BR112014017416B1

BR112014017416B1 - Processo de preparação de uma combinação vacinal contendo pelo menos dois antígenos capazes de se adsorverem sobre o óxi-hidróxido de alumínio e composição vacinal

Info

Publication number: BR112014017416B1
Application number: BR112014017416-4A
Authority: BR
Inventors: Landry Bertaux; Isabelle Chacornac; Alain Françon; Jean-François Hau; Sandrine Lentsch Graf
Original assignee: Sanofi Pasteur
Priority date: 2012-01-17
Filing date: 2013-01-17
Publication date: 2022-08-16
Also published as: MX2014007850A; JP6356886B2; ES2625011T3; ZA201405431B; SI2804628T1; RS55962B1; JP6199310B2; US9358294B2; DK2804628T3; EA201491387A1; KR20140119109A; LT2804628T; MX349411B; EA026058B1; PT2804628T; US20140370049A1; EP2804628A1; JP2015504085A; NZ627345A; AU2013210927A1

Abstract

PROCESSO DE FORMULAÇÃO DE UMA VACINA CONTENDO PELO MENOS DOIS ANTÍGENOS CAPAZES DE SE ADSORVEREM SOBRE O ÓXI-HIDRÓXIDO DE ALUMÍNIO. A invenção tem por objeto um processo para preparar uma composição vacinal, compreendendo pelo menos o óxi-hidróxido de alumínio (AlOOH) e pelo menos o antígeno de superfície da hepatite B e o antígeno de Haemophilus influenzae tipo b. De acordo com a invenção o antígeno de superfície da hepatite B é mantido adsorvido sobre AIOOH, enquanto que o antígeno de Hib é mantido não adsorvido. Para esse fim: se procede à adsorção do antígeno de superfície da hepatite B sobre AIOOH, a fim de obter um complexo AIOOH/HBsAg, depois se mistura esse complexo AIOOH/HBsAg com o antígeno de Hib em presença dos ácidos aminados catiônicos a uma concentração de pelo menos 100 mg/l, e de íons fosfato a uma concentração de 35 a 45 mMol/l.

Description

[001] A presente invenção é relativa ao domínio das combinações vacinais, compreendendo, ao mesmo tempo, a valência Hepatite B constituída pelo antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg) e a valência Haemophilus influenzae tipo b, constituída por seu poli-sacarídeo capsular, denominado poli-ribosil ribitol fosfato (PRP) que é, para ser eficaz nas crianças de menos de dois anos, conjugado a uma proteína portadora, por exemplo, a proteína tetânica.

[002] Essas combinações que são destinadas à administração das crianças de baixa idade, compreendem geralmente outros antígenos, permitindo vacinar, em uma única operação, contra várias doenças, assim como um adjuvante à base de alumínio.

[003] Assim, o pedido de patente WO99/13906 divulga uma composição vacinal, compreendendo, assim como foi descrito na página 13, antígenos contra a difteria, o tétano, a pólio, a coqueluche, a hepatite B e as infecções a Haemophilus influenzae tipo b. Determinados desses antígenos necessitam de, para serem imunógenos, ser adsorvidos sobre um sal de alumínio. É o caso notadamente do antígeno de superfície da hepatite B ou HBsAg.

[004] Ora, assim como foi indicado na página 12 do pedido WO99/13906, a valência HIB constituída pelo poli-sacarídeo capsular conjugado à proteína tetânica, tem tendência a perder sua imunogenicidade no decorrer do tempo, quando ela é adsorvida sobre sais de alumínio. Para evitar esse inconveniente, a solução proposta nessa técnica anterior é, assim como já foi recomendado no pedido anterior PCT/FR96/00791, acrescentar ânions e notadamente íons fosfato, carbonato ou citrato.

[005] Todavia, os autores da presente invenção observaram que, se o acréscimo de ânions, notadamente de fosfatos ou de carbonatos, permitir efetivamente evitar a adsorção do PRP-T sobre o óxi-hidróxido de alumínio (AlOOH), e, portanto, manter sua imunogenicidade no decorrer do tempo, esse acréscimo terá também por inconveniente dessorver o antígeno de superfície da hepatite B quando este fora, também adsorvido sobre o óxi-hidróxido de alumínio.

[006] É, portanto, necessário encontrar um processo de preparo de uma combinação vacinal, compreendendo o óxi-hidróxido de alumínio, na qual o antígeno de superfície da hepatite B é mantido adsorvido sobre AlOOH, enquanto que o antígeno de Hib é mantido não adsorvido.

[007] Para isso, a presente invenção tem por objeto um processo de preparo de uma combinação vacinal líquida, compreendendo pelo menos:

[008] - um antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg);

[009] - um antígeno de Haemophilus influenzae tipo b (Hib) constituído por poli-sacarídeo capsular conjugado a uma proteína portadora;

[0010] - o óxi-hidróxido de alumínio (AlOOH), na qual o antígeno de superfície da hepatite B é mantido adsorvido sobre AIOOH, enquanto que o antígeno de Hib é mantido não adsorvido,

[0011] segundo o qual:

[0012] - se procede à adsorção do antígeno de superfície da hepatite B sobre AIOOH, a fim de obter um complexo AIOOH/HBsAg,

[0013] - se mistura esse complexo AIOOH/HBsAg com o antígeno de Hib em presença de ácidos aminados catiônicos a uma concentração de pelo menos 100 mg/l, e de íons fosfato a uma concentração de 35 a 45 mMol/l.

[0014] Graças ao processo, de acordo com a invenção, é possível atingir o equilíbrio desejado entre a manutenção da adsorção do antígeno de superfície da hepatite B sobre o óxi-hidróxido de alumínio e a manutenção da não adsorção do antígeno de Hib.

[0015] De acordo com um modo particular de realização da invenção, procede-se à adsorção do antígeno HBsAg sobre o alumínio, misturando uma suspensão de AlOOH a uma suspensão de HBsAg sob agitação durante pelo menos quatro horas, de preferência, pelo menos 12 horas, de preferência, entre 20 e 24 horas.

[0016] De acordo com um modo particular de realização da invenção, acrescentam-se os ácidos aminados catiônicos a esse complexo AlOOH/HBsAg, antes da mistura com o antígeno Hib.

[0017] De acordo com um modo particular de realização da invenção, acrescentam-se os ácidos aminados catiônicos a esse antígeno de Hib antes da mistura com o complexo AlOOH/HBsAg.

[0018] De acordo com um modo de realização da invenção, acrescentam-se os íons fosfato a esse complexo AlOOH/HBsAg, antes da mistura com o antígeno Hib.

[0019] De acordo com um modo de realização da invenção, ajusta- se o pH do preparado, compreendendo o complexo AlOOH/HBsAg a 7.1 + 0,1 antes da mistura com o antígeno de Hib.

[0020] A invenção tem também por objeto uma combinação vacinal obtida, segundo o processo reivindicado e compreendendo pelo menos:

[0021] - o antígeno de superfície da hepatite B,

[0022] - o antígeno da difteria sob a forma de toxina diftérica D,

[0023] - o antígeno do tétano sob a forma de toxina tetânica T,

[0024] - os antígenos da coqueluche sob a forma de Toxina Purificada (PTxd) e de Hemaglutinina Filamentosa (FHA),

[0025] - o antígeno de Haemophilus influenzae tipo b, sob a forma de poli-ribosil ribitol fosfato conjugado à proteína tetânica (PRP-T),

[0026] - os antígenos da pólio sob a forma de vírus inativados de tipo 1, 2 e 3.

[0027] Essa composição vacinal apresenta a vantagem de se apresentar sob a forma líquida, o que evita operações de retomada de liofilizado; ela se mostrou suficientemente estável para permanecer imunógeno até hoje de sua utilização e isto mesmo a 36 meses depois de sua data de fabricação.

[0028] De acordo com a invenção, a composição vacinal compreende um antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg). Esse antígeno pode notadamente ser um antígeno de superfície da hepatite B, tal como aquele presente na vacina Recombivax HBTM, ou em qualquer outra vacina contra hepatite B. Pode notadamente tratar-se do antígeno recombinante obtido por fermentação de um lêvedo Hansenula polymorpha modificada, segundo a tecnologia desenvolvida por Crucell, tal como aquele presente na vacina Hepavax-GeneTM. Para fins da invenção, a quantidade de HBsAg presente em uma dose de 0,5 ml está vantajosamente compreendida entre 5 e 15 μg e, em particular, de 10 μg.

[0029] De acordo com a invenção, a composição vacinal compreende um antígeno de Haemophilus influenzae tipo B, (Hib). Esse antígeno é constituído pelo poli-sacarídeo capsular da bactéria ou poli-ribosil ribitol fosfato que é conjugado a uma proteína portadora. A proteína portadora pode ser qualquer proteína em uso a esse respeito no domínio das vacinas. Pode ser, por exemplo, a toxina diftérica D, a toxina tetânica T, a lipoproteína D de Haemophilus influenzae, a CRM197 ou a proteína da membrana externa (OMP) de N. meningitidis. Utiliza-se, de preferência, a proteína tetânica, a fim de se obter o conjugado PRP-T. Para fins da presente invenção, o conjugado PRP-T pode estar presente, à razão de 1 a 30 μg de PRP por dose de 0,5 ml; vantajosamente de 5 a 25 μg de PRP por dose; de preferência, de 10 a 15 μg de PRP por dose; de maneira inteiramente preferida de 10 a 12 μg de PRP por dose, e, mais particularmente, 12 μg de PRP, conjugado a 22-36 μg de proteína tetânica.

[0030] De acordo com a invenção, a composição vacinal compreende óxi-hidróxido de alumínio AlOOH. Esse sal de alumínio é muito freqüentemente denominado, por abuso de linguagem, hidróxido de alumínio. O AlOOH podendo ser utilizado para fins da presente invenção pode ser, por exemplo, o AlOOH comercializado por Brenntag AG ou o Rehydragel HPA de Reheis Corp. (Berkeley Heights, NJ), embora o modo de produção de cada um dos dois adjuvantes difira. A quantidade de AlOOH utilizada é calculada para permitir o alcance de uma resposta imunitária satisfatória; ela depende notadamente do número e da natureza dos antígenos presentes na composição, assim como a quantidade de cada um desses antígenos.

[0031] A título informativo somente, o máximo de adsorção do HBsAg sobre o AlOOH é da ordem de 780 μg de proteína por mg de alumínio (de maneira clássica a quantidade de AlOOH é expressa em quantidade de alumínio Al3+). Para uma dose vacinal que compreende 10 μg de HBsAg, sem outros antígenos adicionais, bastaria, portanto, 13 μg de alumínio, quantidade, todavia, insuficiente para se obter a eficácia buscada, quando outros antígenos são acrescentados. Assim, em função do acréscimo de um ou vários antígenos suplementares, pode-se colocar em contato 10 μg de HBsAg com 0,01 mg a 1,25 mg de alumínio que é a quantidade máxima recomendada pela farmacopeia europeia.

[0032] Por exemplo, uma dose de 0,5 ml de uma vacina pediátrica, compreendendo antígenos da difteria, do tétano, da coqueluche, da hepatite B, pode conter, de maneira convencional, de 0,5 a 0,7 mg de alumínio, de preferência, aproximadamente 0,6 mg de alumínio.

[0033] De acordo com a invenção o antígeno da superfície da hepatite B é mantido adsorvido sobre aquele AlOOH, o que significa que pelo menos 60%, de preferência, pelo menos 65%, de preferência, pelo menos 70%, de preferência, pelo menos 75%, de preferência, pelo menos 80%, de preferência, 85%, de preferência, pelo menos 90%, de preferência, pelo menos 95% da quantidade total desse antígeno presente na composição o é sob a forma adsorvida.

[0034] De acordo com a invenção, o antígeno de Hib é mantido não adsorvido sobre AlOOH, o que significa que pelo menos 65%, de preferência, pelo menos 70%, de preferência, pelo menos 75%, da quantidade total desse antígeno presente na composição o é sob a forma não adsorvida.

[0035] De acordo com a invenção, a duração durante a qual o antígeno de superfície da hepatite B é mantido adsorvido sobre o AlOOH e o antígeno de Hib é mantido não adsorvido é de pelo menos 3 meses, de preferência, pelo menos 6 meses, de preferência, pelo menos 12 meses, de preferência, pelo menos 18 meses, de preferência, pelo menos 24 meses, de preferência, ainda pelo menos 36 meses, a partir da data de fabricação da composição, quando a temperatura de conservação é de 5 + 3 oC. De preferência, a quantidade de antígenos adsorvidos ou não adsorvidos é estável no decorrer do tempo, mas ela pode também variar, à condição de permanecer em limites aceitáveis. Assim, quando pelo menos 85% da quantidade total do HBsAg presente na composição são adsorvidos sobre o AlOOH durante 3 meses, a partir da data de fabricação da composição conservada a uma temperatura de 5 + 3 oC, é inteiramente possível que, ao cabo de um ano e sempre nas mesmas condições de conservação, 80% da quantidade total do HBsAg presente na composição sejam mantidos adsorvidos.

[0036] Para apreciar a quantidade de antígeno adsorvido, o técnico pode utilizar qualquer método conhecido.

[0037] No que se refere à determinação da percentagem de adsorção do HBsAg, é possível utilizar um método ELISA de tipo sanduíche segundo as regras definidas pela farmacopéia européia 2.7.1. Brevemente, o HBsAg é capturado por um anticorpo monoclonal primário anti-HBsAg de tipo IgM, em poços de uma placa de 96 poços. O HBsAg assim fixado é recoberto por um anticorpo monoclonal anti- HBsAg, de tipo IgG que é ele próprio detectado por um anticorpo policlonal anti-IgG, acoplado à peroxidase. Um substrato cromógeno da peroxidase, a tetra-metil benzidina (TMB), serve de agente revelador. Quando de seu acréscimo, uma cor se desenvolve, cuja intensidade é proporcional à quantidade de HBsAg capturado no poço. A análise dos resultados é feita segundo o método das retas paralelas descrito na Farmacopeia Europeia 5.3.3. A percentagem de adsorção é obtida a partir da determinação do conteúdo total em HBsAg e do conteúdo em HBsAg não adsorvido.

[0038] No que se refere à quantidade de PRP-T não adsorvida, pode-se fazer a avaliação por HPAEC-PAD (cromatografia de troca de íons elevado desempenho-detecção amperométrica pulsada).

[0039] De acordo com o processo da invenção, o antígeno da superfície da hepatite B é adsorvido sobre o AlOOH. Essa etapa é realizada colocando em contato o antígeno de superfície da hepatite B e o AlOOH na ausência de qualquer outro antígeno e deixando o antígeno da superfície da hepatite B se adsorver sobre o AlOOH, durante pelo menos 4 horas, de preferência, pelo menos 12 horas, de maneira inteiramente preferida entre 20 e 24 horas, para se obter um preparado contendo um complexo AlOOH/HBsAg. Essa adsorção pode ser realizada, segundo a invenção, na ausência de íons fosfatos. O objetivo prosseguido por um tempo de contato prolongado entre o antígeno de superfície da hepatite B e o AlOOH consiste em maximizar as interações eletrostáticas e em favorecer as interações estáveis, podendo chegar assim a uma adsorção por troca de ligante. Esse contato é vantajosamente prosseguido sob agitação.

[0040] De acordo com o processo da invenção, realiza-se a mistura do complexo AlOOH/HBsAg com o antígeno de Hib em presença de ácidos aminados catiônicos e de íons fosfatos.

[0041] Para fins da invenção, entendem-se por ácidos aminados catiônicos ácidos aminados dos quais o pHi é superior ao pH da composição vacinal e que estarão, sob a forma catiônica no pH da vacina; trata-se notadamente da Lisina (Lys), da Arginina (Arg) ou da Histidina (His); cada um desses ácidos aminados pode ser utilizado sozinho, ou em mistura seja por 2 (Lys + Arg; Lys + His; Arg + His), seja os 3 conjuntos (Lys + Arg + His). Segundo um modo particular, os ácidos aminados catiônicos podem ser associados sob a forma de dipeptídeo. Citam-se notadamente os dipeptídeos Lys-Lys, Lys-Arg, Lys-His, Arg-Arg, Arg-Lys, Arg-His, His-His, His-Lys e His-Arg. De maneira alternativa, um dipeptídeo útil para fins da presente invenção pode ser composto de um ácido aminado catiônico e um ácido aminado não carregado selecionado dentre Ala, Val, Leu, Iso, Pro, Met, Phe, Trp, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asp e Gln. Assim, na prática, pode-se utilizar um preparado contendo um ou vários ácidos aminados catiônicos sob a forma livre e/ou de dipeptídeo. É também possível utilizar preparados de ácidos aminados, compreendendo, ao mesmo tempo, ácidos aminados catiônicos em quantidade desejada, em mistura com outros ácidos aminados. A fim de não produzir uma queda muito grande do pH, quando do acréscimo dos ácidos aminados, pode-se prever aumentar o pH do preparado compreendendo os ácidos aminados antes de acrescentá-lo ao complexo AlOOH/HBsAg, por meio de uma base, notadamente da soda.

[0042] De acordo com a invenção, a quantidade de ácidos aminados catiônicos presentes na composição vacinal no final, deve ser de pelo menos 10 mg/L, vantajosamente de pelo menos 30 mg/L, vantajosamente de pelo menos 400 mg/L; de maneira inteiramente preferida, de pelo menos 500 mg/L. Não existe dose máxima crítica. Todavia, é preferível que a quantidade máxima seja no máximo 2 mg/ml, de preferência, ainda no máximo igual 1 mg/ml; de preferência, ainda no máximo 800 μg/ml; de maneira inteiramente preferida no máximo 700 μg/ml. Quando do cálculo da quantidade de ácidos aminados catiônicos a acrescentar, convém considerar ácidos aminados catiônicos capazes de serem fornecidos pelos meios nos quais estão presentes os antígenos diferentes do HBsAg e o antígeno do Hib.

[0043] Segundo uma alternativa do processo, pode-se determinar a quantidade de ácidos aminados catiônicos em relação ao peso do poli-sacarídeo capsular de Hib e prever uma relação em peso poli- sacarídeo de Hib/ácido aminado catiônico de 1 : 4 a 1 : 100, vantajosamente de 1 : 10 a 1 : 80, de preferência, de 1 : 15 a 1 : 60, de maneira particularmente preferida 1 : 20 a 1 : 30 ou 40.

[0044] De acordo com o processo da invenção, a mistura do complexo AlOOH/HBsAg com o antígeno de Hib é realizado em presença de ácidos aminados catiônicos, mas também em presença de íons Fosfatos. De acordo com um modo de realização da invenção, os íons fosfatos são acrescentados ao complexo AlOOH/HBsAg antes de sua colocação em contato com o antígeno Hib. O fornecimento de íons fosfato pode, por exemplo, ser realizado por acréscimo de hidrogeno fosfato de sódio ou de hidrogeno fosfato de potássio, ou ainda por uma mistura dos dois. A quantidade de íons fosfatos é calculada para que o máximo de antígenos de superfície da hepatite B permaneça adsorvido sobre o AlOOH, evitando a adsorção do antígeno Hib. Essa quantidade varia em função da natureza e do número dos antígenos presentes, e notadamente em função dos antígenos, diferentes dos antígenos HBsAg e Hib.

[0045] Assim, para uma combinação vacinal compreendendo os antígenos habitualmente utilizados nas vacinas pediátricas sejam, além disso, o HBsAg e do antígeno, os antígenos da difteria, do tétano, da coqueluche, pode ser vantajoso acrescentar íons fosfatos, de tal modo que a concentração de íons fosfatos na composição vacinal obtida ao final seja pelo menos igual a 35 mMol/l, e, mais particularmente, esteja compreendida entre 35 e 45 mMol/l, bornes incluídos; de preferência, entre 38 e 44 mMol/l, bornes inclusos; de maneira inteiramente preferida, entre 38 e 42 mMol/l, bornes inclusos. De acordo com um modo preferido, a concentração de íons fosfato na composição vacinal obtida em último lugar é de 40 mMol/l.

[0046] De acordo com um modo alternativo, os íons fosfato são acrescentados em quantidade tal que estão presentes na composição vacinal a uma concentração final compreendida entre 35 mMol/l, bornes inclusos. Completa-se, acrescentando-se, além disso, íons de carbonato, mas, todavia, em quantidade limitada, pois se observou, com efeito, que uma quantidade de íons carbonatos muito grande era desfavorável. Vantajosamente, eles podem ser acrescentados em quantidade tal que estão presentes na composição vacinal a uma concentração final inferior ou igual a 10 mMol/l.

[0047] A fim de evitar um choque iônico muito importante que poderia desestabilizar o HBsAg e favorecer sua dessorção, preconiza- se acrescentar íons fosfato em várias (por exemplo, em 2) operações (etapas) distintas. Assim, os íons fosfato podem ser acrescentados em uma primeira operação, em quantidade permitindo atingir uma concentração final compreendida entre 20 e 30 mMol/l bornes inclusos; depois, em uma segunda operação, em quantidade, permitindo atingir uma concentração final tal como especificada acima.

[0048] De acordo com um modo de realização preferido, conforme a invenção, ajusta-se, além disso, o pH do preparado obtido a 7.1 + 0,1, antes de misturar o antígeno Hib com o complexo AlOOH/HBsAg. Observou-se, com efeito que esse valor de pH tinha um efeito positivo sobre a manutenção no estado não adsorvido do antígeno Hib.

[0049] De acordo com um modo de realização particular, ajusta- se, além disso, o pH a 7.1 + 0.1, após a fase de mistura.

[0050] Assim, graças ao processo, de acordo com a invenção, pode-se obter uma composição vacinal, na qual:

[0051] (i) pelo menos 60 ou 80%, de preferência, pelo menos 85% da quantidade total do antígeno de superfície da hepatite B presente na composição é adsorvido sobre o AlOOH durante pelo menos 3 meses, a partir da data de fabricação da composição conservada a uma temperatura de 5 + 3 oC; e

[0052] (ii) pelo menos 65, 70 ou 75% da quantidade total do antígeno Hib presente na composição não é adsorvido sobre AlOOH.

[0053] A expressão "complexo AlOOH/HBsAg" deve ser interpretada como significante que o complexo compreende pelo menos o antígeno HBsAg adsorvido sobre o AlOOH. O complexo pode conter outros antígenos, quer isto seja precisado ou não.

[0054] Um ou vários antígenos adicionais pode(m) vir, além disso, formar o complexo. Pode notadamente tratar-se da anatoxina diftérica (D), da anatoxina tetânica (T), antígenos acelulares da coqueluche, tais como: a toxina destoxificada de Bordetella pertussis (PTxd), a hemaglutinina filamentosa (FHA), a pertactina (antígeno de 69 kDa) e aglutinógenos (fimbriae) dessa mesma bactéria. De acordo com um modo particularmente vantajoso, para formar o complexo, podem-se acrescentar antígenos D, T, PTxd e FHA.

[0055] Os antígenos adicionais podem ser acrescentados de diversas maneiras. Eles podem ser acrescentados, de maneira seqüencial, na sequência do antígeno de superfície da hepatite B adsorvido previamente (I), seja sobre a quantidade total de AlOOH que deve estar presente na composição vacinal; (II) seja sobre uma quantidade parcial, completada na sequência para atingir a quantidade total. De maneira alternativa, os antígenos adicionais podem ser adsorvidos de maneira separada, cada um sobre uma quantidade parcial de AlOOH, como o HBsAg. Pode-se também prever um processo de adsorção mista - determinados antígenos sendo adsorvidos de maneira separada; outros sendo adsorvidos, de maneira sequencial.

[0056] De acordo com um modo particular do processo, segundo a invenção, agita-se a composição obtida, após acréscimo de cada antígeno.

[0057] De acordo com um modo vantajoso e dado unicamente a título de exemplo, o HBsAg é adsorvido, de maneira separada, sobre uma quantidade parcial de AlOOH correspondente a aproximadamente 30% (um terço) da quantidade total de AlOOH presente na composição final. Em paralelo, os antígenos D são adsorvidos, de maneira sequencial, sobre a parte complementar do AlOOH. Depois ao preparado, contendo o complexo AlOOH-D-T, acrescentam-se os antígenos da coqueluche PTxd e FHA, cada um desses dois últimos antígenos tendo sido eles próprios adsorvidos individualmente sobre o AlOOH. Enfim, reúnem-se os dois preparados (complexo AlOOH - HbsAg e complexo AlOOH - D - T - PTxd - FHA) para formar um preparado compreendendo o complexo AlOOH - HbsAg - D - T - PTxd - FHA, no qual as quantidades de cada um dos elementos foram escolhidos para serem obtidas doses vacinais de 0,5 ml compreendendo, de forma clássica:

[0058] - de 5 a 15 μg de HBsAg / dose; de preferência, 10 μg / dose,

[0059] - de 20 a 40 Lf de D / dose; de preferência, 25 a 35 Lf / dose; de maneira inteiramente preferida, 30 Lf / dose. (Lf = limite de floculação), (expressa, de uma outra maneira, a quantidade de D é superior ou igual a 20 UI / dose),

[0060] - de 5 a 25 Lf de T / dose; de preferência, de 10 a 15 Lf / dose; de maneira inteiramente preferida, 10 Lf / dose, (expressa de outra maneira, a quantidade de T é superior ou igual a 40 UI / dose),

[0061] - de 20 a 30 μg de FHA / dose; de preferência, 25 μg / dose,

[0062] - de 20 a 30 μg de PTxd / dose; de preferência, 25 μg / dose.

[0063] De acordo com um modo particular de realização da invenção, acrescentam-se antígenos da pólio que são constituídos, de forma convencional, por vírus inativados. Pode-se prever acrescentar vírus da pólio dos três tipos habitualmente presentes nas vacinas pediátricas, isto é, os tipos 1, 2 ou 3, ou, no caso em que não seria necessário vacinar contra os três tipos, introduzir apenas os tipos contra os quais a proteção é buscada. As quantidades de vírus da pólio por dose podem notadamente ser:

[0064] - entre 20 e 43 DU (unidades de antígenos D), em particular 40 para o tipo 1,

[0065] - entre 5 e 9 DU, em particular 8, para o tipo 2,

[0066] - entre 17 e 36 DU, em particular 32, para o tipo 3.

[0067] Esses antígenos não são necessariamente adsorvidos previamente sobre um sal de alumínio, antes de serem acrescentados ao preparo vacinal.

[0068] De acordo com um modo de realização particular, o processo conforme a invenção, é um processo segundo o qual:

[0069] - (i) (a) se coloca em contato o HBsAg e o AlOOH na ausência de qualquer outro antígeno, e se deixa o HBsAg se adsorver sobre o AlOOH durante pelo menos 4 horas, de preferência, pelo menos 12 horas, de maneira inteiramente preferida de aproximadamente 24 horas, para se obter um preparado contendo um complexo de AlOOH/HBsAg;

[0070] (i) (b) ao preparado obtido no ponto (i) (a), se acrescenta um preparado compreendendo os antígenos D, T, PTxd e FHA, previamente adsorvidos sobre AlOOH, e de maneira opcional antígenos adicionais de Bordetella. pertussis, tais como a Pertactina e os aglutinogênios;

[0071] (ii) ao preparado obtido no ponto (i) (b), se acrescentam íons fosfato, a fim de se obter uma concentração final na vacina de 40 mMol/l,

[0072] (iii) ao preparado obtido no ponto (ii), se acrescentam, de maneira opcional, os antígenos da pólio,

[0073] (iv) ao preparado obtido no ponto (ii) ou (iii), se acrescenta um preparado contendo o antígeno Hib,

[0074] (v) se ajusta o pH em 7.1 + 0.1; e

[0075] (vi) (a) se acrescenta pelo menos um ácido aminado catiônico para completar o preparado obtido no ponto (ii) ou (iii) antes do acréscimo do antígeno Hib, ou

[0076] (b) se acrescenta ao antígeno Hib pelo menos ácido aminado catiônico; esse ácido aminado catiônico sendo acrescentado em quantidade suficiente, a fim de se obter uma concentração final na vacina de pelo menos 100 mg/l.

[0077] De acordo com um modo particular, a composição vacinal, segundo a invenção, é uma composição que compreende o HBsAg, a toxina diftérica D, a toxina tetânica T, os antígenos da coqueluche PTxd e FHA tendo sido pré-adsorvidos sobre o AlOOH, o antígeno Hib, e opcionalmente a valência pólio, na qual:

[0078] (i) pelo menos 85%, de preferência, pelo menos 90% da quantidade total do HBsAg presente na composição é mantido adsorvido sobre o AlOOH durante pelo menos 3 meses, a partir da data de fabricação da composição conservado a uma temperatura de 5 + 3 oC; e

[0079] (ii) pelo menos 65, 70, ou, de preferência, 75% da quantidade total do antígeno Hib presente na composição não é adsorvido sobre o AlOOH, essa quantidade permanecendo relativamente estável no decorrer do tempo.

[0080] Além disso, graças ao processo, de acordo com a invenção, os antígenos, além do HBsAg, que mostraram que era vantajoso que eles fossem adsorvidos sobre o óxi-hidróxido de alumínio para serem imunógenos, são também mantidos adsorvidos.

[0081] Assim, indica-se, a título de exemplo, que uma composição, de acordo com a invenção, pode compreender:

[0082] - de 10 a 30 μg do HBsAg / ml, de preferência, 20 μg / ml;

[0083] - de 40 a 80 Lf de D/ml, de preferência, 50 a 70 Lf/ml;

[0084] - de 10 a 50 Lf de T/ml, de preferência, 10 a 30 Lf/ml;

[0085] - de 40 a 60 μg de FHA/ml, de preferência, 50 μg/ml;

[0086] - de 40 a 60 μg de PTxd/ml, de preferência, 50 μg/ml;

[0087] - de 2 a 60 μg de PRP/ml, de preferência, 20-24 μg/ml;

[0088] - de 1 a 2 mg de AlOOH/ml; de preferência, 1.2 mg de AlOOH/ml;

[0089] - íons fosfato a uma concentração de 35 a 45 mMol/l, de preferência, 38 a 42 mMol/l de íons fosfato;

[0090] - 100 a 1000 μg/ml de ácidos aminados catiônicos, de preferência, de 400 a 800 μg/ml; e, de maneira opcional;

[0091] - os tipos 1, 2 e 3 do vírus pólio sob a forma inativa em quantidade respectiva de 80, 16 e 64 DU/ml.

[0092] Conforme indicado anteriormente, uma composição, de acordo com a invenção, pode também compreender antígenos adicionais de Bordetella. pertussis, tais como a Pertactina (de 69 kDa) ou os aglutinogênios.

[0093] Descrição da Figura: A Figura 1 é um esquema de um processo da técnica anterior, segundo o qual, após o acréscimo de cada componente, se mistura.

Exemplo - Preparo na escala industrial a granel (250 L) de uma vacina hexavalente HepB-Dt-Tt-Pertussis-pólio-HiB

[0094] Esse preparo é feito nas condições estéreis e sob agitação contínua:

A - Preparo do HBsAg adsorvido sobre AlOOH

[0095] Em uma cuba de 50 l, introduz-se, de maneira asséptica, uma suspensão homogênea de gel de óxi-hidróxido de alumínio (AlOOH) comercializado por Brenntag AG, a 8 g de alumínio/l.

[0096] Após filtragem sobre um filtro 0,22 μm, o volume necessário de HBsAg, para se obter uma concentração de 20 μg/ml na vacina final, é acrescentado em contínuo na cuba, contendo já o AlOOH.

[0097] A mistura é deixada sob agitação durante 20 a 24 horas à temperatura ambiente, de maneira a se obter uma suspensão homogênea.

B - Preparo de D + T + PTxd + FHA adsorvidas sobre o gel de alumínio

[0098] Em paralelo, prepara-se uma mistura de gel de alumínio, de anatoxina diftérica (D), de anatoxina tetânica (T), de anatoxina de Bordetella pertussis (PTxd) e de hemaglutinina filamentosa de Bordetella pertussis (FHA) da seguinte maneira:

[0099] em uma cuba 250 l, introduz-se, de maneira asséptica, uma suspensão homogênea de gel de AlOOH comercializado por Brenntag AG, a 8 g de Alumínio / l;

[00100] na cuba de 250 l, contendo já o AlOOH, são introduzidos sucessivamente, após filtragem sobre filtro 0,22 μm, as soluções de D, depois, após homogeneização, de T de maneira a se obterem as concentrações respectivas em D e T na vacina final de 60 Lf (limite de floculação)/ml e 20 Lf/ml.

[00101] Uma vez a mistura homogênea obtida, são acrescentados sucessivamente nessa cuba, de maneira asséptica, a suspensão de PTxd previamente absorvida sobre AlOOH, depois a suspensão de FHA previamente adsorvida sobre AlOOH, a fim de se obterem as concentrações em PTxd e FHA na vacina final de 25 μg/ml.

[00102] Enfim, acrescenta-se, após filtragem sobre um filtro 0,22 μm, o volume necessário de tampão fosfato 500 mM para se obter uma concentração em íons fosfato de 20 a 30 mMol/l.

[00103] A suspensão D - T - PTxd - FHA - AlOOH assim obtida é deixada sob agitação pelo menos durante 14 horas a uma temperatura de 5 + 3 oC.

C - Preparo da mistura HBsAg + D + T + PTxd + FHA adsorvidos sobre gel de alumínio.

[00104] Ao preparo obtido no ponto B, acrescenta-se, de maneira asséptica, o preparo obtido no ponto A.

[00105] Essa mistura é deixada sob agitação, de maneira a se obter uma suspensão homogênea.

[00106] Depois se acrescenta o volume necessário de tampão fosfato 500 mM, após filtragem sobre um filtro 0,22 μm, para se obter uma concentração em íons fosfato de 40 mMol/l na composição final.

D - Saturação dos locais eletrostáticos do complexo gel de alumínio / HBsAg + D + T + PTxd + FHA por uma solução de ácidos aminados.

[00107] Fabrica-se uma solução de ácidos aminados contendo 12 ácidos aminados essenciais, da seguinte composição:

[00108] Seja 21,2 g/l de ácidos aminados dos quais 5,44 g/l de ácidos aminados catiônicos (His - Arg - Lys).

[00109] Acrescentam-se 450 ml de soda (NaOH) 2.5 N (0,5 l / por minuto). Deixa-se a homogeneização prosseguir, sob agitação, durante 10 minutos.

[00110] Essa solução de ácidos aminados, filtrada sobre filtro 0,22 μm, é acrescentada em contínuo na mistura obtida em C, de maneira a se obter uma concentração de 572 μg/ml de ácidos aminados catiônicos na composição final.

E - Ajuste do pH

[00111] O pH da suspensão obtida no ponto D é ajustado em pH 7.1 (7.0 - 7.2), utilizando uma solução de estoque de soda com 2.5 N filtrada.

F - Acréscimo dos antígenos pólio

[00112] É então introduzida na cuba contendo a suspensão obtida em E, um preparado contendo os sorotipos 1, 2 e 3 do vírus da pólio sob a forma inativada (cepas Mahoney, MEF-1 e Saukett respectivamente) filtrada sobre filtro 0,22 μm.

G - Acréscimo PRP-T

[00113] Prepara-se inicialmente uma solução intermediária de PRP- T da seguinte maneira: a um preparado de PRP-T filtrada sobre filtro 0,22 μm é acrescentado do tampão Tris sacarose previamente filtrado sobre filtro 0,22 μm para constituir uma mistura intermediária.

[00114] Essa mistura é introduzida assepticamente na mistura obtida em F.

H - Fase final de ajuste

[00115] Após homogeneização da suspensão obtida em G, é acrescentada uma quantidade suficiente de água PPI filtrada previamente, de maneira a atingir o volume alvo de 250 l. Depois, se necessário, o pH da mistura é ajustado em pH 7.1 + 0.1, acrescentando-se uma solução de soda 2.5 N ou de ácido acético 10% filtrada previamente.

[00116] A mistura é estocada a 5 + 3 oC; depois repartida em seringas ou em frascos à razão de 0,5 ml/dose.

[00117] Uma dose de 0,5 ml contém assim 600 μg de Al3+, 10 μg de HBsAg, não menos de 20 IU de D, não menos de 40 IU de T, 25 μg de Pt, 25 μg de FHA, entre 20 e 43 DU (unidade de antígeno D) de pólio tipo I, entre 5 e 9 DU do pólio tipo 2, entre 17 e 36 DU do pólio tipo 3, 12 μg do PRP (sob a forma do PRP-T), íons fosfato a uma concentração de 40 mMol/l, do tampão Tris sacarose a uma concentração de 2.5 mMol/l de Tris e de 2.125% de sacarose, assim como 286 μg de ácidos aminados catiônicos (His - Arg - Lys).

Teste clínico

[00118] A composição vacinal preparada, segundo o exemplo acima, foi testada em um teste clínico, comparativamente a uma vacina hexavalente já presente no mercado, o Infanrix HexaTM, que permite vacinar crianças contra as mesmas doenças que a vacina preparada, de acordo com a invenção (a difteria, o tétano, a coqueluche, a pólio, as infecções com Hib e a hepatite B), mas que apresenta notadamente o inconveniente de ter uma parte liofilizada, e, portanto, necessitar de uma operação de retomada de liofilizado previamente ao ato de administração.

[00119] Quando do teste clínico, os 2 tipos de composições vacinais foram administrados em crianças, em um esquema vacinal compreendendo 3 doses administradas em 2, 4 e 6 meses. A vacina líquida preparada, segundo o processo da invenção, se mostrou bem mais tolerada, e também imunógena, que a vacina presente no mercado.

DADOS EXPERIMENTAIS Percentagem de adsorção do HBsAg / Quantidade de PRP-T não adsorvido

[00120] Três lotes de produto final a granel (PFV39-41-42), assim como três lotes repartidos em frascos (S12-13-14) - todos os lotes tendo sido obtidos, segundo o exemplo fornecido - foram conservados a + 5 oC e analisados em diferentes tempos em um período de 9 a 22 meses respectivamente. A análise se referiu sobre a percentagem de adsorção do HBsAg e a quantidade de PRP-T não adsorvido.

[00121] A determinação da percentagem de adsorção do HBsAg foi realizada, assim conforme foi indicado anteriormente, a partir da determinação do conteúdo total em HBsAg e do conteúdo em HBsAg não adsorvido, a determinação em HBsAg sendo realizada, graças a um método ELISA de tipo sanduíche, segundo as regras definidas pela Farmacopéia Européia 2.7.1. Brevemente, o HBsAg foi capturado por um anticorpo monoclonal primário anti-HBsAg de tipo IgM, em poços de uma placa de 96 poços. O HBsAg assim fixado foi recoberto por um anticorpo monoclonal secundário anti-HBsAg, de tipo IgG que foi ele próprio detectado por um anticorpo policlonal anti-IgG, acoplado à peroxidase. Um substrato cromógeno da peroxidase, a tetrametil benzidina (TMB), serviu de agente revelador. Quando de seu acréscimo, uma cor se desenvolveu, cuja intensidade era proporcional à quantidade de HBsAg capturado no poço. A análise dos resultados foi feita segundo o método das retas paralelas descrita na Farmacopeia Europeia 5.3.3.

[00122] A fim de determinar a percentagem de adsorção do HBsAg, submeteu a vacina a uma centrifugação (8800 g; 5 minutos; 20 oC), o que permitiu recuperar o que flutua contendo o HBsAg não adsorvido. As amostras do que flutua a testar foram diluídas em tampão ELISA, compreendendo um tampão de dessorção em série de 2 em uma faixa compreendida, por exemplo, entre 1/400 e 1/2800.

[00123] As amostras de vacina total e de faixa padrão foram diluídas em tampão ELISA, compreendendo um tampão de dessorção, em série de 2 em uma faixa compreendida, por exemplo, entre 1/800 e 1/25600.

[00124] Uma placa de 96 poços recobertos pelo anticorpo monoclonal primário foi incubada 12 horas a 5%, depois lavado com uma solução PBS-Tween 20. As diluições do que flutua, da vacina total e da faixa padrão, foram repartidas nos poços. Depois se acrescentou o anticorpo secundário e se revelou com o anticorpo conjugado à peroxidase e a TMB (tetra metil benzidina). A reação foi parada acrescentando-se o HCl 1 N. Após cada etapa, a placa foi incubada durante 30 minutos a 25 oC, depois em seguida lavada com a solução PBS-Tween 20. Um branco (tampão de diluição) foi acrescentado nos poços disponíveis e sofreu os mesmos tratamentos. A placa foi lida em DO 450 e 630 nm.

[00125] Avaliou-se a quantidade de PRP-T não adsorvida por HPAEC-PAD (cromatografia de troca de íons de elevado desempenho - detecção amperométrica pulsada) da seguinte maneira:

[00126] preparou-se inicialmente uma faixa padrão de PRP-T de referência de 0,5 a 12,5 μg/ml.

[00127] As amostras a testar foram centrifugadas, assim como as amostras da faixa padrão a 5000 g durante 5 minutos a temperatura ambiente. O que flutua foi recolhido, depois hidrolisados com uma solução de NaCl 1,5 N, contendo a glicosamina -1- fosfato como padrão interno. Acrescentou-se um branco (NaCl 0,9%; NaOH 1,5 N + padrão interno).

[00128] A cromatografia foi utilizada com uma fase móvel composta de NaOH 35 mM e de acetato de sódio 114 mM injetada na coluna à razão de 1.2 ml/ minutos.

[00129] Calculou-se a concentração em PRP não adsorvido (μg/ml), a partir da seguinte igualdade:

[00130] (Superfície do pico PRP / superfície do pico padrão interno) = a x [concentração em PRP] + b, na qual "a" é a inclinação e "b" é a ordenada na origem, a e b tendo sido determinados, a partir da reta de regressão.

[00131] Os resultados são apresentados nas 4 tabelas abaixo:

[00132] Para comparação, testou-se também a adsorção no decorrer do tempo do HBsAg contido nos três lotes de produto final a granel (FDN5-6-7), assim como três lotes repartidos em frascos (S44- 45-46) de um preparado líquido composto dos mesmos antígenos, mas obtido segundo um processo de formulação linear descrito na Figura 1 e, portanto, diferente daquele descrito no exemplo acima. Esse preparado continha em 0,5 ml : 10 μg de HBsAg, 30 Lf de Dt, 10 Lf de Tt, 25 μg de Pt, 25 μg de FHA, 40 DU de vírus pólio tipo 1, 8 DU de vírus pólio tipo 2, 32 DU de vírus pólio de tipo 3, 12 μg de PRP (sob a forma de PRP-T), 0,6 mg de Al, íons fosfato a uma concentração de 55 mMol/l, íons carbonato a uma concentração de 20 mMol/l, tampão Tris sacarose a uma concentração de 2.5 mMol/l em Tris e 2.125% em sacarose e 14 μg de ácidos aminados catiônicos (His - Arg - Lys) provenientes do meio M199 (valência pólio), pH 6,8 - 7,2.

[00133] Os resultados obtidos eram os seguintes:

[00134] As quantidades de PRP-T não adsorvido, medidas no mesmo período, mostraram que havia pouca variação em relação ao tempo 0 e eram, portanto, satisfatórias. Todavia, esses resultados mostram que, nesse caso, que não corresponde a uma formulação obtida, graças a um processo, de acordo com a invenção, o antígeno de superfície da hepatite B não restava adsorvido sobre o óxi-hidróxido de alumínio. Dados experimentais, referindo aos ácidos aminados catiônicos.

[00135] Uma composição, de acordo com a invenção, destacando diretamente do protocolo experimental, utilizado no exemplo fornecido e uma composição obtida graças a um protocolo modificado pelo fato de que se tinha substituído uma composição contendo unicamente os três ácidos aminados catiônicos (Arg - Lys - His) à composição dos 12 ácidos aminados essenciais, foram comparadas no que se refere à quantidade de PRP-T não adsorvida no final. Nenhuma diferença na quantidade do PRP-T não adsorvido foi observada, o que mostra que só importam os ácidos aminados catiônicos.

Claims

1. Processo de preparação de uma combinação vacinal líquida compreendendo pelo menos: - o óxi-hidróxido de alumínio (AlOOH), - um antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg), - um antígeno de Haemophilus influenzae tipo b (Hib) constituído por poli-sacarídeo capilar conjugado a uma proteína portadora, na qual o antígeno de superfície da hepatite B é mantida adsorvido sobre AIOOH, enquanto que o antígeno de Hib é mantido não adsorvido, caracterizado pelo fato de que compreende: - adsorver o antígeno de superfície da hepatite B sobre AIOOH, a fim de obter um complexo AIOOH/HBsAg, - misturar esse complexo AIOOH/HBsAg com o antígeno de Hib em presença de ácidos aminados catiônicos a uma concentração de pelo menos 100 mg/l, e de íons fosfato a uma concentração de 35 a 45 mMol/l.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de se proceder à adsorção do antígeno HBsAg sobre o alumínio, misturando-se uma suspensão de AlOOH a uma suspensão de HBsAg sob agitação durante pelo menos quatro horas, de preferência, pelo menos 12 horas, de preferência, entre 20 e 24 horas.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de se acrescentarem os ácidos aminados catiônicos a esse complexo AlOOH/HBsAg antes da mistura com o antígeno de Hib.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de se acrescentarem os ácidos aminados catiônicos a esse antígeno de Hib antes da mistura com o complexo AlOOH/HBsAg.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de se acrescentarem os íons fosfato ao complexo AlOOH/HBsAg antes da mistura com o antígeno de Hib.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de se ajustar o pH do preparo, compreendendo o complexo AlOOH/HBsAg a 7.1 + 0.1, antes da mistura com o antígeno de Hib.

7. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de consistir, além disso, em: - preparar uma composição, compreendendo pelo menos um antígeno escolhido dentre os antígenos da difteria, do tétano, da pólio, da coqueluche, assim como o óxi-hidróxido de alumínio, e - em misturar esse complexo AlOOH/HBsAg com essa composição, antes de proceder à mistura com o antígeno de Hib.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de consistir em preparar essa composição, acrescentando-se cada um dos antígenos sucessivamente a uma suspensão de óxi- hidróxido de alumínio e agitando-se entre cada acréscimo de antígenos.

9. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de: - se adsorver o HBsAg sobre uma quantidade parcial de AlOOH, representando um terço do AlOOH total presente na composição final, por uma duração de 20 a 24 horas, a fim de formar um complexo AlOOH/HBsAg, - se adsorver em paralelo, em uma quantidade complementar de AlOOH, sucessivamente: a toxina diftérica D, a toxina tetânica T, a toxina purificada de Bordetella, pertussis PTxd, ela própria previamente adsorvida sobre o AlOOH, a hemaglutinina filamentosa de Bordetella pertussis FHA, ela própria previamente adsorvida sobre o AlOOH, depois se acrescentam aí íons fosfatos, depois se acrescentam aí o complexo AlOOH/HBsAg, - se acrescenta de novo íons fosfato em quantidade que permite atingir uma concentração de 40 mMol/l na composição final, - se acrescentar pelo menos um ácido aminado catiônico em quantidade que permite atingir uma concentração de pelo 100 mg/l na composição final, - se ajustar o pH 7.1 + 0.1, - se acrescentarem antígenos da pólio sob a forma de vírus inativados de tipo 1, e/ou de tipo 2 e/ou de tipo 3; - se acrescentar o antígeno Hib. - se ajustar o pH em 7.1 + 0.1, - se repartir a composição obtida em seringa ou em frascos.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de se preparar na escala industrial pelo menos 250 l de composição vacinal.

11. Composição vacinal obtida por um processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos o antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg) e o antígeno de Hib que é constituído por poli- ribosil ribitol fosfato conjugado à proteína tetânica (PRP-T).

12. Composição vacinal de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que compreende, ainda, antígenos da difteria, do tétano, da pólio, da coqueluche.

13. Composição vacinal de acordo a reivindicação 11 ou 12, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos: - o antígeno de superfície da hepatite B, HBsAg; - o antígeno da difteria sob a forma de toxina diftérica D, - o antígeno do tétano sob a forma de toxina tetânica T, - os antígenos da coqueluche sob a forma de Toxina Purificada (PTxd) e de Hemaglutinina Filamentosa (FHA), - o antígeno de Haemophilus influenzae tipo b, sob a forma de poli-ribosil ribitol fosfato conjugado à proteína tetânica (PRP-T), - os antígenos da pólio sob a forma de vírus inativados escolhidos dentre os tipos 1, 2 e 3.

14. Composição vacinal, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos: - de 10 a 30 μg do HBsAg / ml, de preferência, 20 μg / ml; - de 40 a 80 Lf de D/ml, de preferência, 50 a 70 Lf/ml; - de 10 a 50 Lf de T/ml, de preferência, 10 a 30 Lf/ml; - de 40 a 60 μg de FHA/ml, de preferência, 50 μg/ml; - de 40 a 60 μg de PTxd/ml, de preferência, 50 μg/ml; - de 2 a 60 μg de PRP/ml, de preferência, 20-24 μg/ml; sob a forma de conjugado PRP-T; - de 1 a 2 mg de AlOOH/ml; de preferência, 1.2 mg de AlOOH/ml; - de 35 a 45 mMol/l, de preferência, de 38 a 42 mMol/l de íons fosfatos, - 100 a 1000 mg/ml de ácidos aminados catiônicos, de preferência, de 400 a 800 mg/ml; - os tipos 1, 2 e 3 do vírus pólio sob a forma inativada em quantidade respectiva de 80, 16 e 64 DU/ml.