KR101997468B1 - 신규한 락토코커스 락티스 및 류코노스톡 시트리움 균주, 및 이들을 이용한 김치 숙성도 제어방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 락토코커스 락티스 및 류코노스톡 시트리움 균주, 및 이들을 이용한 김치 숙성도 제어방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 본 발명은 김치 종균으로 락토코커스 락티스 균주 및 이의 내성균인 류코노스톡 시트리움 균주의 혼합균주배양액을 사용함으로써 종래의 유산균들의 생육을 억제함과 동시에 이들 균주에 의한 발효가 주도적으로 일어나 김치의 숙성도를 지연시키며, 균체 대신 종균배양액을 사용함으로써 종균의 활성을 극대화함과 동시에 증균이 용이한 효과를 제공한다.
Description
본 발명은 신규한 락토코커스 락티스 및 이의 내성균인 류코노스톡 시트리움 균주, 및 이들을 이용한 김치 숙성도 제어방법에 관한 것이다.
김치의 상품화에 있어 품질 균일화 및 품질유지기한 연장이 가장 큰 문제로 대두되고 있으나 이를 해결할 수 있는 실용화된 기술이 미비한 실정이다.
김치의 경우 배추 품종, 절임 방법, 양념 혼합, 숙성 방법 및 미생물 발효 패턴 등 품질 균일화 및 품질 유지기한연장을 위해서는 많은 변수가 조절되어야 한다. 이 중에서 제조 공정 관리 부분은 현재까지 축적된 산업화 노하우와 연구 데이터로 인하여 산업현장에서 어느 정도 품질관리가 가능하지만 김치 미생물 발효패턴 조절 기술은 아직까지 상용화된 기술이 거의 없는 실정이다.
김치용 종균을 이용하여 김치 관능향상, 품질유지기한 연장 등 김치 품질을 개선하려는 연구가 일부 수행되었으나 대부분 종균의 단순 첨가에 의해 그 효과를 보고자 했다.
본 발명의 목적은 김치 발효에 관여하는 길항 및 공생 관계에 있는 신규한 유산균들을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 길항 및 공생 관계에 있는 신규한 김치 유산균들을 종균으로 이용하여 김치 숙성도를 제어하는 방법 및 이로부터 제조된 김치를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 락토바실러스 사케아이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 커바터스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 페디오코커스 이노피나터스(Pediococcus inopinatus), 웨이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 웨이셀라 컨퓨사(Weissella confusa) 및 류코노스톡 카노섬(Leuconostoc carnosum)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 대해 항균 활성이 있는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0098 [기탁번호 KCTC 13789BP] 또는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0099 [기탁번호 KCTC 13790BP]를 제공한다.
본 발명은 또한 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0098 [기탁번호 KCTC 13789BP] 또는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0099 [기탁번호 KCTC 13790BP]에 대해 내성을 갖는 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) WiKim0096 [기탁번호 KCTC 13788BP] 또는 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) WiKim0101 [기탁번호 KCTC 13791BP]를 제공한다.
본 발명은 또한 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0098 [기탁번호 KCTC 13789BP] 및 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0099 [기탁번호 KCTC 13790BP]로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상; 및 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) WiKim0096 [기탁번호 KCTC 13788BP] 및 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) WiKim0101 [기탁번호 KCTC 13791BP]로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 혼합균주배양액을 종균으로 사용하여 김치를 제조하는 단계를 포함하는 김치 숙성도 제어방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기의 방법으로 제조되고, 종균이 없이 발효된 김치 대비 김치 숙성이 지연된 김치를 제공한다.
본 발명은 김치 발효에 관여하는 주요 유산균들에 대한 항균 활성이 우수한 신규한 락토코커스 락티스 균주와 더불어 이 균주에 저항성을 지닌 류코노스톡 시트리움 균주들을 제공하는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 상기 길항 관계에 있지 않은 유산균들을 함께 종균으로 사용함으로써 기존의 김치 종균 단순 첨가에 따른 김치 발효 조절과는 달리 원래 김치 원부재료에 있던 유산균들의 생육을 억제함과 동시에 본 발명에서 첨가한 균주에 의해 발효가 주도적으로 일어남으로써 김치의 품질유지기한을 약 1.5배 정도 효과적으로 연장할 수 있다. 또한, 종균 첨가시 균체가 아닌 종균 배양액을 사용함으로써 종균의 활성을 극대화하고 증균의 용이함으로 인해 효과를 극대화할 수 있다.
도 1은 Agar-well diffusion assay을 이용한 항균 활성 측정 결과를 나타낸 것으로, 상단 사진도는 락토바실러스 사케아이(Lb. sakei)에 대한 항균 활성 결과(A: 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) CHJ10, B: WiKim0098, C: WiKim0099)이고, 하단 사진도는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 커바터스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 페디오코커스 이노피나터스(Pediococcus inopinatus), 웨이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 웨이셀라 컨퓨사(Weissella confusa) 및 류코노스톡 카노섬(Leuconostoc carnosum)에 대한 항균 활성 결과이다.
도 2는 선발된 유산균들의 16S rRNA 유전자 동정 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 균주별 만니톨 생성량을 나타낸 것이다.
도 4는 종균 증균용 식용배지 2에서의 혼합배양 결과를 나타낸 것이다(원 안은 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum)).
도 5는 발효기간 경과에 따른 pH의 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 발효기간 경과에 따른 유산균 수의 변화를 나타낸 것이다.
도 7은 발효 12일 차 김치 내 종균 생존율을 나타낸 것이다(좌: 대조군 김치, 우: 락토코커스 락티스(Lc . lactis) 및 류코노스톡 시트리움(Leu. citreum) 혼합 종균 첨가군).
도 2는 선발된 유산균들의 16S rRNA 유전자 동정 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 균주별 만니톨 생성량을 나타낸 것이다.
도 4는 종균 증균용 식용배지 2에서의 혼합배양 결과를 나타낸 것이다(원 안은 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum)).
도 5는 발효기간 경과에 따른 pH의 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 발효기간 경과에 따른 유산균 수의 변화를 나타낸 것이다.
도 7은 발효 12일 차 김치 내 종균 생존율을 나타낸 것이다(좌: 대조군 김치, 우: 락토코커스 락티스(Lc . lactis) 및 류코노스톡 시트리움(Leu. citreum) 혼합 종균 첨가군).
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 김치에서 분리 동정되고, 김치 발효 유산균들에 대해 항균 활성을 갖는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0098 [기탁번호 KCTC 13789BP] 또는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0099 [기탁번호 KCTC 13790BP]에 관한 것이다.
본 발명자들은 김치 발효에 관여하는 유산균들에 대해 항균 활성을 갖는 유산균을 선별하기 위해 김치국물에 있는 고형분을 제거한 후, 희석하여 MRS-BPB 배지에서 혐기적으로 배양한 다음 주변에 노란색 환을 생성한 콜로니를 분리하고, 지시 균주로 락토바실러스 사케아이(Lb. sakei)를 사용하여 500여종의 분리된 균주들의 항균 활성을 측정하여 저해환 크기를 기반으로 항균 활성이 가장 우수한 2종의 균주를 선발하였다. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통해 이들 균주는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)로 동정되었으며(도 2 참조), 각각 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0098 및 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0099로 명명하였다. 이렇게 선별된 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0098 및 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0099를 2019년 01월 10일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)(각각 기탁번호 KCTC 13789BP, KCTC 13790BP)에 기탁하였다.
본 발명의 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주들은 그람 양성균으로, 호기적 및 혐기적 조건에서 모두 성장이 가능한 통성 혐기성(facultive anaerobe)이고, 구균의 형태를 취하고 있다.
본 발명의 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주들은 김치 발효에 관여하는 주요 균주로 알려진 락토바실러스 사케아이(Lactobacillus sakei)외에도, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 커바터스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 페디오코커스 이노피나터스(Pediococcus inopinatus), 웨이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 웨이셀라 컨퓨사(Weissella confusa), 류코노스톡 카노섬(Leuconostoc carnosum) 등에 대해 항균 활성을 나타낸다. 그러나 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum)에 대해서는 항균 활성을 나타내지 않는 특징이 있다.
본 발명의 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주들은 통상의 세포배양배지에서 배양될 수 있으며, 바람직하게는, 식품첨가물 등급의 탄소원, 질소원, 무기염류, 비타민, pH 조절제 등을 포함하는 식용배지에서 배양될 수 있다.
바람직한 탄소원은 락토오스, 글루코오스, 프룩토오스, 말토오스 또는 수크로오스 중 하나 이상일 수 있다.
미생물 배양을 위한 질소원은 무기염(예: (NH4)2HPO4, NH4OH, (NH4)2SO4, NH4Cl) 또는 유기 질소 화합물(예: 요소, 아미노산), 이의 혼합물 또는 질소 화합물(예: 콩가루, 효모 추출물, 밀기울)을 함유하는 식품이나 부산물일 수도 있다. 바람직하게는, 카제인 펩톤(casein peptone), 소이펩톤(soypeptone), 효모추출물 등을 사용할 수 있다.
무기염은 금속 양이온, 즉 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 철, 망간, 코발트, 구리 및 아연을 미량 포함한다. 이들 금속 양이온의 각각은 0.001∼100 mM의 농도로 배양 배지에 존재해야 하지만, 나트륨은 특히 pH 조절을 위해 많은 양으로 존재할 수도 있다. 무기물로서 KH2PO4 1∼5g, MgSO4 0.2∼1.5g, 0.1∼0.5M Fe-EDTA 5∼10mL, 0.1∼0.5M MnSO4 5∼10mL 등을 사용할 수 있다.
비타민은 피리독신, 아스코르브산, 티아민, 이노시톨, 폴릭산, 니코틴산, 리보플라빈, 바이오틴 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기 식용배지의 pH는 5.5 내지 7.0, 구체적으로 5.5 내지 6.5, 더 구체적으로 6.0 내지 6.5일 수 있다.
본 발명의 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주들은 25℃ 내지 37℃에서, 구체적으로 28℃ 내지 35℃에서, 더 구체적으로 28℃ 내지 30℃에서, pH는 5.5 내지 7.0, 구체적으로 5.5 내지 6.5, 더 구체적으로 6.0 내지 6.5로 조절하여 15시간 내지 24시간 동안 배양될 수 있다.
본 발명은 또한 김치에서 분리 동정되고, 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0098 [기탁번호 KCTC 13789BP] 또는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0099 [기탁번호 KCTC 13790BP]에 대해 내성을 갖는 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) WiKim0096 [기탁번호 KCTC 13788BP] 또는 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) WiKim0101 [기탁번호 KCTC 13791BP]에 관한 것이다.
본 발명자들은 본 발명의 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주들이 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) 균주에 대해 항균 활성을 나타내지 못함을 확인하였다. 따라서, 만니톨 생성으로 인해 김치 관능에 좋은 영향을 줄 수 있는 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) 균주를 선별하여 김치 종균으로 함께 사용하고자 하였다. 이를 위해 김치국물에서 분리한 유산균들을 과당(fructose)을 첨가한 MRS 배지에서 배양한 다음 만니톨 생성량을 분석하였다. 만니톨 생성능이 가장 우수한 2종의 균주를 선발하고, 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통해 이들 균주는 류코노스톡 시트리움(Leuconstoc citreum)로 동정되었으며(도 2 참조), 각각 류코노스톡 시트리움(Leuconstoc citreum) WiKim0096, 류코노스톡 시트리움(Leuconstoc citreum) WiKim0101로 명명하였다. 이렇게 선별된 류코노스톡 시트리움(Leuconstoc citreum)을 2019년 01월 10일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)(각각 기탁번호 KCTC 13788BP, KCTC 13791BP)에 기탁하였다.
본 발명의 류코노스톡 시트리움(Leuconstoc citreum) 균주들은 그람양성균으로, 호기적 및 혐기적 조건에서 모두 성장이 가능한 통성 혐기성(facultive anaerobe)이고, 구균의 형태를 취하고 있다.
본 발명의 류코노스톡 시트리움(Leuconstoc citreum) 균주들은 만니톨 생성능이 우수한 유산균으로, 4%의 과당으로부터 약 25 내지 30 mg/mL의 만니톨 생성능을 가지며, 본 발명의 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주들에 대해 내성을 갖는다.
본 발명의 류코노스톡 시트리움(Leuconstoc citreum) 균주들은 통상의 세포배양배지에서 배양될 수 있으며, 바람직하게는, 식품첨가물 등급의 탄소원, 질소원, 무기염류, 비타민, pH 조절제 등을 포함하는 식용배지에서 배양될 수 있다. 바람직한 탄소원은 락토오스, 글루코오스, 프룩토오스, 말토오스 및 수크로오스의 혼합물이다. 바람직한 질소원, 무기염류, 비타민 등은 상술한 기재를 따른다. 상기 식용배지의 pH는 5.5 내지 7.0, 구체적으로 5.5 내지 6.5, 더 구체적으로 6.0 내지 6.5일 수 있다.
본 발명의 류코노스톡 시트리움(Leuconstoc citreum) 균주들은 25℃ 내지 37℃에서, 구체적으로 28℃ 내지 35℃에서, 더 구체적으로 28℃ 내지 30℃에서, pH는 5.5 내지 7.0, 구체적으로 5.5 내지 6.5, 더 구체적으로 6.0 내지 6.5로 조절하여 15시간 내지 24시간 동안 배양될 수 있다.
본 발명은 또한 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0098 [기탁번호 KCTC 13789BP] 및 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0099 [기탁번호 KCTC 13790BP]로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상; 및 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) WiKim0096 [기탁번호 KCTC 13788BP] 및 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) WiKim0101 [기탁번호 KCTC 13791BP]로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 혼합균주배양액을 종균으로 사용하여 김치를 제조하는 단계를 포함하는 김치 숙성도 제어방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기의 방법으로 제조되고, 종균이 없이 발효된 김치 대비 김치 숙성이 지연된 김치를 제공한다.
본 발명의 김치 숙성도 제어방법은 김치 발효에 관여하는 주요 유산균들에 대한 항균 활성이 우수한 락토코커스 락티스 균주와 이 균주에 저항성을 지닌 류코노스톡 시트리움 균주를 동시에 종균으로 사용함으로써 기존의 김치종균 단순 첨가에 따른 김치 발효 조절과는 달리 원래 김치원부재료에 있던 유산균들의 생육을 억제시킴과 동시에 본 발명에서 첨가한 균주에 의해 발효가 주도적으로 일어남으로써 김치의 품질유지기한을 약 1.5배 정도 효과적으로 연장시킬 수 있는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 김치 숙성도 제어방법은 종균 첨가시 균체가 아닌 종균 배양액을 사용함으로써 종균의 활성을 극대화하고 증균의 용이함으로 인해 효과를 극대화할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 김치 숙성도 제어방법에서, 종균으로 사용하는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주는 김치 유산균에 대해 항균 활성이 우수한 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0098 [기탁번호 KCTC 13789BP] 또는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0099 [기탁번호 KCTC 13790BP]를 단독 또는 2종 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 김치 숙성도 제어방법에서, 종균으로 사용하는 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) 균주는 만니톨 생성능이 우수하고, 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)에 대해 내성을 가지는 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) WiKim0096 [기탁번호 KCTC 13788BP] 또는 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) Wiim0101 [기탁번호 KCTC 13791BP]를 단독 또는 2종 사용할 수 있다.
본 발명의 김치 숙성도 제어방법에서, 종균으로 사용한 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주 및 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) 균주의 혼합균주배양액은 하기 조건을 만족하는 식용배지에 각각의 균주를 접종하고 28℃ 내지 35℃에서 15시간 내지 24시간 동안 배양하여 얻을 수 있다:
(i) 탄소원: 락토오스, 글루코오스, 프룩토오스, 말토오스 및 수크로오스의 혼합물
(ii) 질소원: 카제인 펩톤(casein peptone), 소이펩톤(soypeptone) 및 효모추출물
(iii) 무기염류: 포타슘 시트레이트
(iv) 비타민: 아스코르브산
(v) pH: 5.5 내지 7.0
상기 식용배지는 식품첨가물 등급의 탄소원, 질소원, 무기염류, 비타민, pH 조절제 등을 포함하는 배지로 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주 및 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) 균주가 함께 증식될 수 있는 배지인 것을 특징으로 한다.
바람직한 탄소원은 락토오스, 글루코오스, 프룩토오스, 말토오스 및 수크로오스의 혼합물로, 식용배지 총 중량 대비 0.1% 내지 5%, 바람직하게는 0.1% 내지 3%를 사용할 수 있다.
미생물 배양을 위한 질소원은 무기염 또는 유기 질소 화합물, 이의 혼합물 또는 질소 화합물을 함유하는 식품이나 부산물일 수도 있다. 바람직하게는, 식용배지 총 중량 대비 0.5 내지 3%의 카제인 펩톤(casein peptone), 0.5 내지 3%의 소이펩톤(soypeptone) 및 0.5 내지 3%의 효모추출물의 혼합물이다.
무기염은 금속 양이온, 즉 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 철, 망간, 코발트, 구리 및 아연을 미량 포함한다. 이들 금속 양이온의 각각은 0.001∼100 mM의 농도로 배양 배지에 존재해야 하지만, 나트륨은 특히 pH 조절을 위해 많은 양으로 존재할 수도 있다. 무기물로서 KH2PO4 1∼5g, MgSO4 0.2∼1.5g, 0.1∼0.5M Fe-EDTA 5∼10mL, 0.1∼0.5M MnSO4 5∼10mL 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는, 식용배지 총 중량 대비 0.5 내지 2%의 포타슘 시트레이트를 사용할 수 있다.
비타민은 피리독신, 아스코르브산, 티아민, 이노시톨, 폴릭산, 니코틴산, 리보플라빈, 바이오틴 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 식용배지 총 중량 대비 0.01 내지 0.1%의 아스코르브산을 사용할 수 있다.
상기 식용배지의 pH는 5.5 내지 7.0, 구체적으로 5.5 내지 6.5, 더 구체적으로 6.0 내지 6.5일 수 있다.
상기 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주 및 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) 균주는 1 내지 2:1의 혼합비로 접종하여 배양될 수 있다.
혼합균주의 배양 조건은 25℃ 내지 37℃에서, 구체적으로 28℃ 내지 35℃에서, 더 구체적으로 28℃ 내지 30℃에서, pH는 5.5 내지 7.0, 구체적으로 5.5 내지 6.5, 더 구체적으로 6.0 내지 6.5로 조절하여 15시간 내지 24시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 김치 숙성도 제어방법에서, 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주 및 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) 균주의 혼합균주배양액은 김치원부재료의 총 중량대비 3% 내지 15%, 또는 5% 내지 10%로 혼합하여 김치를 제조할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "김치원부재료"는 김치의 원재료와 양념의 부재료를 혼합한 것을 의미하며, 김치의 원재료는 배추, 열무, 파, 갓, 부추, 깻잎, 총각무우, 고들빼기, 얼갈이 등을 포함하고, 양념의 부재료는 고춧가루, 무, 마늘, 생강, 쪽파, 멸치액젓, 찹쌀풀 등을 포함하나, 이에 제한하는 것은 아니다.
일 실시예에 따르면, 김치를 제조한 후 10℃에 저장하면서 pH, 유산균수의 변화를 살펴본 결과 이들 균주 첨가군이 대조군에 비해 pH 저하 속도가 느리게 일어나고 첨가한 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주 및 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) 균주들이 발효기간 내내 생존하고 있음을 확인할 수 있었다. 첨가한 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주에 의해 원래 김치 원부재료에 존재했던 유산균들은 생육이 억제되었고 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주에 저항성을 지닌 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) 균주는 생육에 저해를 받지 않는 것으로 나타났다.
일반적으로 알려진 김치의 적숙기 최저 범위인 pH 4.2 도달 시간을 고려했을 때 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주 및 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) 균주의 혼합 첨가군이 대조군에 비해 약 1.5배 정도 김치의 품질유지기한을 연장시키는 것으로 나타났다.
본 발명의 김치 숙성도 제어방법을 통해 제조되고, 종균이 없이 발효된 김치 대비 김치 숙성이 지연된 김치는 특별한 제한은 없으나, 배추김치, 열무김치, 파김치, 갓김치, 부추김치, 깻잎김치, 총각김치, 고들빼기김치 및 얼갈이 김치 등을 예로 들 수 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 항균활성이 우수한 락토코커스 락티스 WiKim0098, WiKim0099 균주의 분리, 선발 및 동정
일반가정과 시중에서 시판되고 있는 김치를 수집하여 유산균을 분리하고자 거즈를 이용하여 김치국물에 있는 고형분을 제거한 후, 희석하여 MRS 배지에 0.2% bromophenol blue 지시약 1%를 넣어 제조한 MRS-BPB 배지에 도말하여 30℃에서 48시간 동안 혐기적으로 배양한 다음 주변에 노란색 환을 생성한 콜로니를 분리하였다.
항균 활성이 우수한 유산균의 선발 및 동정을 위한 항균활성 시험은 agar well diffusion assay를 이용하여 김치 과숙 관련 지시균주에 대하여 분리 균주들의 생육저해활성을 확인하였다. 분리된 500여 종의 균주의 항균활성을 측정하기 위해 김치 과숙 관련 지시균주로 락토바실러스 사케아이(Lb. sakei)를 사용하였다. 지시균주 배양액을 0.7%(v/v) soft MRS agar에 접종하여 MRS 플레이트에 overlay하여 굳힌 다음, cork borer를 이용하여 직경 5 mm의 구멍을 내고 분리 균주의 상등액 30㎕를 접종하였다. 30℃에서 24시간 배양한 후, 저해환의 생성 여부를 확인하였다. 저해환의 크기를 측정하여 항균 활성이 가장 우수한 두 균주를 선발하였고(도 1), 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통해 이들 균주는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)로 동정되었으며(도 2 참조), 각각 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0098 및 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0099로 명명하였다.
이들 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0098 및 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0099 균주는 락토바실러스 사케아이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 커바터스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 페디오코커스 이노피나터스(Pediococcus inopinatus), 웨이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 웨이셀라 컨퓨사(Weissella confusa), 류코노스톡 카노섬(Leuconostoc carnosum) 등의 균주도 저해하는 것으로 나타났다. 그러나 이들 균주는 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) 균주는 저해하지 못하는 것으로 나타났다.
<실시예 2> 만니톨 생성능이 우수한 류코노스톡 시트리움 WiKim0096, WiKim0101 유산균의 분리, 선발 및 동정
상기 실시예 1에서 분리한 항균 활성이 우수한 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주들이 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) 균주는 저해하지 못하는 것으로 나타나 만니톨 생성으로 인해 김치 관능에 좋은 영향을 줄 수 있는 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) 균주를 종균으로 함께 이용하고자 만니톨 생성능이 우수한 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) 균주를 선발하고자 하였다.
상기 실시예 1에서 분리된 유산균 균주들을 4%의 과당(fructose)를 첨가한 5mL의 MRS 액체배지에 접종하여 30℃에서 48시간 배양한 후, 원심분리(10,000Хg, 5min)하여 얻은 상층액을 0.45㎛ syringe filter로 여과하여 배지 내 만니톨(mannitol) 생성량을 분석하는데 사용하였다. 배양액 내 과당 잔존율 및 만니톨 생성율은 HPLC(Waters 2695 eAlliance, Waters, Milford, MA, USA)를 이용하여 측정하였다. 당 분석 검출기는 Waters RI detector를 사용하였고, column은 Sugar-pak column(Waters, USA)을 사용하였다. 시료는 20㎕를 주입하였으며, 이동상으로는 H2O(HPLC-grade, Fisher)를 사용하여 0.5mL/min의 속도로 흘러주었다. 만니톨(mannitol), 포도당(glucose), 과당(fructose)의 표준물질은 Sigma사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, 각각 100mg/mL의 농도가 되도록 계산하여 용량 플라스크에 정밀히 취하고 물을 첨가하여 정용하였으며, 물로 희석하여 0.4mg/mL, 0.8mg/mL, 1.6mg/mL, 3.2mg/mL 용액을 검량선 작성용 표준용액으로 이용하였다. 시료 중의 당 농도는 표준물질의 성분과 머무름 시간이 일치하는 피크의 면적값을 해당 표준물질의 표준곡선에 대비하여 정량하였다. 만니톨 생성능이 우수한 균주의 선발은 MRS 액체 배지 내에 함유된 과당을 전환시켜 만니톨을 많이 생성한 균주를 선발하였다(도 3). 선발한 균주는 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통해 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum)으로 동정되었으며(도 2 참조), 각각 류코노스톡 시트리움(Leuconstoc citreum) WiKim0096, 류코노스톡 시트리움(Leuconstoc citreum) WiKim0101으로 명명하였다.
<실시예 3> 종균 증균용 배양액 제조
상기 실시예 1 및 2에서 분리한 항균 활성이 우수한 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0098 및 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0099 균주의 증균용 식용배지 제조를 위하여 M17 배지에 사용된 성분을 바탕으로 식품첨가물 등급의 탄소원, 질소원, pH 조절제, 무기염류 등을 첨가하여 식용 배지를 제조하였다. 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)의 경우 M17 배지에 잘 증식하므로 M17 배지의 조성을 참고하여 카제인 펩톤(casein peptone) 0.5%, 소이펩톤(soypeptone) 0.5%, 효모 추출물(yeast extract) 3%, 아스코르브산(ascorbic acid) 0.05%, 락토오스(lactose) 3%, 포타슘 시트레이트 1% 등을 기본 조성으로 하여 실험에 사용하였다. 질소원 및 탄소원 등의 함량을 조절하여 실험한 결과 M17 배지와 유사한 결과를 나타내었고 이를 식용배지 1로 이용하였다.
상기 식용배지 1은 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)는 잘 증식되었지만 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum)은 잘 증식되지 않아 이를 해결하고자 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스 및 말토오스의 탄소원을 각각 0.1% 추가로 첨가하여 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)와 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) 혼합배양을 위한 식용배지 2를 제조하였다.
탄소원을 추가로 첨가하여 제조한 식용배지에서는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)와 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) 두 균주 모두 증식하였다(도 4).
기존 동결 건조된 분말 형태로 된 종균을 김치에 첨가하는 방식에 비해 식용배지를 이용하여 증균한 후 균주가 포함된 배양액을 직접 김치에 첨가할 경우 많은 수의 종균을 저렴한 비용으로 첨가할 수 있고(김치 1g당 108 CFU 정도), 종균이 활성화된 상태로 김치에 첨가되기 때문에 김치 내에서 우점율을 차지할 확률이 높아지는 장점이 있다. 또한, 배양액 내에 종균이 생산한 대사산물이 많이 포함되어 있어 그 효과를 극대화할 수 있다.
<실시예 4> 락토코커스 락티스 WiKim0098, WiKim0099 균주 및 류코노스톡 시트리움 WiKim0096, WiKim0101을 첨가한 김치 제조
락토코커스 락티스 WiKim0098, 락토코커스 WiKim0099와 류코노스톡 시트리움 WiKim0096, 류코노스톡 시트리움 WiKim0101을 프룩토오스가 0.1% 함유된 식용배지 2에 접종한 후 30℃에서 16시간 배양한 후 얻은 배양액을 김치용 종균으로 사용하였다.
락토코커스 락티스 WiKim0098, WiKim0099 균주 및 류코노스톡 시트리움 WiKim0096, WiKim0101을 첨가한 김치를 제조하기 위해, 염도 2%의 절임배추를 제조하고 표 1과 같이 배합비를 사용하였다. 표 1의 배합비로 제조한 김치양념에 상기에서 준비한 락토코커스 락티스 WiKim0098, 락토코커스 WiKim0099와 류코노스톡 시트리움 WiKim0096, 류코노스톡 시트리움 WiKim0101 혼합 균주 배양액을 전체 배합비의 10%가 되도록 첨가하여 절임배추와 혼합함으로써 종균 첨가 김치를 제조하였다.
대조구로는 종균 배양액 대신 물 또는 종균을 첨가하지 않은 배양액을 첨가하여 상기와 동일한 조건으로 김치를 제조하였다.
재료명 | 중량(g) |
절임배추 | 75 |
고춧가루 | 3.7 |
무 | 2 |
마늘 | 3.2 |
생강 | 0.8 |
파(쪽파) | 1 |
멸치액젓 | 3.3 |
찹쌀풀 | 1 |
물 (배양액) | 10 |
합계 | 100 |
<실시예 5> 김치의 발효 특성 실험
상기 실시예 4에서 제조된 김치들은 1Kg씩 pouch pack에 담아 10℃±0.5에서 12일간 저장하면서 2일 간격으로 발효특성을 확인하였다. 상기 제조된 김치를 이용한 하기 실험은 pH의 경우 상기 김치를 2일 간격으로 수득하여 핸드 블렌더로 2분간 마쇄한 후, 멸균 거즈로 여과한 김치액을 이용하여 수행하였고 유산균 수의 경우 25 g의 김치를 스토마커 처리한 후 순차적으로 희석하고 희석액을 MRS 배지에 도말하여 30℃에서 48시간 동안 혐기배양한 후 계수하였다. 상기 실시예 4의 방법으로 제조한 김치의 10℃±0.5에서의 발효기간에 따른 김치의 pH 변화를 측정하여 도 5에 나타내었다.
도 5에서 보는 바와 같이, 대조군(균주 비첨가 김치)의 pH는 발효 0일에 pH 5.11를 나타내었고 발효 일수 경과에 따라 빠른 속도로 낮아져 발효 7일째에는 pH 4.29, 발효 10일째에는 pH 4.06을 나타내었다. 반면 락토코커스 락티스를 종균으로 첨가한 김치는 발효 7일째에는 pH 4.87, 발효 10일째에는 pH 4.36을 나타내었다. 락토코커스 락티스와 류코노스톡 시트리움을 혼합 배양하여 종균으로 첨가한 김치는 발효 7일째에는 pH 4.91, 발효 10일째에는 pH 4.40을 나타내었다.
일반적으로 알려진 김치의 적숙기 최저 범위인 pH 4.2 도달 시간을 고려했을 때 락토코커스 락티스와 류코노스톡 시트리움 균주의 혼합 첨가군이 대조군에 비해 약 1.5배 정도 김치의 품질유지기한을 연장시키는 것으로 나타났다.
다음으로, 상기 실시예 4의 방법으로 제조한 김치를 10℃±0.5에서 발효시키면서 발효기간 경과에 따른 유산균 수의 변화를 측정하여 도 6에 나타내었다.
도 6에서 보는 바와 같이 대조군(균주 비첨가 김치)의 경우 발효 0일째 7.0 log CFU/g를 나타내었지만 종균을 첨가한 김치는 발효 0일째 8.5 log CFU/g을 나타내어 대조군보다 약 15배 정도 더 유산균 수가 많았다. 이는 식용배지에 접종한 종균이 충분히 증식하여 김치에 첨가되었음을 알 수 있었다. 발효 3일째에는 대조군 김치가 8.4 log CFU/g, 종균 첨가 김치도 8.4-8.6 log CFU/g 수를 나타내었고 그 이후에는 비슷한 양상을 나타내었다.
마지막으로, 김치에 첨가한 종균이 김치 발효 기간 내 생존하고 있는지 알아보기 위하여 MRS 고체 배지를 이용하여 콜로니를 분리한 다음 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통해 확인하였다.
종균으로 첨가한 락토코커스 락티스의 경우 7일째까지 우점종으로 존재하였으나 그 이후에는 다른 유산균들의 증식으로 인해 그 비율이 점점 감소하였다. 반면 락토코커스 락티스와 함께 첨가되었던 류코노스톡 시트리움은 발효 후반기에도 우점종으로 생존하고 있음을 확인할 수 있었다.
발효 12일째 김치에서 분리된 유산균들을 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통해 분석한 결과, 대조군 김치는 류코노스톡 메센테로이드(54%)와 락토바실러스 사케아이(29%)가 우점종을 차지한 반면 락토코커스 락티스와 류코노스톡 시트리움 종균을 혼합하여 첨가한 김치군에서는 류코노스톡 시트리움(58%)과 류코노스톡 메센테로이드(33%)가 우점종을 차지하고 있어 첨가한 종균에 의해 발효가 주도적으로 일어나고 있음을 알 수 있었다(도 7). 이와 같은 균총 변화는 김치의 관능적 특성에도 직접적으로 영향을 줄 수 있을 것으로 사료 되었다.
Claims (8)
- 락토바실러스 사케아이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 커바터스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 페디오코커스 이노피나터스(Pediococcus inopinatus), 웨이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 웨이셀라 컨퓨사(Weissella confusa) 및 류코노스톡 카노섬(Leuconostoc carnosum)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 대해 항균 활성이 있는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0098 [기탁번호 KCTC 13789BP].
- 락토바실러스 사케아이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 커바터스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 페디오코커스 이노피나터스(Pediococcus inopinatus), 웨이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 웨이셀라 컨퓨사(Weissella confusa) 및 류코노스톡 카노섬(Leuconostoc carnosum)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 대해 항균 활성이 있는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0099 [기탁번호 KCTC 13790BP].
- 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0098 [기탁번호 KCTC 13789BP] 또는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0099 [기탁번호 KCTC 13790BP]에 대해 내성을 갖는 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) WiKim0096 [기탁번호 KCTC 13788BP].
- 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0098 [기탁번호 KCTC 13789BP] 또는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0099 [기탁번호 KCTC 13790BP]에 대해 내성을 갖는 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) WiKim0101 [기탁번호 KCTC 13791BP].
- 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0098 [기탁번호 KCTC 13789BP] 및 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) WiKim0099 [기탁번호 KCTC 13790BP]로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상; 및
류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) WiKim0096 [기탁번호 KCTC 13788BP] 및 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) WiKim0101 [기탁번호 KCTC 13791BP]로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 혼합균주배양액을 종균으로 사용하여 김치를 제조하는 단계를 포함하고,
상기 혼합균주배양액은 하기 조건을 만족하는 식용배지에 혼합균주를 접종하여 28℃ 내지 35℃에서 15시간 내지 24 시간 동안 배양하여 얻은 것인, 김치 숙성도 제어방법:
(i) 탄소원: 락토오스, 글루코오스, 프룩토오스, 말토오스 및 수크로오스의 혼합물
(ii) 질소원: 카제인 펩톤(casein peptone), 소이펩톤(soypeptone) 및 효모추출물
(iii) 무기염류: 포타슘 시트레이트
(iv) 비타민: 아스코르브산
(v) pH: 5.5 내지 7.0
- 삭제
- 제5항에 있어서,
혼합균주배양액은 김치원부재료의 총 중량대비 5% 내지 10%로 혼합하는 것인, 김치 숙성도 제어방법.
- 제5항의 방법으로 제조되고, 종균이 없이 발효된 김치 대비 김치 숙성이 지연된 김치.
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