KR101159237B1

KR101159237B1 - 마늘발효를 통하여 항산화활성을 향상시키는 신규한 류코노스톡 시트리움 균주

Info

Publication number: KR101159237B1
Application number: KR1020110074287A
Authority: KR
Inventors: 김수기; 조상범; 김수옥; 박재원
Original assignee: 초대에프앤피(주); 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2011-07-26
Filing date: 2011-07-26
Publication date: 2012-06-25

Abstract

본 발명은 마늘발효를 통하여 항산화활성을 향상시키는 신규한 Leuconostoc citreum 균주 및 그 균주의 응용에 관한 발명이다.

Description

마늘발효를 통하여 항산화활성을 향상시키는 신규한 류코노스톡 시트리움 균주{Novel Leuconostoc citreum enhancing anti-oxidant activity by garlic fermentation}

일반적으로 마늘 (Allium sativum L.)은 백합과 (Lilliaceae)의 파속 (Allium)에 속하는 일년생 식물로서 우리나라뿐만 아니라 인도, 중국, 미국, 남부유럽 등 다양한 지역에서 재배되고 있다 (Kim et al. 2009, Korean J Culinary Res 15:59-66). 마늘은 독특한 향기를 나타내는 황함유 휘발성 물질을 포함하고 있어 향신료로서 널리 이용되고 있으며, 마늘의 황함유 물질들이 항균성, 항암성, 항혈전성, 항산화성 등의 생리활성을 가진 것으로 알려지면서 다양한 산업분야의 기능성 소재로 널리 활용되고 있다 (Song et al. 2009, Korean J Food Preserv 16:929-937). 이처럼 마늘의 유용성이 널리 알려지면서 그 재배량이 증가하였고, 이에 따라 가공과정에서 상품성이 떨어져 폐기되는 마늘의 량도 따라서 늘어나게 되어 마늘 부산물들의 처리방안에 대한 연구가 진행되고 있다 (Kim et al. 2009,Food Eng Prog 13:352-359).

식물의 이용 효율을 향상시키는 방법의 하나로 발효과정이 적용되는데, 발효과정을 통하여 식물체의 유용성분이 증가될 수 있으며, 그 효능이 향상되는 것으로 보고되었다 (de Castro et al. 1998, International Journal of Food Microbiology 39:205-211; Sato et al. 2006, Plant Foods for Human Nutrition 61:157-160). 그러나 마늘은 다양한 미생물에 대하여 광범위한 항균활성을 가지고 있어 마늘을 발효시킬 수 있는 균주에 대하여 상당한 제약이 따른다 (Kim et al. 2009b, Food Eng Prog 13:352-359). 하지만 마늘은 열처리를 통하여 항균활성이 저하되어 발효의 가능성이 높아지며 또한 이용가능한 탄수화물의 함량이 증가되어 미생물의 기질로서 충분한 가능성을 가지게 된다 (de Castro et al. 1998, International Journal of Food Microbiology 39:205-211). 실제로 마늘의 수분함량은 62~68%로 다른 과채류에 비하여 낮으며, 칼슘, 인, niacin, thiamin, riboflavin, vitamin A, vitamin C 등 다양한 무기물과 비타민을 포함하고 있다 (Kim et al. 2009, Korean J Culinary Res 15:59-66). 국내에서 재배되는 마늘의 조단백질 함량은 약 8~10%수준이며, potassium (559 mg%)과 phosphate (469 mg%)이 주요 무기물로 포함되어 있다. 마늘에 포함된 유리당은 약 1172 mg% 정도이며 이 중 74%는 sucrose로 구성되어 있고 glucose와 fructose는 각각 10%와 17% 정도 포함되어 있다 (Kim et al. 2009,Korean J Culinary Res 15:59-66). 그 외의 탄수화물들은 주로 fructose의 중합체인 fructan으로 구성되어 있다 (Hwang et al. 2010,J Agri Life Sci 44:61-67). 마늘에는 cysteine, histidine, lysine 등과 같은 필수아미노산과 단백질들 그리고 탄수화물이 풍부하게 포함되어 있으며, 필수 지방산도 함유하고 있다 (Kim et al. 2010, Food Eng Prog 14:65-74). 이러한 마늘의 풍부한 영양성분들은 마늘자체가 미생물의 기질로서 충분한 역할을 수행할 수 있을 것으로 판단된다. 이에 본 발명에서는 마늘을 주요한 탄소원과 질소원으로 구성한 선택배지를 통하여 발효시킬 수 있는 유용균주를 분리하기 위하여 수행되어졌다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 마늘을 주요한 탄소원과 질소원으로 구성한 선택배지를 통하여 발효시킬 수 있는 유용균주를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 마늘발효에서 항산화활성을 향상시키는 마늘을 유일한 탄소원과 질소원으로 하는 신규한 Leuconostoc citreum 균주 KACC91593P을 제공한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 균주를 유효성분으로 포함하는 마늘의 항산화 활성 향상용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 균주를 유효성분으로 포함하는 마늘의 유황화합물의 증가용 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 균주를 이용하여 마늘을 발효시키는 단계를 포함하는 마늘의 항산화 활성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 균주를 이용하여 마늘을 발효시키는 단계를 포함하는 마늘의 유황화합물을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 마늘 발효 산물은 식품 소재 및 사료 소재로 사용될 수 있다.

본 발명의 마늘 발효물을 식품 또는 사료에 적용하는 경우에는 식품 또는 사료 원료에 본 발명의 마늘 발효물 조성물을 적절하게 배합하여 만들 수 있다.

식품의 원료로서는 원칙적으로 채소인 것이 바람직하나, 기타 육류 등에도 사용될 수 있으며,

사료 원료로서는 곡물류, 조강류, 식물성 유박류, 동물성 사료 원료, 기타 사료 원료, 정제품 등을 들 수 있다.곡물류로서는, 예를 들면 마이로, 밀, 보리, 귀리, 호밀, 현미, 메밀, 조, 수수, 피, 옥수수, 대두 등을 들 수 있다.

조강류로서는, 예를 들면 쌀겨, 탈지 쌀겨, 밀기울, 말분, 밀, 배아, 보리겨, 스크리닝, 펠렛, 옥수수겨, 옥수수 배아 등을 들 수 있다.

식물성 유박류로서는, 예를 들면 대두박, 콩가루, 아마박, 면실박, 낙화생 박, 홍화박, 야자박, 팜박, 호마박, 해바라기박, 유채박, 케이폭박, 겨자박 등을 들 수 있다.

동물성 사료 원료로서는, 예들 들면 어분(북양 밀, 수입 밀, 홀 밀, 연안 밀), 피쉬솔불, 육분, 어골분, 혈분, 분해모, 골분, 가축용 처리 부산물, 페더 밀, 누에, 탈지 분유, 카제인, 건조 유장 등을 들 수 있다.

그 밖의 사료 원료로서는 식물 경엽류(알팔파, 헤이큐브, 알팔파잎 분말, 유사 아카시아 분말 등), 옥수수 가공 공업부산물(콘 글루텐, 밀, 콘 글루텐 피드, 콘스테이프리카 등), 전분 가공품, 설탕, 발효 공업 산물(효모, 맥주박, 맥아근,알코올박, 장유박 등), 농산 제조 부산물(감귤 가공박, 두부박, 커피박, 코코아박 등), 그 외(카사바, 잠두콩, 구아밀, 해조, 크릴, 스피룰리나, 클로렐라, 광물 등) 등을 들 수 있다.정제품으로서는 단백질(카제인, 알부민 등), 아미노산, 당질(전분, 셀룰로오스, 슈크로우스, 글루코오스 등), 미네랄,비타민 등을 들 수 있다.

이하 본 발명을 설명한다.

마늘발효 미생물의 스크리닝

마늘을 발효시킬 수 있는 유용 균주를 탐색하기 위하여 국내 전통발효식품 (김치, 된장, 마늘절임)과 토양으로부터 유용 균주를 스크리닝하였다. 스크리닝 방법으로는 마늘을 유일 탄소원, 질소원으로 하는 배지 (K₂HPO₄, 0.1 g/l; MgSO₄, 0.01 g/l, 30% (w/v) garlic juice)를 이용하여 스크리닝하였다. 그 결과 총 104개의 균주를 확보하였으며, 스크리닝 한 균주들은 주로 MRS와 LB 배지에서 잘 성장하였다. 선발한 균주들의 성장성을 평가하기 위하여 상기 스크리닝 용 액상배지로 30℃에서 24시간 동안 배양한 후에, 총 viable cell count를 측정한 결과 도 1의 표에서 보는 것과 같이 나타났다.

항균활성의 조사

선발된 균주들의 생리활성을 평가하기 위하여 마늘을 포함한 상기 액상배지에 각 선발균주들을 1%로 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 배양한 후에 그 상등액을 이용하여 Staphylococcus aureus , Salmonella gallinarum, Listeria monocytogens , Escherichia coli와 같은 병원균을 대상으로 항균활성을 평가한 결과 선발균주들의 항균활성은 나타나지 않았다.

항산화활성의 조사

선발된 각 균주들을 배양한 후에 얻은 배양 상등액의 항산화활성을 평가한 결과는 도 2의 표에서 보는 것과 같다.

상대적 활성지수를 이용한 선발균주의 평가

표준정규분포를 이용하여 선발균주들의 상대적 활성을 평가한 결과, SK2556 균주에서 가장 우수한 활성이 나타났다.

선발균주들의 분류동정

선발된 균주들의 16S rRNA gene sequence들을 이용하여 균주들 간의 분자계통학적 위치를 조사하였다. 그 결과 선발된 균주들은 크게 5개의 부류로 나뉘었고, 대부분이 Leuconostoc과 Weisella에 속하는 균주들로 나타났다. 최종적으로 선발된 SK2556 균주는 Leuconostoc citreum으로 나타났다(도 3). 이 분리된 균주를 Leuconostoc citreum SK2556로 명명하였으며, 2010년 11월 23일에 대한민국 경기도 수원시 서둔동 소재 국립농업과학원 농업유전자센터에 Leuconostoc citreum SK2556, 수탁보존번호(기탁번호): KACC91593로 기탁하였다.

유황화합물의 분석결과

선발된 균주들 중에서 상대적 활성지수가 우수한 균주 SK2556를 이용하여 마늘을 발효시킨 후에 발효 전 후로 유황화합물의 증가 여부를 조사하였다. 그 결과 4에서 보는 것과 같이 선발된 균주 모두에서 조사된 유황화합물이 대조군에 비하여 증가되는 것을 확인하였다. 크로마토그램의 피크는 도 5에서 보는 것과 같다.

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 균주는 마늘발효에서 항산화활성을 향상시키고, 유황화합물이 대조군에 비하여 증가되는 효과를 가진다.

도 1은 분리된 균주의 세포 성장 및 배양 pH를 나타낸 표이다.
도 2는 분리된 균주의 자유기 소거 활성을 나타낸 표이다.
도 3은 선택된 본 발명의 SK2556 균주의 16S rRNA 유전자 서열을 나타낸 그림.
도 4는 본 발명의 SK2556 균주를 사용하여 발효된 마늘에서 유황 화합물의 크로마토그램은 나타냄. a, b,c 및 d는 각각 발효 0,8,16 및 24시간의 크로마토그램을 나타낸다.
도 5는 사용된 표준 유황 화합물의 크로마토그램을 나타낸 그림

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: 마늘 배지의 조성 및 제조

마늘을 탄소원과 질소원으로 이용할 수 있는 유용미생물을 탐색하기 위하여 배지 내 주요 탄소원과 질소원으로 마늘을 사용하였다. 본 발명에서 사용한 마늘은 일반 시장에서 판매하는 깐마늘을 사용하였고, 분쇄기(Philips HR2860, Netherlands)를 이용하여 균질화 한 후에 사용하였다. 균주탐색 및 분리를 위한 배지는 10% 마늘배지를 사용하였으며, 선발된 균주의 증균과정에서는 30% 마늘 배지를 사용하였고 자세한 조성은 다음과 같다. 10% 마늘 배지는 마늘, 100 g/L; potassium phosphate, 0.1 g/L; magnesium sulfate, 0.01 g/L; sodium acetate, 1 g/L; sodium chloride, 1 g/L; agar, 15 g/L로 구성하였고, 30% 마늘배지는 마늘, 300 g/L; potassium phosphate, 0.1 g/L; magnesium sulfate, 0.01 g/L; sodium acetate, 1 g/L; sodium chloride, 1 g/L로 구성하였다.

실시예 2: 분리원의 전처리

마늘을 이용하는 유용균주의 분리를 위한 분리원으로는 토양, 김치, 된장 그리고 마늘절임을 사용하였다. 토양은 서울 광진구 화양동 건국대학교 인근 토양을 채취하여 사용하였고, 토양에서 유래되는 영양물질로 인한 미생물 선발 오차를 줄이기 위하여 토양시료의 영양성분을 제거하는 전처리과정을 수행하였으며 자세한 방법은 다음과 같다. 토양시료 10 g을 멸균된 0.8% NaCl 용액 90 mL에 현탁 한 후에 ice bath에서 1시간 동안 교반하였고, 1,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 토양 및 기타 입자들을 제거하였다. 원심분리 상등액을 다시 10,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 토양내 미생물 균체를 포함하는 물질을 분리하였으며, 얻어진 균체 포함 물질은 동량의 0.8% NaCl으로 세척한 후에 동일한 원심분리방법으로 균체 포함 물질을 회수하였다. 0.8% NaCl을 이용한 세척과정은 3번에 걸쳐 진행하였으며, 최종적으로 동량의 0.8% NaCl에 균체 포함 물질을 현탁하였고, DMSO를 최종농도 10%가 되도록 첨가한 후에 실험 전까지 -70℃에서 보관하였다. 김치, 된장 그리고 마늘절임은 전통방법으로 제조된 시료를 사용하였다. 각각의 시료들은 분쇄기(Philips HR2860, Netherlands)를 이용하여 균질화하였고, 시료내 영양물질의 제거를 위한 세척과정은 토양시료의 전처리 과정과 동일한 방법을 사용하였다.

실시예 3: 균주의 선발

전처리과정을 마친 각각의 분리원 시료들을 멸균된 0.8% NaCl 용액에 희석한 후에 10% 마늘 평판배지에 도말하였고, 30℃ 항온기에서 24시간 동안 배양하였다. 평판배지에 형성된 집락의 개수가 약 500~1,000개 정도 되는 평판배지를 균주 분리용으로 사용하였고, 형태학적으로 서로 다른 집락들을 무작위로 선발하였다. 총 104개의 집락들이 선발되었고, 3회에 걸친 계대배양을 통하여 순수한 균주로 분리하였다.

실시예 4: 배양조건

분리된 균주들은 LB (Difco, USA) 혹은 MRS (Difco, USA)에서 증균하였고, 30% 마늘배지에 대한 접종원으로 사용하였다. Complex medium에서 증균된 균주들은 10,000 rpm에서 5분간 원심분리한 후에 멸균된 0.8% NaCl 용액으로 2회 세척한 후에 동량의 멸균된 0.8% NaCl 용액에 현탁하였고 접종액으로 사용하였다. 100 mL 용량의 삼각플라스크에 30% 마늘배지 30 mL를 담고 121℃에서 15분간 멸균한 후에 준비된 접종액을 1% (v/v)의 비율로 접종하였고, 30℃ 진탕배양기에서 150 rpm의 속도로 24시간 동안 배양하였다.

실시예 5: 생균수 측정

30% 마늘 배지에서 분리 균주들의 성장성을 평가하기 위하여 배양액의 생균수를 측정하였다. 배양 종료 후에 배양액 1 mL를 취하여 9 ml의 0.85% 멸균 NaCl 용액에서 순차적으로 희석한 후에 각 단계의 희석액 0.1 ml를 LB 혹은 MRS 평판 배지에 무균적으로 도말하였고 30℃ 항온 배양기에서 20 ~ 24시간 동안배양한 후에 형성된 집락의 수를 측정하였다. 유효 집락수를 30 ~ 300개로 하여 생균수의 밀도를 계산하였다.

실시예 6: 항산화활성 측정

선발 균주들의 발효가 마늘배지의 항산화 활성에 미치는 효과를 알아보기 위하여 배양 상등액의 항산화 활성을 DPPH (α,α'-diphenyl-β-picrylhydrazyl,Sigma)용액을 이용하여 평가하였다. 배양이 완료된 배양액을 10,000 rpm에서 5분간 원심 분리한 후에 상등액을 취하여 사용하였다. 항산화활성 측정을 위한 반응액은 배양 상등액과 멸균증류수, 99.9% 에탄올 그리고 4x10^-4 M DPPH 용액를 각각 0.1 : 0.4 : 1.0 : 1.0 의 비율로 혼합한 후에 상온에서 15분간 반응 시켰고, 분광광도계(SHIMADZU, Japan)를 사용하여 525 nm에서 반응액의 흡광도를 측정하였다. 대조구는 배양 상등액 대신 멸균증류수를 사용하여 반응 시킨 후 흡광도를 측정하였다.

실시예 7: 균주의 선발

마늘발효에 관여하는 우수한 균주의 선발은 성장성과 항산화활성 모두를 평가할 수 있는 상대적 활성지수를 이용하여 평가하였다. 상대적 성능평가 방법은 표준정규분포를 이용하였고, 수식은 다음과 같다.

실시예 8: 선발균주의 동정

상대적 활성지수를 통하여 선발된 균주들의 동정은 16S ribosomal RNA 유전자 염기서열을 이용하여 수행하였으며, 16S rRNA 유전자 염기서열은 두 가지 primer, 27F (forward primer; 5GTT TGA TCC TGG CTC AG-3)와 1492R (reverse primer; 5TAC CTT GTT ACG ACT T-3)를 사용하여 PCR 반응으로 증폭한 후에ABI 3730XL capillary DNA analyzer로 분석하였다. 염기서열의 모든 분석은Solgent (Korea, Daejun)에 의뢰하여 수행하였다. 분석한 염기서열은 NCBI의 BLAST를 이용하여Genbank에서 유사성 분석을 수행하였고, 유사성이 가장 높은 균주를 이용하여 선발균주를 동정 및 명명하였다.

실시예 9: 유황화합물의 분석

선발된 균주들 중에서 상대적 활성지수가 가장 높은 SK2556균주와 두 번째로 활성지수가 높은 SK2554균주를 이용하여 마늘을 발효시킨 후에 배양액에 존재하는 유황화합물을 HPLC를 이용하여 측정하였다. 유황화합물의 측정방법은 Block 등 (1992, J. Agric. Food Chem. 40:2418-2430)의 방법에 따라서 수행하였다.

농업생명공학연구원

KACC91593P

20101123

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류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) SK 2556 KACC91593P 균주를 이용하여 마늘을 발효시키는 단계를 포함하는 마늘의 유황화합물을 증가시키는 방법.