KR101751617B1 - 오계 펩타이드 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents
오계 펩타이드 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 오계 펩타이드 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 연산오계 펩타이드 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 세포내 IL-6 및 TNF-α의 생성을 억제함으로써 우수한 항염증 효과를 나타낼 뿐만 아니라 DPPH 라디컬 소거능이 우수하여 항산화 효과를 나타내고 세포에 대한 독성이 없어 약학적 조성물, 식품 조성물, 화장료 조성물 및 사료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 오계 펩타이드 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 연산 오계(Yeonsan Ogye)의 가슴살, 다리살 또는 날개살의 단백질을 가수분해 공정을 통하여 최적화하고, 가수분해하여 수득한 연산오계 단백질 추출물을 이용하여 염증성 질환 예방 및 치료 또는 항산화 효능을 나타내는 약학적 조성물, 식품 조성물, 화장료 조성물, 및 사료 조성물에 관한 것이다.
염증은 상처나 질병에 반응하는 인체의 면역 반응으로, 자외선이나 활성산소, 자유라디칼 등의 산화적 스트레스 등이 염증성 인자를 활성화시켜 각종 질병 및 피부의 노화를 일으킨다. 혈관 활성 폴리펩타이드인 키닌(kinin), 플라스민(plasmin), 보체(complement) 등이 혈관 확장과 수축 및 주화성(chemotaxis) 작용을 하고, 그 외에 인터루킨-6(IL-6) 등과 같은 림포카인과 아라키돈산(arachidonic acid) 등이 염증 반응을 담당한다. 아라키돈산은 싸이클로옥시게나아제(cyclooxygenase) 혹은 리포옥시게 나아제(lipooxygenase)의 2가지 경로를 거쳐염증 매개체인 프로스타글란딘(prostaglandin), 류코트리엔(lukotriene)들로 대사되어 다양한 염증 반응을 매개한다.
한편, 염증을 소실시키기 위해 염증원의 제거, 생체 반응 및 증상을 감소시키는 작용을 하는 것을 항염제라 한다. 현재까지 항염의 목적으로 이용되고 있는 물질로는 비스테로이드계로 플루폐나믹산(flufenamic acid), 이부프로펜(ibuprofen), 벤지다민(benzydamine), 인도메타신(indomethacin) 등이 있고 스테로이드계통으로 프레드니솔론(prednisolone), 덱사메타손 (dexamethasone) 등이 있다. 또한, 알란토인, 아즈엔, 하이드로코티손 등이 항염증에 효과가 있는 것으로 알려져 있으나, 이들 물질은 피부에 대한 안전성의 문제로 사용량의 제한이 있거나, 효과가 미미하여 실질적으로 염증 완화 효과를 기대할 수 없는 문제점이 있다.
항산화제(antioxidant)는 산화반응을 억제하는 물질로서 활성산소 또는 산소자유라디칼이라고 하는 히드록실라디칼, 수퍼옥시드아니온, 과산화수소 등을 포함하는, 소위 산화물질의 작용을 소거 또는 감쇠시키는 물질을 총칭하는 의미이다. 저분자화합물로는 글루타티온, N-아세틸시스테인, 아스코르빈산, α-토코페롤, 부틸화히드록시아니졸(BHA), 카테킨, 케르세틴, 요산, 빌리루빈, 포도당, 플라보노이드 등이 알려져 있으며, 최근에는 레드와인 추출물, 토마토, 블루베리 등 천연 항산화 제품들이 각광을 받고 있다.
따라서, 생체에 안전하고, 유효성분이 안정하며, 무엇보다도 기존의 항염증 효과가 있는 물질보다 효과가 우수한 성분의 개발이 절실히 요망되고 있다.
이러한 항염증 효과가 있는 물질로서는 대한민국 특허공개 제10-2015-0090295호에서는 칠해목 추출물을 유효성분으로 하는 항염증 치료용 조성물을 개시한 바 있으며, 대한민국 등록특허 제10-1556773호에서는 벼 뿌리 유래의 다이터펜 화합물을 포함하는 항염증 조성물을 보고한 바 있다.
이에 본 발명자들은 천연물질로서 인체에 안전하면서도 항염증 효과가 우수한 물질을 개발하기 위해 계속 연구를 진행하던 중 연산오계 펩타이드 추출물이 혈청 내 사이토카인의 생성을 월등하게 감소시키고 DPPH 라디컬 소거능이 탁월함으로써 항염증 효과 및 항산화 효과가 우수할 뿐만 아니라 세포 독성이 전혀 없다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 세포 독성이 없는 천연 식용물질로서 안전하고 항염증 효과 및 항산화 효과가 우수한 조성물을 제공하기 위한 것이다.
상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 연산오계 펩타이드 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명에서는 연산오계 펩타이드 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위한 항염증용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 연산오계 펩타이드 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 연산오계 펩타이드 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 연산오계 펩타이드 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 연산오계 펩타이드 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 (a) 연산오계로부터 다리살, 날개살 또는 가슴살을 분리하여 다지는 단계, (b) 상기 다진 육질을 균질화하고 단백질 가수분해 효소를 첨가하여 반응시키는 단계 및 (c) 상기 가수분해된 반응물에 0.3 M TCA (Trichloroacetic acid)를 첨가하고, 상온에서 단백질을 침전시킨 후 3000 RPM에서 원심분리한 후 상등액만을 취하는 단계를 포함하는 연산오계 펩타이드 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 제조방법을 제공한다.
일반적으로 오계는 외형이 닭과 큰 차이가 없으나 머리는 작은 편이며, 볏은 닭과 달리 딸기 모양의 관을 가진 것이 보통이고, 때로는 복관·삼매관·장미관도 눈에 띄는데, 어두운 자색 또는 어두운 붉은색을 띠고 있다. 부리는 청백색 또는 검은색, 얼굴과 몸은 자색 또는 청백색, 눈조리개는 갈색 또는 검은색, 귓볼은 청옥색 또는 청백색, 다리는 연색 또는 황색이다. 목은 짧고 깃털이 많으며, 꼬리도 짧은 편이나 부드러운 깃털로 되어 있다. 다리는 짧고 발목에 잔털이 나 있고, 피부와 살빛·뼈 등이 모두 어두운 자색을 띤다. 닭은 발가락이 앞쪽에 3개와 뒤쪽에 1개가 있는 반면, 오계는 뒷발가락 위쪽에 또 하나의 긴 발가락이 있다. 깃털은 흰색이 대부분이며, 드물게 검은색과 흰색에 가슴만 붉은색이 띠는 것도 있다. 알은 닭보다 작다.
연산 화악리의 오계는 관이 자주색 딸기 모양으로 계절과 기온에 따라 농도가 변하는 특징이 있다. 발가락은 일반 닭과 같이 앞에 3개, 뒤에 1개가 있다. 깃털의 색은 당초 붉은색, 흰색, 검은색, 노란색 또는 교잡종으로 검은색, 흰색 등 단일색은 20%밖에 되지 않았으나 1973년 작고한 이계순이 분리 사육 등 혈통고정에 대한 노력의 결과로 오늘날은 대부분이 검은색이며, 흰색이 5%, 기타 혼합색이 15% 정도이다.
본 발명의 항염증용 조성물의 유효성분인 연산오계 펩타이드 추출물은 연산오계로부터 육질을 분리하여 효소를 이용하여 단백질을 가수분해한 다음 수득된 펩타이드를 원심분리하여 제조할 수 있다.
본 발명의 연산오계 펩타이드 추출물을 포함하는 조성물은 세포내 사이토카인 IL-6 및 세포내 사이토카인 TNF-α의 생성을 억제함으로써 우수한 항염증 효과를 나타낼 뿐만 아니라 세포에 대한 독성이 없는 이점이 있다.
또한, 본 발명의 연산오계 펩타이드 추출물을 포함하는 조성물은 DPPH 라디컬을 소거함으로써 우수한 항산화 효과를 나타낼 수 있다.
따라서, 본 발명에서는 연산오계 펩타이드 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물, 식품 조성물, 화장료 조성물 및 사료 조성물을 포함한다.
본 발명의 바람직한 하나의 실시양태에 따르면, 연산오계 추출물은 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 연산오계 펩타이드 추출물을 0.01 내지 80 중량%의 양으로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 60 중량%의 양으로 포함할 수 있다. 그러나 이는 투약자의 필요에 따라 증감할 수 있으며, 식생활, 영양 상태, 병의 진행 정도, 염증의 정도 등 상황에 따라 적절히 증감할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 바람직한 약제학적 제제는 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제가 있으며 이들 약제학적 제제는 약제학적으로 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.
본 발명의 연산오계 펩타이드 추출물을 포함하는 약학적 조성물의 투여 용량은, 환자의 상태, 연령, 성별 및 합병증 등의 다양한 요인에 따라 전문가에 의해 결정될 수 있지만 일반적으로는 성인 1kg 당 0.1㎎ 내지 10g, 바람직하게는 10 mg 내지 5g의 용량으로 투여될 수 있다. 또한, 단위 제형당 상기 약학적 조성물의 1일 용량 또는 이의 1/2, 1/3 또는 1/4의 용량이 함유되도록 하며, 하루 1 내지 6 회 투여될 수 있다.
그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명에서 염증성 질환은 부종, 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia),건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 및 다발성 경화증으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 항산화 효과는 산화반응을 억제하는 물질로서 활성산소 또는 자유라디칼이라고 하는 히드록실라디칼, 수퍼옥시드아니온, 과산화수소 등을 포함하는, 소위 산화물질의 작용을 소거 또는 감쇠시키는 물질을 총칭하는 의미로서, 항산화용 조성물, 산화방지제, 산화방지용 조성물 등의 용어와 동일한 의미로 사용된다.
본 발명의 바람직한 하나의 실시양태에 따르면, 연산오계 펩타이드 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 항산화용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품은 건강보조식품, 건강기능식품, 기능성 식품 등이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 천연식품, 가공식품, 일반적인 식자재 등에 본 발명의 화합물 또는 그 허용 가능한 염을 첨가하는 것도 포함된다.
본 발명의 식품 조성물은 연산오계 펩타이드 추출물을 단독으로 포함하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 개선 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 연산오계 펩타이드 추출물은, 식품 또는 음료의 제조 시에 식품 또는 음료의 원료 100 중량%에 대하여 0.1 내지 70 중량%, 바람직하게는 2 내지 50 중량%로 첨가될 수 있다.
본 발명의 연산오계 펩타이드 추출물의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 연산오계 펩타이드 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제, 기타 영양제 등을 들 수 있으나 이들 종류의 식품으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 하나의 실시양태에 따르면, 연산오계 펩타이드 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 항산화용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 화장료에 있어서, 본 발명의 조성물의 배합비율은, 그 종류 및 배합되는 다른 성분의 종류나 양, 형태 등에 따라서 적당하게 선택할 수 있는데, 통상, 화장료 전량에 대해, 본 발명의 조성물을 0.001 내지 20 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 10 중량%을 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료에는 본 발명이 원하는 효과를 손상하지 않는 범위에서, 기타 다른 여러 다른 성분을 배합할 수 있다. 다른 성분으로서는, 예를 들면, 정제수, 유제, 계면활성제, 윤활제, 알코올류, 겔화제, 보습제, 완충제, 방부제, 항염증제, 증점제, 향료, 비타민류 등에서 1종 또는 2종 이상을 적당하게 선택하여 배합할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 효과적인 경피 흡수를 위하여 피부 침투 촉진제를 포함할 수 있다. 상기 피부 침투 촉진제는 당 업계에서 화장료 조성물에 사용하는 일반적인 피부 침투 촉진제면 되고, 특별히 제한되는 것은 아니다. 예컨대 본 발명의 피부 침투 촉진제는 디메틸 설폭사이드, oleic acid 등 지방산/에스테르 화합물, 리모넨(limonene) 등이 될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 항염 및 항산화 효능이 있는 바, 특히 트러블 피부, 여드름 피부, 아토피 피부 등에 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계의 통상적으로 제조되는 어떠한 제형에도 제조될 수 있으며 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명의 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 또는 파우더 제형으로 제조될 수도 있다.
또한 본 발명의 화장료 조성물을 이용 시에는 충격파, 이온삼투요법, 전기침공법, 미세침요법 등 물리적 방법을 병용하여 경피 흡수를 촉진할 수도 있다.
본 발명의 바람직한 하나의 실시양태에 따르면, 연산오계 펩타이드 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 항산화용 사료 조성물을 제공한다.
본 발명의 사료 조성물은 통상적인 사료와 함께 배식할 수 있으며, 본 발명의 사료 조성물을 통상적인 사료 조성물에 첨가하여 기능성 사료 조성물을 제조하여 이용할 수도 있다. 또한 본 발명의 사료 조성물은 연산오계 펩타이드 추출물 외 기능성 성분을 추가로 포함할 수도 있다. 상기 통상적인 사료 조성물과 본 발명의 연산오계 펩타이드 추출물이 혼합된 기능성 사료 조성물의 제조 시, 본 발명의 연산오계 펩타이드 추출물은 총 사료 조성물에 대하여 0.01 내지 30.00 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 20.00 중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 사료 조성물의 연산오계 펩타이드 추출물의 유효용량은 상기 식품 조성물의 유효 용량에 준해서 사용할 수 있으나, 지속적인 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 필요에 따라 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 사료 조성물은 가축 또는 가금을 대상으로 한다. 상기 가축 또는 가금은 소, 돼지, 닭, 말, 양, 당나귀, 노새, 멧돼지, 토끼, 메추라기, 집오리, 장닭, 투계용 닭, 비둘기, 칠면조, 개, 고양이, 원숭이, 햄스터, 생쥐, 래트, 구관조, 앵무새, 잉꼬, 카나리아 등이나 이들에 제한되는 것은 아니며 가정 내에서 사육 가능한 인간 이외의 포유동물 또는 조류이면 본 발명의 사료 조성물의 대상이라 할 것이다.
이와 같이, 본 발명의 연산오계 펩타이드 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 세포내 사이토카인 IL-6 및 세포내 사이토카인 TNF-α의 생성을 억제함으로써 우수한 항염증 효과를 나타낼 뿐만 아니라 DPPH 라디컬 소거능이 우수하여 항산화 효과를 나타내며 세포에 대한 독성이 없어 항염증 또는 항산화용 약학적 조성물, 식품 조성물, 화장료 조성물 및 사료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 오계 가슴육의 단백질 가수분해도에 대한 온도와 pH의 영향을 측정한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 오계 가슴육의 단백질 가수분해도에 대한 온도와 효소양의 영향을 측정한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 오계 가슴육의 단백질 가수분해도에 대한 pH와 효소양의 영향을 측정한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 오계 가슴육의 효소가수분해 최적조건을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 오계 가슴육 효소가수분해 펩타이드의 Maldi-TOF 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 오계 펩타이드 추출물의 조골세포에서의 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. (A) 가슴살 펩타이드 추출물, (B) 날개살 펩타이드 추출물에 대한 세포독성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 오계 펩타이드 추출물의 DPPH 라디컬 소거능 측정결과를 나타낸 그래프이다. (A) 가슴살 펩타이드 추출물, (B) 날개살 펩타이드 추출물에 대한 DPPH 라디컬 소거능을 측정한 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 오계 펩타이드 추출물의 ABTS 라디컬 소거능 측정결과를 나타낸 그래프이다. (A) 가슴살 펩타이드 추출물, (B) 날개살 펩타이드 추출물에 대한 ABTS 라디컬 소거능을 측정한 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 오계 펩타이드 추출물의 ROS 생성량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. (A) 가슴살 펩타이드 추출물, (B) 날개살 펩타이드 추출물에 대한 ROS 생성량을 측정한 결과를 나타낸다. (** : p <0.01, * : p <0.05)
도 10은 본 발명의 오계 펩타이드 추출물의 IL-6 생성량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. (A) 가슴살 펩타이드 추출물, (B) 날개살 펩타이드 추출물에 대한 IL-6 생성량을 측정한 결과를 나타낸다. (*** : p <0.001, ** : p <0.01)
도 11은 본 발명의 오계 펩타이드 추출물의 TNF-α 생성량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. (A) 가슴살 펩타이드 추출물, (B) 날개살 펩타이드 추출물에 대한 TNF-α 생성량을 측정한 결과를 나타낸다.
도 12는 본 발명의 오계 펩타이드 추출물의 ALP 활성도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. (A) 가슴살 펩타이드 추출물, (B) 날개살 펩타이드 추출물에 대한 ALP 활성도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 13은 본 발명의 오계 펩타이드 추출물의 TRAP 활성도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. (A) 가슴살 펩타이드 추출물, (B) 날개살 펩타이드 추출물에 대한 TRAP 활성도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 오계 가슴육의 단백질 가수분해도에 대한 온도와 효소양의 영향을 측정한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 오계 가슴육의 단백질 가수분해도에 대한 pH와 효소양의 영향을 측정한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 오계 가슴육의 효소가수분해 최적조건을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 오계 가슴육 효소가수분해 펩타이드의 Maldi-TOF 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 오계 펩타이드 추출물의 조골세포에서의 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. (A) 가슴살 펩타이드 추출물, (B) 날개살 펩타이드 추출물에 대한 세포독성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 오계 펩타이드 추출물의 DPPH 라디컬 소거능 측정결과를 나타낸 그래프이다. (A) 가슴살 펩타이드 추출물, (B) 날개살 펩타이드 추출물에 대한 DPPH 라디컬 소거능을 측정한 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 오계 펩타이드 추출물의 ABTS 라디컬 소거능 측정결과를 나타낸 그래프이다. (A) 가슴살 펩타이드 추출물, (B) 날개살 펩타이드 추출물에 대한 ABTS 라디컬 소거능을 측정한 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 오계 펩타이드 추출물의 ROS 생성량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. (A) 가슴살 펩타이드 추출물, (B) 날개살 펩타이드 추출물에 대한 ROS 생성량을 측정한 결과를 나타낸다. (** : p <0.01, * : p <0.05)
도 10은 본 발명의 오계 펩타이드 추출물의 IL-6 생성량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. (A) 가슴살 펩타이드 추출물, (B) 날개살 펩타이드 추출물에 대한 IL-6 생성량을 측정한 결과를 나타낸다. (*** : p <0.001, ** : p <0.01)
도 11은 본 발명의 오계 펩타이드 추출물의 TNF-α 생성량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. (A) 가슴살 펩타이드 추출물, (B) 날개살 펩타이드 추출물에 대한 TNF-α 생성량을 측정한 결과를 나타낸다.
도 12는 본 발명의 오계 펩타이드 추출물의 ALP 활성도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. (A) 가슴살 펩타이드 추출물, (B) 날개살 펩타이드 추출물에 대한 ALP 활성도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 13은 본 발명의 오계 펩타이드 추출물의 TRAP 활성도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. (A) 가슴살 펩타이드 추출물, (B) 날개살 펩타이드 추출물에 대한 TRAP 활성도를 측정한 결과를 나타낸다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1
실험재료 및 실험방법
1. 재료 및 시약
본 실험에 사용된 Folin ciocalteu`s phenol(FCP) 시약은 Sigma Company(Seoul, Korea)사로부터 구입하였다. Tri-chloro-acetic(TCA)산은 Sigma Company(Seoul, Korea)사로부터 구입하였다. 단백질 분해효소 Bromelain 1200GDU(BM120/Nobozyme0)은 대종상사(Seoul, Korea)로부터 구입하였다. BM1200효소는 pineapple로부터 얻어진 식물성 프로테아제이다. 효소의 역가를 측정하기 위한 단백질은 카제인으로 대정화금(Daejon, Korea)에서 구입하였다. 실험에 사용된 오계육은 지산농원(Nonsan, Choongnam, Korea)에서 제공하였다.
2. 오계 가슴육 분리
지산농원에서 제공한 오계육은 깃털 없이 냉동상태로 공급되었다. 공급된 오계육은 실험실 냉동고에 실험 전까지 보관하였다. 오계 가슴육을 분리하기 위하여 냉동된 오계를 40℃의 항온수조에서 20분 동안 해동하였다. 해동된 오계 가슴육은 실험 전까지 -20℃로 냉동 보관하였다.
3. 오계 가슴육 다지기
분리하여 냉동 보관한 오계 가슴육을 상온에서 해동하였다. 해동된 가슴육을 용기에 담고 고기갈개(Kenwood, Seoul, Korea)를 이용하여 골고루 다졌다. 해동된 가슴육을 갈개 재료쟁반에 넣고 분쇄 칼날로 육을 잘게 자른 다음 스크린을 통하여 둥글고 가는 형태로 성형된 육을 제조하였다. 다진 가슴육을 지퍼백에 넣고 샘플이름, 제조날짜를 기입한 후에 -20℃로 냉동 보관하였다.
4. 오계 가슴육 단백질 가수분해 최적 공정을 위한 표면반응실험
가슴육 단백질 가수분해 생산 최적 조건을 구하기 위하여 모든 실험 계획은 3개의 독립변수 즉, 효소반응온도, 반응 pH, 효소의 농도(%)를 각각 50℃, pH 6, 2%로 하는 center run을 5번 반복하는 것을 포함하여 총 17개의 처리 조합으로 구성하였다. Box-Benken design은 세 가지의 중요한 절차에 따라 진행되는데, 첫째는 계획된 실험(designed experiment)에 따라 통계적으로 실험을 수행하고, 둘째는 수식 모델의 계수(coefficients of model)를 구하고, 셋째는 모델의 적합성을 판정하는 것으로 진행된다. 본 실험에서의 반응 변수들은 TCA 용해 펩타이드 양과 단백질 가수분해율(DH, degree of hydrolysis)로 하였다.
통계적인 계산을 원활히 하기 위하여 독립 변수를 다음과 같이 표준화 (code)하여 사용하였다. 세 개의 변수들을 각각 X 1 (온도), X 2 (pH), X 3 (효소농도)로 하였다. 표준화의 값들은 다음과 같은 공식에 의하여 구할 수 있고 그 값을 Z로 하였다.
X o 는 표준화 값의 중심값이고 X 는 표준화 값이다. △X는 1 단위만큼의 증가 또는 감소하는 값의 크기이다. 실험결과에 대한 분석은 표면 반응 분석법을 사용하였으며 최적 공정 조건을 나타내는 다중 회귀식은 다음과 같다.
여기서 Y는 predicted response 이고 본 실험처럼 3개의 변수가 있을 경우에는 k값이 3이 되고 궁극적으로 다음과 같은 식으로 표현된다.
실험 후에 확정된 결과들의 통계분석은 Design Expert (Couresy: Stat-ease Inc.,Statistics Made Easy, Minneapolis, USA)를 사용하였다. 독립변수들의 값의 선택은 예비 실험에서 얻은 결과로부터 선택하여 X1(온도)은 40℃ (-1), 50℃ (0), 60℃ (+1)로 정하고, X2(pH)는 5.0 (-1), 6.0 (0) 7.0 (+1)으로 하고 X3(효소의 양)은 1% (-1), 2% (0), 3% (+1)로 하였다. 가슴육 펩타이드 생산은 50ml PBS용매를 담고 있는 250ml 삼각 플라스크를 이용하였는데, 각각 플라스크 용매에 대하여 효소 양을 넣어주었다.
5. 오계 가슴육 단백질 가수분해
효소 반응 pH 변화에 따른 오계 가슴육 단백질 가수분해 실험을 실행하기 위하여 냉동된 상태로 보관된 다져진 가슴육 5g 을 phosphate 완충용액 50ml를 담고 있는 플라스틱 비커에 넣어 Homogenizer를 이용해 가슴육을 균질화하였다. 균질화 된 가슴육액을 250ml 삼각 플라스크에 옮겨 Enzyme BM1200을 첨가하고 배양기에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 반응한 후 효소 가수분해 된 것을 1ml를 Tube에 옮긴 후 9ml의 Water을 더해 희석해 주었다. 희석용액 2.5ml를 취하여 다른 Tube에 옮겨, 0.3 M TCA (Trichloroacetic acid) 5ml를 넣고, 상온에서 20분 동안 단백질 침전을 시킨 후 3000 RPM에서 10분 동안 원심분리한 후 상등액만을 취하여 오계 가슴육의 단백질 가수분해물을 얻었다.
6. 오계 가슴육 단백질 가수분해도 측정
오계 가슴육의 단백질 가수분해물 1ml 에 0.5 N NaOH 5ml를 혼합한 후, 1 N FCP (Folin-Ciocalteu`s penol reagent) 1ml를 넣고 voltex를 이용하여 즉시 혼합시킨 후 배양기에서 30℃ 온도로 15분 동안 반응시켜 여과필터 해주었다. 필터된 용액을 578nm Absorbance를 측정한다. 프로테아제 가수분해 양은 L-Tyrosine 표준곡선을 이용하여 측정하였고 표준곡선을 구하여 절편의 값은 다음과 같다. Y=0.0078X + 0.0182 절편식을 이용한 후 가수분해양은 DH(%)의 값을 구하는 가수분해 정도를 이용해 계산하였다.
7. 오계
가슴육의
효소가수분해
펩타이드
구성아미노산 분석
시료 0.1 g을 18 ml test tube에 칭량하여 6 N HCl 3 ml를 가하여 감압 밀봉(질소가스 충진)한 후 110℃로 setting된 heatting block에 24시간 이상 동안 가수분해 시켰다. 가수분해가 끝난 시료는 50℃에서 rotary evaporator로 산을 제거한 후 Sodium dilution buffer로 10 ml 정용한 다음, 이 중 1ml를 취하여 membrane filter 0.2 ㎛로 여과시켜 하기 표 1과 같이 아미노산 자동분석기(S433-H)로 정량 분석하였다.
8. 오계
가슴육
고압액화
펩타이드
유리아미노산
분석
시료 0.1g을 18ml test tube에 칭량하여 6 N HCl 3ml를 가하여 감압 밀봉(질소가스 충진)한 후 110℃로 setting된 heating block에 24시간 이상 동안 가수분해 시켰다. 가수분해가 끝난 시료는 50℃에서 rotary evaporator로 산을 제거한 후 Sodium dilution buffer로 10ml 정용한 다음, 이 중 1ml를 취하여 membrane filter 0.2㎛로 여과시켜 하기 표 2와 같은 조건의 아미노산 자동분석기(S433-H)로 정량 분석하였다.
오계 가슴육 5g을 이용하여 pH 6 PBS용매 50ml를 섞고 분쇄한 후 단백질 분해효소 Bromelain 1200GDU(BM1200)를 사용하여 50℃에서 4시간 동안 반응하고 20분간 원심분리하여 상등액(5brix, pH 1)을 취하였다. 상등액은 0.2㎛ membrane filter(Millipore Co.)로 여과하여, 상기 표 2의 조건에서 아미노산 자동 분석기( Amino acid Analyzer S-433 )로 분석하였다.
9. 오계육 가슴육 펩타이드 분자량 분포 ( Maldi-TOF )
가슴육 펩타이드 분자량 측정을 위해 a-cyano-4-hydroxycinamic acid를 사용하였고, 70% ACN 과 0.1% formic acid로 하여 10m/ml의 matrix시료를 만들었다. sample을 50-100 ppm 정도 준비하였다. matrix시료와 샘플을 1:1비율로 섞었다. 깨끗한 plate위에 1ml 정도 떨어뜨려 열풍건조시켰다. 건조 후에 노란색을 띄는 샘플을 취해 질량분석기(MALDI-TOF, Voyager DE-STR, Applide biosystems, USA)로 레이저를 쏘아 측정하였다. 레이저 측정은 Laser : > Nitrogen, 337 nm, 3ns pulse로 하였다.
실험결과
1. BM1200에 의한 오계 가슴육의 펩타이드 생산 최적화
BM1200에 효소를 이용하여 오계 가슴육으로부터 효소가수분해하여 최적 조건요인들인 온도, pH, 효소양의 3개의 실험변수에 대하여 Box-Benken 디자인으로 실험을 설계하여 얻어진 실험결과를 하기 표 3에 나타내었다.
상기 표 3의 실험결과를 이용한 효소가수분해 실험결과 최적 온도는 50℃, 최적 pH는 pH6, 효소의 양은 3%를 넣었을 때 회귀식에 대한 분산분석의 결과는 반응표면분석법에 의해 수립된 모델의 적합성 여부를 알려준다. 표면 반응의 분석결과 정상점(stationary point)이 최대점으로 판명되어 예측 최대 효소가수분해는 표 2에서 온도가 높을수록, pH가 낮을수록, 효소양이 많이 사용될수록 영향을 받는 것으로 나타났다. 온도는 높을수록 점차 증가하지만 50℃ 이상 높아지면서 가수분해가 더욱 잘 된 것을 보여주었다. pH는 6 부근에서 최고 가수분해정도를 보여주다가 pH가 낮아질수록 가수분해도가 낮아지는 것을 보여주었다.
모델 결정계수(determination coefficient) R2값은 실험값(observed value)과 예측값(predicted value)의 상호연관(correlation) 정도를 보여주는데, 가수분해도 0.97 이다. 적합결여(lack of fit) 테스트 검정에서는 유의성이 나타나지 않아 본 실험에 사용한 모델이 매우 적절함을 알 수 있었다.
가수분해 3가지 요인들에 대한 회귀식은 하기 표 4에 나타내었다. 효소의 양은 1%보다 더 많은 3%의 양일 때 일정하게 계속 증가하는 것으로 보였다. 따라서 최대 오계 가슴육의 최적 가수분해는 37.14%이였다.
따라서 종합적으로 보면 오계 가슴육의 효소가수분해에 따른 펩타이드양에 가장 영향을 미치는 것은 효소의 양이고 다음으로 온도 그리고 pH의 순으로 나타났다.
2. 온도와 pH에 따른 최적 생산조건
1년산 오계 가슴육을 이용하여 효소가수분해를 온도와 pH에 따른 최적 표면 반응의 분석결과 정상점(stationary point)이 최대점으로 판명되어 예측 최대 펩타이드 생산은 온도에서 50일 때, pH은 7.5로 반응하였을 때 온도에서 더 큰 영향을 받는 것으로 나타났다. 가수분해도는 pH 6-8까지 가수분해도가 11.70~29.48% 까지 증가하다가 이후에는 감소하였다. 반면 온도에 의한 영향을 보면 40에서부터 60범위에서는 50부근에서 가수분해도의 17.63% 최고점을 보이는 것을 볼 수 있었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 온도를 이용하여 단백질 가수분해도를 보면 온도와 pH 사이의 영향은 pH 7.5일 때와 온도 50 정도에서 가수분해도가 최적임을 보여준다. 이때 가수분해도 33.36% 이었다. 종합적으로 보면 효소가수분해를 이용한 최적 조건으로 가장 영향을 미치는 것은 온도 그리고 pH의 순으로 나타났다.
3. 온도와 효소 양에 따른 최적 생산조건
1년산 오계 가슴육을 이용하여 효소가수분해를 온도와 효소양에 따른 최적 표면 반응의 분석결과 정상점(stationary point)이 최대점으로 판명되어 예측 최대 펩타이드 생산은 온도에서 50일 때, 효소양은 반응용매의 3%로 반응하였을 때 효소양에서 더 큰 영향을 받는 것으로 나타났다. 가수분해도 %는 효소양 1-3%까지 가수분해도가 19.08~38.16% 까지 계속 증가하였다. 반면 온도에 의한 영향을 보면 40에서부터 60범위를 봤을 때 50 부근에서 가수분해도의 23.85% 최고점을 보이는 것을 볼 수 있었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 온도와 효소양을 이용한 단백질 가수분해도를 보면 온도와 효소양의 영향은 효소양 3%일 때와 온도 50 정도에서 가수분해도가 최적임을 보여준다. 이때 가수분해도 38.16% 이었다.
종합적으로 보면 효소가수분해를 이용한 최적 조건으로 가장 영향을 미치는 것은 온도 그리고 효소양 순으로 나타났다.
4. pH와 효소 양에 따른 최적 생산조건
1년산 오계 가슴육을 이용하여 효소가수분해를 pH와 효소양에 따른 최적 표면 반응의 분석결과 정상점(stationary point)이 최대점으로 판명되어 예측 최대 펩타이드 생산은 pH8일 때, 효소양은 반응용매의 3%로 반응하였을 때 효소양에서 더 큰 영향을 받는 것으로 나타났다. 가수분해도 %는 효소양 1-3%까지 가수분해도가 18.32~27.57% 까지 계속 증가하였다. 반면 pH에 의한 영향을 보면 pH6에서부터 pH8범위에서는 pH7.5부근에서 가수분해도 35.20%로 최고점을 보이는 것을 볼 수 있었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, pH와 효소양을 이용한 단백질 가수분해도를 보면 pH와 효소양의 영향은 효소양 3%일 때와 pH7.5 정도에서 가수분해도가 최적임을 보여준다. 이때 가수분해도 36.82% 이었다.
종합적으로 보면 효소가수분해를 이용한 최적 조건으로 가장 영향을 미치는 것은 효소양 그리고 pH의 순으로 나타났다.
5. 온도, 시간, 효소 양에 따른 최적조건
1년산 오계 가슴육 효소가수분해 결과 최고 효소가수분해는 37.14%로 종합적으로 효소가수분해에 가장 영향을 미치는 것은 도 4에 나타낸 바와 같이 효소양, 온도, pH의 순으로 나타났다.
6. 오계
가슴육의
효소가수분해
펩타이드
구성아미노산 분석결과
오계 가슴육 효소가수분해물의 구성 아미노산 조성은 하기 표 5와 같이 나타내었다. 구성 아미노산의 총 함량은 93.447 mg/100g이다. 그 중 Histidine 39.0% (36.429 mg/100g)이 가장 많은 함량을 차지하고 있었다. 다음으로 Leucine 9.5%, Lysine 7.2%, Glutamic acid 6.4%, Methionine 6.3% 등의 순서로 확인되었다.
7. 오계 가슴육의 효소가수분해 펩타이드 유리아미노산 분석결과
오계 가슴육를 분리하여 효소가수분해 처리한 가수분해물의 유리 아미노산 함량은 하기 표 6과 같이 나타내었다. 오계 가슴육 효소가수분해물에서는 26종류의 유리아미노산이 검출되었으며, 총 유리아미노산 함량은 256.631 mg/100g이다. 유리아미노산에서는 Carnosine(27.7%), Lysine 6.7%, Leucine 6.5%, Isoleucine 3.7%, Phenylalanine 3.6% 등이 가장 많은 순서로 확인되었다.
8. 오계 가슴육의 펩타이드 분자량 분포 결과
오계 가슴육을 단백질 가수분해 효소를 이용하여 분해한 생성물들의 분자량 분포 특성을 분석하고자 MALDI-TOP를 사용하였다. MALDI-TOF는, PMF(Peptide Mass Fingerprint) 분석법으로 특정 enzyme을 처리하여 잘라진 peptide fragment들의 mass 값을 측정하고 이를 사용하여 database search를 하여 동정한다. 그러므로 PMF방법은 Genomic sequence가 완료된 생물종이나 NCBI에 등재가 된 단백질을 동정하는데 주로 사용한다. 단백질의 모든 아미노산 평균 분자량은 138이지만, 가중 평균은 128이고 축합 중합에 의해 단백질은 각 단위체당 110의 평균 분자량을 갖게 된다. 이를 나타내는 단위는 dalton(달튼)으로 1 kD는 1000g/mol이다. 예를 들면 약 500개의 아미노산을 갖는 단백질의 평균적인 분자량은 55000D, 즉 55kD의 분자량을 갖는다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 오계 가슴육 단백질 가수분해물의 펩타이드들의 분자량 분포에 대한 분석을 시행하였는데 MALDI-TOP의 그래프에서 X축은 mass(m/z)를 나타내고 Y축은 이온화된 물질의 강도를 나타낸다. 불순물이 어느 정도 포함되어 있지만 대부분의 펩타이드들은 m/z 500에서 1,400 이하 분자량 분포를 보여주었다. 따라서 오계 가슴육 가수분해물 펩타이드들은 아미노산 염기 4에서 12개 정도의 분포를 보여주었다. 그리고 대부분의 펩타이드들이 염기서열 10개 이하로 이루어져 있었다. 평균 분자량으로 환산을 한다면 다수를 차지하는 펩타이드의 분자량들은 아미노산 잔기가 5,6,8,10개로 이루어져 있었다.
실시예 2
1. 세포독성 측정결과
도 6 (A)에 나타낸 바와 같이, 조골세포에서 연산오계 가슴살 펩타이드 추출물에 대한 세포 독성을 측정한 결과, 대조군을 100.0±5.0%로 나타냈을 때 1년산 수탉은 250, 500, 1000 (㎍/㎖) 농도에서 95.0±6.5%, 101.4±4.9%, 94.0±5.0%의 세포 생존율을 나타내었으며, 3년산 수탉은 250, 500, 1000 (㎍/㎖) 농도에서 97.3±3.1%, 114.5±4.5%, 99.4±6.9%의 세포 생존율을 나타내었다. 또한, 3년산 암탉은 250, 500, 1000 (㎍/㎖) 농도에서 98.4±7.9%, 105.1±5.7%, 99.7±13.2%의 세포 생존율을 나타내어 안전한 것으로 나타났다.
도 6 (B)에 나타낸 바와 같이, 조골세포에서 연산오계 날개살 펩타이드 추출물에 대한 세포 독성을 측정한 결과, 대조군을 100.0±5.0%로 나타냈을 때 3년산 수탉은 250, 500, 1000 (㎍/㎖) 농도에서 96.0±4.2%, 104.4±1.2%, 98.7±2.5%의 세포 생존율을 나타내었다. 또한, 3년산 암탉은 250, 500, 1000 (㎍/㎖) 농도에서 95.9±8.4%, 107.3±5.1%, 95.0±5.2%의 세포 생존율을 나타내어 안전한 것으로 나타났다.
2. DPPH 라디컬 소거능 측정
산소를 이용하고 있는 모든 생명체는 필연적으로 산화적 대사과정 중에 free radical을 생성하는데, 정상적인 신체 대사과정 중에 생성된 한 개 이상의 비공유전자를 가진 불안정한 상태의 이온으로 DNA 손상을 일으키고 단백질의 과산화물을 생성하며 지질과산화를 유발하는 등 여러 염증반응과 연관되어 노화 및 조직손상과 밀접한 관련이 있다.
항산화 측정법 중 DPPH 라기컬 소거능 측정법은 강한 산화력을 가진 유리 라디칼계 시약으로, DPPH에 의한 항산화 활성은 화합물이 DPPH radical에 전자를 공여함으로써 전자공여체인 항산화제와 만나 전자를 얻어 환원이 되면서 자유기를 소거하는 활성이다. DPPH radical은 산화된 형태에서 free radical을 가지고 있기 때문에 전자공여체인 항산화제와 만나면 전자를 얻어 환원이 되며, 항산화 효능이 클수록 탈색의 정도가 크게 나타난다고 알려져 있다.
도 7 (A)에 나타낸 바와 같이, 연산오계 가슴살 펩타이드 추출물에 대한 DPPH 라디컬 소거능을 측정한 결과, 1년산 수탉은 10, 20, 30, 40, 50 (㎎/㎖) 농도에서 12.3±0.7%, 16.4±2.0%, 32.4±0.7%, 55.1±3.6%, 59.3±1.5%의 라디컬 소거능을 나타내었으며, 3년산 수탉은 10, 20, 30, 40, 50 (㎎/㎖) 농도에서 4.7±0.6%, 14.5±4.1%, 27.0±3.3%, 50.6±8.0%, 59.2±4.9%의 라디컬 소거능을 나타내었다. 또한, 3년산 암탉은 10, 20, 30, 40, 50 (㎎/㎖) 농도에서 6.6±0.6%, 14.7±0.1%, 25.9±1.0%, 57.8±2.5%, 76.8±1.0%의 라디컬 소거능을 나타내어 농도 의존적으로 라디컬 소거능이 증가하였다.
이와 같은 결과는 3년산 암탉의 50 ㎎/㎖의 농도는 1년산과 3년산 수탉의 결과에 비해 높은 라디컬 소거능을 나타내어, 노화 및 조직 손상 등과 관련된 제품 개발에 있어 효과적일 것이라 사료되는 바이다.
도 7 (B)에 나타낸 바와 같이, 연산오계 날개살 펩타이드 추출물에 대한 DPPH 라디컬 소거능을 측정한 결과, 3년산 수탉은 10, 20, 30, 40, 50 (㎎/㎖) 농도에서 6.6±3.1%, 12.3±0.6%, 31.4±2.5%, 61.2±3.1%, 76.7±3.2%의 라디컬 소거능을 나타내었으며, 3년산 암탉은 10, 20, 30, 40, 50 (㎎/㎖) 농도에서 2.1±0.9%, 6.4±1.3%, 12.7±0.8%, 55.5±3.0%, 73.7±1.6%의 라디컬 소거능을 나타내어 농도 의존적으로 라디컬 소거능이 증가하였다.
이와 같은 결과는 날개살 펩타이드 추출물은 성별간의 차이는 거의 나타나지 않았으며, 가슴살 펩타이드 추출물 중 가장 높은 DPPH 라디컬 소거능을 나타낸 3년산 암탉의 50 ㎎/㎖ 농도와 비교하였을 때도 비슷한 결과가 나타났다. 즉, 날개살 펩타이드 추출물 역시 노화 및 조직 손상 등과 관련된 제품 개발에 있어 효과적일 것이라 사료되는 바이다.
3. ABTS 라디컬 소거능 측정
ABTS 라디칼 소거율 측정 방법은 ABTS의 양이온 라디칼의 흡광도가 항산화제에 의해 감소되는 원리를 이용한 것으로, ABTS와 potassium persulphate를 혼합하여 생성된 ABTS+가 항산화 물질에 의해 소거되면 특유의 색인 청록색이 탈색되는 원리를 이용한 것이다. 또한 소수성과 친수성 시료 모두 측정이 가능하다는 점에서 유용하게 쓰인다.
도 8 (A)에 나타낸 바와 같이, 연산오계 가슴살 펩타이드 추출물에 대한 ABTS 라디컬 소거능을 측정한 결과, 1년산 수탉은 10, 20, 30, 40, 50 (㎎/㎖) 농도에서 27.0±1.2%, 46.7±3.5%, 49.6±6.0%, 52.5±1.7%, 56.5±3.6%의 라디컬 소거능을 나타내었으며, 3년산 수탉은 10, 20, 30, 40, 50 (㎎/㎖) 농도에서 33.9±0.9%, 48.6±2.0%, 54.1±5.2%, 59.6±4.0%, 67.6±1.1%의 라디컬 소거능을 나타내었다. 또한, 3년산 암탉은 10, 20, 30, 40, 50 (㎎/㎖) 농도에서 29.0±2.7%, 51.7±1.9%, 51.7±3.3%, 50.9±1.6%, 56.2±6.0%의 라디컬 소거능을 나타내어 농도 의존적으로 라디컬 소거능이 증가하였다.
이와 같은 결과는 가슴살 펩타이드 추출물의 성별과 연식간의 차이가 거의 나타나지 않았다. DPPH 라디컬 소거능과 비교하였을 때, 낮은 농도에서 ABTS 소거능이 더 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 이는 radical 소거능이라는 점에서는 같으나 DPPH 경우는 free radical 이지만 ABTS는 cation radical이라는 점에서, 또는 페놀성 물질의 종류가 다름에 따라 두 기질에 결합하는 정도가 다르고, radical을 제거하는 기작이 다르다는 점에서 활성이 더 높게 나타난 것으로 판단된다.
도 8 (B)에 나타낸 바와 같이, 연산오계 날개살 펩타이드 추출물에 대한 ABTS 라디컬 소거능을 측정한 결과, 3년산 수탉은 10, 20, 30, 40, 50 (㎎/㎖) 농도에서 37.3±1.8%, 53.5±5.7%, 66.0±1.6%, 64.6±0.8%, 72.4±0.6%의 라디컬 소거능을 나타내었으며, 3년산 암탉은 10, 20, 30, 40, 50 (㎎/㎖) 농도에서 32.7±5.7%, 54.1±2.6%, 52.8±2.3%, 67.2±6.4%, 70.1±6.1%의 라디컬 소거능을 나타내어 농도 의존적으로 라디컬 소거능이 증가하였다.
이와 같은 결과는 날개살 펩타이드 추출물은 성별간의 차이는 거의 나타나지 않았으며, 가슴살 펩타이드 추출물과 마찬가지로 낮은 농도에서 DPPH 라디컬 소거능의 결과보다 높은 결과가 나타났다.
4. ROS 생성량을 측정
도 9 (A)에 나타낸 바와 같이, RAW 264.7 세포에서 연산오계 가슴살 펩타이드 추출물의 ROS 생성량을 측정한 결과, 대조군을 100.0±3.2%로 나타냈을 때 1년산 수탉은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 78.0±2.1%, 81.7±3.7%, 86.8±1.9%의 생성을 나타내었으며, 3년산 수탉의 껍질 추출물은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 101.5±3.1%, 87.1±4.6%, 94.7±1.5%의 생성을 나타내었다. 또한, 3년산 암탉의 껍질 추출물은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 100.3±9.9%, 87.7±4.5%, 68.3±5.6%의 생성을 나타내어 1년산 수탉의 1, 10 (㎍/㎖) 농도와 3년산 암탉의 100 ㎍/㎖ 농도에서 유의성 있는 (** : p <0.01, * : p <0.05) 감소를 나타내었다.
도 9 (B)에 나타낸 바와 같이, RAW 264.7 세포에서 연산오계 날개살 펩타이드 추출물의 ROS 생성량을 측정한 결과, 대조군을 100.0±3.0%로 나타냈을 때 3년산 수탉의 껍질 추출물은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 109.2±9.0%, 108.6±10.9%, 100.4±7.6%의 생성을 나타내었으며, 3년산 암탉의 껍질 추출물은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 95.3±1.0%, 104.1±3.7%, 109.4±1.7%의 생성을 나타내었다.
5.
IL
-6 생성량을 측정
도 10 (A)에 나타낸 바와 같이, RAW 264.7 세포에서 연산오계 가슴살 펩타이드 추출물의 IL-6 생성량을 측정한 결과, 대조군을 92.3±0.6 pg/㎖로 나타냈을 때 1년산 수탉은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 52.6±1.8 pg/㎖, 50.8±1.4 pg/㎖, 44.0±0.4 pg/㎖의 생성을 나타내었으며, 3년산 수탉의 껍질 추출물은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 53.1±1.0 pg/㎖, 45.0±1.1 pg/㎖, 35.3±1.5 pg/㎖의 생성을 나타내었다. 또한, 3년산 암탉의 껍질 추출물은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 57.2±2.1 pg/㎖, 50.8±1.4 pg/㎖, 95.6±0.3 pg/㎖의 생성을 나타내어 1년산 수탉의 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도와 3년산 수탉의 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도, 3년산 암탉의 1, 10 (㎍/㎖) 농도에서 유의성 있는 (*** : p <0.001, ** : p <0.01) 감소를 나타내었다.
이와 같은 결과는 연산오계의 가슴살 펩타이드 추출물은 다리살 펩타이드 추출물과 마찬가지로 LPS로 유도 된 IL-6에 있어 뛰어난 감소가 나타나, IL-6와 관련된 질병에 있어 매우 효과적일 것이라 사료된다.
도 10 (B)에 나타낸 바와 같이, RAW 264.7 세포에서 연산오계 다리살 펩타이드 추출물의 IL-6 생성량을 측정한 결과, 대조군을 92.3±0.6 pg/㎖로 나타냈을 때 3년산 수탉의 껍질 추출물은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 46.0±2.5 pg/㎖, 38.2±1.1 pg/㎖, 61.8±1.7 pg/㎖의 생성을 나타내었으며, 3년산 암탉의 껍질 추출물은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 54.8±1.4 pg/㎖, 57.2±0.7 pg/㎖, 106.2±0.6 pg/㎖의 생성을 나타내어 3년산 수탉의 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도와 3년산 암탉의 1, 10 (㎍/㎖) 농도에서 유의성 있는 (*** : p <0.001, ** : p <0.01) 감소를 나타내었다.
이와 같은 결과는 연산오계의 날개살 펩타이드 추출물 역시 LPS로 유도 된 IL-6에 있어 뛰어난 감소가 나타나, IL-6와 관련된 질병에 있어 매우 효과적일 것이라 사료된다. 다만, 펩타이드 추출물의 모든 농도에서 뛰어난 감소가 나타난 것과는 달리 3년산 암탉의 100 ㎍/㎖ 농도에서는 감소가 나타나지 않은 점은 앞으로 심도있는 연구를 통해 밝혀내야 할 것이다.
6. TNF-α 생성량을 측정
도 11 (A)에 나타낸 바와 같이, RAW 264.7 세포에서 연산오계 가슴살 펩타이드 추출물의 TNF-α 생성량을 측정한 결과, 대조군을 6985.0±55.2 pg/㎖로 나타냈을 때 1년산 수탉은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 6612.3±189.9 pg/㎖, 6464.0±39.6 pg/㎖, 6453.0±101.1 pg/㎖의 생성을 나타내었으며, 3년산 수탉의 껍질 추출물은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 6559.8±71.8 pg/㎖, 6862.5±23.3 pg/㎖, 6643.8±105.7 pg/㎖의 생성을 나타내었다. 또한, 3년산 암탉의 껍질 추출물은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 6898.8±163.0 pg/㎖, 6707.5±152.0 pg/㎖, 6810.8±6.7 pg/㎖의 생성을 나타내었다.
도 11 (B)에 나타낸 바와 같이, RAW 264.7 세포에서 연산오계 다리살 펩타이드 추출물의 TNF-α 생성량을 측정한 결과, 대조군을 6985.0±55.2 pg/㎖로 나타냈을 때 3년산 수탉의 껍질 추출물은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 6571.8±54.8 pg/㎖, 6502.8±16.6 pg/㎖, 6879.5±35.4 pg/㎖의 생성을 나타내었으며, 3년산 암탉의 껍질 추출물은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 6617.5±14.1 pg/㎖, 6730.0±18.4 pg/㎖, 6943.3±123.4 pg/㎖의 생성을 나타내었다
7.
ALP
활성도 측정
도 12 (A)에 나타낸 바와 같이, 조골 세포에서 연산오계 가슴살 펩타이드 추출물의 ALP 활성도를 측정한 결과, 대조군을 100.0±5.0%로 나타냈을 때 1년산 수탉은 250, 500, 1000 (㎍/㎖) 농도에서 76.9±7.7%, 85.4±3.2%, 76.0±4.5%의 활성도를 나타내었으며, 3년산 수탉은 250, 500, 1000 (㎍/㎖) 농도에서 105.2±11.9%, 107.9±7.8%, 114.7±11.8%의 활성도를 나타내었다. 또한, 3년산 암탉은 250, 500, 1000 (㎍/㎖) 농도에서 91.7±9.8%, 91.5±10.9%, 76.0±10.1%의 활성도를 나타내었다.
도 12 (B)에 나타낸 바와 같이, 조골 세포에서 연산오계 날개살 펩타이드 추출물의 ALP 활성도를 측정한 결과, 대조군을 100.0±5.0%로 나타냈을 때 3년산 수탉은 250, 500, 1000 (㎍/㎖) 농도에서 95.7±9.6%, 104.7±4.8%, 103.4±9.9%의 활성도를 나타내었으며, 3년산 암탉은 250, 500, 1000 (㎍/㎖) 농도에서 89.0±13.8%, 93.5±3.0%, 89.0±16.3%의 활성도를 나타내었다.
8. TRAP 활성도
도 13 (A)에 나타낸 바와 같이, 조골 세포에서 연산오계 가슴살 펩타이드 추출물의 TRAP 활성도를 측정한 결과, 대조군을 100.0±5.0%로 나타냈을 때 1년산 수탉은 250, 500, 1000 (㎍/㎖) 농도에서 60.8±1.6%, 53.6±4.1%, 40.5±5.2%의 활성도를 나타내었으며, 3년산 수탉은 250, 500, 1000 (㎍/㎖) 농도에서 53.9±3.1%, 43.8±0.8%, 36.0±4.6%의 활성도를 나타내었다. 또한, 3년산 암탉은 250, 500, 1000 (㎍/㎖) 농도에서 47.3±0.0%, 43.5±4.9%, 41.4±6.2%의 활성도를 나타내었다.
도 13 (B)에 나타낸 바와 같이, 조골 세포에서 연산오계 날개살 펩타이드 추출물의 TRAP 활성도를 측정한 결과, 대조군을 100.0±5.0%로 나타냈을 때 3년산 수탉은 250, 500, 1000 (㎍/㎖) 농도에서 58.6±8.4%, 55.5±5.2%, 50.7±6.1%의 활성도를 나타내었으며, 3년산 암탉은 250, 500, 1000 (㎍/㎖) 농도에서 56.3±3.0%, 48.6±3.4%, 41.9±3.4%의 활성도를 나타내었다.
Claims (7)
- (a) 연산오계로부터 다리살, 날개살 또는 가슴살을 분리하여 다지는 단계;
(b) 상기 다진 육질을 균질화하고 단백질 가수분해 효소를 첨가하여 반응시키는 단계; 및
(c) 상기 가수분해된 반응물에 0.3 M TCA (Trichloroacetic acid)를 첨가하고, 상온에서 단백질을 침전시킨 후 3000 RPM에서 원심분리한 후 상등액만을 취하는 단계로 제조하여 항산화 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 연산오계 다리살, 날개살 또는 가슴살 펩타이드 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물. - 삭제
- 삭제
- (a) 연산오계로부터 다리살, 날개살 또는 가슴살을 분리하여 다지는 단계;
(b) 상기 다진 육질을 균질화하고 단백질 가수분해 효소를 첨가하여 반응시키는 단계; 및
(c) 상기 가수분해된 반응물에 0.3 M TCA (Trichloroacetic acid)를 첨가하고, 상온에서 단백질을 침전시킨 후 3000 RPM에서 원심분리한 후 상등액만을 취하는 단계로 제조하여 항산화 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 연산오계 다리살, 날개살 또는 가슴살 펩타이드 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물. - (a) 연산오계로부터 다리살, 날개살 또는 가슴살을 분리하여 다지는 단계;
(b) 상기 다진 육질을 균질화하고 단백질 가수분해 효소를 첨가하여 반응시키는 단계; 및
(c) 상기 가수분해된 반응물에 0.3 M TCA (Trichloroacetic acid)를 첨가하고, 상온에서 단백질을 침전시킨 후 3000 RPM에서 원심분리한 후 상등액만을 취하는 단계로 제조하여 항산화 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 연산오계 다리살, 날개살 또는 가슴살 펩타이드 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물. - (a) 연산오계로부터 다리살, 날개살 또는 가슴살을 분리하여 다지는 단계;
(b) 상기 다진 육질을 균질화하고 단백질 가수분해 효소를 첨가하여 반응시키는 단계; 및
(c) 상기 가수분해된 반응물에 0.3 M TCA (Trichloroacetic acid)를 첨가하고, 상온에서 단백질을 침전시킨 후 3000 RPM에서 원심분리한 후 상등액만을 취하는 단계로 제조하여 항산화 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 연산오계 다리살, 날개살 또는 가슴살 펩타이드 추출물을 유효성분으로 포함하는 사료 조성물. - 삭제
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-
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 김진우 외 4인. 동의보감에 수재된 오계에 대한 생리활성 연구. 대한본초학회지, 2015.09., 제30권, 제5호, pp. 23-28* |
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|---|---|
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