KR100999429B1

KR100999429B1 - 비만 치료 및 항산화 활성을 갖는 효모 가수분해물

Info

Publication number: KR100999429B1
Application number: KR1020100039717A
Authority: KR
Inventors: 김재환; 서형주
Original assignee: (주)네오크레마
Priority date: 2010-04-28
Filing date: 2010-04-28
Publication date: 2010-12-09
Also published as: US20130052185A1; JP2011231097A; EP2564860A4; JP5902382B2; WO2011136573A3; WO2011136573A2; JP2016147881A; EP2564860A2; EP2564860B1

Abstract

본 발명은 체내 지방 축적을 저해함으로써 비만을 치료 또는 예방하고 항산화 활성을 갖는 효모 가수분해물을 제공한다. 아울러 본 발명은 상기 효모 가수분해물의 제조방법 및 상기 효모 가수분해물을 포함하는 식품, 사료, 약학적 조성물 및 화장료 조성물을 제공한다.

Description

비만 치료 및 항산화 활성을 갖는 효모 가수분해물{Yeast hydrolysate which has obesity treatment and antioxidative function}

본 발명은 체내 지방 축적 저해 및 항산화 활성을 갖는 효모 가수분해물에 대한 것이다.

비만은 섭취한 열량 중에서 소모되고 남은 부분이 지방으로 전환되어 체내의 여러 부분, 특히 피하조직과 복강 내에 축적되는 현상이다. 중성지방(TG, triglycerol)은 글리세린과 세 분자의 지방산이 에스터결합한 화합물이고, 탄수화물로부터 합성되는 중성지방으로 동물의 지방조직에 저장되기 때문에 효소에 의한 가수분해로 유리지방산을 혈액 중에 방출한다. 지방조직에 저장된 중성지방은 당이 에너지원으로서 부족하게 될 때 비에스터화 지방산(nonesterifide fatty acid, NEFA)과 글리세롤(glycerol)로 분해되어 혈중에 방출된다. 에너지 원으로서 사용되고 남은 비에스터화 지방산은 간에서 다시 중성지방으로 변한다. 이것이 다시 혈중에 유입되면 이를 내인성 중성지방이라 한다. 중성지방의 양이 과다하면 죽상경화증, 관상동맥질환 등과 밀접한 관계가 있다.

비만 환자는 지방조직의 기능에 필요한 지방량보다 훨씬 많은 지방이 체내에 축적되어 있는 상태이며 이것이 원인이 되어 인체내의 정상적인 생화학적 및 생리적 기능에 장애를 가진 사람이다. 비만은 여러 가지 질환, 특히 당뇨병, 고지혈증, 고혈압 및 관상동맥질환, 그리고 관절질환 등의 다양한 질병의 원인이 될 뿐만 아니라 정상적인 사회생활을 불가능하게 하기도 한다.

또한 비만은 인간뿐 아니라 동물, 특히 애완동물의 건강에도 치명적인 위험을 미치는데, 과다한 사료의 섭취나 편중된 영양의 섭취로 인하여, 애완동물, 특히 개나 고양이, 햄스터들이 비만해지거나 영양 불균형이 발생되는 경우가 많다.

동물에 필요한 영양성분은 주로 사료에 의존하며, 사료 속에 함유되어 있는 지질은 가공, 저장 중 산패에 의한 품질저하가 일어나 불쾌한 맛이나 냄새를 갖게 된다. 또한 산화 생성물에 의해 DNA가 손상되거나 체내의 효소를 불활성화시켜 대사 이상을 유발 또는 여러 가지 질병의 원인이 되고 있다. 그러므로 지질의 산화를 억제하기 위하여 BHT, BHA, TBHQ 등의 산화방지제를 첨가하는데, 이들은 항산화 효과는 뛰어나지만 변이원성 및 발암성 등이 문제시되어 소비자들의 거부반응으로 인해 그 사용이 감소되고 있는 추세이다. 따라서 항산화능이 높고 안전성이 확보된 천연 항산화제에 대한 많은 연구가 필요하나 천연 항산화제의 개발과 산업화가 어려우므로 식품업계에서는 합성 항산화제를 주로 사용하고 있다.

이에 본 발명자들은 식욕을 신체 대사를 조절하여 비만을 치료, 예방할 수 있는 방안을 연구하던 중 효모를 특정 효소로 가수분해할 경우 상기 효모 가수분해물이 지방의 축적을 저해할 뿐 아니라 체내 지방을 분해함으로써 비만 치료 및 예방에 효과가 큰 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

더군다나 본 발명의 효모 가수분해물은 조직 및 세포의 산화적 손상 또한 예방 및 완화시키는 것을 발견하였는바 본 발명의 효모 가수분해물은 비만 및 산화적 손상을 치료, 예방하는 효과가 있다.

본 발명의 목적은 비만을 치료하는 비만 치료 및 예방용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 항산화 활성을 갖는 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명을 효모를 특정 효소로 가수분해한 효모가수분해물을 제공한다.

본 발명의 효모 가수분해물은 체내 지방 축적의 저해 및 지방 분해를 통하여 체중을 감소, 비만을 치료 및 예방할 수 있다. 또한 본 발명의 효모 가수분해물은 항산화 활성을 갖는다.

도 1은 다양한 효소로 가수분해한 효모 가수분해물의 단백질 회수율을 나타낸다.
도 2는 효모 가수분해물이 3T3-L1 지방세포의 글리세롤 및 렙틴 분비량에 미치는 영향을 나타낸다.
도 3은 MTT 방법으로 측정한, 3T3-L1 지방세포주에 대한 효모 가수분해물의 세포 독성을 보여준다.
도 4는 효모 KH-15 가수분해물의 래트의 DPPH 및 ABTS라디칼 소거능을 나타낸다.
도 5는 효모 KH-15 가수분해물이 SD 래트의 체중에 미치는 영향을 보여준다.
도 6은 효모 KH-15 가수분해물이 SD 래트의 지방 축적을 억제하는 효과를 나타낸다.
도 7은 효모 KH-15 가수분해물이 개의 체중에 미치는 영향을 보여준다.
도 8은 효모 KH-15 가수분해물이 개의 복부 둘레에 미치는 영향을 나타낸다.
도 9는 효모 KH-15 가수분해물 투여 시, 개의 혈액 내의 MDA 및 GSH 함량을 나타낸다.

본 발명은 효모를 효소로 분해한 효모 가수분해물을 유효성분으로 포함하며, 체중 감소 및 항산화 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 효모를 효소로 분해한 효모 가수분해물을 동물에 투여하는 단계를 포함하는 동물의 동맥경화, 내장비만, 복부비만, 고지혈증, 지방간, 비만의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 효모에 효소를 가하는 단계를 포함하는, 체중 감소 및 항산화 활성을 갖는 조성물의 제조 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명의 효모는 식품으로서 사용되는 효모이면 되고 그 종류가 특별히 한정되는 것은 아니다. 예컨대 본 발명의 효모에는 Saccharomyces cerevisiae , Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces fermentati , Saccharomyces bayanus , Saccharomyces sake , Saccharomyces mandshuricus ,, Saccharomyces anamensis , Saccharomyces formosensis , Saccharomyces ellipsoideus , Saccharomyces coreanus 등이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 Saccharomyces cerevisiae 이다.

본 발명의 효소는 단백질 분해효소인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 상기 단백질 분해효소는 프로타맥스(Protamax), 프로리테르 FG-F(Proleather FG-F), 플라보자임(Flavourzyme), 프로테아제 A(Protease A), 에이로즈 AP-10(Aroase AP-10), 피스칼레이즈(Pescalase), 파파인(Papain), 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 KH-15, 브로멜라인(Bromelain), 피신(Ficin) 및 뉴트레이즈(Neutrase)로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나이며, 더더욱 바람직하게는 상기 단백질 분해효소는 프로타맥스, 플라보자임 및 KH-15이다. 가장 바람직하게는 상기 단백질 분해효소는 KH-15이다. 그러나 본 발명의 특징은 효모를 가수분해하여 식이섭취량의 감소 없이 체중을 감소시키고 항산화 활성을 갖는 효모 가수분해물을 제조하는데 있는바, 이러한 특징을 갖도록 효모를 가수분해하는 단백질 분해효소라면 본 발명의 어느 것이나 본 발명의 범위에 포함된다 할 것이다.

상기 조성물은 식품 조성물, 사료 조성물, 약학적 조성물 및 화장료 조성물로부터 선택되는 어느 하나이다.

본 발명의 식품 조성물, 사료 조성물, 약학적 조성물 및 화장료 조성물은 체내 활성산소를 제거함으로써, 체내 지방, 콜레스테롤과 활성산소가 반응하여 과산화지질을 생성하는 것을 저해하고, 이로써, 과산화지질이 혈전, 색전을 생성하는 것을 예방할 수 있다. 또한 본 발명의 식품 조성물, 사료 조성물, 약학적 조성물은 활성산소를 제거함으로써, 활성산소과 관련된 혈전, 색전, 과산화지질로 인한 혈액순환장애, 뇌졸중, 중풍, 뇌혈전, 심근경색, 동맥경화를 예방 및 치료하고, 활성산소에 의한 DNA, 세포, 조직의 변성을 저해함으로써, 아토피, 알레르기, 종양, 관절염, 백내장, 피부종양을 예방 및 치료하며, 노화진행을 저해한다.

또한 본 발명의 식품, 사료 또는 약학적 조성물은 동맥경화, 내장비만, 복부비만, 고지혈증, 지방간 및 비만으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환을 예방 및/또는 치료하며, 당뇨를 예방한다. 아울러 본 발명의 식품, 사료 또는 약학적 조성물은 상기 질환들 외 혈중 지질 농도 증가, 중성지방 축적 등과 관련된 질환에 복합적인 효과를 보이며, 장기간 투여 시 체중 관리, 항산화를 통한 노화 지연, 건강 개선 효과를 갖는다.

또한 본 발명은 효모 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품이란 건강보조식품, 건강기능식품, 기능성 식품 등이나 이에 제한되는 것은 아니며, 천연식품, 가공식품, 일반적인 식자재 등에 본 발명의 효모 가수분해물을 첨가한 것도 포함된다.

본 발명의 효모 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 건강기능식품을 식품 또는 음료의 제조시에 원료에 대하여 0.01 내지 70.00 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 30.00 중량%의 양으로 첨가될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 10.00 중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 식품 조성물의 상기 효모 가수분해물의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 효모 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제의 형태로 이용될 수 있으며, 이들 제제는 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.

상기 효모 가수분해물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있으나 이들 종류의 식품으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 효모 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 사료 조성물은 통상적인 사료와 함께 배식할 수 있으며, 본 발명의 사료 조성물을 통상적인 사료 조성물에 첨가하여 기능성 사료 조성물을 제조하여 이용할 수도 있다. 또한 본 발명의 사료 조성물은 본 발명의 효모 가수분해물 외 기능성 성분을 추가로 포함할 수도 있다. 상기 통상적인 사료 조성물과 본 발명의 효모 가수분해물이 혼합된 기능성 사료 조성물의 제조 시, 본 발명의 효모 가수분해물은 총 사료 조성물에 대하여 0.01 내지 30.00 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 20.00 중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 사료 조성물의 상기 효모 가수분해물의 유효용량은 상기 식품 조성물의 유효 용량에 준해서 사용할 수 있으나, 지속적인 체중 관리를 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 고도 비만 등의 경우에는 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 사료 조성물은 가축 또는 가금을 대상으로 한다. 상기 가축 또는 가금은 소, 돼지, 닭, 말, 양, 당나귀, 노새, 멧돼지, 토끼, 메추라기, 집오리, 장닭, 투계용 닭, 비둘기, 칠면조, 개, 고양이, 원숭이, 햄스터, 생쥐, 래트, 구관조, 앵무새, 잉꼬, 카나리아 등이나 이들에 제한되는 것은 아니며 가정 내에서 사육 가능한 인간 이외의 포유 동물 또는 조류이면 본 발명의 사료 조성물의 대상이라 할 것이다.

본 발명의 효모 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 혈전, 색전, 과산화지질로 인한 혈액순환장애, 뇌졸중, 중풍, 뇌혈전, 심근경색, 동맥경화를 예방 및 치료하고, 활성산소에 의한 DNA, 세포, 조직의 변성을 저해함으로써, 아토피, 알레르기, 종양, 관절염, 백내장, 피부종양을 예방 및 치료하며, 노화진행을 저해한다. 또한 본 발명의 효모 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 고지혈증, 지방간, 내장비만, 복부비만 등 부분적 비만 및 비만(즉, 일반적인 비만)을 예방 및 치료한다.

본 발명의 효모 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 바람직한 약제학적 제제는 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제가 있으며 이들 약제학적 제제는 약제학적으로 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.

본 발명의 효모 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 투여 용량은, 환자의 상태, 연령, 성별 및 합병증 등의 다양한 요인에 따라 전문가에 의해 결정될 수 있지만 일반적으로는 성인 1kg 당 0.1 mg 내지 10 g, 바람직하게는 10 mg 내지 1 g의 용량으로 투여될 수 있다. 또, 단위 제형당 상기 약학적 조성물의 1일 용량 또는 이의 1/2, 1/3 또는 1/4의 용량이 함유되도록 하며, 하루 1 내지 6 회 투여될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 제조방법에 의하여 제조된 효모 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하며, 상기 효모 가수분해물의 제조 단계를 포함하는 상기 화장료 조성물의 생산 방법을 제공한다. 상기 화장료 조성물의 제조 방법에 있어서, 화장품 제조에 허용되는 담체는 본 발명의 화장료 조성물의 제형에 따라 다를 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 제형으로는 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 리퀴드 파운데이션, 크림 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으며, 본 발명의 항산화용 화장료 조성물은 보다 상세하게는 유연 화장수(스킨, 토너), 수렴 화장수, 영양 화장수(로션), 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 젤, 피부 접착용 패치, 파우더, 피부외용연고, 첩포제, 현탁액, 에멀젼 스프레이, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 위터, 팩, 헤어 에센스 또는 미용액 등의 통상의 화장료 형태로 제조될 수 있다.

상기 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 젤의 경우 담체 성분으로는 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라킨트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 바람직하다.

상기 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 효모 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우 담체 성분으로는 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용될 수 있으며, 그의 예로서는 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤젠 알코올, 벤젠 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 바람직하다.

상기 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 효모 가수분해물의 제형이 현탄액의 경우 담체 성분으로는 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 바람직하다.

상기 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 화장료 조성물의 제형이 계면 활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로는 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤. 지방산 에스테르 등이 바람직하다.

이하, 본 발명을 다음의 실시예 및 실험예에 의하여 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 재료

단백질 분해효소

단백질 분해효소 KH-15는 고려대학교 식품영양학과에서 된장으로 분리하여 보존중인 바실러스 균(Bacillus sp.) KH-15를 단백질분해효소의 생산균주로 사용하여 수득하였다. 즉, 단백질분해효소 생산을 위해 LB broth(bactotryptone 10 g/L, yeast extract 5 g/L, NaCl 10 g/L)에 skim milk 1%를 첨가한 액체배지를 단백질분해효소 생산용 배지로 사용하였다. 단백질분해효소 생산용 배지는 pH 6.5로 조정 후 121 ℃, 15분간 가압살균하여, 30 ℃에서 24시간 배양하여, 상징액을 원심분리하여 회수하여 조효소액으로 사용하였다. 이렇게 수득한 단백질 분해효소 KH-15의 아미노산 서열은 서열번호 1과 같다.

<서열번호 1>

MNQKAMIVIA AGSMLFGGAG VYAGINLLEM DKPQTAAVPA TAQADSERDK AMDKIEKAYE

LISNEYVEKV DREKLLEGAI QGMLSTLNDP YSVYMDKQTA KGGSDSLDSS FEGIGAEVGM

EDGKIIIVSP FKKSPAEKAG LKPLSTIISI NGESMAGKDL NHAVLKIRGK KGSSVSMKIQ

RPGTKKQLSF RIKRAEIPLE TVFASEKKVQ GHSVGYIAIS TFSEHTAEDF AKALRELEKK

EIEGLVIDVR GNPGGYLQSV EEILKHFVTK DQPYIQIAER NGDKKRYFST LTHKKAYPVN

VITDKGSASA SEILAGALKE AGHYDVVGDT SFGKGTVQQA VPMGDGSNIK LTLYKWLTPN

GNWIHKKGIE PTIAIKQPDY FSAGPLQLKE PLKVDMNNED VKHAQVLLKG LSFDPGREDG

YFSKDMKKAV MAFQDQNKLN KTGVIDTRTA ETLNQQIEKK KSDEKNDLQL QTALKASFVN

프로타맥스(Protamax)와 플라보자임(Flavourzyme)은 Novo Korea (Seoul, South Korea), 프로리테르 FG-F(Proleather FG-F)과 프로테아제 A(Protease A)는 Amano Enzyme USA Co. (Lombard, IL, USA), 에이로즈 AP-10(Aroase AP-10)과 피스칼레이즈(Pescalase)는 Yakult (Yakult Pharmaceutical Ind. Co., Tokyo, Japan)와 DSM Gist (Netherlands) 각각 구입하여 사용하였으며, 그 특성들은 표 1과 같다.

효소	source	최적 조건		분류
효소	source	온도(℃)	pH	분류
Protamax	Bacillus sp.	35-60	6.6-7.5	Complex
Flavourzyme	Aspergillus sp.	45-50	5.0-7.0	complex
Proleather	Bacillus sp.	60	10	Endo
Protease A	Aspergillus oryzae	50	7.0	Exo
Aroase AP-10	Bacillus subtilis	50-55	7.0-8.0	-
Pescalase	Bacillus subtilis	60	8.0	Endo
Papain	Carica papaya	50	6.5	complex

통계분석

실험결과는 SPSS program을 이용하여 평균과 오차를 제시하였으며, 각 처리별 유의성은 Duncans multiple range test로 p<0.05 수준에서 검정하였다.

<실시예 2> 효모 가수분해물의 활성

<실험예 1> 효모 가수분해물의 제조

Saccharomyces cerevisiae ATCC4126을 2% molasses, 0.6% (NH₄)₂SO₄, 0.1 %, MgSO₄·7H₂O, 0.2 % KH₂PO₄, 0.03 % K₂HPO₄ 와 0.1 % NaCl를 함유한 액체배지를 사용하여 30℃에서 3일간 배양하였다. 배양후 3,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 균체를 회수하여 20 mM 인산염완충용액(pH 7.0)을 사용하여 10 %현탁액 만들었다. 현탁액에 프로타맥스(Protamax), 플라보자임(Flavourzyme), 프로테아제 A(Protease A), 에이로즈 AP-10(Aroase AP-10), 피스칼레이즈(Pescalase), 파파인(Papain) 및 KH-15를 각각 0.5 % 씩 첨가하여 35 ℃에서 6시간 가수분해 후 95 ℃, 10분간 가열 처리한 후 원심분리하여 상징액을 회수하였다. 효모가수분해물은 10 kDa cut-off membrane(Satocon cassette, Sartorius, Germany)을 사용하여 동결건조하여 제조하였다.

<실험예 2> 효모 가수분해물의 단백질 회수율

상업용 효소와 바실러스 균 KH-15가 생산한 단백질분해효소 KH-15를 이용하여 효모 가수분해물을 제조하여 단백질 회수율을 측정하였다(도 1, 식 1).

<식 1>

단백질 회수율(%)=(가수분해 후 단백질/가수분해 전 단백질) X 100

프로타맥스, 플라보자임에 의한 가수분해물은 각각 52.3%와 54.5%의 회수율을 보였으며, endo-type 단백질 분해효소인 프로리테르, 프로테아제 A와 피스칼레이즈에 의한 효모 가수분해물의 단백질 회수율은 각각 46.7%, 44.5%와 50.4%로 다소 낮은 반면, KH-15는 53.9%로 endo와 exo-type의 혼합인 complex-type과 유사한 단백질 회수율을 보였다(표 2).

효소	프로타맥스	플라보자임	프로리테르	프로테아제 A	에이로즈	피스칼레이즈	KH-15	파파인
단백질 회수율(%)	52.3±3.2	54.5±4.5	46.7±4.7	44.5±5.4	48.9±8.9	50.4±5.0	53.9±5.0	51.3±2.4

<실험예 3> 효모 가수분해물의 지방 축적 저해 효과

지방세포에서의 지방분해 효과

3T3-L1 전지방세포(preadipocytes)(ATCC#F8979, Manassas, VA)를 10% fetal bovine serum, 100 unit/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin이 함유된 DMEM 배양액을 사용하여 5% CO₂, incubator에서 배양하였다. 3, 4일 후 세포가 융합하게 되면 0.05% trypsin/EDTA를 처리하여 세포를 분리한 후 원심분리(1,000 rpm, 5 분)하여 세포를 모은 후, 세포 밀도가 3.3×10³ cell/cm² 되도록 suspension용액을 만들어 12 well plate에 1 ㎖씩 분주하여 2차 배양하였다. 3, 4일 후 세포가 융합되면, 분화배지(DMEM 배양액에 5 ㎍/㎖의 insulin, 0.25 μM dexamethazone, 0.5 mM IBMX가 첨가된 배지)를 첨가하여 분화를 유도하였다.

2일 간격으로 feeding medium(DMEM 배양액에 5 ㎍/㎖의 insulin만 포함된 배지)으로 배지를 갈아 주면서 지방세포로 분화시켰다. 분화배지 처리 후 약 10일이 경과하면 90% 이상이 지방세포로 분화하게 된다. 효모 가수분해물은 0.1%의 농도가 되게 feeding medium에 녹인 후 0.2 ㎛의 filter로 여과하여 완전히 분화된 지방세포에 처리하였다.

글리세롤 농도는 효소반응법으로 측정하였다. 37 ℃로 미리 가온해 둔 유리 글리세롤 시약 1 mL에 수집된 배양액 10 ㎕를 첨가하여 37 ℃의 수욕조에서 5분간 배양하였다. 글리세롤 정량을 위해서는 글리세롤 표준용액(Sigma) 12.5 μg과 25 μg을 시료와 동일한 방법으로 반응시킨 후 96-well plate에 200 ㎕을 취하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 지방 분해시 생성되는 글리세롤 농도는 대조군(효모 가수분해 효소 미첨가 군)과 비교시 프로타맥스 첨가군, 플라보자임 첨가군 및 KH-15 첨가군에서 각각 109.3%, 114.5% 및 116.8%로 다른 효모 가수분해물에 비하여 증가하였다. 반면, 프로리테르, 프로테아제 A, 에이로즈, 피스칼레이즈 및 파파인 투여군들의 경우 대조군과 큰 차이가 없었다(도 2).

지방세포에서의 지방 축적 저해 효과

렙틴은 지방세포의 비만 유전자에 의해 생성되는 호르몬으로 시상하부에 작용하여 음식섭취를 억제시키고 에너지소비를 증가시켜 비만을 조절하는 단백질로(Caro et al., 1996) 렙틴은 체지방량과 밀접한 연관관계가 있고(Considine et al., 1996), 혈중 렙틴 농도는 체지방량을 나타내는 지표로 알려져 최근의 비만 연구에서 많이 적용되고 있다. 렙틴은 지방세포 내의 지방 축적량이 증가할수록 렙틴의 분비량이 증가하는 것으로 알려져 있다(Considine et al., 1996). 따라서 렙틴양의 감소는 지방축적이 적다는 것을 의미한다.

지방세포로부터 분비된 렙틴의 양은 Enzyme Linked Immunosolvent Assay(ELISA) 방법을 이용하여 측정하였다. Rat anti-mouse leptin IgG 2 μg/mL를 Maxisorb ELISA plate(Nunc)에 넣어 하룻밤 배양한 후 PBS-T(0.05%의 Tween 20을 포함하는 PBS) 완충액으로 3차례 세척한 plate에 지방세포로부터 수집한 medium 100 ㎕을 배지에 첨가하여 1시간 동안 배양하였다. 다시 PBS-T로 3차례 세척한 후 biotinylated rabbit anti-mouse leptin IgG 200 μg/mL을 넣고 1시간 동안 상온에 둔 다음 다시 PBS-T로 3번 세척하였다. 이후 extravidin-horse radish peroxidase를 상온에서 1시간 동안 배양한 후 3번 세척하였다. Immunoreactivity를 측정하기 위하여 각 well에 100 ㎕의 tetramethylbenzidine dihydrochloride substrate(TMB)를 넣고 30분 동안 반응시킨 후 50 ㎕의 2 M H₂SO₄를 첨가하여 반응을 종료시키고 흡광도를 450 nm에서 측정하였다. 효모 가수분해물의 렙틴 분비량은 대조군과 비교하여 상대적인 값으로 나타내었다.

효모 가수분해물에 의한 지방세포에서의 렙틴함량을 측정한 결과(도 2), KH-15에 의한 효모 가수분해물 처리시 23.5%로 가장 낮은 렙틴 함량을 보였으며, 프로타맥스와 플라보자임 가수분해물은 58.7%와 35.7%의 함량을 보였다.

KH-15에 의한 효모가수분해물 첨가에 의한 글리세롤 농도가 유의적으로 증가하고 렙틴의 분비량이 큰 폭으로 감소한 것으로 보아, KH-15, 프로타맥스 및 플라보자임 효모 가수분해물은 지방 분해 효과와는 별도로 지방 축적을 억제하는 효과가 있으며, 양자는 서로 다른 기전에 의하여 이루어 지는 것으로 확인되었다. 또한 다른 효모 가수분해물에 비하여 특히 KH-15 효모 가수분해물의 비만 억제효과가 우수할 것으로 판단된다.

	대조군	프로타맥스	플라보자임	프로리테르
글리세롤 (%)	100.0±3.5	109.3±3.9	114.5±4.1	100.4±5.3
렙틴 (%)	100.0±2.7	58.7±5.8	35.7±3.7	90.6±4.5
프로테아제 A	에이로즈	피스칼레이즈	KH -15	파파인
99.8±3.3	105.4±4.3	103.5±3.4	121.8±2.8	101.1±1.5
89.7±2.7	75.9±4.3	65.8±5.8	23.5±3.5	93.3±5.3

<실험예 4> 효모 가수분해물의 세포독성

시료에 대한 세포 생존율은 MTT{3-(4,5-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylte trazolium bromide} colorimetric assay 방법으로 실험하였다(Camichael et al., 1978). 세포는 1×10⁵ cell/200 ㎕의 농도로 96 well plate에 분주하고 24시간 배양 후 배지를 제거하였다. 여기에 새로운 DMEM 배지 200 ㎕에 농도별로 희석한 시료를 각각 첨가하여 24시간 배양한 다음 2.5 mg/mL로 제조한 MTT용액 20 ㎕를 각 well에 가하고 4시간 동안 배양하였다. 배양종료 후 상등액을 제거하고 각 well에 100 ㎕의 DMSO를 첨가하여 생성된 formazan 결정을 용해시켜 microplate reader로 550 nm에서 흡광도를 측정하였고, 이때 세포 생존율은 다음과 같이 계산하여 나타내었다.

<식 1>

Cell viability (%)＝{100－(대조군의 흡광도－시료처리군의 흡광도)/대조군의 흡광도}×100

효모가수분해물을 지방으로 분화된 3T3-L1 세포주(adipocyte)에 농도를 달리하여 (50, 100 μg/mL) 24 시간 동안 처리하여 세포독성을 관찰한 결과 처리농도 구간 내에서는 독성이 관찰되지 않았으며 100 μg/mL의 처리시 550 nm에서의 흡광도의 증가는 시료 자체가 가지는 색에 기인한 것으로 세포의 과증식 효과는 없는 것으로 확인되었다. 따라서 이후 비만세포에 처리농도는 100 μg/mL로 설정하였다 (도 3). 효모가수분해물간의 약간의 차이는 있었으나, 이 결과로부터 효모 가수분해물은 100 μg/mL의 농도에서 지방세포에 대한 세포독성이 있지 않고, 지방세포의 증식시키거나 비만을 유도하지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.

농도 (㎍/mL)	대조군	프로타맥스	플라보자임	프로리테르
50	100.0±3.3	108.4±4.8	106.4±2.4	98.9±3.1
100	100.0±3.3	112.5±2.5	111.4±4.1	106.5±5.6
프로테아제 A	에이로즈	피스칼레이즈	KH -15	파파인
99.7±3.8	102.3±3.2	100.5±5.0	104.3±4.3	103.2±3.5
104.5±5.4	109.6±6.9	110.3±3.1	115.6±3.5	110.5±3.4

<실시예 3> 효모 KH-15 가수분해물의 활성

<실험예 1> 재료

효모 KH -15 가수분해물

실시예 2에서 항비만 효과가 가장 우수하였던 Bacillus sp. KH-15가 생산한 단백분해효소인 KH-15를 사용하여 제조한 효모가수분해물(Eatless)를 가지고 생리활성을 측정하였다.

실험동물 및 실험식이

실험동물은 체중 180-185 g 정도되는 S/D 수컷 쥐를 대한실험동물센타 (충북음성)로부터 구입하여 사용하였다. 식이 (표 2)와 물은 자유로이 섭취하도록 하였으며, 사육장 온도는 22℃ 그리고 습도는 40-60%로 유지하였고, 명암은 12시간을 주기로 조명하였다.

쥐들은 2개의 군으로 나누어, 실험군 1은 고지방식이군 (대조군), 실험군 2는 고지방 식이 및 효모 KH-15 가수분해물의 경구투여군 (100 mg/kg)으로 나누어 각 군마다 8마리씩 나누어 실험을 진행하였다. 경구투여는 24일 동안 실시하였다.

Nutrient	고지방 식이(g/100g diet )
Casein	20
Corn starch	32.3
Sucrose	10
Lard	20
Soybean oil	10
Mineral mixture1	3.5
Vitamine mixture2	1
Cellulose	3
DL-methionine	0.2
Total energy(kcal)	519.2
Percent of calories ( per total energy )
Fat	52
Carbohydrate	32.6
Protein	15.4

SD 래트의 식이 조성

<실험예 2> 효모 KH-15 가수분해물이 래트의 혈중 지질에 미치는 영향

혈청내의 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, 중성지질농도는 효소법에 의해 kit시약으로 분석하였다.

효모 KH-15 가수분해물을 24일간 경구 투여한 후 혈청내의 지질의 변화를 측정한 결과 (표 6), 체지방 축적의 원인 물질인 중성지질은 대조군인 고지방 식이군이 96.28 mg/dl인 반면 효모 KH-15 가수분해물을 투여한 경우 80.07 mg/dl으로 차이를 보였으나 통계적으로 유의차를 보이지 않았다.

그러나 총 콜레스테롤의 경우 대조군이 효모 KH-15 가수분해물 투여군에 비해 높은 수치를 보였으며, HDL-콜레스테롤의 경우에는 효모 KH-15 가수분해물 투여군이 고지방식이군에 비해 34%정도 높은 수치를 보였다. 따라서 효모 KH-15 가수분해물 투여군은 총 콜레스테롤의 수치가 낮고 HDL-콜레스테롤의 수치가 높음에 따라 동맥경화 발병율을 낮출 수 있다.

이상의 실험 결과에 의하면 효모 KH-15 가수분해물은 체중감소, 체지방감소 효과를 보임에 따라 비만억제 또는 치료 효과를 가지고 있음을 확인하였다.

Group	중성지방 (mg/dl)	총 콜레스테롤(mg/dl)	HDL 콜레스테롤(mg/dl)	HTR
대조군	96.28 ± 11.31	102.45 ± 4.94	56.42 ± 2.62	0.58 ± 0.04
효모 KH-15 가수분해물 투여군	80.07 ± 9.98	86.87 ± 5.11^*	75.70 ± 2.79^**	0.85 ± 0.04^**

스튜던트 t-검정(Students t-test)에 의할 때 대조군에 대하여 유의한 차이를 보임(*p<0.05, **p<0.01)

HTR=HDL 콜레스테롤/총 콜레스테롤

<실험예 3> 효모 KH-15 가수분해물의 항산화 활성

효모 KH -15 가수분해물의 DPPH 라디칼와 ABTS 라디칼 소거능

DPPH 라디컬 소거능 측정은 Cheung 등(2003)의 방법을 이용하였다. DPPH을 ethanol에 용해시킨 0.2 mM DPPH 용액 0.4 mL와 시료 0.1 mL을 암소에서 10분간 반응시킨 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였다.

ABTS 라디컬 소거능 측정은 Re 등(1999)의 방법을 이용하였다. 7 mM ABTS에 2.45 mM potassium persulfate을 첨가하여 암소에서 실온으로 12-16시간 방치한 후 414 nm에서 흡광도가 1.4-1.5가 되도록 증류수로 희석시켰다. 간 조직 시료 12.5 ㎕에 희석된 ABTS radical 용액 250 ㎕를 넣어 암소에서 60분간 반응시키고 414 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 및 ABTS 라디컬 소거능(%)은 다음과 같이 계산하였다.

<식 2>

라디칼 소거 활성(%) = (1 - A_sample/A_대조군) × 100

A_sample: with sample, A_대조군: without sample

효모 KH-15 가수분해물의 DPPH라디칼와 ABTS라디칼 소거능은 도 4에서처럼 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였으며, 라디칼의 50% 소거에 필요한 IC₅₀값은 19.1 mg/ml 과 9.0 mg/ml였는바 비교적 높은 수준의 라디칼 소거능을 가지고 있음을 확인하였다. 따라서 효모 KH-15 가수분해물을 사료에 첨가 시 항산화 활성을 기대할 수 있을 것이다.

효모 KH -15 가수분해물이 환원형 글루타티온 및 과산화지질에 미치는 영향

산소 유리기(oxygen free radical)는 산소를 이용하여 생존하는 세포 내에서 생성되는 독성이 강한 물질로서 세포의 DNA나 세포막 지질 및 단백질 등을 손상시키므로 세포 내에서는 superoxide dismutase(SOD), catalase, glutathione peroxidase 등의 항산화 효소와 glutathione, uric acid 등의 여러 가지 비효소적 항산화 물질이 있어 산소 유리기에 의한 산화적 손상으로부터 각종 세포 구조물을 보호한다. SOD는 유리산소를 H₂O₂와 O₂로 전환시키며, 생성된 H₂O₂ catalase와 glutathione peroxidase에 의해 소거되는데 glutathione peroxidase는 환원형 glutathione(GSH)을 산화형 glutathione (GSSG)으로 산화 시키면서 H2O2를 제거하며 GSSG 는 glutathione reductase에 의해 다시 GSH로 환원되어 인체 내에서 glutathione은 GSH와 GSSG의 두 가지 형태로 균형을 이루면서 존재하게 된다. 만약 세포 내에 독성 또는 산화적 손상이 일어난 경우에는 GSSG가 서서히 증가하게 되어 GSH/GSSG의 불균형을 초래하게 되어 방어 기전으로서의 역할이 소실된다. GSH는 산소유리기에 의한 세포 손상을 방지하고 세포 내 해독 작용을 담당하는 중요한 물질로 여겨지고 있다. 따라서 건강한 개체의 세포는 산화적 세포손상을 일으킬 수 있는 산소 유리기를 소거하는 방어기전에 의해서 충분히 보호받을 수 있다(De Haan et al., 1995).

Tietz(1969)의 방법을 이용하여 혈액내 환원형 글루타티온 함량을 측정하였다. 혈장에 동량의 5% sulfosalicylic acid를 첨가하고 4 ℃, 2,000 × g에서 10분간 원심 분리를 하였다. 상징액 100 ㎕에 0.3 mM Na₂HPO₄ 800 ㎕와 0.1% sodium citrate에 0.04%가 되도록 5,5'-dithiobis 2-nitrobenzoic acid(DTNB)을 섞은 용액 100 ㎕를 첨가하고 5분 후 412 nm에서 흡광도를 측정하였으며 환원형 글루타티온을 표준물질로 하여 정량하였다.

Quintanilha 등(1982)의 방법을 이용하여　혈액 내 과산화 지질 수준을 측정하였다. 혈장 100 ㎕에 10% trichloroacetic acid 200 ㎕를 넣고 15분간 실온에서 방치한 후 4℃, 2,200 × g에서 15분간 원심 분리를 하였다. 상징액 200 ㎕에 0.67% thiobarbituric acid 200 ㎕를 첨가하여 혼합한 다음 100℃의 항온 수조에서 10분간 반응시키고 냉각하여 532 nm에서 흡광도를 측정하였으며 malondialdehyde(MDA)을 표준물질로 하여 정량하였다.

효모 KH-15 가수분해물을 경구 투여시킨 SD rat의 간과 혈액 내에서의 GSH양을 측정한 결과는 표 7과 같다. 혈액 내 존재하는 지질이 산화되어 생성되는 산화생성물인 MDA(malondialdehyde)의 함량이 높을수록 산화 스트레스가 큰데, 대조군과 효모 KH-15 가수분해물 투여군에서의 MDA함량을 측정한 결과 12.0과 9.0 μmol/g였는바, 효모 KH-15 가수분해물의 경구 투여시 산화 생성물인 MDA가 적게 생성되는 것을 확인하였다. 또한 혈액과 간에서의 항산화 활성에 관여하는 환원형 GSH(glutathione sulfate) 함량은 대조군에 비하여 효모 KH-15 가수분해물 경구 투여군이 437.4 μmol/L와 6.7 mmol/L로 높은 함량을 보였다. 효모 KH-15 가수분해물을 경구 투여함에 따라 항산화에 관여하는 GSH의 함량의 증가와 더불어 산화 생성물인 MDA감소를 확인하였다. 이는 효모 KH-15 가수분해물이 항비만 효과뿐만 아니라 여러 질병의 원인 물질인 라디칼 소거능이 있다는 것을 의미한다.

Group	MDA	GSH
Group	Liver (μmol/g)	Serum (μmol/mL)	Liver (mmol/g)
대조군	12.0±3.7^b	253.3±52.1^b	4.6±0.9^b
효모 KH-15 가수분해물 투여군	9.0±1.7^a	437.4±223.7^a	6.7±1.2^a

효모 KH-15 가수분해물 투여시 간과 혈액에서의 MDA 및 GSH 함량

<실험예 3> 효모 KH-15 가수분해물이 지방 축적 및 비만에 미치는 영향

체중 증가량 및 식이 섭취율

고지방식이를 한 쥐와 효모 KH-15 가수분해물을 경구 투여 (100 mg/kg, 24일 투여)한 쥐들 사이의 체중 증가량을 측정한 결과, 경구투여 12일 이후부터 고지방 식이군과 효모 KH-15 가수분해물 투여군 사이에 체중 증가량이 유의적 차이를 보이며, 효모 KH-15 가수분해물 투여군의 체중 증가량이 적은 것이 확인되었다(도 5).

한편, 일일 평균 체중 증가량을 측정한 결과 (표 8), 효모 KH-15 가수분해물을 경구 투여한 경우 대조군에 비해 체중 증가량이 5.63 g으로 적게 증가하였다. 또한 효모 KH-15 가수분해물 경구투여군이 대조군에 비하여 식이 섭취량이 다소 적은 것으로 확인되었으나 유의적인 수준은 아니었다. 그러나 효모 KH-15 가수분해물 섭취군의 체중 증가량이 적은바, 사료 섭취 효율이 감소하는 것으로 확인되었다.

효모 KH-15 가수분해물을 24일간 경구 투여한 결과, 대조군에 비하여 체중 증가량이 뚜렷이 적었으며, 일일 평균 체중 증가량에서도 역시 뚜렷한 차이를 보임에 따라 비만예방 효과에 탁월할 것으로 예상되었다.

Group	식이 섭취량(g/day)	체중 증가량(g/day)	식이효율
대조군	17.36±0.46	7.28±0.76	0.42±0.04
효모 KH-15 가수분해물 투여군	17.21±0.60	5.63±0.63	0.33±0.04

8 마리 래트에 대한 ± 표준편차 값.

식이효율(체중 증가량 (g/day)/ 식이 섭취량(g/day))

체지방 감소효과

각 실험군의 장기무게의 변화를 측정한 결과, 간, 비장과 신장 장기간의 중량 변화는 유의적 차이가 없었으나, 생식기 주변의 지방 (epididymal fat pad)과 신장주변의 지방 (perirenal fat pad)은 대조군의 경우 5.38 g과 3.78 g인 반면 효모 KH-15 가수분해물 경구투여군의 경우 4.38 g과 3.05 g의 지방 함량을 보였다.

또한 체중에서 지방이 차지하는 비율을 측정한 결과 (도 6), 생식기 주변의 지방 (epididymal fat pad)과 신장 주변의 지방 (perirenal fat pad)은 고지방식이를 한 군의 경우 1.46%와 1.03%의 지방 함량을 보인 반면, 효모 KH-15 가수분해물을 경구 투여한 군의 경우 1.21%와 0.85%의 지방 함량을 보임에 따라 효모 KH-15 가수분해물을 경구 투여한 경우 대조군에 비해 생식기 주변의 지방과 신장주변의 지방 함량이 17.1%와 17.5% 감소하였다.

그러므로 비만의 가장 큰 원인 물질인 지방의 축적이 효모 KH-15 가수분해물을 투여한 경우 상당히 많은 양이 감소됨을 확인하였다.

<실시예 4> 효모 KH-15 가수분해물의 활성

<실험예 1> 재료

효모 KH -15 가수분해물

이상의 결과에 의해 항비만 효과가 가장 우수하였던 바실러스 균 KH-15가 생산한 단백분해효소 KH-15를 사용하여 제조한 효모 KH-15 가수분해물(Eatless)를 이용하여 생리활성을 측정하였다.

실험동물 및 실험식이

개(비글(beagle)) (2-5년)을 표준사료(퓨리나제조)와 물은 자유로이 섭취하도록 하였으며, 사육장 온도는 24℃ 그리고 습도는 40-60%로 유지하였고, 명암은 12시간을 주기로 조명하였다. 효모가수분해물이 들어 있는 캡슐을 100 mg/kg에 해당되는 양을 경구투여 하였다. Beagle을 3군(대조군, 실험군 1, 실험군 2)으로 분류하였으며, 군당 5마리를 사용하였다. 대조군은 표준사료 급여, 실험군 1은 30일 동안 표준사료 및 효모 KH-15 가수분해물을 경구투여하고(100 mg/kg), 실험군 2는 초기 10일은 표준사료, 11-20일 이에는 표준사료 및 효모 KH-15 가수분해물을(100 mg/kg), 21-30일 사이에는 표준사료를 각각 급여하였다. 각 군간의 사료 섭취는 다음과 같으며(표 9), 효모 KH-15 가수분해물에 대하여 개의 최초 밀착성이 상당히 좋았는바, 사료 첨가물로 적합할 것으로 보인다.

그룹	1일차-10일차	11일차-20일차	21일차-30일차
대조군	표준사료	표준사료	표준사료
실험군 1 (Eatless-A)	표준사료+효모 KH-15 가수분해물	표준사료+ 효모 KH-15 가수분해물	표준사료+ 효모 KH-15 가수분해물
실험군 2 (Eatless-B)	표준사료	표준사료+ 효모 KH-15 가수분해물	표준사료

실험군의 사료섭취형태

<실험예 2> 효모 KH-15 가수분해물이 지방 축적 및 비만에 미치는 영향

체중 증가

30일 동안 표준사료, 효모 KH-15 가수분해물을 각각 경구 투여하여, 실험 전, 실험시작 10, 20, 30일 후에 체중 증가량을 측정한 결과(도 7), 대조군은 실험기간이 경과할수록 체중이 증가하는 경향을 보여 10, 20, 30일에서의 체중 증가량은 각각 0.88, 1.46, 3.06 kg의 증가량을 보였다. 반면 실험군 1(Eatless-A)에서는 30일 경과 후 0.2 kg의 체중 증가량을 보였으며, 실험군 2(Eatless-B)에서는 오히려 1.64 kg의 체중 감소량을 보였다.

복부 둘레

복부 둘레를 측정한 결과(도 8), 표준사료만 섭취한 대조군에서는 체중의 증가량과 더불어 복부 둘레도 10일째는 2.2 cm, 20일과 30일째는 2.86과 3.43 cm 의 증가를 보인 반면, 실험군 1에서는 30일째 1.8 cm가 감소하였으며, 실험군 2에서는 30일째에 복부 둘레의 변화가 없었다.

이상의 결과에 의하면 투여 방법에 따라 약간의 차이는 있으나, 효모 KH-15 가수분해물의 경구 투여시 체중의 증가를 방지하고 체중 감소를 유도할 수 있는 기능을 가지고 있음을 확인하였다.

<실험예 3> 효모 KH-15 가수분해물 투여 후 혈중 지표 측정

전술한 바와 같이, 효모 KH-15 가수분해물의 경구투여는 체중증가를 억제 또는 오히려 감소시키는 효과가 있음을 확인하였는데, 이는 효모 KH-15 가수분해물이 지닌 독성에 기인할 수 있으므로 혈액을 채취하여 애견 건강 점검 시 측정하는 몇 가지 혈액 내 성분을 측정하였다(표 10, 11).

효소법에 의해 키트 시약으로 혈청내의 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, 중성지질농도를 분석하였다. 혈액 내에서의 적혈구, 백혈구 및 헤모글로빈의 수치를 확인한 결과(표 10), 대조군과 효모 KH-15 가수분해물 경구투여군인 실험군 1, 2에서 지표는 정상적인 수치를 보이고 있음을 확인하였다.

지표	대조군	실험군 1	실험군 2	정상 범위
적혈구(10¹²/L)	6.0±0.1	5.8±0.3	6.3±0.2	4.7-7.1
백혈구(10⁹/L)	7.2±0.4	8.3±0.4	7.9±0.4	5-12
헤모글로빈(g/100 mL)	13.0±0.7	13.5±0.45	12.7±0.6	9-15

개의 혈액내 적혈구, 백혈구 및 헤모글로빈 함량

또한 혈장에서의 콜레스테롤, 알부민, ALT(alanine aminotrasferase) 등을 측정하였다(표 11). 혈장 내에 지표성분 등을 측정한 결과, 콜레스테롤, 알부민, 단백질의 함량은 각군 모두 정상 수치를 보였다. 특히 간 손상의 지표인 ALT 수치 역시 각군마다 정상 수준임을 확인하였다. 이는 효모 KH-15 가수분해물을 경구 투여시 체중 감소를 보였던 실험군 2의 경우 효모 KH-15 가수분해물 투여군에 의한 독성에 기인한 효과가 아니라는 것을 간접적으로 확인할 수 있는 결과로, 표 7, 8에서 측정된 다른 수치와 비교 시 여러 지표가 정상 범위 내에 속하므로 이러한 체중 감소는 효모 KH-15 가수분해물의 항비만 활성에 기인하는 것으로 보인다.

지표	대조군	실험군 1	실험군 2	정상 범위
총 콜레스테롤(mmol/L)	3.68±0.8	3.41±0.78	3.54±0.43	3.5-7.25
총 단백질 (g/L)	54.6±2.1	56.8±1.8	53.8±1.2	50-62
알부민(g/L)	32.1±0.9	31.5±1.4	30.8±2.1	27-38
글로뷸린(g/L)	22.3±2.1	25.7±0.9	24.6±1.6	17-30
Alanine aminotransferase (U/L)	28.0±4.5	34.5±2.7	36.7±3.5	0-77
Alkaline phosphatase (U/L)	90.4±8.9	99.5±5.6	100.2±6.2	0-174

개의 혈장에서의 생화학적 지표

<실험예 4> 효모 KH-15 가수분해물의 항산화 활성

혈액 내에서 항산화 활성의 지표인 MDA와 GSH함량을 각각 측정한 결과, 산화생성물인 MDA(malondialdehyde)의 함량은 대조군 군이 278.4 μmol/L로 높은 수치를 보인 반면, 효모 KH-15 가수분해물 투여군인 실험군 1, 2는 각각 213.6과 224.4 μmol/L로 낮은 수치를 보였다. 또한 항산화 활성물질인 GSH 함량은 대조군이 2.0 mmol/L인 반면, 실험군 1, 2는 각각 2.7과 2.6 mmol/L으로 다소 높은 함량을 보였다(도 9).

본 발명의 효모 가수분해물은 체내 지방축적을 저해함으로써 체중을 조절하고 비만을 예방 및 치료한다. 또한 본 발명의 효모 가수분해물은 항산화 활성을 갖는다. 그러므로 본 발명의 효모 가수분해물은 비만, 산화적 손상 등과 관련된 여러 질환을 예방 및 치료하는데 효과적이며, 이는 식품, 의약, 사료 등에 이용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 KH-15의 효모(Saccharomyces cerevisiae) 가수분해물을 유효성분으로 포함하며, 지방 분해 촉진 및 지방 축적 저해 활성을 갖는 비만 개선 및 예방용 식품 조성물.
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 KH-15의 효모(Saccharomyces cerevisiae) 가수분해물을 유효성분으로 포함하며, 지방 분해 촉진 및 지방 축적 저해 활성을 갖는 비만 개선 및 예방용 사료 조성물.
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 KH-15의 효모(Saccharomyces cerevisiae) 가수분해물을 유효성분으로 포함하며, 항산화 활성을 갖는 화장료 조성물.
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 KH-15의 효모(Saccharomyces cerevisiae) 가수분해물을 유효성분으로 포함하며, 지방 분해 촉진 및 지방 축적 저해 활성을 갖는, 동맥경화, 내장비만, 복부비만, 고지혈증, 지방간 및 비만으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 2항의 사료 조성물을 동물에 투여하는 단계를 포함하는 동물의 비만 개선 및 예방 방법.
제 4항의 약학적 조성물을 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 동물의 동맥경화, 내장비만, 복부비만, 고지혈증, 지방간 및 비만으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 예방 또는 치료하는 방법.
효모(Saccharomyces cerevisiae)에 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 KH-15를 처리하는 단계를 포함하는, 지방 분해 촉진 및 지방 축적 저해 활성을 갖는 비만 개선 및 예방용 식품 조성물의 제조 방법.
효모(Saccharomyces cerevisiae)에 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 KH-15를 처리하는 단계를 포함하는, 지방 분해 촉진 및 지방 축적 저해 활성을 갖는 비만 개선 및 예방용 사료 조성물의 제조 방법.
효모(Saccharomyces cerevisiae)에 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 KH-15를 처리하는 단계를 포함하는, 항산화 활성을 갖는 화장료 조성물의 제조 방법.
효모(Saccharomyces cerevisiae)에 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 KH-15를 처리하는 단계를 포함하는, 지방 분해 촉진 및 지방 축적 저해 활성을 갖는, 동맥경화, 내장비만, 복부비만, 고지혈증, 지방간 및 비만으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 예방 및 치료용 약학적 조성물의 제조 방법.
삭제