KR101836365B1 - 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32를 첨가한 김치 양념소 및 이를 이용한 김치의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 김치로부터 분리된 신규한 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32, 상기 균주를 포함하는 김치 양념소 및 이를 이용한 김치의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32은 프로바이오틱스로서 사람 또는 동물의 정장, 위장 질환, 면역강화 등의 용도를 위해 다양하게 활용될 수 있을 뿐만 아니라 만니톨 생성 유산균으로서 김치 양념소에 포함되어 위해 미생물 저감화, 품질 균일화 및 저장기간 연장 효과를 나타내는 김치 양념소를 제공할 수 있다. 나아가, 발효 식품의 스타터로서 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32를 첨가한 김치 양념소 및 이를 이용한 김치의 제조방법에 관한 것이다.
김치는 우리나라 전통적인 부식으로 주로 각 가정에서 직접 만들어 섭취해 왔으나 최근 들어 핵가족화, 맞벌이 부부 등이 증가하는 산업화된 사회에서는 김치를 가정에서 자주 만들어 먹기가 너무나 번잡해 소위 공장김치인 가공식품으로 유통되고 있는 김치의 소비가 날로 증가하는 추세에 있다. 그러나 완제품의 형태로 판매되는 김치는 비-멸균성 발효식품이므로 유통되는 과정에서 발효가 계속 진행되므로 유통과정에서 어려움이 있으며, 소비자의 기호에 따른(발효 정도) 김치 섭취기간이 짧다. 또한 집에서의 번거로운 배추세척, 절임, 양념소 만들기 과정 없이 버무리기만 하면 되는 DIY 세트 형태로 절임배추 및 김치 양념소가 상용화하여 판매되고 있다. DIY 제품으로 시판되고 있는 김치 양념소는 현재 두 가지 형태로, 하나는 건조상의 분말 양념소 제품은 변질의 우려가 적고 보관이 용이한 반면 신선도가 없고, 다른 하나는 액체상태의 김치 양념소로 저장에 따른 발효진행으로 유통기한이 3주 이내로 짧으며, 미생물 오염으로 인한 위해성 및 맛이 표준화되지 못한 실정이기 때문에 김치 양념소의 제조방법 및 저장성 개선을 위한 연구가 필요한 실정이다.
본 발명은 신규한 류코노스톡 속 유산균인 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32 균주를 제공하며, 상기 균주를 첨가함으로써 위해 미생물 저감화, 품질 균일화 및 김치 양념소의 저장기간 연장 효과를 나타내는 김치 양념소를 제공하고자 한다.
이에, 본 발명자들은 전통발효식품으로부터 프로바이오틱스로서 우수한 효과는 나타내는 유산균 균주를 찾고자 노력한 결과, 신규한 류코노스톡 속 유산균 균주인 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32(Leuconostoc mesenteroides WiKim32)를 분리, 동정하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에 따른 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32(Leuconostoc mesenteroides WiKim32)는 김치 유래의 류코노스톡 메센테로이드 신규 균주이다. 비록 본 발명에서의 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32를 김치에서 분리, 동정하기는 했으나, 이의 입수 경로가 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에의 실시예를 통해 분리된 전통발효식품으로부터 프로바이오틱스로서 우수한 효과를 나타내는 유산균 균주는 미생물의 동정 및 분류를 위한 16S rDNA 염기서열 분석 결과, SEQ ID NO: 1의 핵산서열을 갖는 것으로 나타났다.
따라서, SEQ ID NO: 1의 16S rDNA 염기서열을 갖는 본 발명의 미생물을 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32(Weissella confuse WiKim32) 로 명명하였으며, 미생물보존센터에 2015년 12월 16일자로 기탁하였다(기탁번호 KFCC11639P).
본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32는 그람양성균이고 호기적 조건과 혐기적 조건에서 모두 성장이 가능한 통성 혐기성(facultive anaerobe)이며, 포자를 형성하지 않고 운동성이 없으며 구균의 형태를 취하고 있다.
본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32는 김치 양념에 첨가되어 관능적 특성이 우수하면서도 위해 미생물이 저감되고 저장기간이 연장된 김치 양념소를 제공할 수 있다. 하기 실시예에서는, 상기 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32를 첨가한 김치 양념소의 pH, 산도 측정 및 관능검사를 통해 장기 저장성과 우수한 관능적 특성을 확인하였다. 이에, 본 발명은 김치 양념에 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32를 첨가하는 단계를 포함하는 김치 양념소의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 김치 양념은 김치 제조시 사용되는 통상적인 김치 양념을 의미하며, 통상적으로 첨가되는 김치 양념의 재료로, 통상적인 김치 양념의 제조방법에 의해 제조된 것을 의미한다.
상기 김치 양념소의 제조방법에서 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32는 김치 양념 1 중량부 당 106 내지 109 CFU/㎖로 첨가될 수 있으며, 예컨대 107 내지 108 CFU/㎖로 첨가될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 김치 양념소는 1 내지 10℃에서 1 내지 50일간 발효시키는 것일 수 있다. 본 발명의 김치 양념소는 상기 온도조건과 같이 저온에서 발효시켜 유산균 수를 증식시킴으로써, 유산균이 다량 함유된 김치 양념소를 제공할 수 있다.
한 구체예에서, 상기 김치 양념소는 동결건조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 단계는 동결건조를 위해 사용되는 통상적인 방법으로 김치 양념소를 동결건조시킬 수 있다. 김치 양념소를 동결건조시킴으로써, 액체 상태의 김치 양념소가 저장에 따라 진행되는 발효에 의해 유통기한이 짧은 문제점을 개선시킬 수 있으므로, 저장기간이 연장된 김치 양념소를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 김치 양념소를 제공한다.
본 발명은 상기 김치 양념소와 절임배추를 버무리는 단계를 포함하는 김치의 제조방법을 제공한다.
상기 김치의 제조방법에 있어서, 김치 양념소는 절임배추 100 중량부 대비 20 내지 30 중량부로 첨가될 수 있으며, 김치 양념소의 중량이 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 따라 제조된 김치를 제공한다.
상기 김치 양념소로 제조된 김치는 관능적 특성과 저장성이 우수하여, 일반 양념소로 제조된 김치에 비해 저장기간에 따라 산도가 완만하게 증가하므로, 저장성이 증가된 김치를 제공할 수 있다.
본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32는 프로바이오틱스로서 사용될 뿐만 아니라 만니톨 생성 유산균으로서 식품에서 생성된 만니톨은 시원한 단맛과 저칼로리의 당 소재로 사용되고 있다. 따라서 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32는 프로바이오틱스로서, 유산균의 일반적인 정장 효과 및 면역증강효과를 갖는다. 류코노스톡 속의 유산균이 정장효과 면역 증강 효과를 갖는다는 것은 잘 알려져 있는 사실이다.
본 발명에 있어서, '프로바이오틱스(probiotics)'는 사람을 포함한 동물의 위장관 내에서 숙주의 장내 미생물 환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물'이라는 의미로 이해된다. 프로바이오틱스는 프로바이오틱 활성을 갖는 살아있는 미생물로 단일 또는 복합균주 형태로 사람이나 동물에 건조된 세포 형태나 발효산물 형태로 급여될 경우, 숙주의 장내 균총에 유익한 영향을 미칠 수 있다.
이에, 본 발명의 한 구체예에서는 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32를 포함하는 프로바이오틱스 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물에 포함되는 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32는 생균체 또는 사균체로서 존재할 수 있으며, 또한 건조 또는 동결건조된 형태로 존재할 수도 있다. 다양한 조성물 내에 포함시키기 적합한 유산균의 형태 및 제제화 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 한 구체예에서는 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32를 포함하는 균주 또는 배양액 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 정장제 조성물은 사람을 포함한 동물의 위장 질환의 예방, 치료, 개선에 이용될 수 있으며, 바람직하게는 상기 동물은 소, 말, 돼지와 같은 가축을 포함한다. 상기 '위장 질환'으로는 위장 위해 세균감염 및 염증성 장 질환을 모두 포함하며, 예를 들어 병원성 미생물(대장균, 살모넬라, 클로스트리디움 등)에 의한 감염성 설사, 위장염증, 염증성 장 질환, 신경성 장염 증후군, 소장 미생물 과성장증, 장 급이성 설사 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 정장제 조성물은 경구로 투여하는 것이 바람직하다. 투여량은 위장 질환의 종류, 질환의 정도, 연령, 성별, 인종, 치료 또는 예방 목적 등에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 성인을 기준으로 하루에 1천만 마리에서 1000억마리를 투여할 수 있다.
본 발명은 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32를 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공한다. 류코노스톡 속의 유산균이 정장효과 면역 증강 효과를 갖는다는 것은 잘 알려져 있는 사실이다.
본 발명은 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32를 포함하는 발효용 유산균 스타터를 제공한다.
본 발명에 따른 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32는 이러한 유리한 작용으로 인해 의약, 건강기능식품, 식품, 사료, 또는 사료 첨가제 조성물 내에 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 활용될 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연당, 옥수수감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐아세테이트, 소듐 클로라이드등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
나아가 해당 분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명은 또한 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 발효유 등의 음료류, 비타민복합제, 건강보조식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아추출물 (예를 들어 레바우디오시드A, 글리시르히진 등]) 및 합성향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종식물추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
상기 본 발명에 따른 조성물은 사료첨가제 또는 사료로서 이용될 수 있다.
사료 첨가제로서 이용될 경우, 상기 조성물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립 형태로 제조될 수 있다. 상기 사료첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산등의 유기산이나 인산 나트륨, 인산 칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 사료로서 이용될 경우, 상기 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화 될 수 있으며, 통상의 사료성분을 함께 포함할 수 있다.
상기 사료첨가제 및 사료는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제 등을 더 포함할 수 있다.
상기 사료첨가제는 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료첨가제는 탑드레싱으로서 또는 이들을 동물사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 사료첨가제를 동물사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수전분, 락토오스, 수크로오스, 콩플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 사료첨가제는 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 사료첨가제는 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.
상기 사료는 동물의 식이욕구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기곡분을 포함할 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩곡분, 또는 옥수수/콩곡분믹스로 주로 구성되어 있다.
또한, 상기 사료첨가제 및 사료는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액촉진제 등을 함유할 수 있다. 상기 사료첨가제는 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.
본 발명의 사료 또는 사료첨가제는 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물식이에 적용할 수 있다.
상기 포유류로서 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치동물, 및 실험용 설치동물뿐만 아니라, 애완동물(예: 개, 고양이) 등에게 사용할 수 있으며, 상기 가금류로서 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및 메추라기 등에도 사용할 수 있고, 상기 어류로서 송어 등에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명에 따른 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32는 프로바이오틱스로서 사람 또는 동물의 정장, 위장 질환, 면역강화 등의 용도를 위해 다양하게 활용될 수 있을 뿐만 아니라 만니톨 생성 유산균으로서 김치 양념소에 포함되어 위해 미생물 저감화, 품질 균일화 및 저장기간 연장 효과를 나타내는 김치 양념소를 제공할 수 있다. 나아가, 발효 식품의 스타터로서 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 저장 0일째 김치 양념소의 pH 및 산도를 측정한 것이다.
도 2는 저장 10일째 김치 양념소 및 이를 동결건조시킨 김치 양념소의 pH 및 산도를 측정한 것이다.
도 3은 저장 25일째 김치 양념소 및 이를 동결건조시킨 김치 양념소의 pH 및 산도를 측정한 것이다.
도 4는 저장 40일째 김치 양념소 및 이를 동결건조시킨 김치 양념소의 pH 및 산도를 측정한 것이다.
도 2는 저장 10일째 김치 양념소 및 이를 동결건조시킨 김치 양념소의 pH 및 산도를 측정한 것이다.
도 3은 저장 25일째 김치 양념소 및 이를 동결건조시킨 김치 양념소의 pH 및 산도를 측정한 것이다.
도 4는 저장 40일째 김치 양념소 및 이를 동결건조시킨 김치 양념소의 pH 및 산도를 측정한 것이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32의 동정
김치 추출물의 원액을 MRS 배지에 도말하여 얻은 균단일집락을 루프로 수거하여 MRS broth에 배양하였다. DNA추출은 QIAamp DNA Mini Kit (QIAgen, Germany)를 사용하여 추출하였다. 추출된 DNA는 1% 아가로스 겔을 이용하여 확인하였으며, 16S rRNA gene을 증폭하기 위하여 추출된 genomic DNA를 주형으로 하여 PCR을 진행하였고, PCR 조건은 denaturation 95℃ 1분, annealing 45℃ 1 분, extension 72℃ 1 분 30초로 30 사이클을 수행하였다. 얻어진 PCR 산물은 마크로젠(Seoul, Korea)에 의뢰하여 서열을 분석하였다. 세균의 동정은 16SrRNA 서열을 National Center for Biotechnology Information(NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 검색엔진과 EzTaxon 서버로 유사도 분석을 통해 수행하였다.
본 발명의 실시예를 통해 분리된 균주는 미생물의 동정을 위한 16S rDNA 염기서열 분석 결과, SEQ ID NO: 1의 핵산서열을 갖는 것으로 나타났다.
이에, 본 발명의 미생물을 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32(Leuconostoc mesenteroides WiKim32)로 명명하였으며, 한국미생물보존센터에 2015년 12월 16일자로 기탁하였다(기탁번호 KFCC11639P).
제조예 1: 절임배추 및 김치 양념소의 제조
절임배추는 원료배추를 잘 다듬어 2절 또는 4절하여 16%(w/v)의 천일염(전남 신안산) 용액에서 15℃ 이하에서 7 내지 8시간 침지하여 흐르는 물에 세척한 후, 채반에 건져 5시간 이상 자연 탈수하였다. 절임배추와 김치 양념소의 배합비율이 절임배추 100g에 대해 양념소 25g이 되도록 김치 양념소를 제조하였으며, 김치양념소는 하기 표 1의 조성에 따라 제조하였다.
| 성분 | 함량(g) |
| 고춧가루 | 3.75 |
| 무 | 3.75 |
| 마늘 | 3.13 |
| 생강 | 1 |
| 파 | 3.13 |
| 액젓 | 3.75 |
| 찹쌀풀 | 1 |
| 설탕 | 1 |
| 물(육수) | 4.5 |
| 총합 | 25.01 |
실시예 2: 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32를 첨가한 김치 양념소의 제조
본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32 균주를 김치 양념소 1 중량부 당 107 CFU/㎖의 농도가 되도록 김치 양념소에 첨가하였다. WiKim32 균주를 첨가한 김치 양념소는 500㎖ 용기에 담아 6℃에서 10일, 15일, 25일 및 40일간 발효시켰다.
실시예 3: 동결건조 김치 양념소의 제조
상기 실시예 2에서 제조한 김치 양념소는 -70℃의 냉동고에서 1일간 냉동시킨 후, 응축기 온도 -70℃, 압력 30 mmTorr 조건 하에서 1주일간 동결건조하여 동결건조 김치 양념소를 제조하였다. 대조구로는 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32 균주를 첨가하지 않은 김치 양념소를 동일한 조건에서 발효시킨 후 동결건조하여 준비하였다.
실시예 4: 김치의 제조
1) WiKim32 첨가 김치 양념소를 이용한 김치의 제조
김치 제조시 절임배추 800g에 대하여 김치 양념소는 200g이 되도록 절임배추에 상기 실시예 2의 김치 양념소를 첨가하여 김치를 제조하였다.
2) 동결건조된 김치 양념소를 이용한 김치의 제조
김치 양념소로 동결건조된 김치 양념소와 살균수를 첨가한 것을 제외하고는 상기 1)과 동일한 방법으로 김치를 제조하였다. 동결건조된 김치 양념소는 20 내지 25℃의 살균수를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 수분을 흡수시킨 후, 김치 제조용 양념소로 사용하였다. 이때, 상기 살균수는 동결건조된 김치 양념소를 배추에 버무리기 위해 복원시키고자 첨가한 것으로, 동결건조 전의 김치 양념소의 중량과 동결건조 후의 건조 양념소의 중량의 차이만큼 첨가하였다. 상기 방법에 따라 제조된 김치는 6℃에서 저장하여 발효 특성을 분석하였다.
실험예 1: 김치의 pH 및 산도 변화 측정
상기 실시예 4의 1) 및 2)에서 제조된 김치는 마쇄한 후 여과하여, 발효시간 경과(0일, 10일, 25일, 40일)에 따른 pH 및 산도를 측정하여 도 1 내지 4에 나타내었다. pH는 pH meter(Corning Co., Medel Pinnacle 545, USA)로 측정하였으며, 산도는 여액 10㎖를 0.1N의 NaOH 용액으로 pH가 8.3이 될 때까지의 NaOH 소비량을 젖산 함량으로 정의하고, 아래 일반식 1을 통해 젖산 함량으로 환산하여 총산 함량(%)으로 표시하였다. 이때 대조구로는 김치 양념소를 제조한 후 이를 바로 절임배추와 버무린 김치(종균 비첨가 김치)를 사용하였다.
[일반식 1]
1) 대조구 김치
일반 김치 양념소로 제조한 김치(대조구)와 WiKim32가 첨가된 김치 양념소로 제조한 김치를 6℃에서 저장하면서 pH 및 산도를 측정한 결과, 대조구 김치는 저장 0일에 산도 0.2%, 10일에 산도 0.46%와 저장 40일에 산도 1.14%를 나타내었고, WiKim32 첨가 김치는 저장 10일에 0.69%, 저장 40일에 0.95%를 나타내어 대조구 김치에 비해 발효 초기 산도는 증가하나 발효 후기 산도는 낮은 것을 확인하였다.
2) 6℃, 10일간 저장 또는 저장 후 동결건조한 김치 양념소로 제조한 김치
6℃에서 10일 저장한 김치 양념소로 제조한 김치의 경우, 대조구 김치는 저장 0일에 0.2%에서 저장 10일에 산도 0.31%, 저장 40일에 0.92%로 증가하였고, WiKim32 첨가 김치의 경우 저장 0일에 0.39%에서 저장 10일에 산도 0.42%, 저장 40일에는 산도 0.89%를 나타내었다.
6℃에서 10일 저장 후 동결건조한 김치 양념소로 제조한 김치의 경우, 대조구 김치는 저장 0일에 0.2%에서 저장 10일에 산도 0.33%, 저장 40일에 0.62%로 증가하였고, WiKim32 첨가 김치의 경우 저장 0일에 0.41%에서 저장 10일에 산도 0.562%, 저장 40일에는 산도 0.75%를 나타내었다.
상기 결과를 통해, 6℃에서 10일간 저장만 한 김치 양념소보다는 10일간 저장 후 동결건조한 김치 양념소로 제조한 김치의 산도 증가가 완만한 것으로 나타났으며, 균주를 첨가하지 않은 김치보다 WiKim32를 첨가한 김치 양념소로 제조한 김치의 산도 증가가 완만하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
3) 6℃, 25일간 저장 또는 저장 후 동결건조한 김치 양념소로 제조한 김치
6℃에서 25일간 저장한 김치 양념소로 제조한 김치의 경우, 대조구 김치는 저장 0일에 0.29%에서 저장 10일에 산도 0.43%, 저장 40일에 0.98%로 증가하였고, WiKim32 첨가 김치의 경우 저장 0일에 0.44%에서 저장 10일에 산도 0.73%, 저장 40일에는 산도 0.92%를 나타내었다.
6℃에서 25일간 저장 후 동결건조한 김치 양념소로 제조한 김치의 경우, 대조구 김치는 저장 0일에 0.2%에서 저장 10일에 산도 0.31%, 저장 40일에 1.19%로 증가하였고, WiKim32 첨가 김치의 경우 저장 0일에 0.48%에서 저장 10일에 산도 0.65%, 저장 40일에는 산도 1.15%를 나타내었다.
상기 결과를 통해, 6℃에서 10일간 저장한 김치 양념소로 제조한 김치보다는 25일간 저장한 김치 양념소로 제조한 김치의 초기 발효속도가 빠르게 진행되었으며, 저장 후 동결건조한 김치 양념소로 제조한 김치가 저장만 한 김치 양념소보다 산도 증가가 완만하였다. 균주를 첨가하지 않는 김치보다 WiKim32을 첨가한 김치 양념소로 제조한 김치의 산도 증가가 완만하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
4) 6℃, 40일간 저장 또는 저장 후 동결건조한 김치 양념소로 제조한 김치
6℃에서 40일간 저장한 김치 양념소로 제조한 김치의 경우, 대조구 김치는 저장 0일에 0.35%에서 저장 10일에 산도 0.65%, 저장 40일에 1.17%로 증가하였고, WiKim32 첨가 김치의 경우 저장 0일에 0.55%에서 저장 10일에 산도 0.82%, 저장 40일에는 산도 1.12%를 나타내었다.
6℃에서 40일간 저장 후 동결건조한 김치 양념소로 제조한 김치의 경우, 대조구 김치는 저장 0일에 0.47%에서 저장 10일에 산도 0.72%, 저장 40일에 1.24%로 증가하였고, WiKim32 첨가 김치의 경우 저장 0일에 0.42%에서 저장 10일에 산도 0.88%, 저장 40일에는 산도 1.15%를 나타내었다.
6℃에서 10일간, 25일간 저장한 김치 양념소로 제조한 김치보다는 40일간 저장한 김치 양념소로 제조한 김치의 초기 발효속도가 가장 빠르게 진행되었으며, 저장 후 동결건조한 김치 양념소로 제조한 김치가 저장만 한 김치 양념소보다 산도 증가가 완만하였다. 이를 통해, 균주를 첨가하지 않은 김치보다 WiKim32를 첨가한 김치 양념소로 제조한 김치의 산도 증가가 완만하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2: 김치의 관능평가
상기 실시예 4의 1) 및 2)에서 제조한 김치에 대해 10명을 대상으로 김치의 외관, 향, 맛, 조직감 및 전반적인 기호도를 아주 나쁘다(1점)-보통이다(5점)-아주 좋다(9점)의 9점 척도법으로 평가하였다. 관능평가용 김치는 유산균을 첨가하지 않은 김치 양념소와 WiKim32 균주가 첨가된 김치 양념소로 제조한 김치를 6℃에서 저장한 것을 사용하였다. 대조구 김치와 WiKim32를 첨가하여 저장 또는 저장 후 동결건조한 김치 양념소로 제조한 김치의 관능성을 비교하여 아래 표 2에 나타내었다.
| 김치 시료 | 저장기간 | 관능적 특징 | ||||
|
전체적인
기호도 |
맛 | 향기 | 색깔 | 윤기 | ||
| 유산균 비첨가 김치 | 저장 0일 | 5.78±0.667 | 5.75±0.667 | 5.33±0.707 | 5.22±0.621 | 5.22±0.325 |
| 저장 10일 | 5.89±0.601 | 5.89±0.601 | 5.78±0.667 | 5.78±0.441 | 5.56±0.527 | |
| 저장 25일 | 6.22±0.667 | 6.33±0.500 | 6.33±0.500 | 6.22±0.667 | 6.00±0.707 | |
| 저장 40일 | 5.44±0.527 | 5.44±0.527 | 5.56±0.527 | 5.22±0.667 | 5.00±0.707 | |
| 저장 10일 후 동결건조 | 5.33±0.500 | 5.33±0.500 | 5.22±0.441 | 5.56±0.527 | 5.56±0.527 | |
| 저장 25일 후 동결건조 | 4.89±0.601 | 4.89±0.601 | 4.56±0.527 | 4.78±0.667 | 4.89±0.601 | |
| 저장 40일 후 동결건조 | 4.11±0.601 | 4.11±0.601 | 3.67±0.866 | 3.89±0.782 | 4.00±0.500 | |
| WiKim32 첨가 김치 | 저장 0일 | 7.11±0.782 | 7.22±0.833 | 6.78±0.667 | 6.67±0.500 | 6.78±0.441 |
| 저장 10일 | 7.00±0.707 | 7.00±0.707 | 6.67±0.707 | 7.11±0.782 | 6.78±0.441 | |
| 저장 25일 | 6.78±0.972 | 6.78±0.972 | 6.67±0.866 | 6.78±0.972 | 6.78±0.972 | |
| 저장 40일 | 5.78±0.972 | 5.78±0.972 | 5.56±1.014 | 5.67±1.000 | 5.33±0.866 | |
| 저장 10일 후 동결건조 | 6.78±0.667 | 6.78±0.667 | 6.67±0.707 | 6.56±0.726 | 6.22±0.667 | |
| 저장 25일 후 동결건조 | 5.78±0.667 | 5.78±0.667 | 6.11±0.601 | 5.89±0.601 | 5.78±0.667 | |
| 저장 40일 후 동결건조 | 5.33±0.707 | 5.33±0.707 | 5.33±0.707 | 5.33±0.707 | 5.33±0.707 | |
전반적인 기호도(overall acceptability)는 저장 0일의 김치 양념소로 제조한 김치가 가장 높은 점수를 받았으며, 그 중에서도 유산균 비첨가 김치보다(5.78점)는 WiKim32 첨가 김치(7.11점)가 높게 평가되었다. 저장 또는 저장 후 동결건조한 김치 양념소로 제조한 김치는 양념소의 저장기간이 오래될수록 전체적인 기호도가 낮아졌으며, 저장 후 동결건조된 김치 양념소보다는 저장만 한 김치양념소로 제조한 김치가 전체적인 기호도가 높은 것으로 나타났고, 유산균 비첨가 김치보다는 WiKim32 균주를 첨가한 김치의 기호도가 높게 평가되었다.
WiKim32를 김치 양념소에 첨가하여 6℃에서 10일 또는 25일간 저장한 후 제조한 김치(기호도 6.78 내지 7.00점)와 6℃에서 10일간 저장 후 동결건조한 김치 양념소로 제조한 김치(기호도 6.78점)는 유산균을 첨가하지 않는 저장 0일의 김치 양념소로 제조한 김치의 기호도(5.78점)보다 우수한 것으로 나타났다.
실험예 3: 식품 적용을 위한 안전성 평가
식품 제조 및 발효에 미생물을 식품원료 또는 첨가물로 적용하기 위해서는 안정성이 확보되어야 하며, 이에 안정성 실험으로 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32 균주에 대한 용혈성과 항생제 내성을 확인하였다.
1) 용혈성 독성 확인
상기 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32 균주가 식품에 원료 또는 첨가물로 활용되기 위해서는 인체에 대한 용혈성 독성이 없는 안전성이 요구된다. 이에, 상기 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32 균주가 적혈구의 파괴 또는 분해를 유도할 수 있는지 여부와 관련하여, 용혈성 여부를 검사하였다.
상기 용혈성 확인은 7% horse blood (Oxoid, England)가 첨가된 blood 고체배지에 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32 균주를 도말하여(streaking) 30℃에서 48시간 배양한 후, 균체 주위에 투명환의 생성 여부로 용혈성을 판단하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 보는 것과 같이, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32 균주는 용혈성 검사에서 균체 주위에 적혈구가 파괴되어 생기는 투명환이 전혀 생성하지 않아 용혈 반응을 유도하지 않는 것으로 확인되었다. 이를 통해 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32 균주는 용혈성과 같은 인체에 유해작용이 없어 식품에 안전하게 적용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
2) 항생제 내성 확인
항생제 내성을 지닌 균주는 항생제 저항성 유전자(horizontal transfer)를 플라즈미드에 보유하는 경우가 있고, 이럴 경우 항생제 저항성 유전자의 수평이동이 가능하다. 즉, 항생제 저항성을 가지는 유전자를 보유한 균주를 식품발효의 종균이나 생균활성제, 프로바이오틱스로 사용시 항생제 저항성 유전자가 인간에게 이동되거나, 또는 저항성 유전자가 숙주내의 병원성균에게 전달되어 숙주의 건강에 해로운 영향을 미치게 된다는 보고에 따라, 최근에는 GRAS 등급의 유산균이라 하더라도 신규 개발 균주의 경우 항생제 내성 특성 조사가 요구되고 있다. 이에, 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32 균주에 대해 항생제 종류별로 MIC(minimum inhibitory concentration)를 측정하여 항생제 내성을 조사하였다(표 3). 항생제 내성 기준은 EFSA(European Food Safety Authority)의 breakpoint를 기준으로 여러 항생제에 대한 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32 균주의 감수성 또는 내성을 판정하였다.
| 항생제 | MIC ( μg /mL) | |
| Breakpoint | WiKim32 | |
| 앰피실린(Ampicillin) | 2 | 0.5 |
| 반코마이신(Vancomycin) | n.r. | >512 |
| 젠타마이신(Gentamycin) | 16 | 2 |
| 카나마이신(Kanamycin) | 16 | 16 |
| 스트렙토마이신(Streptomycin) | 64 | 32 |
| 에리스로마이신(Erythromycin) | 1 | 0.06 |
| 클린다마이신(Clindamycin) | 1 | 0.15 |
| 테트라사이클린(Tetracyclin) | 8 | 1 |
| 클로람페니콜(Chloramphenicol) | 4 | 4 |
항생제에 대한 감수성 또는 내성을 EFSA에서 제시한 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32 균주에 대한 breakpoint를 기준으로 판정한 결과, 상기 표 2와 같이 항생제 9종에 대하여 감수성을 나타내는 농도는 서로 다르게 나타났으나 EFSA breakpoint보다 낮거나 또는 같은 농도에서 감수성을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 숙주의 건강에 위험을 나타내지 않는 기준의 항생제에 대해 저항성을 나타내어 숙주 내 항생제 내성이 없다고 판단함으로써 WiKim32 균주의 안전성을 확인하였다.
실험예 4: 김치 내 우점율 확인
본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32 균주를 양념소에 첨가하여 제조한 김치의 저장기간에 따른 김치내 WiKim32 균주의 존재 여부(우점율)를 NGS분석법으로 pyrosequencing(파이로시퀀싱)을 시행하여 확인하였다. 김치는 핸드블렌더로 마쇄하여 김치여액 1mL을 취하고 원심분리(13,000×g, 10 min)하여 얻은 균체를 멸균된 생리식염수로 2회 세척한 후, DNA Prep kit(Quiagen, Valecia, CA, USA)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를 (주)마크로젠에 의뢰하여 454 GS FLX Titanium Sequencing System(Roche, Germany)을 이용하여 파이로시퀀싱을 수행하였다.
파이로시퀀싱 결과는 RDP(version 11)과 이용하여 분석하였다. 파이로시퀀싱 데이터는 예비 여과과정을 통해 서열의 길이가 짧거나 프라이머의 불일치가 있는 서열을 제거한 후, 프라이머의 바코드 서열을 이용하여 시료별로 분류하였다. 그다음, RDP pipeline의 chemera check 기능을 이용하여 키메라 서열을 제거하고, classifier 결과를 통해 진핵생물, 고세균, 식물 유래 16S rRNA gene sequence(클로로플라스트, 미토콘드리아) 염기서열들을 각 샘플별로 제거하였다. 정리된 서열들은 속(genus) level로 분류하여 그래프로 나타내었다(도 6).
파이로시퀀싱을 수행한 결과(도 6), 저장기간이 경과함에 따라 종균을 첨가하지 않은 양념소로 제조한 김치는 저장 14일과 저장 28일에 류코노스톡(Leuconostoc) 속과 바이셀라(Weissella) 속이 주요 발효균으로 나타난 반면, WiKim32 균주를 양념소에 첨가하여 제조한 김치는 저장 14일뿐만 아니라 저장 28일에도 종균으로 사용한 류코노스톡(Leuconostoc) 속이 우점으로 존재함을 확인할 수 있었다. 이를 통해 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32 균주를 종균으로 사용시 김치의 저장기간에 따른 미생물 천이변화를 줄임으로써 김치의 품질균일화에 대한 우수한 효과를 얻을 수 있음을 확인하였다.
<110> Korea Food Research Institute
<120> Kimchi seasoning containing Leuconostoc mesenteroides WiKim32 and
kimchi prepared by using the same
<130> P15R10C1615
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1503
<212> DNA
<213> Leuconostoc mesenteroides WiKim32
<400> 1
gctcaggatg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgaacgcac agcgaaaggt 60
gcttgcacct ttcaagtgag tggcgaacgg gtgagtaaca cgtggacaac ctgcctcaag 120
gctggggata acatttggaa acagatgcta ataccgaata aaacttagtg tcgcatgaca 180
caaagttaaa aggcgcttcg gcgtcaccta gagatggatc cgcggtgcat tagttagttg 240
gtggggtaaa ggcctaccaa gacaatgatg catagccgag ttgagagact gatcggccac 300
attgggactg agacacggcc caaactccta cgggaggctg cagtagggaa tcttccacaa 360
tgggcgaaag cctgatggag caacgccgcg tgtgtgatga aggctttcgg gtcgtaaagc 420
actgttgtat gggaagaaca gctagaatag gaaatgattt tagtttgacg gtaccatacc 480
agaaagggac ggctaaatac gtgccagcag ccgcggtaat acgtatgtcc cgagcgttat 540
ccggatttat tgggcgtaaa gcgagcgcag acggtttatt aagtctgatg tgaaagcccg 600
gagctcaact ccggaatggc attggaaact ggttaacttg agtgcagtag aggtaagtgg 660
aactccatgt gtagcggtgg aatgcgtaga tatatggaag aacaccagtg gcgaaggcgg 720
cttactggac tgcaactgac gttgaggctc gaaagtgtgg gtagcaaaca ggattagata 780
ccctggtagt ccacaccgta aacgatgaac actaggtgtt aggaggtttc cgcctcttag 840
tgccgaagct aacgcattaa gtgttccgcc tggggagtac gaccgcaagg ttgaaactca 900
aaggaattga cggggacccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg 960
aagaacctta ccaggtcttg acatcctttg aagcttttag agatagaagt gttctcttcg 1020
gagacaaagt gacaggtggt gcatggtcgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1080
agtcccgcaa cgagcgcaac ccttattgtt agttgccagc attcagatgg gcactctagc 1140
gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggc ggggacgacg tcagatcatc atgcccctta 1200
tgacctgggc tacacacgtg ctacaatggc gtatacaacg agttgccaac ccgcgagggt 1260
gagctaatct cttaaagtac gtctcagttc ggattgtagt ctgcaactcg actacatgaa 1320
gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagca cgccgcggtg aatacgttcc cgggtcttgt 1380
acacaccgcc cgtcacacca tgggagtttg taatgcccaa agccggtggc ctaacctttt 1440
aggaaggagc cgtctaaggc aggacagatg actggggtga agtcgtacgg ggggcccccc 1500
aaa 1503
Claims (13)
- 기탁번호 KFCC11639P의 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32{Leuconostoc mesenteroides WiKim32}.
- 김치 양념에 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32(Leuconostoc mesenteroides WiKim32; KFCC11639P)를 첨가하는 단계를 포함하는 김치 양념소의 제조방법.
- 제2항에 있어서,
류코노스톡 메센테로이드 WiKim32는 김치 양념 1 중량부 당 106 내지 109 CFU/㎖로 첨가되는 것인 김치 양념소의 제조방법. - 제2항에 있어서,
김치 양념소는 1 내지 10℃에서 1 내지 50일간 발효시키는 단계를 추가로 포함하는 김치 양념소의 제조방법. - 제2항에 있어서,
김치 양념소를 동결건조하는 단계를 추가로 포함하는 김치 양념소의 제조방법. - 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따라 제조된 김치 양념소.
- 제6항에 따른 김치 양념소와 절임배추를 포함하는 김치.
- 제7항에 있어서,
김치 양념소는 절임배추 100 중량부 대비 20 내지 30 중량부로 포함되는 것인 김치. - 삭제
- 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32(Leuconostoc mesenteroides WiKim32; KFCC11639P) 또는 이의 배양물을 포함하는 면역증강용 조성물.
- 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32(Leuconostoc mesenteroides WiKim32; KFCC11639P) 또는 이의 배양물을 포함하는 정장제 조성물.
- 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32(Leuconostoc mesenteroides WiKim32; KFCC11639P) 또는 이의 배양물을 포함하는 발효용 유산균 스타터.
- 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32(Leuconostoc mesenteroides WiKim32; KFCC11639P) 또는 이의 배양물을 포함하는 사료 또는 사료첨가제 조성물.
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