限されるものではなく、実際の操作の点及び反応結果の観察の点において適切であればよい。
さらに操作をより簡便にするためには、クロマトグラフ媒体部（３）の裏面に、プラスチックなどよりなる支持体を設けることが好ましい。この支持体の性状は特に制限されるものではないが、目視判定によって測定結果の観察を行う場合には、支持体は、標識物質によりもたらされる色彩と類似しない色彩を有するものであることが好ましく、通常、無色又は白色であることが好ましい。
検出部（４）は、前記クロマトグラフ媒体部（３）上に形成される。すなわち、ＶＺＶを認識する抗体が、クロマトグラフ媒体部（３）上の任意の位置に固定化される。該抗体の固定化は常法に従って行うことができる。
検出部（４）における抗体（第二抗体）または該抗体断片の含有量は、通常０．１〜３．０μｇであり、好ましくは０．３〜２．０μｇであり、より好ましくは０．３〜１．０μｇである。また、検出部（４）の単位面積当たりの抗体（第二抗体）または該抗体断片の含有量は、通常０．０４〜１．０μｇ／ｃｍ２であり、好ましくは０．１２５〜０．８μｇ／ｃｍ２であり、より好ましくは０．１２５〜０．４２μｇ／ｃｍ２である。
また、クロマトグラフ媒体部（３）上には、非特異的な吸着により分析の精度が低下することを防止するため、必要に応じて、クロマトグラフ媒体部（３）に、公知の方法でブロッキング処理を行うことができる。一般にブロッキング処理はウシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼインまたはゼラチン等のタンパク質が好適に用いられる。かかるブロッキング処理後に、必要に応じて、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００またはＳＤＳ等の界面活性剤を１つ又は２つ以上組み合わせて洗浄してもよい。
検出部（４）には、上記第二抗体または該抗体断片の他に、コントロールとして抗ＩｇＧ抗体を担持させた抗ＩｇＧ抗体塗布部を設けてもよい。該部位は、抗原と反応しなかった標識抗体の標識物質や上記第二抗体または該抗体断片と反応しなかった標識抗体の標識物質はこの抗ＩｇＧ抗体塗布部で抗ＩｇＧ抗体と反応し固定化され、展開が正常に行われていることを示すコントロールとして機能する。
吸収部（５）は、クロマトグラフ媒体部（３）の末端に、検出部（４）を通過した検体や展開液等の液体を吸収させるために設置される。本発明の免疫クロマト分析装置において、吸収部（５）は、例えばグラスファイバーからなることができる。吸収部（５）がグラスファイバーからなることによって、試料液の液戻りを大幅に低減することができる。
バッキングシート（６）は、基材である。片面に粘着剤を塗布したり、粘着テープを貼り付けることにより、片面が粘着性を有し、該粘着面上に試料添加部（１）、標識物質保持部（２）、クロマトグラフ媒体部（３）、検出部（４）、および吸収部（５）の一部または全部が密着して設けられている。バッキングシート（６）は、粘着剤によって試料液に対して不透過性、非透湿性となるようなものであれば、基材としては、特に限定されない。
上記のようにして作製した免疫クロマト分析装置は、製品化する前に、通常乾燥処理に施される。乾燥温度は例えば２０〜５０℃、乾燥時間は０．５〜１時間である。
＜＜免疫クロマト分析方法＞＞
本発明の免疫学的測定方法の一態様として、免疫クロマト分析方法について説明する。免疫クロマト分析方法は、上記した免疫学的測定用装置を用いて、上記の免疫学的測定用装置を用いて検体に含まれる被検出物質のＶＺＶを検出する方法であり、以下の工程（１）〜（４）を含むことが好ましい。
（１）検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
（２）標識物質保持部に保持されている抗体または該抗体断片により水痘帯状疱疹ウイルスを認識させる工程
（３）前記検体及び抗体または該抗体断片を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
（４）展開された移動相中の水痘帯状疱疹ウイルスを検出部に含まれる抗体により検出する工程
本発明の免疫学的測定方法に使用する前記免疫学的測定用装置における標識物質保持部及び検出部のいずれもが、本発明の抗体または該抗体断片を含有する。上記したように、特に、免疫学的測定用装置における、標識物質保持部及び検出部に本発明の抗体または該抗体断片を含有する。本発明の免疫学的測定用装置は、標識物質保持部及び検出部の一方に、上記した（１ａ）〜（１ｃ）のいずれか１の抗体又は該抗体断片を含有し、もう一方に上記した（２ａ）〜（２ｃ）のいずれか１の抗体又は該抗体断片を含有することが好ましい。
各工程について以下に説明する。
（１）検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
工程（１）では、第一に、検体を、測定精度を低下させることなく、免疫クロマトグラフ媒体中をスムーズに移動する程度の濃度に、検体希釈液で適宜調整または希釈して検体含有液とするのが好ましい。検体希釈液は上述したものを使用できる。第二に、検体含有液を試料添加部（１）上に、所定量（通常、０．１〜２ｍｌ）滴下する。検体含有液が滴下されると、検体含有液は試料添加部（１）中で移動を開始する。
本発明において使用する検体試料は、被検出物質である水痘帯状疱疹ウイルスを含む可能性のある検体試料であり、具体的には、水痘帯状疱疹ウイルスに感染した患者の水疱を穿刺することによって得られる水疱内容液、又は咽頭拭い液等が挙げられるが、これらに限定されない。
（２）標識物質保持部に保持されている抗体または該抗体断片により水痘帯状疱疹ウイルスを認識させる工程
工程（２）は、工程（１）において試料添加部に添加された検体含有液を、標識物質保持部（２）へと移動させ、標識物質保持部に保持されている標識物質が結合した抗体（第一抗体）または該抗体断片により検体中の被検出物質である水痘帯状疱疹ウイルスの糖タンパク質Ｅ（ＶＺＶｇＥ）を認識させる工程である。
標識物質は上記のものを使用できる。標識物質と結合する抗体（第一抗体）または該抗体断片は、上記したように、ＶＺＶｇＥを認識する抗体または該抗体断片である。同抗体または該抗体断片は、試料添加部より展開されてきた検体中のＶＺＶｇＥを認識し結合する。
（３）前記検体及び抗体を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
工程（３）は、工程（２）において被検出物質である水痘帯状疱疹ウイルスが標識物質保持部において標識物質が結合した抗体または該抗体断片に認識された後、検体および抗体または該抗体断片を、クロマトグラフ媒体部上を移動相として通過させる工程である。
（４）展開された移動相中の水痘帯状疱疹ウイルスを検出部に含まれる抗体または該抗体断片により検出する工程
工程（４）は、クロマトグラフ媒体部上を移動相として通過した検体中の水痘帯状疱疹ウイルスにおけるＶＺＶｇＥが、抗原・抗体の特異的結合反応により、検出部に保持、即ち、固定されている抗体とまたは該抗体断片、前記工程（２）において標識物質が結合した抗体または該抗体断片とによってサンドイッチ状に挟まれるように特異的に反応結合して、検出部が着色する工程である。
該抗体（第二抗体）または該抗体断片は、上記したように、ＶＺＶｇＥを認識する抗体または該抗体断片である。標識物質と結合する抗体（第一抗体）または該抗体断片が、前記（１ａ）〜（１ｃ）のいずれか１の抗体又は該抗体断片である場合、検出部には前記（２ａ）〜（２ｃ）のいずれか１の抗体又は該抗体断片を含有させることが好ましい。
また、第一抗体または該抗体断片が前記（２ａ）〜（２ｃ）のいずれか１の抗体又は該抗体断片である場合、検出部には前記（１ａ）〜（１ｃ）のいずれか１の抗体又は該抗体断片を含有させることが好ましい。
被検出物質である水痘帯状疱疹ウイルスが存在しない場合には、試料の水分に溶解した標識試薬は、クロマトグラフ媒体部上の検出部を通過しても特異的結合反応が起こらないので、検出部が着色しない。
最後に、検体含有液の水分は、吸収部（５）へと移動する。
＜＜放射性物質標識免疫抗体法＞＞
放射性物質標識免疫抗体法は、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体または該抗体断片を反応させ、さらに放射線標識を施した抗イムノグロブリン抗体または該抗体断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する。
＜＜酵素免疫測定法＞＞
酵素免疫測定法は、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体または該抗体断片を反応させ、さらに酵素などで標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、基質を添加して反応液の吸光度を吸光光度計で測定する。例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ法などを用いる。酵素免疫測定法で用いる標識体としては、公知［酵素免疫測定法、医学書院（１９８７）］の酵素標識を用いることができる。
例えば、アルカリフォスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ルシフェラーゼ標識またはビオチン標識などを用いる。サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、固相に抗体を結合させた後、検出または測定対象である抗原をトラップさせ、トラップされた抗原に第２の抗体を反応させる方法である。該ＥＬＩＳＡ法では、検出または測定したい抗原を認識する抗体または抗体断片であって、抗原認識部位の異なる２種類の抗体を準備し、そのうち、第１の抗体または抗体断片を予めプレート（例えば、９６ウェルプレート）に吸着させ、次に第２の抗体または抗体断片をＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素またはビオチンなどで標識しておく。上記の抗体が吸着したプレートに、生体内から分離された、細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水または眼液などを反応させた後、標識したモノクローナル抗体または抗体断片を反応させ、標識物質に応じた検出反応を行う。濃度既知の抗原を段階的に希釈して作成した検量線より、被験サンプル中の抗原濃度を算出する。サンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ）２などの抗体フラグメントを用いてもよい。サンドイッチＥＬＩＳＡ法で用いる２種類の抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体または抗体断片の組み合わせでもよいし、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体または抗体断片との組み合わせでもよい。
＜＜蛍光免疫測定方法＞＞
蛍光免疫測定法は、文献［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック(1987)］などに記載された方法で測定する。蛍光免疫測定法で用いる標識体としては、公知［蛍光抗体法、ソフトサイエンス社（１９８３）］の蛍光標識を用いることができる。例えば、ＦＩＴＣまたはＲＩＴＣなどを用いる。
＜＜発光免疫測定方法＞＞
発光免疫測定法は文献［生物発光と化学発光 臨床検査４２、廣川書店（１９９８）］などに記載された方法で測定する。発光免疫測定法で用いる標識体としては、公知の発光体標識が挙げられ、アクリジニウムエステルまたはロフィンなどを用いる。
＜＜ウエスタンブロット法＞＞
ウエスタンブロット法は、抗原または抗原を発現した細胞などをＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル）［Antibodies -A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］で分画した後、該ゲルをポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜またはニトロセルロース膜にブロットし、該膜に抗原を認識する抗体または抗体断片を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素標識またはビオチン標識などを施した抗マウスＩｇＧ抗体または結合断片を反応させた後、該標識を可視化することによって測定する。
一例を以下に示す。配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現している細胞や組織を溶解し、還元条件下でレーンあたりのタンパク量として０．１〜３０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により泳動する。泳動されたタンパク質をＰＶＤＦ膜にトランスファーし１〜１０％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）に室温で３０分間反応させブロッキング操作を行う。ここで本発明のモノクローナル抗体を反応させ、０．０５〜０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウスＩｇＧを室温で２時間反応させる。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄し、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャム社製）などを用いてモノクローナル抗体が結合したバンドを検出することにより、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを検出する。ウェスタンブロッティングでの検出に用いられる抗体としては、天然型の立体構造を保持していないポリペプチドに結合できる抗体が用いられる。
＜＜物理化学的手法＞＞
物理化学的手法は、例えば、抗原であるＶＺＶｇＥと本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片とを結合させることにより凝集体を形成させて、この凝集体を検出することにより行う。この他に物理化学的手法として、毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法またはラテックス免疫比濁法［臨床検査法提要、金原出版（１９９８）］などを用いることもできる。ラテックス免疫比濁法は、抗体または抗原を感作させた粒径０．１〜１μｍ程度のポリスチレンラテックスなどの担体を用い、対応する抗原または抗体により抗原抗体反応を起こさせると、反応液中の散乱光は増加し、透過光は減少する。この変化を吸光度または積分球濁度として検出することにより被験サンプル中の抗原濃度などを測定する。
ＶＺＶｇＥが発現している細胞の検出または測定は、公知の免疫学的検出法を用いることができるが、中でも、免疫沈降法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法または蛍光抗体染色法などを用いることが好ましい。
免疫沈降法は、ＶＺＶｇＥを発現した細胞などを本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片と反応させた後、プロテインＧ−セファロースなどのイムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させる。または以下のような方法によっても行うことができる。ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに上述した本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片を固相化した後、ＢＳＡ−ＰＢＳによりブロッキングする。抗体が、例えばハイブリドーマ培養上清などの精製されていない状態である場合には、抗マウスイムノグロブリン、抗ラットイムノグロブリン、プロテイン−Ａまたはプロテイン−ＧなどをあらかじめＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに固相化し、ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングした後、ハイブリドーマ培養上清を分注して結合させる。次に、ＢＳＡ−ＰＢＳを捨てＰＢＳでよく洗浄した後、ＶＺＶｇＥを発現している細胞や組織の溶解液を反応させる。よく洗浄した後のプレートより免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーで抽出し、上記のウェスタンブロッティングにより検出する。
免疫細胞染色法または免疫組織染色法は、抗原を発現した細胞または組織などを、場合によっては抗体の通過性を良くするため界面活性剤やメタノールなどで処理した後、本発明のモノクローナル抗体と反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光標識、ペルオキシダーゼなどの酵素標識またはビオチン標識などを施した抗イムノグロブリン抗体またはその結合断片と反応させた後、該標識を可視化し、顕微鏡にて顕鏡する方法である。また、蛍光標識の抗体と細胞を反応させ、フロ−サイトメーターにて解析する蛍光抗体染色法［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック(1987)］により検出を行うことができる。特に、ＶＺＶｇＥに結合する、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片は、蛍光抗体染色法により天然型の立体構造を保持して発現している細胞の検出ができる。
また、蛍光抗体染色法のうち、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などを用いた場合には、形成された抗体−抗原複合体と、抗体−抗原複合体の形成に関与していない遊離の抗体または抗原とを分離することなく、抗原量または抗体量を測定できる。
＜免疫学的測定用キット＞
本発明の免疫学的測定用キットは、上記の免疫学的測定用装置と、検体（検体試料または単に試料ということもある）を希釈して展開するための検体希釈液とを含む。
本発明の免疫学的測定用キットにおいて検体希釈液は、展開液としても使用することができるものであるが、通常溶媒として水を用い、これに緩衝液、塩、および非イオン性界面活性剤、さらに、例えば抗原抗体反応の促進または非特異的反応を抑制するためのタンパク質、高分子化合物（ＰＶＰ等）、イオン性界面活性剤もしくはポリアニオン、または、抗菌剤、キレート剤等々の１種もしくは２種以上を加えてもよい。
非イオン性界面活性剤としては、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル）、Ｔｗｅｅｎ２０（商品名、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、ＮＰ−４０（商品名 ノニデット４０）、Ｂｒｉｊ３５、ノニオンＭＮ−８１１（日油社製）等が挙げられ、１種もしくは２種以上を加えてもよい。
好ましくは、検体希釈液が含有する非イオン性界面活性剤が、ＨＬＢ値６〜１２の非イオン性界面活性剤を一種以上含むことである。更に好ましくはＨＬＢ値７〜１１、最適にはＨＬＢ値８〜１０の非イオン性界面活性剤を一種以上含むことである。ＨＬＢ値６〜１２の非イオン性界面活性剤としては、好ましくは片末端が水酸基のポリオキシアルキレンエーテルが用いられる。片末端のアルキル基は、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、繰り返しのアルキルエーテル基のアルキル部位についても、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよい。
また、検体希釈液が含有する非イオン性界面活性剤が、ＨＬＢ値６〜１２の非イオン性界面活性剤を一種以上含むことに加え、ＨＬＢ値１３〜１８の非イオン性界面活性剤を一種以上含むことがより好ましい。その配合比としては、ＨＬＢ値６〜１２の非イオン性界面活性剤の総量（Ａ）に対するＨＬＢ値１３〜１８の非イオン性界面活性剤の総量（Ｂ）の質量比が、Ａ：Ｂ＝３０：７０〜７０：３０であることが好ましい。より好ましくは、Ａ：Ｂ＝４０：６０〜６０：４０で用いられる。
または、検体希釈液中で、検体試料から被検出物質（ＶＺＶｇＥ等）を抽出するために、アルコール等の周知の疎水的な物質（疎水性物質）を検体希釈液に含有させたり、検体を採取した直後に加えたりしてもよい。検体希釈液中に上記疎水性物質を含有させたり、加えたりすることによって、検体を希釈するのと同時に検体から被検出物質（ＶＺＶｇＥ等）を抽出することができるため、事前の抽出の手間を省くことができる上、検出感度を高めることができるため好ましい。
検体希釈液を展開液として用いる場合には、検体試料と展開液を予め混合した検体含有液を、試料添加部上に供給・滴下して展開させることもできるし、先に検体試料を試料添加部上に供給・滴下した後、展開液を試料添加部上に供給・滴下して展開させてもよい。
本発明においてＶＺＶｇＥを検出または測定する対象となる生体試料としては、例えば、組織、細胞、血液、血漿、血清、膵液、尿、糞便、組織液または培養液など、ＶＺＶｇＥが発現している細胞を含む可能性のあるものであれば特に限定されない。
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明は下記例に制限されるものではない。
［試験例１］ＶＺＶｇＥを認識する抗体の作製
ＶＺＶのｇＥタンパク質（ＶＺＶｇＥ）のアミノ酸配列（配列番号１）をＤＤＢＪ（国立遺伝学研究所データベース）より入手した。前記ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列から、膜貫通ドメインを除いた細胞外領域である配列番号２に示すアミノ酸配列（配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち１−５４４番目のアミノ酸配列）を特定し、対応する遺伝子配列を合成した。Ｈｉｓ−ｔａｇ発現用ベクターであるｐＥＴ３０２／ＮＴ−Ｈｉｓを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した後、脱リン酸化処理としてアルカリフォスファターゼにより処理し、前記遺伝子配列と混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いてライゲーション反応をおこなった。
目的遺伝子を組み込んだ組換えＶＺＶｇＥプラスミドを組換え蛋白発現用宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に導入した。導入菌をＬＢ寒天平板培地で培養し、得られたコロニーをＬＢ液体培地で培養した。さらに１ｍＭ ＩＰＴＧ（タカラバイオ）を添加して組換えＶＺＶｇＥの発現を誘導した後、Ｅ．ｃｏｌｉを回収した。回収した菌を可溶化バッファー［０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、２０ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅおよび０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）］に再浮遊し、超音波処理により可溶化した後、組換えＶＺＶｇＥをＨｉｓ ｔｒａｐ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて精製した。この精製タンパク質をリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと称する）に対して透析し、目的の組換えＶＺＶｇＥとした。
得られた組換えＶＺＶｇＥを免疫用抗原として、組換えＶＺＶｇＥに対するモノクローナル抗体（以下、抗ＶＺＶｇＥ抗体と称する）を作出した。モノクローナル抗体の作出は次のように、常法に従っておこなった。
１００μｇの組換えＶＺＶｇＥと等量のＡｄｕｖａｎｔ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ（Ｄｉｆｃｏ）を混合して、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、５週齢、日本ＳＬＣ）に３回免疫し、その脾臓細胞を細胞融合に用いた。
細胞融合には、マウスの骨髄腫細胞であるＳｐ２／０−Ａｇ１４細胞（Ｓｈｕｌｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０，１９７８）を用いた。細胞の培養には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）にＬ−グルタミン ０．３ｍｇ／ｍｌ、ペニシリンＧカリウム １００単位／ｍｌ、硫酸ストレプトマイシン １００μｇ／ｍｌ、Ｇｅｎｔａｃｉｎ ４０μｇ／ｍｌを添加し（ＤＭＥＭ）、これに牛胎児血清（ＪＲＨ）を１０％となるように加えた培養液を用いた。
細胞融合は、免疫マウスの脾臓細胞とＳｐ２／０−Ａｇ１４細胞を混合し、そこにＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ）を添加することにより行った。融合細胞はＨＡＴ−ＤＭＥＭ［０．１ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｈｙｐｏｘａｎｔｉｎｅ、０．４μＭ Ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎおよび０．０１６ｍＭ Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ）を含む血清加ＤＭＥＭ］で培養し、酵素結合抗体法（ＥＬＩＳＡ）により培養上清中の抗体産生を確認した。
抗体産生陽性の細胞をＨＴ−ＤＭＥＭ［０．１ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｈｙｐｏｘａｎｔｉｎｅおよび０．１６ｍＭ Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅを含む血清加ＤＭＥＭ］で培養し、さらに血清加ＤＭＥＭで培養を続けた。
クローニングした細胞は、２，６，１０，１４−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ（Ｓｉｇｍａ）を接種しておいたマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、リタイア、日本ＳＬＣ）に腹腔内接種し、腹水を採取した。この腹水をプロテインＧカラムに供し、モノクローナル抗体を精製した。最終的にＶＺＶｇＥを認識するモノクローナル抗体産生細胞が２３クローン得られた。
［試験例２］ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列のうち１−１８８番目のアミノ酸配列を認識する抗体を産生する細胞のスクリーニング
試験例１で得られたＶＺＶｇＥに認識するモノクローナル抗体産生細胞の２３クローンのうち、ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列のうち１−１８８番目のアミノ酸配列を認識する抗体を産生する細胞をスクリーニングするため、以下の実験を行った。
試験例１と同様の方法で、配列番号１で表されるＶＺＶｇＥのアミノ酸配列のうち、１−１８８番目のアミノ酸配列からなるリコンビナントタンパク質を作製し、以下の実験に用いた。
作製した０．０１ｍｇ／ｍｌのＶＺＶｇＥ（配列番号１のアミノ酸配列のうち１−１８８番目のアミノ酸配列）リコンビナントタンパク質溶液を、１０％の２−メルカプトエタノールを添加した２×Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ ＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴＥＦＣＯ社製）と等量で混合し、１００℃で１０分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、レディーゲル Ｊ５−２０％ １２ｗｅｌｌ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて、公知の標準的な方法に従った。泳動後のゲルからタンパク質をＳｅｑｕｉ−Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にブロッテイング装置（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により転写した。転写後のＰＶＤＦ膜をイムノブロック（ＤＳファーマラボラトリーズ）で室温にて１時間ブロッキングした。
ブロッキング液を除き、ＰＶＤＦ膜を０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（商品名）を含むＰＢＳ（以下、Ｔ−ＰＢＳという。）で１０分間３回洗浄後、試験例１で得られた２３のモノクローナル抗体産生細胞から産生されたモノクローナル抗体を含む培養上清とともに室温で１時間インキュベートした。抗体の濃度をそれぞれ１０μｇ／ｍｌに調製し、１レーン当たり１．０μｇのＶＺＶｇＥリコンビナントタンパク質と反応させた。
ＰＶＤＦ膜をＴ−ＰＢＳで１０分間３回洗浄後、Ｔ−ＰＢＳで５０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ社製）とともに室温で３０分間インキュベートした。Ｔ−ＰＢＳで１０分間３回洗浄後、発色基質である１−Ｓｔｅｐ（商標） ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ＰＩＥＲＣＥ社製）とともにＰＶＤＦ膜をインキュベートして、ＰＶＤＦ膜に結合した抗体を可視化した。
その結果、２１ｋＤａのバンド（ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１−１８８番目に相当）が、２３のモノクローナルの中から複数検出できた。後述する免疫クロマト分析試験に供するため、当該抗体のうちから任意に２種類の抗体を選び、該抗体を産生するハイブリドーマをクローニングして、この２つの独立したクローンを選び、それぞれをハイブリドーマＡ、Ｂと命名した。また、ハイブリドーマＡ、Ｂがそれぞれ産生する抗体を、抗体Ａ、Ｂと命名した。両抗体は、配列番号１で表されるＶＺＶｇＥのアミノ酸配列のうち１−１８８番目のアミノ酸配列を認識する抗体である。該ハイブリドーマ２株から得られたモノクローナル抗体のサブクラスはいずれもＩｇＧ１であった。
［試験例３］免疫クロマト分析
本試験では、試験例２で得られた抗体Ａ、Ｂを標識物質保持部及び検出部のいずれかに用いた免疫クロマト分析装置を作製し、免疫クロマト分析を行った。
＜免疫クロマト分析装置の作製＞
（１）試料添加部の作製
試料添加部としてグラスファイバーからなる不織布（ミリポア社製：３００ｍｍ×３０ｍｍ）を用いた。
（２）標識物質保持部の作製
金コロイド懸濁液（田中貴金属工業社製：ＬＣ４０ｎｍ）０．５ｍｌに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した抗体（抗体Ａ、Ｂのいずれか１つ）を０．１ｍｌ加え、室温で１０分間静置した。
次いで、１質量％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加え、更に室温で１０分間静置した。その後、十分撹拌した後、８０００×ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を除去した後、１質量％のＢＳＡを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加えた。以上の手順で標識物質溶液を作製した。
上記作製した標識物質溶液３００μＬに３００μＬの１０質量％トレハロース水溶液と１．８ｍＬの蒸留水を加えたものを１２ｍｍ×３００ｍｍのグラスファイバーパッド（ミリポア社製）に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識物質保持部を作製した。
（３）クロマトグラフ媒体部および検出部の作製
メンブレンとしてニトロセルロースからなるシート（ミリポア社製、商品名：ＨＦ１２０、３００ｍｍ×２５ｍｍ）を用いた。
次に、５質量％のイソプロピルアルコールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１．０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように、抗体（抗体Ａ，Ｂのいずれか１つ）を希釈した溶液１５０μＬを、乾燥されたメンブレン上の検出部位（検出ライン）に１ｍｍの幅でイムノクロマト用ディスペンサー「ＸＹＺ３０５０」（ＢＩＯＤＯＴ社製）を用いて１μＬ／ｍｍの量（１シートあたり２５μＬ）でライン状に塗布した。
また、金ナノ粒子標識試薬の展開の有無や展開速度を確認するために検出部位の下流に、金ナノ粒子標識物質と広く親和性を有するヤギ由来抗血清をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した液をコントロール部位（コントロールライン）に塗布した。その後、５０℃で３０分間乾燥させ、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフ媒体部および検出部を作製した。
（４）免疫クロマト分析装置の作製
次に、バッキングシートから成る基材に、試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収部としてグラスファイバー製の不織布を順次貼り合わせた。そして、裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、免疫クロマト分析装置とした。なお、標識物質保持部の試料展開方向の長さを１２ｍｍとした。
（５）検体希釈液
１質量％の非イオン性界面活性剤ＮＰ−４０（ナカライテスク社製、商品名：ノニデットＰ−４０、ＨＬＢ値１７．７）と、ノニオンＭＮ−８１１（日油社製、商品名：ノニオンＭＮ−８１１、ＨＬＢ値８．３）との質量比１：１混合物を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、を調製し、検体を希釈処理するための検体希釈液とした。
＜測定＞
試験例２で作製した０．０１μｇ／ｍｌのＶＺＶｇＥ（アミノ酸配列１−１８８番目）リコンビナントタンパク質を抗原として、上記作製した免疫クロマト分析装置を用いた場合の、検出部における発色強度を測定した。上記抗原は、上記検体希釈液で１００倍に希釈し、検体試料とした。
上記それぞれの検体試料１５０μＬを免疫クロマト分析装置の試料添加部上に載せて展開させ、検出部の着色の度合い（発色強度）をイムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス社製Ｃ１００６６−１０／−５０）にて測定した。結果を表１に示す。
Figure 0006982129
表１の結果により、ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列１−１８８番目を認識する抗体を免疫クロマト分析装置に用いることによって、ＶＺＶを検出することができることが分かった。
［試験例４］ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列のうち４８−８８番目のアミノ酸配列を認識する抗体のスクリーニング
試験例１で得られたＶＺＶｇＥに対するモノクローナル抗体のうち、ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列の４８−８８番目を認識する抗体をスクリーニングするため、以下の実験を行った。
Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ ｍｏｄｕｌｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、コード４６９９４９）ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに、ＶＺＶ ｇＥ（アミノ酸配列４８−８８）を、ペプチドの化学合成法の常法であるペプチド固相合成法で合成、精製したタンパク質ＶＺＶ ｇＥ（アミノ酸配列４８−８８）４ｎｇ／ｍＬ ｉｎ ５０ｍＭ 炭酸バッファーｐＨ９．５を１００μＬ加え、４°Ｃにて１６時間インキュベートした。１６時間後、ｇＥ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。
ブロッキング液として、５％ ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳＴ（ＢＳＡ：オリエンタル酵母社製）を３００μＬ加え、３７°Ｃで１時間インキュベートした。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。一次抗体として、抗ＶＺＶ ｇＥ抗体５μｇ／ｍＬ ｉｎ ５０％ ブロッキング溶液１００μＬをウェルに加え３７°Ｃで１時間インキュベートした。その後一次抗体溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。
二次抗体として、Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｒａｂｂｉｔ，ＩｇＧ Ｗｈｏｌｅ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｃｏｊｕｇａｔｅｄ（和光純薬社製、コード０１４−１７６１１）１ｍｇ／ｍＬを１００μＬ、ウェルに加え、３７°Ｃ、１．５時間インキュベートした。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。
ウェルに発色基質として、Ｓｕｒｅ Ｂｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏ ｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）（ＫＰＬ社製、コード５３−００−０１）を１００μＬ加え、１５分間反応させ、２Ｎ硫酸を１００μＬ加えて反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、６つのモノクローナル抗体がＶＺＶｇＥのアミノ酸配列のうち４８−８８番目のアミノ酸配列を認識する抗体として単離できた。当該抗体を産生するハイブリドーマをクローニングして、この６つの独立したクローンを選び、それぞれをハイブリドーマ２、３、４、５、９及び１８と命名した。また、ハイブリドーマ２、３、４、５、９及び１８がそれぞれ産生する抗体を、抗体２、３、４、５、９及び１８と命名した。また、該ハイブリドーマ６株から得られたモノクローナル抗体のサブクラスは全てＩｇＧ１であった。
［試験例５］免疫クロマト分析
本試験では、試験例２で得られた抗体２、３、４、５、９及び１８のいずれかを用いた免疫クロマト分析装置を作製し、免疫クロマト分析を行った。
＜免疫クロマト分析装置の作製＞
（１）試料添加部の作製
試料添加部としてグラスファイバーからなる不織布（ミリポア社製：３００ｍｍ×３０ｍｍ）を用いた。
（２）標識物質保持部の作製
金コロイド懸濁液（田中貴金属工業社製：ＬＣ４０ｎｍ）０．５ｍｌに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した抗体（抗体１〜６のいずれか１つ）を０．１ｍｌ加え、室温で１０分間静置した。
次いで、１質量％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加え、更に室温で１０分間静置した。その後、十分撹拌した後、８０００×ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を除去した後、１質量％のＢＳＡを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加えた。以上の手順で標識物質溶液を作製した。
上記作製した標識物質溶液３００μＬに３００μＬの１０質量％トレハロース水溶液と１．８ｍＬの蒸留水を加えたものを１２ｍｍ×３００ｍｍのグラスファイバーパッド（ミリポア社製）に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識物質保持部を作製した。
（３）クロマトグラフ媒体部および検出部の作製
メンブレンとしてニトロセルロースからなるシート（ミリポア社製、商品名：ＨＦ１２０、３００ｍｍ×２５ｍｍ）を用いた。次に、５質量％のイソプロピルアルコールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１．０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように、抗体（抗体１〜６のいずれか１つ）を希釈した溶液１５０μＬを、乾燥されたメンブレン上の検出部位（検出ライン）に１ｍｍの幅でイムノクロマト用ディスペンサー「ＸＹＺ３０５０」（ＢＩＯＤＯＴ社製）を用いて１μＬ／ｍｍの量（１シートあたり２５μＬ）でライン状に塗布した。
また、金ナノ粒子標識試薬の展開の有無や展開速度を確認するために検出部位の下流に、金ナノ粒子標識物質と広く親和性を有するヤギ由来抗血清をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した液をコントロール部位（コントロールライン）に塗布した。その後、５０℃で３０分間乾燥させ、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフ媒体部および検出部を作製した。
（４）免疫クロマト分析装置の作製
次に、バッキングシートから成る基材に、試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収部としてグラスファイバー製の不織布を順次貼り合わせた。そして、裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、免疫クロマト分析装置とした。なお、標識物質保持部の試料展開方向の長さを１２ｍｍとした。
（５）検体希釈液
１質量％の非イオン性界面活性剤ＮＰ−４０（ナカライテスク社製、商品名：ノニデットＰ−４０、ＨＬＢ値１７．７）と、ノニオンＭＮ−８１１（日油社製、商品名：ノニオンＭＮ−８１１、ＨＬＢ値８．３）との質量比１：１混合物を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、を調製し、検体を希釈処理するための検体希釈液とした。
＜測定＞
０．０１ｍｇ／ｍｌのＶＺＶｇＥリコンビナントタンパク質（ＣａｌＢｉｏｒｅａｇｅｎｔ社）を抗原として、上記作製した免疫クロマト分析装置を用いた場合の、検出部における発色強度を測定した。上記抗原は、上記検体希釈液で１００倍に希釈し、検体試料とした。
上記それぞれの検体試料１５０μＬを免疫クロマト分析装置の試料添加部上に載せて展開させ、検出部の着色の度合い（発色強度）をイムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス社製Ｃ１００６６−１０／−５０）にて測定した。結果を表２示す。
Figure 0006982129
表２の結果により、ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列のうち４８−８８番目を認識する抗体を免疫クロマト分析装置に用いて、ＶＺＶを検出することができることが分かった。特に、ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列４８−８８番目を認識する抗体（抗体９、１８）を、標識物質保持部または検出部の両方に含有させた場合に、ＶＺＶをより強く検出することができることが分かった。
［試験例６］ＶＺＶｇＥのアミノ酸配列のうち４８−８８番目のアミノ酸配列を認識する抗体の配列解析
抗体９及び抗体１８についてアミノ酸配列及びアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を決定した。これらの結果を表３に示す。
Figure 0006982129
塩基配列の解析に用いたプライマーは以下の通りである。なお、Ｎｏｖａｇｅｎ社Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔｓに含まれるプライマー、および文献（IMMUNOTHERAPY, Vol,33, 6, 2014）に記載のプライマーでは抗体９及び抗体１８をコードする塩基配列はともに増幅されなかった。配列番号２８及び２９における「ｒ」はａ又はｇ、「ｎ」はａ、ｃ、ｇ又はｔ、「s」はｃ又はｇ、「ｍ」はａ又はｃ、「ｗ」はａ又はｔの混合塩基をそれぞれ表す。
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号２８）:５’−cttccggaat tcsargtnma gctgsagsag tc−３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号２９）：５’−cttccggaat tcsargtnma gctgsagsag tcwgg−３’
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号３０）：５’−ggaagatcta tagacagatg ggggtgtcgt tttggc−３’
［試験例７］実検体による免疫クロマト分析
ＶＺＶを含有する検体試料として、ＶＺＶ感染者の水疱内容液を用いたことを除いて、試験例６を繰り返した。水疱内容液は、ＶＺＶ感染者である被験者の水疱を穿刺することにより採取した。また、採取した水疱内容液を、５００μＬの上記検体希釈液に添加し、検体試料とした。
上記それぞれの検体試料１５０μＬを免疫クロマト分析装置の試料添加部上に載せて展開させ、検出部の着色の度合い（発色強度）をイムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス社製Ｃ１００６６−１０／−５０）にて測定した。その結果、検体試料を実検体とした場合も、ＶＺＶｇＥリコンビナントタンパク質を抗原とした試験例６と同様の結果となった。
［試験例８］競合阻害試験によるエピトープ解析
抗体のエピトープのさらなる解析の為、配列番号１のアミノ酸配列のうち４８−６７番目のアミノ酸配列からなるペプチド断片（Ｐｅｐｔｉｄｅ１、以下Ｐ１と略す）、５４−７２番目のアミノ酸配列からなるペプチド断片（Ｐｅｐｔｉｄｅ２、以下Ｐ２と略す）、６２−８１番目のアミノ酸配列からなるペプチド断片（Ｐｅｐｔｉｄｅ３、以下Ｐ３と略す）、６９−８８番目のアミノ酸配列からなるペプチド断片（Ｐｅｐｔｉｄｅ４、以下Ｐ４と略す）を上記方法にて合成した。各ペプチド断片を表４に示す濃度となるように検体希釈液に加えた以外は、試験例６と同様に実施した。ＶＺＶｇＥの全長アミノ酸配列に対する各ペプチド断片の位置について、図２に模式図を示す。
結果を表４及び図３に示す。表４において、ＰＣとは、合成ペプチドを非添加であるコントロールを示す。表４および図３において、「ＮＣ」は陰性対照を示し、ＶＺＶｇＥと反応するが配列番号１のアミノ酸配列のうち４８−８８番目のアミノ酸配列には反応しない抗体を添加した結果である。
Figure 0006982129
表４に示すように、ＶＺＶｇＥリコンビナントタンパク質と比較し、相対的に過剰量のペプチド断片を加えているにも関わらず、いずれのペプチド断片とも競合阻害を生じなかった。したがって、当該抗体は配列番号１のアミノ酸配列のうち４８−８８番目のアミノ酸配列を持つペプチド断片とは反応し、４８−６７番目のペプチド断片（Ｐ１）、５４−７２番目のペプチド断片（Ｐ２）、６２−８１番目のペプチド断片（Ｐ３）、６９−８８番目のペプチド断片（Ｐ４）とは反応しないことがわかった。
１ 試料添加部（サンプルパッド）
２ 標識物質保持部
３ クロマトグラフ媒体部
４ 検出部
５ 吸収部
６ バッキングシート

Claims (7)

  1. 試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む、ＶＺＶを検出するための免疫学的測定用装置であって、前記標識物質保持部及び前記検出部が以下の（i）又は（ii）である、免疫学的測定用装置。
    （i）前記標識物質保持部が下記（１ａ）の抗体又はその抗原結合性断片を含有し、且つ前記検出部が下記（２ａ）の抗体又はその抗原結合性断片を含有する。
    （ii）前記標識物質保持部が下記（２ａ）の抗体又はその抗原結合性断片を含有し、且つ前記検出部が下記（１ａ）の抗体又はその抗原結合性断片を含有する。
    （１ａ）水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−Ｚｏｓｔｅｒ Ｖｉｒｕｓ、以下、ＶＺＶと略記する）の糖タンパク質Ｅ（以下、ＶＺＶｇＥと略記する）に対する抗体又はその抗原結合性断片であって、抗体の重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ；以下、ＶＨと略記する）の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；以下ＣＤＲと略記する）１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号８、９および１０に記載されるアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ；以下、ＶＬと略記する）のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１１、１２および１３に記載されるアミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合性断片。
    （２ａ）ＶＺＶｇＥに対する抗体又はその抗原結合性断片であって、ＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１４、１５および１６に記載されるアミノ酸配列を含み、抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１７、１８および１９に記載されるアミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合性断片。
  2. 前記試料添加部に添加する試料が、水痘帯状疱疹ウイルスを含む水疱内容液である、請求項１に記載の免疫学的測定用装置。
  3. 前記（１ａ）の抗体が下記（ＩＡ）の抗体であり、前記（２ａ）の抗体が下記（ＩＩＡ）である、請求項１または２に記載の免疫学的測定用装置。
    （ＩＡ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２０に記載されるアミノ酸配列であって、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２１に記載されるアミノ酸配列である抗体。
    （ＩＩＡ）ＶＨのアミノ酸配列が配列番号２２に記載されるアミノ酸配列であって、かつＶＬのアミノ酸配列が配列番号２３に記載されるアミノ酸配列である抗体。
  4. 前記抗体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の４８〜８８番目のアミノ酸配列によって構成される立体エピトープを認識し、配列番号１で示されるアミノ酸配列の４８〜６７番目のアミノ酸配列によって構成される立体エピトープ、５４〜７２番目のアミノ酸配列」によって構成される立体エピトープ、６２〜８１番目のアミノ酸配列によって構成される立体エピトープ、及び、６９〜８８番目のアミノ酸配列によって構成される立体エピトープを認識しない抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫学的測定用装置。
  5. 前記抗体が、遺伝子組換え抗体である請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫学的測定用装置。
  6. 前記抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる１の 抗原結合性断片 である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫学的測定用装置。
  7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫学的測定用装置を用いて、検体中のＶＺＶを検出する方法であり、以下の工程（１）〜（４）を含む免疫学的測定方法。
    （１）検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を前記試料添加部に添加する工程
    （２）前記標識物質保持部に保持されている前記抗体又はその抗原結合性断片により水痘帯状疱疹ウイルスを認識させる工程
    （３）前記検体及び前記抗体又はその抗原結合性断片を移動相として前記クロマトグラフ媒体部に展開させる工程
    （４）展開された移動相中の水痘帯状疱疹ウイルスを前記検出部に含まれる前記抗体又はその抗原結合性断片により検出する工程
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