KR100401423B1

KR100401423B1 - 혼합 백신의 제조 방법

Info

Publication number: KR100401423B1
Application number: KR10-2001-0001290A
Authority: KR
Inventors: 김규완; 지희정; 이윤경; 김완규; 이희구; 김원겸
Original assignee: 주식회사 엘지생명과학
Priority date: 2001-01-10
Filing date: 2001-01-10
Publication date: 2003-10-17
Also published as: AR032391A1; UY27118A1; ZA200305072B; CA2434421A1; RU2264226C2; AU2002219693B2; DE60222529T2; US20040048336A1; DE60222529D1; MXPA03006154A; ATE373485T1; PL369433A1; JP2004517866A; EP1349572A1; PE20020758A1; BR0206391A; CA2434421C; EP1349572B1; EP1349572A4; MY143688A

Abstract

본 발명은 디프테리아, 파상풍, 백일해, B형 간염 등 소아기의 예방하여야 할 질병을 동시에 예방하는 혼합 백신의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의해, 디프테리아, 파상풍, 백일해 및 B형 간염 등 소아기의 예방하여야 할 각 질병에 대한 각각의 예방 항원을 수산화 알루미늄 겔 형태의 흡착제에 독립적으로 흡착시키는 단계 및 흡착후 상기 흡착제에 흡착된 각각의 예방항원을 혼합하는 단계를 포함하는, 디프테리아, 파상풍, 백일해 및 B형 간염 등 소아기의 예방하여야 할 질병을 동시에 예방하기 위한 혼합백신의 제조방법이 제공된다.

본 발명에 의한 혼합 백신의 사용에 의하여, 디프테리아, 파상풍, 백일해 및 B형 간염 등 소아기의 예방하여야 할 질병을 동시에 효과적으로 예방할 수 있다.

Description

혼합 백신의 제조 방법{A Manufacturing Method of Combined Vaccine}

본 발명은 디프테리아, 파상풍, 백일해, B형 간염 등 소아기의 예방하여야 할 질병을 동시에 예방할 수 있는 혼합 백신의 제조 방법에 관한 것이다.

혼합 백신은 여러 가지 다른 감염 질병에 대한 예방으로써 각 질병에 대한 예방 항원을 혼합한 백신이나 또는 한 가지 감염 질병에 대한 예방으로써 여러가지 관련 항원을 혼합한 백신을 일컫는다. 전자의 예로서는 디프테리아, 파상풍, 백일해에 대한 면역을 주는 DTP 백신과 홍역, 볼거리, 풍진에 대한 면역을 주는 MMR 백신 등이 있고, 이는 지난 20년간 사용되어 왔다. 후자의 예로서는 급성 중이염 등을 일으키는 폐구균에 대한 면역을 주는 14개 또는 23개의 폐구균 추출 다당질을 혼합한 폐구균 백신과 수막구균에 대한 면역을 주는 4개의 수막구균 추출 다당질을 혼합한 수막구균 백신 등이 이에 속하고, 이러한 백신은 지난 수년간 사용되어 왔다.

위에서 소개한 이제까지 개발된 혼합 백신은 오랜 기간 사용되어 오면서 각 감염 질병에 대한 높은 면역력과 적은 부작용, 여러 질병에 대한 적응력 등으로 인정되어 왔다. 이러한 이유로 많은 백신 개발자들은 여러 형태의 혼합 백신을 새로이 개발하였거나 개발중에 있다. 그러한 혼합 백신으로는 DTP 백신과 세균성 뇌수막염 백신(Hib 백신), 불활화 폴리오 백신, B형 간염 백신 등을 혼합한 백신(특허번호 : WO 99/13906호)이 있고, 폐구균 추출 다당질과 수막구균 다당질을 단백질과결합시킨 혼합 백신이 개발중에 있으며, 콜레라, 장티프스, 이질, 설사의 각 원인균에 대한 장내 감염을 예방하기 위한 혼합 백신 등도 머지않은 미래에 개발 예정에 있다.

여러 다른 감염 질병에 대한 예방을 위해 각 항원을 혼합하는 방식의 혼합 백신은 접종 횟수의 감소 및 백신 공급의 간편화 등에 따른 비용 감소 등의 이점 등을 줄 수 있다. 소아과학회 1997년 소아 예방 접종표에 따르면 특히, 태어난 지 1년 이하의 유아기에는 많은 백신의 접종 및 이종의 백신간의 중복 접종이 이루어지게 되므로, 이 시기에 적절한 혼합 백신을 사용하게 되면 피접종자 및 접종자 모두에게 편이를 제공하게 된다. 특히, 국내에서 반드시 실행하여야 하는 기본 접종 중 DTP 백신과 B형 간염 백신은 모두 기본 3회 접종에 추가적인 접종이 권장되고 있는 백신으로 접종 주기가 1년 이하의 유아기에 집중되어 있고, 그 접종 주기도 유사하므로 접종이 중복되는 문제가 발생하기도 한다.

이에 본 발명자들은 우선적으로 DTP 백신과 B형 간염 백신을 혼합하여 접종자 및 피접종자에게 편이를 제공하며, 혼합 백신을 통한 백신 공급의 안정화를 꾀하여 보다 많은 국민에게 보다 편리하게 백신의 혜택을 줄 수 있는 연구를 실시하게 되었다.

혼합 백신의 연구는 기존의 면역력 및 안정성이 입증이 된 제품을 혼합하는 연구이므로 각 예방 항원 및 흡착제 간의 상호 작용에 의한 반응성, 면역력 등의변화를 최소화하는 혼합 방법에 대한 연구가 혼합 백신 개발시의 주안점이고, 개발이 완료된 시점에서는 혼합 백신 간의 동질성, 안정성 문제가 검토 연구되어야 한다. 본 발명에서는 DTP 백신과 B형 간염 백신이 이미 기존의 면역력 및 안정성이 입증이 된 것에 기초하여 연구를 실시하였다.

각 성분 백신을 혼합하는 방법에는 먼저 각 성분 백신의 제품을 단순히 혼합하여 사용하는 방법(특허번호 : WO 99/13906호, WO 00/7623호)과 특수한 용기를 사용하여 주사 시에 동시에 투여될 수 있게 하는 방법(특허번호 : WO 99/13906호), 각 성분 백신을 하나의 제품으로 제조하는 방법 등 제품의 형태면에서 3가지의 방법으로 볼 수 있다. 그런데, 앞의 두 방법은 백신 공급면에서는 각 성분 백신을 단독으로 사용할 때와 거의 유사하거나 또는 단독으로 공급하는 경우보다 취급상의 주의를 요하게 되므로, 혼합 백신을 사용함으로써 얻게되는 실익이 거의 없다. 또한, 접종시 혼합에 의한 면역력의 변화, 부작용의 발생 등에 대한 연구가 어렵다. 그리하여, 혼합 백신의 연구를 위하여서는 각 성분 백신을 하나의 제품으로 제조하는 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 목적은, 디프테리아, 파상풍, 백일해 및 B형 간염 등 소아기의 예방하여야 할 질병을 동시에 예방하기 위한 혼합 백신의 제조방법을 제공하는 것이다.

도 1는 흡착제의 농도별 각 성분 항원의 흡착률을 나타낸 것이다. 본 도면에서 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, B형간염항원은 각각 디프테리아 항원, 파상풍 항원, B형 간염 항원의 구성 성분이고, 백일해 톡소이드와 백일해 FHA 항원 (백일해 사상 혈구 응집소 항원)은 정제 백일해 항원의 각 구성 성분이다.

도 2는 흡착 방법에 따른 항원가 및 면역력을 각각의 항원 구성 성분별로 비교한 것이다. 제형 1은 각 성분 백신의 혼합이 완료된 후에 여분의 수산화알루미늄 겔을 추가로 첨가한 제형이고, 제형 2는 같은 농도의 흡착제가 혼합 완료전에 미리 첨가된 제형이다.

도 3는 전세포성 백일해 항원을 포함한 혼합 백신의 면역력을 각각의 예방 질병별로 비교한 것이고, 제시된 역가 기준은 세계 보건 기구에서 권장하는 기준이다. 제형 A는 각 성분 백신의 혼합이 완료된 후에 여분의 수산화알루미늄 겔을 추가로 첨가한 제형이고, 제형 B는 같은 농도의 흡착제가 혼합 완료전에 미리 첨가된 제형이다.

본 발명에 따르면, 디프테리아, 파상풍, 백일해 및 B형 간염 등 소아기의 예방하여야 할 각 질병에 대한 각각의 예방 항원을 수산화 알루미늄 겔 형태의 흡착제에 독립적으로 흡착시키는 단계 및 흡착 후 상기 흡착제에 흡착된 각각의 표면항원을 혼합하는 단계를 포함하는, 디프테리아, 파상풍, 백일해 및 B형 간염 등 소아기의 예방하여야 할 질병을 동시에 예방하기 위한 혼합백신의 제조방법이 제공된다.

각 성분 백신을 하나의 제품으로 제조하는 방법은 흡착제를 사용하는 경우, 각 성분 백신을 구성하는 항원을 혼합한 후 흡착제를 이용하여 흡착하는 방법과 이미 흡착된 항원을 혼합하는 방법 등으로 나눌 수 있다. 그러나, 각각의 성분 항원을 먼저 혼합할 경우에는 용액 내에서의 각 항원간 상호 작용에 의하여 각 항원의 흡착제에 대한 흡착 능력이 감소할 가능성이 존재한다. 또한, 흡착제와 성분 항원 간의 흡착은 각각 독립적인 조건하에서 최적화되는데, 이러한 흡착 과정이 동시에 발생하게 되면 각 성분 항원의 흡착 조건의 작은 차이에 의해서 흡착률이 감소할 가능성이 존재한다. 성분 항원의 흡착제에 대한 흡착률과 그 백신의 면역력과의 관계는 서로 비례하므로,이러한 방식으로 제조된 혼합 백신의 면역력은 각 단독 백신의 면역력보다는 감소할 것이다.

그러므로, 혼합 백신의 제조시에는 각 성분 항원의 원액을 제조하여서, 독립적으로 흡착을 실시한 후에 이를 혼합하여 혼합 백신을 제조하는 것이 타당하다고 본 발명자들은 분석하였다.

그리고, 각 성분 항원을 각각의 흡착 형태로 혼합하는 경우에, 혼합 백신에서의 각 성분 항원의 최종 농도는 기존의 각 단독 백신에서의 성분 항원 농도와 동일하여야만, 그 면역력 및 특성에 대한 비교 시험이 유의성이 있기에, 혼합 백신의경우에는 단독 백신의 경우보다 더 농축된 성분 항원을 흡착한 후 혼합하여야 한다. 이에 따라, DTP 백신은 1.5 ∼ 2 배, B형 간염 백신은 2 ∼ 3 배로 농축된 항원으로 흡착하여 제조하고, 서로의 혼합 비율을 조정하여, 본 발명의 혼합 백신의 각 성분 항원의 최종농도가 각 단독 백신에서의 농도와 서로 일치하도록 조절하였다.

본 발명자들은 혼합 백신의 여러 조합에 대한 연구를 실시하였다. 이 경우, 각 면역 성분의 최종 함량은 단독 백신에서와 같은 함량으로 사용하였고, 흡착제 및 기타 성분의 함량을 조절하여 각 항원의 흡착률의 변화가 있는지를 살펴 보았고, 흡착률의 변화가 상대적으로 적은 각 제형을 소동물에 면역한 후 항체 생성률의 상대 비교를 통하여 올바른 혼합 방법에 대하여 고찰하였다.

또한, 흡착제의 선정을 위하여, 현재 제품화된 DTP 백신과 B형 간염 백신의 흡착제를 조사한 결과, 수산화알루미늄 겔과 인산알루미늄 겔 등이 주로 사용되고 있었다. 각 알루미늄 겔에 대한 단백질의 흡착은 주로 각 단백질과 겔 성분의 표면 전하 차이에 의한 것이고, 생리적 pH 범위에서 수산화알루미늄 겔은 양의 표면 전하를, 인산 알루미늄 겔은 음의 표면 전하를 띠고 있는 것으로 알려져 있다("Vaccine Design - The subunit and adjuvant approach", ed. by M.F. Powell M.J.Newman, 1995, p229-239). 그리하여, 두 형태의 알루미늄 겔을 동시에 사용할 경우에는 상호간의 작용이 발생하여, 용액내에 산포되어 있는 입자의 크기가 커지고, 단백질에 대한 흡착은 감소할 가능성이 존재한다고 본다. 그리고, B형 간염 백신 및 혼합 백신을 이루는 각 성분 항원의 표면 전하는 생리적 pH 범위에서 대개음의 표면 전하를 띠는 것으로 알려져 있으므로 수산화알루미늄 겔이 흡착제로 적절하다.

기존의 발명에서는 수산화알루미늄 겔과 인산 알루미늄 겔 등 흡착제의 성분을 혼용하고 있지만(특허 번호 WO 제93/24148호), 위와 같은 이유로 혼합 백신의 흡착제는 동일한 염 형태를 취하여야 하고, 이 흡착제로서 수산화알루미늄 겔을 사용하는 것이 각 성분 항원의 흡착률을 유지하는 데에 필수 구성 요소라고 본 발명자들은 분석하였다.

또한, 본 발명의 혼합 백신에서는 타 성분 항원은 단백질이 주성분인데 반하여 B형 간염 표면 항원의 경우에는 인지질막을 포함한 입자 형태로 존재하고 있는 경우가 대부분이기 때문에, 바람직하게는, 본 발명의 혼합 백신을 위한 B형 간염 백신의 제조시에 인지질막을 포함한 B형 간염 항원의 인지질 성분에 대한 타 항원에 의한 간섭 작용을 감소시키기 위하여, 폴리소베이트 20, 폴리소베이트 80, 트리톤 X-100 과 같은 중성 계면활성제를 추가로 첨가하여 제조하였다.

상기 중성 계면활성제의 양이 너무 높은 경우에는 B형 간염 백신의 역가가 감소하는 경향이 있으므로, B형 간염 표면 항원 단백량과의 50% 이하의 질량비로 첨가되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 디프테리아 항원으로써 코리네박테리움 디프테리아 PW No.8 주 (Corynebacterium diphtheriae, PW No. 8 )를 이용하여 적당한 배지에서 배양한 후, 통상적인 방법으로 정제한 디프테리아 독소를 무독화한 디프테리아 톡소이드가 적합하고, 항원의 양은 소아 1회 투여량 기준으로 10 ∼ 25 Lf가 적당하다. 파상풍 항원은 클로스트리듐 테타니 하버드 주( Clostridium tetanii, Harvard )를 혐기 조건하 적당한 배지에서 배양한 후, 통상적인 방법으로 정제한 파상풍 독소를 무독화한 파상풍 톡소이드가 적합하고, 항원의 양은 소아 1회 투여량 기준으로 1 ∼ 5 Lf가 적당하다. 그리고, 백일해 항원은 보데텔라 페르투시스 토하마 제1상주( Bordetella pertussis, Tohama phase I )를 이용하여 적당한 배지에서 배양한 후, 배양액에서 백일해 독소를 포함한 다종의 항원 단백질을 통상적인 방법으로 정제하여 독성을 제거하고 혼합한 정제 백일해 항원이나 전세포성 백일해 항원이 적합하고, 항원의 양은 정제된 다종의 항원 단백질인 경우에는 소아 1회 투여량 기준으로 20 ㎍PN 이하, 그리고 전세포성 백일해 항원인 경우에는 소아 1회 투여량 기준으로 20 OE 이하가 적당하다. 또한, B형 간염의 항원은 B형 간염 바이러스의 표면 항원의 유전자를 유전 공학적인 방법으로 재조합한 효모 세포를 배양하여 고순도로 정제된 표면 항원 단백질이 바람직하고, 항원의 양은 소아 1회 투여량 기준으로 5 ∼ 10 ㎍이 적당하다.

바람직하게는 본 발명에서는, 디프테리아 항원으로서 무독화한 디프테리아 독소를 소아 1회 투여량 기준 10∼25 Lf의 양으로 혼합하는 것을 특징으로 하는 혼합백신의 제조방법이 제공된다. 그리고, 바람직하게는 본 발명에서는, 파상풍 항원으로서 무독화한 파상풍 독소를 소아 1회 투여량 기준 1∼5 Lf의 양으로 혼합하는 것을 특징으로 하는 혼합백신의 제조방법이 제공된다. 또한, 바람직하게는 본 발명에서는 백일해 항원으로서, 정제된 다종의 항원 단백질을 소아 1회 투여량 기준 20 ㎍PN 이하의 양으로 혼합하거나 또는 전세포성 백일해 항원을 소아 1회 투여량 기준 20 OE 이하의 양으로 혼합하는 것을 특징으로 하는 혼합백신의 제조방법도 제공된다. 더 바람직하게는, 정제된 다종의 항원 단백질이, 무독화한 백일해 독소 및 사상 혈구 응집소 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 혼합백신의 제조방법이 제공된다.

바람직하게는 본 발명에서는, B형 간염 항원으로서 유전 공학적으로 제조된 B형 간염 표면 항원을 소아 1회 투여량 기준 5 ∼ 10 ㎍의 양으로 혼합하는 것을 특징으로 하는 혼합백신의 제조방법이 제공된다. 더 바람직하게는 상기에 있어서, B형 간염 표면 항원을 흡착제와 2 ∼ 8 ℃에서 3 ∼ 20 시간동안 교반하여 숙성시켜 흡착시키는 것을 특징으로 하는 혼합백신의 제조방법이 제공된다. 정확한 흡착제의 함량 연구를 위하여, 흡착제의 농도별 각 성분 항원의 흡착률을 조사한 결과, 최종 혼합이 완료된 시점에서의 최종 알루미늄 이온 농도가 0.5 mg/ml 이하일 때 각 항원의 흡착률이 상대적으로 저하되었다(도 1 참조). 그리고, 세계 보건 기구에서는 백신에서 사용하는 알루미늄 겔에서의 알루미늄 이온 농도를 1.25 mg/ml이하로 규정하였다(WHO, "Requirements for diphtheria, tetanus, pertussis and combined vaccines" in Technical Report Series No. 800, 1990, p87 ~ 179 ). 이런 사실을 토대로 할 때, 혼합 백신에서의 수산화알루미늄 겔로서 최종 알루미늄 이온의 농도는 0.5 ∼ 1.25 mg/ml 범위가 바람직하고, 0.7 mg/ml이 더 바람직하다.

그리고, 각 성분 백신의 혼합이 완료된 후에도, 각 성분 항원간의 척력에 의하여 각 성분 항원의 흡착률이 감소할 가능성을 억제하기 위하여 여분의 수산화알루미늄 겔을 혼합 후에 추가로 첨가한 제형과, 같은 농도의 흡착제가 혼합 완료전에 미리 첨가된 제형간의 비교를 위하여 각 성분 항원의 항원가와 항체가를 상대적인 백분율로 표시하여 조사한 결과, 각 성분 백신의 혼합이 완료된 후에도, 여분의 흡착제가 첨가되어야 각 항원 간의 항원가 및 항체가의 상호 작용이 줄어든다는 사실을 알 수 있었다(도 2 참조).

또한, 폴리소베이트 20 (트윈 20)을 첨가한 제형의 경우, B형 간염에 대한 항원가와 역가가 유지되는 결과를 얻었다. (도 2 참조) 이러한 결과를 토대로 폴리소베이트 20과 유사한 작용을 할 것으로 예상되며, 주사제에서 적정 농도 이하에서 사용 가능한 중성 계면 활성제인 폴리소베이트 80, 트리톤 X-100등을 사용하여도 유사한 결과가 나타날 것이다.

도 2 에서, 제형 1은 각 성분 백신의 혼합이 완료된 후에 여분의 수산화알루미늄 겔을 추가로 첨가한 제형이고, 제형 2는 같은 농도의 흡착제가 혼합 완료전에 미리 첨가된 제형이다.

바람직하게는 본 발명에서는, 제제화 후의 수산화알루미늄 겔의 알루미늄 이온 농도가 0.5 ∼ 1.25 mg/ml 범위인 것을 특징으로 하는 혼합백신의 제조방법이 제공된다. 또한 바람직하게는 본 발명에서는, 상기 흡착제에 흡착된 각각의 예방 항원을 혼합한 후에 0.5 ∼ 1.25 mg/ml 의 알루미늄 이온의 농도 범위를 넘지 않는 범위에서 여분의 흡착제를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 혼합백신의 제조방법이 제공된다. 본 발명의 상기 바람직한 구체예에 의하여 혼합 백신 내의 각 성분 항원의 흡착 형태를 유지하고 면역력을 높일 수 있다.

백일해 항원은 국내에서는 정제 백일해 항원을 사용하는 것이 일반적이나,미주나 제3세계 등에서는 무독화한 백일해 균주 자체를 이용하는 전세포성 백일해 항원을 사용하므로 이에 대한 혼합 방법도 연구하여, 본 발명의 혼합 백신의 적용 범위를 넓혔다. 이 경우에도 위의 정제 백일해 항원과 동일한 방식으로 혼합하여 각 성분의 면역력을 유지하는 제형을 얻었다. (도 3 참조)

전세포성 백일해 항원을 포함한 DTP 백신의 경우에는 흡착제로써 인산 알루미늄 겔을 사용하는 것이 일반적이나, B형 간염 항원과의 혼합 백신을 제조하기 위하여 수산화 알루미늄 겔을 사용하여 DTP 백신을 제조하였다. 이 경우, 백일해에 대한 면역력이 떨어지나, 각 성분 백신의 혼합이 완료된 후에 여분의 수산화 알루미늄 겔을 추가로 첨가한 제형(제형 A) 을 사용하는 경우에는 그 면역력을 유지할 수 있었다. 참고로 제형 B는 같은 농도의 흡착제가 혼합 완료전에 미리 첨가된 제형이다.

결론적으로 본 발명에서 적용한 혼합 방법은, 서로 다른 각각의 면역 성분간의 상호 작용을 최소화하면서 각각의 면역력은 감소하지 않는 것이었다. 본 발명의 혼합 백신에서 사용한 각 면역 성분을 물리 화학적인 부분으로 나누면, 단백질 항원(디프테리아 항원, 파상풍 항원, 정제 백일해 항원), 단백질과 인지질로 구성된 항원(B형 간염 항원), 사균체로 구성된 항원(전세포성 백일해 항원) 등으로 구분할 수 있다. 이는 대개의 백신이 이와 물리화학적으로 유사한 성분으로 구성된 것을 감안할 때, 다른 단독 백신과의 혼합에도 적용할 수 있다는 가설을 세울 수 있게 된다. 그러므로, 본 발명에서 사용된 혼합 백신을 모체로 하여 소아기에 예방하여야 하는 질병들(세균성 뇌수막염, 소아마비)에 대한 추가 백신의 혼합이 가능하리라 본다.

본 발명에서 사용한 혼합 백신 제제의 인체 접종 주기는 DTP백신이나 B형 간염 백신의 기존 접종 주기가 모두 가능하나, 모체에 B형 간염 항체가 있을 경우에는 2, 4, 6 개월의 3회 접종하는 방법이 가장 적당하며, 모체에 B형 간염 항체가 없을 경우에는 생후에 바로 B형 간염 백신을 단독으로 접종한 후, 추가 접종을 혼합 백신 제제로 접종하는 접종 주기가 적당하다. 소아에 대한 접종 방법은 근육 또는 피하 주사가 모두 적합하다. 본 발명에서 사용한 혼합 백신에서의 디프테리아, 파상풍, 백일해, B형 간염 각각의 항원의 소아 1회 투여량은 각 단독 백신에서의 항원의 소아 1회 투여량과 동일하다.

하기에서 실시예 및 실험예를 들어 본 발명을 더 상세히 설명하겠지만, 하기 실시예 및 실험예는 예시의 목적으로만 제공된 것이며, 본 발명의 범주 및 범위가 하기 실시예 및 실험예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1.

B형 간염 항원의 제조

B형 간염 표면 항원을 발현하는 유전 공학적으로 재조합된 효모 세포를 고농도로 배양하여 효모 세포가 대부분인 원심 분리하여 모은 침전물 1kg을 완충 용액 ( 0.5M NaCl, 10mM EDTA, 0.01% Thimerosal, 0.1M Phosphate, pH 7.0 )에 1:2의 비율로 혼탁화시켰다. 이 혼탁화시킨 용액을 유리알 파쇄기( glass bead beator 또는 Dynomil)로 통과시켜 세포벽 등을 파쇄하였다. 여기서 얻은 용액에 중성 계면활성제(Tween 계 또는 Triton 계)를 0.5% 첨가하고 4℃에서 1차 교반하여 골고루 섞이게 한 후, 수산화나트륨을 첨가하여 pH를 11로 적정하고 4℃에서 5시간 정도 교반하였다. 교반이 끝난 용액에 묽은 염산을 첨가하여 pH를 4로 적정한 후, 원심 분리기(ROTOR: JA-14, Beckman사, 미국)를 사용하여 6000rpm으로 15분간 원심 분리하여 침전물을 제거하고, B형 간염 표면 항원이 있는 상층액을 취하였다. 상층액의 pH를 7로 적정한 후, 실리카를 첨가하여 4∼25 ℃에서 3∼16 시간 교반하여 B형 간염 표면 항원을 실리카에 흡착시켰다. 본 발명의 방법과 함께 사용되기에 적합한 실리카겔은 100∼500 mm2/g내의 허용 표면적을 갖는 미립 수화 실리카 또는 무수 실리카를 포함하는데 가장 바람직하게는 에어로실 380( Aerosil 380, 데구싸 사, 미국)이 적합하다. B형 간염 표면 항원이 흡착된 실리카로부터 오염 물질을 제거하기 위하여 pH 7의 인산 나트륨-염화 나트륨 완충 용액으로 2회 세척하였다. 세척이 끝난 실리카를 pH 9.6의 탄산 나트륨 완충 용액에 약 2시간 접촉시킴으로써 표면 항원을 탈착시켰다. 이렇게 탈착된 표면 항원은 용액 내의 단백질의 순수도가 약 90% 이상 되었다. 이 용액을 탈착에 사용된 완충 용액으로 평형화한 음이온 교환 수지( DEAE-Sepharose, 파마시아사, 스웨덴)에 흘려 보내어 표면 항원을 특이적으로 부착시키고, 상기의 완충 용액으로 컬럼에 유리되어 있는 물질들을 제거하였다. 다시 0.05∼0.1M의 염화나트륨을 포함한 상기의 완충 용액으로 컬럼에 약하게 부착되어 있는 이물질을 용출시켰다. 이 과정 후에 0.2M의 염화나트륨을 포함한 상기의 완충 용액을 이용하여 B형 간염 표면 항원을 용출시켰다. 이렇게 용출된 용액을 분자량 100,000의 물질을 단절시키는 한외 여과막으로 농축한 다음 침전물을 원심 분리하여 제거하고 상층액만을 모아 겔 투과 크로마토그래피(gel permeation chromatography, Sepharose CL-4B, 파마시아사, 스웨덴)를 수행하여, 각 분획중 전기 영동을 통하여 순수한 표면 항원을 함유하고 있는 분획들을 모아 백신을 위한 B형 간염 항원으로 사용하였다. 또한, B형 간염 표면 항원에 의한 상호 작용을 감소하기 위하여 폴리소베이트 20을 1ml 당 0, 5, 10 ug으로 처리하여 변화 양상을 관찰하였다. (도 2 참조)

실시예 2.

디프테리아 톡소이드의 제조

상기의 코리네박테리움 디프테리아 PW No.8주를 영양 한천 배지(디프코사, 미국)에서 35℃로 24시간 배양하여 2회 계대 배양한 후, 그 중 한 개의 콜로니를 2ml의 브레인 하트 인퓨젼 배지(디프코사, 미국)에서 35℃로 24시간 배양한 것 중 1.2ml을 300ml의 변형 뮬러 배지(참조: Stainer 외 다수, Canadian J. Microbiol., 14:155, 1968)에 접종하여서 35℃로 36시간 배양하였다. 배양 완료 후, 배양액에서 균체를 제거하고 독소액만을 모아 4℃에서 황산암모늄을 첨가하여 그 최종 농도가 25(w/v)%이 되게 하고, pH를 8.0으로 조정하였다. 25(w/v)% 황산 암모늄을 포함한 10mM 트리스 완충 용액( pH 8.0 )으로 미리 평형시킨 페닐-세파로오스 컬럼에 상기 pH와 염도를 조정한 배양액을 점적하였다. 컬럼 평형 용액과 동일한 완충 용액과 15(w/v)% 황산 암모늄을 포함한 10mM 트리스 완충 용액( pH 8.0 )을 순차적으로 컬럼에 흘려 보내어 불순물을 제거한 후, 염을 포함하지 않은 10mM 트리스 완충 용액( pH 8.0 )으로 독소를 용출시켰다. 용출된 디프테리아 독소액만을 모아서 150mM 염화 나트륨을 포함한 10mM 인산 완충 용액( pH 7.4 )에 투석하였다. 투석 과정이 완료된 후, 포르말린을 최종 농도가 0.05(w/v)%가 되게 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음, 라이신을 최종 농도가 0.05M 이 되게 첨가하고, 37℃에서 4주일 동안 숙성시키어 무독화하였다. 무독화 과정이 완료된 톡소이드액은 150mM 염화 나트륨을 포함한 10mM 인산 완충 용액( pH 7.4 )에 투석하여 포르말린을 완전히 제거하고, 치메로살을 최종 농도가 0.01(w/v)%가 되게 첨가하여 이를 디프테리아 톡소이드액으로 사용하였다.

실시예 3.

파상풍 톡소이드의 제조

상기의 클로스트리듐 테타니 하바드 주를 멸균하여 40℃로 유지하는 리버 비일 한천 배지(디프코사, 미국)에 혼합하여 굳히어 35℃로 24시간 배양한 것 중 수개의 콜로니를 용존 산소의 양을 줄인 2ml의 0.3 (w/v)% 효모 추출물(디프코사, 미국)을 포함한 브레인 하트 인퓨젼 배지(디프코사, 미국)에 접종하고 혐기 상태로 35℃로 24시간 배양한 후, 질소 가스로 충분히 포화시킨 0.3 (w/v)% 효모 추출물(디프코사, 미국)을 포함한 브레인 하트 인퓨젼 배지(디프코사, 미국) 500ml에 접종하여 혐기 상태로 35℃로 7일간 배양하였다. 배양 완료 후, 배양액에서 균체를 제거하고 독소액만을 모아 4℃에서 황산암모늄을 최종 농도가 60(w/v)%이 되게 첨가하고, 24시간이상 교반하여 충분히 섞어 준 후, 침전물을 원심 분리로 회수하였다. 침전물을 소량의 증류수에 용해시키고, 불용성 물질을 제거한 후, 0.5M 염화 나트륨을 포함한 10mM 트리스 완충 용액(pH 8.0)으로 미리 평형시킨 세파크릴 S-100 컬럼에 점적하였다. 동일한 완충 용액을 흘려 주어, 분리된 독소를 용출시킨 후, 파상풍 독소액만을 모아 150mM 염화 나트륨을 포함한 10mM 인산 완충 용액(pH 7.4 )에 투석하였다. 투석 과정이 완료된 후, 포르말린을 최종 농도가 0.025 (w/v)%가 되게 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음, 라이신과 탄산수소나트륨을 최종 농도가 각각 0.05M, 0.04M 이 되도록 첨가하고, 37℃에서 4주일 동안 숙성시키어 무독화하였다. 무독화 과정이 완료된 톡소이드액은 150mM 염화 나트륨을 포함한 10mM 인산 완충 용액( pH 7.4 )에 투석하여 포르말린을 완전히 제거하고, 치메로살을 최종 농도가 0.01 (w/v)%가 되게 첨가하여 이를 파상풍 톡소이드액으로 사용하였다.

실시예 4.

정제 백일해 항원 단백질의 제조

백일해균 보르데텔라 퍼투시스 토하마 제1상주( Bordetella pertussis, Tohama phase I )를 15% 토끼 혈액을 포함한 보뎃-겐고 한천 배지(디프코사, 미국)에서 35℃로 72시간 배양하여 2회 계대 배양한 후, 이중 수개의 콜로니를 스테이너-숄테 배지 50ml에 접종하여 35℃로 48시간 배양한 것을 500ml의 변형 스테이너-숄테 배지( 참조 Imazumi et al., INFECT.-IMMUN., 1983, vol 41, pp. 1138)에 다시 접종하여서 35℃로 36시간 배양하였다. 배양이 완료된 배양액에 10% 치메로살 수용액을 최종 농도 0.01%로 첨가하여 백일해 균의 성장을 억제한 후, 원심 분리를 사용하여 균체를 제거하였다. 균체가 제거된 배양액에 3배 부피의 증류수를 첨가하여 충분히 혼합한 다음, 1N 황산 수용액을 사용하여 pH 6.0으로 낮추었다. 이를 pH 6.0의 10mM 인산 나트륨 완충 용액으로 미리 평형시킨 CM-세파로오즈 컬럼에 점적하였다. 컬럼 평형 용액과 동일한 완충 용액을 컬럼에 흘려 주어 컬럼에 결합하지 않은 물질들을 제거하고, 100mM 염화 나트륨을 포함한 컬럼 평형 용액과 동일한 완충 용액으로 컬럼에 약한 결합을 한 불순물들을 제거하였다. 불순물이 컬럼을 통하여 더 이상 유출되지 않게 되면, 동일한 부피의 100mM 염화 나트륨과 600mM 염화 나트륨을 각각 포함하는 컬럼 평형 용액과 동일한 완충 용액으로 직선 농도 구배를 형성시키어 컬럼에 흘려 주어 백일해 독소와 사상 혈구 응집소 등의 백일해 항원 단백질을 포함하는 분획을 분리하였다. 항원 분획을 2배 부피의 10mM 인산 나트륨 완충 용액(pH 8.0)으로 희석한 후, pH를 8.0으로 조정하였다. 이를 pH 8.0의 10mM 인산 나트륨 완충 용액으로 미리 평형시킨 하이드록시 인회석 컬럼에 점적하였다. 100mM 염화 나트륨을 포함하는 컬럼 평형 용액과 동일한 완충 용액을 컬럼에 흘려 주어 컬럼에 결합하지 않은 물질들을 제거하였다. 100mM 염화 나트륨을 포함한 pH 8.0의 80mM 인산 나트륨 완충 용액으로 점적시와 같은 유속으로 흘려 주어 백일해 독소 분획을 분리하였다. 백일해 독소의 분리가 완료되면, 200mM 염화 나트륨을 포함한 pH 8.0의 250mM 인산 나트륨 완충 용액으로 점적시와 같은 유속으로 흘려 주어 사상 혈구 응집소 분획을 분리하였다. 각 분리된 백일해독소와 사상 혈구 응집소 등은 0.15% 염화 나트륨을 포함하는 10mM 인산 나트륨 완충 용액 ( pH 7.4 )에 4℃에서 투석하였다. 투석이 완료된 백일해 독소 시료액에 글리세롤과 글루탈 알데하이드를 최종 농도가 각각 50(w/v)%, 0.05(w/v)%가 되게 첨가하고, 37℃에서 4시간 동안 무독화하고 나서, 아스파틱산 나트륨을 최종 농도가 0.025M이 되게 첨가하여 무독화 과정을 종료하였다. 투석이 완료된 사상 혈구 응집소 시료액에는 글리세롤과 포르말린을 최종 농도가 각각 50(w/v)%, 0.025(w/v)%가 되게 첨가하고, 37℃에서 24시간 동안 무독화하고 나서, 라이신을 최종 농도가 0.025M이 되게 첨가하여 무독화 과정을 종료하였다. 각 시료액을 상온에서 0.15% 염화 나트륨을 포함하는 10mM 인산 나트륨 완충 용액( pH 7.4 )에 투석하고, 치메로살을 최종 농도가 0.01(w/v)%가 되게 각각 첨가하였다. 상기 단계가 완료된 무독화한 백일해 독소 시료액과 사상 혈구 응집소 시료액을 1대 4의 비율로 혼합하여 이를 백일해 항원 단백질로 사용하였다.

실시예 5.

전세포성 백일해 항원의 제조

백일해균 보르데텔라 퍼투시스 토하마 제1상주( Bordetella pertussis, Tohama phase I )를 15% 토끼 혈액을 포함한 보뎃-겐고 한천 배지(디프코사, 미국)에서 35℃로 72시간 배양하여 2회 계대 배양한 후, 이중 수개의 콜로니를 스테이너-숄테 배지 50ml에 접종하여 35℃로 48시간 배양한 것을 500ml의 변형 스테이너-숄테 배지( 참조: Imazumi 외 다수, INFECT.-IMMUN., 1983, vol 41, pp.1138 )에 다시 접종하여서 35℃로 36시간 배양하였다. 배양이 완료된 배양액에 10% 치메로살 수용액을 최종 농도 0.01%로 첨가하여 백일해 균의 성장을 억제한 후, 원심 분리를 사용하여 균체를 모았다. 수집한 균체액은 0.15% 염화 나트륨을 포함하는 10mM 인산 나트륨 완충 용액( pH 7.4 )에 4℃에서 투석하였다. 투석이 완료된 백일해 균체액에 포르말린을 최종 농도가 0.025(w/v)%가 되게 첨가하고, 37℃에서 4주간 동안 무독화시킨 후, 라이신을 최종 농도가 0.025M이 되게 첨가하여 무독화 과정을 종료하였다. 시료액을 상온에서 0.15% 염화 나트륨을 포함하는 10mM 인산 나트륨 완충 용액( pH 7.4 )에 투석하고, 치메로살을 최종 농도가 0.01(w/v)%가 되게 첨가하였다. 이를 전세포성 백일해 항원으로 사용하였다.

실시예 6.

정제 백일해 항원을 포함하는 혼합 백신의 제조

단계 1. B형 간염 백신의 제조

상기 실시예 1에서 제조된 B형 간염 표면 항원을 이용하여 제조하였다. 인산염 완충 용액에 수산화알루미늄 겔을 가하여 수산화알루미늄 용액을 제조한 후 이 용액을 서서히 교반하면서 위의 항원 용액을 적가한 뒤 4℃에서 15시간동안 충분한 교반, 배합하여 B형 간염 백신을 제조하였다. 이 때의 B형 간염 표면 항원의 양은 일반적인 B형 간염 백신의 양보다 3배 농축된 60 ㎍/ml 을 사용하였고, 제형 1의 경우에는 수산화알루미늄 겔에서의 알루미늄 이온의 양은 0.9 mg/ml 을 사용하였다. 제형 2의 경우에는 수산화알루미늄 겔에서의 알루미늄 이온의 양은 1.5 mg/ml 을 사용하였다. (도 2 참조)

단계 2. DTP 혼합 백신의 제조

상기 관련 실시예 2, 3 및 4 에서 제조된 각 항원을 이용하여 제조하였다. 통상의 방법과 같이 인산염 완충 용액에 수산화알루미늄 겔을 가하여 수산화알루미늄 용액을 제조한 후 이 용액을 서서히 교반하면서 위의 각 항원 용액을 적가한 뒤 충분한 시간을 교반하여 균일하게 흡착시켜 DTP 혼합 백신을 제조하였다. 이 때의 각 항원의 양은 일반적인 DTP 백신의 각 성분 항원의 양보다 1.5 배 농축된 양을 사용하였고, 수산화알루미늄 겔에서의 알루미늄 이온의 양은 0.3 mg/ml을 사용하였다.

단계 3. DTP-B형 간염 혼합 백신의 제조

상기 단계 1 및 2 에서 제조된 각 DTP 백신과 B형 간염 백신을 2:1의 부피비로 서서히 교반하면서 배합하고, 제형 1의 경우에는 수산화알루미늄 겔에서의 알루미늄 이온의 양이 최종 0.7 mg/ml이 되게 여분의 수산화알루미늄 겔을 첨가한 후, 25℃에서 1시간동안을 계속 교반하여 조성물간의 상호 작용을 하지 않는 안정한 혼합 백신을 제조하였다. 제형 2의 경우에는여분의 수산화 알루미늄 겔을 첨가하지 않고, 25℃에서 1시간동안을 계속 교반하여 혼합 백신을 제조하였다. 제형 1, 2 모두 혼합 백신의 수산화 알루미늄 겔에서의 알루미늄 이온의 양은 0.7 mg/ml이다.역가 실험을 위하여 혼합 백신의 조성은 1ml 기준으로 B형 간염 표면 항원 20 ug, 디프테리아 톡소이드 25 Lf, 파상풍 톡소이드 3 Lf, 백일해 톡소이드 2.5 ugPN, 백일해 FHA 항원 (백일해 사상 혈구 응집소 항원) 10 ugPN으로 제조하였다. (도 2 참조)

실시예 7.

전세포성 백일해 항원을 포함하는 혼합 백신의 제조

단계 1. B형 간염 백신의 제조

단계 2. DTP 혼합 백신의 제조

상기 실시예 2, 3 및 5 에서 제조된 각 항원을 이용하여 제조하였다. 통상의 방법과 같이 인산염 완충 용액에 수산화알루미늄 겔을 가하여 수산화알루미늄 용액을 제조한 후 이 용액을 서서히 교반하면서 위의 각 항원 용액을 적가한 뒤 충분한 시간을 교반하여 균일하게 흡착시켜 DTP 혼합 백신을 제조하였다. 이 때의 각 항원의 양은 일반적인 DTP 백신의 각 성분 항원의 양보다 1.5 배 농축된 양을 사용하였고, 수산화알루미늄 겔에서의 알루미늄 이온의 양은 0.3 mg/ml을 사용하였다.

단계 3. DTP-B형 간염 혼합 백신의 제조

상기 단계 1 및 2 에서 제조된 각 DTP 백신과 B형 간염 백신을 2:1의 부피비로 서서히 교반하면서 배합하고, 제형 1의 경우에는 수산화알루미늄 겔에서의 알루미늄 이온의 양이 최종 0.7 mg/ml이 되게 여분의 수산화알루미늄 겔을 첨가한 후, 25℃에서 1시간동안을 계속 교반하여 조성물간의 상호 작용을 하지 않는 안정한 혼합 백신을 제조하였다. 제형 2의 경우에는여분의 수산화 알루미늄 겔을 첨가하지 않고, 25℃에서 1시간동안을 계속 교반하여 혼합 백신을 제조하였다. 제형 1, 2 모두 혼합 백신의 수산화 알루미늄 겔에서의 알루미늄 이온의 양은 0.7 mg/ml이다. 역가 실험을 위하여 혼합 백신의 조성은 1ml 기준으로 B형 간염 표면 항원 20 ug, 디프테리아 톡소이드 50 Lf, 파상풍 톡소이드 10 Lf, 전세포성 백일해 항원 20 OE 로 제조하였다. (도 2 참조)

실시예 8. 혼합 백신 항원가 실험

실시예 6 및 7에 의하여 제조된 혼합 백신의 항원가 실험은 각 항원에 대한 모노클로날 항체와 폴리클로날 항체를 이용한 효소 면역 측정법을 이용하여 각 항원의 표준품과 비교하여 항원가를 측정하였다.

그리고, 각 항원의 흡착률을 조사하기 위하여 알루미늄 염에 흡착된 항원을 원심 분리로 제거한 후, 상층액만을 가지고 유리된 항원의 양을 측정하였다.

각 결과의 평균치를 도 1 에 표시하였고, 도 2 에는 각 성분 항원으로 구성된 단독 백신 대비 백분율로 표시하였다.

실시예 9. 혼합 백신의 역가 실험

B형 간염 역가 실험

실시예 6 및 7에 의하여 제조된 혼합 백신과 B형 간염 백신을 각각 16마리를 1군으로 하는 ICR 마우스에 접종하고 28일 후에 채혈하여 혈청만을 분리하고, 혈청의 B형 간염 표면 항원에 대한 항체가를 효소 면역 측정법을 이용하여 IU/ml단위로 측정하여 각 기하 평균을 구하였고, B형 간염 백신 대비, 혼합 백신의 역가를 계산하였다.

도 2 에는 각 성분 항원으로 구성된 단독 백신 대비 백분율로 표시하였고, 도 3 에는 각 역가의 수치를 제시하였다.

디프테리아 역가 실험

실시예 6 및 7에 의하여 제조된 혼합 백신과 DTP 백신을 각각 16마리를 1군으로 하는 ICR 마우스에 접종하고 28일 후에 채혈하여 혈청만을 분리하고, 혈청의 디프테리아 항원에 대한 항체가를 효소 면역 측정법을 이용하여 IU/ml단위로 측정하여 각 기하 평균을 구하였고, DTP 백신 대비 혼합 백신의 역가를 측정하였다.

파상풍 역가 실험

실시예 6 및 7에 의하여 제조된 혼합 백신과 DTP 백신을 각각 16마리를 1군으로 하는 ICR 마우스에 접종하고 28일 후에 채혈하여 혈청만을 분리하고, 혈청의 파상풍 항원에 대한 항체가를 효소 면역 측정법을 이용하여 IU/ml단위로 측정하여 각 기하 평균을 구하였고, DTP 백신 대비 혼합 백신의 역가를 측정하였다.

백일해 역가 실험

실시예 6 및 7에 의하여 제조된 혼합 백신과 DTP 백신을 각각 16마리를 1군으로 하는 ICR 마우스에 접종하고 28일 후에 채혈하여 혈청만을 분리하고, 혈청의 백일해 항원에 대한 항체가를 효소 면역 측정법을 이용하여 IU/ml단위로 측정하여각 기하 평균을 구하였고, DTP 백신 대비 혼합 백신의 역가를 측정하였다.

본 발명에 따르면, 디프테리아, 파상풍, 백일해 및 B형 간염 등 소아기의 예방하여야 할 질병을 동시에 예방하기 위한 혼합 백신의 제조방법이 제공된다. 본 발명에 의한 혼합 백신의 사용에 의하여, 디프테리아, 파상풍, 백일해 및 B형 간염 등 소아기의 예방하여야 할 질병을 동시에 효과적으로 예방할 수 있다.

상기에서 본 발명은 기재된 구체예를 중심으로 상세히 설명되었지만, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

Claims

디프테리아, 파상풍, 백일해 및 B형 간염 등 소아기의 예방하여야 할 각 질병에 대한 각각의 예방 항원을 수산화 알루미늄 겔 형태의 흡착제에 독립적으로 흡착시키는 단계 및 흡착 후 상기 흡착제에 흡착된 각각의 예방 항원을 혼합하는 단계를 포함하는, 디프테리아, 파상풍, 백일해 및 B형 간염 등 소아기의 예방하여야 할 질병을 동시에 예방하기 위한 혼합백신의 제조방법
제1항에 있어서, 혼합 백신 제제 후의 수산화알루미늄 겔의 알루미늄 이온 농도가 0.5 ∼ 1.25 mg/ml 범위인 것을 특징으로 하는, 혼합백신의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 흡착제에 흡착된 각각의 예방 항원을 혼합한 후에, 0.5 ∼ 1.25 mg/ml 의 알루미늄 이온의 농도 범위를 넘지 않는 범위에서 여분의 흡착제를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 혼합백신의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 B형 간염 항원으로서 유전 공학적으로 제조된 B형 간염 표면 항원을 소아 1회 투여량 기준 5 ~ 10 ug 의 양으로 혼합하는 것을 특징으로 하는,혼합백신의 제조방법.
제4항에 있어서, 폴리소베이트 20, 폴리소베이트 80, 트리톤 X-100 과 같은 중성 계면활성제를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 혼합백신의 제조방법.
제4항에 있어서, B형 간염 항원을 흡착제와 2∼8℃에서 3∼20 시간동안 교반하여 숙성시켜 흡착시키는 것을 특징으로 하는, 혼합백신의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 디프테리아 항원으로서 무독화한 디프테리아 독소를 소아 1회 투여량 기준 10∼25 Lf의 양으로 혼합하는 것을 특징으로 하는, 혼합백신의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 파상풍 항원으로서 무독화한 파상풍 독소를 소아 1회 투여량 기준 1∼5 Lf의 양으로 혼합하는 것을 특징으로 하는, 혼합백신의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 백일해 항원으로서, 정제된 다종의 항원 단백질을 소아 1회 투여량 기준 20 ㎍PN 이하의 양으로 혼합하거나 또는 전세포성 백일해 항원을 소아 1회 투여량 기준 20 OE 이하의 양으로 혼합하는 것을 특징으로 하는,

혼합백신의 제조방법.
제9항에 있어서, 정제된 다종의 항원 단백질이, 무독화한 백일해 독소 및 사상 혈구 응집소 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는, 혼합백신의 제조방법.