KR20130140215A - 펩티드 - Google Patents

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KR20130140215A
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유키코 쿠니에다
사토시 히구라시
무츄미 모토우리
히로아키 마츄야마
아츄시 세리자와
히로시 카와카미
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유키지루시 메그밀크 가부시키가이샤
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Abstract

항산화 효과 및 아디포넥틴의 생산 촉진 효과가 있는 His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln, His-Pro-Ile-Lys 혹은 His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 유효 성분으로 하는 항산화제 및 이 항산화제를 배합한 음식품, 아디포넥틴의 생산 촉진제 및 이 생산 촉진제를 배합한 음식품. 또한, 치즈에 포함되는 성분을 유효 성분으로 하는 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제제, 혹은 치즈에 포함되는 유효 성분을 배합한 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제용 음식품.

Description

펩티드{PEPTIDE}
본 발명은 유단백질에서 유래하는 항산화 작용을 갖는 펩티드, 이 펩티드를 유효 성분으로 하는 항산화제 및 이 펩티드를 배합한 항산화용 음식품 또는 사료에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 유단백질에서 유래하는 아디포넥틴 생산 촉진 작용을 갖는 펩티드, 이 펩티드를 유효 성분으로 하는 아디포넥틴 생산 촉진제 및 이 펩티드를 배합한 아디포넥틴 생산 촉진용 음식품 또는 사료에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 치즈에 포함되는 성분을 유효 성분으로 하는 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제제, 혹은 치즈에 포함되는 성분을 배합한 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제용 음식품에 관한 것이다.
불포화 지방산의 산화에 의해 생기는 과산화물이나 프리라디칼은, 식품의 풍미나 영양가 등을 손상하여, 품질의 열화를 야기할 뿐만 아니라, 생체에 있어서는, 그 강한 산화력에 의해 세포 내의 단백질이나 유전자 DNA를 훼손하며, 세포막을 구성하는 지질을 공격하여, 독성이 강한 하이드로퍼옥사이드 등의 과산화 지질을 제조하고, 세포 손상이나 조직 장해를 야기한다고 되어 있다. 이러한 활성 산소나 프리라디칼에 의한 생체로의 유해한 작용의 축적이, 노화를 촉진하거나, 암이나 동맥 경화, 심장병을 비롯한, 소위 생활 습관병의 원인 중 하나로서 관계가 있는 것이 분명하게 되어 왔다. 특히 생활 습관병은 식생활과 밀접한 관계가 있기 때문에, 식사 내용의 개선에 의한 질병 예방의 중요성이 주목되고 있다. 그 때문에, 식품 성분에 의한 산화 스트레스의 방지나 억제의 관점에서, 식품의 항산화성과 식품 성분의 관계에 관한 연구나 항산화성을 갖는 성분의 탐색이 행하여지고 있다.
항산화성을 갖는 성분에 관해서는, 식물 유래의 비타민이나 폴리페놀 등이 이전부터 알려져 있다. 비타민에 관해서는 많은 보고가 있으며, 특히 비타민 C, 비타민 E 및 β-카로틴 등에 항산화성이 인정되어 있다. 또한, 폴리페놀에 대해서는, 카테킨류나 후라보노이드류 등이 강한 항산화성을 갖는 것이 밝혀져 있다. 또한, 단백질의 프로테아제 가수분해물로부터도 다종 다양한 항산화 펩티드가 분리·동정(identification)되어 있으며, 난백알부민의 효소 분해물로부터 3종류의 항산화 펩티드를 분리하였다는 보고가 있다(예컨대, 비특허문헌 1 참조). 또한, 대두단백질의 β-콘글리시닌(conglycinin)의 프로테아제 가수분해물로부터, 6종류의 항산화 펩티드를 분리·동정하였다는 보고도 있다(예컨대, 비특허문헌 2 참조).
한편, 유단백질의 효소 분해물에 대해서는 오피오이드(opioid) 활성 작용, 칼슘 흡수 촉진 작용, 세포 증식 작용, 항균 작용, 앤지오텐신I 변환 효소 저해 작용 등, 많은 생리 작용이 밝혀져 있다. 어유 등의 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid) 함유 유지를 수용성 단백질 용액에 의해 유화(乳化)하여 어유 냄새를 억제하는 방법(예컨대, 특허문헌 1 참조)이나, 고도 불포화 지방산 함유 유지를 유의 부분 가수분해물에 의해 유화하며, 산화 안정성이 높은 고도 불포화 지방산 함유 유지의 분말을 얻는 방법(예컨대, 특허문헌 2 참조)이 개시되어 있다. 또한, 고도 불포화 지방산 함유 유지, 치즈 및 물을 유화시켜 항산화 유화물을 조제하여, 고도 불포화 지방산 함유 유지의 산화를 방지하며, 고도 불포화 지방산 함유 어유 유래의 물고기 냄새나 보존 중의 이상한 냄새를 마스킹하는 방법(예컨대, 특허문헌 3 참조)이 개시되어 있다. 그러나, 이들은 모두 고도 불포화 지방산 함유 유지에, 수용성 단백질 용액, 유의 부분 가수분해물, 또는 치즈를 더하여 각각 유화시킨 고도 불포화 지방산 함유 유지의 유화물로서, 주체가 되는 고도 불포화 지방산 함유 유지 자체의 물고기 냄새나 보존 중의 이상한 냄새를 방지하는 것이다. 그러나, 고도 불포화 지방산 함유 유지와 혼합하여 유화시키는 일 없이, 유단백질 유래의 펩티드 단독으로 항산화성을 갖는다고 하는 보고는 많지 않다. 본 발명자들은 치즈의 수용성 펩티드 획분이 항산화 작용을 갖는 것을 발견하여, 특허출원을 행하였다(특허문헌 4 참조). 또한, 특정한 아미노산 서열을 갖는 펩티드가 항산화 작용을 갖는 것도 발견하였다(특허문헌 5 참조). 그러나, 이들 펩티드는 특히 곰팡이 숙성형 치즈에 많이 포함되는 것이다. 세계적으로 치즈의 생산량을 보면, 유산균만으로 숙성한 치즈는, 곰팡이 숙성형 치즈보다도 훨씬 많이 생산·소비되고 있다. 유산균만으로 숙성한 치즈는, 가공 치즈의 원료로서도 많이 이용된다. 이것으로부터, 유산균만으로 숙성한 치즈에서 높은 항산화 작용을 나타내는 펩티드 성분의 단리가 요구된다.
전술한 바와 같이, 활성 산소나 프리라디칼에 의한 생체로의 유해한 작용의 축적이, 소위 생활 습관병의 원인 중 하나로서 관계가 있는 것이 분명하지만, 고혈압, 고지혈증, 당뇨병 등의 생활 습관병 발증·진전의 위험 인자를 예방하는 것이 중요하다. 현재, 일본에서, 심질환 및 뇌혈관 질환에 의한 사망이, 해마다 증가하는 경향이 있으며, 심혈관 질환과 뇌혈관 질환에 의한 사망이 사인의 약 3분의 1을 차지하여, 이 대책이 국민적인 과제가 되어 있다. 이들 동맥 경화성 질환에 있어서는, 고혈압, 고지혈증, 내당능 장해 등의 리스크 요인이 한 개인에게 집적됨으로써 발증의 위험도가 현저히 상승하는 것이 알려져 있고, 이 리스크 요인의 집적된 상태는 대사 증후군(metabolic syndrome)이라고 불리며 널리 인식되어 왔다.
대사 증후군의 개념 중에서, 가장 중요시되고 있는 것이 내장 지방의 지나친 축적이다. 생체 최대의 분비 조직인 지방 조직은, 여러 가지 내분비 인자를 생산하며, 생체에 있어서의 항상성의 유지에 관여하고 있다. 그러나 내장 지방의 지나친 축적에 따라, 내분비 인자의 분비 밸런스가 무너져, 여러 가지 병의 형태로 이어져 간다고 생각된다. 지방 조직은 지금까지, 에너지 저장고로서의 역할밖에 고려되고 있지 않았지만, 생활 습관병을 중심으로 한 대사 이상 증후군의 병의 형태를 고려한 지방 조직의 중요성이, 최근 주목받게 되었다. 즉, 지방 조직은 플러스미노겐액티베이터인히비터, 종양 괴사 인자(TNF-α), 렙틴, 아디포넥틴 등의 내분비 인자를 분비하며, 생체의 호메오스타시스의 유지에 기여하고 있지만, 그 생산, 분비의 과잉 혹은 과소라고 하는 밸런스의 혼란이, 당·지질 대사 이상, 고혈압, 동맥 경화의 발증·진전에 깊게 관여하고 있는 것이 밝혀져 왔다.
지방 조직에 유래하는 내분비 인자 중 하나인 아디포넥틴(adiponectin)은 244개의 아미노산으로 이루어지는, 30 kDa의 호르몬으로, 동맥 경화 억제 작용 등 외에, 간장이나 근육에서의 지방 연소를 촉진하는 효과가 있다. 또한, 아디포넥틴에는 혈액 내의 포도당과 지방산이 세포 내에 취득되는 것을 촉진하는 작용을 가지고 있는 것이 밝혀졌다. 근육이나 간장 등에 지방이 축적되면, 당분의 취득이 나빠져 당뇨병으로 이어진다. 그러나, 통상, 아디포넥틴은 일시적으로 과잉된 지방이나 당분을 분해함으로써, 체내의 영양 밸런스를 유지한다고 여겨지며, 비만이 진행되면, 아디포넥틴을 분비하는 지방 세포의 작용이 약해져, 체내의 영양 밸런스가 무너지게 된다.
지방 조직이 특이적으로 분비하는 아디포넥틴은 통상 혈중에 고농도로 존재하지만, 내장 지방이 축적됨에 따라 분비가 감소해 가는 것으로 알려져 있다. 아디포넥틴은, 항당뇨병, 항동맥 경화, 항염증, 항고혈압 등 여러 가지 생리 기능을 갖는다고 알려져 있으며, 혈중에서, 아디포넥틴 농도의 증가를 촉진하는 것, 혹은 아디포넥틴 농도의 감소를 억제하는 것은, 대사 증후군을 치료하는 데 매우 중요하다.
종래, 대사 증후군의 개개의 병의 형태에의 대책으로서 약품 요법도 행하여지고 있지만, 처방이 필요하거나 부작용이 수반되는 등의 문제가 있다. 또한, 하나의 병의 형태에 대한 치료를 행하여도, 그 밖의 병의 형태가 계기가 되어 위독한 병의 형태로 발전하는 것이 발견되었으며, 이들 상태의 상류에 존재하는 지방 세포 유래의 내분비 인자의 분비 밸런스를 갖추는 것이 필요하게 된다. 또한, 내장 지방의 축적에 기인하는 대사 증후군의 치료에는, 약품 요법보다도 운동 요법이나 식사 요법 등 일상 생활을 재점검하는 것이 중요하다고 되어 있다. 그래서, 일상적으로 섭취할 수 있으며, 장기간에 걸쳐 섭취하여도 안정성이 높고, 내장 지방의 축적에 기인하는 대사 증후군의 치료에 유효한 음식품이 요구되고 있다.
최근에는, 합성 의약품에 의한 치료보다는, 식생활을 통하여 병의 증상의 진전을 될 수 있는 한 억제하는 것과 같은 기능을 갖는 식품 성분에 대한 연구도 주목받고 있다.
아디포넥틴에 관해서는, 아디포넥틴에 의한 간선유화 억제나 정상 간세포 증식 촉진 효과나 항염증 효과(예컨대, 특허문헌 6 참조)가 알려져 있으며, 음식물 유래의 아디포넥틴 생산 촉진물로서는 발효차 추출물을 유효 성분으로 하는 조성물(예컨대, 특허문헌 7 참조), 암라(amla)라고 하는 여우구슬(Phyllanthus urinaria)에 속하는 낙엽의 아고목(亞高木) 추출물로 이루어지는 혈중 지방 조직 특이 분비 단백 증강 조성물(예컨대, 특허문헌 8 참조)이 개시되어 있다.
한편, 치즈는 고지방 함유 식품임에도 불구하고, 혈중 트리글리세이드 농도의 저하 촉진 작용이나 콜레스테롤 대사의 개선 작용을 갖는다고 보고되어 있다(특허문헌 9, 특허문헌 10). 그러나, 치즈의 기능으로서, 혈중 아디포넥틴 농도의 증가를 촉진하는 작용, 혹은 혈중 아디포넥틴 농도의 감소를 억제하는 작용에 대해서는, 조금도 알려져 있지 않다.
[특허문헌 1] 일본 특허 공개 소화 제60-102168호 공보
[특허문헌 2] 일본 특허 공개 평성 제2-305898호 공보
[특허문헌 3] 일본 특허 공개 평성 제7-274823호 공보
[특허문헌 4] 일본 특허 공개 제2004-352958호
[특허문헌 5] 일본 특허 출원 제2005-294358호
[특허문헌 6] 일본 특허 공개 제2000-256208호 공보
[특허문헌 7] 일본 특허 공개 제2002-363094호 공보
[특허문헌 8] 일본 특허 공개 제2006-56836호 공보
[특허문헌 9] 일본 특허 공개 제2003-300890호 공보
[특허문헌 10] 일본 특허 공개 제2003-144090호 공보
[비특허문헌 1] 쓰게 노부아키 등, 일본 농예 화학 회지, 65호, p.1635, 1991년
[비특허문헌 2] 에이치·엠·체인 등(Chen, H.M.et al.), 저널·애그리컬쳐럴·앤드·후드·케미스트리(J.Agric.Food Chem.), 43호, p.574, 1995년
본 발명은 식품의 풍미나 영양가 등을 손상하여, 품질의 열화를 야기할 뿐만 아니라, 생체에 있어서는 질병이나 노화 등에 악영향을 끼치는 활성 산소나 프리라디칼 등에 의한 생체의 산화적 장해를 억제하는 데 유효한 항산화 작용을 갖는 펩티드를 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 본 발명은 생체에 있어서 아디포넥틴의 생산을 촉진시킴으로써, 동맥 경화를 억제하며, 간장이나 근육에서의 지방의 연소를 촉진하는 펩티드를 제공하는 것을 과제로 한다.
또한, 본 발명은 이것을 섭취함으로써 혈중 아디포넥틴 농도의 증가 촉진, 혹은 감소 억제에 유용하며, 더구나, 일상적인 섭취가 가능한 치즈에 포함되는 성분을 유효 성분으로 하는 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제제, 혹은 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제용 음식품을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하도록 예의 연구를 거듭한 결과, 다음 식 (1) ∼ 식 (3)으로 나타내는 것 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드에 항산화 효과가 있으며, 더구나 저용량으로 효과를 갖는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln 식 (1)
His-Pro-Ile-Lys 식 (2)
His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln 식 (3)
즉, 본 발명은 상기 식 (1) ∼ 식 (3) 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 항산화 작용을 갖는 펩티드에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 유단백질에서 유래하는 식 (1) ∼식 (3) 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 항산화 작용을 갖는 펩티드에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 식 (1) ∼ 식 (3) 중 어느 하나로 나타내는 1 이상의 펩티드를 유효 성분으로 하는 항산화제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 식 (1) ∼ 식 (3) 중 어느 하나로 나타내는 1 이상의 펩티드를 배합한 항산화용 음식품 또는 사료에 관한 것이다.
또한, 본 발명자들은 상기 식 (1)로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드는 아디포넥틴의 생산을 촉진하는 효과가 있으며, 더구나 저용량으로 효과를 갖는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 상기 식 (1)로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 아디포넥틴 생산 촉진 작용을 갖는 펩티드에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 유단백질에서 유래하는 식 (1)로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 아디포넥틴 생산 촉진 작용을 갖는 펩티드에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 식 (1)로 나타내는 펩티드를 유효 성분으로 하는 아디포넥틴 생산 촉진제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 식 (1)로 나타내는 펩티드를 배합한 아디포넥틴 생산 촉진용 음식품 또는 사료에 관한 것이다.
덧붙이면, 본 발명자들은 일상적으로 섭취가 가능한 식품 소재에 의해 생체의 여러 가지 기능 이상을 예방이나 개선할 수 없는 것인가라는 관점에서, 치즈에 포함되는 성분에 착안하여, 그 생리 기능을 확인하여 온바, 혈중 아디포넥틴 농도의 증가를 촉진하는 작용, 혹은 혈중 아디포넥틴 농도의 감소를 억제하는 작용을 발견하였다.
그리고, 이들의 생리 기능을 이용한 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제제, 혹은 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제용 음식품을 제공함으로써, 혈중 아디포넥틴 농도의 증가를 촉진하는 것, 혹은 혈중 아디포넥틴 농도의 감소를 억제할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 치즈에 포함되는 성분의 혈중 아디포넥틴 농도의 증가를 촉진하는 작용, 혹은 혈중 아디포넥틴 농도의 감소를 억제하는 작용을 이용하여, 치즈에 포함되는 성분을 유효 성분으로 하는 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제제, 혹은 치즈에 포함되는 성분을 배합한 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제용 음식품을 제공함으로써 과제를 해결할 수 있었다. 또한, 치즈에 포함되는 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제의 유효 성분에 대해서 예의 연구를 거듭한 결과, 유효 성분의 하나로서, 치즈에 포함되는 펩티드를 발견하기에 이르렀다.
본 발명의 식 (1) ∼ 식 (3) 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 항산화 작용을 갖는 펩티드는, 식품의 풍미나 영양가 등을 손상하여 품질의 열화를 야기할 뿐만 아니라, 생체에 있어서는 질병이나 노화 등에 악영향을 끼치는 활성 산소나 프리라디칼 등에 의한 생체의 산화적 장해를 억제하는 데 유효하며, 이 펩티드를 유효 성분으로 하는 항산화제로서, 또한, 이 펩티드를 배합한 항산화용 음식품 또는 사료로서 유용하다.
또한, 본 발명의 식 (1)로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 아디포넥틴 생산 촉진 작용을 갖는 펩티드는, 아디포넥틴의 생산을 촉진하는 데 유효하며, 이 펩티드를 유효 성분으로 하는 아디포넥틴 생산 촉진제로서, 또한, 이 펩티드를 배합한 아디포넥틴 생산 촉진용 음식품 또는 사료로서 유용하다.
또한, 본 발명의 치즈에 포함되는 성분을 유효 성분으로 하는 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제제나 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제용 음식품은, 이들을 섭취함으로써 혈중 아디포넥틴 농도의 증가를 촉진 및/또는 감소를 억제하기 때문에, 내장 지방의 지나친 축적을 억제하며, 혈전증, 인슐린 저항성, 당대사 이상, 고혈압 등의 대사 증후군의 치료 및 예방에 유효하다.
도 1은 고다 치즈를 원료로 하는 수용성 펩티드 획분의 분리 크로마토그램을 나타낸다(실시예 1).
도 2는 합성 펩티드 획분의 분리 크로마토그램을 나타낸다(실시예 2).
도 3은 합성 펩티드 획분의 항산화 활성 평가를 나타낸다(실시예 2, 시험예 2).
도 4는 트립신 소화 후의 펩티드 획분의 분리 크로마토그램을 나타낸다(실시예 3).
도 5는 트립신 소화 후의 펩티드 획분의 항산화 활성 평가를 나타낸다(실시예 3, 시험예 3).
도 6은 펩티드 농도의 차이에 의한 아디포넥틴 생산량(단위 DNA량당)을 나타낸다(실시예 1, 시험예 4).
도 7은 펩티드 농도의 차이에 의한 축적 지방량을 나타낸다(실시예 1, 시험예 4).
본 발명에 이용할 수 있는 His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln, His-Pro-Ile-Lys, 혹은 His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드는, 예컨대 치즈를 용매에 현탁한 후, 탈지, 원심 분리에 의해 불용성 물질을 제거하여 얻을 수 있다. 또한 그 얻어진 획분으로부터 단백질을 제거하여도 좋다. 본 발명에서 치즈를 용매에 현탁한다는 것은, 치즈에 용매를 더하여 균질화하거나, 또는 용매 내에서 파쇄하거나 하여, 수용성 펩티드 획분을 얻기 쉬운 크기로 하는 것을 말한다. 용매로서는, 물, 인산 완충액 등의 수성 용매를 이용할 수 있다. 그 후, 투석막이나 이온 교환 수지 등에 의해 탈염을 행하여도 좋으며, 또한, 동결 건조나 분무 건조 등에 의해 건조시킴으로써 분말화하여도 좋다.
*또한, 식 (1) ∼ 식 (3)으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 얻기 위한 치즈 원료, 또한, 본 발명의 치즈에 포함되는 성분을 유효 성분으로 하는 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제제나 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제용 음식품을 얻기 위한 치즈 원료로서는, 파르메산 치즈, 그뤼에르 치즈, 마리보 치즈, 고다 치즈, 체다 치즈, 에멘탈 치즈, 에담 치즈, 카망베르 치즈, 브리 치즈, 먼스터 치즈, 퐁·레벡 치즈, 스틸턴 치즈, 다나블루 치즈, 블루 치즈 등의 내추럴 치즈 및 이들 내추럴 치즈를 원료로 한 가공 치즈 등을 이용할 수 있지만, 식 (1) ∼식 (3)으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 얻기 위해서는, 숙성도가 진행된 유산균 숙성형 내추럴 치즈를 이용하는 것이 바람직하다. 이들 치즈 자체를 사용할 수도 있으며, 치즈를 용매에 현탁한 후, 탈지, 불용성 물질 제거, 단백질 제거 등을 행한 획분을 사용할 수도 있다. 또한, 이들 획분을 투석막이나 겔 여과, 이온 교환 등의 각종 크로마토그래피에 의해 정제한 획분을 사용할 수도 있다. 또한, 이들 획분에 대해서는, 농축이나 건조를 행하여 사용할 수도 있다.
또한, 치즈를 용매에 현탁한 후, 탈지, 불용성 물질의 제거 및 단백질의 제거에 의해 얻어지는 식 (1) ∼ 식 (3)으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 포함하는 획분은, C18 컬럼을 이용한 역상 크로마토그래피에 의해 더 정제하는 것도 가능하다. 본 펩티드를 포함하는 획분을 트리플루오로초산(TFA) 등의 산성 조건 하 혹은 증류수 등의 중성 조건 하에서 C18 컬럼에 통과시켰을 때에, 항산화 활성을 갖는 획분은, 컬럼에 흡착되지 않는 투과 획분과, 컬럼에 흡착되어 80％ 아세토니트릴로 용출되는 획분으로 주로 분리된다.
또한, 이 펩티드를 포함하는 획분을 증류수로 용해한 후, YMC-Pack ODS-A 컬럼(4.6 ㎜×150 ㎜; YMC사)을 이용하여 역상 HPLC에 제공하여 펩티드를 분획한다. 크로마토그래피는, 용매(A액: 50 mM 초산암모늄 수용액; B액: 80％ 아세토니트릴), 농도 경사(12％B→60％B, 60 min), 유속 0.8 ㎖/min, 검출 파장 215 ㎚의 조건에서 행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 식 (1) ∼ 식 (3)으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 및 이 펩티드를 포함하는 획분은, 음식품에 배합하여 음식품의 품질 열화 방지에 사용할 수 있다. 음식품에 배합하는 경우는, 치즈를 수중에서 마쇄한 후, 탈지, 원심 분리에 의해 불용성 물질의 제거를 행하고, 단백질을 더 제거함으로써 얻은 치즈의 수용성 펩티드를 그대로 배합할 수 있으며, 투석막이나 이온 교환 수지 등에 의해 탈염을 행한 것, 또한, 동결 건조나 분무 건조 등에 의해 건조를 행하여 분말화한 것도 배합할 수 있다. 또한, 합성하여 얻어진 펩티드도 이용 가능하다.
본 발명의 식 (1) ∼ 식 (3)으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 항산화 작용을 갖는 펩티드 및 이 펩티드를 포함하는 획분은, 경구 혹은 비경구적으로 투여하여, 생체에 있어서 활성 산소나 프리라디칼 등을 소거함으로써 질병이나 노화 등의 진행을 방지할 수 있다. 또한, 본 발명의 식 (1)로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 아디포넥틴 생산 촉진 작용을 갖는 펩티드 및 이 펩티드를 포함하는 획분은, 경구 혹은 비경구적으로 투여하여, 생체에 있어서 아디포넥틴 생산을 촉진함으로써 동맥 경화를 억제하며, 간장이나 근육에서의 지방의 연소를 촉진할 수 있다. 경구 혹은 비경구적으로 투여하는 경우, 본 발명의 항산화 작용나 아디포넥틴 생산 촉진 작용을 갖는 펩티드, 혹은, 치즈에 포함되는 성분을 유효 성분으로 하는 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제제의 제형으로서는, 정제, 캡슐제, 세립제, 산제, 환제, 정제, 설하제 또는 액제 등의 경구 투여용 제제, 혹은, 주사제, 좌제 등의 비경구 투여용 제제를 예시할 수 있다.
본 발명의 식 (1) ∼ 식 (3)으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 항산화 작용을 갖는 펩티드, 혹은 본 발명의 식 (1)로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 아디포넥틴 생산 촉진 작용을 갖는 펩티드의 경구에 의한 투여량은, 치료나 예방의 목적, 증상, 체중, 연령이나 성별 등을 고려하여 적절하게 결정하면 좋지만, 통상, 성인 1일당, 식 (1) ∼ 식 (3)으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 항산화 작용을 갖는 펩티드, 혹은 본 발명의 식 (1)로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 아디포넥틴 생산 촉진 작용을 갖는 펩티드로서 10 ㎍∼500 ㎎ 투여하면, 질병이나 노화 등에 악영향을 끼치는 활성 산소나 프리라디칼 등에 의한 생체의 산화적 장해를 억제하는, 혹은, 아디포넥틴 생산을 촉진하는 효과를 얻을 수 있다. 이와 같이 본 발명은 저용량으로 효과가 있다.
또한, 본 발명의 치즈에 포함되는 성분을 유효 성분으로 하는 혈중 아디포넥틴 증가 촉진 및/또는 감소 억제제나 혈중 아디포넥틴 증가 촉진 및/또는 감소 억제용 음식품의 투여량은, 치료나 예방의 목적, 증상, 체중, 연령이나 성별 등을 고려하여 적절하게 결정하면 좋지만, 성인의 경우, 1식당 20 g∼200 g 정도의 치즈에 상당하는 유효 성분을 섭취하도록 한다.
본 발명의 식 (1) ∼ 식 (3)으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드는, 이들을 배합한 음식품 또는 사료를 경구 섭취함으로써 생체 내에서 항산화 작용 혹은 아디포넥틴 생산 촉진 작용을 발휘할 뿐만 아니라, 음식품 또는 사료에 배합한 음식품 또는 사료 자체의 산화에 의한 열화도 방지한다.
또한, 본 발명의 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제제나 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제용 음식품은, 치즈에 포함되는 성분을 유효 성분으로 한다. 또한, 본 발명의 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제제나 혈중 아디포넥틴 증가 농도 촉진 및/또는 감소 억제용 음식품은, 치즈에 포함되는 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제 작용을 갖는 성분을 배합한다.
본 발명의 항산화용 혹은 아디포넥틴 생산 촉진용 음식품으로서, 또한, 치즈에 포함되는 성분을 유효 성분으로 하는 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제용 음식품으로서는, 치즈, 버터, 유음료, 청량 음료, 쥬스, 요구르트, 젤리, 빵, 아이스크림, 면, 소시지, 스낵 과자, 케익, 푸딩, 소시지, 육아용 조제유나 이유식 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 식 (1) ∼ 식 (3)으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 항산화 작용을 갖는 펩티드는, 각 펩티드 1종만을 유효 성분으로 하여 항산화제로 하거나, 1종만을 배합하여 항산화용 음식품 또는 사료로도 할 수 있지만, 각 펩티드 1종 이상을 유효 성분으로 하여 항산화제로 하거나, 1종 이상을 배합하여 항산화용 음식품 또는 사료로 할 수도 있다.
이하에 실시예 및 시험예를 나타내어, 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 이들은 단순히 예시일 뿐이며, 본 발명은 이들에 의해 조금도 한정되는 것이 아니다.
[실시예 1]
(고다 치즈의 펩티드의 조제)
고다 치즈 40 g에 증류수 160 ㎖를 더하여, 워링 블렌더(니혼세이키세이사쿠쇼)로 15분간 마쇄한 후, 폴리트롬 호모게나이저(키네마치카사)로 30초간 더 파쇄하였다. 파쇄 시에 생긴 유지방을 제거하며, 얻어진 치즈 슬러리로부터 원심 분리(6,000×g, 20 min, 4℃)로 불용물을 제거하고, 상청을 여과지(No.113; 왓토만사)에 의해 여과하였다. 얻어진 여과액에 에탄올을 70％ 농도가 되도록 더하여, 4℃에서 하룻밤 정치한 후, 원심 분리(9,000×g, 20 min, 4℃)에 의해 불용물을 제거하고, 증발관으로 에탄올을 제외한 후, 동결 건조하여 고다 치즈의 수용성 펩티드 획분을 얻었다.
이 수용성 펩티드 획분을 증류수로 용해한 후, YMC-Pack ODS-A 컬럼(YMC사; 4.6 ㎜×150 ㎜)을 이용하여 역상 HPLC에 제공하여, 수용성 펩티드 정제 획분으로 분획하였다. 크로마토그래피는, 용매(A액: 50 mM 초산암모늄 수용액; B액: 80％ 아세토니트릴), 농도 경사(12％B→60％B, 60 min), 유속 0.8 ㎖/min, 검출 파장 215 ㎚의 조건에서 행하였다. 결과를 도 1에 나타낸다. 분획한 획분의 항산화 활성을 이하에 나타내는 시험예 1의 방법으로 측정한 바, 크로마토그램의 화살표의 획분에 강한 항산화 활성이 확인되었다.
얻어진 고다 치즈의 펩티드에 대해서, 액체 크로마토그래프 질량 분석계(서모일렉트론사)를 이용하여 분자량을 추정하며, 펩티드 시퀀서(어플라이드·바이오시스템사)로 아미노산 서열을 해석한 바, 도 1의 화살표로 나타내는 6번이 His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln으로 이루어지는 서열인 것이 확인되었다.
이와 같이 하여 얻어진 펩티드는, 그대로 본 발명의 항산화제 혹은 아디포넥틴 생산 촉진제로서 이용 가능하다.
[시험예 1]
(펩티드의 항산화 활성 측정)
실시예 1에서 분획한 펩티드에 대해서, 리놀레산의 산화물이 β-카로틴을 퇴색시키는 작용을 이용하는 방법으로 항산화 활성을 측정하였다. 즉, β-카로틴 용액(1 ㎎/㎖ 클로로포름) 0.5 ㎖, 리놀레산 용액(100 ㎎/㎖ 클로로포름) 0.2 ㎖, 트윈 40 용액(200 ㎎/㎖ 클로로포름) 1.0 ㎖를 300 ㎖의 삼각 플라스크에 넣어, 질소 가스로 클로로포름을 완전히 제거한 후, 100 ㎖의 증류수를 더하여 용해하였다. 또한, 0.2 M 인산 완충액(pH 7.0) 9.0 ㎖를 첨가하여, 리놀레산·β-카로틴 용액을 조제하였다. 다음에, 미리 펩티드 획분 0.02 ㎖를 분주한 98혈(穴) 마이크로 웰 플레이트에, 상기 리놀레산·β-카로틴 용액 0.18 ㎖를 더하여, 바로 490 ㎚의 흡광도(S0)를 측정하였다. 또한, 리놀레산·β-카로틴 용액의 조제에 있어서는, S0이 1.2 정도(1.1∼1.3)가 되도록 β-카로틴 용액의 첨가량을 적절하게 증감하였다. S0 측정 후, 즉시 마이크로 웰 플레이트를 50℃의 항온조에 넣어, 30분간 인큐베이트하였다. 인큐베이트 종료 후, 즉시 흡광도(S30)를 측정하여, 30분간에 있어서의 490 ㎚의 흡광도의 저하량, ΔS=S0-S30을 산출하였다. 블랭크에는 시료 대신에 70％ 에탄올을 이용하여, 동일한 조작을 행하였다. 즉, 리놀레산·β-카로틴 용액을 더한 직후의 흡광도(B0) 및 50℃, 30분간 유지한 후의 흡광도(B30)를 측정하여, 30분간에 있어서의 490 ㎚의 흡광도의 저하량, ΔB=B0-B30을 구하였다. 항산화 활성은 다음 식에 대입하여, 항산화율(％)로서 나타내었다.
[수학식 1]
항산화율(％)=〔ΔB-ΔS〕/(ΔB)×100
또한, 포지티브 컨트롤로서, 근육 유래 항산화 활성 펩티드인 카르노신(β-Ala-L-His; 펩티드켄큐쇼)을 0.01 ㎍/㎖, 0.1 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖로 조제한 것을 이용하였다.
정제 펩티드 및 포지티브 컨트롤로서의 카르노신의 항산화 활성을 측정한 결과를 표 1에 나타낸다.
항산화 활성(%)
샘플 농도(㎍/㎖) 0.01 0.1 1
카르노신(Ala-His) 32.9 57.8 78.3
His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln 13.0 41.0 64.6
표 1에 보이는 바와 같이, 펩티드를 첨가하면, 농도 의존적인 항산화 활성을 나타내었다. 이상, 본 시험예의 결과에 의해 His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 치즈 유래의 펩티드에는 항산화 활성(라디칼 스캐빈저 활성)이 인정되며, 활성 산소나 과산화 지질에 의한 산화적 세포 장해의 예방·개선에 유용한 것이 발견되었다.
[실시예 2]
(펩티드의 합성)
상기 식 (1)로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드에 대해서, 펩티드 신시사이저로 합성을 행하였다. 펩티드 신시사이저 431A(어플라이드·바이오시스템사)에 의해, 파라히드록시메틸페녹시메틸폴리스티렌(HMP) 수지를 이용하며, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc)기를 아미노 말단의 보호기로서 C말단측으로부터 펩티드쇄를 순차 연장함으로써 0.25 m㏖ 스케일로 직쇄 보호 펩티드를 합성하였다. 얻어진 HMP 수지 결합 보호 펩티드를 페놀, 1,2-에탄디티올, 티오아니솔 존재 하, 트리플루오로초산(TFA)에 의해 펩티드의 HMP 수지로부터의 분리와 보호기의 제거를 동시에 행하였다. 감압 농축에 의해 TFA를 제거한 후, 에틸에테르로 조(粗) 펩티드를 결정화시키고, 이것을 5％ 초산에 용해하여 동결 건조를 행하였다.
얻어진 직쇄 조 펩티드를, YMC-Pack ODS-A 컬럼(YMC사; 4.6 ㎜×150 ㎜)을 이용한 HPLC에 제공하였다. 크로마토그래피는, 용매(A액: 50 m㏖ 초산암모늄 수용액; B액: 80％ 아세토니트릴), 농도 경사(12％B→60％B, 60 min), 유속 0.8 ㎖/min, 검출 파장 215 ㎚의 조건에서 행하였다. 얻어진 직쇄 정제 펩티드의 순도는, HPLC에 의한 분석의 결과 98％였다. 결과를 도 2에 나타낸다.
이와 같이 하여 얻어진 펩티드는, 그대로 본 발명의 항산화제 혹은 아디포넥틴 생산 촉진제로서 이용 가능하다.
[시험예 2]
(합성 펩티드의 항산화 활성 측정)
실시예 2에서 얻어진 펩티드에 대해서 시험예 1과 동일한 방법으로 항산화 활성을 측정하였다. 포지티브 컨트롤로서, 근육 유래 항산화 활성 펩티드인 카르노신(β-Ala-L-His; 펩티드켄큐쇼) 및 카테킨(와코쥰야쿠코교사)을 1 ㎛, 10 ㎛, 100 ㎛로 조제한 것을 이용하였다. 합성 펩티드의 항산화 활성을 평가한 결과를 표 2 및 도 3에 나타낸다. 표 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 얻어진 합성 펩티드에 강한 항산화 활성이 확인되었다.
항산화 활성(%)
샘플 농도(㎛) 1 10 100
카테킨 52.65 84.45 97.17
카르노신 7.07 21.2 48.41
합성 펩티드 32.86 61.13 63.6
[실시예 3]
(트립신 소화물의 조제)
실시예 2에서 얻어진 펩티드의 트립신 소화물을 조제하였다.
실시예 2에서 얻어진 펩티드 및 트립신(시그마알도리치재팬사)을, 각각 1 ㎎/㎖가 되도록 효소 반응 용액(50 mMTris-HCl, 20 mMCaCl2, pH 8.0)에 용해하였다. 펩티드 용액 500 ㎕에, 트립신 용액을 5 ㎕ 첨가하여, 37℃에서 2시간 반응시킨 후, 트립신 용액 5 ㎕를 더 더하여, 37℃에서 18시간 반응시켜 트립신 소화물을 얻었다.
이 트립신 소화물을 증류수로 용해한 후, YMC-Pack ODS-A 컬럼(YMC사; 4.6 ㎜×150 ㎜)을 이용하여 HPLC에 제공하였다. HPLC 분석은 실시예 2의 트립신 소화 전의 펩티드와 동일한 조건에서 행하였다. 결과를 도 4에 나타낸다. 도면에 나타낸 바와 같이 2개의 피크로 분리되었다.
트립신으로 분해된 2개의 단편(fragment)[(His-Pro-Ile-Lys, 펩티드 1) 및 (His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln, 펩티드 2)]에 상당하는 2개의 피크를, 각각 10회분 회수하며, 원심 증발관을 이용하여 건조하여, 트립신 소화물인 2종의 펩티드를 얻었다. 얻어진 2종의 펩티드 및 분획 전의 트립신 소화물의 항산화 활성을 이하에 나타내는 시험예 3의 방법으로 측정한 바, 도 5에 나타낸 바와 같이, 합성 펩티드에 강한 항산화 활성이 확인되었다.
이와 같이 하여 얻어진 항산화 작용을 갖는 펩티드는, 그대로 본 발명의 항산화제로서 이용 가능하다.
[시험예 3]
(펩티드의 항산화 활성 측정)
실시예 3에서 얻어진 트립신 소화물인 2종의 펩티드 및 분획 전의 트립신 소화물에 대해서 시험예 2와 카로틴 퇴색법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다. 펩티드 농도는 각각의 펩티드를 500 ㎕의 순수에 용해하여, Micro BCA Proteinassay kit(피어스사)를 이용하여 측정하였다. 포지티브 컨트롤로서, 시험예 2와 마찬가지로, 카르노신(β-Ala-L-His; 펩티드켄큐쇼) 및 카테킨(와코쥰야쿠코교사)을 이용하였다. 각 단편에 대해서 1 ng/㎖, 10 ng/㎖, 100 ng/㎖의 희석계열을 조제하여, β카로틴 퇴색법을 이용하여 항산화 활성을 평가하였다. 트립신 소화 펩티드의 항산화 활성을 평가한 결과를 도 5에 나타낸다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 얻어진 트립신 소화 펩티드에 강한 항산화 활성이 확인되었다.
[시험예 4]
(펩티드의 지방 세포 투여 실험)
실시예 1에서 얻어진 치즈로부터 분리된 펩티드에 대해서, 초대 배양 내장 지방 세포에의 투여 실험을 행하였다.
쥐의 초대 배양 내장 지방 세포(VAC01, 셀가레지사) 및 내장 지방 세포 분화 유도 배양액(셀가레지사)을 이용하여 실험을 행하였다. 셀가레지사의 프로토콜에 따라 동결 보존한 세포를 융해하여, 24혈(穴) 플레이트에 파종한 날을 0일째로 하며, 2일째, 5일째, 7일째에 합성 펩티드를 용해한 배양액(펩티드 농도: 100 μM, 50 μM, 10 μM, 0 μM)을 더하여, 8일간 배양하였다. 5일째, 7일째, 8일째에 배양 상청을 회수하여, 아디포넥틴 농도를 측정하였다. 또한, 8일째에 세포를 회수하여, 세포 내의 글리세롤 3-인산 탈수소 효소(GPDH) 효소 활성 및 각 웰의 DNA량, 세포 내 축적 지방량을 측정하였다. GPDH는 글루코오스로부터 트리글리세이드를 합성할 때에 작용하는 효소로, 성숙 지방 세포가 발현된다. 이번 배양계에서는, 지방 전구 세포를 분화시키면서 본 발명의 펩티드를 투여하여 그 영향을 보았다.
DNA량은, 셀가레지사의 DNA 정량 키트를 이용하여, 정량을 행하였다.
세포 내의 글리세롤 3-인산 탈수소 효소(GPDH) 효소 활성은, 셀가레지사의 GPDH 활성 측정 키트를 이용하여, 셀가레지사 프로토콜에 따라 측정을 행하였다. 측정 결과는 각 웰로부터 추출한 DNA량으로 표준화하였다.
아디포넥틴 농도의 측정은, 오쯔카세야쿠사의 아디포넥틴 ELISA 키트를 이용하여, 배양 상청 내의 아디포넥틴 농도를 측정하였다. 측정 결과는 각 웰로부터 추출한 DNA량으로 표준화하였다.
세포 내 축적 지방의 정량은, 셀가레지사의 지방 염색 키트를 이용하여, 오일레드0에 의한 지방 염색 및 흡광도 측정에 의한 축적 지방 정량을 행하였다.
(펩티드의 지방 세포 투여 실험 결과)
각 웰의 세포 유래 DNA를 정량한 결과, Student's t-test에서는, 본 발명 펩티드 무첨가군과 첨가군의 세포 DNA량에 유의차는 검출되지 않았다.
GPDH 활성(단위 DNA량당)을 측정한 결과, 각 웰의 세포 DNA량으로 표준화한 GPDH 활성에서, 펩티드 무첨가군보다도 본 발명 펩티드 10 μM 또는 50 μM 첨가군에서 유의하게 높은 활성이 발견되었다. 펩티드 100 μM 첨가군과, 무첨가군의 유의한 차는 검출되지 않았다.
배양 일수에 따른 아디포넥틴 농도 변화의 측정 결과로서는, 배양 7일째에서 아디포넥틴 생산량은 최대가 되지만, 8일째에서는 급격히 감소하는 것이 발견되었다. 배양 상청 내의 아디포넥틴 농도가 가장 높던 7일째에서, 투여한 펩티드 농도의 차이에 의한 아디포넥틴 생산량의 차이(단위 DNA량당)를 도 6에 나타낸다.
펩티드 무첨가로 배양한 세포보다도 펩티드를 첨가한 세포 쪽이, 아디포넥틴을 유의하게 많이 생산하고 있었다. 이 경향은, 특히 펩티드 농도 10 μM 혹은 50 μM로 첨가한 것에서 현저히 발견되었다. 이 결과는, 이 치즈 유래의 펩티드가 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제 작용을 가져오는 성분 중 하나인 것을 나타낸다.
그러나, 본 발명에서의 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제 작용의 유효 성분은 이들 펩티드에 한정되는 것이 아니며, 이 외에도 여러 가지 유효 성분이 포함되어 있다고 생각된다.
배양 8일째에, 오일레드0에 의한 지방 염색 및 흡광도 측정에 의한 축적 지방량의 정량을 행한 결과를 도 7에 나타낸다.
지방 세포의 염색에는 고정이 필요하기 때문에, 지방 정량을 행한 웰의 세포수(세포 DNA량)를 정량할 수는 없다. 그러나, 동일한 조건에서 배양한 세포의 DNA 정량 결과로부터, 펩티드 첨가에 의한 세포수에의 영향이 발견되지 않았기 때문에, 각 웰에는 거의 동수의 세포가 존재한다고 추측된다. Student`st-test에서는, 펩티드 무첨가로 배양한 것과, 펩티드를 더하여 배양한 것의 지방 축적량에 유의한 차는 발견되지 않았지만, 펩티드를 100 μM 첨가한 세포에서는, 도 7에 나타낸 바와 같이 지방 축적량이 약간 감소하는 경향이 발견되었다.
(펩티드의 지방 세포 투여 실험 정리)
지방 전구 세포에 본 발명의 펩티드를 10 μM∼50 μM 첨가하여 배양하면,
(1) GPDH 활성이 좋아지며,
(2) 아디포넥틴 생산량도 증가하지만,
(3) 지방 축적량에는 변화가 없었다.
이 경우, 펩티드 첨가에 의해 지방 전구 세포로부터 지방 세포에의 분화가 촉진되고 있던지, 혹은 분화된 숙성 지방 세포에서의 지방 합성 활성이 촉진되고 있다고 생각된다. 그러나, 펩티드 무첨가의 세포와 지방 축적량에는 차가 없었기 때문에, 어떠한 별도의 분자 메카니즘에 의해, 합성된 지방은 분해되고 있을 가능성이 있다. 아디포넥틴은 성숙 지방 세포로부터 분비되는 베네피셜(beneficial) 사이토카인이며, 본 발명의 펩티드 첨가에 의해 이 아디포넥틴 생산 촉진 효과가 확인되었다. 이상으로부터, 본 발명의 펩티드에는, 지방 전구 세포로부터 지방 세포에의 기능적 분화를 재촉하여, 아디포넥틴의 생산량을 증가시키는 작용이 있는 것이 인정되며, 또한, 세포에의 지방 축적은 억제하는 효과가 있을 가능성이 시사되었다.
아디포넥틴에는 동맥 경화 억제 작용 등 외에, 간장이나 근육에서의 지방 연소를 촉진하는 효과가 있다고 되어 있다. 본 발명의 펩티드에는, 아디포넥틴을 생산하기 쉬운 지방 세포를 만들어, 대사 증후군을 예방하는 작용이 있는 것이 생각된다.
한편, 지방 전구 세포에 본 발명의 펩티드를 100 μM 첨가하여 배양하면,
(1) GPDH 활성에는 변화가 없으며,
(2) 아디포넥틴 생산량은 증가하고,
(3) 지방 축적량에는 변화가 없다(유의한 차는 없지만, 감소 경향이 보이는 것 같다).
이들 결과로부터, 지방세포에 대한 본 발명의 펩티드의 효과에는 농도에 따라 차이가 있으며, 옵티마 농도가 존재할 가능성이 시사되었다. 어떻든간에, 본 발명의 펩티드 첨가에 의해, 아디포넥틴 생산량을 촉진하는 작용이 확인되었다. 또한, 지방 축적량 억제 효과가 있는 것에는 틀림 없으며, 본 발명 펩티드에 대사 증후군 예방 효과가 있을 가능성이 표시되었다.
또한, 이 His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드의 트립신 분해물인 His-Pro-Ile-Lys 및 His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드에 대해서도, 마찬가지의 아디포넥틴 생산을 촉진하는 작용이 확인되었다.
[실시예 4]
(세균 숙성 타입 치즈의 조제)
원료유를 가열 살균(75℃, 15초간)한 후, 30℃까지 냉각하고, 0.01％ 염화 칼슘을 첨가하였다. 또한, 시판의 치즈 제조용 유산균 스타터(크리스챤·한센사) 1.5％ 및 다당 생산 유산균의 락토바실러스·헬베티쿠스(L.helveticus) SBT2171(FERMP-14381) 3％를 첨가하며, 레닛(rennet) 0.003％를 더 첨가하여, 유을 응고시켰다. 이와 같이 하여 얻어진 응유를 커팅하고, pH가 6.2∼6.1이 될 때까지 교반하여 훼이(Whey)를 배출하여, 커드(curd) 입자를 얻었다. 그리고, 이 커드 입자를 틀에 넣어 압착하며, 또한 가염하여, 10℃에서 숙성시켜, 고다 치즈 타입의 경질 내추럴 치즈를 조제하였다. 이 경질 내추럴 치즈(12개월 숙성)를 민싱기(mincing machine)(GM-DX, 니혼캐리어사 제조)에 의해 민싱하며, 동결 건조를 행하였다. 그 후, 커피밀에 의해 미세화하여, 치즈 가루를 얻었다.
[시험예 5]
(혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제 작용의 확인)
실시예 4에서 얻은 치즈 가루를 사용하여, 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제 작용을 확인하였다. 동물 실험은 1군 8마리로 하며, 치즈 가루를 배합한 고지방 사료를 투여한 군(치즈식군), 치즈 가루를 배합한 고지방 사료를 투여하지 않고 컨트롤 사료를 투여한 군(컨트롤식군)으로 하여 행하였다. 컨트롤 사료는 치즈 성분 분석의 결과(표 3 참조)를 바탕으로, 일반 성분, 주요 미네랄, 비타민 E(α-토코페롤)의 함유량을, 치즈 가루를 배합한 고지방 사료에 맞추며, 단백질원으로서 밀크 카제인, 지질원으로서 버터 오일을 이용하였다. 치즈 가루를 배합한 고지방 사료로서는, 단백질, 지질 모두, 치즈 성분만으로 준비하였다.
치즈의 성분
단백질
지방
회분		 44.8(g/100g)
43.4
6.3
나트륨
칼륨		 1050(mg/100g)
130
칼슘
마그네슘
인
철		 1190
41
850
0.22
α-토코페롤 0.9(mg/100g)
동물 실험은, 사육 후 4주째까지는 컨트롤 사료를 부여하며, 그 후 2군으로 나누어 8주째까지 컨트롤 사료 혹은 치즈 가루를 배합한 고지방 사료를 부여하였다. 4주째, 8주째에 채혈을 행하며, 마우스/랫트 아디포넥틴(rat adiponectin) ELISA 키트(오쯔카세이야쿠사 제조)를 이용하여 혈중 아디포넥틴 농도를 측정하였다. 또한, 8주째에 있어서의 혈중 트리글리세이드 농도 및 혈중 총콜레스테롤 농도를 측정하였다.
결과를 표 4 및 표 5에 나타낸다. 이에 따르면 컨트롤식군의 혈중 아디포넥틴 농도는 시간의 경과에 따라 감소하고 있는 데 대하여, 치즈식군에서는 오히려 증가하는 것이 분명하게 되었다. 즉, 치즈를 섭취함으로써, 혈중 아디포넥틴 농도가 증가 혹은 저하 억제되는 것이 발견되었다. 또한, 혈중 트리글리세이드 농도는 컨트롤식군에 비해서, 치즈식군에서는 유의하게 저하하고 있었다. 한편, 혈중 총콜레스테롤 농도에서도 유의차는 발견되지 않았지만, 치즈식군에서 저하하는 경향이 있는 것이 발견되었다.
혈중 아디포넥틴 농도의 변화
식군
 혈중 아디포넥틴 농도(㎍/㎖) 변화율(%)
4주간 8주간
컨트롤식군 11.19 10.40 93.72
치즈식군 10.41 13.14 129.67
혈중 트리글리세이드 농도 및 혈중 총콜레스테롤 농도
식군 트리글리세이드 농도(mg/dl) 총콜레스테롤 농도(mg/dl)
컨트롤식군 111.75 80.38
치즈식군 75.63 68.63
[실시예 5]
(정제의 제조)
실시예 1에서 얻어진 항산화 펩티드(His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln) 20 중량％, 유당(DMV사) 46 중량％, 결정 셀룰로오스(와코쥰야쿠코교사) 31 중량％, 물 3 중량부를 충분히 혼합한 후, 타정기(후지야쿠힝키카이사 제조)에 의해 타정하여, 본 발명의 항산화용 정제를 제조하였다.
[실시예 6]
(과즙 음료의 제조)
표 6에 나타낸 조성으로 각 성분을 혼합하여, 용기에 충전한 후, 가열 살균하여, 본 발명의 실시예 2에서 얻어진 합성 항산화 펩티드(His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln)를 배합한 본 발명의 항산화용 과즙 음료를 제조하였다.
혼합 이성화 당 15.4(중량%)
과즙 10.0
구연산 0.5
항산화 펩티드(His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln) 0.1
향료 0.2
물 73.8
[실시예 7]
(청량 음료수의 제조)
표 7에 나타낸 조성으로 각 성분을 혼합하여, 용기에 충전한 후, 가열 살균하여, 본 발명의 실시예 3에서 얻어진 트립신 소화 펩티드(His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln)를 배합한 본 발명의 항산화용 청량 음료수를 제조하였다.
말티톨(Maltitol) 7.5(중량%)
50％ 유산 용액 0.12
항산화 펩티드 0.1
향료 0.2
물 92.08
[실시예 8]
(청량 음료수의 제조)
표 8에 나타낸 조성으로 각 성분을 혼합하여, 용기에 충전한 후, 가열 살균하여, 본 발명의 실시예 3에서 얻어진 트립신 소화 펩티드(His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln 및 His-Pro-Ile-Lys)를 배합한 본 발명의 항산화용 청량 음료수를 제조하였다.
말티톨(Maltitol) 7.5(중량%)
50％ 유산 용액 0.12
항산화 펩티드(His-Pro-Ile-Lys) 0.05
항산화 펩티드(His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln) 0.05
향료 0.2
물 92.08
[실시예 9]
표 9에 나타내는 조성의 도우(dough)를 작성하여, 성형한 후, 배소하여 본 발명의 실시예 1에서 얻어진 펩티드(His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln)를 배합한 본 발명의 항산화용 비스킷을 제조하였다.
밀가루 51.0(중량%)
설탕 20.0
식염 0.5
마가린 12.5
계란 12.5
물 2.5
미네랄 혼합물 0.8
항산화 펩티드(실시예 1) 0.2
[실시예 10]
표 10에 나타내는 조성으로 각 성분을 혼합하여, 본 발명의 실시예 1에서 얻어진 항산화 펩티드(His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln)를 배합한 본 발명의 개 사육용 사료를 제조하였다.
대두박 12.0(중량%)
탈지 분유 14.9
대두유 4.0
콘유 2.0
팜유 28.0
옥수수 전분 15.0
밀가루 8.0
글루텐 2.0
비타민 혼합물 9.0
미네랄 혼합물 2.0
셀룰로오스 3.0
항산화 펩티드(실시예 1) 0.1
[실시예 11]
(정제의 제조)
실시예 1에서 얻어진 항산화 펩티드(His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln) 20 중량％, 유당(DMV사) 46 중량％, 결정 셀룰로오스(와코쥰야쿠코교사) 31 중량％, 물 3 중량부를 충분히 혼합한 후, 타정기(후지야쿠힝키카이사)에 의해 타정하여, 본 발명의 아디포넥틴 생산 촉진용 정제를 제조하였다.
[실시예 12]
(과즙 음료의 제조)
표 11에 나타낸 조성으로 각 성분을 혼합하여, 용기에 충전한 후, 가열 살균하여, 본 발명의 실시예 2에서 얻어진 합성 펩티드(His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln)를 배합한 본 발명의 아디포넥틴 생산 촉진용 과즙 음료를 제조하였다.
혼합 이성화 당 15.4(중량%)
과즙 10.0
구연산 0.5
펩티드(His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln) 0.1
향료 0.2
물 73.8
[실시예 13]
(치즈 양갱의 제조)
우유 200 ㎖와 가루 한천 2.5 g을 잘 섞어 가열하고, 한천을 용해 후, 설탕 50 g을 더하여 끓여서 녹여, 가볍게 비등시켰다. 또한, 치즈에 포함되는 유효 성분을 배합할 목적으로 고다 치즈 150 g을 한입 크기로 잘라 더하여, 한김 식히고, 틀에 넣어 냉장고에서 굳혀, 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제용 치즈 양갱을 얻었다.
[실시예 14]
(분말 치즈의 제조)
치즈에 포함되는 유효 성분을 배합할 목적으로 고다 치즈 10 ㎏을 미트 초퍼(meat chopper)로 세단하여, 용융염[인산(Na)을 1.2％, 폴리 인산(Na)을 1％), 유화제(슈거 에스테르를 0.6％)와 함께 90℃의 온수 5 ㎏이 들어 있는 용해 탱크 내에 투입하여 pH 6.2로 조정한 후, 교반, 증기 취입에 의해 유화액을 조제하였다. 이 유화액을 균질하여 필터로 여과하고, 분무 건조를 행하여, 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제용 분말 치즈를 얻었다.
[실시예 15]
(스틱형 영양 건강 식품의 제조)
실시예 15에서 얻어진 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제용 분말 치즈 100 g과, 비타민 C 40 g, 그래뉴당 100 g, 옥수수 녹말과 유당의 등량 혼합물 60 g을 혼합하여 봉지에 넣어, 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진 및/또는 감소 억제용의 스틱형 영양 건강 식품을 100봉지 제조하였다.
도 1의 화살표는 본 발명의 His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln으로 이루어지는 아미노산 서열을 나타낸다.
도 4의 도면 부호 1은 본 발명의 His-Pro-Ile-Lys로 이루어지는 아미노산 서열을 나타내며, 도면 부호 2는 본 발명의 His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln으로 이루어지는 아미노산 서열을 나타낸다.
도 5의 펩티드 소화물 1은 본 발명의 His-Pro-Ile-Lys로 이루어지는 아미노산 서열을 나타내며, 펩티드 소화물 2는 본 발명의 His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln으로 이루어지는 아미노산 서열을 나타낸다.
SEQUENCE?LISTING <110>Snow Brand Milk Products Co.,Ltd. <120>Peptide <160>3 <210>1 <211>10 <212>PRT <213>Bovine <400> His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln 1 5 10 <210>2 <211>4 <212>PRT <213>Bovine <400> His Pro Ile Lys 1 <210>3 <211>6 <212>PRT <213>Bovine <400> His Gln Gly Leu Pro Gln 1 5

Claims (6)

  1. 다음 식 (1) 내지 식 (3) 중 어느 하나에 기재된 펩티드를 유효 성분으로 하는 아디포넥틴 생산 촉진제.
    His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln 식 (1)
    His-Pro-Ile-Lys 식 (2)
    His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln 식 (3)
  2. 다음 식 (1) 내지 식 (3) 중 어느 하나에 기재된 펩티드를 배합한 아디포넥틴 생산 촉진용 음식품.
    His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln 식 (1)
    His-Pro-Ile-Lys 식 (2)
    His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln 식 (3)
  3. 치즈 자체를 유효 성분으로 하는 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진, 감소 억제, 또는 농도 증가 촉진 및 감소 억제제.
  4. 치즈 자체를 배합한 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진, 감소 억제, 또는 농도 증가 촉진 및 감소 억제용 음식품.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 아디포넥틴 생산 촉진제는 대사 증후군의 예방 또는 치료를 위한 것임을 특징으로 하는 아디포넥틴 생산 촉진제.
  6. 제 3 항에 있어서, 상기 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진, 감소 억제, 또는 농도 증가 촉진 및 감소 억제제는 대사 증후군의 예방 또는 치료를 위한 것임을 특징으로 하는 혈중 아디포넥틴 농도 증가 촉진, 감소 억제, 또는 농도 증가 촉진 및 감소 억제제.
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