JP2014506883A - Psa捕捉剤、組成物、方法及びその製造 - Google Patents
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Abstract
Description
前記アンカーリガンド及び第2リガンドが、他と、1、5−二置換−1、2、3−トリアゾール結合を介して結合される場合には、前記1、5−二置換−1、2、3−トリアゾールは、ルテニウム触媒を用いて単一化学反応で合成され得る。例えば、前記1、5−二置換−1、2、3−トリアゾール結合は、ルテニウム−触媒アジド/アルキン環化付加反応(RuAAC)を用いて形成され得る(図11に示される)。前記アンカーリガンド及び第2リガンドが、他と、1、4−二置換−1、2、3−トリアゾール結合を介して結合される場合には、前記1、4−二置換−1、2、3−トリアゾールは、Cu−触媒アジド/アルキン環化付加反応(CuAAC)を用いて形成され得る。1、4−及び1、5−二置換−1、2、3−トリアゾール位置異性体を導き及び/又は選択的生成のために複数の化学反応を要する他のプロセスも使用され得る。
3つのターゲット−結合部分を持つ捕捉剤は、捕捉剤トリリガンドとしてここで参照される。ここで提供される捕捉剤トリリガンドのある実施態様では、捕捉剤トリリガンドは、第3のターゲット−結合部分に結合される捕捉剤バイリガンドを含み、好ましくは前記捕捉剤バイリガンドの前記第2リガンドで結合される。この実施態様では、前記第3のターゲット−結合部分は、第3リガンドと参照される。ある実施態様では、前記第3リガンドが、前記バイリガンドと共有結合で結合され、これらのある実施態様では、前記第3リガンドと前記捕捉剤バイリガンドはお互いにTz4又はTz5結合で結合される。
(a)ターゲット−結合部分の合成ブロックを製造し、前記合成ブロックがターゲット−結合部分を持ち、及び他の合成ブロックと望ましい結合を形成し得る少なくとも1つの反応性基を持ち、ここで:(i)前記結合は、アミド結合、1、4−二置換1、2、3−トリアゾール結合及び1、5−二置換1、2、4−トリアゾール結合からなる群から選択され;及び(ii)前記ターゲット−結合部分の他の全ての官能基が、望ましくない反応を防止するために保護され;及び
(b)前記ターゲット−結合部分の合成ブロックを結合させて前記捕捉剤を与えることを含む。
(a)前記ターゲットタンパク質のためのアンカーリガンドを選択するための、第1の複数の候補ペプチドを製造するステップ;
(b)前記ターゲットタンパク質を前記第1の複数の候補ペプチドと接触させるステップ;
(c)前記アンカーリガンドとして、前記ターゲットタンパク質に対する親和性を持つ候補ペプチドを選択するステップ;
(d)前記アンカーリガンドを配列決定するステップ;
(e)前記アンカーリガンドとアジド基又はアルキン基を含むアンカーリガンド選択ブロックを製造するステップ;
(f)前記ターゲットタンパク質のための第2リガンドを選択するために第2の複数の候補ペプチドを製造するステップを含み、ここで前記第2の複数のペプチドは、前記アンカーリガンド選択ブロックがアルキン基及びアジド基をそれぞれ持つ場合には、アジド基又はアルキン基を含み;
(g)前記アンカーリガンド選択ブロックと前記第2の複数のペプチドを前記ターゲットタンパク質と接触させるステップ;
(h)前記アンカーリガンド選択ブロックと前記第2リガンドとの間に二置換1、2、3−トリアゾール結合を形成することで捕捉剤バイリガンドを与えるステップを含み、ここで前記アンカーリガンド選択ブロックと前記第2リガンドの前記アジド基及びアルキン基は、前記ターゲットタンパク質への結合により緊密位置とされ;
(i)前記ターゲットとの親和性を持つ前記捕捉剤バイリガンドを選択するステップ;
(j)前記第2リガンドの配列を決定するステップ;及び
(k)アジド基又はアルキン基を含むバイリガンド選択ブロックを製造するステップ;及びステップ(f)から(k)を、前記ターゲットタンパク質への望ましい結合親和性を持つ捕捉剤がスクリーニングされるまで繰り返すステップ、を含む。
この実施態様では、アジド−変性アンカーリガンド選択ブロックは、ビオチン−PEG5−シクロ(CVFAHNYDYLVC)−Azを意味し、ここでAzは、アジド基を含む変性アミノ酸を表す(例えば、Az4とは、L−アジドリジンを表す)。これらの実施態様では、前記スクリーニング/製造方法は、次のステップ:
(a)PSAを、ビオチン−PEG5−シクロ(CVFAHNYDYLVC)−Az4(「アジド−変性PSA捕捉剤アンカーリガンド選択ブロック(I))と接触させてPSA−アンカー複合体を与えるステップ;
(b)前記PSA−アンカー複合体を、第2リガンドを選択するための第1の複数の候補ペプチドと接触させるステップであり、前記ペプチドはそのN末端でD−プロパルギルグリシンと結合されている;
(c)前記アンカーリガンド選択ブロックと前記第2リガンドとの間に1、5−二置換−1、2、3−トリアゾール結合を形成することでPSA捕捉剤バイリガンドを与えるステップであり、ここで、前記アンカーリガンド選択ブロックと前記第2リガンドを前記アジド及びアルキン基が、前記ターゲットタンパク質に結合することで緊密位置にもたらされ、前記PSA捕捉剤バイリガンドで変性されたビーズを与え;
(d)前記PSA捕捉剤バイリガンドで変性された前記ビースを選択するステップ;
(e)前記PSA捕捉剤バイリガンドで変性された前記ビーズから前記PSA捕捉剤バイリガンドを除去するステップ;
(f)前記PSA捕捉剤バイリガンドの前記PSA捕捉剤第2リガンドの配列決定するステップ;
(g)ビオチン−PEG5−サイクル((CVFAHNYDYLVC)−PSA第リガンド−Az4(「アジド−変性捕捉剤バイリガンド選択ブロック(I)」)を製造するステップ;及び
(h)上のステップを、前記性質を持つPSA捕捉剤が識別されるまで、繰り返すステップ、を含む。
(a)対象体から生体サンプルを得るステップ;
(b)前記PSA捕捉剤で、前記サンプル中のPSAの存在又は不存在を測定するステップ;
(c)前記PSA濃度を、PSAの既定のコントロール範囲と比較するステップ;及び
(d)前記生体サンプル及び前記既定のコントロールとの間の差に基づいて、前立腺癌又は前立腺障害を診断するステップ、を含む。
実施例1:PSA捕捉剤トリリガンドのスクリーニング及び製造:
試薬。
Fmoc−D−X−OH(Fmoc、フルオレン−9−イルメトキシカルボニル)(C=Ala、Arg(Pbf、ペンタメチルジヒドロネンゾフラン−5−スルホニル)、Asn(Trt)(Trt、トリチル)、Asp(OtBu)(tBu、tert−ブチル)、Glu(OtBu)、Gln(Trt)、Gly、His(Trt)、OLe。Leu、Lys(Boc)(Boc、tert−ブトキシカルボニル)、Met、Phe、Pro、Ser(tBu)、Thr(tBu)、Trp(Boc)、Tyr(tBu)及びVal)(Anaspec; San Jose、CA)。アミノ酸カップリング反応は、1−メチル−2−ピロリジノン(NMP、99%)中で、HBTU(O−ベンゾトリアゾール−N、N、N’、N’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−フォスフェート(AAPPTEC)及びN、N’−ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)で実施した。Nα−Fmoc保護基の除去のためには、NMP中の20%ピペリジン溶液を使用した。前記ペプチドライブラリーの最終脱保護基には、トリフルオロ酢酸(TFA、最小98%、滴定)及びトリエチルシラン(TES)を使用した。全ての溶媒及び試薬はSigma−Aldrich(St. Louis、 MO)から入手した。
ペンタ−からヘプタペプチド(5〜7)の無作為OBOCライブラリーは、自動合成装置、Titan357(AAPPTEC)を用いて、ポリエチレングリコール−グラフトポリスチレンビーズ(TentaGel S−NH2、90μm、0.29mmol/g、2.86x106ビーズ/g)に標準スプリット−ミックス方法により合成した。通常のライブライリー構築で、非天然−D−立体異性体を前記ペプチド配列でのそれぞれの位置に使用した。前記カップリングステップでは、Fmoc化学を標準固相ペプチド合成方法に適用した。樹脂は、収集容器(CV)内でNMPで2時間膨潤させた。Fmoc−メチオニンのカップリングは、0.17当量のHATU(2−(7−アザ−1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1、1、3、3−テトラメチルアンモニウムヘキサフルオロフォスフェート;ChemPep)と2当量のDIEAの添加により開始させた。前記カップリング反応は30分間行った。カップリング反応に次いで、前記ビーズを完全に洗浄(4xNMP)し、NMP中の20%ピペリジンで処理した(15分間、その後新しい脱イオン水で洗浄)。樹脂を完全に洗浄(4xNMP、4xDCM)し、次のカップリングサイクルのためにいくつかの等量区分に分けて反応容器(RV)へ入れた。前記カップリング及びFmoc脱保護基反応が完了して、前記樹脂は収集容器内で一緒にされた。前記手順は、望ましい長さのペプチドが得られるまで繰り返された。前記アミノ酸側鎖保護基は次に、トリフルオロ酢酸(94%)、水(3%)及びトリイソプロピルシラン(3%)で2時間インキュベートすることで除去された。前記ライブラリー樹脂は、ジクロロメタン(DCM;5x)、メタノール(MeOH;5x)、水(5x)、MeOH(5x)、DCM(5x)及びジエチルエーテル(5x)で完全に洗浄した。得られた樹脂は、真空乾燥し、4℃で保存した。
スクリーニングのために、N末端にD−プロパルギルグリシンで結合されたOBOCライブラリーの200mg部分を、8−mL容量Alltech容器内に移動し、PBS緩衝液(pH7.4)中の0.05%NaN3、0.1%Tween20及び0.1%BSAからなるブロッキング溶液で、1時間、25℃で360°回転装置上でプレインキュベーションした。別に、ブロッキング溶液で希釈された10nM遊離PSAの3mLを、L−アジドリジン−変性捕捉剤バイリガンドビオチン−(PEG)5−シクロTz(1、5)−Gllffk−Az4[ビオチン−(PEG)5−シクロ(配列1)−Tz(1、5)−配列2−Az4;Tz(1、5)=二置換1、2、3−トリアゾール]と、2時間25℃で、360°回転装置上でプレインキュベートした。捕捉剤バイリガンドは、タンパク質の5000倍過剰で供給された。OBOCライブラリーからブロッキング溶液を除去した後、前記10nM遊離PSAと捕捉剤バイリガンドとのプレインキュベート溶液をライブラリー樹脂へ添加して、4時間25°で360°回転装置上でインキュベートした。抗−ヒトPSAマウスモノクローナル抗体(PS6)と抗−マウスIgGAP−抗体でプロービングして、記載されたようにイニシアルヒットが選択された。記載差されたように、AP−結合ストレプトアビジンで第2回スクリーニングが実施された。抗−スクリーニングもまた別に実施された。これらの調節に続いて、オーセンティックヒットの配列決定を、MALDI−TO/TOF及び半自動アルゴリズムを用いて行った(Lee 2000)。
単一ビーズを純粋を含むミクロ遠心チューブに移した(10μl)。CNBr(0.2NのHCl溶液中の0.50M、10μL)添加後、反応容器をアルゴンで15分間パージして、1分間電子レンジ内に置く(Lee 2000)。さらに25分間アルゴンでパージして、得られる溶液を、10分間45℃、次いで60℃で50分間遠心真空下して濃縮した。
それぞれのチューブに、α−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸CHCAを添加した(10μL、アセトニトリル/水(70:30)中の0.5%マトリクス溶液)、及びアセトニトリル/水(10μL、0.1%トリフルオロ酢酸(体積/体積)含有70:30)。前記混合溶液の2μLを取り出して、384ウェルMALDIプレート上にスポットし、これを自然乾燥させるために約15分間放置した。
前記インシチュクリック化学手順から前記PSAトリリガンドを選択した後、さらなる生体評価のために材料の大量合成が必要である。まとめると、前記それぞれのペプチドリガンド(図4)は、AAPPTEC Titan357合成装置で、Fmoc系固相ペプチド合成を用いて2−クロロトリチル塩化物(CTC)樹脂上で製造された。それぞれのアミノ酸カップリング反応は、4当量のFmoc−アミノ酸、3.9当量のHBTU(O−ベンゾチトリアゾール−N、N、N’、N’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフロロ−フォソフェート)及び10当量のDIEAを取り込んだ。Fmoc基の脱保護基には20%ピペリジン/NMPを要した。ビオチン、PEG−鎖(n=5)及び1、5−トリアゾールリンカーは、樹枝上の前記ペプチド断片の手動でカップリングさせた。前記ペプチドは、側鎖保護基は変化させることなく、樹脂から開裂させ[ジクロロメタン/トリフロロエタノール/酢酸(7:3:1)]、望ましくない副反応や副生成物がなく、続くバイリガンド及びトリリガンドの効果的な合成を保証した。
ペプチドは、Fmoc化学を用いた標準固相メリフィールドペプチド合成により合成された。Fmoc−L−アジゾリジンt−ブチルエステル及びBoc−D−Pra−OHを含む二置換1、2、3−トリアゾールリンカーが、上で説明したように、Ru−触媒アジド−アルキン環化付加反応(RuAAC)で合成された。
Fmoc=フルオレン−9−イルメトキシカルボニル、Pbf=ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−5−スルホニル、Trt=トリチル、tBu=tert−ブチル、Boc=tert−ブチルオキシカルボニル、Bn=ベンジル、HATU=(2−(7−アザ−1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1、1、3、3−テトラメチルアンモニウムヘキサフロロフォスフェート(AK Scientific; Union City、 CA)、HOAt=(7−アザ−1−ヒドロキシベンゾトリアゾール)(AK Scientific; Union City、 CA)、DMF=ジメチルホルミアミド、DIEA=N、N’−ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)、TFA=トリフルオロ酢酸、TES=トリエチルシラン。全ての溶媒及び試薬は、Sigma−Aldrich(St. Louis、 MO)から購入した。
0℃の氷冷浴中で冷却されたDMF中のビオチン−PRG5−(保護)PSAアンカーの20mM溶液中に、1当量のO−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−N、N、N’、N’−テトラメチルウロニウムヘキサフロロフォスフェート(HATU)をDMF中の0.4M溶液として添加し、続いて1当量のジイソプロピルエチルアミン(DIEA)をDMF中0.4M溶液として添加した。DMF中のFmoc保護第2リガンドの20mM溶液を調製し、これを前記反応混合物中に滴下した。反応物を室温で16時間撹拌した。カップリングしたバイリガンドをH2Oでチューブ内に沈殿させ、遠心分離した。上澄みを除去し、残る白色固体を乾燥し、そのまま次にステップで使用した。
0℃の氷冷浴で冷却されたDMF中のビオチン−PEG5−(保護)PSAバイリガンドの20mM溶液に、1当量のHATUをDMF中の0.4M溶液として添加し、次に1当量のHOAtをDMF中の0.4M溶液として添加し、次いで1当量のDIEAをDMF中0.4Mの溶液として添加した。DMF中のFmoc保護第3リガンドの20mM溶液を調整し、これを前記反応混合物中に滴下した。反応物を16時間室温で撹拌した。カップリングしたトリリガンドはチューブ内でH2Oで沈殿させ、遠心分離した。上澄を捨てて残る白色固体を乾燥しそのまま次にステップで使用した。
Boc−(D)−プロパリギルグリシンベンジルエステルの合成(図8)。
Fmoc−(L)−Ot−Bu(950mg、2.1mmol)及びBoc−(D)−プロパルギルグリシン(451mg、2.1mmol)を9:1のDMG/H2O混合物(7mL)に溶解した。ヨウ化銅(I)(42mg、0.22mmol)を添加し、次にジイソプロピルエチルアミン(36μL、0.22mmol)を添加した。アスコルビン酸ナトリウム(87mg、0.44mmol)をH2O(0.5mL)に溶解し、この水溶液を反応混合物に添加した。反応物を16時間撹拌した。TLC(DCM中10%MeOH)で、1、4−トリアゾール生成物を確認し、プロパルギルグリシン出発物は残っていないことが示された。反応混合物をEtOAc(35mL)及び飽和NaHCO3水溶液で希釈した。水層をEtOAcで抽出した(3x10mL)。有機層をまとめて、0.1Mクエン酸アンモニウム(20mL)で洗浄し、次に塩水(10mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥して濃縮し、油状固体を得た。フラッシュクロマトグラフによる精製(DCM中10%MeOH5%−10%)で、白色残渣を得た(1.3g、1.9mmol、93%収率)。
材料と方法。
MAXISORP(商標)マイクロタイタープレートを、pH7.4でPBS中10μg/mLでの抗−ヒトPSA(PS6、Abeam)で2時間コーティングした。それぞれのマイクロウェルをPBSで洗浄後(3x)、TBS(25mM Tris、150mM NaCl、pH7.25)中5%脱脂乾燥乳でで前記プレートを充填し、2時間室温でブロッキングした。TBS中1%BSAで連続希釈した遊離PSA(Scripps Laboratories#P0725)を、室温で2時間、前記マイクロタイタープレート全体でインキュベートした。前記プレートをTBS中1%BSAで洗浄し(5x)、次にTBS中1%BSA+0.1%DMSO(体積/体積)中の2μMビオチン化捕捉剤で室温1時間インキュベートした。全てのマイクロウェルをTBS中1%BSAで洗浄(5x)した後、TBS中1%BSAの0.1μg/mLのストレプトアビジンPoly−HRP共役(Pierce、IL)でインキュベートした。前記プレートをTBS中1%BSAで洗浄(10x)後、さらにTBSで洗浄し(2x)、次いで、QuantaRed(商標)強化化学発光HRP基質(Pierce、IL)を添加することで発色させた。励起波長535nmを用いて、595nmでの蛍光発光を、Beckman Coulter DTX880分光光度計(Brea、 CA)で、ターゲット濃度の関数として記録した。滴定曲線を、4パラメータ回帰曲線フィッティングプログラム (Origin 8.5、 Northampton、 MA)を用いてフィッティングした。アッセイは3回繰り返した。
この結果は、合成PSA捕捉剤は、サンドイッチELISAを用いる市販の抗体と比較する際に検出抗体として使用され得ることを示す。好適な捕捉抗体(例えば抗−ヒトPSA(PS6))とのペアの場合、前記アッセイは、10から200ng/mLの範囲にわたり直線性を持つ(図13)。前記PSA捕捉剤トリリガンドは、4ng/mL遊離PSAのカットオフ濃度の範囲で定量限界(LOQ)を示したが、これは研究用モノクローナル抗体(抗−ヒトPSA(PS1)、Abeam)と類似する(図14)。LOQ又は最小の統計的に信頼性のある定量的測定は、前記アッセイシステムの感度、精度(変動)及びノイズレベルに依存する(〜2.5ng/mL)。捕捉剤トリリガンドとバイリガンドについてアッセイ間変動(%CV)は、前記研究用モノクローナル抗体と類似しており、これは遊離PSAの3ng/mLの濃度に下がる。前記PSA捕捉剤トリリガンドは、前記PSA捕捉剤バイリガンドよりも感度が強化(2倍を超える)されているが;このことは、前記タンパク質ターゲットが触媒であるインシチュクリック選択プロセスにおいてより高い特異性から予測されることである。このPSA捕捉剤ELISAの分析性能特性は、この合成PSA捕捉剤が、ヒト血清中のPSA検出において臨床的に有用である、ということを示唆した。
材料と方法。
pH7.4PBS中で連続希釈された遊離PSA(Scriopps Laboratories#P0725)をミクロピペットによりニトロセルロース膜へ適用された。前記膜を、TBS(25mM Tris、150mM NaCl、pH7.25)中の5%脱脂乾燥乳で4℃2時間ブロッキングした。前記膜をTBSで洗浄した(3x)。ビオチン化PSA捕捉剤を、TBS+0.03%DMSO(体積/体積)中0.5%乳の0.1μLで調製して、前記膜上で4℃で一晩インキュベートした。TBSで洗浄(3x)後、前記膜をさらに、0.02%Twenn20(体積/体積)を含むTBS中の0.1μg/mL HRP−共役ストレプトアビジン(Abeam)で4℃で30分間処理した。0.02%Tween20(体積/体積)を含むTBSで洗浄(5x)後、TBSで洗浄(2x)して、前記膜を、SuperSignal West Picoの化学発光強化及び基質溶液(Pierce、 IL)で発色させ、次いで直にHyBlot CL ARフィルムに暴露した。
PSA捕捉剤は、遊離PSAの2.2μgから0.14μgの範囲で検出された。PSA捕捉剤は、アンカーリガンドから、バイリガンド、トリリガンドへと親和性増加を示し、PSA捕捉剤トリリガンドについては、0.14μmgの遊離PSAの検出下限であった。前記PSA捕捉剤トリリガンドは、抗−ヒトPSAモノクローナル抗体(PS1)よりも優れた性能を示し、市販PSAモノクローナル抗体(PS2、PS6)よりも低感度であった。前記PSA捕捉剤とモノクローナル抗体アッセイとの間の強度の差は、ビオチン化(1ビオチン/捕捉剤対10ビオチン/モノクローナル抗体(平均して))での差によると考えられる。
概要
プルダウンアッセイは、緩衝液又はヒト血清溶液中の前記タンパク質に結合した複合媒体から1つのタンパク質を精製する能力を測定することでPSA捕捉剤の特異性を評価した。前記PSA捕捉剤複合体は次いで、固相親和性樹脂で前記サンプルから物理的に分離された。前記捕捉されたサンプルを、ウェスタンブロット分析にためにSDS−PAGEで分離した。
PSAのプルダウン検出は、抗体の代わりにPSA捕捉剤を取り込んだ免疫沈降技術を修正したものを用いた。最初に、ビオチン化PSA捕捉剤(0.3−0.5μg/mL)を、TBS中の25%ヒトAB雄血清(#HS−20、Omega Scientific、 Tarzana、 CA)の2mLと4℃でインキュベートとした。別に、ビオチン化PSA捕捉剤(0.3−0.5μg/mL)を、遊離PSA1μg含むTBS中の25%ヒトAB雄血清(#HS−20、Omega Scientific、 Tarzana、 CA)の2mLと4℃でインキュベートとした。ビオチン化PSA捕捉剤(0.3−0.5μg/mL)と2mLTBS中に1μgの遊離PSAを含む第3のサンプルを同様に4℃で一晩インキュベートした。
PSA捕捉剤トリリガンドは緩衝液中に遊離PSAを検出した(図16)。前記PSA捕捉剤配列/構造への追加の変性は、ヒト血清からの高い特異的なプルダウンに寄与するものと予想される。
概要
タンパク質文化への安定性は、インビボ用途でのペプチドの使用及び血清タンパク質診断の重要な要素のひとつである。大抵の天然ペプチドは酵素分解を防止するために変性される必要がある。D−アミノ酸、非天然アミノ酸及び環化の使用を含むいくつかの研究が捕捉剤安定性を完全するために使用されている。
安定性は、800μLの全体積中の25%(体積/体積)ヒトAB血清(HS−20、 Omega Scientific、 Tarzana、 CA)を含むTBS中の200μg捕捉剤を混合することで研究された(例えばPakkala 2007参照)。ペプチドは、37℃でインキュベートされ、及び100μL部分が時間=0分、30分後、及びその後は最大4時間までの1時間毎に取り出された。最終部は24時間後であった。前記ペプチドは、血清タンパク質から、Microcon遠心ろ過フィルタ装置(Microcon YM−10、MWCO=10kDa、Millipore、Bedford、MA)で、Beckman Coulter冷却ミクロ遠心(Brea、 CA)により12000rpmで20分間遠心して分離された。ろ過物を分析用HPLC(C18カラムで、0から50%Bの勾配で30分間溶出。A=H2O+0.1%TFA及びB=ACN+0.1%TFA)で試験され、次いで、Bruker UltrafleXtreme MALDI質量分析スペクトル装置で分析された。
ヒト血清と4時間37℃でのインキュベーション後、前記PSA捕捉剤トリリガンドは変化なしであった。24時間後、HPLCではなんらの断片も観察されなかった(図17)。このデータは、前記PSA捕捉剤トリリガンドは、ヒト血清中では生理的温度及び緩衝液では24時間を超えてタンパク質分解に対して安定である、ことを示唆する。この結果は、環化は、(天然)−L−アミノ酸を含む配列部分にタンパク質分解に対して抵抗性を改善する方法であり、及びD−アミノ酸及び非天然アミノ酸は本来的に安定な要素であることを示す。配列を変化させることのない、この方法はインビボ研究のためのペプチド設計のために有用となり得る。
合成PSA捕捉剤の長期安定性は、凍結乾燥粉末として捕捉剤を、空気中で室温と−80℃で、3ヶ月間保存することで評価された。一部分を周期的に取り出し、分析用HPLC(C18カラムで、0から50%Bの勾配を用いた。ここでA=H2O+0.1%TFA、B=ACN+0.1%TFAである)で分析し、次いで、Bruker UltrafleXtreme MALDI質量分析スペクトルで分析した。HPLC分析は、捕捉剤トリリガンドは、保存温度によらず凍結乾燥粉末として6週間を超えて安定であることを示した(図18)。
材料と方法
遊離PSAの酵素安定性は、捕捉剤とキモトリプシン基質Suc−Arg−Pro−Tyr−pNA(AnaSpec、 San Jose、 CA) (例えば、Wu 2000参照)の存在下研究された。PSA(333nM)を、1−100倍過剰モルのTBS(25mMTris、150mMのNaCl)緩衝液中捕捉剤と、pH7.8で1時間23℃でインキュベートした。別に、PSAの酵素活性へのZn2+の阻害効果が、コントロールとして前記反応緩衝液中に1−200μMZnCl2を含ませることで研究された。最終濃度0.l4mMとなる基質の添加後、吸光度をBeckman Coulter DTX880 分光光度計(Brea、 CA)で、5分間隔で80分間405nmでモニターした。PSAの酵素活性は、本来の活性を測定するためにZn及び捕捉剤の不存在下で試験された。全てのアッセイは3回繰り返した。
PSAの酵素活性は、PSA捕捉剤により強化され、発色基質に対して約3倍のPSA活性を刺激した。この効果は、捕捉剤の濃度に依存し、及び半最大刺激はミクロモルの濃度範囲で検出された。活性に影響を与える最小ペプチド濃度は、アンカーリガンドで0.250μM(図19A)、及び捕捉剤バイリガンドで0.159μM(図19B)の間を変動した。示唆されたことは、アンカーリガンドは活性サイトの近くで結合し、前記活性サイトの立体構造を変化させて、前記合成基質よりもより近づきやすい触媒ポケットを形成し得る、ということである(Wu 2000)。本発明で識別された捕捉剤が、また、天然基質に対してPSAの活性を増加する場合、これらは、前立腺病理学及び生理学においてPSAの生体内役割を研究するために有用であり得るものである。興味あることに、これらのいずれのペプチドも酵素活性を阻害しなかったことである。Zn2+は、これに比べてPSAの酵素活性の阻害を示し、比較のために図19Cに示される挙動に寄与する。
概要
スキャッチャード分析は、捕捉剤について平衡解離定数(kD)を決定するために実施された。
MAXISORP(商標)マイクロタイタープレートを、PBSpH7.4中の2μg/mL遊離PSA(Scripps Laboratories#P0725)で室温で2時コーティングした。それぞれのウェルをPBSで洗浄(x3)後、プレートを、TBS(25mM Tris、1.50mM NaCl)中5%の脱脂乾燥乳で充填し、1時間室温でブロッキングした。前記プレートをTBS中の1%BSAで洗浄し(5x)、TBS+0.1%DMSO(体積/体積)中1%BSA内で連続希釈されたビオチン化捕捉剤を室温で2時間インキュベートした。TBS中1%BSAで全てのミクロウェルを洗浄後、TBS中1%BSA内の0.1μg/mLのストレプトアビジンPoly−HRP共役(Pierce、 IL)でインキュベートした。前記プレートを吸引して、TBS中1%BSAで洗浄され(10x)、次にTBSで洗浄し(2x)、及びその後QuantaRed(商標)強化化学発光HRP基質(Pierce、 IL)で発色させた。励起波長535nmを用いて、595nmの蛍光発光を、捕捉剤濃度の関数として、Beckman Coulter DTX880分光光度計(Brea、 CA)で記録した。アッセイは3回繰り返した。
DOTA−ラベル化1、5−Tz−バイリガンドは、64Cuでラベル化され、マウスに100μgI.V.尾部注射により投与される。全身イメージングが、2時間の動的スキャンを用いてミクロPET、続いてミクロCTイメージングで実施される。10分間のミウロPETスキャンはまた、4及び6時間で実施され得る。種々の器官(例えば腎臓、胆嚢、肝臓、脳及び血液)の間のラベル化捕捉剤の生体内分布が、クリアランス及び蓄積を評価するために分析され得る。
多重反応モニター(MRM)は、質量スペクトル系アッセイであり、急速に開発されてきた高多重アッセイを可能にする。アッセイパラメータと質量スペクトル装置に依存して最大100のタンパク質アッセイが、単一のMRMサンプル分析で多重でなされ得る。数百のタンパク質アッセイが、サンプルの一部を取り出すことで単一の血液で実施され得る。
それぞれのサンプルは、MRM試行のために2又は3の区分に分けられ得る。サンプルは、サンプル試験にわたり定量を標準化するためのペプチド標準物でスパイクされ得る。それぞれの集団からのサンプルは、臨床データ(性、年齢、収集位置など)に基づきマッチングされ、及びマッチングされたサンプルは、分析バイアスを最小化するためにMRMアッセイを連続的に実施する。タンパク質アッセイ測定は、それぞれのサンプル中のそれぞれのタンパク質について得られる。
それぞれのタンパク質について、統計学的試験(偽発見率調整片側検定ペアt−テストなど)が、あるスポットサイズ(例えば10mm)を超える癌性サンプルと非癌性サンプルとを識別するかどうかを決定するために使用される。統計的試験でのサンプルのペアリングは、上で記載されたサンプルのマッチングにより決定され得る。タンパク質ごとに4つのデータが存在することから、4つの点の少なくとも3つは、有意な統計的差を示す必要がある。
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Claims (20)
- マルチリガンド前立腺特異的抗原(PSA)ターゲット捕捉剤を含む合成検出剤であり、前記捕捉剤が血清中で特異的にPSAに結合する検出剤。
- 請求項1に記載の検出剤であり、前記捕捉剤が、タンパク質分解に抵抗性の環状トリリガンドであり、前記環状トリリガンドが、アンカーリガンド、第2リガンド及び第3リガンドを含む、検出剤。
- 請求項1の検出剤であり、前記捕捉剤が、凍結乾燥粉末として保存に安定である、検出剤。
- 請求項1に記載の検出剤であり、前記捕捉剤が、約−80℃から40℃の温度で保存に安定である、検出剤。
- 請求項1に記載の検出剤であり、前記捕捉剤が、室温で保存に安定である、検出剤。
- 請求項1に記載の検出剤であり、前記捕捉剤が、ヒト血清中で少なくとも24時間安定である、検出剤。
- 請求項1に記載の検出剤であり、前記捕捉剤が、pHが3.0から8.0の範囲で安定である、検出剤。
- 請求項1に記載の検出剤であり、前記捕捉剤が、銅−DOTAでラベル化されている、検出剤。
- 請求項1に記載の検出剤であり、前記捕捉剤が、ビオチンでラベル化されている、検出剤。
- 請求項1に記載の検出剤であり、前記捕捉剤が、タンパク質の非正規のエピトープへ結合する、検出剤。
- 請求項1に記載の検出剤であり、前記捕捉剤が、免疫療法剤である、検出剤。
- 請求項1に記載の検出剤であり、前記捕捉剤が、診断剤である、検出剤。
- 請求項2に記載の検出剤であり、前記アンカーリガンドが、環状L−ペプチドであり、前記第2リガンドがD−ペプチドであり、及び前記第3のリガンドがD−ペプチドである、検出剤。
- 請求項2に記載の検出剤であり、前記アンカーリガンドと前記第2リガンドとの結合、及び前記第2リガンドと前記第3リガンドとの結合が、Tz5である、検出剤。
- 請求項16に記載の前記Tz5−トリリガンドの製造方法であり、前記方法は:
(a)側鎖−保護ビオチン−PEG5−CVFAHNYDYLVC(側鎖−保護ビオチン−PEG5アンカー合成ブロック(I))、
側鎖−保護Tz5−Gllffk(側鎖−保護第2合成ブロック(I))、及び
側鎖−保護Tz5−rrivk(側鎖−保護第3合成ブロック(I))の合成を含み、これらはそれぞれ以下の構造
(b)前記側鎖−保護ビオチン−PEG5アンカー合成ブロック(I)と前記側鎖−保護第2合成ブロック(I)とをカップリングさせて、以下の構造を持つ、側鎖−保護ビオチン−PEG5−CVFAHNYDYLVC−Tz5−Tz5−Gllffk(側鎖−保護ビオチン−PEG5−PSATz5−バイリガンド合成ブロック(I))
(c)前記側鎖−保護−ビオチン−PEG5−Tz5−バイリガンド合成ブロック(I)を、前記側鎖−保護第3合成ブロック(I)とカップリングさせて、次の構造の、側鎖−保護ビオチン−PEG5−CVFAHNYDYLVC−Tz5−Gllffk−Tz5−rrivk(側鎖−保護ビオチン−PEG5−PSATz5−トリリガンド合成ブロック(I))
(d)前記側鎖−保護ビオチン−PEG5−PSATz5−トリリガンド合成ブロック(I)を脱保護基して、ビオチン−PEG5−CVFAHNYDYLVC−Tz5−Gllffk−Tz5−rrivkを形成し:及び
(e)ジスルフィド結合を形成して、次の構造:
- 請求項1に記載のPSA−ターゲット捕捉剤を開発する方法であり、前記方法は:
(a)PSAをビオチン−PEG5−シクロ(CVFAHNYDYLVC)−Az4(「アジド−変性PSA−PCCアンカー選択ブロック(I)」)と接触させてPSA−アンカー複合体を与えるステップ;
(b)前記アンカー複合体を第1の複数の候補ペプチドと接触させて、PSA−PCC第2リガンドを選択するステップを含み、前記ペプチドがD−プロパルギルグリシンとそのN末端で結合されており;
(c)前記PSA−PCCアンカー選択ブロックと前記PSAPCC第2リガンドとの間に1、2、3−トリアゾール結合を形成することでPSA−PCCバイリガンドを与えるステップを含み、前記アンカー選択ブロックと前記第2リガンドのアジド基とアルキン基が、前記ターゲットタンパク質と結合することで緊密位置にもたらされて、前記PSA−PCCバイリガンドで変性されたビーズを与え;
(d)前記PSA−PCCバイリガンドで変性された前記ビーズを選択するステップ;
前記PSA−PCCバイリガンドを、前記PSA−PCCバイリガンドで変性された前記ビースから除去するステップ;
(e)前記PSA−PCCバイリガンドの前記PSA−PCC第2リガンドの配列決定するステップ;
(f)ビオチン−PEG5−シクロ(CVFAHNYDYLVC)−PSA第2リガンド−Az4(「アジド変性PCCバイリガンド選択ブロック(I)」)を製造するステップ;及び望ましい抗体−様性質がスクリーニングされるまでステップ(a)から(f)を繰り返すステップ、を含む方法であり、ここで
PEG5は−(NH−(CH2H4−O−)5−C(O))−であり、Az4はL−アジドリジンである。 - 免疫アッセイにおいて請求項1に記載の前記PSA捕捉剤を用いてPSAを検出する方法であり、前記PSA捕捉剤が、前記免疫アッセイにおいて抗体又はその等価物と交換される、方法。
- 請求項19に記載の方法であり、前記免疫アッセイが、ウェスタンブロット、プルダウンアッセイ、ドットブロット及びELISAからなる群から選択される、方法。
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