KR101520672B1 - 유방암 줄기 유사세포 분리방법 - Google Patents

유방암 줄기 유사세포 분리방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유방암 줄기유사세포 분리방법에 관한 것이다.

Description

유방암 줄기 유사세포 분리방법{A method of isolating breast cancer stem-like cells}
본 발명은 유방암 줄기유사세포 분리방법에 관한 것이다.
지난 수년간의 연구들은 그러한 암 줄기 유사 세포(cancer stem-like cells;CSLCs)[일반적으로 '암줄기세포(CSCs) 또는 암-개시 세포(CICs)'라고도 함]의 존재에 대한 강한 증거를 제공하였다.
세포 분획화 실험 유래 축적된 실험적 증거들이 있다(Al-Hajj and Clarke, 2004; Oncogene 23, 7274-7282.; Dick, 2008; Blood 112, 4793-4807). CSLC는 뇌, 전립선, 유방, 흑색종, 다발성 골수종, 대장, 췌장 및 두경부 암을 포함하는 여러 악성종양으로부터 분리되고 동정된 많은 연구들이 정의되었다(Collins et al., 2005; Collins, A.T., Berry, P.A., Hyde, C., Stower, M.J., and Maitland, N.J. (2005). Cancer Res. 65, 10946-10951;Fang et al., 2005; Fang, D., Nguyen, T.K., Leishear, K., Finko, R., Kulp, A.N., Hotz, S., Van Belle, P.A., Xu, X., Elder, D.E., and Herlyn, M. (2005). Cancer Res. 65, 9328-9337;Li et al., 2007; Li, C., Heidt, D.G., Dalerba, P., Burant, C.F., Zhang, L., Adsay, V., Wicha, M., Clarke, M.F., and Simeone, D.M. (2007). Cancer Res. 67, 1030-1037). CSLCs는 전형적으로 전체 암 세포 군의 작은 서브셋이고, 기능적인 알데히드 탈수소효소-1 (ALDH1) (Dylla, S.J., Beviglia, L., Park, I.K., Chartier, C., Raval, J., Nyan, L., Pickell, K., Aguilar, J., Lazetic, S., Smith-Berdan, S., et al. (2008). PLoS One 3, e2428;Huang, E.H., Hynes, M.J., Zhang, T., Ginestier, C., Dontu, G., Appelman, H., Fields, J.Z., Wicha, M.S., and Boman, B.M. (2009). Cancer Res. 69, 3382-3389) 또는 CD133 (Rich, J.N. (2007). Cancer Res. 67, 8980-8984), CD44 및 CD24 (Dalerba, P., Cho, R.W., and Clarke, M.F. (2007).Annu. Rev. Med. 58, 267-284) 와 같은 특정 세포 표면 마커의 발현에 기초하여 분리될 수 있다. 유방 CSLCs는 부분 개체군 (side-population) 세포에 대한 특정 표면 마커 또는 특정 마커, CD44high/CD24low 세포(Al-Hajj 2003)에 대하여 분류하여 인리치(enrich)될 수 있지만 또한 그것은 여러 종양들에서 많은 비 줄기유사세포 및 악성 유방 종양 상에도 프리젠트(present)된다. 사실 이들 마커들을 발현하는 대부분의 세포는 줄기 유사세포가 아니다.
CSLCs는 종양 유도, 전이 및 약제 내성을 갖는 세포로 결과적으로 많은 경우 종양 재발에 관여한다(Fengyan Yu, 2007). CSLCs 가설의 확장은 CSLCs가 세포독성 암 치료제에 대한 저항성을 부여하여 방사선 또는 화학요법으로 치료된 종양의 재군집화를 가능하게 할 수 있는 가능성을 유도한다. 많은 분자 기작들이 업-레귤레이트된 ATP-결합 카세트 트랜스포터에 의한 효과적인 DNA 손상 반응 및 향상된 항-에팝토시스와 같은 기작을 통해 CSLCs에서의 약재 내성과 관련되어 있다. 결국 CSLCs의 분자적 조절 및 CSLCs 특성이 종양의 생존 기작 및 치료제 내성과 직접 관련이 있는지에 대해서는 거의 알려지지 않았다.
또한 비록 약제 내성의 여러 종양 세포 기작이 동정되었지만 그것의 분자적 기작은 여전하게 불명료하게 남아있다.
[선행 특허문헌]
대한민국 특허공개번호 제1020080018619호
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 효과적이고 단순한 유방암 줄기 유사세포 분리방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 환자 유래 1 차 유방암 세포의 계대를 성장 배지에서 현탁 배양하고, 그 현탁된 세포를 분리하는 것을 포함하는 유방암 줄기 유사세포 분리방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 방법은 환자 유래 1 차 유방암 세포의 7 또는 8 계대를 플레이트 상의 성장 배지에서 현탁하는 것이 바람직하고,
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 방법은 환자 유래 1 차 유방암 세포의 7 또는 8 계대를 10일 동안 비 코팅된 플레이트 상의 성장 배지에서 현탁하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 화학요법 치료된 환자 유래 1 차 유방암 세포의 계대를 성장 배지에서 현탁배양하고 그 현탁된 세포를 분리하는 것을 포함하는 유방암 줄기 유사세포 분리방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 수술 전 화학요법 치료는 독소루비신(Doxorubicin)이나 탁솔 (Paclitaxel)이나 독시탁셀 (Doxetaxel)에 의하여 수행된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 화학요법 치료된 환자 유래 1 차 유방암 세포의 계대를 성장 배지에서 현탁배양하고 그 현탁된 세포를 분리하는 것을 포함하는 스피어-형성 및 종양성 CD24-/CD44-/CD133+ 인간 유방암 줄기 유사세포 분리방법을 제공한다.
또한 본 발명은 화학요법 치료된 환자 유래 1 차 유방암 세포의 계대를 성장 배지에서 현탁배양하고 그 현탁된 세포를 분리하는 것을 포함하는 스피어-형성 및 종양성 CD24-/CD44-/CD133+ 인간 유방암 줄기 유사세포 인 비트로 증식방법을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
최근 암 치료 연구를 위한 다양한 분야에서 암 줄기세포가 유용하게 이용되고 있다.
그러나 기존의 암 줄기세포 분리방법은 각각의 암 줄기세포가 갖고 있는 특정 세포 표면 마커 들을 확인할 수 있는 고가의 항체를　이용한 FACS 소팅이나, EGF, FGF 등과 같은 고가의 성장 인자가 들어간 특별한 배지를 이용하여 암 조직/세포에서 암 줄기세포를 분리/ 정제하고 있다.
그러나 이러한 방법들은 고가의 비용이 들고 각 암 줄기세포들에 사용되는 항체의 특이성이 부정확하며 분리/ 정제된 세포의 수가 매우 적어 연구에 사용되기 위해서는 많은 시간과 비용이 들어 비효율적이다.
본 발명에 사용한 방법은 보통 여러 정상세포나 암세포 배양 시 사용되는 성장 배지만을 사용하여 세포를 배양 접시에 부착시키지 않고 일정 기간 부유 배양을 시킴으로써 기존의 방법보다 시간과 비용이 적게 들고 매우 효율적으로 암 줄기세포를 얻을 수 있는 방법이다.
유방 CSLCs의 유지를 지배하는 첫번째 단계로, 본 발명자들은 배아줄기세포(ESCs)의 자기재생 특성에서 연류된 현탁액에 초점을 맞추었다. 분리에서 CSLCs를 연구하기 위한 통상적인 방법은 특정 표면 마커에 의한 분획화 또는 세포 소팅에 의존한다. 그것은 매우 고가이며, 장시간이 소요되고 비효율적이고 낮은 민감성의 부정확한 원인이다. 따라서 이들 방법은 순수한 CSLCs의 분리에 대하여 부정확하다. 실험적 효율성 및 정확성을 개량하기 위항여 본 발명자들은 '현탁액 배양 조건'을 사용하여 방법을 변화시키는 새로운 전략을 시도하였다. 종종, 현탁액 배양(suspension culture, 이하 'SC'라 함) 방법은 스피어(sphere) 형성 배지로 스피어 형성을 사용하여 에세이한다. 이 기술은 세포의 자기재생 특성에 의존한다. 이 기반하에, 본 발명자들은 성장 배지(배양배지라 함)로 현탁액 배양 방법에 의하여 인 비트로 유방 CSLCs를 분리하고 증식을 시도하였다. 환자 유래 1차 유방암 세포의 배양을 위한 전에 기재된 방법을 적용하여 본 발명자들은 자기재생 특성을 가진 유방 CSLCs의 배양을 얻었다. 자기재생은 CSLCs의 정의에서 중심 특성 중 하나이다.
본 발명의 데이터는 화학요법 치료된 환자들로부터 유래된 유방암은 CSLCs의 특성을 가지는 세포가 매우 농후하다는 것을 시사한다. 또한 상기 언급된 많은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명자들은 SC 방법을 적용하였다. 이 SC 방법들은 화학요법 치료된 종양에서 자기 재생 세포 특성의 보유를 추적하기 위하여 채택하였다. 본 발명자들은 자기재생 및 약제 내성을 지시하는 유방 CSLCs를 분리하고 동정하였다.
암 연구에서 유방 암 줄기 유사세포(breast cancer stem-like cell, 이하, 'BCSC'라 함)의 적용은 악성 종양 세포의 분리와 동정을 위한 단순하고 정확한 방법의 부족에 의하여 제한되어왔다. 게다가 현재 BCSCs가 인 비트로에서 증식될 수 있다는 직접적인 증거가 여전히 부족하다. 본 발명에서, 본 발명자들은 단순한 현탁 배양(SC) 방법이 화학요법 치료된 환자들로부터 유래된 높은 스피어-형성 및 종양성 CD24-/CD44-/CD133+ 인간 BCSCs의 효과적인 분리 및 인 비트로 증식에 유용하다는 것을 시사한다. 인 비트로 및 인 비보 실험 시스템을 이용하여, 본 발명자들은 환자 유래된 BCSCs, KU-CSLCs (Konkuk University-Cancer Stem-Like Cells)가 증가된 자기재생 활성 및 약제 내성, 종양형성과 같은 여러 암 줄기 세포 특성을 보인다는 것을 발견하였다. 이 결과들은 신규한 타입 BCSCs의 분리를 위한 단순한 방법을 제공하고 재발성 유방암의 치료를 위한 자기재생 신호전달의 조절의 임상적 중요성을 가능하게한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
화학요법 치료된 환자 종양 세포는 현탁배양 조건 하에서 세포를 현탁하는 것을 촉진함
CSLCs 가설에 따르면, 종양 세포에서 CSLCs의 줄기세포 유사 특성은 화학요법 저항성을 매개한다(Al-Hajj, 2007; Domingo-Domenech et al., 2012; Rich, 2007; Wicha et al., 2006; Yu et al., 2007). 화학요법이 CSLCs를 증가시키는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 화학요법 치료 또는 비(non)-화학요법 치료된 유방암 세포에서 세포 생존률을 조사하였다. 전체적으로 수술전에 유방암으로 진단받은 72 명 환자를 화학요법 또는 비-화학요법 후에 수술을 수행하였다. 이들 중에서, 11 명 환자들(16%)은 수술 전에 화학요법에 노출하고 61명 환자들(84%)은 화학요법에 노출하지 않았다(도 1A). 먼저 본 발명자들은 화학요법 또는 비-화학요법을 받은 조직학적 그레이드 I, 그레이드 II, 그레이드 III, 그레이드 IV 환자 유래 1차 유방암 세포의 세포 생존률에 대한 항암제 doxorubicin의 효과를 조사하였다(도 1B). 일반적으로, doxorubicin (Adriamycin TM)는 유방암 치료에 사용된 효과적인 치료제이다. 0.1 μM doxorubicin의 처리는 화학요법 치료 환자 암세포 환자 18 및 33의 세포 생존률에서 현저한 감소가 없었다. 반면에, 비-화학요법 치료된 환자 암세포는 doxorubicin 처리에 의하여 세포 생존률에서 현저한 감소를 가졌다(도 1B). 이 결과에서,본 발명자들은 화학요법 치료된 암 세포는 비-화학요법 치료된 환자 암세포에 비하여 더 높은 항암제 내성을 가진다는 것을 관찰하였다. 다음 본 발명자들은 종양 세포에서 더 높은 군의 줄기 유사 세포는 화학요법의 낮은 임상 반응과 관련된다는 것을 가설하였다.
많은 증거들이 종양의 성장 능력은 종양 내에서 소수 세포들을 나타내는 CSLCs에 의존한다는 것을 시사한다(Shu, Z., Curt, B., Chan, M.W., Hung-Cheng, L., Daniela, M., Schilder, J.M., Yan, P.S., Huang, T.H., Nephew, K.P. (2008). Cancer Res 68, 4311-4320). 신선한 화학요법 치료된 환자 암세포로부터 유래된 세포들은 줄기세포 유사 콜로니를 나타내었다(도 1C-a). 이들 콜로니들의 인 비트로 배양은 스페로이드(spheroid)-유사 형성을 생성하였고 이것은 종양 기질 전구세포(stromal progenitors)의 존재를 시사한다(도 1C-b). 이 결과에서, 본 발명자들은 화학요법 치료된 환자 암 세포는 암 줄기유사세포군을 가진다는 것을 예측하였다. 이 가설을 입증하기 위하여 본 발명자들은 화학요법 치료 또는 비처리된 환자 암 세포를 분석하기 위하여 SC 방법을 사용하였다. SC 방법은 실험 과정 및 세포 조건에서 서술된다(도 1C-c 상단 패널). 비-화학요법 치료 환자 암 세포는 조직 그레이드 IV를 제외하고는 SC방법 하에서 현탁되지 않았다(도 1C-c 하단 패널).조직 그레이드 IV의 현탁된 세포들은 침습성에 의하여 야기될 수 있다. 그러나 조직 그레이드 IV의 현탁된 이들 세포는 15일에 사멸되었다. 흥미롭게도, 화학요법 치료 환자 암세포에서 현탁된 세포의 퍼센트는 3 일에 현저하게 증가되고 10일에 95% 이상이었다(도 1C-c 하단 패널). 화학요법 치료 환자 암 세포에서 현탁 세포들의 수는 3일에 관찰되기 시작하여 10일까지 점차적으로 현탁된 세포의 수가 증가되었다(도 1D). 반면, 비-화학요법 치료된 환자 암세포들은 SC 방법 하에서 현탁되지 않았다. 따라서 10일에 화학요법 치료 그레이드 III 환자 암세포의 현탁된 세포들은 유방 CSLCs으로 중요하다. 이들 세포들을 KU-CSLCs로 명명하였다. 또한 이들 KU-CSLCs는 환자 유래 1차 유방암 세포와 형태적으로 차이를 나타내었다. 본 발명자들은 환자 유래 1차 유방암 세포와 KU-CSLCs의 면역 염색 또는 상 이미지에 의하여 세포 형태를 관찰하였다. 대부분 환자 유래 1차 유방암 세포 형태는 유사한 형태를 가졌다. 결론적으로 본 발명자들은 핵의 비율이 KU-CSLCs에서 팽창하였다는 것을 발견하였다(도 1E).
KU-CSLCs의 표면 마커 발현 및 EGFR 계열
KU-CSLCs의 CSLCs 포텐셜을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 특정 수용체 및 표면 마커들의 발현을 관찰하였다. 최근에, CSLCs의 동정 및 분리를 위하여, 특정 마커 유전자(ALDH1 또는 HER2 등) 또는 표면 마커(CD24, CD44, CD10, CD133 등)을 사용하는 것이 암 줄기세포 연구에서 우선권을 가졌다. 비록 이들 특정 마커들이 다른 단계의 종양에서 다양한 발현 레벨을 나타내지만 그들의 주된 조절 기능은 불명확하다. 먼저, 본 발명자들은 EGFR 계열의 발현을 PCR 분석을 사용하여 조사하였다(도 1F). EGFR2/HER2는 CSLC 군의 확장을 매개한다. 화학요법 치료 환자 암세포는 EGFR 1 및 2 유전자를 용이하게 발현하였다. 그러나, EGFR 3 및 4 유전자들은 현탁 배양 조건 하에서 더 높은 발현을 나타내었다. 그리고 비-화학요법 치료 환자 암 세포 상에서는 EGFR 계열 유전자들 발현에서 현저한 차이가 검출되지 않았다(도 1F). 사실, 여러 유방암 세포주에서, EGFR 계열 유전자의 발현 레벨은 다양하고 이것은 EGFR 계열 유전자 발현이 유방 CSLCs 특성과 강하게 관련이 없다는 것을 의미한다(도 1F). 비록 EGFR 계열 유전자들의 발현이 KU-CSLCs 상에서 증가되었지만, 본 발명자들은 데이터에서 EGFR 계열 유전자들과 유방 CSLCs 특성 사이의 관련성을 발견할 수 없었다.
CD133 발현이 유방, 전립성 및 뇌를 포함하는 몇 종의 암들의 CSLCs에서 보고되었다. 또한, CD133 발현은 Ewing sarcoma 세포에서 항암제 내성과 관련된다. 따라서 본 발명자들은 이 가설적인 표면 마커 CD24/CD44/CD133의 발현을 확인하였다. SKBR3 및 MDA MB231의 대부분 현탁된 세포들은 10일에 CD44+/ CD24- 표현형을 가졌다(도 1G-a). 흥미롭게도, 대부분의 화학요법 치료된 환자 암 세포들은 현탁배양 전에 CD44+/ CD24- 표현형을 가지지만, 10일 후 현탁배양은 대부분 세포들은 CD44-/ CD24- 표현형이 되었다(도 1G-b). CD133 발현은 SKBR3 및 MDA MB231 세포의 현탁배양 조건에서만 약간 증가하였다. 그러나 화학요법 치료된 환자 암세포들은 지속적으로 CD133를 발현하였다. 비록 SKBR3 및 MDA MB231 세포들은 현탁 배양 조건 상에서 CD44+/ CD24-/ CD133+ 표현형을 발현하였지만, KU-CSLCs는 CD44-/ CD24-/ CD133+ 표현형을 가졌다. 결론적으로 본 발명자들은 CD44+/ CD24- / CD133+ 표현형은 유방 CSLCs 특성을 확인하기 위한 절대적인 마커가 아니라는 것으로 여겼다.
항암제 내성 및 자기재생에서 KU-CSLCs의 동정
KU-CSLCs는 환자 유래 1차 유방암 세포와 형태적인 면에서 완전하게 다른 것을 보여준다. KU-CSLCs가 CSLCs의 특이적인 특성을 가지지는지를 결정하기 위하여 본 발명자들은 MCF 10A, MCF 7, SKBR 3, MDA MB231, 환자 18 또는 33, KU-CSLC 1 또는 2에서 ABCG2, ABCC1, ABCB5와 같은 다중 약제 내성( multi-drug resistant;MDR) 관련 유전자, aldehyde-dehydrogenase 1 (ALDH1)와 같은 약제 내성 유전자들의 유전자 발현을 비교하였다. 본 발명자들은 ABCG2, ABCC1, ABCB5와 같은 MDR 관련 유전자 및 ALDH1의 발현을 분석하였다. CSLCs는 ABCC1 및 ABCBs와 같은 ABC(ATP-binding cassette) 트랜스포터를 발현하였다(Hirschmann-Jax, C., 2004). 도 2B에 나타낸 것과 같이, KU-CSLCs는 ABCG 2, ABCC 1, 및 ABCB 5를 발현하였다. 따라서 본 발명자들은 화학요법제에 저항성이 증가된 KU-CSLCs를 조사하였다. 본 발명자들은 KU-CSLCs는 화학요법제, doxorubicin 및 pacilitaxol의 통상적인 사용에 대한 환자 18 또는 33, MCF 10A, MCF 7, SKBR 3, 및 MDA MB231 보다 강한 자기재생 활성 및 강한 약제 내성 활성을 나타내는 것을 발견하였다(도 2A).
현탁 세포의 수는 인 비트로 자기재생을 할 수 있는 세포의 능력을 반영한다. CSLCs의 주된 특성은 자기재생을 겪는 그것의 독특한 능력이다. KU-CSLCs가 암 줄기세포의 특이적인 성질을 가지는지를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 MCF 10A, MCF 7, SKBR 3, MDA MB231, 환자 18 또는 33, KU-CSLC 1 또는 2 및 인간 배아 암종에서 Nanog, Oct 4, 및 Sox 2와 같은 자기재생 마킹 유전자의 유전자 발현을 비교하였다. KU-CSLCs는 1차 환자 암 세포보다 자기재생 유전자에서 더 높은 레벨이 발현되었다(도 2C). Oct 4, Nanog, 및 Sox 2의 유전자 발현은 유방 종양 및 유방암세포주에서 동정되었다. 흥미롭게도 본 발명자들은 MDA MB231 및 KU-CSLCs는 스피어 형성 배지(F. M.)에서 3일 후 스피어를 형성하는 것을 관찰하였다. 그러나 배양된 배지(C. M.)에서, 단지 KU-CSLCs 만 3일 후 스피어를 형성하였다(도 2D, 우측 패널). KU-CSLCs는 성장인자 없이 스피어를 형성하였고 이것은 MDA MB231 세포주보다 더 높은 자기재생 활성을 가진다는 것을 시사한다. 또한, F.M. 조건 하에서 스피어 형성된 MDA MB231 세포들은 C.M. 조건보다 더 높은 자기재생 유전자 발현 레벨을 나타내었다(도 2D, 우측 패널). 그러나, KU-CSLC 1에서 F.M. 및 C.M 사이에 자기재생 마커 유전자들에서 현저한 발현차이가 없었다 (도 2D, 좌측 패널). KU-CSLCs의 스피어가 자기재생 세포가 농후한지를 결정하기 위하여 본 발명자들은 KU-CSLCs 스피어로부터 스피어들을 계대하였다. KU-CSLCs는 MDA MB231 보다 약 1.5배 이상 스피어를 형성하였다(도 2E). 1차 스피어 유래 KU-CSLCs는 인 비트로 자기재생 능력을 나타내는 동일한 비율의 2차 및 3차 스피어를 생성하였다. 이 결과들에서 본 발명자들은 KU-CSLCs가 더 높은 자기재생을 반영하는 전형적인 종양스피어를 크게 형성하였다는 것을 시사한다.
면역 결핍 마우스에서 KU-CSLCs의 종양 형성 능력
본 발명자들은 KU-CSLCs가 종양형성에 대한 능력을 가지지는지를 질의하였다. 놀랍게도 본 발명자들은 KU-CSLCs 세포들이 MDA MB231 보다 더 큰 종양형성 활성을가지는 것을 관찰하였다. 일련의 희석 실험을 MDA MB231, 환자 33 및 KU-CSLCs 세포의 인 비보 종양형성을 측정하기 위하여 수행하였다. NOD/SCID 마우스를 기재된 것과 같은 여러 다른 세포의 수로 피하 주사하고 주사 4주 후에 조사하였다. KU-CSLCs 세포 주사된 마우스는 MDA MB231 세포를 주사한 것과 비교하여 매우 큰 종양을 생성하였다(도 3A-a). 도 3A-b에 나타낸 것과 같이, 본 발명자들은 MDA MB231 세포 보다 KU-CSLCs 세포에서 더 높은 종양형성 활성을 관찰하였다. 이들 1차 종양의 면역 조직 조사는 전이 또는 침습성종양의 조직학적 특성을 나타내었다(도 3B). 이 종양 세포들을 N-cadherin, E-cadherin, 및 twist와 같은 EMT (Epithelial-Mesenchymal Transition) 마커들에 대해 염색하였다. 그러나 E-cadherin은 KU-CSLC 1 및 MDA MB231 유래 종양에서 검출되지 않았다. 중요하게도 KU-CSLCs 세포 주사에 의하여 생성된 종양들은 순서적으로 2nd 및 3rd 수용체로 계대할 수 있다. 차후 종양의 부피 및 중량은 주사된 세포 수에 의존하여 증가되었다(도 3C). 또한, EMT 유전자 발현은 3rd 주사에서 증가되었다(도 3D, 3E). 종합하면 본 발명자들은 화학요법 치료된 환자로부터 유래된 1차 배양된 세포에서 단순한 SC 방법에 의하여 유방 를 축적하기 위하여 이용하였다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이 본 발명은 CSLCs의 농후를 보유하는 화학요법 치료된 환자 암세포를 이용할 가능성을 나타내고, CSLCs의 분자적 기작 연구 및 치료적 접근을 수행하는 강력한 수단을 제공한다. 본 발명의 가장 큰 중요성 중 하나는 Nanog가 KU-CSLCs의 종양형성을 조절하고 자기재생 및 약제 내성에 대한 그들의 반응을 지배하는데 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 종합하면, 본 발명의 결과는 Nanog-MEK/ERK 경로가 유방CSLCs의 제거를 위한 효과적인 치료제의 개발을 위한 잠재적인 타겟이라는 것이다.
도 1은 SC 방법에 의한 환자 유래 암세포로부터 유방 암 줄기유사세포의 분리. (A) 원 다이어그램은 각 종양 조직 그레이드 환자에서 화학요법 치료 또는 비처리의 퍼센트. (B) doxorubicin로 처리된 환자 유래 1차 유방암세포의 생존률의 용량-반응 그래프(*p<0.05). 에러 바는 적어도 3번의 독립적인 실험에서 SD를 나타냄. (C) a, 환자 18 및 33 세포로부터 유래된 1차 유방암 세포(계대 3, 좌측 패널)의 위상차 이미지(40X). 중앙 패널은 환자 18 및 33 세포(계대 8)에서 줄기 세포 유사 콜로니를 보이고 인 비트로 배양 세포 트랜스퍼 콜로니의 위상차 이미지 (우측 패널, 40X). b, 콜로니 세포는 스피어를 형성하고 crystal violets에 의하여 염색. c, 우측 패널, 현탁과 부착을 나누는 단일 세포 카운트의 분리 방법의 개략 설명. 하단 패널, 0, 3, 5, 10 일에 환자 유래 1차 유방암 세포의 단일 세포로부터 배양된 현탁 및 부착의 퍼센트 (D) 현탁 및 부착에서 세포의 수를 화학요법 치료 또는 비처리 환자 세포의 단일세포로부터 카운트(*p<0.05). 에러 바는 적어도 3회 독립적인 실험에서 SD를 나타냄. (E) 상단 패널, 환자 3, 45, 33, 2 세포에서 위상차 이미지. 하단 패널, 환자 18, 33, KU-CSLC 1, 2 세포에서 액틴(원형질) 및 topro(핵)의 면역조직화학염색 및 액틴과 actin과 topro 염색 사이의 비율의 정량화. (F) EGFR 계열 유전자(EGFR 1, 2, 3, 4) 유전자의 RT-PCR 분석을 0, 3, 10 현탁 일에 화학요법 치료 또는 비처리 환자 세포 및 MCF 10A, MCF 7, SKBR 3, MDA MB231에서 발현. (G) a, 대부분의 SKBR3, MDA MB231 세포는 유방암 줄기 세포에 대해 예측되는 것으로 CD44+/CD24-/CD133+. b, 화학요법 치료된 환자 세포(환자 18, 33)는 현탁 0-10일에 CD44-/CD24-/CD133+.
도 2는 암줄기 유사세포의 기질을 가지는 KU-CSLCs. (A) doxorubicin 및 pacilitaxol로 처리된 MCF 10A, MCF 7, SKBR 3, MDA MB231, 환자 18, 환자 33, KU-CSLC 1, 및 KU-CSLC 2의 생존률의 용량 반응 그래프(*p<0.05). (B) ALDH 1, 다중약제 내성 유전자(ABCG2, ABCC1, 및 ABCB5)의 RT-PCR 분석을 MCF 10A, MCF 7, SKBR 3, MDA MB231, 환자18, 환자 33, KU-CSLC 1, 및 KU-CSLC 2에서 발현. (C) Nanog, Oct 4, 및 Sox 2의 RT-PCR 분석을 MCF 10A, MCF 7, SKBR 3, MDA MB231, 환자18, 환자 33, KU-CSLC 1, KU-CSLC 2, 및 인간 배아 암종(대조군)에서 발현. (D) 좌측 패널, Nanog, Oct 4, 및 Sox 2의 RT-PCR 분석을 스피어 형성용 두 종의 배지에서 MDA MB231 및 KU-CSLC 1에서 발현. 우측 패널, MDA MB231, 및 KU-CSLC 1는 스피어를 형성하고 crystal violets에 의하여 염색. (E) MCF 10A, MDA MB231, 및 KU-CSLC 1의 스피어는 10,000 세포에 의하여 생성되고, 3계대에서 유사한 스피어 시작 능력에 의하여 나타냄(*p<0.05). 데이터는 3 독립 실험의 평균±SD로 나타냄.에러 바는 적어도 3회 독립적인 실험에서 SD를 나타냄.
도 3은 KU-CSLCs가 NOD/SCID 마우스에서 가장 종양형성적. (A) a. 종양의 부피를 4주간 여러 다른 수의 MDA MB231, 환자 33, 및 KU-CSLC 1 세포(부위 당 100 또는 10,000 세포)로 접종 후 측정. b, 종양의 중량을 100 MDA MB231, KU-CSLC 1 세포의 접종 후 측정. 종양의 상 이미지를 나타냄(우측 이미지). N=3, *p<0.05. 에러 바는 평균±SD에 해당. (B) 1 x 102 세포로 접종된 마우스에서 성장한 종양은 H&E 염색에 의하여 유사한 조직학을 가지나 KU-CSLC 1 종양은 MDA MB231 종양에 비하여 더 높은 N-cadherin 및 twist의 발현을 가짐. MDA MB231 또는 KU-CSLC 1 종양은 거의 사일런싱과 같은 정도로 E-cadherin 발현을 감소. (C) a. 종양 부피를 KU-CSLC 1 세포로 일련의 반복 후에 측정. b, 종양 중량을 KU-CSLC 1 세포로 일련의 반복 후 측정. N=4, *p<0.05, 에러 바는 평균±SD에 해당. (D) 3rd KU-CSLC 1, 1st KU-CSLC 1, MDA MB231 종양을 면역 조직화학 및 웨스턴 블럿에 의한 N-cadherin, E-cadherin 및 twist의 발현을 분석.
이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위하여 예시된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1:환자 유래 1차 유방암 세포의 분리
유방 종양 조직 견본을 임상시험심사위원회(IRB) 승인을 가진 33환자를 포함한 건국대병원 유방암 센터에서 2005년 및 2008년 사이에 유방 종양에 대한 유방절개술을 수행한 72명 환자로부터 수집하였다. 종양 조직을 PBS로 세척하여 실온에서 20분간 Type IV collagenase (Sigma)로 배양하였다. 단일 세포 현탁을 100 세포 스트레이너(BD bioscience)를 통하여 상등액을 여과하여 얻었다. 이 환자 유래 1차 유방암 세포를 10% 우태아 혈청(FBS, Hyclone) 및 100 U/ml penicillin/ streptomycin (Hyclone)이 보충된 DMEM에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 유지하였다. 이 세포를 10% FBS 및 100 U/ml penicillin/ streptomycin으로 보충된 DMEM에서 배양된 KU-CSLCs(Konkuk University-Cancer Stem-like cells)로 명명하였다.
실시예 2: 현탁 배양( SC ) 방법
환자 유래1차 유방암 세포의 7 또는 8 계대를 10일 동안 비 코팅된 플레이트 상에서 성장 배지(배양 배지)에서 현탁하였다. 이들 세포를 트립신처리하고 모아서 5분 간 60 rpm으로 세이커 (Shaker) 에서 진탕한 후 세포의 각 부분을 5분간 1,000 rpm에서 원심분리하였다. 1, 3, 5, 10 일 후, 세포 생존률을 trypan blue 염색하고 헤마토사이토미터로 계수하여 평가하였다. 본 발명자들은 현탁 및 부착 세포를 계수하고 비교하였다(도 1C, 1D).
실시예 3: 세포
MCF 7 및 SKBR 유방암 세포를 10% 태아 혈청(FBS, Hyclone) 및 100 U/ml penicillin/ streptomycin (Hyclone)이 보충된 DMEM에서 배양하고 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. MDA MB231 유방암 세포를 10% 우태아 혈청(FBS, Hyclone) 및 100 U/ml penicillin/ streptomycin이 보충된 RPMI-1640 배지에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 유지하였다. MCF 10A 유방암 세포를 5% 말 혈청(Gibco-BRL), 0.5 ㎍/ml hydrocortisone (Sigma), 10㎍/ml 인슐린 (Sigma), 20 ng/ml 표피 성장인자(EGF, Sigma) 및 100 U/ml penicillin/streptomycin이 보충된 DMEM/F12 (Gibco-BRL)에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 세포 생존률을 trypan blue 배제 염색하고 헤마토사이토미터로 계수하여 평가하였다.Doxorubicin (Calbiochem)을 DMSO에서 용액으로 제조하고 -20에서 저장하였다. 화학요법 치료 또는 비처리된 암 환자세포의 모든 처리는 혈청없는 배지에서 수행하였다.
실시예 4: 스피어 형성 에세이
세포(10,000 세포)를 10% FBS를 가지는 DMEM(C. M., 배양 배지) 또는 B27-보충물(Invitrogen), 20 ng/ml EGF (Sigma), 10 ㎍/ml 인슐린(Invitrogen), 소 혈청 알부민(Sigma)이 보충된 혈청 없는 DMEM/F12(F. M., 형성 배지)에서 현탁으로 배양하였다. 인 비트로에서 스피어를 증식하기 위하여, 그 스피어들을 원심분리에 의하여 모아서 (Fengyan Yu et al., 2007)에 기재된 것과 같이 단일 세포로 해리한 후 배양하여 다음 세대의 스피어를 생성하였다. Crystal violet (Sigma) 염색을 사용하여 스피어를 염색한 후 콜로니 카운트를 위하여 촬영하였다.
실시예 5: 유동 세포 분석
세포를 트립신처리하고 0.2% BSA를 포함하는 냉장 PBS로 세척하였다. 세포의 알리쿠아트를 PBS/ BSA 용액에서 4℃에서 anti-CD44-FITC (BD Pharmigen), anti-CD24-PE (BD Pharmigen), anti-CD133-FITC (BD Pharmigen), 및 아이소타입-매치된 대조군 IgG 항체로 30분간 배양하였다. PBS/ BSA로 3회 세척 후, 그 세포들을 PBS에 재부유하고 FACScan (Becton Dickinson)을 사용하여 분석하였다.
실시예 6: 면역염색
세포를 24시간 동안 C. M. 또는 F. M에서 유리 커버슬립 상에 첨가하였다. 세포를 냉장 PBS로 한번 세척 후, 3.7% formaldehyde/PBS에서 상온에서 15 분간 고정하고 0.1% Triton X-100/PBS로 10분간 투과시켰다. 그 커버슬립을 블럭킹 용액(1% 노말 염소 혈청/PBS)에서 1시간 동안 블럭킹한 후 10시간 동안 블럭킹 용액에서 특정 항체(베타-액틴, Santa cruz)으로 배양하였다. 그 세포를 3회 세척한 후 1시간 동안 블럭킹 용액에서 2차 항체(Alexa 488-conjugated FITC, Molecular Probes)로 배양하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하고 핵을 마운팅 용액(Beckstone)으로 마운트된 TO-PRO3 (Molecular Probes)로 염색하고 공초점 현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 조사하였다.
조직학적 분석을 위하여, MDA MB231 또는 KU-CSLCs 마우스의 주사로부터 해부된 종양들을 4% paraformaldehyde에서 4℃에서 오버나잇 고정하고, 세척하고 파라핀 충진을 위한 과정 때까지 70% 에탄올에서 저정하였다. 충진된 조직을 Jung RM 2025 MICROTOME FROM Leica 상에서 절편화(두께 5 ㎛)하였다. 조사를 위하여 그 슬라이드를 표준 프로토콜에 따라 hematozylin 및 eosin (H & E, Santa cruz)으로 염색하였다. 그 다음 면역 염색을 위하여, 그 절편을 0.5% 블럭킹 버퍼(노말 염소 혈청)에서 N-cadherin (Santa cruz), E-cadherin (Santa cruz), 및 twist (Santa cruz) 항체로 배양하였다. 절편을 세척하고 0.5% 블럭킹 버퍼에서 1시간 동안 상온에서 1:1000 희석된 항-마우스 또는 토끼 2차 항체(Oncogene Research Products)로 배양하였다. Vectastain Elite ABC 및 diaminobenzidine (DAB) 기질 키트를 제조업자(Vector Laboratories)의 지시에 따라 면역-퍼옥시데이즈 염색을 검출하기 위하여 사용하였다.
실시예 7:RT-PCR 분석
전체 세포 RNA를 제조업자의 프로토콜에 따라서 Trizol reagent (Gibco-BRL)을 사용하여 배양된 세포로부터 정제하였고 그 추출된 RNA 샘플을 MMLV reverse transcriptase (Promega)로 처리하였다. mRNA를 하기 각 온도: 94℃, 55℃, 및 72℃에서 40초간 35 주기에서 PCR 증폭하였다. PCR 산물들을 1 또는 1.2 % 아가로스 젤 상에서 분석하였다. 증폭 프라이머의 서열을 표2에 리스트하였다.
실시예 8: 웨스턴 블럿 분석
전체 세포 추출물을 제조하기 위하여, 세포들을 디쉬로부터 스크랩하여 추출 버퍼(100 mM Tris-Cl pH 7.8, 10 mM NaCl, 10% Glycerol, 1 mM sodium orthovanadate, 50 mM sodium fluoride, 및 1 mM phenymethylsulfonyl fluoride)에서 부유하였다. 동량의 단백질을 10% SDS-PAGE 젤 상에서 분리하고 나이트로셀루로스 막으로 전기영동 트랜스퍼하였다. 막을 Tris-버퍼 식염수 내 5% 탈지분유 및 0.1% Tween-20에서 블럭킹하고 1차 항체로 프로브하였다. 사용된 1차 항체는 anti-N-cadherin, -E-cadherin, -twist, -beta-actin, -mouse IgG-HRP 및 Rabbit IgG-HRP (Santa cruz)에 대한 것들을 포함한다. 항체-항원 복합체들을 anti- rabbit- or mouse- IgG-peroxidase 부착물로 배양하고, enhanced chemiluminescence (ECL) 키트(Amersham Biosciences)를 사용하여 검출하였다.
실시예 9: 종양 이식
NOD/SCID 마우스를 유방암 세포 및 유방암 줄기 유사세포로부터 종양형성의 인 비보 줄기세포 특성을 평가하는데 사용하였다. 암컷 면역 결핍(SCID) 마우스 (NOD CB17-PRBDC SCID/J, 5-주령)을 대한민국 생명공학연구원의 의생명 마우스 센터(충북, 청원)으로부터 구입하였다. 스피어로부터 해리된 10,000 개 또는 100 개의 MDA MB231, KU-CSLC 1 세포를 암컷 면역결핍 (SCID) 마우스에 주사하였다. 그들을 4 주까지 종양 형성을 조사하였다. 그 마우스를 희생시키고 종양의 존재를 부검으로 확인하였다. 종양 부피를 부피(mm3) = 길이X 넓이2 X0.5로 계산하였다. 일련의 반복을위하여, 1st 주사 후, MDA MB231 또는 KU-CSLC 1 세포를 사용하여, 그 결과적으로 형성된 종양을 1차 수용체로부터 절개하고 단일세포로 해리하고 약 1주 동안 배양하고 2차 마우스 수용체에 재주사하였다.
본 발명의 데이터는 평균±평균의 표준편차(SEM)로 나타내었다. 통계적 분석을 엑셀 프로그램(Microsoft, Redmond, WA)에서 two-tailed Student's t-테스트 또는 one-way ANOVA (분산 분석)을 사용하여 수행하였다. 유의적 차이는 P < 0.05에서 간주되었다.

Claims (7)

  1. 환자 유래 1 차 유방암 세포의 계대를 성장 배지에서 현탁 배양하고, 그 현탁된 세포를 분리하는 것을 포함하는 유방암 줄기 유사세포 분리방법에 있어서,
    상기 유방암 줄기 유사세포는 CD24-, CD44-, 및 CD133+의 표현형을 가지고 스피어-형성 및 종양 형성능을 가지며, 그 기원이 화학요법 치료된 환자의 1차 유방암 세포이고,
    화학요법 치료된 환자 유래 1 차 유방암 세포의 7 또는 8 계대를 플레이트 상의 성장 배지에서 현탁하는 것을 특징으로 하는 유방암 줄기 유사세포 분리방법
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 방법은 환자 유래 1 차 유방암 세포의 7 또는 8 계대를 10일 동안 비 코팅된 플레이트 상의 성장 배지에서 현탁하는 것을 특징으로 하는 유방암 줄기 유사세포 분리방법.
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서, 상기 화학요법 치료는 독소루비신(doxorubicin), 탁솔, 또는 파클리탁셀(paclitaxel)에 의하여 수행된 것을 특징으로 하는 유방암 줄기 유사세포 분리방법.
  6. 삭제
  7. 화학요법 치료된 환자 유래 1 차 유방암 세포의 계대를 성장 배지에서 현탁배양하고 그 현탁된 세포를 분리하는 것을 포함하고, 유방암 줄기 유사세포는 스피어-형성 및 종양성 및 CD24-, CD44-, 및 CD133+의 표현형을 가지는 인간 유방암 줄기 유사세포 인 비트로 증식방법.

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