PT2097102E - Vacina de combinação tendo quantidades reduzidas de antigénio de poliovírus - Google Patents

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antigenic
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Herve De Hemptinne
Michel Duchene
Anne Mary
Marc Sonveaux
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Glaxosmithkline Biolog Sa
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Description

DESCRIÇÃO
"VACINA DE COMBINAÇÃO TENDO QUANTIDADES REDUZIDAS DE ANTIGÉNIO DE POLIOVÍRUS"
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao campo das vacinas para protecção contra pólio e, em particular, a vacinas de combinação para protecção contra as doenças pólio, difteria, tétano e tosse convulsa.
ANTECEDENTES
As vacinas de combinação (que proporcionam protecção contra múltiplos patogénios) são muito desejáveis para minimizar o número de imunizações requerido para conferir protecção contra múltiplos patogénios, para baixar custos de administração e para aumentar as taxas de aceitação e cobertura. 0 fenómeno, bem documentado, da competição (ou interferência) antigénica complica o desenvolvimento de vacinas multicomponente. A interferência antigénica refere-se à observação de que a administração de múltiplos antigénios resulta, frequentemente, numa resposta diminuída a determinados antigénios, em relação à resposta imunitária observada quando esses antigénios são administrados individualmente. São conhecidas as vacinas de combinação que podem prevenir a infecção por Bordetella pertussis, Clostridium tetani, 1
Corynebacterium diphtheriae e, opcionalmente, poliovírus inactivado (IPV) e/ou vírus de Hepatite B e/ou Haemophilus tipo B (ver, por exemplo, os documentos W093/24148, W097/00697 e WO2000/030678) .
Após muitos anos de investigação, a dose padrão de vacinas de pólio, aceite como eficaz no seio da comunidade de vacinas de hoje, contém 40 unidades antigénicas D de poliovírus inactivado tipo 1 (Mahoney), 8 unidades antigénicas D de poliovírus inactivado tipo 2 (MEF-1) e 32 unidades antigénicas D de poliovírus inactivado tipo 3 (Saukett) (e. g., Infanrix-IPV™). Herremans et al. (1999), The Journal of Immunology, 162:5011-5018, divulga uma vacina de IPV em que os serotipos 1, 2 e 3 estão presentes nas seguintes quantidades, respectivamente: 40, 4 e 7,5 unidades antigénicas D. Em Doi et al. (2001), Brown F (ed) : Progress in Polio Eradication: Vaccine strategies for the End Game, Dev Biol. Basel, Karger, 105:163-169, a potência de S-IPV produzido em células Vero infectadas com estirpe Sabin foi testado em ratos. O IPV tipo 1 foi testado a 11 e 32 unidades antigénicas D, sendo seleccionadas 30 unidades antigénicas D para ensaios humanos subsequentes. A presente requerente verificou, surpreendentemente, que doses reduzidas de IPV podem manter um nível adequado ou melhorado de protecção contra pólio. Tais vacinas têm vantagens consideráveis, incluindo a capacidade de proporcionar mais doses de vacinas de IPV para os indivíduos que delas necessitam. 2
SUMARIO DA INVENÇÃO
Consequentemente, a presente divulgação contempla várias vacinas de IPV de dose reduzida (que podem ter apenas componentes de IPV ou podem ter componentes de IPV combinados com outros antigénios).
Consequentemente, um aspecto da presente divulgação é uma vacina de IPV compreendendo poliovirus inactivado tipo 1, a uma dose superior a 10 unidades antigénicas D e inferior a 20 unidades antigénicas D, e. g., 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 unidades antigénicas D.
Uma forma de realização aqui divulgada é uma vacina de IPV compreendendo poliovirus inactivado tipo 3, a uma dose de 8-20 unidades antigénicas D, e. g. , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 unidades antigénicas D.
Noutra forma de realização, a presente divulgação proporciona uma vacina de IPV da invenção compreendendo poliovirus inactivado tipo 2, a uma dose de 2-4 unidades antigénicas D, e. g., 2, 3 ou 4 unidades antigénicas D.
Numa forma de realização adicional, é divulgada uma vacina de IPV compreendendo ainda toxóide diftérico e/ou toxóide tetânico e/ou uma vacina de tosse convulsa na forma de vacina de célula intacta morta de Pw ou antigénios de tosse convulsa acelular.
Num aspecto adicional, a presente divulgação inclui uma vacina de IPV que é uma vacina de combinação de DTP-IPV isenta 3 de tiomersal, compreendendo poliovírus inactivado tipo 1, a uma dose entre 10 e 36 unidades antigénicas D.
Noutra forma de realização, a divulgação contempla uma vacina de combinação de DTP-IPV isenta de tiomersal, compreendendo poliovírus inactivado tipo 2, a uma dose de 2-7 unidades antigénicas D, e. g., 5, 6 ou 7 unidades antigénicas D.
Noutra forma de realização, é divulgada uma vacina de combinação de DTP-IPV isenta de tiomersal, compreendendo poliovírus inactivado tipo 3, a uma dose de 8-29 unidades antigénicas D, e. g. , 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ou 29 unidades antigénicas D.
Numa forma de realização adicional, as vacinas aqui divulgadas também podem compreender um ou mais antigénios seleccionados do grupo consistindo de: antigénio de superfície de Hepatite B, antigénio (s) de Haemophilus influenzae b, antigénio(s) de Neisseria meningitidis A, antigénio(s) de Neisseria meningitidis C, antigénio(s) de Neisseria meningitidis W, antigénio(s) de Neisseria meningitidis Y, bleb ou antigénio (s) de Neisseria meningitidis B, antigénio (s) de Hepatite A e antigénio (s) de Salmonella typhi, em particular antigénios de sacárido capsular das referidas bactérias. É proporcionado um método de preparação de uma vacina de combinação para imunização de um hospedeiro humano, cuja vacina compreende toxóide diftérico, toxóide tetânico e poliovírus de tipo 1 inactivado a uma dose superior a 10 unidades antigénicas D e inferior a 20 unidades antigénicas D. 4
DEFINIÇÕES 0 termo "vacina" é, opcionalmente, substituível com a expressão "composição imunogénica" e vice-versa. "Unidades antigénicas D" (também referidas como "unidades internacionais" ou IU) : A forma antigénica D do poliovírus induz anticorpos neutralizantes protectores. As unidades antigénicas D aqui referidas (por exemplo, nas vacinas da invenção) são as unidades antigénicas D totais medidas de cada tipo de antigénio de IPV agregado não adsorvido, antes de formulação da vacina final, que são adicionadas em cada dose humana de vacina formulada (tipicamente, 0,5 mL de volume final). Métodos fiáveis de medição de unidades antigénicas D são bem conhecidos na técnica e são publicados, por exemplo, pela Farmacopeia Europeia. Por exemplo, as unidades antigénicas D podem ser medidas utilizando o teste ELISA, como descrito no Exemplo 1 ("quantificação antigénica D por ELISA") abaixo. A Farmacopeia Europeia proporciona uma amostra de teste (Preparação de Referência Biológica da Farmacopeia Europeia - disponível a partir do Ph. Eur. Secretariat, e. g., Código P 2160000) para padronização de tais métodos entre fabricantes (Pharmeuropa Special Issue, Bio 96-2) . Deste modo, o valor de unidade antigénica D é bem compreendido na técnica.
Aqui, o termo "dose" é tipicamente uma administração da vacina da invenção, que é tipicamente uma injecção. Uma dose humana típica é 0,5 mL. Certamente, podem ser administradas diversas doses num programa de administração de vacina. O termo "IPV" ou uma vacina compreendendo estes componentes pretende, aqui, significar poliovírus tipo 1 inactivado (e. g. , 5
Mahoney, como de um modo preferido utilizado, ou Brunhilde, como comercializado pelo Statens Serum Institut, sob o nome
DiTeKiPol), tipo 2 (e. g. , MEF-1) ou tipo 3 (e. g. , Saukett), ou uma combinação de quaisquer dois ou todos os três destes tipos. Um exemplo de uma vacina de IPV de dose completa (ou padrão) (40-8-32 unidades antigénicas D de IPV tipos 1, 2 e 3, respectivamente) para efeitos desta invenção poderia ser Poliorix® (GSK Biologicals S.A.). Deste modo, onde é aqui referido que X% de uma dose padrão de IPV está presente numa vacina da invenção, entende-se que unidades antigénicas D correspondendo a X% de 40, 8, e/ou 32 unidades antigénicas D de IPV tipos 1, 2 e/ou 3, respectivamente (como medido em cada tipo de antigénio de IPV agregado) são formuladas em cada dose da referida vacina.
Os termos "lipopolissacárido" (LPS) e "lipooligossacárido" (LOS) são intercambiáveis. O termo "sacárido" em toda esta descrição pode indicar polissacárido ou oligossacárido e inclui ambos. O antigénio de sacárido capsular pode ser um polissacárido de tamanho completo ou pode ser prolongado para "sacáridos" e "oligossacáridos" de tamanho bacteriano (que têm, naturalmente, um baixo número de unidades de repetição, ou que são polissacáridos reduzidos em tamanho para exequibilidade, mas são ainda capazes de induzirem uma resposta imunitária protectora num hospedeiro) que são bem conhecidos na técnica de vacina (ver, por exemplo, o documento EP 497525). A expressão "ácido nucleico" pode, aqui, compreender ácido desoxirribonucleico (ADN) de cadeia simples ou dupla ou ácido 6 ribonucleico (ARN) de cadeia simples ou dupla ou uma sua mistura. 0 termo "componente(s)" de um patogénio ou "componente(s) conferindo protecção para um tal patogénio" nas vacinas da invenção pretende significar, um ou mais antigénios desse patogénio.
Os termos "em torno de" ou "aproximadamente" são, aqui, utilizados para significar ±10% do valor referido, mas devem estar em conformidade com o contexto de utilização.
DESCRIÇÃO DE FIGURAS
Figura 1. Evolução da Potência Relativa (RP) de DTPwSF-HB-IPV "Método de produção 3" com a dose de IPV.
A potência de IPV de dose reduzida das formulações "Método de produção 3" foi examinada in vivo, em comparação com formulação de referência (formulação Poliorix e DTPalPVHB). A RP de IPV foi medida a doses 100%, 50%, 25% e 12,5% da dose de IPV padrão (40/8/32 unidades antigénicas D para os tipos 1/2/3).
Figura 2. Evolução da Potência Relativa (RP) do diagrama de fluxo da formulação DTPwSF-HB-IPV. A potência de IPV de dose reduzida para ambas as formulações "Método de produção 3" e "Método de produção 4" foi examinada in vivo, em comparação com formulações de referência (formulação Poliorix e DTPalPVHB). A RP foi medida para "Método 7 de produção 3" e "Método de produção 4", a 25% da dose de IPV padrão (40/8/32 unidades antigénicas D para os tipos 1/2/3), em comparação com um placebo com 25% de IPV isoladamente.
Figura 3. Potência Relativa de IPV tipos 1, 2 e 3 no tempo 0 e 8 meses. A potência relativa de IPV foi medida [em relação a DTPaHBIPV (Pediarix) (Figura 3a) ou Poliorix (Figura 3b) ] para determinar se o componente Hib tem um efeito na potência de IPV e para avaliar a estabilidade de IPV ao longo do tempo a diferentes doses de IPV.
DESCRIÇÃO DETALHADA A presente divulgação refere-se a uma vacina (e. g., uma vacina de combinação) compreendendo antigénios de poliovírus (IPV) e, opcionalmente, Corynebacterium diphtheriae (D), Clostridium tetani (T), Bordetella pertussis (P) ou Hepatite B.
Os antigénios das vacinas divulgadas Componentes de vacina de IPV
ou IPV
As vacinas aqui divulgadas podem ser compreendidas de IPV tipo 1 ou IPV tipo 2 ou IPV tipo 3, ou IPV tipos 1 e 2, tipos 1 e 3, ou IPV tipos 2 e 3, ou IPV tipos 1, 2 e 3.
Os métodos de preparação de poliovírus inactivado (IPV) são bem conhecidos na técnica. Numa forma de realização, o IPV deve compreender os tipos 1, 2 e 3, como é comum na técnica de vacinas e pode ser a vacina pólio de Salk que é inactivada com formaldeido (ver, por exemplo, Sutter et al., 2000, Pediatr. Clin. North Am. 47:287; Zimmerman & Spann 1999, Am Fam Physician 59:113; Salk et al., 1954, Publicação Mensal Oficial da Associação de Saúde Pública Americana 44(5) :563; Hennesen, 1981, Develop. Biol. Standard 47:139; Budowsky, 1991, Adv. Vírus Res. 39:255) .
Numa forma de realização, o IPV não está adsorvido (e. g., antes da mistura com outros componentes, se presentes). Noutra forma de realização, o ou os componentes de IPV da invenção podem ser adsorvidos sobre um sal de alumínio, tal como hidróxido de alumínio (e. g., antes ou depois da mistura com outros componentes, se presentes). Noutra forma de realização, o ou os componentes de IPV da invenção podem ser adsorvidos sobre um sal de alumínio, tal como fosfato de alumínio. Numa forma de realização adicional, o ou os componentes de IPV podem ser adsorvidos sobre uma mistura de hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio. Se adsorvido, um ou mais componentes de IPV podem estar adsorvidos separadamente ou em conjunto como uma mistura. O IPV pode ser estabilizado por um processo de secagem particular, como descrito no documento W02004/039417. O poliovírus pode ser cultivado em cultura celular. A cultura celular pode ser uma linha celular VERO ou PMKC, que é uma linha celular contínua derivada de rim de macaco. As células VERO podem ser cultivadas, de modo conveniente, em microtransportadores. A cultura das células VERO, antes e durante infecção virai, pode envolver a utilização de material 9 derivado de bovinos, tal como soro de vitelo e este material deve ser obtido de fontes que estejam isentas de encefalite espongiforme bovina (BSE) . A cultura também pode envolver materiais, tal como hidrolisado de lactalbumina. Após cultivo, os viriões podem ser purificados utilizando técnicas, tais como ultrafiltração, diafiltração e cromatografia. Antes da administração a doentes, os virus devem ser inactivados e isto pode ser realizado por tratamento com formaldeido.
Os virus podem ser cultivados, purificados e inactivados individualmente e, depois, combinados para dar uma mistura em bruto concentrada, para utilização de vacina de IPV ou para adição ao antigénio de difteria e tétano e componentes de tosse convulsa adsorvidos para vacinas compreendendo DTPw-IPV ou DTPa-IPV.
Os antigénios em vacinas aqui divulgadas estarão presentes em "quantidades imunologicamente eficazes", i. e., a administração dessa quantidade a um indivíduo, numa dose única ou como parte de uma série, é eficaz para tratamento ou prevenção de doença. 0 tratamento de dosagem pode ser um programa de dose única ou um programa dose múltipla (e. g., incluindo doses de reforço).
As doses padrão de vacinas de pólio tendem, hoje, a conter 40 unidades antigénicas D de poliovírus inactivado tipo 1, 8 unidades antigénicas D de poliovírus inactivado tipo 2 e 32 unidades antigénicas D de poliovírus inactivado tipo 3 (e. g., Infanrix-IPV™).
Contudo, a presente requerente verificou, surpreendentemente, que podem ser utilizadas doses reduzidas de 10 IPV para se obter uma boa resposta imunitária. Numa forma de realização da divulgação, uma dose de vacina de IPV pode compreender entre 10 e 36 unidades antigénicas D de IPV tipo 1 (e. g. , 11-32, 12-28, 13-24, 14-20 ou 15-19 unidades antigénicas D) . Noutra forma de realização, uma dose de vacina de IPV pode compreender IPV tipo 1 a uma dose superior de 10-20 unidades antigénicas D ou uma dose superior a 10 unidades antigénicas D e inferior a 20 unidades antigénicas D. Noutra forma de realização, uma dose de vacina pode compreender 26-49%, 30-45%, 33-40%, 35-37% ou, aproximadamente ou exactamente, um terço de uma dose padrão de 40 unidades antigénicas D de IPV tipo 1 (equivalente a, aproximadamente, 10,4-19,6, 12-18, 13,2-16, 14-14,8 ou 13,3 unidades antigénicas D). Noutra forma de realização, uma dose de vacina de IPV dose pode compreender 11-32 unidades antigénicas D, 12-28 unidades antigénicas D, 13-24 unidades antigénicas D ou 14-20 unidades antigénicas D de IPV tipo 1.
Alternativamente, uma dose de vacina de IPV pode compreender 10-19,5 unidades antigénicas D, 12-19 unidades antigénicas D, 14-18,5 unidades antigénicas D ou 15-17 unidades antigénicas D; por exemplo, em torno de ou exactamente 16 unidades antigénicas D de IPV tipo 1.
Numa forma de realização adicional, as vacinas aqui divulgadas podem compreender menos de 4 unidades antigénicas D, 2-4 unidades antigénicas D (equivalente a 25-50% de uma dose padrão de 8 unidades antigénicas D) ou em torno de ou exactamente 3 unidades antigénicas D de IPV tipo 2 (equivalente a 37,5% de uma dose padrão de 8 unidades antigénicas D) . 11
Noutra forma de realização, a vacina divulgada pode compreender, aproximadamente ou exactamente, um terço de uma dose padrão de 8 unidades antigénicas D de IPV tipo 2 (equivalente a, aproximadamente, 2,7 unidades antigénicas D).
Numa forma de realização adicional, as vacinas aqui divulgadas podem compreender 2-7 unidades antigénicas D de IPV tipo 2. Noutra forma de realização, uma dose de vacina de IPV pode compreender 3-6 unidades antigénicas D ou 4-5 unidades antigénicas D de IPV tipo 2.
Alternativamente, uma dose de vacina de IPV pode compreender 2-4,5 unidades antigénicas D, 2,5-4 unidades antigénicas D ou 3-3,5 unidades antigénicas D de IPV tipo 2.
Numa forma de realização adicional, as vacinas aqui divulgadas podem compreender 8-20 unidades antigénicas D, mais de 8 e menos de 2 0 unidades antigénicas D, 9-19 unidades antigénicas D, 10-18 unidades antigénicas D, 11-17 unidades antigénicas D, 12-16 unidades antigénicas D ou 13-15 unidades antigénicas D; por exemplo, em torno de ou exactamente 14 unidades antigénicas D de IPV tipo 3 (equivalente a 25-62,5%, 28,125-59,375%, 31,25-46,875% ou 43,75% de uma dose padrão de 32 unidades antigénicas D) .
Noutra forma de realização, a vacina divulgada pode compreender, aproximadamente ou exactamente, um terço de uma dose padrão de 32 unidades antigénicas D de IPV tipo 3 (equivalente a, aproximadamente, 10,7 unidades antigénicas D).
Numa forma de realização adicional, uma dose de vacina de IPV pode compreender 8-29 unidades antigénicas D, 9-26 unidades 12 antigénicas D, 10-23 unidades antigénicas D, 11-20 unidades antigénicas D, 12-17 unidades antigénicas D ou 13-14 unidades antigénicas D de IPV tipo 3.
Alternativamente, uma dose de vacina de IPV pode compreender 8-19,5 unidades antigénicas D, 9-19 unidades antigénicas D, 10-18,5 unidades antigénicas D, 11-18 unidades antigénicas D, 12-17,5 unidades antigénicas D, 13-17 unidades antigénicas D ou 14-16 unidades antigénicas D; por exemplo, em torno de ou exactamente 15 unidades antigénicas D.
Componentes de vacina de DTP
As vacinas de DTP são vacinas bem conhecidas para prevenir ou tratar difteria, tétano e doença de B. pertussis. As vacinas aqui divulgadas podem compreender componente(s) de difteria, tétano e/ou tosse convulsa. O antigénio da difteria é tipicamente um toxóide diftérico. A preparação de toxóides diftéricos (DT) está bem documentada. Pode ser utilizado qualquer toxóide diftérico adequado. Por exemplo, o DT pode ser produzido por purificação da toxina de uma cultura de Corynebacterium diphtherial, seguida de desintoxicação química mas é, alternativamente, preparado por purificação de um análogo recombinante ou geneticamente desintoxicado da toxina (por exemplo, CRM197 ou outros mutantes, como descritos nos documentos US 4709017, US 5843711, US 5601827 e US 5917017). Numa forma de realização, o DT está presente numa quantidade de 5-50, 7-30 Lf ou, aproximadamente ou exactamente, 7,5 Lf ou 25 Lf por dose de 0,5 mL. Numa forma de realização adicional, o DT está presente numa dose baixa, inferior a 5 Lf 13 ou 1-4 Lf ou, aproximadamente ou exactamente, 2 Lf por dose de 0,5 mL. Numa forma de realização, o toxóide diftérico da invenção pode ser adsorvido sobre um sal de alumínio, tal como hidróxido de alumínio. Noutra forma de realização, o toxóide diftérico da invenção pode ser adsorvido sobre um sal de alumínio, tal como fosfato de alumínio. Numa forma de realização adicional, o toxóide diftérico pode ser adsorvido sobre uma mistura de hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio. O antigénio do tétano da invenção é tipicamente um toxóide tetânico. Os métodos de preparação de toxóides tetânicos (TT) são bem conhecidos na técnica. Numa forma de realização, o TT é produzido por purificação da toxina a partir de uma cultura de Clostridium tetani, seguida de desintoxicação química mas é, alternativamente, preparado por purificação de um análogo recombinante ou geneticamente desintoxicado da toxina (por exemplo, como descrito no documento EP 209281). Pode ser utilizado qualquer toxóide tetânico adequado. 'Toxóide tetânico' pode abranger fragmentos imunogénicos da proteína de tamanho completo (por exemplo, Fragmento C - ver o documento EP 478602). Numa forma de realização, o TT está presente numa quantidade de 2,5-30 Lf, 3-20 Lf, 5-15 Lf ou, exactamente ou aproximadamente, 10 Lf por dose de 0,5 mL. Numa forma de realização, o toxóide tetânico da invenção pode ser adsorvido sobre um sal de alumínio, tal como hidróxido de alumínio. Noutra forma de realização, o toxóide tetânico da invenção pode ser adsorvido sobre um sal de alumínio, tal como fosfato de alumínio. Numa forma de realização adicional, o toxóide tetânico pode ser adsorvido sobre uma mistura de hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio. 14 0 componente de tosse convulsa pode ser acelular (Pa), onde são utilizados antigénios de tosse convulsa purificados, ou de célula intacta (Pw), onde é utilizada célula intacta morta de tosse convulsa como o componente de tosse convulsa. 0 Pw pode ser inactivado por vários métodos conhecidos, incluindo métodos isentos de mercúrio. Tais métodos podem incluir inactivação por calor (e. g., 55-65 °C ou 56-60 °C, durante 5-60 minutos ou durante 10-30 minutos, e. g., 60 °C durante 30 minutos), formaldeido (e. g., 0,1% a 37°, 24 horas), glutaraldeido (e. g., 0,05%, à temperatura ambiente, 10 minutos), acetona-I (e. g., três tratamentos, à temperatura ambiente) ou acetona-II (e. g., três tratamentos, à temperatura ambiente e quarto tratamento, a 37 °C) (ver, por exemplo, Gupta et al. , 1987, J. Biol. Stand. 15:87; Gupta et al., 1986, Vaccine, 4 :185) . Os métodos de preparação de célula intacta morta de Bordetella pertussis (Pw) adequados para utilização nas vacinas divulgadas, são divulgados no documento WO 93/24148, como são métodos de formulação adequados para produzir vacinas de DT-TT-Pw-HepB. O tiomersal foi utilizado no passado, na preparação de Bordetella pertussis de célula intacta morta (ver abaixo). Contudo, numa forma de realização não é utilizado no processo de formulação das vacinas aqui divulgadas. É tipicamente utilizada uma dose de Pw de 5-50 IOU, 7-40 IOU, 9-35 IOU, 11-30 IOU, 13-25 IOU, 15-21 IOU ou em torno de ou exactamente 20 IOU.
Vacinas de Pa acelular também são bem conhecidas e podem compreender 2 ou mais antigénios de: toxóide de tosse convulsa (PT), hemaglutinina filamentosa (FHA), pertactina (PRN), aglutinogénios 2 & 3. Numa forma de realização, a vacina de Pa compreende PT, FHA e PRN. Os kits ou vacinas aqui divulgados 15 podem compreender PT desintoxicado por um método bem conhecido de tratamento de formaldeído ou por meio de mutações (derivado de PT) . Verificou-se que as substituições de resíduos dentro da subunidade SI da proteína resultam numa proteína que retém as suas propriedades imunológicas e protectoras do PT, mas com toxicidade reduzida ou sem toxicidade (documento EP 322533). As mutações desintoxicantes discutidas nas reivindicações do documento EP322533 são exemplos dos mutantes desintoxicados de DT adequados da presente divulgação. Tais mutantes podem ser utilizados a doses inferiores a 20-25 pg.
Numa forma de realização, o PT é utilizado a uma quantidade de 2-50 pg, 5-40 pg, 10-30 pg ou, exactamente ou aproximadamente, 25 pg por dose de 0,5 mL. Noutra forma de realização, o PT é utilizado a uma quantidade de, exactamente ou aproximadamente, 2,5 ou 8 pg por dose de 0,5 mL.
Numa forma de realizaçao, a FHA é utilizada a uma quantidade de 2- 50 pg, 5-40 pg, 10- -30 pg ou, exactamente ou aproximadamente, 25 pg por dose de 0,5 mL . Noutra forma de realização, a FHA é utilizada a uma quantidade de, exactamente ou aproximadamente, 2,5 ou 8 pg por dose de 0,5 mL.
Numa forma de realização, a PRN é utilizada a uma quantidade de 0,5-20 pg, 0,8-15 pg, 2-10 pg ou, exactamente ou aproximadamente, 8 pg por dose de 0,5 mL. Noutra forma de realização, a PRN é utilizada a uma quantidade de, exactamente ou em torno de, 0,8 ou 2,5 pg por 0,5 mL.
Numa forma de realização, o componente de tosse convulsa pode ser adsorvido sobre um sal de alumínio, tal como hidróxido de alumínio. Noutra forma de realização, o componente de tosse 16 convulsa pode ser adsorvido sobre um sal de alumínio, tal como fosfato de alumínio. Numa forma de realização adicional, o componente de tosse convulsa pode ser adsorvido sobre uma mistura de hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio. Por exemplo, numa forma de realização, pelo menos, PRN é adsorvida sobre hidróxido de alumínio, com PT/FHA adsorvido sobre hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio ou uma mistura de ambos.
Antigénios adicionais
As formulações de vacina aqui divulgadas, opcionalmente também compreendendo DTP (DTPw ou DTPa), podem adicionalmente compreender um ou mais antigénios seleccionados do grupo consistindo de: antigénio de superfície de Hepatite B, antigénio(s) de Haemophilus influenzae b, antigénio (s) de
Neisseria meningitidis A, antigénio(s) de Neisseria meningitidis C, antigénio(s) de Neisseria meningitidis W-135, antigénio(s) de Neisseria meningitidis Y, bleb ou antigénio(s) purificado de Neisseria meningitidis B, antigénio(s) de Hepatite A, antigénio(s) de Salmonella typhi e RTS,S. Tipicamente, podem ser utilizados o sacárido capsular ou antigénios LOS destes patogénios. Os antigénios estarão, tipicamente, presentes numa concentração de, pelo menos, 1 pg/mL cada, por exemplo, 1-20 pg/mL, 2-15 pg/mL, 2,5-10 pg/mL, 3-8 pg/mL ou 4-6 pg/mL. Em geral, a concentração de qualquer antigénio será suficiente para induzir uma resposta imunitária contra esse antigénio.
Prefere-se que a eficácia protectora de antigénios individuais não seja removida através da sua combinação, embora a imunogenicidade real (e. g., títulos ELISA) possa ser reduzida. 17 0 ou os antigénios adicionais podem, numa forma de realização, ser adsorvidos sobre um sal de alumínio, tal como hidróxido de alumínio. Noutra forma de realização, os antigénios adicionais da invenção podem ser adsorvidos sobre um sal de alumínio, tal como fosfato de alumínio. Numa forma de realização adicional, os antigénios adicionais podem ser adsorvidos sobre uma mistura de hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio ou podem ser não adsorvidos.
Nos casos em que é utilizado um sacárido capsular ou antigénio LOS, este pode ser conjugado a uma proteína transportadora compreendendo epitopos T auxiliares, de modo a melhorar a imunogenicidade. A invenção também pode compreender "proteínas transportadoras" livres.
Como uma alternativa à utilização de antigénios proteicos nas composições divulgadas, pode ser utilizado ácido nucleico codificando o antigénio. Os componentes proteicos das composições da invenção podem, deste modo, ser substituídos por ácido nucleico (por exemplo ADN, que pode ser na forma de um plasmídeo) que codifica a proteína. De modo semelhante, as composições aqui divulgadas podem compreender proteínas que mimetizam antigénios sacarídicos, e. g., mimotopos ou anticorpos anti-idiótipo. Estes podem substituir componentes sacarídicos individuais ou podem suplementá-los.
Antigénio de hepatite B A preparação do antigénio de superfície de hepatite B (HBsAg) está bem documentada. Ver, por exemplo, Hartford et al., 1983, Develop. Biol. Standard 54:125, Gregg et ai., 1987, 18
Biotechnology 5:479, documentos EP0226846, EP0299108. Pode ser preparado como se segue. Um método envolve a purificação do antigénio na forma particulada, a partir do plasma de portadores crónicos de hepatite B, uma vez que grandes quantidades de HBsAg são sintetizadas no fígado e libertadas na corrente sanguínea durante uma infecção de HBV. Outro método envolve a expressão da proteína por métodos de ADN recombinante. 0 HBsAg pode ser preparado por expressão na levedura Saccharomyces cerevísíae, pichia, células de insecto (e. g., Hi5) ou células de mamífero. 0 HBsAg pode ser inserido dentro de um plasmídeo e a sua expressão a partir do plasmídeo pode ser controlada por um promotor, tal como o promotor "GAPDH" (do gene da gliceraIdeido- 3-fosfato desidrogenase). A levedura pode ser cultivada num meio sintético. 0 HBsAg pode ser, depois, purificado por um processo envolvendo etapas, tais como precipitação, cromatografia de permuta iónica e ultrafiltração. Após purificação, o HBsAg pode ser submetido a diálise (e. g., com cisteína) . 0 HBsAg pode ser utilizado numa forma particulada.
Como aqui utilizada, a expressão "antigénio de superfície de Hepatite B" ou "HBsAg", inclui qualquer antigénio HBsAg ou seu fragmento exibindo a antigenicidade do antigénio de superfície de HBV. Será compreendido que, adicionalmente à sequência de 226 aminoácidos do antigénio HBsAg S (ver Tiollais et al., 1985, Nature 317:489 e suas referências), o HBsAg como aqui descrito pode, se desejado, conter a totalidade ou parte de uma sequência pre-S, como descrita nas referências acima e no documento EP0278940. Em particular, o HBsAg pode compreender um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos compreendendo os resíduos 133-145, seguidos dos resíduos 175-400 da proteína L de HBsAg, em relação à grelha de leitura aberta, 19 num vírus de Hepatite B de serotipo ad (este polipéptido é referido como L*; ver o documento EP0414374) . 0 HBsAg no âmbito da invenção também pode incluir o polipéptido preSl-preS2 -S, descrito no documento EP0198474 (Endotronics) ou seus análogos, tais como os descritos no documento EP0304578 (McCormick e Jones) , o HBsAg, como aqui descrito, também pode referir-se a mutantes, por exemplo o "mutante de escape", descrito no documento WO91/14703 ou EP0511855A1, especialmente HBsAg, em que a substituição de aminoácido na posição 145 é de glicina em arginina. 0 HBsAg pode estar numa forma particulada. As partículas podem compreender, por exemplo, apenas proteína S ou podem ser partículas compostas, por exemplo L*, S), onde L* é como acima definido e S denota a proteína S de HBsAg. A referida partícula está, de um modo vantajoso, na forma na qual é expressa na levedura.
Numa forma de realização, o HBsAg é o antigénio utilizado em EngerixB™ (GlaxoSmithKline Biologicals S.A.) que é, adicionalmente, descrito no documento W093/24148.
Numa forma de realização, o HBsAg está presente numa quantidade de 5-20 pg, 8-15 pg ou, aproximadamente ou exactamente, 10 pg por dose de 0,5 mL. O antigénio de superfície de Hepatite B pode ser adsorvido sobre fosfato de alumínio, que pode ser feito antes da mistura com os outros componentes (descritos no documento W093/24148) . O componente de Hepatite B deve estar substancialmente isento de tiomersal (o método de preparação de HBsAg sem tiomersal foi anteriormente publicado no documento EP1307473). 20
Antigénio(s) de Haemophilus influenzae b
As vacinas compreendendo antigénios de Haemophilus influenzae tipo B foram descritas no documento WO97/00697. As vacinas aqui divulgadas podem utilizar qualquer antigénio de Haemophilus influenzae tipo B adequado. 0 antigénio pode ser sacárido capsular (PRP) de Haemophilus influenzae tipo B conjugado a uma proteína transportadora (Hib). 0 sacárido é um polímero de ribose, ribitol e fosfato. 0 antigénio Hib pode, opcionalmente, ser adsorvido sobre fosfato de alumínio, como descrito no documento W097/00697 ou pode ser não adsorvido, como descrito no documento W002/00249 ou pode não ter sido submetido a um processo específico de adsorção.
Por um antigénio sendo "não adsorvido sobre um sal adjuvante de alumínio" pretende-se, aqui, significar, por exemplo, que uma etapa de adsorção, expressa ou dedicada, para o antigénio sobre sal adjuvante de alumínio de fresco não está envolvida no processo de formulação da composição. 0 Hib pode ser conjugado a qualquer transportador que possa proporcionar, pelo menos, um epitopo auxiliar T (cujos exemplos são descritos abaixo) e pode ser toxóide tetânico, toxóide diftérico, CRM-197 (mutante de toxina diftérica) ou Proteína D. 0 Hib pode ser liofilizado e pode ser reconstituído extemporaneamente (e. g., com diluente, opcionalmente compreendendo outros componentes antigénicos das vacinas da invenção). 21
Numa forma de realização, o Hib está presente numa quantidade de 5-20 pg, 8-15 pg ou, aproximadamente ou exactamente, 10 pg de sacárido por dose de 0,5 mL.
Numa forma de realização adicional, o Hib está presente numa dose baixa (e. g., 1-6 pg, 2-4 pg ou em torno de ou exactamente 2,5 pg de sacárido), como descrito no documento W002/00249 .
Antigénios de Neisseria meningitidis tipos A, C, W ou Y
As vacinas aqui divulgadas podem, adicionalmente, compreender um sacárido capsular de uma bactéria seleccionada do grupo consistindo de N. meningitidis tipo A (MenA, opcionalmente conjugado a uma proteína transportadora) , N. meningitidis tipo C (MenC, opcionalmente conjugado a uma proteína transportadora) , N. meningitidis tipo W-135 (MenW, opcionalmente conjugado a uma proteína transportadora) e N. meningitidis tipo Y (MenY, opcionalmente conjugado a uma proteína transportadora).
As vacinas podem compreender um ou mais antigénios das diferentes estirpes de N meningitidis, que podem ser utilizados isoladamente ou em qualquer combinação de dois, três ou quatro componentes, como detalhado abaixo:
MenA, MenC, MenW, MenY ou MenA + MenC, MenA + MenW, MenA + MenY r MenC + MenW, MenC + MenY, MenW + MenY ou MenA + MenC + MenW, MenA + MenC + MenY, MenA + MenW + MenY, MenC + MenW + MenY ou MenA + MenC + MenW + MenY. 22
Numa forma de realização, o ou os componentes de Neisseria meningitidis podem ser adsorvidos sobre um sal de alumínio, tal como hidróxido de alumínio. Noutra forma de realização, o ou os componentes de Neisseria meningitidis podem ser adsorvidos sobre um sal de alumínio, tal como fosfato de alumínio. Numa forma de realização adicional, o ou os componentes de Neisseria meningitidis podem ser adsorvidos sobre uma mistura de hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio. Numa forma de realização, o ou os componentes de Neisseria meningitidis podem ser não adsorvidos sobre um adjuvante, e. g., um sal adjuvante de alumínio.
Bleb ou antigénio(s) de Neisseria meningitidis tipo B
As vacinas divulgadas também podem compreender um componente MenB, tal como uma vesícula ou bleb de membrana externa, como descrito nos documentos W001/09350, W003/105890, W004/014417 ou W004/014418 ou um antigénio de sacárido capsular MenB conjugado (ou seu derivado) (e. g., ver o documento WO 96/40239) ou um LOS meningocócico L2 ou L3 ou L2 e L3 livre ou conjugado (conforme o documento WO 2004/014417) . Numa forma de realização, o ou os componentes MenB podem ser adsorvidos sobre um sal de alumínio, tal como hidróxido de alumínio. Noutra forma de realização, o ou os componentes MenB podem ser adsorvidos sobre um sal de alumínio, tal como fosfato de alumínio. Numa forma de realização adicional, o ou os componentes MenB podem ser adsorvidos sobre uma mistura de hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio. Numa forma de realização, o ou os componentes MenB pode ser não adsorvido sobre um adjuvante, e. g., um sal adjuvante de alumínio. 23
Antigénio(s) de Salmonella typhi
As vacinas aqui divulgadas podem, adicionalmente, compreender o sacárido Vi de Salmonella typhi, que pode ser o produto registado Typherix®, descrito no documento EP1107787, ou uma sua conjugação, (e. g., com uma proteína transportadora como aqui descrita). 0 processo de conjugação pode ser efectuado como descrito no documento WO 2007/000343. Numa forma de realização, o ou os sacáridos Vi podem ser adsorvidos sobre um sal de alumínio, tal como hidróxido de alumínio. Noutra forma de realização, o ou os sacáridos Vi podem ser adsorvidos sobre um sal de alumínio, tal como fosfato de alumínio. Numa forma de realização adicional, o ou os sacárido Vi podem ser adsorvidos sobre uma mistura de hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio. Numa forma de realização, o ou os sacáridos Vi podem ser não adsorvidos sobre um adjuvante, e. g., um sal adjuvante de alumínio.
Antigénio(s) de Hepatite A O componente conferindo protecção contra a Hepatite A pode ser uma vacina de Hepatite A atenuada morta, por exemplo o produto conhecido como Havrix™ (Marca Registada da
GlaxoSmithKline Biologicals S.A.) que é uma vacina atenuada morta derivada da estirpe HM-175 do vírus da Hepatite A (HAV) (ver "Vacinas Candidatas Inactivadas para Hepatite A" por F.E. Andre et al., 1980, Prog. Med. Virol. 37:72 e a monografia de produto "Havrix", publicada por SmithKline Beecham Biologicals 1991) . Flehmig et al. (1990, Prog. Med Virol. 37:56) reviram os aspectos clínicos, virologia, imunologia e epidemiologia da
Hepatite A e discutiram abordagens para o desenvolvimento de vacinas contra esta infecção virai comum. Como aqui utilizada, a expressão "antigénio de HAV" refere-se a qualquer antigénio capaz de estimular anticorpo neutralizante para HAV em humanos. Numa forma de realização, o antigénio de HAV compreende partículas de vírus atenuado inactivado ou, noutra forma de realização, pode ser uma cápside de HAV ou proteína virai de HAV, que podem ser convenientemente obtidas por tecnologia de ADN recombinante. Numa forma de realização, o componente de Hepatite A pode ser adsorvido sobre um sal de alumínio, tal como hidróxido de alumínio. Noutra forma de realização, o componente de Hepatite A pode ser adsorvido sobre um sal de alumínio, tal como fosfato de alumínio. Numa forma de realização adicional, o componente de Hepatite A pode ser adsorvido sobre uma mistura de hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio.
Antigénio(s) malárico(s)
As vacinas podem, adicionalmente, compreender antigénio(s) Maláric(o). 0 antigénio malárico pode ser RTS,S (proteína híbrida entre CS e HBsAg — descrita nos documentos US 6306625 e EP 0614465). Numa forma de realização, o RTS,S pode ser utilizado nas vacinas em vez de HBsAg. Outros antigénios maláricos também podem ser utilizados nas vacinas, incluindo proteína CS, RTS, TRAP, proteína de 16 kD de B 2992, AMA-1, MSP1, opcionalmente incluindo CpG (documentos W02006/029887, WO98/05355, WO01/00231).
Numa forma de realização, o ou os antigénios Maláricos podem ser adsorvidos sobre um sal de alumínio, tal como hidróxido de alumínio. Noutra forma de realização, o ou os 25 antigénios Maláricos podem ser adsorvidos sobre um sal de alumínio, tal como fosfato de alumínio. Numa forma de realização adicional, o ou os antigénios Maláricos podem ser adsorvidos sobre uma mistura de hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio. Numa forma de realização, o antigénio Malárico é com adjuvante com uma emulsão de óleo-em-água e/ou derivado de lípido A (tal como MPL) e ou esterol (tal como colesterol) e/ou tocol (tal como α-tocoferol). Noutra forma de realização, o ou os antigénios Maláricos podem ser não adsorvidos sobre um adjuvante, e. g., um sal adjuvante de alumínio.
Conjugados
Os conjugados sacáridos capsulares bacterianos podem compreender gualquer péptido, polipéptido ou proteína transportadora compreendendo, pelo menos, um epitopo auxiliar T. A ou as proteínas transportadoras utilizadas podem ser seleccionadas do grupo consistindo de: toxóide tetânico, toxóide diftérico, CRM197, toxina diftérica recombinante (como descrito em qualquer dos documentos US4709017, WO93/25210, W095/33481 ou WOOO/48638), pneumolisina (opcionalmente, quimicamente destoxifiçada ou um mutante desintoxicado) de S. pneumoniae (ver, e. g., o documento W02004/081515 e referências nele referidas), OMPC de N. meningitidis (documento EP0372501) e proteína D (PD) de H. influenzae (documento EP594610). Outros transportadores podem incluir péptidos sintéticos (documentos EP0378881; EP0427347), proteínas de choque térmico (documentos W093/17712; W094/03208), proteínas de tosse convulsa (documentos W098/58668; EP0471177), citocinas (documento WO91/01146), linfocinas (documento WO91/01146), hormonas (documento WO91/01146), factores de crescimento (documento WO91/01146), 26 proteínas artificiais compreendendo múltiplos epitopos de célula T CD4+ humana de diversos antigénios derivados de patogénios (Falugi et al. , 2001, Eur. J. Immunol. 31:3816), proteína de superfície pneumocócica PspA (documento WO02/091998), proteínas de absorção de ferro (documento WOOl/72337), toxina A ou B de C. difficile (documento WOOO/61761), PhtD pneumocócica (documento WO00/37105), PhtDE pneumocócica (e. g., documentos WOOl/98334 & W003/054007), PhtX, etc.
Os sacáridos podem estar todos no mesmo transportador, particularmente todos os sacáridos de um particular organismo, por exemplo, os sacáridos MenA, MenC, MenW e MenY podem ser todos conjugados a TT, DT ou CRM-197. Contudo, devido ao conhecido efeito de supressão de transportador, pode ser vantajoso se em cada das composições, os antigénios sacaridicos nelas contidos ('n' antigénios) forem conjugados a mais de um transportador. Deste modo, (n-1) dos sacáridos poderiam ser transportados (separadamente) num tipo de transportador e 1 num transportador diferente, ou (n-2) em um e 2 em dois transportadores diferentes, etc. Por exemplo, numa vacina contendo 4 conjugados sacaridicos bacterianos, 1, 2 ou todos os quatro poderiam ser conjugados a transportadores diferentes). A Proteína D, contudo, pode ser utilizada para diversos (2, 3, 4 ou mais) sacáridos numa composição sem um marcado efeito de supressão de transportador. O Hib pode estar presente como um conjugado de TT, DT ou CRM197, e MenA, MenC, MenY e MenW podem ser conjugados de TT, DT, CRM197 ou PD. O Vi pode estar presente como um conjugado de TT, DT ou CRM197. A Proteína D é um transportador útil, uma vez que proporciona um antigénio adicional que pode proporcionar protecção contra H. influenzae. Numa forma de realização, todos os sacáridos são conjugados à mesma proteína transportadora. 27 0 Vi pode ser conjugado a uma proteína transportadora, por exemplo, por um método que utiliza química de condensação de carbodiimida (e. g., EDAC) (dado que a subunidade de repetição de Vi compreende grupos de ácido carboxílico). Este poderia ser alcançado por (i) uma única reacção de carbodiimida entre COOH de Vi e NH2 de proteína ou (i i) uma dupla reacção de carbodiimida que pode ocorrer entre COOH de Vi e NH2 de uma molécula ligante homobifuncional e COOH de proteína e NH2 da molécula ligante homobifuncional, ou entre COOH de Vi e NH2 da molécula ligante heterobifuncional e NH2 de proteína e COOH da molécula ligante heterobifuncional. A conjugação pode ser utilizada em conjunto com proteína(s) transportadora (s) livre(s). Numa forma de realização, quando uma determinada proteína transportadora está presente na forma livre e conjugada numa composição aqui divulgadas, a forma não conjugada não é mais de 5% da quantidade total da proteína transportadora na composição como um todo ou, noutra forma de realização, está presente em menos de 2%, em peso. 0 sacárido pode ser ligado à proteína transportadora por qualquer método conhecido (por exemplo, por Likhite, Patente U.S. 4372945 e por Armor et al. , Patente U.S. 4474757), com qualquer ligante adequado onde necessário. 0 sacárido será, tipicamente, activado ou funcionalizado antes da conjugação. A activação pode envolver, por exemplo, agentes de cianização, tal como CDAP (tetrafluoroborato de 1-ciano-dimetilaminopiridínio) (documentos WO95/08348 & WO96/29094). A reacção de cianização pode ser realizada sob condições relativamente moderadas que evitem hidrólise dos 28 sacáridos sensíveis alcalinos. Esta síntese permite ligação directa a uma proteína transportadora. Outras técnicas adequadas utilizam carbodiimidas, hidrazidas, ésteres activos, norborano, ácido p-nitrobenzóico, N-hidroxissuccinimida, S-NHS, EDC ou TSTU.
As ligações por meio de um grupo ligante podem ser realizadas utilizando qualquer processo conhecido, por exemplo, os processos descritos nos documentos US 4882317 e US 4695624. Um tipo de ligação envolve aminação redutora do sacárido, ligando o grupo amino resultante com uma extremidade de um grupo ligante de ácido adípico (documentos EP 0477508, Porro et al., 1985, Mol. Immunol. 22:907, EP0208375) e, depois, ligando uma proteína à outra extremidade do grupo ligante de ácido adípico. Outros ligantes incluem B-propionamido (documento WO 00/10599), nitrofenil-etilamina (Gever et al., 1979, Med. Microbiol. Immunol. 165:171), halogenetos de haloacilo (documento US 4057685), ligações glicosídicas (documentos US 4673574; US 4761283; US4808700), ácido 6-aminocapróico (documento US 4459286), ADH (documento US 4965338), unidades C4 a C12 (documento US 4663160), etc. Como uma alternativa à utilização de um ligante, pode ser utilizada a ligação directa. As ligações directas à proteína podem compreender oxidação do sacárido, seguida de aminação redutora com a proteína, como descrito, por exemplo, nos documentos US 4761283 e US 4356170 ou uma reacção de CDAP directa.
Após conjugação, sacáridos livres e conjugados podem ser separados. Existem muitos métodos adequados para esta separação, incluindo cromatografia hidrófoba, ultrafiltração tangencial, diaf iltração, etc. (ver também Lei et al., 2000, Dev Biol. (Basel). 103:259; documentos WO 00/38711; US 6146902). Numa 29 forma de realização, se uma vacina compreender um determinado sacárido nas formas livre e conjugada, a forma não conjugada não é superior a 20% em peso, da quantidade total desse sacárido na composição como um todo (e. g., ^15%, ^10%, ^5%, ^2%, ^1%).
Uma quantidade de sacárido que é capaz de conferir protecção a um hospedeiro (uma quantidade eficaz) pode ser determinada pelo especialista. Numa forma de realização, cada dose compreenderá 0,1-100 pg de sacárido, noutra forma de realização cada dose compreenderá 0,1-50 pg, numa forma de realização adicional cada dose compreenderá 0,1-10 pg, ainda noutra forma de realização cada dose compreenderá 1 a 5 pg.
Adjuvantes
As vacinas divulgadas podem incluir um excipiente farmaceuticamente aceitável, tal como um adjuvante adequado. Adjuvantes adequados incluem um sal de alumínio, tais como hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio, mas também pode ser um sal de cálcio, ferro ou zinco, ou pode ser uma suspensão insolúvel de tirosina acilada, ou açúcares acilados, ou podem ser sacáridos derivatizados cationica ou anionicamente, polifosfazenos, microsferas biodegradáveis, monofosforil-lípido A (MPL), derivados de lípido A (e. g., de toxicidade reduzida), MPL 3-O-desacilado, quil A, Saponina, QS21, tocol (documento EP 0382271), Adjuvante Incompleto de Freund (Difco Laboratories, Detroit, MI), Adjuvante 65 Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ) , AS-2 (Smith-Kline Beecham, Filadélfia, PA), oligonucleótidos CpG, bioadesivos e mucoadesivos, micropartículas, lipossomas, formulações de éter de polioxietileno, formulações de éster de polioxietileno, péptidos 30 de muramilo ou compostos de imidazoquinolona (e. g., imiquamod e seus homólogos). Imunomoduladores humanos adequados para utilização como adjuvantes na invenção incluem citocinas, tais como interleucinas (e. g. , IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.) , factor estimulador de colónias de macrófagos (M-CSF), factor de necrose tumoral (TNF), factor estimulador de colónias de macrófagos granulociticos (GM-CSF) também podem ser utilizados como adjuvantes.
Numa forma de realização, a composição de adjuvante das formulações induz uma resposta imunitária predominantemente do tipo TH1. Níveis elevados de citocinas de tipo TH1 (e. g., IFN-γ, TNFoí, IL-2 e IL-12) tendem a favorecer a indução de respostas imunitárias mediadas por células a um antigénio administrado. Numa forma de realização, na qual uma resposta é predominantemente de tipo TH1, as citocinas do tipo TH1 aumentarão em maior escala do que o nível de citocinas de tipo TH2. Os níveis destas citocinas podem ser facilmente avaliados utilizando ensaios padrão. Para uma revisão das famílias de citocinas, ver Mosmann e Coffman, 1989, Ann. Rev. Immunol. 7:145.
Consequentemente, sistemas adjuvantes adequados que promovem uma resposta predominantemente TH1 incluem derivados de lípido A (e. g., de toxicidade reduzida), Monofosforil-lípido A (MPL) ou um seu derivado, particularmente monofosforil-lípido A 3-des-0-acilado (3D-MPL) e uma combinação de monofosforil-lípido A, opcionalmente monofosforil-lípido A 3-des-0-acilado, juntamente com um sal de alumínio. Um sistema melhorado envolve a combinação de um monofosforil-lípido A e um derivado de saponina, particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL, como divulgado no documento W094/00153 ou uma composição 31 menos reactogénica, onde o QS21 é atenuado com colesterol, como divulgado no documento W096/33739. Uma formulação adjuvante particularmente potente envolvendo QS21, 3D-MPL e tocoferol, numa emulsão de óleo em água, é descrita no documento WO95/17210. A vacina pode, adicionalmente, compreender uma saponina que pode ser QS21. A formulação também pode compreender uma emulsão de óleo em água e tocoferol (documento WO95/17210). Oligonucleótidos contendo CpG não metilado (documento WO96/02555) também são indutores preferenciais de uma resposta TH1 e são adequados para utilização nas vacinas divulgadas.
As vacinas aqui divulgadas também podem compreender combinações de aspectos de um ou mais dos adjuvantes da invenção identificados acima.
Qualquer adjuvante da invenção pode ser adsorvido ou combinado com o componente de IPV aqui divulgado.
Quando se faz referência a hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio, é feita referência a todos os adjuvantes de hidróxido de alumínio e ou fosfato de alumínio, como descritos por Hem e White (Pharm Biotechnol. 1995;6:249-276).
Numa forma de realização, o fosfato de alumínio também pode ser referido como hidroxifosfato de alumínio. Noutra forma de realização, o fosfato de alumínio tem uma carga negativa a um pH de 7,4. Tipicamente, o ponto isoeléctrico (pi) de fosfato de alumínio é 5-7, ou 6-7 ou em torno de ou exactamente 5. Numa forma de realização adicional, o fosfato de alumínio tem uma razão molar fosfato:alumínio de 0,3-0,9, ou 0,3-0,6 ou 0,8-0,9. 32
Numa forma de realização, o hidróxido de alumínio tem uma carga positiva a um pH de 7,4. Tipicamente, o pi de hidróxido de alumínio é 8-11, 9-11, 10-11 ou em torno de ou exactamente 11.
Tipicamente, o teor de alumínio total é 200-1000 pg, 300-900 pg, 400-800 pg, 500-700 pg ou em torno de ou exactamente 630 pg de Al3+ por dose de 0,5 mL. Este pode ser todo hidróxido de alumínio ou todo fosfato de alumínio. Alternativamente, o teor de Al3+ pode ser de uma mistura de hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio na seguinte razão: 1:8-8:1, 1:4-4:1, 3:8-8:3, 1:2-2:1 ou 1:1 de fosfato de alumínio:hidróxido de alumínio. Numa forma de realização, é utilizada uma razão de 12:1-4:1, 11:1-5:1, 10:1-6:1, 9:1-7:1 ou 8:1 de fosfato de alumínio:hidróxido de alumínio.
Embora a maioria do alumínio seja proporcionada por antigénios pré-adsorvidos antes da mistura, de modo a formar uma vacina de combinação, algum alumínio pode ser adicionado na forma livre durante a formulação da vacina de combinação divulgada, e. g. , antes da etapa de ajustamento de pH aqui descrita. Tipicamente, o teor de alumínio livre por dose de 0,5 mL pode ser 0-300 pg, 50-250 pg, 75-200 pg, 100-154 pg ou em torno de ou exactamente 115 pg de Al3+. O Al3+ livre pode ser todo AI (OH) 3 ou tudo A1P04, ou uma mistura de Al(OH)3 e A1P04 na seguinte razão (p:p, A13+:A13+): 1:1-1:6, 1:1.1-1:5, 1:1.2-1:4, 1:1.3-1:3, 1:1.4-1:2, e. g., 23/92 ou 69/46 ou 6:1-1:1, 5:1-1,1:1, 4:1-1,2:1, 3:1-1,3:1, 2:1-1,4:1, e. g. , 46/69 ou 92/23 .
Alternativamente, determinados componentes das vacinas podem ser não expressamente adsorvidos sobre adjuvante, em particular sais de alumínio. 33 0 IPV pode ser não adsorvido ou adsorvido sobre A1(0H)3 ou uma mistura de AI (OH) 3 e A1P04. 0 DT pode ser adsorvido sobre AI (OH)3 ou AIPO4, o TT pode ser adsorvido sobre A1(0H)3 ou A1P04, o Pw pode ser adsorvido sobre ou misturado com A1P04, o PRN pode ser adsorvido sobre A1(0H)3, o FHA pode ser adsorvido sobre AI (OH) 3, o PT pode ser adsorvido sobre AI (OH) 3, o HB pode ser adsorvido sobre A1P04, o Hib pode ser adsorvido sobre A1P04 ou não adsorvido, o Men ACWY pode ser adsorvido sobre AI (OH) 3 ou AIPO4 ou não adsorvido, o componente MenB pode ser adsorvido sobre A1(0H)3 ou A1P04 ou não adsorvido, o Vi pode ser adsorvido sobre A1(0H)3 ou AIPO4 ou não adsorvido, o HepA pode ser adsorvido sobre AI(OH)3 ou AIPO4.
Os antigénios que são pré-adsorvidos sobre um sal de alumínio podem ser pré-adsorvidos individualmente antes da mistura. Noutra forma de realização, uma mistura de antigénios pode ser pré-adsorvida antes da mistura com adjuvantes adicionais. Numa forma de realização, o IPV pode ser adsorvido separadamente ou como uma mistura de IPV tipos 1, 2 e 3 ou quando misturado com componentes D e T adsorvidos. 0 significado de "antigénio adsorvido" é, por exemplo, tomado como significando mais que 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% adsorvido. O significado dos termos "fosfato de alumínio" e "hidróxido de alumínio", como aqui utilizados, inclui todas as formas de hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio que são adequadas para vacinas com adjuvante. Por exemplo, o fosfato de alumínio pode ser um precipitado de fosfato de alumínio insolúvel (amorfo, semi-cristalino ou cristalino) que pode ser, 34 opcionalmente, mas não exclusivamente, preparado através da mistura de sais de alumínio solúveis e sais de ácido fosfórico. 0 "hidróxido de alumínio" pode ser um precipitado de hidróxido de alumínio insolúvel (amorfo, semi-cristalino ou cristalino) que pode ser, opcionalmente, mas não exclusivamente, preparado através da neutralização de uma solução de sais de alumínio. São particularmente adequadas as diversas formas de qéis de hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio, disponíveis a partir de fontes comerciais, por exemplo Alhydrogel (hidróxido de alumínio, suspensão a 3% em água) e Adjuphos (fosfato de alumínio, suspensão a 2% em solução salina) fornecidos por Brenntag Biosector (Dinamarca).
Componentes não imunológicos das vacinas divulgadas
As vacinas aqui divulgadas irão tipicamente, adicionalmente aos componentes antigénicos e adjuvantes mencionados acima, compreender um ou mais "veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis" que incluem qualquer excipiente que não induza, por si só, a produção de anticorpos nocivos para o indivíduo recebendo a composição. Os excipientes adequados são, tipicamente, macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas, tais como proteínas, sacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, sacarose (Paoletti et al., 2001,
Vaccine, 19:2118), trealose (documento WO 00/56365), lactose e agregados lipídicos (tais como gotículas de óleo ou lipossomas). Tais veículos são bem conhecidos de um técnico com conhecimento geral na matéria. As vacinas também podem conter diluentes, tais como água, solução salina, glicerol, etc. Adicionalmente, podem estar presentes substâncias auxiliares, tais como agentes 35 molhantes ou emulsionantes, substâncias de tamponização de pH e semelhantes. A solução salina fisiológica estéril, apirogénica, tamponada com fosfatos, é um veículo típico. Uma discussão exaustiva de excipientes farmaceuticamente aceitáveis está disponível em referência Gennaro, 2000, Remington: The Science e Practice of Pharmacy, 20a edição, ISBN: 0683306472.
As composições divulgadas podem ser liofilizadas ou na forma aquosa, i. e., soluções ou suspensões. As formulações líquidas deste tipo permitem que as composições sejam administradas directamente da sua forma acondicionada, sem a necessidade para reconstituição num meio aquoso e são, deste modo, ideais para injecção. As composições podem ser apresentadas em frasquinhos ou podem ser apresentadas em seringas cheias prontas. As seringas podem ser proporcionadas com ou sem agulhas. Uma seringa incluirá uma dose única da composição, ao passo que um frasquinho pode incluir uma dose única ou doses múltiplas (e. g., 2 doses). Numa forma de realização, a dose é para humano. Numa forma de realização adicional, a dose é para um adulto, adolescente, criança pequena, bebé ou humano de menos de um ano de idade e pode ser administrada por injecção.
As vacinas líquidas também são adequadas para reconstituir outras vacinas a partir de uma forma liofilizada. Onde uma vacina deva ser utilizada para tal reconstituição extemporânea, é divulgado um kit, que pode compreender dois frasquinhos ou pode compreender uma seringa cheia pronta e um frasquinho, com os conteúdos da seringa sendo utilizados para reconstituir os conteúdos do frasquinho antes da injecção. 36
As vacinas aqui divulgadas podem ser acondicionadas na forma de dose unitária ou na forma de dose múltipla (e. g. , 2 doses) . Para formas de dose múltipla, os frasquinhos são preferidos a seringas pré-cheias. Os volumes de dosagem eficaz podem ser rotineiramente estabelecidos, mas uma dose humana típica da composição para injecção tem um volume de 0,5 mL.
Numa forma de realização, as vacinas aqui divulgadas têm um pH compreendido entre 6,0 e 8,0, noutra forma de realização as vacinas têm um pH compreendido entre 6,3 e 6,9, e. g., 6,6 ± 0,2. As vacinas podem ser tamponadas a este pH. O pH estável pode ser mantido através da utilização de um tampão. Se uma composição compreender um sal de hidróxido de alumínio, pode ser utilizado um tampão de histidina (documento W003/009869) . As composições devem ser estéreis e/ou apirogénicas.
Com respeito a humanos, as composições aqui divulgadas podem ser isotónicas.
As vacinas divulgadas podem incluir um antimicrobiano, particularmente quando acondicionadas num formato de dose múltipla. O tiomersal deve ser evitado, uma vez que este conduz a perda de potência do componente de IPV. Podem ser utilizados outros antimicrobianos, tais como 2-fenoxietanol ou parabenos (parabenos de metilo, etilo, propilo). Qualquer conservante está, de um modo preferido, presente em níveis baixos. 0 conservante pode ser adicionado de modo exógeno e/ou pode ser um componente dos antigénios agregados que são misturados de modo a formarem a composição (e. g., presentes como um conservante em antigénios de tosse convulsa). 37
Numa forma de realização, as vacinas estão isentas de tiomersal ou substancialmente isentas de tiomersal. Por "isentas de tiomersal" ou "substancialmente isentas de tiomersal" entende-se que não há tiomersal suficiente presente na formulação final, de modo a influenciar negativamente a potência do componente de IPV. Por exemplo, se o tiomersal for utilizado durante o processo de purificação do Pw ou antigénio de superfície de Hepatite B, deve ser substancialmente removido antes da mistura com IPV. 0 teor de tiomersal na vacina final deve ser inferior a 0,025 pg/pg de proteína, 0,02 pg/pg de proteína, 0,001 pg/pg de proteína ou 0,001 pg/pg de proteína, por exemplo, 0 pg/pg de proteína. Numa forma de realização, o tiomersal não é adicionado nem utilizado na purificação de qualquer componente. Ver, por exemplo, o documento EP1307473 para Hepatite B e ver acima para processos de Pw, onde a morte é alcançada não na presença de tiomersal.
As vacinas aqui divulgadas podem compreender detergente, e. g., um Tween (polissorbato) , tal como Tween 80. Os detergentes estão, em geral, presentes em níveis baixos, e. g., <0,01%.
As vacinas podem incluir sais de sódio (e. g., cloreto de sódio) para conferir tonicidade. A composição pode compreender cloreto de sódio. Numa forma de realização, a concentração de cloreto de sódio na composição é na gama de 0,1 a 100 mg/mL (e. g., 1-50 mg/mL, 2-20 mg/mL, 5-15 mg/mL) e, numa forma de realização adicional, a concentração de cloreto de sódio é 10±2 mg/mL de NaCl, e. g., cerca de 9 mg/mL.
As vacinas incluirão, em geral, um tampão. É típico um tampão de fosfatos ou histidina. 38
As vacinas divulgadas podem incluir iões de fosfato livres em solução (e. g., através da utilização de um tampão de fosfatos), de modo a favorecer a não adsorção de antigénios. A concentração de iões de fosfato livres na composição é, numa forma de realização, entre 0,1 e 10,0 mM ou, noutra forma de realização, entre 1 e 5 mM ou, numa forma de realização adicional, cerca de 2,5 mM.
Propriedades das vacinas divulgadas
Numa forma de realização, as vacinas são formuladas como uma vacina para administração in vivo ao hospedeiro, de tal modo que os componentes individuais da composição são formulados de modo a que a imunogenicidade dos componentes individuais não seja substancialmente comprometida por outros componentes individuais da composição. Por substancialmente não comprometida, entende-se que após imunização, é obtido um título de anticorpo contra cada componente que é mais de 60%, 70%, 80% ou 90% ou 95-100% do título obtido quando o antigénio é administrado em isolamento. Deste modo, em formas de realização preferidas, não ocorre efeito (significativamente) prejudicial aos componentes adicionais (em termos de eficácia protectora) na combinação, em comparação com a sua administração em isolamento.
Formulações de vacina
Numa forma de realização, as vacinas divulgadas são formuladas como uma vacina para administração in vivo ao hospedeiro, de modo a que confiram um título de anticorpo 39 superior ao critério para seroprotecção para cada componente antigénico, para uma percentagem aceitável de indivíduos humanos. Trata-se de um teste importante na avaliação da eficácia de uma vacina em toda a população. Os antigénios com um título de anticorpo associado acima do qual um hospedeiro é considerado como seroconvertido contra o antigénio são bem conhecidos e tais títulos são publicados por organizações, tal como a OMS. Numa forma de realização, mais de 80% de uma amostra estatisticamente significativa de indivíduos é seroconvertida, noutra forma de realização mais de 90% de uma amostra estatisticamente significativa de indivíduos é seroconvertida, numa forma de realização adicional mais de 93% de uma amostra estatisticamente significativa de indivíduos é seroconvertida e, ainda noutra forma de realização, 96-100% de uma amostra estatisticamente significativa de indivíduos é seroconvertida. A quantidade de antigénio em cada dose de vacina é seleccionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotectora, sem efeitos secundários adversos significativos em vacinas típicas. Tal quantidade irá variar, dependendo de que imunogénios específicos são empregues. Em geral, é de prever que cada dose compreenderá 1-1000 pg de imunogénio total, ou 1-100 pg, ou 1-40 pg ou 1-5 pg. Uma quantidade óptima para uma particular vacina pode ser averiguada por estudos envolvendo observação de títulos de anticorpo e outras respostas em indivíduos. Um programa de vacinação primário pode incluir 2-3 doses de vacina, dadas com um a dois meses de intervalo, e. g. , seguindo as recomendações da OMS para a imunização de DTP (i. e., no primeiro ano de vida) . Podem seguir-se doses de reforço no segundo e/ou ano(s) subsequente(s) de vida. 40
Potência de Pólio, como medida por teste de seroneutralização em ratos
Para efeitos da divulgação, o ensaio para a avaliação quantitativa de IPV da potência de vacina, das vacinas contendo IPV divulgadas deve ser efectuado utilizando uma dose única de vacina e deve ser realizado através da determinação da razão de titulo médio geométrico de vacina de teste (GMT) para GMT de vacina de referência e é referido como a resposta relativa (RR) ou potência relativa (RP) . 0 GMT de referência pode ser o GMT obtido com qualquer vacina de IPV compreendendo 40-8-32 unidades antigénicas D de IPV tipos 1-2-3, respectivamente, e pode ser o GMT obtido com a conhecida vacina Poliorix®. Tipicamente, o teste de RP é efectuado como se segue:
Potência dos poliovírus Tipos 1, 2 e 3 como determinada em ratos por seroneutralização:
Grupos de 10 ratos saudáveis (Sprague-Dawley (OFA) ou qualquer estirpe validada de antemão) são inoculados intramuscularmente com diluições (1/1,25; 1/3,125; 1/7,81) das amostras de teste ou material de referência, em solução salina tamponada com fosfatos. Se necessário, a gama de diluição pode ser alargada para 4 diluições, através da inoculação de vacina não diluída e as três diluições mencionadas anteriores. Dez ratos inoculados com o diluente são utilizados como controlos negativos. Os ratos são observados uma vez por semana, de modo a detectar qualquer reacção anómala. 20 a 22 dias após a inoculação, cada animal é profundamente anestesiado, sangrado e o soro é recolhido, de modo a ser analisado por teste de seroneutralização. 41
Para o teste de seroneutralização, os soros são inactivados por incubação a 56 °C, durante 30 minutos, num banho de água. Três séries de diluição dos soros, uma para cada tipo de pólio, são preparadas em microplacas utilizando o meio de diluição apropriado. As placas são armazenadas a +4 °C.
Para os três tipos de poliovírus, uma quantidade predeterminada de vírus (30-300 CCID5o) é adicionada às diluições de soros. As três suspensões de virus são diluídas tendo em conta os seus títulos respectivos. A diluição final é denominada 'diluição de trabalho'. Cada diluição de trabalho é adicionada às microplacas correspondentes. As placas são, depois, seladas e incubadas, a 37 °C ± 1 °C, durante 16 horas. Células Hep-2 são, depois, adicionadas e as microplacas são incubadas, a 37 °C ± 1 °C, durante 7 dias. O efeito citopatogénico (CPE) do vírus é lido utilizando um microscópio invertido, após coloração de azul de Coomassie. A presença de anticorpos anti-poliomielite inibe o crescimento do vírus e o aparecimento do CPE correspondente. Os títulos virais anti-pólio (tipo 1, 2 e 3) correspondem ao recíproco da última diluição sem qualquer CPE. Em cada grupo, os animais com anticorpos neutralizantes são registados e o título dos anticorpos de cada amostra de soro é determinado para o diferente tipo de poliovírus. O título de anticorpo neutralizante é expresso como o log2 do inverso da diluição mais elevada da amostra de soro que inibe totalmente o efeito citopático de poliovírus em células Hep-2. 0 título médio geométrico por diluição (GMT) e por tipo de vírus também é determinado para cada grupo de ratos. 42
Acondicionamento das vacinas divulgadas
As vacinas podem ser acondicionadas em diversos tipos de recipientes, e. g., em frasquinhos, em seringas, etc. Um frasquinho multidose compreenderá, tipicamente, um orifício de plástico resselável, através do qual uma agulha estéril pode ser inserida para remover uma dose de vacina, que ressela após a agulha ter sido removida. A vacina pode ser proporcionada em diversos recipientes (e. g., 2 ou 3) . Os conteúdos dos recipientes podem ser misturados extemporaneamente antes da administração a um hospedeiro numa única injecção ou podem ser administrados concomitantemente em diferentes locais. A dose da vacina ou cada vacina, se um kit for administrado concomitantemente (em dois ou mais recipientes), será tipicamente de 0,5 mL.
Numa forma de realização deste aspecto da divulgação é proporcionado um kit compreendendo duas vacinas multivalentes para conferir protecção num hospedeiro contra doença provocada por poliovírus, Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtherial e, opcionalmente, um ou mais de Hepatite B, Haemophilus influenza tipo B, Neisseria meningitidis tipo A, Neisseria meningitidis tipo C, Neisseria meningitidis tipo W, Neisseria meningitidis tipo Y, Neisseria meningitidis tipo B, Salmonella typhi, Hepatite A ou Malária. O kit compreende um primeiro recipiente compreendendo: (1) (a) Poliovírus inactivado (IPV) da invenção, (b) toxóide diftérico (DT ou D) (ver acima), (c) toxóide tetânico (TT ou T) (ver acima), 43 (d) célula intacta morta de Bordetella pertussis (Pw) ou 2 ou mais componentes de tosse convulsa acelular (Pa) (ver acima), (e) opcionalmente, antigénio de superfície de Hepatite B (HepB ou HB) (ver acima), (f) opcionalmente, um conjugado de uma proteína transportadora e o sacárido capsular de H. influenzae tipo B (Hib) (ver acima), (g) opcionalmente, um ou ambos os conjugados de uma proteína transportadora e um sacárido capsular de um N. meningitidis tipo A (MenA) ou N. meningitidis tipo C (MenC) (ver acima) e um segundo recipiente compreendendo: (2A) (a) conjugados de uma proteína transportadora e um sacárido capsular de N. meningitidis tipo A (MenA), N. meningitidis tipo C (MenC) , N. meningitidis tipo W (MenW) e/ou N. meningitidis tipo Y (MenY) (ver acima para diversas combinações de sacárido Men da invenção) e (b) opcionalmente, um conjugado de uma proteína transportadora e o sacárido capsular de H. influenzae tipo B (Hib); ou (2B) (a) um conjugado de uma proteína transportadora e o sacárido capsular de H. influenzae tipo B (Hib) e (b) opcionalmente, um conjugado de uma proteína transportadora e sacárido Vi de Salmonella typhi 44 0 kit pode, opcionalmente, compreender um terceiro recipiente compreendendo: (3) (a) opcionalmente, antigénio de superfície de
Hepatite B (b) opcionalmente, um conjugado de uma proteína transportadora e sacárido Vi de Salmonella typhi
Os recipientes podem em qualquer caso compreender, adicionalmente, antigénio(s) de HepA e/ou antigénio(s) de MenB e/ou RTS,S e/ou antigénio(s) de Streptococcus pneumonia.
Em qualquer caso, o mesmo antigénio não deve estar presente em ambos os recipientes.
Numa forma de realização, o primeiro recipiente tem, além dos componentes a), b), c), d), também e), f), g), e)+f), e)+g), f)+g) ou e)+f)+g).
Numa forma de realização, a vacina do primeiro recipiente pode ser líquida e a vacina do segundo recipiente pode ser líquida ou liofilizada (e. g. , na presença de um excipiente estabilizante conhecido, tal como sacarose ou trealose).
Os recipientes do kit podem ser acondicionados separadamente ou, opcionalmente, acondicionados em conjunto. Numa forma de realização, o kit é proporcionado com uma lista de instruções para administração das vacinas nos dois ou mais recipientes. 45
Numa forma de realização, onde um recipiente num kit contém um determinado conjugado sacaridico, o mesmo conjugado não está presente no outro recipiente do kit. A requerente acredita que um kit proporcionado no modo acima pode, de um modo vantajoso, apresentar os diversos antigénios a um sistema imunitário de um hospedeiro num modo óptimo. 0 kit pode proporcionar a um médico assistente um método óptimo de imunizar um hospedeiro, com uma ou mais das seguintes vantagens: eficácia protectora para todos os antigénios, reactogenicidade mínima, interferência mínima de supressão de transportador, interferência mínima de adjuvante/antigénio ou interferência mínima de antigénio/antigénio. Desse modo, estes objectivos podem ser alcançados com o número mínimo (duas) de administrações, opcionalmente ocorrendo na mesma visita ao médico.
Numa forma de realização, as vacinas do primeiro e segundo recipientes são administradas concomitantemente em diferentes locais (como se descreve abaixo sob administração de vacinas da invenção) e, numa forma de realização alternativa, a requerente considera que os conteúdos do primeiro e segundo recipientes podem ser misturados (opcionalmente, extemporaneamente) antes da administração como uma única vacina. 46
Preparação de vacinas divulgadas É também aqui divulgado um método para a produção de uma formulação de vacina, compreendendo a etapa de misturar os componentes da vacina juntamente com um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Numa forma de realização da presente divulgação é proporcionada uma vacina, como aqui descrita, para utilização num medicamento para o tratamento ou prevenção de doenças provocadas por infecção por poliovírus Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtherial e, opcionalmente, virus de Hepatite B, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis tipo A, Neisseria meningitidis tipo C, Neisseria meningitidis tipo W, Neisseria meningitidis tipo Y, Salmonella typhi ou Hepatite A.
Noutra forma de realização da divulgação é proporcionada uma utilização das vacinas divulgadas na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doenças provocadas por infecção por poliovírus, Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtherial e, opcionalmente, vírus de Hepatite B, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis tipo A, Neisseria meningitidis tipo C, Neisseria meningitidis tipo W, Neisseria meningitidis tipo Y, Salmonella typhi ou Hepatite A.
Também é aqui divulgado um método de imunização de um hospedeiro humano contra doença provocada por poliovírus e opcionalmente Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtherial e, vírus de Hepatite B, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis tipo A, Neisseria meningitidis tipo C, Neisseria meningitidis tipo W, Neisseria meningitidis tipo Y, Salmonella typhi ou Hepatite A, cujo método compreende administrar ao hospedeiro uma dose imunoprotectora da vacina divulgada. A quantidade de antigénio em cada dose de vacina é seleccionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotectora, sem efeitos secundários adversos significativos em vacinas típicas. Tal quantidade irá variar, dependendo de que imunogénio específico é empregue e de como é apresentado. Numa forma de realização, cada dose compreenderá 0,1-100 pg de sacárido, noutra forma de realização cada dose compreenderá 0,1-50 pg, numa forma de realização adicional cada dose compreenderá 0,1-10 pg, ainda noutra forma de realização cada dose compreenderá 1 a 5 pg de sacárido.
Numa forma de realização, o teor de antigénios proteicos na vacina serão na gama 1-100 pg, noutra forma de realização o teor dos antigénios proteicos nas vacinas serão na gama 5-50 pg, numa forma de realização adicional o teor dos antigénios proteicos nas vacinas serão na gama 5-25 pg. A preparação da vacina é, em geral, descrita em Vaccine Design ["The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press, Nova Iorque]. A encapsulação dentro de lipossomas é descrita por Fullerton, Patente US 4235877. A conjugação de proteínas em macromoléculas é divulgada, por exemplo, por Likhite, Patente US 4372945 e por Armor et al. , Patente US 4474757. A utilização de Quil A é divulgada por Dalsgaard et al., 1977, Acta Vet Scand. 18:349. O 3D-MPL está disponível a partir de Ribi immunochem, EUA e é divulgado no Pedido de Patente Britânica N° 2220211 e Patente US 4912094. O QS21 é divulgado na patente US 5057540. 48
Numa forma de realização adicional, é divulgada uma vacina multivalente, compreendendo poliovírus inactivado (IPV) e, opcionalmente, célula intacta morta de Bordetella pertussis (Pw) , toxóide tetânico (TT), toxóide diftérico (DT), um conjugado de uma proteína transportadora e o sacárido capsular de H. influenzae tipo B (Hib - opcionalmente conjugado a TT, DT ou CRM197), em que a quantidade de conjugado por dose de 0,5 mL de vacina em bruto é 1-8 pg e a imunogenicidade do conjugado é equivalente ou melhorada em relação a tais composições compreendendo quantidades maiores de conjugado. Opcionalmente, também pode ser incluído o antigénio de superfície de Hepatite B.
Numa forma de realização, a quantidade de conjugado por dose de 0,5 mL de vacina em bruto é inferior a 10 pg (de sacárido no conjugado), noutra forma de realização a quantidade de conjugado é 1-7, noutra forma de realização a quantidade de conjugado é 2-6 pg ou, numa forma de realização adicional, cerca de 2,5, 3, 4 ou 5 pg.
Será entendido que determinados componentes, por exemplo componentes de DTPw, podem ser combinados separadamente antes da adição do HBsAg adsorvido ou outros componentes.
Também é proporcionado um método de preparação de vacinas da invenção, compreendendo a etapa de misturar IPV tipo 1, IPV tipo 2 e/ou IPV tipo 3 com um excipiente f armaceut icamente aceitável. Um processo típico para preparar uma vacina em bruto como aqui divulgada, com antigénios adicionais, adicionará os componentes de IPV a uma mistura dos componentes D e T, i. e., os componentes DT são misturados com os componentes de IPV. Esta 49 ordem de mistura permite que a força iónica e/ou pH da composição seja ajustada (e. g. , pH<7) antes da adição dos componentes de Pa ou Pw. Tipicamente, HB pré-adsorvido sobre A1P04 é adicionado em primeiro lugar se incluido na composição, seguido da adição de DT pré-adsorvido sobre AI(OH)3 ou A1P04, seguido da adição de TT pré-adsorvido sobre A1(0H)3 ou A1P04, seguido da adição de IPV, opcionalmente pré-adsorvido sobre A1(0H)3, antes do ajuste do pH para, e. g., pH 5,9-7,2, ou pH 6-7, ou pH 6,2-6,8 ou pH 6,4-6,6 e, depois, a adição de Pw pré-adsorvido sobre A1P04. Opcionalmente, os antigénios Hib, Vi, MenA, MenC, MenW, Men Y, MenB e/ou HepA podem ser adicionados em qualquer ponto neste processo. Numa forma de realização, os antigénios Hib, Vi, MenA, MenC, MenW, Men Y, MenB e/ou HepA são adicionados antes do ajuste de pH. Numa forma de realização, um ou mais antigénios são adsorvidos sobre fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio ou uma mistura de ambos. Noutra forma de realização, os antigénios da invenção são misturados com um excipiente e/ou adjuvante(s) farmaceuticamente aceitável(eis).
Numa forma de realização, a composição de vacina divulgada pode ser preparada na seguinte ordem: é adicionado HBsAg pré-adsorvido, seguido de toxóide diftérico pré-adsorvido, seguido de toxóide tetânico pré-adsorvido e IPV, o pH é, depois, ajustado para, aproximadamente, 6,5, antes da adição de Pw pré-adsorvido.
Noutra forma de realização, a composição de vacina divulgada pode ser preparada na seguinte ordem: é adicionado toxóide tetânico pré-adsorvido, seguido de IPV, seguido de HBsAg pré-adsorvido, seguido de toxóide Diftérico pré-adsorvido, o pH é, depois, ajustado para, aproximadamente, 6,5, antes da adição de Pw pré-adsorvido. 50
Em geral, as composições de vacina combinadas de acordo com qualquer aspecto da divulgação podem ser preparadas como se segue: 0 IPV, DTPw, HepB, MenA, MenC, MenW, MenY, MenB, Vi, Hepatite A ou outros componentes são pré-adsorvidos sobre um adjuvante adequado, especialmente hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio ou uma mistura de ambos. Após dar tempo para adsorção completa e estável dos respectivos componentes, os diferentes componentes são combinados sob condições apropriadas. 0 ou os conjugados de Hib, Vi, MenA, MenC, MenW e/ou MenY podem ou não ser adsorvidos sobre sal adjuvante de alumínio antes de serem misturados com a vacina de DTPw.
Numa forma de realização, as vacinas são preparadas entre 15 °C e 30 °C (e. g., entre 19 °C e 27 °C ou a 23±4 °C).
Administração das vacinas divulgadas É aqui divulgado um método para produzir uma resposta imunitária num mamífero, compreendendo o passo de administração de uma quantidade eficaz de uma vacina como aqui divulgada. As vacinas podem ser administradas profilacticamente (i. e., para prevenir infecção). A resposta imunitária é, de um modo preferido, protectora e, de um modo preferido, envolve anticorpos. O método pode induzir uma resposta de reforço.
Após uma vacinação inicial, os indivíduos podem receber uma ou várias imunizações de reforço (subsequentes), adequadamente espaçadas. O tratamento de dosagem pode ser um programa de dose única ou um programa de dose múltipla. As doses múltiplas podem ser utilizadas num programa de imunização primária e/ou num programa de imunização de reforço. Um programa de dose primária, 51 que pode ser no primeiro ano de vida, pode ser seguido de um programa de dose de reforço. 0 tempo adequado entre doses de imunização primária (e. g., entre 4-16 semanas) e entre imunização primária e reforço pode ser rotineiramente determinado.
Numa forma de realização, o mamífero é um humano. Onde a vacina seja para utilização profiláctica, o humano é, de um modo preferido, uma criança (e. g. , uma criança pequena ou bebé) ou um adolescente ; onde a vacina seja para utilização terapêutica, o humano é, de um modo preferido, um adulto. Uma vacina destinada a crianças também pode ser administrada a adultos e. g., para avaliar a segurança, dosagem, imunogenicidade, etc.
As preparações de vacina podem ser utilizadas para proteger ou tratar um mamífero susceptível a infecção, por meio de administração da referida vacina directamente a um doente. A distribuição directa pode ser alcançada por administração parentérica (intramuscularmente, intraperitonealmente, intradermicamente, subcutaneamente, intravenosamente ou no espaço intersticial de um tecido); ou por administração rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, auricular, pulmonar ou outra mucósica. Numa forma de realização, a administração é por injecção intramuscular na coxa ou na parte superior do braço. A injecção pode ser por meio de uma agulha (e. g., uma agulha hipodérmica) mas pode, alternativamente, ser utilizada injecção sem agulha. Uma dose intramuscular típica é 0,5 mL.
As infecções bacterianas afectam diversas áreas do corpo e, assim, as composições divulgadas podem ser preparadas de diversas formas. Por exemplo, as composições podem ser 52 preparadas como injectáveis, como soluções ou suspensões líquidas. A composição pode ser preparada para administração pulmonar, e. g., como um inalador, utilizando um pó fino ou spray. A composição pode ser preparada como um supositório ou óvulo moldado. A composição pode ser preparada para administração nasal, auricular ou ocular, e. g., como spray, gotas, gel ou pó (ver, e. g., Almeida & Alpar, 1996, J Drug Targeting, 3:455; Bergquist et al., 1998, APMIS, 106 : 800). A administração intranasal bem-sucedida de vacinas de DTP foi referida (Ryan et ai., 1999, Infect. Immun., 67:6270; Nagai et al., 2001, Vaccine, 19:4824).
Numa forma de realização, as vacinas do primeiro e segundo (e terceiro, onde aplicável) recipientes são administradas concomitantemente em diferentes locais e, numa forma de realização alternativa, a requerente considera que os conteúdos do primeiro e segundo recipientes podem ser misturados (opcionalmente, extemporaneamente) antes da administração como uma única vacina.
As vacinas divulgadas podem ser utilizadas para induzir imunidade sistémica e/ou mucosal.
Uma forma de verificar a eficácia do tratamento terapêutico envolve a monitorização de infecção bacteriana, após administração da composição divulgada. Uma forma de verificar a eficácia do tratamento profiláctico envolve a monitorização de respostas imunitárias contra os antigénios, após administração da composição. A imunogenicidade de composições pode ser determinada através da administração das mesmas a indivíduos de teste (e. g., crianças de 12-16 meses de idade ou modelos animais - documento WO 01/30390) e, depois, determinar parâmetros 53 imunológicos padrão. Estas respostas imunitárias serão, em geral, determinadas cerca de 4 semanas após administração da composição e comparadas com valores determinados antes da administração da composição. Em vez de avaliar a eficácia protectora real em doentes, modelos animais e in vitro padrão e correlacionados de protecção para avaliar a eficácia de vacinas de DTP são bem conhecidos. A requerente pretende, aqui, que os termos "compreendendo", "compreender" e "compreende" sejam, opcionalmente, substituíveis com os termos "consistindo de", "consiste de" e "consiste de", respectivamente, em todos os casos. Isto não altera o significado normal destes termos e pretende-se, apenas, proporcionar base para a substituição, não para torná-los equivalentes em significado.
EXEMPLOS
Os exemplos são proporcionados meramente para efeitos de ilustração e não se destinam a limitar o âmbito da invenção.
Exemplo 1: Testes em formulações de IPV de dose baixa
Para todas as formulações do exemplo 1, os antigénios são adsorvidos por adição de sal de alumínio antes da formulação, excepto IPV, que é adicionado sem adsorção.
As tabelas abaixo apresentam o método de adsorção para D, T, Pw e HBsAg. 54 αιρο4 ι D (7,5 Lf/0,075 mg de Al3*)
I
Agitar 15 até 20 min. à ta ambiente
I
Ajustar o pH a pH 5,1 +/- 0,1
I
Agitar 15 até 20 min. à ta ambiente i
Verificar o pH 5,1 +/- 0,1
Agitar 15 até 45 min. à ta ambiente
I
Maturação de 7 dias +/- 8 H, a 37 °C +/- 1 °C, sem agitação (recipiente de vidro) com agitação (recipiente de aço inoxidável)
I
Agitar 15 até 45 min. à ta ambiente
I
Ajustar o pH a pH 6,1 +/- 0,1
I
Agitar 15 até 20 min. à ta ambiente
I
Verificar o pH 6,1 +/- 0,1
I
Armazenar, no mínimo 7 dias, a +2/+8 °C, antes da formulação Verificar o pH 6,1 +/- 0,1
COMPOSIÇÃO FINAL por dose Difteria 7,5 Lf (+/- 420 Lf/mL) Al3+ 0,075 mg NaCl 150 mM PH 6,1 + /- 0,1 Volume aproximadamente 18 pL
Tabela 1. Método de produções para adsorção de toxóide Diftérico. 55 Α1(0Η)3
Tipo SUPERFOS
I Τ (3,25 Lf/0,070 mg de Al^)
Agitar 15 até 20 min. à T.A.
I
Ajustar a pH 6,1 +/- 0,1 i
Agitar 15 até 20 min. à T.A. i
Verificar o pH 6,1 +/- 0,1 I
Agitar 16 h até 24 h à T.A.
I
NaCl a 1500 irM (ad. 150 irM) i
Agitar 15 até 45 min. à T.A.
I
Ajustar a pH 6,1 +/- 0,1 I
Agitar 15 até 20 min. à T.A.
I
Verificar o pH 6,1 +/- 0,1 I
Armazenar, no mínimo 14 dias, a +2 °C/+8 °C, antes da formulação. Verificar o pH 6,1 +/- 0,1
COMPOSIÇÃO FINAL por dose Tétano 3,25 Lf (+/- 360 Lf/mL) Al3+ 0,070 mg NaCl 15 0 mM pH 6,1 +/- 0,1 Volume aproximadamente 9 pL
Tabela 2. Método de produções para adsorção de toxóide Tetânico. 56
AlPCXj 0,17 mcr de Al^/d (Brenntag)
Ajustar o pH a pH 6,5 +/- 0,1
I
Agitar 15 até 20 min. à ta anibiente
I
Verificar o pH 6,5 +/- 0,1
I
Pw 20 IOU/d
Agitar 15 até 45 min. à ta Anibiente
I
Medir o pH
I
Armazenar a +2 °C - +8 °C
COMPOSIÇÃO FINAL por dose Antigénios Adjuvante [Al3+] (mg) Pw 2 0 OU A1P04 0,170 mg Al3+ 0,170 mg A1P04 NaCl 150 mM pH 6,8 Volume aproximadamente 65 pL
Tabela 3. Método de produções para adsorção de Pw. 57 HBsAg 10 ug 0,20 mg de AI31-A1P04
Agitar 15 min. até 30 min. à ta ambiente
I
Ajustar o pH a pH 5,3 +/- 0,1 [
Agitar 15 min. até 30 min. à ta ambiente í
Verificar o pH a pH 5,3 +/- 0,1
I
Agitar 20 H +/- 4 H à ta ambiente (adsorção)
I
Ajustar o pH a pH 6,1 +/- 0,1
^ I
Agitar 15 min. até 30 min. à ta ambiente
I
Verificar o pH a pH 6,1 +/- 0,1 1
Armazenar 14 dias à ta ambiente (maturação)
I
Armazenar a 2 °C - 8 °C
COMPOSIÇÃO FINAL por dose Antigénios Adjuvante [Al3+] (mg) HBsAg 10 pg A1P04 0,200 mg Al3+ 0,200 mg AIPO4 NaCl 150 mM PH 6,1 + /-0, 1 Volume aproximadamente 50 pL
Tabela 4. Método de produções para adsorção de HBsAg. 58
Foram testadas várias formulações diferentes: • Uma combinação de toxóide Diftérico, toxóide Tetânico, célula intacta de Tosse convulsa e antigénio de superfície de Hepatite B: DTPwSF-HB, como uma referência (DTPwSf significa que é uma formulação isenta de tiomersal), formulada com o método de produção 1 (tabela 5). • Produto da GlaxoSmithKline Biologicals S.A.,
Poliorix®, (IPV autónomo não adsorvido) , como uma referência não adsorvida à dose padrão, formulado com o método produção 2 (tabela 5). • Uma combinação de toxóide Diftérico, toxóide Tetânico, célula intacta de Tosse convulsa, antigénio de superfície de Hepatite B e poliovírus Inactivado: DTPwsf-HB-IPV com adição do IPV antes de Pw, formulada com o método de produção 3 (tabela 5). • Uma combinação de toxóide Diftérico, toxóide Tetânico, célula intacta de Tosse convulsa, antigénio de superfície de Hepatite B e poliovírus Inactivado: DTPwsf-HB-IPV com adição do IPV imediatamente após T adsorvido. Este método de adição permite a adsorção de IPV sobre AI(OH)3. Esta vacina é formulada com o método de produção 4 (tabela 5).
Um placebo contendo apenas sais de alumínio, IPV e tampões dos outros antigénios. Uma vez que o IPV é o único antigénio neste placebo, não há competição por adsorção. Por conseguinte, 59 o IPV está completamente adsorvido. Esta vacina é formulada com o método de produção 5 (tabela 5). 5 foram 100% da
As vacinas formuladas com o método de produção 2, 3, 4 e produzidas com uma gama de dose de IPV entre 12,5% e dose de IPV padrão de 40/8/32 IU/0,5 mL.
Etapa Método de produção 2: IPV autónomo 1 Adicionar IPV a uma dose de
Tipo 1 Tipo 2 Tipo 3 40 IU 8 IU 32 IU 20 IU 4 IU 16 IU 10 IU 2 IU 8 IU 5 IU 1 IU 4 IU
2 Adicionar tampão M199 para atingir um volume final de 0,5 mL 9 Agitar
10 Ajustar o pH a 6,9 +/- 0,2 14 Armazenar a +2 a +8 °C 60
Etapa Método de produção 3: DTwSF-HB-IPV 1 Agua para injecção para atingir un volume de dose final de 0,5 iríL 2 Adicionar NaCl a 1,5 M para atingir una concentração final de 150 irM 3 Adicionar 115 pg de Al3* ccmo AIP04 4 Adicionar 10 pg de HBsAg adsorvido 5 Adicionar 7,5 Lf de toxoide Diftérico adsorvido 6 Adicionar 3,25 Lf de toxóide Tetânico adsorvido 7 Agitar 3 Ajustar o IPV a una dose de
Tipo 1 Tipo 2 Tipo 3 40 1U 8 IU 32 IU 20 IU 4 IU 16 IU 10 IU 2 IU 8 IU 5 IU 1 IU 4 IU
9 Agitar 10 Ajustar o pH a 6,5+/-0,1 11 Agitar 12 Adicionar 20 ICU de Pw adsorvido 13 Agitar 14 Armazenar a +2 a +3 °C 61
Etapa Método de produção 4: DTwSF-HB-IPV
Etapa Método de produção 4: DTwSF-HB-IPV 1 Água para injecção para atingir un volume de dose final de 0,5 iriL 2 Adicionar NaCl a 1,5 M para atingir una concentração final de 150 irM 3 Adicionar 3,25 Lf de tojoóide Tetânico adsorvido 4 Adicionar IPV a una dose de
Tipo 1 Tipo 2 Tipo 3 40 iU 8 IU 32 IU 20 IU 4 IU 16 IU 10 IU 2 IU 8 IU 5 IU 1 IU 4 IU
5 Agitar 6 Adicionar 115 pg de Al^ caro AIP04 7 Adicionar 10 pg de HBsAg adsorvido 8 Adicionar 7,5 Lf de toxóide Diftérico adsorvido 9 Agitar 10 Ajustar opBa 6,5+/-0,1 11 Agitar 12 Adicionar 20 ICU de Pw adsorvido 13 Agitar 14 Armazenar a +2 a +8 °C _Método de produção 5: Placebo_
Conforme o Método de produção 3, contudo todos os antigénios que não IPV foram omitidos.
Tabela 5. Método de produções por dose de 0,5 mL
Para a formulação do método de produção 1: HBsAg, D e T são adsorvidos separadamente em A1P04, AIPO4 e A1(0H)3, respectivamente. Os três antigénios são adicionados sequencialmente a uma suspensão contendo água, NaCl e A1P04 livre. A mistura é agitada durante 60-75 min. Depois, o pH é ajustado para 6,5, antes da adição de Pw adsorvido.
Para a formulação do método de produção 3, os três antigénios adsorvidos são adicionados sequencialmente a uma suspensão contendo água, NaCl e AIPO4 livre. A mistura é agitada, durante 60-75 min, antes da adição de IPV. 0 pH é ajustado para 6,5, antes da adição de antigénios de Pw. 62
Para a formulação do método de produção 4, o antigénio T é adsorvido em A1(0H)3. 0 antigénio T pré-adsorvido é adicionado a uma suspensão contendo água e NaCl, seguida de IPV tipos 1, 2 e 3. A mistura é agitada, durante 60-75 minutos, antes da adição de A1P04 livre. O HBsAg pré-adsorvido é, depois, adicionado, seguido do antigénio D pré-adsorvido e a mistura é, depois, agitada durante 60-75 minutos adicionais. O pH é ajustado para 6,5, antes da adição de antigénios de Pw. O método de produção 3 foi eventualmente seleccionado, devido à facilidade de preparação, uma vez que este protocolo apenas envolvia uma etapa de agitação. Durante o processo de preparação da vacina, não é utilizado tiomersal e não é adicionado ao produto de vacina final. A tabela abaixo apresenta a composição das formulações para uma dose de 0,5 mL. 63 6 4
Al^ cano llllil! DoseèM Al3+ <w> ttádaès Al^ccm? A1(0H}3 para A1P04 para A1P04 para Doseè Doseè Doseè Dose antigénicas A1P04 para adsorçãoè adsorçãoè adsorçãoè J1P04 mh toxóíè toxóíè tosse è lee? D (*) Descrição adsorçãodeD D HBsAg fllllllllll llllil livre diftérioo tetânico convulsa HBsAg pajrão cn/E/te) Método de produção I D1P%-HB 75 pg 70 pg 200 pg 170 pg 115 pg NA 7,5 Lf 3,25 Lf 20IOU 10 pg NA NA 100% 40/8/32 Método de produção 2 na NA NA NA NA NA NA NA NA NA 50% 20/4/16 IPV 25% 10/2/8 12,50% 5/1/4 100% 40/8/32 Método de produção 3 75 pg 70 pg 200 pg 170 pg 115 pg NA 7,5 Lf 3,25 Lf 20 IOU 10 pg 50% 20/4/16 D1P%-HB-IPV 25% 10/2/8 12,50% 5/1/4 100% 40/8/32 Método de produção 4 75 pg 70 pg 200 pg 170 pg 115 pg NA 7,5 Lf 3,25 Lf 20 IOU 10 pg 50% 20/4/16 D1P%-HB-IPV 25% 10/2/8 12,50% 5/1/4 100% 40/8/32 Método de produção 5 NA NA NA NA 560 pg 70 pg NA NA NA NA 50% 20/4/16 Placebo 25% 10/2/8 12,50% 5/1/4 (*) 0 teor de antigénio D é os valores visados para a diluição do agregado de pólio inactivado concentrado durante a formulação
Tabela 6. Composição de formulações por dose de 0,5 mL
Determinação da potência de pólio em ratos por seroneutralização A potência da vacina foi determinada por um teste de seroneutralização após inoculação intramuscular de ratos (Sprague-Dawley (OFA) ou qualquer estirpe validada de antemão. Grupos de 10 ratos saudáveis inactivos foram inoculados intramuscularmente (0,5 mL) com diluições das amostras de teste, material de referência em solução salina tamponada com fosfatos ou diluente (solução salina tamponada com fosfatos). Os dez ratos inoculados com o diluente foram utilizados como controlos negativos. Vinte a vinte e dois dias após a inoculação (período de imunização) , cada animal foi profundamente anestesiado, antes da recolha de sangue por punção cardíaca. As amostras de sangue foram centrifugadas (a, aproximadamente, 800 g) e os soros foram analisados.
Teste de seroneutralização:
Os soros foram inactivados por incubação, a 56 °C, durante 30 minutos. Três séries de diluição dos soros, uma para cada tipo de pólio, foram preparadas em microplacas utilizando o meio de diluição apropriado. Para os três tipos de poliovírus, uma quantidade predeterminada de vírus foi adicionada às diluições de soros. As três suspensões de vírus foram diluídas tendo em conta os seus títulos respectivos. A diluição final é denominada 'diluição de trabalho'. Cada diluição de trabalho foi adicionada às microplacas correspondentes. As placas foram, depois, seladas e incubadas, a 37 °C ± 1 °C, durante 16 horas. Células Hep-2 foram, depois, adicionadas e as microplacas foram incubadas, a 65 37 °C ± 1 °C, durante 7 dias. 0 efeito citopatogénico (CPE) do vírus foi lido utilizando um microscópio invertido, após coloração de azul de Coomassie. A presença de anticorpos anti-poliomielite inibe o crescimento do vírus e o aparecimento do CPE correspondente. Os títulos virais anti-pólio (tipo 1, 2 e 3) correspondem ao recíproco da última diluição sem qualquer CPE.
Em cada grupo, os animais com anticorpos neutralizantes são registados e o título dos anticorpos de cada amostra de soro é determinado para o diferente tipo de poliovírus. 0 título de anticorpo neutralizante é expresso como o log2 do inverso da diluição mais elevada da amostra de soro que inibe totalmente o efeito citopático de poliovírus em células Hep-2. 0 título médio geométrico por diluição (GMT) e por tipo de vírus é, depois, determinado para cada grupo de ratos.
Para cada tipo de vírus, a diluição de vacina e, subsequentemente, a quantidade de antigénio D que induziu anticorpos neutralizantes em 50% dos ratos (ED50) também foi calculada por análise probit. O ED50 foi expresso em unidades antigénicas D.
Para quantificar a potência relativa em relação à da vacina de referência (habitualmente Poliorix®, mas pode ser um vacina de DTPaHBIPV, tal como Pediarix®), a potência relativa (RP) , definida como a razão de duas respostas de dose equivalentes num teste multidose, foi medida. Nesta abordagem, a potência da vacina de teste é calculada por ensaio de linha paralela, como 66 descrito em Finney, 1978 (Método Estatístico em Ensaio Biológico, Charles Griffin & Company Ltd, Londres, 1978).
Determinação da Potência de Pólio Tipo 1, 2 e 3 por ELISA A determinação da potência de Pólio por ELISA é realizada em uma ou duas etapas, dependendo de se a medição está sendo efectuada em IPV não adsorvido em bruto vs vacinas formuladas, respectivamente: 1. Desorção para vacina adsorvida final (para medição de unidades antigénicas D em vacinas formuladas - não requerido para medição em agregado antigénico de IPV não adsorvido); 2. Teste de ELISA para a quantificação de teor de antigénio D de vacina desorvida e não adsorvida e/ou agregado de pólio.
Etapa de desorção
Após centrifugação, durante 10 minutos, da vacina adsorvida sob teste, são realizadas três desorções sucessivas, através da adição de um tampão de fosfatos de desorção ao sedimento, misturando e incubando, à temperatura ambiente. 0 primeiro e o segundo períodos de desorção são de 2 horas, o período de incubação para a terceira extracção sendo uma noite, à temperatura ambiente. As recolhas a partir das três extracções são agrupadas e diluídas com solução tampão de fosfatos (PBS), sem Ca e Mg, contendo albumina de soro bovino (BSA) e Tween 20. 67
Os três antigénios de poliovírus são quantificados por ELISA, como se descreve abaixo.
Quantificação de antigénio D por ELISA:
As placas de microtitulação são revestidas com IgG anti-poliovirus (tipo 1, 2 ou 3) específica de coelho, diluída com tampão de carbonato/bicarbonato (pH 9,6) e incubada, de um dia para o outro, a 4 °C. Após lavagem, é adicionada a solução saturante (solução salina tamponada com fosfatos, sem Ca e Mg, + 1% de BSA) . Os brancos (PBS) e diluições seriais de amostras de vacina e padrão não adsorvido interno são adicionados em duplicado. A preparação de padrão trivalente interno contém antigénios tipo 1, 2 e 3 calibrados. 0 calibrador é a referência Farmacopeia Europeia Biológica (EPBRP).
Para todas as etapas seguintes, as placas de microtitulação são incubadas durante 1 h 30, a 37 °C e lavadas. IgG anti-poliovírus (tipo 1, 2 ou 3) de coelho conjugada a peroxidase, diluída com tampão de fosfatos (sem Ca e Mg + Tween 20) contendo BSA, é adicionada. A solução de substrato, contendo a tetrametilbenzidina dissolvida em dimetilssulfóxido (DMSO) e diluída em tampão de acetato contendo H2O2 a 0,003%, é adicionada, seguida de uma incubação de 15-30 minutos no escuro. A solução de bloqueamento, contendo H2SO4 é, depois, adicionada. No espaço de uma hora, a densidade óptica (O.D.) de cada poço é lida utilizando um fotómetro, regulado a 450 nm, com uma referência a 620 nm. 68 A concentração de antigénio D em amostras de teste é calculada a partir da curva-padrão, obtida através da representação gráfica dos valores de 0.D. contra as concentrações de antigénio padrao.
Como um suplemento à Potência por ELISA, qualquer antigénio de IPV não adsorvido pode ser detectado pelo método de completitude:
Completitude de adsorção a de adjuvante de Pólio Tipo 1, 2 e 3 não ligado por Elisa São realizadas duas centrifugações sucessivas. 0 sobrenadante é, depois, recolhido e testado, não diluído, em duplicado, em microplacas por ELISA. As placas de microtitulação são revestidas com IgG anti-poliovírus (tipo 1, 2 ou 3) específica de coelho, diluída com tampão de carbonato/bicarbonato (pH 9,6) e incubada, de um dia para o outro, a 4 °C. Após lavagem, é adicionada a solução saturante (solução salina tamponada com fosfatos, sem Ca e Mg, + 1% de BSA) . Os brancos (PBS), sobrenadante e padrão não adsorvido interno são adicionados em duplicado.
Para todas as etapas seguintes, as placas de microtitulação são incubadas durante 1 h 30, a 37 °C e lavadas. IgG anti-poliovírus (tipo 1, 2 ou 3) de coelho conjugada a peroxidase, diluída com tampão de fosfatos (sem Ca e Mg + Tween 20) contendo BSA, é adicionada. A solução de substrato, contendo a tetrametilbenzidina dissolvida em dimetilssulfóxido (DMSO) e diluída em tampão de acetato contendo 69 Η202 a 0,003%, é adicionada, seguida de uma incubação de 15-30 minutos no escuro. A solução de bloqueamento, contendo H2SO4 é, depois, adicionada. No espaço de uma hora, a densidade óptica (O.D.) de cada poço é lida utilizando um fotómetro, regulado a 450 nm, com uma referência a 620 nm. A completitude é considerada positiva (antigénio no sobrenadante) se a OD média da amostra for superior aos valores de OD média de brancos + 3 desvios-padrão e se a OD média da amostra for superior a 0,1.
No caso de completitude positiva, o teor de antigénio é medido pelo método de ELISA, como descrito na segunda etapa da Potência de Pólio Tipo 1, 2 e 3 por ELISA. Método de medição de Unidade Internacional de Opacidade (IOU) A concentração celular (IOU) pode ser determinada utilizando solução padrão de IRPO (Preparação de Referência Internacional de Opacidade) visual ou por medição de absorvência a 660 nm. A opacidade de Suspensão de Estirpe Simples é, depois, determinada através da aplicação da equação de "opacidade atribuída" como se segue: AO= LO/KOxCO; 70 onde AO = opacidade atribuída, LO = opacidade de recolha viva, KO = opacidade de recolha morta e CO = opacidade de concentrado.
RESULTADOS
Determinação da potência de pólio em ratos por seroneutralização à dose padrão 40:8:32
As experiências foram realizadas para determinar a potência de IPV tipos 1, 2 e 3. Os resultados são mostrados na Tabela 8 abaixo (no presente documento, 40:8:32 unidades antigénicas D de IPV tipos 1, 2 e 3, respectivamente, é equivalente a 100% de dose de IPV).
Descrição Potência de IPV (ED50 expresso em IU/dose) Tipo 1 Tipo 2 Tipo 3 Ref. Poliorix 20, 78 8, 88 40, 02 Ref. DTPaHBIPV 3,21 0,57 8, 62 DTPwsf-HB-IPV Método de produção 3 <1,93 0,64 <2,57
Tabela 8. Potência de IPV tipos 1, 2 e 3 em três formulações de vacina diferentes. 71 A formulação DTPwSF-HB-IPV (100% de IPV) apresenta potências de IPV melhores do que a referência Poliorix e semelhante ou melhor do que a referência DTPaHBIPV.
Avaliação da potência de IPV com dosagens reduzidas de IPV A potência é medida por métodos in vitro e in vivo descritos acima. A potência por ELISA de IPV de dose reduzida para ambas as formulações de métodos de produção 3 e 4 foi examinada in vitro e comparada com DTPalPVHB de referência, como mostrado na Tabela 9. Foram testados dois lotes para cada formulação para o método de produção 3. A percentagem de recuperação foi calculada em relação ao teor de antigénio tomado a partir de agregado de IPV para cada formulação (e. g., 40/8/32 para formulação contendo 100% de IPV; 20/8/16 para formulação contendo 50% de IPV; 10/4/8 para formulação contendo 25% de IPV; 5/2/4 para formulação contendo 12,5% de IPV.
TI T2 T3 Amostra Potência de Pólio (% de Recuperação) Carpletitude (% de Recuperação) Potência de Pólio (% de Recuperação) Carpletitude (% de Recuperação) Potência de Pólio (% de Recuperação) Ccnpletitude (% de Recuperação) DTPalPVHB de Referência 82% NP 99% NP 93% NP 72 (continuação)
Amostra TI T2 T3 Potência, de Pólio (% de Recupera ção) Completitude (% de Recuperação) Potência de Pólio (% de Recuperação) Completitude (% de Recuperação) Potência de Pólio (% de Recuperação) Completitude (% de Recuperação) DIPwSF-HB-IFV 1 "Método de Produção 3" 100% de IFV 46% 47% 94% <5% 24% 74% DIPwSF-HB-IFV 2 "Fíátodo de Produção 3" 100% de IPV 80% <5% 100% <5,0% 81% 17% DIPwSF-HB-IPV 1 "Fíátodo de Produção 3" 50% de IPV 48% 31% 98% <5% 29% 64% DIPwSF-HB-IPV 2 "Método de Produção 3" 50% de IPV 71% <5% 99% <5% 91% >5% DIPwSF-HB-IPV 1 "Fíátodo de Produção 3" 25% de IPV 54% 34% 115% <5% 33% 71% DIPwSF-HB-IPV 2 "Fíátodo de Produção 3" 25% de IPV 81% <5% 115% <5% 107% <5% DIPwSF-HB-IPV "Fíátodo de Produção 3" 12,5% de IPV 50% 24% 110% <5% 28% 60% DIPwSF-HB-IPV "Fíátodo de Produção 4" 100% de IPV 41% 48% 93% <5% 23% 51% DIPwSF-HB-IPV "Fíátodo de Produção 4" 50% de IPV 47% 37% 98% <5% 28% 69% DIPwSF-HB-IPV "Método de Produção 4" 25% de IPV 51% 28% 80% <5% 33% 61% 73 (continuação)
Amostra TI T2 T3 Potência, de Pólio (% de Recuperação) Completitude (% de Recuperação) Potência de Pólio (% de Recuperação) Completitude (% de Recuperação) Potência de Pólio (% de Recuperação) Completitude (% de Recuperação) DTPwSF—HB—IPV "Método de Produção 4" 12,5% de IPV 42% 22% 100% <5% 40% 58% Placebo "Método de produção 5" 100% de IPV 86% <5% 98% <5% 107% <5% Placebo "Método de Produção 5" 50% de IPV 94% <5% 110% <5% 111% <5% Placebo "Método de produção 5" 25% de IPV 80% <5% 100% <5% 104% <5% Placebo "Método de produção 5" 12, 5% de IPV 72% <5% 100% <5% 98% <5%
Tabela 9 A Tabela 9 mostra que a completitude de adsorção é semelhante para todas as doses de IPV. 0 Tipo 1 e Tipo 3 são fortemente desorvidos (17% - 74%), enquanto o Tipo 2 permanece bem adsorvido. Os três tipos são bem adsorvidos para a formulação de placebo para todas as doses de IPV. A adsorção é semelhante como para a vacina de referência DTPalPVHB. Há uma variabilidade de completitude de IPV, devido ao facto de que o método de quantificação de completitude não é validado nem para as formulações de IPV DTPwHB nem para 74 concentrações inferiores de IPV (<40/8/32 Unidades antigénicas D/0,5 mL) . A potência relativa (expressa em comparação com a vacina de referência poliorix) de IPV de dose reduzida para ambas as formulações dos métodos de produção 3 e 4 foi examinada in vivo, em comparação com formulações de referência, como mostradas nas Figuras 1 e 2. Foram testados dois lotes para cada formulação para o método de produção 3. A Figura 1 mostra que a potência de IPV de DTPwSF-HB-IPV com 100% de IPV é ligeiramente superior à potência de IPV em DTPaHBIPV. A potência de IPV de DTPwSF-HB-IPV a 50% da formulação, do método de produção 3, pode ser verificada como sendo semelhante a 100% de DTPaHBIPV. A potência de IPV para DTPwSF-HB-IPV a 25%, do método de produção 3, é ligeiramente mais baixa do que para Poliorix®. Também foi verificado que 12,5% da dose de IPV não foi suficiente para obter uma boa potência de IPV. A Figura 2 mostra que a potência de IPV é semelhante para a formulação do método de produção 3 e a formulação do método de produção 4. Também é mostrado que há uma tendência de melhor potência para o placebo do que para DTPwSF-HB-IPV.
Estes dados confirmam, por conseguinte, que uma dose reduzida de IPV é suficiente para obter uma boa potência in vivo. 75
Exemplo 2: Praticabilidade de não utilização de tiomersal em vacinas da invenção 0 Teste de Eficácia de Conservante (PET) permite a demonstração da actividade antimicrobiana da vacina testada. 0 teste consiste de: - provocar a preparação de vacina, na sua etapa de recipiente final, com um inoculo prescrito de microrganismos adequados, - armazenar a preparação inoculada a uma temperatura prescrita - retirar amostras do recipiente em intervalos de tempo especificados e contar os organismos nas amostras retiradas. 0 processo de testagem de PET está descrito na Farmacopeia Europeia (5.1.3) e na USP (<51 >) . De acordo com estas directrizes, a actividade antimicrobiana é avaliada através da comparação da redução no número de microrganismos viáveis com os critérios mencionados na seguinte tabela (Tabela 7). 76
Microrganismos Temp Critérios: Redução 0 1 -1 o EP A EP B EP C USP Bactérias Staphylococus aureus 6h 2 Escherichia coli dl 3 1 Ni* Pseudomonas aeruginosa d7 3 Ni* 1 dl4 3 3 d28 Nr* Ni* Ni* Ni* Levedura e bolores Candida albicans d7 2 Ni* Aspergillus niger dl 4 1 Ni* Ni* d28 Ni* Ni* Ni* Ni*
Tabela 7. Critérios de EP e USP
Nr*: não recuperado Ni*: não aumentado
Exemplo 3: Efeito do componente Hib na potência de IPV e estabilidade de IPV ao longo do tempo A potência relativa de IPV foi medida, como descrito no Exemplo 1, para determinar os efeitos que o componente Hib possa ter na potência de IPV e para avaliar a estabilidade de IPV ao longo do tempo a diferentes doses de IPV. As vacinas investigadas foram DTPwHBIPV(40-8-32), DTPwHBIPV com Hib reconstituído e armazenada durante 8 meses, DTPwHBIPV(20-4-16), DTPwHBIPV(20-4-16) com Hib reconstituído e armazenada durante 77 8 meses, DTPwHBIPV(20-4-16) e armazenada durante 8 meses, DTPwHBIPV(10-2-8) e DTPwHBIPV(10-2-8) com Hib reconstituído e armazenada durante 8 meses. Os valores de RP foram medidos em relação a DTPalPVHB (Pediarix) (Figura 3a) ou Poliorix (Figura 3b) . Verificou-se que o componente Hib não tem impacto na potência de IPV. Verificou-se que a potência relativa de IPV se manteve aos 8 meses (Figura 3).
Exemplo 4: Efeito da razão de A1P04/A1(OH)3 no aspecto visual, na adsorção de D e T e na potência de IPV
As formulações foram realizadas com alteração da composição de Alumínio.
As formulações DTPwSf-HB-IPV contêm, habitualmente, 630 pg de Alumínio: 560 pg de Al3+ como A1P04, 70 pg de A13+ como Al (OH) 3. Os sais de alumínio são utilizados para adsorver D, T, Pw e HBsAg. Durante a formulação são adicionados 115 pg de Al3+ de A1P04 livre. 78
As formulações foram realizadas com as seguintes razões de Al3+ livre: AI(OH)3 pg A13+ A1P04 pg A13+ Lote 1 0 115 Lote 2 23 92 Lote 3 69 46 Lote 4 46 69 Lote 5 92 23 Lote 6 115 0
Tabela 10. Razão de A1P04/A1(OH)3
Etapa Método de produção 3: DTPwSF-HB-IPV 1 Água para injecção para atingir um volume de dose final de 0,5 mL 2 Adicionar NaCl a 1,5 M para atingir uma concentração final de 150 mM 3 Adicionar 115 yg de Al3+ com às diferentes razões AI(OH)3/AIPO4 4 Adicionar 10 yg de HBsAg adsorvido 5 Adicionar 7,5 Lf de toxóide Diftérico adsorvido 6 Adicionar 3,25 Lf de toxóide Tetânico adsorvido 7 Agitar 8 Adicionar IPV a uma dose de 40/8/32 IU 9 Agitar 10 Ajustar 0 pH a 6,5+/-0,1 79 (continuação)
Etapa Método de produção 3: DTPwSf-HB-IPV 11 Agitar 12 Adicionar 20 IOU de Pw adsorvido 13 Agitar 14 Armazenar cL +2 cL + 8 °C
Tabela 11. Método de produção para DTPwHB-IPV 0 aspecto visual foi observado e, até uma razão 69/46, é obtida agregação aceitável.
As formulações foram realizadas com o mesmo método de produção e uma gama de dose para IPV entre 0 e 100% da dose de IPV regular. A percentagem de adsorção de toxóides D e T foi medida por ELISA. A estabilidade da adsorção foi seguida de um tratamento de 7 dias, a 37 °C. Os resultados são apresentados na Tabela 12 e 14. 80 RAZÃO AI (OH) 3/AIPO4 Dose de IPV 0/115 23/92 46/69 T0 7d37°C T0 7d37°C T0 7d37°C PWsf 0% <1% 25% <1% 6% / 25% <1% 29% <1% 1 <1% 5% 50% 3% 41% <1% 26% <1% 17% 100% 4% 49% <1% 23% <1% 11%
Tabela 12. Percentagem de desorção de toxóide D em DTPwHB— IPV com gama de dose de IPV RAZÃO AI (OH) 3/AIPO4 Dose de IPV 0/115 23/92 46/69 T0 7d37°C T0 7d37°C T0 7d37°C PWsf 0% <1% 34% <1 12% / 25% <1% 50% <1 32% <1% 12% 50% 5% 61% <1 51% <1% 33% 100% 8% 63% <1 41% <1% 29%
Tabela 13. Percentagem de desorção de toxóide T em DTPwHB— IPV com gama de dose de IPV A adsorção de IPV foi seguida. A estabilidade da adsorção foi seguida de um tratamento de 21 dias, a 25 °C. 81 IPV Estimativa de Ag não adsorvido RAZÃO AI(OH)3/A1P04 0/115 23/92 46/69 Dose Tipo T0 21d25°C TO 21d25°C TO 21d25°C 0% N/A N/A N/A N/A N/A AGREGAÇÃO 25% Tipo 1 -10-20% -20-30% -10-20% -20-30% <10% -20-30% Tipo 2 <10% <10% <10% <10% <10% <10% Tipo 3 >30% >30% -20-30% >30% <10% >30% 50% Tipo 1 >30% >30% -10-20% >30% -10- 20% >30% Tipo 2 -10-20% -10-20% <10% <10% <10% <10% Tipo 3 >30% >30% -10-20% >30% -10- 20% >30% 100% Tipo 1 >30% >30% -10-20% >30% -10- 20% >30% Tipo 2 -10-20% -10-20% <10% <10% <10% <10% Tipo 3 >30% >30% -20-30% >30% -20- 30% >30%
Tabela 14. Percentagem de desorção de IPV em DTPwHB-IPV com gama de dose de IPV 0 aumento do teor de AI(OH)3 nas formulações permite um melhoramento de adsorção para D, T e IPV. A melhor razão de adsorção obtida foi com a razão AI(OH)3/AIPO4 de 46/69. 82 A esta razao: A adsorção de T e D é completa em TO. A desorção após um estudo de estabilidade acelerada de 7 dias, a 37 °C, apresenta <20% de desorção para D, <30% para T.
Cada tipo de IPV é adsorvido. A desorção do Tipo 3 ocorre 21 dias a 25 °C.
As formulações com a razão 46/69 foram testadas in vivo e comparadas com Tetravac, Poliorix e uma vacina DTPaTPV.
Amostra ED50 Tipo 1 Tipo 2 Tipo 3 DTPw-HB-IPV 100%/Razão HIB 46/69 <1,93 <0,64 2,57 DTPw-HB-IPV 50%/Razão HIB 46/69 <1,59 0, 46 <1,67 DTPw-HB-IPV 25%/Razão HIB 46/69 3,08 0,96 3,25 Tetravac 8,53 0,39 9,15 Poliorix 9,52 2,64 15, 06 DTPaHBIPV <5, 18 <0,64 15, 01
Tabela 15. Resultados de potências in vivo 83 Não há diferenças (ED50) significativas entre as formulações de DTPw-HB-IPV. DTPaHBIPV, Tetravac e Poliorix dão resultados semelhantes, inferiores às formulações de DTPw-HB-IPV (à excepção do tipo 2, relativamente à qual todas as formulações são equivalentes).
Exemplo 5: Avaliação clínica da vacina DTPw-HBV-IPV/Hib de investigação com dosagens reduzidas de IPV É planeado um estudo de praticabilidade de Fase II, de modo a avaliar a imunogenicidade, reactogenicidade e segurança de três formulações diferentes da vacina DTPw-HBV-IPV/Hib de investigação da GSK Biologicals, em comparação com as vacinas comerciais DTPw-HBV/Hib e IPV administradas concomitantemente. • Indicação/populações:
Imunização primária de bebés saudáveis na primeira semana de vida contra doenças de difteria, tétano, tosse convulsa, hepatite B, poliomielite e Haemophilus influenzae tipo b.
Grupos de estudo:
Vacina DTPw-HBV-IPV(dose padrão)/Hib Vacina DTPw-HBV-IPV(49% de dose padrão)/Hib Vacina DTPw-HBV-IPV(26% de dose padrão)/Hib 84 DTPw-HBV/Hib + vacinas de IPV • Objectivos co-primários:
Os objectivos co-primários serão avaliados em modo sequencial: i. e., o segundo e terceiro objectivos serão avaliados, apenas se o anterior tiver sido cumprido. S Demonstrar a não inferioridade da vacina DTPw-HBV-IPV (dose padrão)/Hib em relação à vacina de IPV co-administrada com a vacina DTPw-HBV/Hib, em termos de resposta de anticorpo aos três tipos de poliovirus, um mês após o programa de vacinação primária. 0 objectivo de não inferioridade será atingido se o limite superior do Cl de 95% assimptótico padronizado na diferença entre grupos (DTPw-HBV/Hib + IPV menos DTPw-HBV-IPV (dose padrão)/Hib), em termos de taxas de seroprotecção para cada dos três tipos de poliovirus, for ^ 10%.
Demonstrar a não inferioridade da vacina DTPw-HBV-IPV (49% de dose padrão) /Hib em relação à vacina de IPV co-administrada com a vacina DTPw-HBV/Hib, em termos de resposta de anticorpo aos três tipos de poliovirus, um mês após o programa de vacinação primária. 0 objectivo de não inferioridade será atingido se o limite superior do Cl de 95% assimptótico padronizado na diferença entre grupos (DTPw-HBV/Hib + IPV menos DTPw-HBV-IPV (49% de 85 dose padrao)/Hib), em termos de taxas de seroprotecção para cada dos três tipos de poliovírus, for ^ 10%. ν' Demonstrar a não inferioridade da vacina DTPw-HBV-IPV(26% de dose padrão) /Hib em relação à vacina de IPV co-administrada com a vacina DTPw-HBV/Hib, em termos de resposta de anticorpo aos três tipos de poliovírus, um mês após o programa de vacinação primária. O objectivo de não inferioridade será atingido se o limite superior do Cl de 95% assimptótico padronizado na diferença entre grupos (DTPw-HBV/Hib + IPV menos DTPw-HBV-IPV (26% de dose padrão)/Hib), em termos de taxas de seroprotecção para cada dos três tipos de poliovírus, for ^ 10%. • Objectivos secundários:
Imunogenicidade
Avaliar a imunogenicidade da vacina candidata DTPw-HBV-IPV/Hib, em termos de resposta a todos os antigénios de vacina, em comparação com as vacinas DTPw-HBV/Hib e IPV co-administradas. 86
Reactogenicidade
Avaliar a reactogenicidade e segurança das vacinas de estudo, em termos de sintomas solicitados, sintomas não solicitados e eventos adversos graves. • Programa de vacinação
Programa de vacinação primária de três doses a 6, 10 e 14 semanas de idade. Todos os indivíduos recebem uma dose de nascimento de Hepatite B. • País:
Filipinas • Amostragem de sangue:
Pré- e pós-vacinação 3 87
Formulações de vacina:
Vacina Formulação/dose Apresentação Volume DTPw-HBV-IPV/Hib da Toxóide diftérico: não Líquido 0,5 mL da vacina GSK Biologicals inferior a 30 IU (7,5 Lf) esbranquiçado reconstituída Toxóide tetânico: não inferior a 60 IU (3,25 Lf) Bordetella pertussis, morta: não inferior a 4 IU (20 OU) r-ADN de HBsAg: 10 pg Alumínio como sais: 0,66 mg em frasquinhos monodose Componente de IPV Poliovírus Inactivado tipo 1: (dose padrão) 40 unidades antigénicas D Poliovírus Inactivado tipo 2: 8 unidades antigénicas D Poliovírus Inactivado tipo 3: 32 unidades antigénicas D Componente de IPV 49% de dose padrão completa de (49% de dose IPV (40-8-32) padrão) Componente de IPV 26% de dose padrão completa de (26% de dose IPV (40-8-32) padrão) Conjugado de Haemophilus Sedimento influenzae tipo b capsular liofilizado em polissacárido: 2,5 pg e toxóide Tetânico: 5-10 pg Lactose: 12,6 mg Alumínio como sais: 30 pg frasquinhos monodose DTPw-HBV/Hib Toxóide diftérico: não Líquido 1 mL da vacina (Zilbrix™ Hib) da inferior a 30 IU (7,5 Lf) esbranquiçado reconstituída (continuação)
Vacina Formulação/dose Apresentação Volume GSK Biologicals Toxóide tetânico: não inferior a 60 IU (3,25 Lf) Bordetella pertussis, morta: não inferior a 4 IU (20 OU) r-ADN de HBsAg: 10 pg Alumínio como sais: 0,66 mg Tiomersal: 8 pg em frasquinhos de duas doses Conjugado de Haemophilus influenzae tipo b capsular polissacárido: 2,5 pg e toxóide Tetânico: 5-10 pg Lactose: 12,6 mg Alumínio como sais: 30 pg Sedimento liofilizado em frasquinhos de duas doses IPV (Poliorix™) da GSK Biologicals Poliovírus Inactivado tipo 1: 40 unidades antigénicas D Poliovírus Inactivado tipo 2: 8 unidades antigénicas D Poliovírus Inactivado tipo 3: 32 unidades antigénicas D 2-fenoxietanol, máx. 2,5 mg Polissorbato, máx. 50 pg Formaldeído, máx. 100 pg Solução salina tamponada com fosfatos Contém aminoácidos para injecção, q.s, 0,5 mL de ad Líquido esbranquiçado em frasquinhos monodose 0,5 mL
Tabela 16. Formulações de vacina 89
PRÉ-ADSORÇÃO DOS ANTIGÉNIOS A formulação DTPw-HBV-IPV combina toxóide diftérico, toxóide tetânico, três estirpes de Bordetella pertussis, o antigénio de superfície principal purificado (HBsAg) do vírus de Hepatite B (HBV) e o poliovirus inactivado (IPV). Estes antigénios, excepto IPV, foram, em primeiro lugar, pré-adsorvidos em sal de alumínio, antes de serem misturados com sal de alumínio, tampão de cloreto de sódio e água para injecção.
Adsorção de toxóide diftérico 0 concentrado purificado diftérico foi adsorvido em fosfato de alumínio, numa razão de 15 Lf de toxóide Diftérico/0,15 mg de A13+. Os dois componentes foram agitados, durante 15 até 45 minutos, à temperatura ambiente. 0 pH foi ajustado para pH 5,1 ± 0,1, seguido de agitação, durante 15 a 45 minutos. A mistura foi armazenada, durante uma semana, a 37 °C. Após agitação de 15 a 45 minutos, à temperatura ambiente, o pH foi ajustado para pH 6,1 ± 0,1. 0 concentrado adsorvido foi armazenado a +2 °C - +8 °C durante, pelo menos, 7 dias, antes da formulação final da vacina DTPw-HB-IPV. A Figura 1, mais abaixo, destaca o processo de preparação de adsorção do agregado Diftérico pré-adsorvido. 90
Fluxograma de adsorção de toxóide diftérico AIPO* D (15 Lf/0,15 mg de Al3+) l
Agitar 15 a 45 minutos, à temperatura ambiente Ajustar e verificar o pH (5,1 ± 0,1) 4-
Agitar 15 a 45 minutos, à temperatura ambiente 4
Adsorção, 7 dias a 37 °C Φ
Agitar 15 a 45 minutos, à temperatura ambiente Ajustar e verificar o pH (6,1 ± 0,1) i
Armazenar, no mínimo, 7 dias, a +2 °C - +8 °C antes da formulação
Adsorção de toxóide tetânico 0 concentrado tetânico purificado foi adsorvido em hidróxido de alumínio, numa razão de 3,25 Lf/0,07 mg de Al3+. Os dois componentes foram agitados, durante 15 a 20 minutos. 0 pH foi ajustado a pH 6,1 ± 0,1. A mistura foi armazenada, sob agitação, durante 16 a 24 horas, à temperatura ambiente. Foi adicionada uma solução de cloreto de sódio de 1500 mM de concentração nominal (ad a 150 mM) . Após agitação de 15 a 45 minutos, à temperatura ambiente, o pH foi ajustado para pH 6,1 ± 0,1. 0 concentrado adsorvido foi armazenado a + 2 °C - +8 °C durante, pelo menos, 14 dias, antes da formulação final da vacina DTPw-HBV-IPV. 91
Fluxograma de adsorção de toxóide tetânico AI(OH)3 i T (3,25 Lf/0,07 mg de Al3+)
Agitar 15 a 20 minutos, à temperatura ambiente 4
Ajustar e verificar o pH, 6,1 ± 0,1 i
Agitar 16 horas a 24 horas, à temperatura ambiente
I
NaCl a 1500 mM (ad a 150 mM) i
Agitar 15 a 45 minutos, à temperatura ambiente i
Ajustar e verificar o pH (6,1 ± 0,1) i
Armazenar, no minimo, 14 dias, a +2 °C - +8 °C antes da formulação
Adsorção de antigénio de Hepatite B 0 agregado de HBsAg purificado estéril foi misturado com uma suspensão estéril de fosfato de alumínio, de modo a obter uma suspensão que contém, por 10 pg, HBsAg, 0,2 mg de Al3+ (como fosfato de alumínio) , NaCl a 150 mM, num volume final de cerca de 50 pL. 92
Processo de adsorção de HBsAg HBsAg (10 pg/0,5 mL) 4.
Al3+1 (0,2 mg/0,5 mL) (A1P04)
Agitar 15-20 minutos, à temperatura ambiente Ajustar e verificar o pH (5,3 ± 0,1) Agitar 16-24 horas, à temperatura ambiente i
Ajustar o pH a 6,1 ± 0,1 4r
Armazenar 14 dias, à temperatura ambiente i
Armazenamento a 4 °C
Adsorção de antigénio Pw A solução de AIPO4 foi transferida, de modo asséptico, para dentro de um recipiente estéril. A solução foi agitada, durante 5 a 10 minutos e o pH foi ajustado para 6,5 +/- 0,1 com HC1 a 1 M ou NaOH a 0,5 M, directamente no recipiente. A solução foi agitada durante 15-20 minutos. 0 pH foi verificado (6,5 +/- 0,1) e ajustado, se necessário.
Antes da adsorção, a recolha agrupada de tosse convulsa (PPH) foi misturada durante um minimo de 15 minutos, antes da utilização e, depois, o PPH foi adicionado ao recipiente estéril contendo o A1P04. A suspensão foi agitada durante um minimo de 15 minutos, à temperatura ambiente e poderia ser armazenada, de um dia para o outro, à temperatura ambiente. Se o produto fosse armazenado, de um dia para o outro, à temperatura ambiente, 93 tinha de ser ressuspenso durante um mínimo de 30 minutos, antes da distribuição. As amostras foram retiradas para testagem. O agregado de Pw adsorvido foi distribuído para dentro de garrafas de vidro estéreis e armazenadas a 2-8 °C.
Fluxograma de adsorção de Pw
Transferir o A1P04 em reservatório de aço inoxidável estéril i
Ajustar o pH para 6,5 ± 0,1 i
Agitar 15-20 minutos, à temperatura ambiente i
Verificar o pH e ajustar se necessário (6,5 +/- 0,1) Adicionar o PPH no reservatório de aço inoxidável estéril i
Agitar, no minimo, 15 minutos, à temperatura ambiente
I
Distribuição em garrafa de vidro i
Armazenamento do Pw adsorvido a 2-8 °C
FORMULAÇÃO FINAL DTPW-HBV-IPV 0 processo foi realizado como se segue: - A solução de cloreto de sódio e água foi misturada para injecções, de modo a alcançar uma concentração final de NaCl a 150 mM. 94
Foi adicionado A1P04, de modo a obter uma concentração de Al3+ livre de 0,115 mg/dose
Foram adicionados os concentrados adsorvidos de HEF, difteria e tétano, de modo a obter uma concentração final de 10 pg de HBsAg, 7,5 Lf de toxóide diftérico e 3,25 Lf de toxóide tetânico por dose de 0,5 mL.
Foi adicionado IPV, de modo a obter uma concentração final de 40/8/32 ou 19,6/3,9/15,7 ou 10,4/2,1/8,3 UI/d.
Agitar suavemente, durante 60 até 120 minutos, à temperatura ambiente. O pH foi ajustado a 6,5 +/- 0,1.
Agitar durante 15 até 20 minutos, à temperatura ambiente. O pH foi verificado: 6,5 +/- 0,1
Foi adicionado concentrado de Pw adsorvido, de modo a obter uma concentração final de 20 IOU por dose de 0,5 mL.
Agitar durante 15 a 45 minutos, à temperatura ambiente. O pH foi medido O agregado final foi armazenado entre +2 °C e +8 °C, até ao enchimento. 95
Fluxograma de formulação da vacina DTPw-HBV
WFI a 0,5 mL 4
NaCl a 1,5 M a 150 mM 4 A1P04 (115 pg de Al3+) HBsAg adsorvido, 10 pg 4
Diftérico adsorvido a 7,5 Lf 4
Tetânico adsorvido a 3,25 Lf 4 IPV 10/8/32 ou 19,6/3,9/15,7 ou 10,4/2,1/8,3 Ol/d 4
Agitar 60 min. até 120 min., à temperatura ambiente 4
Ajustar e verificar o pH (6,5 +/- 0,1) 4
Pw adsorvido a 20 IOU 4
Agitar 15 min. até 45 min., à temperatura ambiente
Exemplo 6: Avaliação clínica da vacina DTPa-HBV-IPV/Hib de investigação com dosagens reduzidas de Hib e IPV É planeado um estudo exploratório de Fase II, de modo a avaliar a imunogenicidade, reactogenicidade e segurança de 4 formulações diferentes da vacina DTPa-HBV-IPV/Hib de investigação da GSK Biologicals versus a vacina comercial DTPa-HBV-IPV/Hib e as vacinas comerciais DTPw-HBV/Hib e IPV administradas concomitantemente. 96
Indicação/populações:
Imunização primária de bebés saudáveis na primeira semana de vida contra doenças de difteria, tétano, tosse convulsa, hepatite B, poliomielite e Haemophilus influenzae tipo b. • Grupos de estudo:
Vacina DTPa-HBV-IPV(49% de dose padrão)/Hib, 5 pg Vacina DTPa-HBV-IPV(49% de dose padrão)/Hib, 2,5 pg Vacina DTPa-HBV-IPV(26% de dose padrão)/Hib, 5 pg Vacina DTPa-HBV-IPV (26% de dose padrão)/Hib, 2,5 pg Vacina DTPa-HBV-IPV/Hib DTPw-HBV/Hib + vacinas de IPV • Objectivos primários:
Avaliar a imunogenicidade das vacinas candidatas DTPa-HBV-IPV/Hib, em termos da resposta a PRP e aos três antigénios de pólio (pólio 1, 2 e 3). 97
Objectivos secundários:
Imunogenicidade
Avaliar a imunogenicidade de todas as vacinas de estudo em termos de resposta a todos os antigénios de vacina.
Reactogenicidade
Avaliar a reactogenicidade e segurança das vacinas de estudo, em termos de sintomas solicitados, sintomas não solicitados e eventos adversos graves. • Programa de vacinação
Programa de vacinação primária de três doses desde as 6 semanas de idade. Todos os indivíduos recebem uma dose de nascimento de Hepatite B. • País:
TBC
Amostragem de sangue:
Pré- e pós-vacinaçao 3 98
Formulações de vacina: A vacina é constituída por duas partes: uma parte líquida (DTPa-HB-IPV) e uma parte liofilizada (Hib). D, T, PT, FHA, PRN e HBsAg são preliminarmente pré-adsorvidos. Água e NaCl são combinadas com os diferentes antigénios. A mistura é agitada para homogeneizar e o pH é ajustado. A composição final da parte DTPa-HB-IPV da vacina é apresentada na tabela mais abaixo.
Componente Quantidade Toxóide D 25 Lf Toxóide T 10 Lf PT 25 pg FHA 25 pg PRN co HBsAg 10 pg IPV tipo 1 40 ou 19,6 ou 10,4 IU IPV tipo 2 8 ou 3,9 ou 2,1 IU IPV tipo 3 32 ou 15,7 ou 8,3 IU Al3 + Desde 700 a 790 pg
Tabela 17. Composição para uma dose humana de 0,5 mL de DTPa-HBV-IPV 0 Hib está pré-adsorvido. 0 Hib pré-adsorvido é misturado com sacarose ou lactose, antes da liofilização. A quantidade de 99
Hib será 2,5 ou 5 ou 10 yg por dose humana. O teor de alumínio será desde 30 a 120 yg de Al3+, como A1P04, por dose humana.
Lisboa, 27 de Julho de 2012 100

Claims (16)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Método de preparação de uma vacina de combinação compreendendo poliovirus tipo 1 inactivado para imunização de um hospedeiro humano, compreendendo as etapas de: misturar toxóide diftérico e toxóide tetânico, seguida pela adição de poliovirus tipo 1 inactivado numa dose superior a 10 unidades antigénicas D e inferior a 20 unidades antigénicas D.
  2. 2. Método da reivindicação 1, em que a vacina compreende poliovirus tipo 1 inactivado a 26-49%, 30-45%, 33-40% ou 35-37% de uma dose padrão de 40 unidades antigénicas D.
  3. 3. Método da reivindicação 1 ou 2, em que a vacina compreende ainda poliovirus tipo 3 inactivado a uma dose de 8-20 unidades antigénicas D, 9-19 unidades antigénicas D, 10-18 unidades antigénicas D, 11-17 unidades antigénicas D, 12-16 unidades antigénicas D ou 13-15 unidades antigénicas D.
  4. 4. Método das reivindicações 1-3, em que a vacina compreende ainda poliovirus tipo 2 inactivado a uma dose de 2-4 unidades antigénicas D.
  5. 5. Método das reivindicações 1-4, compreendendo a etapa subsequente de ajustar o pH a 6,5±0,5 ou pH 5,9-7,2 ou pH 6-7 ou pH 6,2-6,8 ou pH 6,4-6,6.
  6. 6. Método das reivindicações 1-5, compreendendo as etapas subsequentes de adicionar componente(s) de tosse convulsa 1 acelular ou de célula intacta morta e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
  7. 7. Método da reivindicação 6, em que está presente fosfato de alumínio livre, antes da adição dos antigénios.
  8. 8. Método das reivindicações 1-7, compreendendo a etapa adicional de adicionar antigénio de superfície da hepatite B, antes do ajuste de pH ou antes da adição de IPV.
  9. 9. Método das reivindicações 1-7, compreendendo a etapa adicional de misturar um ou mais antigénios de um patogénio seleccionado da lista consistindo de: Haemophilus influenzae b, Neisseria meningitidis tipo A, Neisseria meningitidis tipo C, Neisseria meningitidis tipo W, Neisseria meningitidis tipo Y, Neisseria meningitidis tipo B, Salmonella typhi e hepatite A, com toxóide diftérico, toxóide tetânico e poliovírus inactivado tipos 1, 2 e/ou 3, antes do ajuste de pH, ou método da reivindicação 8, compreendendo a etapa adicional de misturar um ou mais antigénios de um patogénio seleccionado da lista consistindo de: Haemophilus influenzae b, Neisseria meningitidis tipo A, Neisseria meningitidis tipo C, Neisseria meningitidis tipo W, Neisseria meningitidis tipo Y, Neisseria meningitidis tipo B, Salmonella typhi e hepatite A, com toxóide diftérico, toxóide tetânico e poliovírus inactivado tipos 1, 2 e/ou 3 e antigénio de superfície da hepatite B, antes do ajuste de pH. 2
  10. 10. Método das reivindicações 1-9, em que a vacina compreende IPV de tipos 1, 2 e 3 adsorvidos em hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio ou numa mistura de ambos, em que a adsorção ocorre antes de misturar com antigénio diferente de IPV ou, em que a adsorção ocorre após misturar com o antigénio diferente de IPV.
  11. 11. Método das reivindicações 1-10, em que a vacina compreende um conjugado de uma proteína transportadora e o sacárido capsular de Haemophilus influenzae tipo B (Hib).
  12. 12. Método da reivindicação 11, em que o referido conjugado está adsorvido em fosfato de alumínio ou não adsorvido no adjuvante e, em que a adsorção ocorre antes ou depois de misturar com outros antigénios.
  13. 13. Método das reivindicações 1-12, em que a vacina compreende um ou mais de: Bordetella pertussis célula intacta morta (Pw); dois ou mais componentes acelulares de tosse convulsa (Pa); um ou mais conjugados de uma proteína transportadora e um sacárido capsular de uma bactéria seleccionada do grupo de Neisseria meningitidis tipo A, Neisseria meningitidis tipo C, Neisseria meningitidis tipo W e Neisseria meningitidis tipo Y; Neisseria meningitidis tipo B (MenB) ou vesículas de membrana externa ou LOS ou um sacárido capsular MenB conjugado, ou seu derivado; um sacárido Vi de Salmonella typhi conjugado a uma proteína transportadora; ou um antigénio da hepatite A.
  14. 14. Método de qualquer uma das reivindicações 1-13, em que a vacina compreende toxóide diftérico e/ou toxóide tetânico 3 adsorvido em hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio, ou uma mistura de ambos, em que a adsorção ocorre antes ou depois de misturar com outros antigénios.
  15. 15. Método das reivindicações 1-14, em que o teor de alumínio total na vacina é 200-1000 pg, 300-900 pg, 400-800 pg, 500-700 pg ou em torno de ou exactamente 630 pg de Al3+ por 0,5 mL de dose.
  16. 16. Método de qualquer uma das reivindicações 1-15, em que o IPV tipo 1, se presente na vacina, é a estirpe Mahoney; e/ou em que o IPV tipo 2, se presente na vacina, é a estirpe MEF-1; e/ou em que o IPV tipo 3, se presente na vacina, é a estirpe Saukett. Lisboa, 27 de Julho de 2012 4
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