ES2291466T3

ES2291466T3 - Procedimiento de fabricacion de vacuna mixta.

Info

Publication number: ES2291466T3
Application number: ES02729589T
Authority: ES
Inventors: Kyu-Wan Kim; Hyi-Jeong Ji; Youn-Kyeong Lee; Wan-Kyu Kim; Hee-Ku Lee; Won-Kyum Kim
Original assignee: LG Life Sciences Ltd
Current assignee: LG Chem Ltd
Priority date: 2001-01-10
Filing date: 2002-01-09
Publication date: 2008-03-01
Anticipated expiration: 2022-01-09
Also published as: AR032391A1; UY27118A1; ZA200305072B; CA2434421A1; RU2264226C2; AU2002219693B2; DE60222529T2; US20040048336A1; DE60222529D1; MXPA03006154A; ATE373485T1; PL369433A1; JP2004517866A; EP1349572A1; PE20020758A1; BR0206391A; CA2434421C; EP1349572B1; EP1349572A4; MY143688A

Abstract

Un procedimiento para fabricar una vacuna mixta que comprende: (a) proporcionar antígenos protectores individuales de antígeno diftérico, antígeno tetánico, antígeno tosferínico y antígeno de la hepatitis B, (b) adsorber independientemente cada antígeno protector en un adsorbente de gel de hidróxido de aluminio, y (c) combinar cada antígeno protector adsorbido independientemente.

Description

Procedimiento de fabricación de vacuna mixta.

Antecedentes de la invención Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento de fabricación de vacuna mixta que puede prevenir simultáneamente diversas enfermedades de los lactantes tales como difteria, tétanos, tos ferina, hepatitis B y otras enfermedades, que deben prevenirse en los lactantes.

Técnica anterior

Una vacuna mixta se refiere a una vacuna fabricada mediante la combinación antígenos protectores para cada enfermedad con respecto a otras diversas enfermedades infecciosas o a una vacuna fabricada mediante la combinación de diversos antígenos relacionados para prevenir una enfermedad infecciosa.

Como ejemplos de las primeras, existe una vacuna de DTP (difteria, tétanos, tos ferina) que puede potenciar una inmunidad con respecto a difteria, tétanos y tos ferina, una vacuna de MMR (sarampión, paperas, rubéola) que puede potenciar una inmunidad con respecto a sarampión, paperas y rubéola, etc. Las vacunas anteriores se han usado durante 20 años. Como ejemplos de las últimas, existe una vacuna antineumocócica fabricada combinando 14 ó 23 polisacáridos neumocócicos que pueden potenciar una inmunidad frente a neumonía y una vacuna antimeningocócica fabricada combinando 4 polisacáridos meningocócicos que pueden potenciar una inmunidad para proteger contra meningitis, etc. Las vacunas anteriores se han usado durante unos pocos años.

Las vacunas anteriores se han usado durante muchos años debido a que su desarrollo está bien reconocido con sus efectos inmunógenos y menor efecto secundario con respecto a cada enfermedad infecciosa y con su buena adaptación para proteger frente a diversas enfermedades. Quienes desarrollan vacunas están desarrollando recientemente diversos tipos de vacunas mixtas por las razones anteriores. Como las vacunas mixtas anteriores, existe una vacuna (publicación internacional número WO 99/13906) fabricada combinando una vacuna de DTP, vacuna de la encefalomielitis bacteriana (vacuna Hib), vacuna de la poliomielitis inactivada y vacuna de la hepatitis B. Una vacuna mixta determinada se desarrolla mediante la combinación de polisacáridos neumocócicos y de meningococo conjugados con proteína. Pronto se desarrollará una vacuna mixta que puede prevenir una infección intestinal con respecto a cada bacteria que la produce de cólera, fiebre tifoidea, disentería y diarrea.

La vacuna mixta preparada de la manera de combinar cada antígeno para prevenir otras diversas enfermedades infecciosas, tiene ventajas porque el número de vacunaciones disminuye y la administración de vacunas es simple para disminuir así el coste. Según el programa de vacunación de los lactantes recomendado por la Asociación de Pediatría (1997), los lactantes reciben muchas inyecciones dentro del primer año tras el nacimiento, y la inyección de la vacuna coincide algunas veces con distintas vacunas por conveniencia o enfermedad. Por tanto, es importante inocular a los lactantes basándose en un procedimiento apropiado para así proporcionar una determinada conveniencia tanto a personas que vacunan como a personas inoculadas. En particular, según el programa de vacunación establecido, las vacunaciones de la hepatitis B y DTP están dirigidas a realizar tres inyecciones primarias dentro del primer año de los lactantes e inyecciones de refuerzo. Además, ya que los programas de vacunación recomendados son similares, puede producirse el problema de que las inyecciones coincidan.

Los inventores de la presente invención realizaron una investigación para proporcionar una conveniencia determinada para la vacunación tanto a las personas que vacunan como a las personas inoculadas, desarrollando la vacuna mixta de las vacunas de DTP y de hepatitis B y estabilizando la administración de la vacuna para así proporcionar un beneficio de vacunación a más personas.

Dado que la investigación sobre la vacuna mixta se dirige mayormente a la combinación de cada antígeno componente de los productos de la vacuna que está dotada de inmunidad y estabilidad, es importante, para la investigación anterior, el desarrollo del procedimiento de combinación para minimizar una variación en la reacción e inmunidad que se producen debido a una interacción entre cada antígeno protector y adsorbente. Con la finalización del desarrollo, se han revisado la homogeneidad y estabilidad de las formulaciones de vacuna mixta inventadas. En la presente invención, se ha realizado la investigación basándose en la vacuna de DTP y en la vacuna de la hepatitis B, de las que se ha demostrado su inmunidad y estabilidad.

Como procedimiento para combinar cada vacuna componente, existen un procedimiento (publicaciones internacionales números WO 99/13906 y WO 00/7623) para combinar simplemente los productos de cada vacuna componente, un procedimiento (publicación internacional número WO 99/13906) de administración simultánea cuando se realiza la vacunación, usando el envase especialmente diseñado y un procedimiento de fabricación de la vacuna mixta mezclando cada vacuna componente y el resto de los componentes en una formulación. Con respecto a la administración de la vacuna, la utilización de la vacuna mixta preparada mediante los dos procedimientos anteriores es similar al uso de cada vacuna monovalente, particularmente necesita más atención manejar vacunas que cada vacuna monovalente, de modo que no existe una ventaja en usar este tipo de la vacuna mixta. Además, es imposible realizar una investigación con respecto a la variación de la inmunidad y la aparición de los efectos secundarios. Por tanto, es preferible que se mezcle cada vacuna componente en una formulación tal como un producto en la investigación de la vacuna mixta.

El fin de la presente invención es proporcionar procedimiento de fabricación de vacuna mixta que puede prevenir diversas enfermedades de los lactantes incluyendo difteria, tétanos, tos ferina y hepatitis B, que deben prevenirse en los lactantes.

Descripción de la invención

Por consiguiente, es un objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento de fabricación de vacuna mixta para prevenir simultáneamente diversas enfermedades de los lactantes tales como difteria, tétanos, tos ferina y hepatitis B, que deben prevenirse en los lactantes.

Con el fin de conseguir el objetivo anterior, se proporciona un procedimiento de fabricación de una vacuna mixta, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

La presente invención se entenderá mejor con referencia a los dibujos adjuntos, que se facilitan sólo a modo de ilustración, y por tanto no limitan la presente invención, en los que;

la figura 1 es una vista que ilustra una proporción de adsorción de cada antígeno componente basándose en la concentración de un adsorbente. El toxoide diftérico, el toxoide tetánico y el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B son componentes del antígeno diftérico, del antígeno tetánico y del antígeno de hepatitis B y el antígeno de FHA tosferínica (corpúsculo de aglutinina sanguínea en forma de filamentos de toxina tosferínica) son cada componente de un antígeno tosferínico purificado;

las figuras 2a a 2d son vistas que ilustran una antigenicidad e inmunidad basándose en un procedimiento de adsorción, en el que la muestra 1 es una muestra en la que se añade hidróxido de aluminio en exceso después de completar una combinación de cada vacuna componente, y la muestra 2 es una muestra en la que dicho adsorbente de la misma concentración se añade previamente antes de completar la combinación; las figuras 2a y 2b son vistas que ilustran la antigenicidad relativa de las muestras 1 y 2 respectivamente y, las figuras 2c y 2d son vistas que ilustran el nivel relativo de formación de anticuerpos frente a cada antígeno de las muestras 1 y 2, respectivamente.

la figura 3 es una vista que ilustra el nivel de formación de anticuerpos frente a cada antígeno del suero obtenido de monos a los que se ha administrado una vacuna mixta preparada según la presente invención o simultáneamente cada producto de vacuna de DTP y de la hepatitis B basándose en la fecha de la extracción de muestras de sangre de cada mono. El grupo 1 se diseña de modo que cada vacuna de DTP y de la hepatitis B se administra simultáneamente, y el grupo 2 se diseña de modo que se administra una vacuna mixta.

Modos para llevar a cabo las realizaciones preferidas

Como procedimiento para la fabricación de la vacuna mixta que contiene cada vacuna componente como un producto, el procedimiento anterior se divide en dos etapas: un procedimiento para la etapa de combinar los antígenos que forman cada vacuna componente y realizar una adsorción usando un adsorbente y un procedimiento para la etapa de combinar los antígenos adsorbidos previamente, en el caso de que se use un adsorbente como un componente en dicho método. Sin embargo, en el caso de que se mezcle primero cada antígeno componente, puede disminuir la capacidad de adsorción con respecto al adsorbente de cada antígeno debido a la interacción entre los antígenos y los componentes en disolución. Además, la adsorción entre el adsorbente y el antígeno componente se optimiza en cada estado independiente. Si se realizan simultáneamente los procedimientos de adsorción anteriores, puede disminuirse la proporción de adsorción debido a una diferencia en las condiciones de adsorción de cada antígeno componente. Ya que la interrelación entre la proporción de adsorción con respecto al adsorbente del antígeno componente y la inmunidad de la vacuna es en proporción inversa, puede disminuirse la inmunidad de la vacuna mixta, que se fabrica en el procedimiento realizado simultáneamente, en comparación con la inmunidad de cada vacuna monovalente.

Por tanto, los inventores de la presente invención han considerado que es apropiado fabricar una vacuna mixta preparando una disolución a granel de cada antígeno componente, realizando independientemente una adsorción de cada antígeno y combinando entre sí los antígenos adsorbidos.

Además, en el caso de que cada antígeno componente se combine en cada tipo de adsorción, la concentración final de cada antígeno componente en la vacuna mixta debe ser igual a la concentración del antígeno componente en cada vacuna monovalente convencional, para comparar la inmunidad y las características de los antígenos de la vacuna en los productos de la vacuna. Por tanto, para fabricar la vacuna mixta, se adsorbe el antígeno componente más concentrado que una vacuna simple, y luego se combina. La vacuna de DTP se fabrica basándose en la adsorción usando el antígeno que se concentra 1,5\sim2 veces y la vacuna de la hepatitis B se fabrica usando el antígeno que se concentra 2\sim3 veces. La concentración final de cada antígeno componente de la vacuna mixta según la presente invención coincide con la concentración de cada vacuna simple que se ajusta a la proporción de combinación de cada antígeno.

Según la presente invención, los inventores realizaron diversos estudios de combinaciones para desarrollar la vacuna mixta. En este caso, el contenido final de cada componente inmunitario en un producto de la vacuna es igual al contenido de la vacuna monovalente. Además, se sigue el cambio de la proporción de adsorción de cada antígeno controlando el contenido del adsorbente y otros componentes. Se inmuniza cada muestra que tiene un cambio menor en la proporción de adsorción en animales pequeños para comparar el nivel de la formación de anticuerpos. Se seleccionó un procedimiento de combinación apropiado revisando el resultado de la formación de anticuerpos en animales pequeños.

Además, como resultado de la revisión con respecto a los adsorbentes de vacuna de DTP y la vacuna de la hepatitis B comerciales actualmente, se usaron principalmente gel de hidróxido de aluminio y gel de fosfato de aluminio. Se sabe que la adsorción de la proteína a cada gel de aluminio se produce por una carga eléctrica superficial de cada proteína y un componente del gel. Y también se sabe que el gel de hidróxido de aluminio tiene una carga eléctrica superficial positiva en un intervalo de pH fisiológico y que el gel de fosfato de aluminio tiene una carga superficial negativa ("Vaccine Design - The subunit and adjuvant approach", ed. By M.F. Powell & M.J. Newman, 1995, páginas 229-239). En el caso de que se usen simultáneamente los dos tipos anteriores de geles de aluminio, se produce una interacción determinada, de modo que puede aumentarse el tamaño de partícula en la disolución y puede disminuirse la capacidad de adsorción a proteína. Además, la carga superficial eléctrica de cada antígeno componente de la vacuna de la hepatitis B y la vacuna mixta tiene generalmente una carga superficial eléctrica negativa en un intervalo de pH fisiológico. Por tanto, el gel de hidróxido de aluminio es apropiado como adsorbente.

En la técnica convencional, se usaban conjuntamente el componente del adsorbente tal como el gel de hidróxido de aluminio y gel de fosfato de aluminio (publicación internacional número WO 93/24148) pero, basándose en la siguiente razón, los inventores de la presente invención consideraron que el adsorbente de la vacuna mixta debe tener el mismo tipo de sal y el gel de hidróxido de aluminio que se usa como adsorbente es un factor importante para obtener una determinada proporción de adsorción de cada antígeno componente.

Además, en la vacuna mixta preparada por la presente invención, otros antígenos componentes, excepto el antígeno de la hepatitis B, incluyen proteínas como un componente principal, mientras que, en el caso de la vacuna de la hepatitis B, el antígeno existe generalmente en un tipo de partícula que incluye una capa fosfolipídica. Por tanto, se prefiere que, cuando se fabrica la vacuna de la hepatitis B para una vacuna mixta preparada por la presente invención, con el fin de disminuir una determinada interferencia de los otros antígenos con respecto al componente fosfolipídico del antígeno de la vacuna de la hepatitis B que incluye una capa fosfolipídica, se incluya un tensioactivo neutro tal como Polisorbato 20 (Tween 20), Polisorbato 80 (Tween 80) y Triton X- 100.

Ya que el título de la vacuna de la hepatitis B tiende a disminuir en el caso de que la cantidad del tensioactivo neutro sea alta, se prefiere que el tensioactivo neutro se añada en la razón másica inferior al 50% con respecto a la cantidad de proteína del antígeno de superficie de la hepatitis B, pero la cantidad anterior no está limitada por ello.

En la presente invención, se prepara y se cultiva en un medio de cultivo apropiado Corynebacterium diphtheriae, PW nº 8 como un antígeno de la difteria. Se prefiere el toxoide diftérico, que se obtiene destoxificando la toxina diftérica que se purifica mediante un procedimiento convencional. La cantidad del antígeno es preferiblemente 10\sim25 Lf basándose en la dosis pediátrica. Como antígeno tetánico se cultiva Clostridium tetanii, Harvard, en un medio de cultivo apropiado en condiciones anaerobias. Es apropiado el toxoide tetánico que se obtiene destoxificando la toxina tetánica purificada mediante el procedimiento convencional. La cantidad del antígeno es preferiblemente 1\sim5 Lf basándose en la dosis pediátrica. Además, se cultiva el antígeno tosferínico en un medio de cultivo apropiado usando Bordetella pertussis, Tohama fase I y se purifican múltiples tipos de proteína de antígeno incluyendo un toxoide tosferínico mediante un procedimiento convencional en un sobrenadante de cultivo y se destoxifican. Son apropiados los antígenos tosferínicos o un antígeno tosferínico de célula completa. En el presente documento se proporciona un procedimiento de fabricación de una vacuna mixta, en el que en el caso de múltiples tipos de antígenos, la cantidad total de los antígenos es inferior a 20 \mugPN (\mug de nitrógeno de proteína) basándose en la dosis pediátrica y, en el caso del antígeno tosferínico de célula completa, la cantidad del antígeno es preferiblemente inferior a 20 OE basándose en la dosis pediátrica. La presente invención se refiere además a un procedimiento para fabricar una vacuna mixta en el que las proteínas de antígenos múltiples purificadas incluyen un toxoide tosferínico destoxificado y antígeno de hemaglutinina filamentosa (FHA).

Preferiblemente, la presente invención se refiere a un procedimiento para fabricar una vacuna mixta de una manera tal que la cantidad de antígeno de superficie del virus de la hepatitis B recombinante, que se fabrica mediante un procedimiento de ingeniería genética como un antígeno de la hepatitis B, es de 5\sim10 \mug basándose en la dosis pediátrica. Más preferiblemente, la presente invención se refiere a un procedimiento de fabricación de una manera tal que el antígeno de superficie de la hepatitis B se adsorbe en un adsorbente mezclando con agitación a 2\sim8ºC durante 3\sim20 horas. Con el fin de encontrar el contenido óptimo en adsorbente para la fabricación de la vacuna mixta, se analizó la proporción de adsorción para cada componente del antígeno a cada concentración de adsorbente. Como resultado, cuando la concentración final de ión aluminio es inferior a 0,5 mg/ml en el momento en que se completa la combinación final, la proporción de adsorción de cada antígeno se redujo relativamente (tal como se muestra en la figura 1). Además, se estipula por norma que la concentración de ión aluminio es inferior a 1,25 mg/ml en el gen de aluminio usado para la vacuna (OMS, "Requirements for diphtheria, tetanus, pertussis and combined vaccines" en Technical Report Series nº 800, 1990, páginas 87\sim179). Por tanto, como el gel de hidróxido de aluminio, la concentración final del ión aluminio está preferiblemente en el intervalo de 0,5\sim1,25 mg/ml y más preferiblemente en el intervalo de 0,7 mg/ml.

Además, con el fin de prevenir la posibilidad de que se reduzca la proporción de absorción de cada antígeno componente por una fuerza de repulsión producida entre cada antígeno componente, incluso después de que se complete la combinación de cada componente, se convierten la antigenicidad y el nivel de formación de anticuerpos de cada antígeno componente en el porcentaje relativo para comparar esos valores entres las dos muestras: una muestra en la que se combina previamente el otro componente excepto un gel de hidróxido de aluminio y luego se añade adicionalmente gel de hidróxido de aluminio en exceso y, una muestra en la que se añade previamente el adsorbente de igual concentración antes de que se complete la combinación. El cambio de la antigenicidad y del nivel de formación de anticuerpos disminuye cuando se añade el adsorbente en exceso, incluso después de que se complete la combinación de cada componente (tal como se muestra en la figura 2).

Además, en el caso de la muestra en la que se añade el polisorbato 80 (tween 80), se mantuvieron la antigenicidad y el título con respecto a la hepatitis B (tal como se muestra en la figura 2). Se espera que pueda obtenerse un resultado similar incluso si se usan tensioactivos neutros tales como polisorbato 20 y Triton X-100 en una concentración apropiada. Tal como se muestra en la figura 2, la muestra 1 y muestra 2 se preparan de una manera en la que se añade adicionalmente gel de hidróxido de aluminio en exceso después de que se complete la combinación de cada componente y en la que se añade previamente el adsorbente de igual concentración antes de que se complete la combinación, respectivamente.

Preferiblemente, la presente invención se refiere a un procedimiento para fabricar una vacuna mixta en la que la concentración de ión aluminio del gel de hidróxido de aluminio está en el intervalo de 0,5\sim1,25 mg/ml. Más preferiblemente, la presente invención se refiere a un procedimiento para fabricar una vacuna mixta que incluye una etapa de añadir adsorbente en exceso en el intervalo que no supera el intervalo de concentración del ión aluminio de 0,5\sim1,25 mg/ml después de que se combinan los antígenos protectores adsorbidos en el adsorbente. En una realización preferida de la presente invención, es posible mantener una adsorción inherente de cada antígeno componente en la vacuna mixta y aumentar la inmunidad.

Como el antígeno tosferínico, se usa generalmente un antígeno tosferínico purificado usado en Corea y otros diversos países. Algunos países americanos y los países del Tercer Mundo usan el antígeno tosferínico de célula completa que está destoxificado. Por tanto, en la presente invención, se amplía el intervalo aplicable de la vacuna mixta mediante el estudio sobre el procedimiento de combinación que usa antígeno tosferínico de célula completa. En este caso, la combinación se realizó con el mismo procedimiento que usando el antígeno tosferínico purificado mencionado para así obtener una muestra que puede mantener la inmunidad de cada componente (tal como se muestra en la tabla 1).

En el caso de la vacuna de DTP que incluye un antígeno tosferínico de célula completa, se usa generalmente un gel de fosfato de aluminio como adsorbente. Sin embargo, con el fin de fabricar una vacuna mixta con respecto al antígeno de la hepatitis B, se fabricó la vacuna de DTP usando el gel de hidróxido de aluminio. En este caso, se disminuía la inmunidad con respecto a la tos ferina, pero cuando se añadía adicionalmente un gel de hidróxido de aluminio en exceso después de que se completara la combinación de cada vacuna componente (muestra A), era posible mantener la inmunidad deseada. Como referencia, se prepara la muestra B de manera que se añadió previamente el adsorbente de igual concentración antes de que se completara la combinación.

Se sometió a prueba la seguridad y la eficacia de la vacuna mixta fabricada según la presente invención basándose en los siguientes procedimientos. En primer lugar, se administró una sobredosis de vacuna mixta a un roedor, y se comprobó que no se observaba lesión como resultado de la biopsia (no se proporciona el resultado de la misma). Además, se midió el nivel de anticuerpos frente a cada antígeno en un grupo (grupo 2) en el que se administró una vacuna mixta a un mono y en un grupo (grupo 1) en el que se administraron simultáneamente cada vacuna de DTP y de la hepatitis B. Como resultado de la prueba t con respecto a la cantidad de anticuerpo entre los dos grupos, cuando se comparó el resultado del grupo 2 con el resultado del grupo 1, se evaluó que la vacuna mixta mostraba igual o mejor inmunogenicidad frente a cada antígeno que el grupo de inyección simultánea de cada vacuna (tal como se muestra en la figura 3. No se proporciona el resultado de la estadística).

Como conclusión, se desarrolló el procedimiento de combinación en la presente invención, en el que se minimizó la interacción entre los diferentes componentes inmunitarios y no se disminuyó cada efecto inmunógeno. Cuando se divide cada componente inmunitario usado para la vacuna mixta basándose en las propiedades físicas y químicas, los componentes inmunógenos pueden dividirse en un antígeno de proteína (antígeno diftérico, antígeno tetánico, antígeno tosferínico purificado), un antígeno compuesto de capa de fosfolípido y proteína (antígeno de la hepatitis B) y un antígeno compuesto de célula completa inactivada (un antígeno tosferínico de célula completa), etc. Por tanto, puede predecirse que pueda ponerse en práctica una combinación con otro antígeno de vacuna simple basándose en las características físicas y químicas de los componentes. Puede ser posible una combinación de una vacuna adicional con respecto a las enfermedades (Hemophilus influenza, poliomielitis) que deben prevenirse en los lactantes mediante las vacunas mixtas preparadas según la presente invención.

El periodo de vacunación del cuerpo del agente de la vacuna mixta según la presente invención pueden ser los periodos de vacunación previos de la vacuna de DTP o la vacuna de la hepatitis B. En el caso de que exista el antígeno de la hepatitis B en el cuerpo de la madre, se prefiere inocular tres veces en el segundo, cuarto y sexto mes. En el caso de que no exista la hepatitis B en el cuerpo de la madre, como periodo de vacunación apropiado, se inocula particularmente la vacuna de la hepatitis B tras el nacimiento y después se realiza la vacunación adicional usando una vacuna mixta. Puede realizarse una vacunación apropiada con respecto a los lactantes mediante un procedimiento de inyección hipodérmica o muscular. La dosis del antígeno diftérico, tetánico, tosferínico y de la hepatitis B respectivamente en la vacuna mixta según la presente invención es la misma que la dosis para el lactante del antígeno de cada vacuna simple.

Ejemplo 1 Fabricación del antígeno de la hepatitis B

Se cultivó de manera intensiva la célula de levadura que puede expresar el antígeno de superficie de la hepatitis B mediante un procedimiento de ingeniería genética. Se diluyó 1 kg del precipitado de células de levadura que se obtuvo mediante la centrifugación a una proporción de 1:2 en una disolución tampón (NaCl 0,5 M, EDTA 10 mM, timerosal al 0,01%, fosfato 0,1 M, pH 7,0). La disolución diluida fluyó a través de una batidora de perlas de vidrio (o Dynomil) para así romper las paredes celulares, etc. Se añadió a la disolución obtenida un tensioactivo neutro (grupo Tween o grupo Triton) al 0,5% y se mezcló uniformemente agitando a 4ºC. Se añadió hidróxido de sodio a la disolución resultante para así obtener pH 11 y luego se mezcló agitando a 4ºC durante 5 horas. Se añadió ácido clorhídrico diluido a la disolución resultante para así obtener pH 4. Se retiró el precipitado mediante centrifugación a 6000 rpm durante 15 minutos usando la centrífuga (ROTOR: JA-14, Beckman Inc. EE.UU.) y se obtuvo la disolución superior que incluía el antígeno de superficie de la hepatitis B. Se ajustó el pH de la disolución superior a 7 y luego se añadió a la misma sílice y se mezcló a 4\sim25ºC durante 3-16 horas, de modo que se adsorbió a la sílice el antígeno de superficie de la hepatitis B. El gel de sílice que se usa preferiblemente en la presente invención es Aerosil 380 (Degussa, EE.UU.) que incluye sílice de hidratación fina o sílice anhidra que tiene un área superficial válida de 100\sim500 mm^{2}/g. Con el fin de eliminar los contaminantes de la sílice a la que se adsorbe el antígeno de superficie de la hepatitis B, se lavó la disolución resultante dos veces usando disolución de tampón fosfato de sodio (disolución de cloruro de sodio de pH 7). Se puso en contacto la sílice lavada con la disolución de tampón carbonato de sodio de pH 9,6 durante aproximadamente 2 horas para así producir la desorción de un antígeno de superficie. El antígeno de superficie así separado tenía una pureza de proteína superior al 90% en la disolución. Se hizo fluir la disolución resultante en DEAE-Sepharose (PHAMACIA, Suecia) que se equilibró usando dicha disolución de tampón sodio para así unir de manera específica un antígeno de superficie y eliminar las sustancias separadas en la columna usando dicha disolución tampón. Se eluyeron los contaminantes ligeramente unidos en la columna usando la disolución tampón que incluía cloruro de sodio de 0,05\sim0,1 M. A continuación, se eluyó el antígeno de superficie de la hepatitis B usando dicha disolución tampón que incluía el cloruro de sodio de 0,2 M. Se concentró la disolución así eluida usando una membrana de ultrafiltración que puede separar la sustancia de peso molecular superior a 100.000 y se separó el precipitado mediante precipitación y se retiró, y se recogió la disolución superior y se realizó la cromatografía de permeación en gel (Sepharose CL-4B, PHAMACIA, Suecia) con respecto a la disolución superior recogida. Se confirmaron mediante electroforesis las fracciones que incluían un antígeno de superficie puro y se usaron como el antígeno de la hepatitis B. Además, con el fin de disminuir la interacción con cada antígeno de la hepatitis, se añadió tween 80 a 0, 5, 10 \mug por 1 ml y después se observó el efecto de tween 80 (tal como se muestra en la figura 2).

Ejemplo 2 Fabricación de toxoide diftérico

Se cultivó Corynebacterium diphtheria PW nº 8 a 35ºC durante 24 horas en el medio de cultivo en agar de nutrición (DIFCO, EE.UU.) y se subcultivó dos veces. Se cultivó una de las colonias a 35ºC durante 24 horas en 2 ml del medio de cultivo de infusión de cerebro y corazón (DIFCO, EE.UU.) y se inocularon 1,2 ml de esto al medio de cultivo Muller modificado (véase: Stainer, et. al, Canadian J. Microbiol., 14:155, 1968) de 300 ml y se cultivó a 35ºC durante 36 horas. Tras el cultivo se retiraron las células de la disolución de cultivo y se recogió la disolución de toxina y se le añadió sulfato de amonio a 4ºC. Se llevó la concentración final al 25% (p/v) y se ajustó el pH a 8,0. Se añadió gota a gota la disolución de cultivo, que tenía ajustados el pH y la concentración de sal, a la columna de fenil-Sepharose que se había equilibrado previamente usando disolución de tampón Tris 10 mM pH 8,0 que incluía sulfato de amonio al 25% (p/v). La disolución tampón, al igual que la disolución de equilibrio de la columna y la disolución de tampón Tris 10 mM (pH 8,0) que incluida sulfato de amonio al 15% (p/v), se hicieron fluir secuencialmente a la columna para así eliminar las impurezas. Se eluyó la toxina usando disolución de tampón Tris 10 mM (pH 8,0) que no incluía sal. Se recogió la disolución de toxina diftérica diluida y se dializó en disolución de tampón fosfato 10 mM (pH 7,4) que incluía cloruro de sodio 150 mM. Una vez completado el procedimiento de diálisis, se añadió formalina, de modo que la concentración final fue del 0,05% (p/v) y se hizo reaccionar la disolución resultante a 37ºC durante 1 hora, y se añadió lisina para así obtener la concentración final de 0,05 M y después se destoxificó la disolución resultante a 37ºC durante 4 semanas. Se dializó la disolución de toxoide en disolución de tampón fosfato 10 mM (pH 7,4) con cloruro de sodio para así eliminar completamente la formalina y se añadió timerosal hasta tener el 0,01% (p/v) de la concentración final. Se usó la disolución resultante como disolución de toxoide diftérico.

Ejemplo 3 Fabricación de toxoide tetánico

Se cultivó Clostridium tetanii (cepa de Harvard) mediante un procedimiento en agar fundido con medio en agar de bilis de hígado esterilizado (DIFCO, EE.UU.). Se inocularon unas pocas colonias del cultivo anterior en un medio de cultivo de infusión de cerebro y corazón (DIFCO, EE.UU.) que incluía el 0,3% (p/v) de extracto de levadura (DIFCO, EE.UU.) de 2 ml que tenía un nivel de oxígeno disminuido y se cultivaron a 35ºC durante 24 horas en estado anaerobio. Y después se inoculó la disolución de cultivo en 500 ml de medio de cultivo de infusión de cerebro y corazón saturado completamente con nitrógeno (DIFCO, EE.UU.) que incluía el 0,3% (p/v) de extracto de levadura (DIFCO, EE.UU.) y se cultivó a 35ºC durante 7 días en estado anaerobio. Tras el cultivo se retiraron las células de la disolución de cultivo, se recogió la disolución de toxina y se le añadió sulfato de amonio a 4ºC para así obtener la concentración final de 60% (p/v) y se mezcló durante 24 horas, y se mezcló completamente para así obtener un precipitado mediante centrifugación. Se disolvió el precipitado en una pequeña cantidad de agua destilada y se retiró el material insoluble. Se añadió gota a gota la disolución resultante a la columna Sephagrill S-100 que se equilibró previamente usando disolución de tampón Tris 10 mM (pH 8,0) que incluía cloruro de sodio 0,5 M. Se hizo fluir la misma disolución tampón para así eluir la toxina separada. Se recogió la disolución de toxina tetánica y se dializó en disolución de tampón fosfato 10 mM (pH 7,4) que incluía cloruro de sodio 150 mM. Después de la diálisis se añadió formalina hasta tener la concentración final del 0,025% (p/v) y se hizo reaccionar a 37ºC durante 1 hora. A continuación se añadieron lisina e hidrogenocarbonato de sodio hasta tener la concentración final de 0,05 mM y 0,04 M, respectivamente y se maduró a 37ºC durante 4 semanas y se destoxificó. Después de destoxificar, se dializó la disolución de toxoide en disolución de tampón fosfato 10 mM (pH 7,4) que incluía cloruro de sodio 150 mM y se eliminó totalmente la formalina. Se añadió timerosal hasta tener la concentración final del 0,01% (p/v) y se usó como disolución de toxoide tetánico.

Ejemplo 4 Fabricación de proteína de antígeno tosferínico purificada

Se cultivó Bordetella pertussis, Tohama fase I, en medio de cultivo en agar Bodet-Gengo (DIFCO, EE.UU.) que incluía el 15% de sangre de conejo a 35ºC durante 72 horas y se hizo pasar dos veces. Se inocularon unas pocas colonias en 50 ml de medio de cultivo Stainer-Sholte y se cultivaron a 35ºC durante 48 horas. Se volvió a inocular la disolución así cultivada en 500 ml de medio de cultivo Stainer-Sholte modificado (véase Imazumi et al., INFECT.-IMMUN., 1983, vol 41, páginas 1138) y se cultivó a 35ºC durante 36 horas. Se añadió a la disolución cultivada una disolución acuosa de timerosal al 10% hasta tener una concentración final del 0,01% para así evitar el crecimiento de la bacteria tosferínica y después se retiraron las células mediante centrifugación. Se añadieron a la disolución resultante el triple de volumen de agua destilada y se mezcló bien. Se disminuyó el pH actual hasta pH 6,0 usando ácido sulfúrico 1 N. Se añadió gota a gota la disolución resultante a la columna de CM-Sepharose que se había equilibrado previamente usando tampón fosfato de sodio 10 mM de pH 6,0. Se hizo fluir la disolución tampón, al igual que la disolución de equilibrio de la columna, para así eliminar las sustancias que no estaban acopladas a la columna y se eliminaron las impurezas que estaban ligeramente acopladas a la columna usando la disolución tampón al igual que la disolución de equilibrio de la columna que incluía cloruro de sodio 100 mM. Cuando las impurezas ya no se eluían a través de la columna, se eluyeron los materiales unidos con un gradiente lineal formado por la disolución de equilibrio de la columna que incluía cloruro de sodio 100 mM y cloruro de sodio 600 mM que tenían el mismo volumen, de modo que se separó una fracción que incluía proteína de antígeno tosferínico tal como FHA (hemaglutinina filamentosa) y toxina tosferínica. Se diluyó la fracción de antígeno usando disolución de tampón fosfato de sodio 10 mM (pH 8,0) del doble de volumen hasta tener pH 8,0. Se añadió gota a gota la disolución resultante en una columna de hidroxiapatita que se había equilibrado previamente usando disolución de tampón fosfato de sodio 10 mM de pH 8,0. Se hizo fluir la disolución tampón al igual que la disolución de equilibrio de la columna que incluía cloruro de sodio 100 mM en la columna, para así eliminar las sustancias que no se habían acoplado a la columna. Se hizo fluir la disolución de tampón fosfato de sodio 80 mM de pH 8,0 que incluía cloruro de sodio 100 mM a la misma velocidad que la velocidad de goteo para así separar la fracción de toxina tosferínica. Cuando se separó la toxina tosferínica, se hizo fluir una disolución de tampón fosfato de sodio 250 mM de pH 8,0 que incluía cloruro de sodio 100 mM a la misma velocidad que la velocidad de goteo para así separar la fracción de FHA (hemaglutinina filamentosa). Se dializaron la toxina tosferínica y la FHA (hemaglutinina filamentosa) en disolución de tampón fosfato de sodio 10 mM (pH 7,4) que incluía cloruro de sodio al 0,15% a 4ºC. Se añadieron glicerol y glutaraldehído a la disolución de muestra de toxina tosferínica dializada hasta tener la concentración final del 50% (p/v) y del 0,05% (p/v) y destoxificó a 37ºC durante 4 horas. Se añadió aspartato de sodio hasta tener la concentración final de 0,025 M para así completar el proceso de destoxificación. Se añadieron glicerol y formalina a la disolución de muestra de FHA (hemaglutinina filamentosa) dializada hasta tener el 50% (p/v) y el 0,025% (p/v) y se destoxificó a 37ºC durante 24 horas. Se añadió lisina hasta tener la concentración final de 0,025 M, de modo que se completó el proceso de destoxificación. Se dializó cada disolución de muestra en disolución de tampón fosfato de sodio 10 mM (pH 7,4) que incluía cloruro de sodio al 0,15% a temperatura ambiente. Se añadió timerosal hasta tener la concentración final del 0,01% (p/v). A continuación se mezclaron la disolución de muestra de toxina tosferínica y la disolución de muestra de FHA (hemaglutinina filamentosa) destoxificadas en una proporción de 1:4 y se usaron como una proteína de antígeno tosferínico.

Ejemplo 5 Fabricación de un antígeno tosferínico de célula completa

Se cultivó la bacteria tosferínica, Bordetella pertussis, Tohama fase I, en medio de cultivo en agar Bodet-Gengo (DIFCO, EE.UU.) que incluía el 15% de sangre de conejo a 35ºC durante 72 horas y se hizo pasar dos veces. Se inocularon algunas de las colonias en 50 ml de medio de cultivo Stainer-Sholte y se cultivaron a 35ºC durante 48 horas. Se volvió a inocular la disolución resultante en el medio de cultivo Stainer-Sholte modificado (véase Imazumi et al., INFECT.-IMMUN., 1983, vol 41, página 1138) de 500 ml y se cultivaron a 35ºC durante 36 horas. Se añadió disolución acuosa de timerosal al 10% a la disolución de cultivo hasta tener la concentración final del 0,01% para así evitar el crecimiento de la bacteria tosferínica y recoger los componentes somáticos basándose en la centrifugación. Se dializó la disolución somática recogida en disolución de tampón fosfato de sodio 10 mM (pH 7,4) que incluía cloruro de sodio al 0,15% a 4ºC. Se añadió formalina a la disolución somática tosferínica dializada hasta tener la concentración final del 0,025% (p/v) y se destoxificó a 37ºC durante 4 semanas. Se añadió lisina hasta tener la concentración final de 0,025 M para así completar el proceso de destoxificación. Se dializó la disolución de muestra en disolución de tampón fosfato de sodio 10 mM (pH 7,4) que incluía cloruro de sodio al 0,15% y se añadió timerosal hasta tener la concentración final del 0,01% (p/v) y se usó como el antígeno tosferínico de célula completa.

Ejemplo 6 Fabricación de vacuna mixta que incluye antígeno tosferínico purificado

Etapa 1

Fabricación de vacuna de la hepatitis B

Se fabricó la vacuna de la hepatitis B usando el antígeno de superficie de la hepatitis B fabricado en el ejemplo 1. Se fabricó una disolución de hidróxido de aluminio añadiendo gel de hidróxido de aluminio a la disolución de tampón fosfato. Se mezcló lentamente la disolución resultante y se añadió gota a gota la disolución de antígeno anterior y se mezcló agitando lentamente a 4ºC durante 15 horas para así fabricar la vacuna de la hepatitis B. En este momento, la cantidad de antígeno de superficie de la hepatitis era de 60 \mug/ml que era tres veces más concentrado comparado con la cantidad del antígeno de superficie de la hepatitis B común. En el caso de la primera muestra, la cantidad del ión aluminio en el gel de hidróxido de aluminio era de 0,9 mg/ml. En el caso de la segunda muestra, la cantidad del ión aluminio en el gel de hidróxido de aluminio era de 1,5 mg/ml (tal como se muestra en la figura 2).

Etapa 2

Fabricación de la vacuna mixta de DTP

Se fabricó la vacuna mixta de DTP usando cada antígeno fabricado en los ejemplos segundo, tercero y cuarto. Se fabricó la disolución de hidróxido de aluminio añadiendo gel de hidróxido de aluminio a la disolución de tampón fosfato en el procedimiento convencional. A medida que se mezclaba lentamente la disolución resultante, se añadió gota a gota cada antígeno a cada disolución de hidróxido de aluminio y se mezcló agitando lentamente para así realizar una adsorción uniforme, de modo que se fabricó la vacuna mixta de DTP. En este momento se concentró la cantidad de cada antígeno 1,5 veces más alta comparado con la cantidad de cada antígeno componente de vacuna de DTP común. La cantidad del ión aluminio en el gel de hidróxido de aluminio era de 0,3 mg/ml.

Etapa 3

Fabricación de la vacuna mixta de DTP - hepatitis B

Se mezclaron lentamente cada vacuna de DTP y vacuna de la hepatitis B fabricadas en las etapas 1 y 2 a la proporción en volumen de 2:1. En el caso de la primera muestra, se añadió gel de hidróxido de aluminio en exceso de modo que la cantidad del ión aluminio en el gel de hidróxido de aluminio fue finalmente de 0,7 mg/ml y se mezcló de manera continua agitando a 25ºC durante 1 hora para así fabricar una vacuna mixta estable que no interactúa con otros componentes. En el caso de la segunda muestra, no se añadió gel de hidróxido de aluminio en exceso y se mezcló de manera continua a 25ºC durante 1 hora para así fabricar la vacuna mixta. Las cantidades de los iones aluminio en el gel de hidróxido de aluminio de las vacunas mixtas de la primera y segunda muestra eran de 0,7 mg/ml. Para la prueba del título de anticuerpos, la composición de la vacuna mixta era de 20 \mug del antígeno de superficie de la hepatitis B, 25 Lf de toxoide diftérico, 3 Lf de toxoide tetánico, 2,5 \mugPN de toxoide tosferínico y 10 \mugPN de antígeno de FHA tosferínica (antígeno de FHA (hemaglutinina filamentosa) tosferínica) basado en 1 ml (tal como se muestra en la figura 2).

Ejemplo 7 Fabricación de la vacuna mixta que incluye un antígeno tosferínico de célula completa

Etapa 1

Fabricación de la vacuna de la hepatitis B

Se fabricó la vacuna de la hepatitis B usando el antígeno de superficie de la hepatitis B fabricado en el ejemplo 1. Se añadió un gel de hidróxido de aluminio a la disolución de tampón fosfato para así fabricar la disolución de hidróxido de aluminio. A medida que se mezclaba lentamente la disolución, se añadió gota a gota la disolución de antígeno anterior y se mezcló totalmente a 4ºC durante 15 horas para así fabricar la vacuna de la hepatitis B. En este momento, la cantidad del antígeno de superficie de la hepatitis B era de 60 \mug/ml que estaba tres veces más concentrada comparado con la cantidad de la vacuna de la hepatitis B común. En el caso de la primera muestra, la cantidad del ión aluminio era de 0,9 mg/ml en el gel de hidróxido de aluminio. En el caso de la segunda muestra, la cantidad del ión aluminio era de 1,5 mg/ml en el gel de hidróxido de aluminio (tal como se muestra en la figura 2).

Etapa 2

Fabricación de la vacuna mixta de DTP

Se fabricó la vacuna mixta de DTP usando cada antígeno fabricado en los ejemplos 2, 3 y 5. Se añadió el gel de hidróxido de aluminio a la disolución de tampón fosfato en el procedimiento convencional para así fabricar una disolución de hidróxido de aluminio. A medida que se mezclaba lentamente la disolución resultante, se añadió lentamente cada disolución de antígeno en cada disolución de hidróxido de aluminio y se mezcló totalmente. Se realizó una adsorción uniforme para así fabricar una vacuna mixta de DTP. En este momento se concentró la cantidad de cada antígeno 1,5 veces más comparado con la cantidad de cada antígeno componente de la vacuna de DTP común. La cantidad del ión aluminio era de 0,3 mg/ml en el gel de hidróxido de aluminio.

Etapa 3

Fabricación de la vacuna mixta de DTP-hepatitis B

Se mezclaron lentamente cada vacuna de DTP y vacuna de la hepatitis B fabricadas en las etapas 1 y 2 en una proporción en volumen de 2:1. En el caso de la primera muestra, se añadió un gel de hidróxido de aluminio en exceso, de modo que la cantidad del ión aluminio era finalmente de 0,7 mg/ml en el gel de hidróxido de aluminio y se mezcló de manera continua la disolución resultante a 25ºC durante 1 hora para así fabricar una vacuna mixta estable que no interactúa con otros componentes. En el caso de la segunda muestra, no se añadió gel de hidróxido de aluminio en exceso y se mezcló de manera continua la disolución a 25ºC durante 1 hora para así fabricar una vacuna mixta. Las cantidades de los iones aluminio en el gel de hidróxido de aluminio de las vacunas mixtas de las muestras 1 y 2 fueron de 0,7 mg/ml. Para la prueba del título de anticuerpos, la composición de la vacuna mixta fue de 20 \mug del antígeno de superficie de la hepatitis B, 50 Lf de toxoide diftérico, 10 Lf de toxoide tetánico y 20 OE de un antígeno tosferínico de célula completa basado en 1 ml (tal como se muestra en la figura 2).

Ejemplo 8 Prueba de antigenicidad en la vacuna mixta

Se realizó la prueba de antigenicidad en la vacuna mixta fabricada en los ejemplos 6 y 7 mediante inmunoensayo enzimático (EIA) usando anticuerpo monoclonal y anticuerpo policlonal mediante comparación con el patrón de cada antígeno con respecto a cada contenido en antígeno.

Además, se eliminó mediante centrifugación el antígeno adsorbido a la sal de para medir la proporción de adsorción de cada antígeno, y se midió la cantidad de antígeno separado usando la disolución superior.

El promedio de cada resultado que se muestra en las figuras 1 y 2 muestra la antigenicidad relativa de cada antígeno.

Ejemplo 9 Prueba de formación de anticuerpos por la vacuna mixta Prueba de formación de anticuerpos por el antígeno de superficie de la hepatitis B

Se inocularon la vacuna mixta y la vacuna de la hepatitis B fabricadas en los ejemplos 6 y 7 en ratones ICR en los que se agruparon 16 ratones como el grupo 1 y se extrajo sangre de los ratones ICR tras 18 días. Se separó el suero de la sangre. Se obtuvo el nivel de anticuerpos frente al antígeno de superficie de la hepatitis B basándose en la unidad de UI/ml usando el EIA (inmunoensayo enzimático) y se calculó como el título de anticuerpos en media geométrica. Se calculó el título de la vacuna mixta con respecto a la vacuna de la hepatitis B.

Las figuras 2c y 2d muestran el título de anticuerpos relativo de vacuna mixta con respecto a cada antígeno y la tabla 1 muestra los valores de cada título.

Prueba de formación de anticuerpos por el antígeno diftérico

Se inocularon la vacuna mixta y la vacuna de DTP fabricadas en los ejemplos 6 y 7 en ratones ICR en los que se agruparon 16 ratones como el grupo 1. Se extrajo sangre de los ratones ICR tras 28 días. Se separó el suero de la sangre. Se midió el nivel de anticuerpos frente al antígeno diftérico del suero usando el EIA (inmunoensayo enzimático) basado en la unidad de UI/ml y se calculó como el título de anticuerpos en media geométrica. A continuación se midió el título de la vacuna mixta comparado con la vacuna de DTP.

\newpage

Las figuras 2c y 2d muestran el título de anticuerpos relativo de la vacuna mixta con respecto a cada antígeno y la tabla 1 muestra los valores de cada título.

Prueba de formación de anticuerpos por el antígeno tetánico

Se inocularon la vacuna mixta y la vacuna de DTP fabricadas en los ejemplos 6 y 7 en ratones ICR en los que se agruparon 16 ratones como el grupo 1. Se extrajo sangre de los ratones ICR tras 28 días. Se separó el suero de la sangre. Se midió el nivel de anticuerpos frente al antígeno tetánico del suero usando el EIA (inmunoensayo enzimático) basado en la unidad de UI/ml y se calculó como el título de anticuerpos en media geométrica. A continuación, se midió el título de la vacuna mixta comparado con la vacuna de DTP.

Prueba de formación de anticuerpos por el antígeno tosferínico

Se inocularon la vacuna mixta y la vacuna de DTP fabricadas en los ejemplos 6 y 7 en ratones ICR en los que se agruparon 16 ratones como el grupo 1. Se extrajo la sangre de los ratones ICR tras 28 días. Se separó el suero de la sangre. Se midió el nivel de anticuerpos frente al antígeno tosferínico del suero usando el EIA (inmunoensayo enzimático) basado en la unidad de UI/ml y como el título de anticuerpos en media geométrica. A continuación se midió el título de la vacuna mixta comparado con la vacuna de DTP.

1

Ejemplo 10 Prueba de eficacia comparativa con monos

Se realizó una prueba para probar la inmunogenicidad en un primate de la vacuna mixta y compararla con la vacuna simple convencional. Se vacunaron 6 monos (grupo 2, formado por el mismo número de monos macho y hembra) con la vacuna mixta fabricada en el ejemplo 6, y se vacunaron 6 monos (grupo 1, formado por el mismo número de monos macho y hembra) con cada vacuna componente simultáneamente. Se volvió a vacunar a cada grupo con los mismos productos con los que se habían vacunado en los días 30 y 60. Se extrajo la sangre de cada animal de experimentación en los días 1, 29, 58 y 86 a partir de la fecha de vacunación inicial, y se midió el título de anticuerpos frente a cada enfermedad basado en el método ELISA apropiado para el suero del mono.

La figura 3 muestra el título de anticuerpos en media geométrica frente a cada antígeno de cada grupo.

Aplicabilidad industrial

La presente invención, se refiere a un procedimiento para fabricar una vacuna mixta para prevenir simultáneamente enfermedades tales como difteria, tétanos, tos ferina y hepatitis B, etc., que deben prevenirse en un lactante. Mediante la presente invención, es posible prevenir simultáneamente enfermedades tales como difteria, tétanos, tos ferina y hepatitis B que deben prevenirse en un lactante usando la vacuna mixta según la presente invención.

Dado que la presente invención puede realizarse de varias formas sin apartarse del espíritu o características esenciales de la misma, debe entenderse también que las realizaciones descritas anteriormente no están limitadas por ninguno de los detalles de la descripción anterior, a menos que se especifique lo contrario, sino que más bien deben interpretarse en líneas generales dentro de su espíritu y alcance tal como se define en las reivindicaciones adjuntas, y por tanto, se pretende que todos los cambios y modificaciones que caen dentro de los cumplimientos y limites de las reivindicaciones, o equivalencias de tales cumplimientos y límites, queden incluidos por las reivindicaciones adjuntas.

Claims

1. Un procedimiento para fabricar una vacuna mixta que comprende:

(a): proporcionar antígenos protectores individuales de antígeno diftérico, antígeno tetánico, antígeno tosferínico y antígeno de la hepatitis B,

(b): adsorber independientemente cada antígeno protector en un adsorbente de gel de hidróxido de aluminio, y

(c): combinar cada antígeno protector adsorbido independientemente.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además una etapa de:

añadir más gel de hidróxido de aluminio después de combinar cada antígeno protector adsorbido independientemente.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la concentración final de ión aluminio del gel de hidróxido de aluminio está en el intervalo de 0,5-1,25 mg/ml.

4. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el antígeno de la hepatitis B combinado es un antígeno de superficie de la hepatitis B recombinante en una cantidad de 5-10 \mug por dosis.

5. El procedimiento según la reivindicación 4, que comprende además una etapa de: añadir un tensioactivo neutro seleccionado del grupo constituido por polisorbato 20, polisorbato 80 y Triton®X- 100.

6. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que se combina dicho antígeno de la hepatitis B agitando con un hidróxido de aluminio a 2-8ºC durante 3-20 horas.

7. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el antígeno diftérico es

un toxoide diftérico en una cantidad de 10-25 Lf por dosis.

8. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el antígeno tetánico

es un toxoide tetánico en una cantidad de 1-5 Lf por dosis.

9. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el antígeno tosferínico es

un antígeno tosferínico purificado en una cantidad inferior a 20 \mugPN por dosis; o

un antígeno tosferínico de célula completa en una cantidad inferior a 20 OU por dosis.

10. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que el antígeno tosferínico purificado es toxoide tosferínico, FHA (hemaglutinina filamentosa) tosferínica o una mezcla de los mismos.

11. Una vacuna mixta tal como se produce según cualquiera de los procedimientos reivindicados en las reivindicaciones 1 a 10.