KR100536108B1 - 김치에서 분리한 내산성 류코노스톡 메센테로이드 및 이를 이용한 맛있는 김치의 제조 방법 - Google Patents

김치에서 분리한 내산성 류코노스톡 메센테로이드 및 이를 이용한 맛있는 김치의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 저온에서 최적으로 숙성시켜 가장 맛이 좋은 김치에서 분리한 내산성 류코노스톡 메센테로이드 균주, 그리고 상기 균주와 혈압강하 및 긴장완화 기능을 갖는 가바를 첨가하여 맛과 기능성이 향상된 김치의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 제조된 김치는 일반적인 유산균 균주를 첨가하여 제조된 김치와 비교할 때 맛에 있어 우수할 뿐만 아니라, 기능성도 우수하다는 효과를 갖고 있다.

Description

김치에서 분리한 내산성 류코노스톡 메센테로이드 및 이를 이용한 맛있는 김치의 제조 방법{Acid tolerant Leuconostoc mesenteroides isolated from Kimchi and method for producing a tasty Kimchi using the same}
본 발명은 김치에서 분리한 내산성 류코노스톡 메센테로이드 균주 및 이를 이용한 김치의 제조방법에 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 저온에서 최적으로 숙성시켜 가장 맛이 좋은 김치에서 분리한 내산성 류코노스톡 메센테로이드 균주, 그리고 상기 균주와 혈압강하 및 긴장완화 기능을 갖는 가바를 첨가하여 맛과 기능성이 향상된 김치의 제조방법에 관한 것이다.
김치는 주원료인 절임 배추에 고춧가루, 마늘, 생강, 파 및 무 등을 혼합한 후, 제품의 보존성과 숙성도를 확보하기 위하여 저온에서 발효시킨 식품으로서, 우리나라 고유의 대표적인 전통발효식품이다. 1990년대까지만 해도 김치는 주로 가정에서 자체적으로 생산이 되어온 식품이었으나, 급속한 경제성장과 국민 소득의 증가, 산업구조 및 생활환경의 변화에 의하여 1990년대 이후 본격적으로 상품화되기 시작하였다. 최근에는 상품김치에 대한 인식의 개선과 함께 국내 수요량과 수출량이 꾸준히 증가하고 있는 추세에 있다. 그러나, 상품화되고 있는 김치의 경우 김치의 발효를 주도하고 김치 특유의 맛을 내는 자연발생적 균주들이 원재료의 산지, 계절, 발효 조건에 따라 달라지게 되어 상품김치의 품질이나 맛을 원하는 상태로 일정하게 유지하기가 대단히 어려웠다. 또한, 대부분 숙성된 상태에서 판매가 되기 때문에 맛이 쉽게 변질되는 문제점이 있었다. 따라서, 품질과 맛이 일정하면서도 우수한 상품김치에 대한 개발이 요구되고 있는 실정이다.
한편, 겨울철 김장김치의 시원하고 깊은 맛을 내는 주된 요인은 김치를 저온에서 숙성 시켰을 때 유산균 중 이상젖산발효균(heterofermentative lactic acid bacteria)인 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 균주가 증가하기 때문이다(So M.H. and Kim Y.B., Korean J. Food Sci. Technol., 27(4):495-505, 1995; So M.H. and Kim Y.B., Korean J. Food Sci. Technol., 27(4):506-515, 1995). 이 류코노스톡 메센테로이드 균주는 김치 제조시 초기부터 생육을 시작하여 이산화탄소, 젖산, 초산, 에탄올 및 기타 휘발성 대사 산물을 생산하여 김치를 복합적이며 독특한 풍미를 지닌 상태로 발효시킨다. 또한, 생산된 이산화탄소로 하여금 김치내부를 혐기적 조건으로 유지시켜 호기성 세균의 번식을 강력히 억제시킴으로써 정상적인 김치발효가 되게 한다. 김치의 발효중기에 이르면 이 류코노스톡 메센테로이드 균주의 수가 급격히 감소되며 정상젖산발효균(homofermentative lactic acid bacteria)인 락토바실러스 플란타리움(Lactobacillus plantarium) 균주가 왕성히 증식하게 된다. 락토바실러스 플란타리움 균주는 김치의 신맛을 내는 주된 균이며 산패에 관여한다고도 알려져 있다. 이 락토바실러스 플란타리움 균주는 젖산을 다량으로 생성하고 pH 3.0의 산성 환경에서도 생육이 가능하다. 따라서, 김치의 발효 말기부터는 상대적으로 산에 약한 균주인 류코노스톡 메센테로이드 균주의 생육은 감소되면서 신맛의 원인균인 락토바실러스 플란타리움 균주의 생육이 증가되고 이에 따라 김치의 시원하고 깊은 맛이 사라지게 된다.
따라서, 김치내 류코노스톡 메센테로이드 균주의 생육을 유지시키면서 김치의 신맛을 내는 주된 원인균인 락토바실러스 플란타리움 균주의 생육을 억제하여 김장김치의 깔끔한 맛을 재현하는 것이 품질과 맛이 좋은 김치를 생산할 수 있는 주요 관건이라 할 수 있다.
최근에는 김치에서 유래되는 유산균을 분리한 후, 김치 제조시 스타터(starter)로 첨가함으로써 김치의 맛과 발효를 조절하려는 연구들이 많이 진행되고 있다. 즉, 대한민국특허 제 1989-4894호에는 차아염소산나트륨과 류코노스톡 메센테로이드 균주를 첨가하여 산패가 억제되고 보존성이 연장된 김치를 제조하는 방법이 개시된 바 있고, 대한민국특허 제 0181009호에는 류코노스톡 파라메센테로이드와 류코노스톡 메센테로이드 균주를 혼합 첨가함으로써 맛이 좋을 뿐만 아니라 락토바실러스 속 균주의 생육을 억제하여 산패가 지연되도록 한 김치의 제조방법이 개시된 바 있는 등 류코노스톡 메센테로이드를 이용하여 김치의 품질을 향상시키려는 연구가 진행되었다. 그러나, 류코노스톡 파라메센테로이드와 류코노스톡 메센테로이드의 혼합균주를 사용하는 경우 락토바실러스 플란타리움 균주의 생육은 억제되었으나 혼합배양의 경우 각각의 균주를 분리 배양하여 첨가해야 하는 등 기술적 적용성과 편리성이 저하된다는 문제점이 있다. 또한, 류코노스톡 메센테로이드 균주는 내산성이 약하기 때문에 단독 첨가시 김치의 발효가 점차 진행되면서 균주의 수가 감소되고, 상대적으로 산에 강한 균주인 락토바실러스 플란타리움 균주의 생육은 억제되지 않아 김치의 신선한 맛을 지속적으로 유지시킬 수 없다는 문제점이 있었다.
따라서, 이러한 문제점들을 극복하기 위하여 대한민국특허 제 1996-1940호에서는 류코노스톡 속 균주의 내산성을 향상시키기 위하여 류코노스톡 속 균주를 자외선 처리하여 내산성 변이균주를 제조하였고, 이를 김치 제조시 스타터로 첨가한 결과 김치의 관능성을 향상시키고 김치의 산패를 지연시켰다. 그러나, 이러한 내산성 변이균주를 첨가하여 제조한 김치는 맛이 좋고 산패가 지연되기는 하였으나 김치의 신맛을 내는 주원인균이면서 강력한 내산성 균주인 락토바실러스 플란타리움의 생육이 억제됨을 보이지는 못했다.
한편, 가바(GABA; γ-aminobutyric acid)는 포유류의 뇌속에 존재하는 아미노산으로서 글루타메이트 디카르복실라아제(Glutamate decarboxylase)에 의해 글루타메이트로부터 생성되는 신경전달물질이다. 특히, 혈관의 운동을 활성화시켜 혈압을 저하시키고(Kayahara H. and Sgiura D., Food & Development., 36(6):4-6, 2001), 뇌기능 개선작용을 하여 정신안정 및 학습능력을 증가시킨다고 알려져 있다(Ishikawa K. and Saito S., Psychopharmacology, 56:127-131, 1978; Akaga T., Food & development, 36(6):7-9, 2001). 김치의 맛뿐만 아니라 기능성을 향상시키기 위한 일환으로 이러한 가바가 다량 함유된 김치가 개발된 바 있으나(대한민국 특허출원 제 2001-14638호) 대두단백질이나 두류 등을 첨가하여 간접적으로 가바가 김치 내에서 생산되게 하였기 때문에, 대두나 두류 등에 의해 김치 고유의 맛이 없어질 수도 있다는 문제점이 있었다.
김치의 기능적인 측면을 향상시키려는 연구가 활발해 지면서 장내균총 개선 효과 있는 키토산을 첨가한 김치, 수삼의 약리효과를 이용한 수삼김치 등과 같이 다양한 형태의 기능성 김치에 대한 연구가 진행되고 있다. 그러나, 상기 연구들에서 사용된 첨가물들의 경우 그 기능성들이 입증은 되었으나 유효농도로 첨가할 경우 김치의 풍미에 영향을 주기 때문에 실용화되지는 못하고 있는 실정이다.
본 발명자들은 연중 김치의 시원하고 깔끔한 맛을 유지하면서도 기능성을 갖는 김치를 제조하기 위하여 연구를 수행하던 중, 저온숙성된 맛이 좋은 김치로부터 내산성 유산균 균주를 분리하였고, 상기 분리한 내산성 유산균 균주와 가바를 첨가함으로써 맛과 함께 기능성이 향상된 김치를 제조하는 방법을 개발하였으며, 상기 방법으로 제조된 김치가 일반적인 류코노스톡 메센테로이드 균주를 첨가한 김치와 비교하여 맛이 월등히 좋음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 저온숙성된 맛이 좋은 김치로부터 분리된 내산성 유산균 균주 및 상기 균주를 이용하여 맛과 기능성이 우수한 김치를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 김치에서 분리된 pH 3.5-5.0에서 내산성을 갖으며 젖산 생성능이 낮은 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211(Leuconostoc mesenteroides DRC 0211)(기탁번호 : KFCC-11318)을 제공한다.
또한, 본 발명은 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211(Leuconostoc mesenteroides DRC 0211; KFCC-11318) 균주 또는 그의 배양액과 가바(GABA; γ-aminobutyric acid)를 첨가하는 것을 특징으로 하는 김치의 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211(Leuconostoc mesenteroides DRC 0211; KFCC-11318) 균주 또는 그 배양액과 가바(GABA;γ- aminobutyric acid)를 첨가하여 김치를 제조하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서는 깔끔하고 시원한 맛을 갖는 김치를 제조하기 위하여 김치가 가장 맛있을 때 생육되는 균주를 분리하였다. 김치의 시원하고 깔끔한 맛을 재현시킬 수 있는 균주의 분리를 위한 김치로는 저온에서 숙성되고, pH가 4.3-4.5 범위에 있으며, 산도가 0.6-0.8% 범위에 있는 김치를 사용하는 것이 바람직하다. 구체적으로 본 발명에서는 -1℃에서 숙성되고, pH가 4.46, 산도가 0.7%인 김치로부터 유산균을 분리하였고, 상기 분리된 유산균의 동정을 수행하였다. 그 결과, 류코노스톡 메센테로이드에 속하는 균주임을 확인할 수 있었고, 이 균주를 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211이라 명명하였으며, 상기 균주를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 2002년 11월 22일자로 기탁하였다(기탁번호 : KFCC-11318).
본 발명은 상기 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주를 제공하는 것을 특징으로 한다. 일반적으로 류코노스톡 메센테로이드 균주는 산성 조건, 특히 pH 4.0 이하에서 증식이 급격히 저하되나 본 발명에 따른 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주는 pH 3.5-5.0의 산성 조건에서 내산성을 갖고 있으며, 특히 pH 3.5에서 생육하여 내산성이 강한 것으로 나타났다. 또한 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211를 이용하여 김치를 제조하는 경우 김치의 산도 증가 속도가 완만하며 김치내 젖산 생성량이 종래 류코노스톡 메센테로이드에 비하여 상대적으로 낮은 것으 로 나타났다. 따라서 김치 제조시 본 발명에서 분리된 균주 또는 그 배양액을 이용하는 경우에는 산패가 억제되고 적정 숙도를 유지하는 기간이 연장되어 좋은 김치맛을 오래 유지할 수 있게 된다.
본 발명에 따른 김치 제조시 상기 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주를 직접 김치에 첨가할 수도 있으나, 균주의 배양액 형태로 첨가하는 것이 바람직하다. 본 발명의 김치 제조시 사용되는 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주의 배양액은 상기 균주를 펩톤, 효모 추출액, 포도당이 2:1:2의 비율로 첨가된 영양배지에 접종한 후 25-30℃에서 18-24시간 동안 1차 전배양하는 단계; 상기 1차 전배양액을 멸균된 배추즙에 0.5-1.0%(v/v) 접종한 후 25-30℃에서 18-24시간 동안 2차 전배양하는 단계; 상기 2차 전배양액을 멸균된 배추즙에 0.5-1.0%(v/v) 접종한 후 25-30℃에서 18-24시간 동안 본배양하는 단계를 거쳐 제조되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 김치 제조시 첨가되는 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주를 가장 효과적으로 배양하기 위해서는 상기 균주를 천연배지인 멸균된 배추즙에서 배양하는 것이 바람직하다. 상기 멸균된 배추즙은 절임배추를 분쇄하고 착즙한 후, 효과적인 균주의 생육을 위하여 염농도를 2.5-3.0%로 조정하고, 포도당을 1.0-2.0%(w/v) 첨가하여 제조되는 것이 바람직하며, 구체적으로 염농도를 2.8%로 조정하고 포도당을 1.0%(w/v) 첨가하는 것이 가장 바람직하다.
이와 같이 제조된 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주의 배양액은 본 발명에 따른 김치 제조시 가바와 함께 첨가되는데, 상기 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주의 배양액은 김치 전체 중량에 대해 0.5-5중량% 첨가되는 것이 바람직하고, 가바는 김치 전체 중량에 대해 0.12-0.35중량% 첨가되는 것이 바람직하다.
상기에서 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주의 배양액이 김치 전체 중량에 대하여 0.5중량% 미만으로 첨가되면 균주에 의한 효과가 미미하고, 5중량%를 초과하여 첨가하게 되면 김치의 풍미가 저하되고 김치가 과숙성되는 문제점이 발생할 수 있기 때문에 상기 범위로 첨가하는 것이 바람직하며, 구체적으로는 1중량% 첨가하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 가바가 김치 전체 중량에 대하여 0.12중량% 미만으로 첨가되면 가바에 의한 효과가 미미하게 되고, 0.35중량%를 초과하여 첨가하게 되면 김치의 풍미가 저하될 수 있기 때문에 상기 범위로 첨가하는 것이 바람직하며, 구체적으로는 0.12중량% 첨가하는 것이 가장 바람직하다.
이상과 같이 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주와 가바를 첨가하여 제조된 김치는 깔끔하고 상쾌한 맛을 낼뿐만 아니라, 신맛이 억제되어 맛을 오래 보존할 수 있으며 혈압강하 및 긴장완화 효과를 갖고 있다는 특징이 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
저온에서 숙성된 맛이 우수한 김치로부터 유산균의 분리
통상적인 방법으로 여러 종류의 김치를 제조한 후, 가장 맛이 좋다고 평가되는 김치를 선택하였다. 이 김치를 -1℃의 저온에서 숙성시킨 후(도 1 참조), pH 4.46 산도 0.7%가 되는 시기에 관능평가를 실시하여 가장 풍미가 우수한 시점의 김치를 유산균 분리 김치시료로 사용하였다. 상기 김치시료를 0.85% 식염수로 10배 희석하였고, 0.1ml씩 PES 아가(Penylethyl alcohol sucrose agar; tryptone 5g, yeast extract 0.5g, sucrose 20g, ammonium sulfate 2g, dipotassium phosphate 1g, magnesium sulfate 0.244g, phenylethyl alcohol 2.5ml, agar 15g/D.W. 1L) 플레이트에 접종한 후, 유리막대로 도말하였다. 상기 김치시료가 도말된 아가 플레이트를 25℃의 항온배양기에서 1일 동안 배양한 후, 생성된 각각의 콜로니를 PES 아가 플레이트에 획선 접종하였고, 25℃에서 1일 동안 배양하여 유산균 균주를 분리하였다.
<실시예 2>
김치에서 분리한 유산균 중 내산성 균주 분리
상기 실시예 1에서 분리된 각 유산균 콜로니를 젖산(lactic acid)으로 pH 3.5, 4.0, 4.5, 5.0으로 조정한 MRS 브로스(MRS broth, Difco.; bacto peptone 10g, beef extract 10g, yeast extract 5g, glucose 2 0g, tween 80 1g, ammonium citrate 2g, dipotassium phosphate 2g, sodium acetate 5g, manganese sulfate 0.1g, magnesium sulfate 0.05g/D.W. 1L) 5ml에 각각 접종한 후 25℃에서 72시간 배양하면서 생육유무를 관찰하여 상기 pH 범위에서도 생육이 활발한 내산성 균주를 선별하였다. 상기 내산성 유산균 균주는 pH 3.5-5.0에서 생육이 활발하며, 특히 pH 3.5에서 생육하여 내산성이 강한 것으로 나타났다.
<실시예 3>
김치에서 분리한 내산성 유산균 균주의 동정
상기 실시예 2에서 분리된 내산성 유산균 균주와 이외 실시예 1에서 분리된 다른 유산균 균주들을 각각 단일 콜로니로 분리한 후, 버기의 분류 세균학 매뉴얼(Bergy's manual of systematic bacteriology)에 준하여 형태학적, 생화학적 특성을 조사하였고, 그람 염색을 수행하였다. 그 결과, 상기 분리된 균주들이 모두 그람 양성 균주이며 구균의 형태를 갖고 있음을 확인할 수 있었다.
이후, 상기 균주들을 API 시스템(API system; La Balme-les-Grottes, France)으로 동정하였다. 우선, 멸균 백금이로 균 콜로니를 취한 후 멸균 증류수 2ml에 부유시키고, 다시 멸균 증류수 5ml에 API 50CH 키트(BioMerieux, France)에서 제공되는 맥팔란드 표준 용액 No.2(MccFaland Standard Solution No.2)의 농도로 균액을 부유시켰다. 상기 부유액을 API 50CH 키트의 액체배지에 첨가하여 균질화 시킨 후, API 50CH 키트의 50개 각 튜브에 200㎕씩 접종하였다. 미네랄 오일로 튜브 위를 엎어준 후, 30℃에서 48시간 동안 배양시켰다. 상기 배양액을 API 시스템으로 분석하여 49종의 탄수화물 발효패턴을 확인한 후, 이 결과를 ATB 동정 컴퓨터 시스템에 입력하여 동정하였다.
그 결과, 상기 실시예 2에서 분리한 내산성 균주는 하기 표 1의 탄수화물 발효패턴을 갖고 있는, 류코노스톡 메센테로이드에 속하는 균주인 것으로 판명되었다. 또한, 상기 내산성 균주 이외에 분리된 다른 류코노스톡 메센테로이드 균주들은 동정 결과 일반적인 류코노스톡 메센테로이드 균주의 특성을 갖고 있음을 확인할 수 있었으며, 이중 한 개를 류코노스톡 메센테로이드 0-20으로 명명하고 이후 비교실험에서 대조군 김치 제조시 사용하였다. 상기 류코노스톡 메센테로이드 0-20 균주의 탄수화물 발효패턴 결과는 표 2에 나타내었다.
한편, 상기에서 분리된 내산성 균주의 16S rRNA의 염기서열을 분석한 결과, 류코노스톡 메센테로이드와 99% 동일성을 가짐을 확인할 수 있었다. 본 발명에서는 류코노스톡 메센테로이드와 99% 동일성을 갖는 균주를 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211로 명명하였고, 이를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 2002년 11월 22일자로 기탁하였다(기탁번호 : KFCC-11318).
대조군 - D-만노즈 + 살리신 - 겐티오비오즈 -
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글리세롤 - L-솔보즈 - 셀로비즈 - D-튜라노즈 +
에리쓰리톨 - 람노즈 - 말토즈 - D-리조즈 -
D-아라비노즈 - 둘시톨 - 락토즈 - D-타가토즈 -
L-아라비노즈 + 이노시톨 - 멜리비오즈 - D-퓨코즈 -
리보오즈 + 만니톨 - 사카로즈 + L-퓨코즈 -
D-자일로즈 - 솔비톨 - 트레할로즈 + D-아라비톨 -
L-자일로즈 - D-만노시드 - 이눌린 - L-아라비톨 -
아도니톨 - D-글루코시드 + 멜레지토즈 - 글루코네이트 -
자일로시드 - 글루코사민 + D-라피노즈 - 2-세토-글루코네이트 -
갈락토즈 - 아미그달린 + 아미돈 - 5-세토-글루코네이트 -
D-글루코즈 + 알부틴 + 글리코겐 -
D-프록토즈 + 에스큘린 + 자일리톨 -
<실시예 4>
김치에서 분리한 내산성 유산균 균주와 종래 유산균 균주의 내산성 비교
상기 실시예 2에서 분리된 내산성 유산균 균주(류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211균주)와 종래 공지된 유산균 균주인 류코노스톡 메센테로이드 KCCM 11324 및 류코노스톡 속 균주 KFCC 10774의 내산성 정도를 비교하였다.
상기 각 유산균을 젖산(lactic acid)으로 pH 3.2, 3.5, 4.0, 5.0으로 조정한 MRS 브로스(MRS broth, Difco.; bacto peptone 10g, beef extract 10g, yeast extract 5g, glucose 2 0g, tween 80 1g, ammonium citrate 2g, dipotassium phosphate 2g, sodium acetate 5g, manganese sulfate 0.1g, magnesium sulfate 0.05g/D.W. 1L) 10ml에 각각 접종한 후 25℃에서 72시간 배양하면서 생육유무를 관찰하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
pH 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 류코노스톡 메센테로이드 KCCM 11324 류코노스톡 속 균주 KFCC 10774
5.0 + + +
4.0 + + +
3.5 + - -
3.2 - - -
상기 표 3에 기재되어 있는 바와 같이, 본 발명에서 분리 동정한 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211은 종래 류코노스톡 속 미생물에 비하여 내산성이 강하여 pH 3.5-5.0에서도 생육이 활발하게 유지됨이 확인되었다.
<실시예 5>
류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주의 김치첨가 배양액 제조
상기 실시예 2와 3에서 분리, 동정된 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주를 배양하기 위한 천연배지를 제조하였다. 우선, 절임배추를 브랜더로 분쇄, 착즙 후 재제염을 사용하여 염도가 2.8%가 되도록 조정하였다. 여기에 포도당을 1.0%(w/v) 첨가한 후, 멸균하여 배추즙을 제조하였다.
류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주를 영양배지(Nutrient broth; peptone 5g, yeast extract 2.5g, glucose 5g/D.W. 1L) 5ml에 접종하여 25℃에서 24시간 1차 전배양을 하였다. 이후, 상기 1차 전배양액을 멸균된 배추즙에 1.0% 접종하여 25℃에서 24시간 동안 2차 전배양을 하였다. 상기 2차 전배양액을 다시 멸균된 배추즙에 1.0% 접종하여 25℃에서 18시간 동안 본배양하였다.
<실시예 6>
김치내에서의 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주의 특성 분석
본 발명에서 분리, 동정한 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211를 이용하여 김치를 제조함으써 상기 균주가 김치 내에서 갖는 특성, 산도 변화와 젖산 생성량을 분석하였다.
6-1) 김치 제조
상기 실시예 5에서 제조한 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주의 배양액을 첨가하여 일반적인 김치 제조 방법으로 김치를 제조하였다.
우선, 배추를 각각 소금으로 절여 배추의 염도가 2.3%가 되도록 한 후 절여진 배추(82.5중량%)에 고춧가루(2.5중량%), 마늘(2중량%), 생강(0.5중량%), 대파(2중량%), 무채(9중량%), 설탕(0.5중량%)의 김치 양념을 혼합하였다. 이렇게 제조된 김치에 상기 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주 배양액을 전체 김치 중량에 대해 1중량% 첨가하였다.
이때 대조군으로 종래 공지된 류코노스톡 메센테로이드 KCCM 11324를 사용한다는 점만 제외하고는 상기와 같이 일반적인 김치 제조 방법과 동일한 방법으로 김치를 제조하였다.
김치제조 후 각각의 김치는 김치의 일반 숙성 온도인 20℃에서 저장하면서 산도와 젖산 생성량을 비교하였다.
6-2) 산도 측정
상기에서 제조한 본 발명의 김치와 대조군으로 사용된 김치를 대상으로 산도를 측정하여 비교하였다. 우선, 산도를 측정하기 위하여 각 김치 100g을 마쇄한 후 거즈로 여과하여 김치액을 제조하였다. 이후, 상기 김치액 20ml를 0.1N NaOH을 사용하여 pH 8.1이 되도록 중화적정한 후, 소비된 NaOH량을 젖산 함량(%)으로 환산하여 나타내었다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주를 이용하여 제조된 김치는 20℃에서 숙성 3일째 적정 산도인 0.6% 에 도달하였고 이후 완만하게 증가가 되었었다. 반면, 류코노스톡 메센테로이드 KCCM11324 균주를 첨가한 대조군 김치는 20℃에서 숙성 2일째 적정숙도 인 0.6%에 도달한 다음 산도가 급상승되는 것으로 나타났다.
6-3) 젖산 생성량 비교
상기에서 제조한 본 발명의 김치와 대조군으로 사용된 김치를 대상으로 젖산 생성량을 측정하여 비교하였다. 젖산 생성량은 산도측정에 사용된 김치즙액과 같은 방법으로 김치액을 준비한 뒤 13,000rpm, 3min간 원심분리 한 후 0.22 μm syringe filter로 여과하였다. 여과된 시료는 HPLC(High performance liquid chromatography)로 시료 20 μl를 50℃에서 0.008M H2SO4(0.5ml/min) 용매를 사용하여 분석하였다.
그 결과, 하기 표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주를 이용하여 제조된 김치는 20℃에서 숙성 6일째 젖산이 0.36%이고, 류코노스톡 메센테로이드 KCCM 11324 균주를 첨가한 대조군 김치는 20℃에서 숙성 6일째 0.53%로 나타났다.
숙성일 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211젖산 생성량(%) 류코노스톡 메센테로이드 KCCM 11324젖산 생성량(%)
0 0.019 0.02
2 0.014 0.021
4 0.029 0.055
5 0.278 0.26
6 0.36 0.53
따라서 본 발명에서 분리, 동정된 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주를 이용하여 김치를 제조하는 경우, 젖산 생성능이 상대적으로 낮고, 김치의 적정 숙도에 도달된 다음 산도 증가속도가 완만하여 김치의 적정 숙도를 유지하는 기간이 길어지게 된다. 즉 본 발명의 균주로 김치를 제조하는 경우 맛있는 상태의 김치가 오랜 기간 지속되며 산패로의 진행이 지연되는 효과가 있다.
<실시예 7>
류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주 및 가바를 첨가한 김치의 제조
상기 실시예 5에서 제조한 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주의 배양액과 가바(Pharma Foods International Co. Ltd.)를 첨가하여 일반적인 김치 제조 방법으로 김치를 제조하였다.
우선, 배추를 각각 소금으로 절여 배추의 염도가 2.3%가 되도록 한 후 절여진 배추(82.5중량%)에 고춧가루(2.5중량%), 마늘(2중량%), 생강(0.5중량%), 대파(2중량%), 무채(9중량%), 설탕(0.5중량%)의 김치 양념을 혼합하였다. 이렇게 제조된 김치에 상기 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주 배양액을 전체 김치 중량에 대해 1중량% 첨가하였다.
기존에 발표된 문헌(東口 伸二, 上野 義榮, 早川 潔, 八田 一, 金武祚, 日本農藝化學會 2001 學術大會 p.271-275; Kim M.J., Higashiguchi S., Iwamoto Y., Lee S.Y., Hurh B.S. and Lee Y.H., Proc. KMB Autumn Meeting, 2002, p.9-11)에는 최고혈압이 140이상인 고혈압환자 10명을 대상으로 가바를 100mg/1day 섭취시킨 경우 4개월 후 최고혈압이 140이하로 저하되는 효과를 보였으며, SD-래트에게 가바를 100mg/kg의 농도로 5주간 매일 투여한 경우 쥐의 학습능력 상승효과를 나타낸다고 기재되어 있다. 이를 근거로 한국인 1일 섭취하는 김치의 양이 87g이므로 유효 기능성을 갖는 가바의 농도는 0.12%이다. 따라서, 본 발명에서는 김치 제조시 가바를 김치 중량에 대해 0.12중량% 첨가하였다. 김치제조 후 각각의 김치는 10℃에서 저장하면서 산도, pH 측정 및 관능검사를 수행하였다.
<비교예 1>
일반적인 류코노스톡 메센테로이드 균주를 첨가한 김치의 제조
김치 제조시 상기 실시예 2와 3에서 분리, 동정된 류코노스톡 메센테로이드 O-20 균주를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 7에서와 같이 일반적인 김치 제조 방법과 동일한 방법으로 김치를 제조하였고 이를 대조군으로 하여 이후 비교실험을 수행하였다.
<실시예 8>
김치의 산도, pH, 유산균 수 측정 및 관능검사
8-1) 산도 및 pH 측정
상기 실시예 7에서 제조한 본 발명의 김치와 비교예 1에서 제조한 대조군 김치를 대상으로 산도와 pH를 측정하여 비교하였다. 우선, pH 및 산도를 측정하기 위하여 각 김치 100g을 마쇄한 후 거즈로 여과하여 김치액을 제조하였다. 이후, 상기 김치액 20ml를 시료로 하여 pH 미터(Thermo Orion 720A., USA)로 각 김치의 pH를 측정하였다. 산도는 상기 실시예 6-2)와 동일한 방법으로 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주와 가바를 첨가한 김치는 10℃에서 숙성 4일째 pH 4.2의 적정 pH에 도달하면서 이후 계속 유지되었다. 반면, 류코노스톡 메센테로이드 0-20 균주를 첨가한 대조군 김치는 10℃에서 숙성 3일째부터 pH가 빠르게 감소되었고, 이후 적정숙도 이하의 pH를 나타내었으며, 14일 이후에는 빠르게 pH가 내려갔다. 또한, 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 김치의 경우 적정산도인 0.6% 도달이후 증가율이 완만하였으나 대조군 김치는 산도가 급상승되는 것으로 나타났다.
8-2) 유산균 수 측정 결과
상기 실시예 7에서 제조한 본 발명의 김치와 비교예 1에서 제조한 대조군 김치의 유산균 수를 측정하였다. 상기 각 김치를 0.85% 식염수로 10배 희석하였고, 류코노스톡 속 균수를 측정하는 경우, 김치 희석액 0.1ml씩을 PES 아가(Penylethyl alcohol sucrose agar; tryptone 5g, yeast extract 0.5g, sucrose 20g, ammonium sulfate 2g, dipotassium phosphate 1g, magnesium sulfate 0.244g, phenylethyl alcohol 2.5ml, agar 15g/D.W. 1L) 플레이트에 접종한 후 유리막대로 도말하였다. 또한, 락토바실러스 속 균수를 측정하는 경우, 김치 희석액 0.1ml씩을 m-LBS 아가(tryptone 10g, yeast extract 5g, glucose 20g, tween 80 1g, ammonium citrate 2g, dipotassium phosphate 6g, sodium acetate 35g, glacial acetic aicd 2.5ml, manganese sulfate 0.12g, magnesium sulfate 0.57g, iron sulfate 0.034g/D.W. 1L) 플레이트에 접종한 후 유리막대로 도말하였다. 상기 김치 희석액이 도말된 각 아가 플레이트를 25℃의 항온배양기에서 1일 동안 배양한 후, 생성된 집락의 수를 각각의 균수로 계수하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의해 제조된 김치의 유산균 수는 발효기간 동안 류코노스톡 메센테로이드 균주의 수가 108 - 109 cfu/ml의 수준으로 일정하게 유지가 되어 첨가된 유산균이 김치에서 우점종으로 발효를 주도하였다. 또한, 김치 발효 후기에 왕성하게 증식하여 김치의 신맛의 원인이 되는 락토바실러스 속 균주의 수는 감소됨을 확인할 수 있었다. 반면, 류코노스톡 메센테로이드 0-20 균주를 첨가하여 제조한 김치는 본 발명에 따라 제조된 김치에 비해 발효 경과에 따라 류코노스톡 메센테로이드 균주의 수가 급감하였으며, 락토바실러스 속 균주의 수는 오히려 증가되었음을 확인할 수 있었다.
8-3) 관능 검사
상기 실시예 7에서 제조한 김치와 비교예 1에서 제조한 대조군 김치에 대해 50명을 대상으로 관능 검사를 수행하였고, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 또한, 가바를 각각 0.12, 0.35, 0.50% 첨가하여 상기 실시예 5의 방법으로 김치를 제조한 후, 가바의 첨가량에 따른 관능 검사를 수행하였고, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 테스트 결과는 5점을 만점으로 기호도 척도법에 의해 실시하였다. 유의성 검증은 t-test에 의해 실시하였다.
종류 종합적인 맛 이미 외관 냄새 질감
실시예 5 4.2 2.0 3.6 3.7 3.9
비교예 1 3.1 4.1 2.8 3.5 3.8
종류 가바 첨가량(중량%) 종합적인 맛 이미 이취 외관 질감
본 발명에 따라 제조된 김치 0.12 4.0 2.1 1.5 3.6 4.0
0.35 3.8 2.5 2.0 3.5 3.8
0.50 3.1 3.9 3.4 3.6 3.9
상기 표 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 김치는 전반적으로 류코노스톡 메센테로이드 0-20 균주를 첨가한 대조군 김치에 비해 관능특성이 우수한 것으로 평가되었다. 즉, 대조군 김치의 경우 류코노스톡 균주가 감소되고 락토바실러스 균주가 증가하면서(도 5 참조) 산도가 증가되어 이미가 강하게 평가되었으며, 배추의 색이 어둡게 변색되어 외관에서도 낮게 평가되었다. 반면, 본 발명에 따라 제조된 김치는 가바의 양과 류코노스톡 균수가 발효기간내 일정 수준으로 유지되면서 맛, 외관에 대해 풍미상승의 효과가 있고, 산미도 강하지 않아 대조군과 비교하여 이미가 거의 없음을 알 수 있었다.
또한, 상기 표 6에 나타난 바와 같이, 가바의 첨가량을 달리하여 제조한 김치의 관능 검사 결과, 가바의 유효농도 범위내인 0.12-0.35중량%를 첨가하여도 김치의 관능에는 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다. 즉, 이러한 가바의 첨가에 의해 김치의 맛에는 영향을 미치지 않으면서도 혈압강하 및 긴장완화 효과가 있는 김치를 제조할 수 있었다.
상기에서 기술한 바와 같이, 본 발명에서는 저온 숙성된 김치로부터 김장김치의 시원하고 깔끔한 맛을 재현시킬 수 있는 내산성 유산균 균주를 분리하였다. 또한 상기 균주와 혈압강하 및 긴장완화 기능을 갖는 가바가 첨가된 김치는 일반적인 유산균 균주를 첨가하여 제조된 김치와 비교할 때 맛에 있어 우수할 뿐만 아니라, 기능성도 우수하다는 효과를 갖고 있다.
도 1은 김치의 맛을 연중 재현시킬 수 있는 유산균을 분리하기 위하여 사용된 김치의 저온숙성 중 품온 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주를 첨가하여 제조한 김치와 종래 공지된 류코노스톡 메센테로이드 KCCM 11324 균주를 첨가하여 제조한 김치의 산도 변화를 비교하여 나타낸 그래프이다.
◆ : 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주를 첨가하여 제조된 김치
■ : 류코노스톡 메센테로이드 KCCM 11324 균주를 첨가하여 제조된 김치
도 3은 본 발명에서 제조한 김치와 일반적인 류코노스톡 메센테로이드 균주를 첨가하여 제조한 김치의 pH 변화를 비교하여 나타낸 그래프이다.
◆ : 류코노스톡 메센테로이드 O-20 균주 첨가군
■ : 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주 첨가군
도 4는 본 발명에서 제조한 김치와 일반적인 류코노스톡 메센테로이드 균주를 첨가하여 제조한 김치의 산도 변화를 비교하여 나타낸 그래프이다.
◆ : 류코노스톡 메센테로이드 0-20 균주 첨가군
■ : 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주 첨가군
도 5는 본 발명에서 제조한 김치와 일반적인 류코노스톡 메센테로이드 균주를 첨가하여 제조한 김치의 숙성 중 유산균의 수를 비교하여 나타낸 그래프이다.
◆ : 류코노스톡 메센테로이드 0-20 균주를 첨가하여 제조된 김치에서의 류코노스톡 속 균주 수
▲ : 류코노스톡 메센테로이드 0-20 균주를 첨가하여 제조된 김치에서의 락토바실러스 속 균주 수
■ : 본 발명에 따라 제조된 김치에서의 류코노스톡 속 균주 수
× : 본 발명에 따라 제조된 김치에서의 락토바실러스 속 균주 수

Claims (8)

  1. 김치에서 분리된 pH 3.5-5.0에서 내산성을 갖으며 젖산 생성능이 낮은 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211(Leuconostoc mesenteroides DRC 0211)(기탁번호 : KFCC-11318).
  2. 제 1항의 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211(KFCC-11318) 균주 또는 그 배양액과 가바(GABA; γ-aminobutyric acid)를 첨가하는 것을 특징으로 하는 김치의 제조방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주(KFCC-11318)의 배양액은 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주를 펩톤, 효모 추출액, 포도당이 2:1:2의 비율로 첨가된 영양배지에 접종한 후 25-30℃에서 18-24시간 동안 1차 전배양하는 단계; 상기 1차 전배양액을 멸균된 배추즙에 0.5-1.0 %(v/v) 접종한 후 25-30℃에서 18-24시간 동안 2차 전배양하는 단계; 상기 2차 전배양액을 멸균된 배추즙에 0.5-1.0%(v/v) 접종한 후 25-30℃에서 18-24시간 동안 본배양하는 단계를 거쳐 제조되는 것을 특징으로 하는 김치의 제조방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 멸균된 배추즙은 절임배추를 분쇄하고 착즙한 후, 염농도를 2.5-3.0%로 조정하고 포도당을 1.0-2.0%(w/v) 첨가하여 제조되는 것을 특징으로 하는 김치의 제조방법.
  5. 제 2항에 있어서, 상기 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주(KFCC-11318)는 pH 4.3-4.5, 산도 0.6-0.8%로 숙성된 김치에서 분리된 것을 특징으로 하는 김치의 제조방법.
  6. 제 2항에 있어서, 상기 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주(KFCC-11318)는 pH 3.5-5.0에서 내산성을 갖는 것을 특징으로 하는 김치의 제조방법.
  7. 제 2항에 있어서, 상기 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211 균주(KFCC-11318)의 배양액을 김치 제조시 김치 전체 중량에 대해 0.5-5 중량% 첨가하는 것을 특징으로 하는 김치의 제조방법.
  8. 제 2항에 있어서, 상기 가바를 김치 제조시 김치 전체 중량에 대해 0.12-0.35 중량% 첨가하는 것을 특징으로 하는 김치의 제조방법.
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