KR101099924B1 - 신규한 류코노스톡 시트리움 및 이를 스타터로 사용한 발효식품 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 류코노스톡 시트리움 CJGN34(Leuconostoc citreum CJGN34) KCTC 10974BP 유산균, 상기 유산균을 스타터로 사용하여 제조된 김치를 포함한 발효 식품, 및 상기 유산균을 포함하는 유산균 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 신규 류코노스톡 시트리움 CJGN34는 김치의 전반적인 맛품질을 향상시키고, 겨울철 제조 방식의 전통적인 제법의 김치 고유의 복잡한 신맛과 탄산미를 상승시켜 연중 발효 품질을 일정하게 유지하고 특히 맛품질이 저하되는 하절기의 발효품질저하를 효과적으로 제어하는데 효과가 있어, 김치를 포함한 발효식품에 적용하여 스타터로 활용하거나, 담체 또는 첨가제 등을 혼합하여 정제, 캡슐 등의 의약품, 식품용 생균제로 활용하거나, 화장품에 사용되는 원료에 일정량을 혼합함으로써 의약품, 식품, 사료, 화장품 등 다양한 분야에 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 활용이 가능하다.
류코노스톡 시트리움, 유산균, 김치, 발효식품
Description
본 발명은 신규한 류코노스톡 시트리움 균주 및 이를 스타터로 사용한 발효식품, 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 겨울철 김치의 맛품질 수준의 발효풍미를 연중 유도할 수 있으며, 특히 하절기의 발효 품질 저하를 효과적으로 제어할 수 있는 신규한 류코노스톡 시트리움 균주 및 이를 스타터로 사용한 발효식품 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
김치는 다양한 채소류를 소금에 절여 혼합하여 자연 발효시키는 우리나라의 대표적인 야채 발효식품이다. 이중 대표적인 김치는 배추를 주재료로 하는 ‘김장 김치’로 늦가을 또는 초겨울에 수확한 배추, 무를 소금에 절여서 마늘, 생강, 파 등을 부재료로 혼합하여 담가 땅에 묻어두고 겨우내 먹어왔다(Cheigh and Park, Biochemical, microbiological and nutritional aspects of Kimchi, Crit.Rev.FoodSci.Nutr.Vol34,1981,pages107-127). 이와 같이 김장김치는 식품보존법 중에서 절임과 발효법을 이용하여 채소의 생산이 안 되는 겨울철 동안 저온에서 채소를 보존하면서, 탄소원, 아미노산, 비타민의 공급원으로써 이용하여온 저온 발효 저장 식품으로 원료에서 유래한 고유의 유산균에 의한 발효와 숙성을 통해 풍부한 발효풍미를 갖게 된다.
그러나 현대에 와서는 품종개량과 재배기술의 발달로 연중 배추를 비롯한 원료들이 생산, 저장되어 김장철 이외에도 배추 김치의 제조가 가능하게 되었고, 냉장고와 김치 전용 냉장고의 보급으로 언제라도 겨울과 같은 저온 발효 저장이 가능하게 되어 전통적인 김장배추김치와는 차이가 있다.
김치품질은 기본적으로는 연중 출하되는 배추를 포함한 다양한 원료의 품질에 의한 영향을 많이 받게 되며 김치를 상품화하는 기업입장에서는 이로 인한 연중 품질의 변화는 소비자에게 균일한 품질을 제공함에 있어서 큰 걸림돌이 되고 있다. 특히 하절기 (6월 ~ 8월)경에 생산되는 김치에 있어서 겨울과 동일한 발효숙성 관리를 하여도 원료의 품질적인 문제와 발효숙성풍미의 저하로 다른 시기와의 품질편차가 심하여 고객으로부터 품질 저하에 대한 다양한 클레임이 발생함은 관련 업계의 주지의 사실이다.
이러한 문제를 해결하기 위해 종래의 기술을 살펴보면 다양한 미생물, 주로 유산균을 스타터(starter)로 첨가함으로써 김치의 품질을 제어하고자 하였음을 알 수 있다 (대한민국 등록특허 제10-0536108호, 제10-0181009호, 제10-0330674호 등). 그러나 기존의 방법들은 연중 발생하는 품질의 변화에 대한 명확한 규명을 통 한 문제의 개선이라기 단순히 품질 개선을 도모하고자 스타터를 적용하였으며, 관능품질에 있어서도 명시되지 않은 비특정 시기의 전반적인 맛품질의 차이만을 확인하는 등 하절기의 품질 개선에 집중하여 품질저하의 원인을 분석하고 문제점을 개선하려는 사례는 없었다.
한편 김치 유산균인 류코노스톡 김치아이(Leuconostoc kimchii), 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 가시코미타툼(Leuconostoc gasicomitatum), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 등이 단독 또는 복합으로 다양한 발효식품 제조에 사용되어 왔다.
이들 중 류코노스틱 시트리움(Leuconostoc citreum) 균주는 김치의 숙성에 관여하며, 특히 설탕을 이용하여 고분자 점질물의 덱스트란을 생산하는 능력이 있는 것으로 알려져 있으며(대한민국 등록특허 제10-0718344호), 아토피성 피부염의 치료 및 예방에 효과가 있는 것으로 밝혀진 바 있다(대한민국 특허출원 제10-2005-0041572호). 이와 관련하여 대한민국 등록특허 제10-0814665호에 덱스트란을 생산하는 루코노스톡 시트리움 S5 균주 및 이를 이용한 덱스트란 함유 발효물의 제조방법이 개시되어 있고, 대한민국 특허출원 제10-0800530호에 만니톨 생산능을 갖는 류코노스톡 시트리움 및 이를 이용하여 만니톨을 생산하는 방법이 개시되어 있다.
이에, 본 발명자들은 연중 배추김치의 발효 패턴을 분석하고 발효 품질 변화 에 영향을 미치는 유산균 군집의 변화와 유기산의 변화를 모니터링 하였으며, 이를 통해 연중 품질을 개선하고 안정화 시키는데 겨울철 맛있는 시기에 분리되는 유산균이 연중 일정한 발효품질의 김치를 제조하는데 유효한 역할을 함을 알아내었으며, 겨울철 김치의 맛품질 수준의 발효풍미를 연중 유도할 수 있으며, 특히 하절기의 발효품질저하를 효과적으로 제어할 수 있는 신규한 류코노스톡속 유산균 균주를 분리, 동정하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 김치에 스타터로 이용하여 겨울철 김치의 맛품질 수준의 발효풍미를 연중 유도할 수 있으며, 특히 하절기의 발효품질저하를 효과적으로 제어할 수 있는 신규한 류코노스톡속 유산균 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규한 류코노스톡속 유산균 균주를 스타터로 사용한 발효식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 류코노스톡속 유산균 균주를 포함하는 산업용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 류코노스톡 시트리움 CJGN34 (Leuconostoc citreum CJGN34) (기탁기관: 생명공학연구원 유전자은행, 기탁일: 2006.07.27, 수탁번호: KCTC 10974BP)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 류코노스톡 시트리움 CJGN34를 유효성분으로 함유하는 식품발효용 스타터 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 스타터 조성물을 사용하여 제조한 김치를 포함한 발효 식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 류코노스톡 시트리움 CJGN34을 유효성분으로 함유하는 유산균 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, “유효성분”이라 함은 내재된 약리작용에 의해 그 의약품의 효능·효과를 직접 또는 간접적으로 발현한다고 기대되는 물질 또는 물질군(약리학적 활성성분 등이 밝혀지지 않은 생약 등을 포함한다)으로서 주성분을 포함하는 것을 의미한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에 따른 류코노스톡 시트리움 CJGN34(Leuconostoc citreum CJGN34)는 김치로부터 분리 및 동정된 류코노스톡 시트리움의 신규한 균주임을 특징으로 한다. 상기 균주는 겨울 김장철에 제조한 배추 김치로부터 분리되기는 하였으나 관련 균주의 분리 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 류코노스톡 시트리움 CJGN34는 미생물의 동정 및 분류를 위한 16S rRNA 염기서열 분석 결과 류코노스톡 시트리움 표준균주(Leuconostoc citreum KCTC 3526T, GenBank accession number AF111948)와 가장 높은 상동성(99.7%)을 나타내어 류코노스톡 시트리움과 가장 높은 분자계통학적 유연관계를 보였다. 따라서 상기 미생물을 류코노스톡 시트리움 (Leuconostoc citreum)으로 동정하고, 류코노스톡 시트리움 CJGN34로 명명하였으며, 생명공학연구원 유전자은행에 2006년 7월 27일자로 기탁하였다(수탁번호 KCTC 10974BP).
본 발명의 류코노스톡 시트리움 CJGN34는 그람양성균이며 호기적 조건과 혐기적 조건에서 모두 성장이 가능한 통성 혐기성(facultive anaerobe)이며 포자를 형성하지 않고 운동성이 없으며 세포의 형태는 단일 또는 쌍구균이다. 류코노스톡 시트리움 CJGN34의 보다 구체적인 형태 및 생리학적 특성은 당해 기술분야의 통상의 방법의 따라 분석한 결과 하기 표 1과 같은 것으로 나타났다.
[표 1]
형태 및 생리, 생화학적 특성 | 결과 |
형태 (Morphology) | 구균 (Coccus) |
운동성 (Motility) | - |
포자 (Spore) | - |
카탈라제 | - |
호모- 헤테로 발효 | 통성 헤테로 발효 |
15℃에서의 증식 | + |
45℃에서의 증식 | - |
포도당 대사를 통한 덱스트란 생성 | + |
NaCl 3%에서의 증식 | + |
혐기성 증식 | + |
포도당 이용 CO2생성 | + |
당 발효 특성 | |
글리세롤 | - |
에리쓰리톨 | - |
D-아라비노오스 | - |
L-아라비노오스 | + |
리보오스 | - |
D-자일로오스 | - |
L-자일로오스 | - |
아도니톨 | - |
자일로사이드 | - |
갈락토오스 | + |
D-글루코오스 | + |
D-프럭토오스 | + |
D-만노오스 | + |
L-소르보오스 | - |
람노오스 | - |
둘시톨 | - |
이노시톨 | - |
만니톨 | + |
솔비톨 | - |
D-만노사이드 | - |
D-글로코사이드 | + |
글루코사민 | + |
아미그달린 | + |
알부틴 | + |
에스큘린 | + |
살리신 | + |
셀로비오스 | + |
말토오스 | + |
락토오스 | - |
멜리비오스 | - |
사카로오스 | + |
트레할로오스 | + |
이뉼린 | - |
멜리지토오스(melizitose) | - |
D-라피노오스 | - |
아미돈(amidon) | - |
글리코겐 | - |
자일리톨 | - |
겐티오비오스 | - |
D-투라노오스 | + |
D-릭소오스 | - |
D-타가토오스 | - |
D-푸코오스 | - |
L-푸코오스 | - |
D-아라비톨 | - |
L-아라비톨 | - |
글루코네이트 | - |
2-글루코네이트 | - |
5-글루코네이트 | - |
+ : 양성 반응
- : 음성 반응
본 발명의 류코노스톡 시트리움 CJGN34는 장기간 안정적으로 보존하기 위해서는 물에 글리세롤 성분을 일정량 혼합하여 만든 보관용액에 균체를 풀어 -70℃에서 보관하거나 멸균된 10% 탈지유에 현탁하여 동결건조하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 류코노스톡 시트리움 CJGN34는 자연발효한 김치로부터 분리된 유산균으로 사람에게 위해가 없는 GRAS(Generally recognized as safe)균주로 분류되며 안전성과 관련된 젤라틴 액화반응검사, 페닐알라닌탈아민 생성 검사, 암모니아 생성검사, 용혈성 실험검사 등을 자체적으로 수행한 결과 젤라틴 액화반응검사, 페닐알라닌탈아민 생성 검사, 및 암모니아 생성검사, 용혈성 실험 검사 모두에서 음성으로 확인되어 식품에 사용할 수 있는 안전한 균임이 확인되었다.
본 발명에 따른 류코노스톡 시트리움 CJGN34는 김치를 포함한 발효식품에 스타터로 사용할 경우 전반적인 맛품질을 향상시키고, 겨울철 제조 방식의 전통적인 제법의 김치 고유의 복잡한 신맛과 탄산미를 상승시켜 연중 발효 품질을 일정하게 유지하고 특히 맛품질이 저하되는 하절기의 발효품질저하를 효과적으로 제어하는데 도움을 줄 수 있다. 또한 이상의 균주를 포함하는 균체를 배양 후 회수하여 균체조성물을 만들 수 있으며, 이러한 조성물은 사료에 원료로 쓰이는 곡물가루와 혼합 하여 사료용 생균제로 활용하거나, 담체 또는 첨가제 등을 혼합하여 정제, 캡슐 등의 의약품, 식품용 생균제로 활용하거나, 화장품에 사용되는 원료에 일정량을 혼합함으로써 의약품, 식품, 사료, 화장품 등 다양한 분야에 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 활용할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 류코노스톡 시트리움 CJGN34는 유산균 약학 조성물에 이용될 수 있다. 이러한 경우에는 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 의약품은 바람직하게는 경구 제형을 제제화될 수 있으며, 예를 들어 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 또는 엑스제와 같은 경구 투여용 제형으로 제제화될 수 있다.
상기 각각의 제형으로 제제화 시, 각각의 제형의 제조에 필요한 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 부가하여 제조할 수 있다. 대표적으로 경구 투여용 제형으로 제제화 시 상기 담체로서 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 및 방부제 중에서 1 종 이상을 선택하여 사용할 수 있으며, 첨가제로는 향료, 비타민류, 및 항산화제 중에서 1 종 이상을 선택하여 사용할 수 있다.
상기 담체 및 첨가제는 약제학적으로 허용 가능한 것은 모두 가능하며, 구체적으로 희석제로는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘 또는 탈크, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필셀룰로오스가 바람직하다. 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는 크로스포비돈, 감미제로는 백당, 과당, 솔비톨, 또는 아스파탐, 안정제로는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사 이클로덱스트린, 백납, 또는 잔탄검, 방부제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 솔빈산칼륨이 바람직하다.
또한, 상기 성분 이외에도 공지의 첨가제로서 미각을 돋구기 위하여, 매실향, 레몬향, 파인애플향, 허브향 등의 천연향료, 천연과즙, 클로로필린, 플라보노이드 등의 천연색소, 과당, 벌꿀, 당알코올, 설탕과 같은 감미성분, 또는 구연산, 구연산 나트륨과 같은 산미제를 혼합하여 사용할 수도 있다.
이러한 제제화 방법 및 제제화시 필요한 담체 및 첨가제에 대해서는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세하게 기재되어 있다.
또한 본 발명에 따른 류코노스톡 시트리움 CJGN34는 유산균 식품 조성물로서 이용될 수 있다. 상기 식품 조성물은 건강기능식품뿐만 아니라, 인간이 널리 통상적으로 매일 섭취하는 일반적인 식품을 포함하는 것이다. 건강기능식품으로서 이용될 경우 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제와 함께 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 건강기능식품은 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 엑스제, 차, 젤리, 또는 음료 등으로 제조될 수 있다. 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제는 제조하고자 하는 제형의 제조에 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다.
또한 본 발명에 따른 류코노스톡 시트리움 CJGN34는 덱스트란(dextran)이라는 함습성이 높은 폴리머를 함유할 수 있으므로 유산균 화장료 조성물로서 이용될 수도 있다. 상기 본 발명에 따른 화장료 조성물의 경우에는 당해 화장품 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 제형의 다양한 화장품으로 제조될 수 있다. 상기 각각의 제형으로 제제화 시, 각각의 제형의 제조에 필요한 화장품의 제조에 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 부가하여 제조할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 류코노스톡 시트리움 CJGN34는 유산균 사료첨가제 또는 사료 조성물로서 이용될 수 있다.
사료 첨가제로서 이용될 경우, 상기 조성물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립형태로 제조될 수 있다. 상기 사료 첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 사료로서 이용될 경우, 상기 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화될 수 있으며, 통상의 사료 성분을 함께 포함할 수 있다.
상기 사료 첨가제 및 사료는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양 보충제, 소화 및 흡수 향상제, 성장 촉진제 등을 더 포함할 수 있다.
상기 사료 첨가제는 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료 첨가제는 탑 드레싱으로서 또는 이들을 동물 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구 제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 사료 첨가제를 동물 사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용 가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토오스, 수크로오스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.
상기 사료는 동물의 식이 욕구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분을 포함할 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩 곡분, 또는 옥수수/콩 곡분 믹스로 주로 구성되어 있다.
또한, 상기 사료 첨가제 및 사료는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다. 상기 사료 첨가제는 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.
본 발명의 사료 또는 사료 첨가제는 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다. 상기 포유류로서 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물, 및 실험용 설치 동물 뿐만 아니라, 애완 동물(예: 개, 고양이) 등에게 사 용할 수 있으며, 상기 가금류로서 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및 메추라기 등에도 사용할 수 있고, 상기 어류로서 송어 등에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
앞서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 신규 류코노스톡 시트리움 CJGN34는 김치를 포함한 발효식품에 스타터로 사용할 경우 전반적인 맛품질을 향상시키고, 겨울철 제조 방식의 전통적인 제법의 김치 고유의 복잡한 신맛과 탄산미를 상승시켜 연중 발효 품질을 일정하게 유지하고 특히 맛품질이 저하되는 하절기의 발효품질저하를 효과적으로 제어하는데 효과가 있다. 또한 본 발명에 따른 신규 류코노스톡 시트리움 CJGN34는 균체 조성물을 제조하여 상기의 김치를 포함한 발효식품에 적용하여 스타터로 활용하거나, 담체 또는 첨가제 등을 혼합하여 정제, 캡슐 등의 의약품, 식품용 생균제로 활용하거나, 화장품에 사용되는 원료에 일정양을 혼합함으로써 의약품, 식품, 사료, 화장품 등 다양한 분야에 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 활용이 가능하다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 연중 김치 품질 변화 모니터링을 통한 개선 포인트 도출 및 GN34균주의 분리
연중 김치의 품질 변화를 모니터링 하여 품질변화의 원인을 파악하고 개선하기 위하여 연중 김치 품질의 변화를 확인하였다.
김치는 CJ제일제당의 제조방법에 따라 제조한 김치를 사용하였으며 3월-5월 15일 제조된 김치를 봄김치, 5월 15일-8월에 제조된 김치를 여름김치, 9월-11월 15일에 제조된 김치를 가을김치, 11월 16일-2월 말에 제조된 김치를 겨울김치로 구분하였다.
각 시기의 김치의 관능품질을 5점 척도법을 사용하여 분석한 맛품질의 결과를 확인한 결과 다른 계절에 제조한 김치의 전반맛이 평균 3.8-4.0정도가 유지됨에 비하여 여름김치에서 전반맛이 3.5 수준으로 저하되는 특징이 확인되었다. 상기의 결과를 도 1에 나타내었다.
상기와 같은 연중 맛품질의 변화에 발효 미생물이 미치는 영향을 분석하기 위하여 최 등 (Choi et. al., Microobial population dynamics of kimchi, a fermented cabbage, FEMS microbial. Lett., Vol. 257, 2006, pages 262-267)의 방법으로 16S rRNA 분석을 통하여 동정을 하였다. 그 결과 전통적으로 김장김치를 담구어 왔으며 맛품질에 가장 우수한 시기인 겨울에 제조한 김치는 절대이형발효를 하여 당을 이용하여 젖산 이외의 다양한 산을 생성하고 가스를 내는 류코노스톡속이 80%이상으로 검출되었으며 겨울김치의 복잡한 발효풍미와 탄산미를 내는데 주요 한 역할을 하는 것으로 확인되었다. 반면에 발효품질저하가 발생하는 여름에 제조한 김치에서는 편성이형발효 또는 동형발효, 즉 일반적인 환경에서는 당을 이용하여 젖산만을 생성하고 가스를 내지 않는 락토바실러스속(Lactobacillus)인 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum)과 같은 균의 비율이 50% 이상으로 타 시기에 제조한 김치에 비하여 높아짐이 확인되었으며 이러한 발효균총의 변화가 하절기 김치의 단순한 신맛과 탄산미가 약해지는데 영향을 미칠 수 있음을 예상할 수 있었다. 상기의 결과를 도 2에 나타내었다.
이와 같은 발효균총의 변화가 김치의 발효풍미에 미치는 영향을 보다 명확히 하기 위하여 상기 최 등의 방법에 따라 발효가 시작된 총산도 0.4%이상인 미생물 분석에 사용한 동일한 샘플에 대해 HPLC를 활용한 유기산 분석을 수행하였다. 유기산은 유산균이 당을 소비하여 생성하는 주요 대사산물로 편성이형발효, 동형발효의 경우는 젖산만이 주로 생성되고, 절대이형발효의 경우는 젖산과 함께 초산, 이산화탄소등의 발효산물이 생성됨으로 어떤 종류의 발효가 일어나는지를 확인할 수 있는 주요 지표물질이다. 그 분석결과를 표 2에 나타내었다.
표 2와 같이 젖산과 초산의 몰농도의 비율을 계산한 결과 연중 1.3-1.6 정도의 비율로 초산 대비 젖산의 비율이 유지되는데 반하여 여름에 제조한 김치는 2.2-2.8 까지 젖산의 비율이 높아짐을 확인 할 수 있었다. 이는 발효 유산균의 변화로 인하여 특히 여름철에 동형발효의 비율이 높아지는 발효특성의 차이가 나타나고 이러한 특징이 하절기의 품질저하의 원인임을 확인할 수 있었다.
[표 2]
제조시기 | 샘플 번호 | 젖산/초산 농도 비율 (mM) |
봄 | 봄김치 1 | 1.5 ± 0.08 |
봄 | 봄김치 2 | 1.6 ± 0.11 |
여 름 | 여름김치 1 | 2.8 ± 0.13 |
여 름 | 여름김치 2 | 2.2 ± 0.09 |
여 름 | 여름김치 3 | 2.4 ± 0.25 |
여 름 | 여름김치 4 | 2.8 ± 0.13 |
가 을 | 가을김치1 | 1.4 ± 0.09 |
겨 울 | 겨울김치1 | 1.4 ± 0.25 |
겨 울 | 겨울김치2 | 1.5 ± 0.39 |
겨 울 | 겨울김치3 | 1.3 ± 0.02 |
겨 울 | 겨울김치4 | 1.3 ± 0.09 |
이상의 결과를 통해 본 발명자들은 겨울철 맛있는 시기에 분리되는 유산균을 스타터로 적용하여 연중 일정한 발효품질의 김치를 제조하고 특히 하절기의 발효품질저하를 효과적으로 제어하고자 겨울철에 제조한 김치로부터 약 500여 균주를 분리하였으며 이중 절대이형발효균이며 겨울김치의 우점종인 균 중에서 목적하는 바에 부합하는 신규한 유산균을 분리하게 되었다.
실시예 2: 미생물 류코노스톡 시트리움 CJGN34 균주의 분리 및 동정
상기 실시예 1과 같이 연중 김치 품질 변화의 원인 분석과 이를 통해 겨울에 제조하여 맛있게 잘 익은 김치에서 분리된 유산균 균주를 CJGN34로 균주명을 정하고 상기의 균주를 1.5% 한천(agar)이 포함된 MRS 고체 배지(Difco, USA)에 도말하여 30℃에서 24시간 배양한 후 순수 분리되었음이 확인된 집락을 백금이(loop)로 취하여 MRS 액체 배지(Difco, USA)에서 30℃ 18-24시간 배양하였다.
그런 다음, CJGN34 균주의 형태 및 생리학적 특성을 김 등(Kim et.al., Leuconostoc inhae sp. nov., a lactic acid bacterium isolated from kimchi, International Journal of Systematic and Evolutional Microbiology, Volume 53, July 2003, pages 1123-1126)의 방법과 API50CH 및 API50CHL키트(바이오메리오사 제품)을 사용하여 결정하였다. 그 결과 확인된 CJGN34 균주의 형태 및 생리학적 특성을 상기 표 1에 정리하였다.
또한, 유산균 동정 및 분류를 위한 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하였다. 16S rRNA 유전자의 염기서열 결정 및 분석은 김 등(Kim et.al., Leuconostoc kimchii sp. nov., a new species from kimchi. International Journal of Systematic and Evolutional Microbiology, Volume 50, September 2000, pages 1915-1919)의 방법을 사용하였다.
본 발명에 따른 류코노스톡 시트리움 CJGN34 균주는 16S rRNA 염기서열 분석 결과 류코노스톡 시트리움 표준균주(Leuconostoc citreum KCTC 3526T, GenBank accession number AF111948)와 가장 높은 상동성(99.7%)을 나타내어 류코노스톡 시트리움 (Leuconostoc citreum)으로 동정하고, 류코노스톡 시트리움 CJGN34로 명명하였으며, 생명공학연구원 유전자은행에 2006년 7월 27일자로 기탁하였다(수탁번호 KCTC 10974BP).
실시예 3: 류코노스톡 시트리움 CJGN34 균주의 안전성 평가
상기 실시예 1에서 분리된 균주의 안전성을 평가하기 위하여 한국바이오벤처협회 단체표준에서 제시한 안전성 평가 시험법에 따라 용혈 현상 검사, 젤라틴 액 화 반응 검사, 유해 대사산물(암모니아) 생성 확인, 페닌알라닌탈아민 검사를 수행하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
<표 3>
락토바실러스 플란타룸 CJGN34의 안전성 평가 결과
균주 | 항목 | |||
균주 | 젤라틴 액화반응검사 | 페닐알라닌탈아민 | 용혈성실험결과 | 암모니아생성 |
CJGN34 | 음성 | 음성 | 음성 | 음성 |
상기 결과에 따르면, 류코노스톡 시트리움 CJGN34 (Leuconostoc citreum CJGN34)은 젤라틴 액화 반응, 유해 대사산물 (암모니아) 생성, 페닌알라닌탈아민 생성, 용혈현상 검사 모두에서 음성으로 확인되었다. 따라서 류코노스톡 시트리움 CJGN34는 인체에 투여할 수 있는 안전한 균주인 것으로 확인되었다.
실시예 4: 류코노스톡 시트리움 CJGN34균주를 스타터로 제조한 김치의 특징
본 발명의 류코노스톡 시트리움 CJGN34 균주를 스타터로 적용하기 위하여 균주의 배양액 또는 균체 조성물을 제조하였으며 상기 균주 배양액과 균체 조성물은 다음과 같이 제조하였다.
본 발명 균주 배양액은 포도당 10g, 효모추출물 5g과 구연산 암모늄(diammonium citrate) 5g을 물에 녹여 멸균 후 본 발명 균주를 접종하고 25-37℃의 온도에서 8-24시간 배양하여 준비하였다. 그리고 본 발명 균체 조성물은 균체의 대량생산을 위하여 MRS 액체배지(Difco)를 암모니아 가스로 pH를 5.5-7.0으로 조절하면서 30℃에서 약 18 시간 발효를 실시하고 원심분리를 수행하여 균체만을 회수하였다. 회수한 균체는 균체 중량에 대하여 덱스트린 5%와 탈지우유 10%를 동결 보호제로 사용하여 -40℃이하에서 동결 후 30-37℃에서 건조한 후 균체를 믹서로 갈아서 분체화하였다. 상기 분체화한 생균분말은 목표로 하는 균수에 맞추고 보관을 하기 위하여 적당량의 포도당, 유당, 탈지우유 중 어느 하나 이상의 부형제와 혼합하여 밀봉되는 알루미늄 파우치에 담아 포장하였다.
이와 같이 제조한 본 발명 균주 배양액 또는 균체 조성물은 김치 전체 중량에 대하여 0.001%-3%되게 김치 제조 시에 첨가하여 사용하였다. 김치는 CJ제일제당의 제조법에 따라 제조 발효하였으며, 동일한 재료와 배합비로 제조하여 CJGN34를 스타터로 첨가하여 제조 후 발효한 김치와, 첨가하지 않고 자연 발효한 김치의 관능품질 및 이화학적 특성 분석을 진행하였다. 김치의 관능품질 및 이화학적 특성은 숙성도에 따라 차이가 발생할 수 있으므로 총산도를 기준으로 하여 0-0.05%내로 숙성정도를 맞추어 조사를 진행하였다. 이상과 같이 제조한 김치의 관능품질을 분석한 결과를 하기 표 4에서 나타내었다.
<표 4>
제조 시기 | 샘플 | 전반맛 기호도 | 신맛 기호도 | 탄산감 기호도 | 뒷맛 기호도 |
여름 | 자연발효김치 | 3.59 | 3.22 | 3.49 | 3.36 |
여름 | 스타터김치 | 3.85 | 3.67 | 3.61 | 3.81 |
겨울 | 자연발효김치 | 4.01 | 3.81 | 3.71 | 3.76 |
겨울 | 스타터김치 | 4.05 | 3.92 | 3.82 | 3.79 |
봄 | 자연발효김치 | 3.81 | 3.66 | 3.68 | 3.68 |
봄 | 스타터김치 | 3.91 | 3.71 | 3.75 | 3.72 |
가을 | 자연발효김치 | 3.86 | 3.72 | 3.66 | 3.71 |
가을 | 스타터김치 | 3.89 | 3.78 | 3.71 | 3.7 |
표 4에 나타난 바와 같이 자연발효 김치의 전반맛 기호도가 제조시기에 따라 여름김치 3.59에서 겨울김치 4.01까지 맛품질의 편차가 크게 발생함에 비하여 CJGN34를 스타터로 사용한 경우 여름김치 3.85에서 겨울김치 4.05까지 맛품질의 편 차가 줄어드는 것을 확인할 수 있어 목적하였던 연중 균일한 발효품질의 김치를 제조하는데 유효한 역할을 함을 알 수 있었다. 특히 하절기에 제조한 자연발효 김치에서는 신맛 기호도, 탄산감 기호도, 뒷맛 기호도가 떨어지면서 전반맛 기호도가 3.5대로 떨어짐에 반하여 CJGN34 스타터 김치의 경우는 신맛 기호도, 뒷맛 기호도는 95% 유의수준, 탄산감 기호도는 90% 유의수준의 차이를 보이면서 전반맛 기호도에 있어서도 95% 유의수준의 차이를 나타내어 목적하였던 하절기의 발효품질저하를 효과적으로 제어할 수 있음을 확인 할 수 있었다.
또한 이형발효와 동형발효 중 어떤 종류의 발효가 일어났는지를 확인할 수 있는 주요 지표물질인 젖산과 초산의 몰농도 비율을 확인한 결과 여름김치에서 높아졌던 젖산의 생성비율이 낮아짐을 확인할 수 있었으며, 이는 CJGN34스타터가 정상적으로 우점하여 하절기 맛품질을 저하시키는 동형발효 또는 편성이형발효 유산균의 생장을 억제하여 김치의 발효품질을 효과적으로 제어함을 다시금 확인 할 수 있게 하였다.
이상과 같은 각 제조시기의 김치의 유기산 분석 결과를 하기 표 5에서 나타내었다.
<표 5>
제조시기 | 샘플 | 젖산/초산 농도 비율 (mM) |
여름 | 자연발효김치 | 2.4 ± 0.3 |
여름 | 스타터김치 | 1.5 ± 0.1 |
겨 울 | 자연발효 김치 | 1.4 ± 0.2 |
겨 울 | 스타터 김치 | 1.3 ± 0.3 |
봄 | 자연발효김치 | 1.5 ± 0.1 |
봄 | 스타터김치 | 1.5 ± 0.1 |
가 을 | 자연발효김치 | 1.4 ± 0.1 |
가 을 | 스타터김치 | 1.4 ± 0.1 |
실시예 5: 류코노스톡 시트리움 CJGN34균주를 스타터로 제조한 발효식품 및 절임 식품
본 발명의 류코노스톡 시트리움 CJGN34 균주를 김치 이외의 발효식품의 스타터로 적용하기 위하여 실시예 4와 동일한 방법으로 균주의 배양액 또는 균체 조성물을 제조하였으며, 이를 스타터로 하여 발효식품을 제조하였다. 발효식품은 오이, 무, 당근, 양파, 마늘, 고추, 등 다양한 채소원료를 활용하여 제조할 수 있으며, 단무지와 같은 절임식품에 적용하여 발효 단무지를 제조할 수 있었다.
실시예 6: 류코노스톡 시트리움 CJGN34 (
Leuconostoc citreu
m CJGN34)를 포함하는 균체 조성물의 제조 및 활용
상기 실시예 1에서 동정된 류코노스톡 시트리움 CJGN34(Leuconostoc citreum CJGN34)을 의약품, 식품, 사료, 사료 첨가제, 또는 화장품의 원료로 적용하기 위하여 대량 생산하고 실시예 4와 동일한 방법으로 균체 조성물을 제조 하였다.
이와 같이 제조된 균체 조성물은 사료에 원료로 쓰이는 곡물가루와 혼합하여 사료용 생균제로 활용하거나, 담체 또는 첨가제 등을 혼합하여 정제, 캡슐 등의 의약품, 식품용 생균제로 활용하거나, 화장품에 사용되는 원료에 일정량을 혼합함으로써 의약품, 식품, 사료, 화장품 등 다양한 분야에 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 활용할 수 있다.
도 1은 김치 제조시기에 따른 전반맛 점수 평균을 나타낸 그래프이다.
도 2는 김치 제조시기에 따른 발효 균총의 변화 비율을 나타낸 그래프이다.
Claims (9)
- 겨울김치 우점종에서 분리한 절대 이형발효균이며 D-아라비노오스, 글루코네이트 당발효 음성이고, 무포자, 비운동성 구균이며, 증식온도가 15~45℃의 고온으로 연중 균일한 품질유지를 위한 김치발효용 유산균주 류코노스톡 시트리움 CJGN34 (Leuconostoc citreum CJGN34) KCTC 10974BP.
- 제1항 기재의 류코노스톡 시트리움 CJGN34(Leuconostoc citreum CJGN34) KCTC 10974BP를 유효성분으로 함유하는 식품 발효용 스타터(starter) 조성물.
- 제1항 기재의 류코노스톡 시트리움 CJGN34 (KCTC 10974BP) 균주 배양액에서 회수한 균체를 덱스트란 5%, 탈지우유 10%를 동결보호제로 사용하여 -40℃이하에서 동결후 30~37℃에서 건조한 후 믹서로 분체화하고 상기에서 얻은 생균분말을 김치 전체중량에 대하여 0.001%~3%되게 김치 제조시 첨가하기에 적합한 균수에 맞추고, 보관에 적합한 포도당, 유당, 탈지우유 중 하나이상의 부형제와 혼합 밀봉한 것이 특징인 김치발효용 스타터 조성물.
- 제3항에 따른 김치 발효용 스타터 조성물로 제조된 김치.
- 제2항 또는 제3항 기재의 식품 발효용 스타터 조성물로 발효된 오이, 무, 당근, 양파, 마늘, 고추 중 어느 하나의 절임식품.
- 제1항 기재의 류코노스톡 시트리움 CJGN34(Leuconostoc citreum CJGN34) KCTC 10974BP 균주를 유효성분으로 함유하는 유산균 화장료 조성물.
- 제1항 기재의 류코노스톡 시트리움 CJGN34(Leuconostoc citreum CJGN34) KCTC 10974BP 균주를 유효성분으로 함유하는 유산균 발효식품 조성물.
- 제1항 기재의 류코노스톡 시트리움 CJGN34(Leuconostoc citreum CJGN34) KCTC 10974BP 균주를 유효성분으로 함유하는 유산균 사료첨가제.
- 제8항 기재의 유산균 사료첨가제를 포함하는 동물사육용 유산균 사료.
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