WO2022114921A1 - 알루미늄 부형제를 이용하여 다가 혼합백신 내 백일해 균 유래 엔도톡신 제거 방법 - Google Patents
알루미늄 부형제를 이용하여 다가 혼합백신 내 백일해 균 유래 엔도톡신 제거 방법 Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a method for removing endotoxin derived from pertussis bacteria in a multivalent mixed vaccine comprising the step of pre-adsorbing an aluminum excipient and a stock solution of dead pertussis vaccine, a method for producing a multivalent mixed vaccine from which endotoxin is removed, and a multivalent mixed vaccine composition from which endotoxin is removed will be.
- a combination vaccine is a vaccine composed of two or more antigens and is intended to prevent one or more infections or to prevent infections caused by different types or serotypes of the same microorganism.
- Combination vaccines allowing simultaneous administration of Diphtheria, Tetanus and other antigens have been in use since the mid-20th century.
- DTwP-based and DTaP-based combined vaccines are widely used worldwide.
- DTwP-based combined vaccines are mainly exported to underdeveloped countries through international organizations such as the United Nations.
- the DTwP-based whole-cell pertussis vaccine uses the pertussis bacteria as a vaccine after detoxifying the pertussis bacteria through heat treatment/formalin treatment, etc., and is called a whole-cell pertussis vaccine.
- Pertussis is caused by Bordetella pertussis , and clinical symptoms persist for 6 to 10 weeks without complications. Complications include convulsions, pneumonia, encephalopathy, and death.
- LPS lipopolysaccharide
- LPS When LPS flows into the bloodstream of the human body, the lipid A region of LPS acts as a toxic pyrogen to activate the immune system. cause fatal symptoms. For this reason, LPS is widely known as endotoxin, meaning that it is a toxin derived from the cell, and its content is very strictly regulated in all biologics and food manufacturing processes according to the regulations of the US FDA.
- the present inventors made diligent efforts to reduce the side effects of the multivalent combined vaccine and solve the vaccine stability problem for infants and young children. By establishing a process capable of rapidly lowering the content, the present invention was completed.
- One object of the present invention is to provide a method of removing endotoxin derived from pertussis bacteria in a multivalent combination vaccine, comprising the step of pre-adsorbing the dead pertussis vaccine stock solution in an aluminum vehicle before mixing with other antigens of the multivalent combination vaccine.
- Another object of the present invention is to (a) mixing the tetanus vaccine (T), the diphtheria vaccine (D), and the hepatitis B vaccine (HBsAg) with an aluminum excipient; (b) mixing the whole cellular pertussis vaccine (wP) in which the content of endotoxin is lowered by pre-adsorption of the dead pertussis vaccine stock solution to an aluminum excipient in the mixture of step (a); And (c) adding and mixing the Haemophilus influenzae conjugated vaccine (Hib) and the inactivated polio virus vaccine (sIPV) in the mixture of step (b); It is to provide a method for producing a multivalent mixed vaccine, in which the content of is reduced.
- Another object of the present invention is diphtheria (D), tetanus (T), whole-cell pertussis (wP), hepatitis B vaccine (HBsAg), haemophilus influenzae conjugated vaccine type b (Hib) and inactivated polio virus vaccine ( sIPV,), to provide a multivalent mixed vaccine composition, characterized in that the whole cellular pertussis (wP) is pre-adsorbed to an aluminum excipient and added thereto.
- D diphtheria
- T tetanus
- wP whole-cell pertussis
- HBsAg hepatitis B vaccine
- Hib haemophilus influenzae conjugated vaccine type b
- sIPV inactivated polio virus vaccine
- the present invention by reacting the aluminum excipient and the dead pertussis vaccine stock solution in advance to adsorb the pertussis cells to the aluminum excipient, it is effective in rapidly lowering the content of endotoxin in the multivalent combination vaccine using the pertussis antigen.
- FIG. 1 shows a schematic diagram of a general multivalent mixed vaccine manufacturing method.
- Figure 2 shows a schematic diagram of a method for producing a multivalent mixed vaccine including the pre-adsorption step of the present invention.
- FIG 3 shows the results of changes in the endotoxin content according to the conventional manufacturing method and the manufacturing method of the present invention including the pre-adsorption process step.
- Figure 6 shows the basis for the optimization of pre-adsorption.
- One aspect embodying the present invention provides a method of removing endotoxin derived from pertussis bacteria in a multivalent combination vaccine, comprising the step of pre-adsorbing the dead pertussis vaccine stock solution in an aluminum excipient before mixing with other antigens of the multivalent combination vaccine. .
- the method follows the order of the method for producing a multivalent mixed vaccine generally produced, and the whole-cell pertussis vaccine may be pre-adsorbed to an aluminum excipient to lower the endotoxin content and then mixed, but is not limited thereto.
- the term “whole cell pertussis vaccine (wP, whole cell pertussis)” refers to a vaccine in which pertussis bacteria are detoxified through heat treatment/formalin, etc. and then the bacteria itself is used as a vaccine.
- the causative agent of whooping cough is Bordetella pertussis , a gram-negative polymorphic bacillus that is difficult to cultivate. It is mainly invented in infants and children and can cause acute respiratory diseases.
- side effects continuous fever, redness and edema, convulsions, encephalopathy, etc.
- the side effects as described above can be caused by the endotoxin possessed by Gram-negative bacteria, so it is important to lower the content of endotoxin.
- the present invention in order to efficiently lower the endotoxin content of the whole-cell pertussis vaccine, it is the first to develop a multivalent mixed vaccine production process that can reduce endotoxin as much as possible while maintaining the antigenicity of the dead pertussis vaccine stock solution by pre-adsorption under optimized conditions using an aluminum excipient. It is significant that it has been established.
- endotoxin refers to lipopolysaccharide and lipopolysaccharide (LPS) that form the outer cell membrane of Gram-negative bacteria together with proteins and phospholipids. Endotoxins occur only in Gram-negative bacteria and play important roles in the organization, stability and barrier function of the outer cell membrane. Many bacteriophages use endotoxin or general lipopolysaccharide as a specific method to find their host bacteria.
- Endotoxin is a biomolecule that can be found in almost all aqueous solutions without a separate preventive measure.
- the lipid A region of LPS acts as a toxic pyrogen to activate the immune system and cause various inflammatory (inflammatory) effects.
- overexpression of cytokines can lead to fatal symptoms such as high fever, hypotension due to vasodilation and septic shock.
- the method of removing endotoxin derived from pertussis bacteria in the multivalent combined vaccine of the present invention uses the conventional polyvalent combined vaccine manufacturing method as it is, and uses the unique properties of aluminum excipients to efficiently reduce the content of endotoxin in the dead pertussis vaccine stock solution. can be lowered
- the pH was adjusted to find a point where the adsorption power to endotoxin was maximized.
- the term “pre-adsorption” refers to the step of reacting the dead pertussis vaccine stock solution with an aluminum excipient under optimal conditions in the conventionally generally used multivalent mixed vaccine manufacturing method step.
- the pre-adsorption with an aluminum excipient is about pH 2 to 4, about pH 2 to 3.5, about pH 2.1 to 2.8, about pH 2.3 to 2.8, about pH 2.3 to 3, about pH 2.35 to 3, about pH 2.4 to 3 , about pH 2.3 to 3.5, about pH 2.35 to 3.5, about pH 2.4 to 3.5, or about pH 2.5 at about 3 to 6 hours, about 3.5 to 5.5 hours, may be carried out under the reaction conditions of about 4 to 5 hours, not limited Under low pH conditions, aluminum phosphate gel becomes positively charged, and it becomes possible to adsorb and remove negatively charged proteins such as endotoxin.
- the adsorption effect is not high because it is electrically neutral or positively charged, there is a possibility of damaging the vaccine stock solution, and the antigen value may be lowered.
- the pH is 3.5 or higher, the adsorption rate of the pertussis pertussis vaccine to the aluminum excipient may be lowered.
- pertussis pre-adsorbed to an aluminum excipient may include a step of reducing to about pH 6 to 7, about pH 6.1 to 6.9, about pH 6.2 to 6.8, about pH 6.3 to 6.7, or about pH 6.6 to terminate the reaction.
- the present invention is not limited thereto.
- the pH is adjusted to 2.5 ⁇ 0.2 (pH 2.3 to pH 2.7) using 1N HCl, and the pH is 2.5 ⁇ 0.2 (pH 2.3 to pH 2.3). 2.7)
- stop the input of 1N HCl and proceed with the adsorption reaction process for 4 hours 30 minutes ⁇ 1 hour.
- neutralization is performed using 1N NaOH so that the pH becomes 6.6 ⁇ 0.2, and when the neutralization titration is completed, the mixture is stirred for 30 minutes or more.
- the aluminum phosphate-pertussis mixed stock solution after the pre-adsorption process has been completed may be stored at 2-8° C. until use or may be added according to the input time of the mixed vaccine main process, but is not limited thereto.
- aluminum excipient refers to a substance that acts to enhance the immunogenicity of an immunogenic composition.
- the aluminum excipient may be used in combination with a pharmaceutically acceptable adjuvant.
- Adjuvants of the present invention are often provided to boost the immune response and are well known to those skilled in the art.
- the aluminum excipient may be aluminum hydroxide gel, aluminum phosphate gel, or a combination thereof, and specifically, aluminum phosphate gel, but is not limited thereto.
- the present inventors have established a new process by using the property of removing endotoxins when aluminum phosphate gel, an aluminum excipient, which is not simply used for adjuvant, is pre-adsorbed with the whole cell pertussis dead vaccine stock solution.
- aluminum hydroxide gel has superior endotoxin adsorption capacity compared to aluminum phosphate gel (Vaccine, Vol 19, No 13-14, p1747 ⁇ 1752, 2001 Feb 8 ), but it can be seen that, in the method of the present invention, aluminum phosphate gel is superior to aluminum hydroxide gel in removing endotoxin from whole-cell pertussis dead vaccine stock solution. This is due to the intrinsic properties of aluminum phosphate gel, which is a unique property of aluminum phosphate gel, which the present inventors discovered for the first time and provided this new process.
- endotoxin when endotoxin is adsorbed to the aluminum excipient, the activity of endotoxin disappears or decreases, and the endotoxin is adsorbed to aluminum phosphate gel and is not released in the human body, so it may be using the principle that it cannot express its toxicity, but is not limited thereto. .
- endotoxin can be adsorbed due to its physical properties different from aluminum phosphate. Specifically, by using electrostatic interaction, endotoxin can be adsorbed without a separate process such as a pre-adsorption step. However, when comparing the endotoxin content in the final process, it can be seen that the endotoxin content in the multivalent mixed vaccine prepared by the manufacturing method of the present invention is low (FIG. 5).
- the aluminum excipient is added to the step of pre-adsorbing a portion of the total input amount input to the conventionally used multivalent mixed vaccine manufacturing method with the stock solution of the dead pertussis vaccine.
- the total amount of the aluminum excipient input in the polyvalent mixed vaccine manufacturing method used in general is 100
- the amount of the aluminum excipient input in the pre-adsorption step may be about 10
- input to the pre-adsorption step The ratio of all aluminum excipients except for the aluminum excipient used in the pre-adsorption step may be about 9:1, but is not limited thereto.
- the aluminum excipient added in the pre-adsorption step is about 5% to about 15%, about 6% to about 13%, about 7% to about 11%, or about It may be 10%, but is not limited thereto.
- using about 10% of the aluminum excipient is to use the minimum amount of the total amount of aluminum in the range where endotoxin is reduced by the target value and used for the adsorption reaction, and the remaining aluminum excipient is not insufficient to adsorb other antigens. should not be, but is not limited thereto.
- the term “about” includes all values within a range including ⁇ 0.5, ⁇ 0.4, ⁇ 0.3, ⁇ 0.2, ⁇ 0.1, etc., and includes all values in a range equal to or similar to the value following the term about, but not limited
- multivalent vaccine refers to a mixture of two or more vaccines capable of generating immunogenicity against an antigen, and includes two or more vaccines that cause immunogenicity against different sites within the same antigen or against two or more antigens. It may include a vaccine.
- the multivalent combination vaccine of the present invention is a diphtheria vaccine (D, Diphtheria), a tetanus vaccine (T, Tetanus), a whole-cell pertussis vaccine (wP), an inactivated polio virus vaccine (sIPV), hepatitis B Vaccine (HBsAg), and/or may include, but is not limited to, Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine (Hib).
- the multivalent combination vaccine may be used in liquid form, but is not limited thereto.
- the diphtheria vaccine (D, Diphtheria) detoxifies diphtheria toxin with formalin to make diphtheria toxoid and uses it as a vaccine.
- the symptoms of diphtheria are upper respiratory tract infections with a sore throat and mild fever, with a membrane that does not fall off easily on the tonsils, pharynx, and nose without any specific cause. Occasionally, it can cause skin, conjunctival and genital infections.
- the tetanus vaccine (T, Tetanus) detoxifies tetanus toxin with formalin to make tetanus toxoid and uses it as a vaccine.
- the causative bacterium is Clostridium tetani , an anaerobic Gram-positive bacillus that produces spores, and it is a neurological disease that causes severe muscle spasm by secreting exotoxin that binds to the central nervous system. It is caused by invading through wounds on the skin and mucous membranes, and symptoms appear gradually, and severe muscle contraction occurs gradually.
- the whole cell pertussis vaccine (wP, whole cell pertussis) is a vaccine in which the pertussis bacteria are detoxified through heat treatment/formalin or the like and then the bacteria itself is used as a vaccine.
- the causative agent of whooping cough is Bordetella pertussis , a gram-negative polymorphic bacillus that is difficult to cultivate. It is mainly invented in infants and children and can cause acute respiratory diseases.
- the inactivated polio (polio) virus vaccine is of two types: the inactivated polio virus vaccine (sIPV) of the Sabin strain (attenuated type) and the inactivated polio virus vaccine (wIPV) of the Salk strain (Wild type).
- sIPV inactivated polio virus vaccine
- wIPV inactivated polio virus vaccine
- Attenuated orally administered vaccines have been developed and Dr.
- the live attenuated strain developed by Sabin is called sabin-inactivated poliovirus.
- the sIPV vaccine contains three strains: Type 1, Type 2, and Type 3.
- the injectable wIPV vaccine has been widely used, but recently, sIPV has been studied and commercialized according to the WHO's wild polio virus Eradication policy.
- the hepatitis B vaccine (HBsAg, Hepatitis B Antigen) is a vaccine having a VLP (Virus Like Particle) structure produced by genetic manipulation of a surface antigen (HBsAg) of the hepatitis B virus.
- Hepatitis B is a disease in which the hepatitis B virus attacks liver cells and develops into liver function loss, cirrhosis, or liver cancer.
- Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine is a conjugate vaccine made by conjugating a carrier protein to PRP (Polyribose ribitol phosphate), a polysaccharide in the coat of Haemophilus influenzae type b (Hib) bacteria. 95% of invasive diseases such as meningitis and sepsis caused by Haemophililus influenza are caused by type b, so Hib is an important causative agent of bacterial meningitis in children.
- PRP Polyribose ribitol phosphate
- the diphtheria (D), tetanus (T), whole-cell pertussis (wP), hepatitis B vaccine (HBsAg), haemophilus influenzae conjugated vaccine b (Hib) and inactivated polio virus vaccine by the method of the present invention
- the endotoxin content was measured. As a result, it was confirmed that the endotoxin content was significantly reduced compared to the existing general method without a pre-adsorption process.
- the content of endotoxin of the final multivalent mixed vaccine produced by the above method may be about 5000 EU/mL or less, but is not limited thereto.
- the present invention provides a method comprising: (a) mixing a tetanus vaccine (T), a diphtheria vaccine (D), and a hepatitis B vaccine (HBsAg) with an aluminum excipient; (b) mixing the whole cellular pertussis vaccine (wP) in which the content of endotoxin is lowered by pre-adsorption of the dead pertussis vaccine stock solution to an aluminum excipient in the mixture of step (a); And (c) adding and mixing the Haemophilus influenzae conjugated vaccine (Hib) and the inactivated polio virus vaccine (sIPV) in the mixture of step (b); It provides a method for producing a multivalent mixed vaccine, with a reduced content.
- T tetanus vaccine
- D diphtheria vaccine
- HBsAg hepatitis B vaccine
- the present invention relates to diphtheria (D), tetanus (T), whole-cell pertussis (wP), hepatitis B vaccine (HBsAg), haemophilus influenzae conjugate vaccine (Hib) and inactivated type b
- D diphtheria
- T tetanus
- WP whole-cell pertussis
- HBsAg hepatitis B vaccine
- Hib haemophilus influenzae conjugate vaccine
- inactivated type b In the multivalent combination vaccine including the polio virus vaccine (sIPV,), the whole cellular pertussis (wP) is pre-adsorbed to an aluminum excipient and additionally added to provide a multivalent combination vaccine composition.
- the whole-cell pertussis deadly vaccine may be pre-adsorbed to an aluminum excipient to lower the endotoxin content, and then added in the order of a method for preparing a generally prepared multivalent mixed vaccine, but is not limited thereto.
- the endotoxin content is most effectively reduced only when the polyvalent mixed vaccine is prepared in the order shown in the schematic diagram of the multivalent mixed vaccine manufacturing method including the pre-adsorption process step of the present invention in FIG. 2 .
- the multivalent mixed vaccine prepared by the above method and the composition are reacted in advance with an aluminum excipient and a dead pertussis vaccine stock solution to adsorb the pertussis cells to the aluminum excipient, thereby rapidly increasing the content of endotoxin in the multivalent mixed vaccine using pertussis antigen. It is characterized by lowering, the content of the final polyvalent mixed vaccine prepared by the above method and the endotoxin in the composition may be about 5000 EU/mL or less, but is not limited thereto.
- compositions of the present invention may be readily accomplished using well-known methods and techniques, and may be administered in a variety of ways, specifically parenterally or intranasally.
- the composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, binder, carrier, preservative, buffer, isotonic, emulsifying or wetting agent.
- Formulations suitable for parenteral or intranasal administration include aqueous and non-aqueous sterile injectable solutions which may contain antioxidants, buffers, bacteriostats, and solutes that render the formulation isotonic to the body fluids of the subject in question; and aqueous and non-aqueous sterile suspensions which may contain suspending or thickening agents.
- the active immunogenic component is often mixed with pharmaceutically acceptable excipients such as water, saline, dextrose, glycerol, ethanol, and the like.
- the immunogenic composition may also contain minor amounts of auxiliary substances, such as wetting or emulsifying agents, pH buffering agents, binders, carriers or preservatives.
- the hexavalent combined vaccine composition of the present invention may include a buffer.
- the buffer serves to maintain the pH of the solution so that the pH does not change rapidly, and examples of such a buffer include phosphate buffer, histidine buffer, citric acid. Buffer solution (Citrate Buffer), Tris buffer solution (Tris Buffer), etc. are mentioned.
- compositions of the present invention may include isotonic agents.
- the isotonic agent includes amino acids, polyalcohols, sodium chloride, and the like, and serves to maintain an appropriate osmotic pressure in the body when the vaccine is administered in a liquid form.
- composition of the present invention may include pharmaceutically acceptable excipients, and may include sugar alcohols (Sugars and Polyols), surfactants, polymers, and the like as excipients.
- Sugar alcohols may include sucrose, trealose, lactose, maltose, galactose, mannitol, sorbitol, glycerol, and the like.
- Nonionic surfactants such as polysorbate 20, polysorbate 80, and poloxamer as surfactants may be used, and as the polymer, dextran, polyethylene glycol, carboxymethyl cellulose, hyaluronic acid, cyclodextrin, etc. may be used.
- the present invention provides a method for preventing infection in an individual comprising administering to the individual an immunogenic composition of the present invention.
- immunogenic compositions of the present invention may be administered in any effective and convenient manner, including, for example, administration by topical, oral, anal, vaginal, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intranasal or intradermal routes. have.
- an individual refers to a multicellular eukaryote including but not limited to metazoans, mammals, ovids, bovines, birds, primates, and humans.
- the infection may mean infection by pertussis, polio virus (polio), diphtheria, tetanus, hepatitis B virus, or Haemophilus influenzae type b.
- polio virus polio
- diphtheria diphtheria
- tetanus diphtheria
- hepatitis B virus hepatitis B virus
- Haemophilus influenzae type b Haemophilus influenzae type b.
- Example 1 Method for preparing a multivalent combination vaccine
- a method for preparing a polyvalent (or hexavalent) mixed vaccine is as shown in FIG. 1 , and a process requiring a separate chemical reaction is not included, and is prepared by a process of mixing using only a physical method. Specifically, the antigen stock solution and excipients are mixed in the order of FIG. 1, and finally, when the addition of the excipients and preservatives is completed, the finished preparation process is terminated by additional stirring for 2 hours or more.
- the overall sequence of the multivalent (or hexavalent) mixed vaccine manufacturing method of the present invention follows the existing process as in 1-1, but a part of the aluminum excipient, Aluminum Phosphate Gel (10% of the total dose) is added to the pertussis deadly vaccine. The difference is that endotoxin is removed through an adsorption reaction separately from the stock solution in advance, and then added when preparing the hexavalent vaccine complete mixture.
- the manufacturing method is the same as in FIG. 2 , and the antigen stock solution and excipients are added in the order of FIG. 2 and mixed.
- Pertussis pre-adsorption is performed by adjusting the pH to 2.5 ⁇ 0.2 in the state of mixing aluminum excipient and pertussis antigen, reacting for 4 hours 30 minutes ⁇ 1 hour, and after adsorption is complete, reducing to a final 6.6 ⁇ 0.2 using 1N NaOH. The process ends.
- the manufacturing method of FIG. 2 is specifically as follows. 1 Prepare each undiluted solution and excipient ingredients. 2 Check the stirring vessel or tank, and add aluminum phosphate excipient. For aluminum phosphate excipients, only 90% of the total amount is added (in the existing process, 100% of the total amount is added). 3 Stir for 10 to 60 minutes (the stirring speed may vary depending on the specifications of the stirring vessel and tank). 4 Weigh the tetanus stock solution, put it in a stirring container or tank, and stir for 10 to 60 minutes. 5 Weigh the diphtheria stock solution, put it in a stirring container or tank, and stir for 10 to 60 minutes. 6 Weigh the hepatitis B stock solution, put it in a stirring container or tank, and then stir for 10 to 60 minutes.
- the aluminum phosphate-pertussis mixed stock solution after the pre-adsorption process has been completed should be stored at 2 ⁇ 8°C until use or added according to the time of input in the main process of the mixed vaccine.
- the final process conditions are '10%' for aluminum phosphate use ratio (total vaccine volume), '2.5 ⁇ 0.2' for pH, and '4 hours 30 minutes ⁇ 1 hour' for adsorption process time.
- the wP adsorption rate requires a high adsorption rate because it has an effect on the animal potency of the whole-cell pertussis vaccine.
- endotoxin is also adsorbed and removed, so the adsorption rate should be as high as possible.
- PT Pertussis Toxin
- the process time is set to a condition in which the adsorption time of other antigens is reflected and the process time is maintained for a certain period of time or more.
- a yellow area is indicated as an area that is the basis for setting the condition.
- the endotoxin content was analyzed using the SOP-QC-260 Ver.1 device according to the SOP test method operated by QC.
- the endotoxin content value in the hexavalent mixed vaccine could be reduced to 4000-EU/mL level by using the pre-adsorption process (performing the adsorption mixing process with aluminum excipients for about 4 hours in a pH 2.5 environment) (compared to the existing 80% removed).
- the endotoxin content in the final product was analyzed to be about 21,000 EU/mL. In the case of the same product of other companies, the endotoxin content is about 13,000 EU/mL.
- the degree of adsorption of pertussis antigen is about 20-30% for the hexavalent mixed vaccine produced by the existing process, 60-70% for the same product of other companies, and 70% for the finished product to which the pre-adsorption process presented in the present invention is applied. more than the adsorption rate.
- the aluminum hydoxide gel had a residual amount of endotoxin of 6,000 EU/mL, but in the case of the aluminum phosphate gel used in the present invention, it was approximately 4,000 EU/mL, effectively reducing the residual amount of endotoxin compared to the aluminum hydroxide gel. was able to confirm that
- the purpose of this study was to determine whether the endotoxin content results were different depending on the pre-absorption pH.
- a pre-adsorption pH ranging from pH 2.0 to 4.0 was applied, and the endotoxin content for each sample was checked.
- Aluminum hydroxide gel is a material different from aluminum phosphate gel and has a very large electrostatic interaction due to its physical properties, so it is judged that endotoxin can be adsorbed without a separate process, showing the distinction and superiority of the present invention In order to do this, we wanted to compare it with competitors' vaccine products using the same adjuvant and products before the company's process optimization.
- the endotoxin content was 21,000 EU/mL in the case of the competitor's vaccine using the same adjuvant, but as a result of applying the method of the present invention, it was found that the endotoxin content was 4,223 EU/mL in the vaccine finished product. That is, as a result of applying the method of the present invention, the content of endotoxin was reduced by 1/5 or more compared to the existing process, and thus the content of endotoxin can be effectively reduced.
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Abstract
본 발명은 알루미늄 부형제에 백일해 사백신 원액을 다가 혼합백신의 다른 항원과 혼합시키는 단계 전에 사전흡착시키는 단계를 포함하는, 다가 혼합백신 내 백일해 균 유래 엔도톡신을 제거하는 방법, 엔도톡신이 제거된 다가 혼합백신 제조방법 및 엔도톡신이 제거된 다가 혼합백신 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 알루미늄 부형제와 백일해 사백신 원액을 사전흡착시키는 단계를 포함하는 다가 혼합백신 내 백일해 균 유래 엔도톡신을 제거하는 방법, 엔도톡신이 제거된 다가 혼합백신 제조방법 및 엔도톡신이 제거된 다가 혼합백신 조성물에 관한 것이다.
혼합 백신은 2개 이상의 항원으로 구성되는 백신으로 하나 이상의 감염증을 예방하거나 동일 미생물의 서로 다른 형태 또는 혈청형에 의해 유발되는 감염증을 예방하기 위한 것이다. 디프테리아(Diphtheria), 파상풍(Tetanus) 및 다른 항원들의 동시 투약을 허용하는 혼합 백신은 20세기 중반 이후부터 사용되어 왔다.
최근에는 사용 연령 범위 (즉, 영아, 유아, 어린이, 청소년, 성인)에 따라 각 항원의 양과 항원의 총 범위는 다르지만, 전 세계적으로 DTwP 기반 및 DTaP 기반 혼합 백신이 많이 이용되고 있다. 특히, DTwP 기반 혼합 백신은 주로 UN 등의 국제기구를 통해 저개발 국가에 수출되고 있다.
특히, DTwP 기반인 전세포성 백일해 백신(wP, Whole Cell Pertussis)은 백일해 균을 열처리/포르말린 등의 처리를 통하여 무독화시킨 후에 균 자체를 백신으로 사용하며, 이를 전세포성 백일해 백신이라고 한다. 백일해는 Bordetella pertussis를 원인균으로 하며, 임상 증상은 합병증이 없는 경우 6 ~ 10주간 계속된다. 합병증으로는 경련, 폐렴, 뇌증 등이 있으며 사망할 수 있다.
전세포성 백일해 백신의 부작용(지속적인 발열, 발적 및 부종, 경련, 뇌증 등)이 보고되면서 효율적인 백신의 개발이 요구되고 있다. 상기와 같은 부작용은 그람 음성균이 가지고 있는 엔도톡신(endotoxin)에 의해 야기될 수 있는바, 엔도톡신의 함량을 낮추는 것이 중요하다(Vaccine, Vol 19, No 13-14, p1747~1752, 2001 Feb 8).
엔도톡신(endotoxin)의 정확한 학술 명칭은 lipopolysaccharide(LPS)로서 그람음성균의 세포외막(outer membrane)을 구성하는 주요 성분 중의 하나이다.
인체의 혈류 내로 LPS가 유입될 경우 LPS의 lipid A 영역이 유독성 발열 물질로 작용하여 면역계를 활성화시키고, 다양한 염증성(inflammatory) cytokine들이 과다 발현됨에 따라 고열, 혈관 이완에 의한 저혈압 및 패혈성 쇼크와 같은 치명적인 증상을 초래한다. 이러한 이유로 LPS는 세포내에서 유래한 독소물질이라는 의미의 엔도톡신으로 널리 알려져 있으며 미국 FDA의 규정에 따라 모든 생물의약품 및 식품 제조 공정에서 그 함량이 매우 엄격하게 규제되고 있는 물질이다.
따라서 그람음성균을 이용한 백신, 항체, 원료의약품, 수액, 주사제 및 혈액제재와 식품 생산 공정 등에서 엔도톡신이 제거되지 않고 최종 생산물에 남아 있으면 인체 내로 유입 시 심각한 부작용을 초래하게 되므로, 엔도톡신의 함량을 낮추는 것이 중요하다.
본 발명자들은 다가 혼합백신에서 부작용을 감소시켜, 영유아들의 백신 안정성 문제를 해소시키고자 예의 노력한 결과, 알루미늄 부형제인 인산 알루미늄 젤(Aluminum Phosphate gel)의 고유 성질을 이용하여 다가 혼합백신의 완제에서 엔도톡신의 함량을 급격히 낮출 수 있는 공정을 확립하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 알루미늄 부형제에 백일해 사백신 원액을 다가 혼합백신의 다른 항원과 혼합시키는 단계 전에 사전흡착시키는 단계를 포함하는, 다가 혼합백신 내 백일해 균 유래 엔도톡신을 제거하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 (a) 파상풍 백신(T), 디프테리아 백신(D), 및 B형 간염 백신(HBsAg)과 알루미늄 부형제를 혼합하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 혼합물에 백일해 사백신 원액을 알루미늄 부형제에 사전흡착시켜 엔도톡신의 함량을 낮춘 전세포성 백일해 백신(wP)을 넣어 혼합하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 혼합물에 b형 헤모필루스 인플루엔자 접합 백신(Hib) 및 불활화된 폴리오 바이러스 백신(sIPV)을 넣어 혼합하는 단계;를 포함하고 사전흡착 공정이 없는 방법과 비교하여 엔도톡신의 함량이 감소된, 다가 혼합백신 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 디프테리아(D), 파상풍(T), 전세포성 백일해(wP), B형 간염백신(HBsAg), b형 헤모필루스 인플루엔자 접합 백신(Hib) 및 불활화된 폴리오 바이러스 백신(sIPV,)을 포함하는 다가 혼합백신에 있어서, 전 세포성 백일해(wP)는 알루미늄 부형제에 사전 흡착시켜 추가로 투입하는 것을 특징으로 하는, 다가 혼합백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에서는 알루미늄 부형제와 백일해 사백신 원액을 사전에 반응시켜 백일해 균체를 알루미늄 부형제에 흡착시킴으로써 백일해 항원을 사용하는 다가 혼합백신 내 엔도톡신의 함량을 급격히 낮추는데 효과가 있다.
도 1은 일반적인 다가 혼합백신 제조방법의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 사전흡착공정 단계를 포함하는 다가 혼합백신 제조방법의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 기존의 제조방법과 사전흡착공정 단계가 포함된 본 발명의 제조방법에 따른 엔도톡신 함량의 변화 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 기존의 제조방법과 사전흡착공정 단계가 포함된 본 발명의 제조방법에서 전세포성 백일해(wP) 항원 흡착율을 비교한 것이다.
도 5는 Aluminum 종류에 따른 엔도톡신 잔류량 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 사전흡착의 최적화를 위해 근거가 되는 영역을 나타낸 것이다.
도 7은 사전흡착 pH의 범위에 따른 엔도톡신 잔류량 분석 결과를 나타낸 것이다.
이하에서는, 본 출원을 더욱 상세히 설명한다.
한편, 본 출원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명을 구현하는 하나의 양태는 알루미늄 부형제에 백일해 사백신 원액을 다가 혼합백신의 다른 항원과 혼합시키는 단계 전에 사전흡착시키는 단계를 포함하는, 다가 혼합백신 내 백일해 균 유래 엔도톡신을 제거하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 방법은 일반적으로 제조되는 다가 혼합백신의 제조방법의 순서를 따르며, 전세포성 백일해 사백신은 알루미늄 부형제에 사전흡착시켜 엔도톡신의 함량을 낮춘 뒤, 혼합하는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 “전세포성 백일해 백신(wP, Whole Cell Pertussis)”은 백일해 균을 열처리/포르말린 등의 처리를 통하여 무독화시킨 후에 균 자체를 백신으로 사용하는 백신이다. 백일해의 원인균인 백일해균은 Bordetella pertussis이며, 이는 배양하기가 까다로운 그람 음성 다 형태성의 간균으로, 주로 영유아에게 발명하며 급성 호흡기 질환을 야기시킬 수 있다. 또한, 전세포성 백일해 백신의 부작용(지속적인 발열, 발적 및 부종, 경련, 뇌증 등)이 보고되면서 효율적인 백신의 개발이 요구되고 있다. 상기와 같은 부작용은 그람 음성균이 가지고 있는 엔도톡신에 의해 야기될 수 있는바, 엔도톡신의 함량을 낮추는 것이 중요하다.
본 발명에서는 전세포성 백일해 백신의 엔도톡신의 함량을 효율적으로 낮추고자 알루미늄 부형제를 사용하여 최적화된 조건으로 사전흡착시켜 백일해 사백신 원액의 항원성을 유지하면서 엔도톡신을 최대한 낮출 수 있는 다가 혼합백신 생산 공정을 최초로 확립하였다는데 의의가 크다.
본 발명의 용어 “엔도톡신(endotoxin)”은 단백질 및 인지질과 함께 그람-음성 박테리아의 외부세포막을 형성하는 리포다당체과 lipopolysaccharide(LPS)를 의미한다. 엔도톡신은 오직 그람-음성 박테리아군에서만 발생하며 외부세포막의 조직화, 안정성 및 장벽 기능에 있어서 중요한 역할을 한다. 다수 박테리오파지는 그들의 숙주 박테리아를 찾는 특이방법으로서 엔도톡신이나 일반적인 리포다당체를 사용한다.
엔도톡신은 별도의 예방수단 없이 거의 모든 수용성 용액에서 발견될 수 있는 생체분자이며, 인체의 혈류 내로 LPS가 유입될 경우 LPS의 lipid A 영역이 유독성 발열 물질로 작용하여 면역계를 활성화시키고, 다양한 염증성(inflammatory) cytokine들이 과다 발현됨에 따라 고열, 혈관 이완에 의한 저혈압 및 패혈성 쇼크와 같은 치명적인 증상을 초래할 수 있다.
따라서 그람 음성균을 이용한 백신, 항체, 원료의약품, 수액, 주사제 및 혈액제재와 식품 생산 공정 등에서 엔도톡신이 제거되지 않고 최종 생산물에 남아 있으면 인체 내로 유입 시 심각한 부작용을 초래하게 되므로, 엔도톡신의 함량을 낮추는 것이 중요하다.
본 발명의 다가 혼합백신 내 백일해 균 유래 엔도톡신을 제거하는 방법은 기존에 일반적으로 사용하는 다가 혼합백신 제조방법을 그대로 사용하면서, 알루미늄 부형제의 고유 성질을 이용하여 백일해 사백신 원액에서 엔도톡신의 함량을 효율적으로 낮출 수 있다. 특히, 본 발명에서는 인산 알루미늄 겔(Aluminum Phosphate gel)과 전세포성 백일해 원액을 사전흡착할 때에 pH를 조절함으로써 엔도톡신에 대한 흡착력이 극대화되는 지점을 찾고자 하였다.
본 발명의 상기 용어 “사전흡착”은 기존에 일반적으로 사용하는 다가 혼합백신 제조방법 단계에서 백일해 사백신 원액을 알루미늄 부형제와 최적조건으로 반응시키는 단계를 의미한다. 구체적으로, 사전흡착은 알루미늄 부형제와 약 pH 2 내지 4, 약 pH 2 내지 3.5, 약 pH 2.1 내지 2.8, 약 pH 2.3 내지 2.8, 약 pH 2.3 내지 3, 약 pH 2.35 내지 3, 약 pH 2.4 내지 3, 약 pH 2.3 내지 3.5 약 pH 2.35 내지 3.5, 약 pH 2.4 내지 3.5 또는 약 pH 2.5에서 약 3 내지 6시간, 약 3.5 내지 5.5시간, 약 4 내지 5시간의 반응조건에서 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 낮은 pH 조건에서는 인산 알루미늄 겔(Aluminum phosphate gel)이 양전하를 띄게 되며, 엔도톡신과 같은 음전하를 띄는 단백질을 흡착하여 제거하는 것이 가능해진다.
pH가 2.3 이하인 경우, 전기적으로 중성 또는 양전하 상태를 띄므로 흡착효과가 높지 않으며, 백신 원액에 손상을 입힐 가능성이 있으며, 항원가가 낮아질 수 있다. 또한, pH가 3.5 이상인 경우, 알루미늄 부형제에 백일해 사백신의 흡착율이 낮아질 수 있다. 특히, pH 2 초과 pH 4 미만의 조건 사이에서 pH가 낮을수록 엔도톡신 제거율이 가장 높아지는 최적점이 있는 것을 알 수 있으며, 구체적으로 약 pH 2.3 내지 pH 2.7, 또는 약 pH 2.5일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 알루미늄 부형제에 사전 흡착시킨 백일해는 약 pH 6 내지 7, 약 pH 6.1 내지 6.9, 약 pH 6.2 내지 6.8, 약 pH 6.3 내지 6.7 또는 약 pH 6.6으로 환원시켜 반응을 종료시키는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 인산알루미늄 부형제와 완제 투입량의 백일해 사백신 원액을 교반시킨 뒤, 1N HCl을 이용하여 pH가 2.5±0.2(pH 2.3 내지 pH 2.7)가 되도록 적정하고, pH가 2.5±0.2(pH 2.3 내지 pH 2.7) 범위가 되면 1N HCl 투입을 멈추고, 4시간 30분±1시간 동안 흡착반응공정을 진행한다. 이후, 흡착공정이 종료되면 1N NaOH를 사용하여 pH가 6.6±0.2가 되도록 중화하고, 중화적정이 종료되면 30분 이상 교반한다. 사전흡착공정이 종료된 인산알루미늄-백일해 혼합원액은 2~8℃에 사용 전까지 보관하거나 혼합백신 주공정 투입 시점에 맞게 투입하도록 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 “알루미늄 부형제”는 면역원성 조성물의 면역원성을 향상시키는 작용을 하는 물질이다. 상기 알루미늄 부형제는 약학적으로 허용가능한 항원 보강제(adjuvant)와 혼용되어 사용될 수 있다. 본 발명의 항원보강제는 종종 면역 반응을 부스팅시키기 위해 제공되고 당업자에게 잘 공지되어 있다.
상기 알루미늄 부형제는 수산화 알루미늄 겔(Aluminum hydroxide gel) 인산 알루미늄 겔(Aluminum phosphate gel) 또는 이들의 조합일 수 있으며, 구체적으로 인산 알루미늄 겔(Aluminum phosphate gel)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명자들은 단순히 항원보강제에 이용되는 것이 아닌, 알루미늄 부형제인 인산 알루미늄 겔이 전세포성 백일해 사백신 원액과 사전흡착시키는 경우, 엔도톡신을 제거하는 특성을 이용해 새로운 공정을 확립하였다.
알루미늄 부형제 중 수산화 알루미늄 겔(Aluminum hydroxide gel)이 인산 알루미늄 겔(Aluminum phosphate gel)에 비하여 내독소 흡착능이 뛰어남을 공지하고 있는 문헌(Vaccine, Vol 19, No 13-14, p1747~1752, 2001 Feb 8)이 있으나, 본 발명의 방법은 오히려 전세포성 백일해 사백신 원액에서 인산 알루미늄 겔(Aluminum phosphate gel)이 수산화 알루미늄 겔(Aluminum hydroxide gel)에 비하여 엔도톡신 제거가 우수함을 알 수 있다. 이는 인산 알루미늄 겔(Aluminum phosphate gel)의 고유성질에 의한 것으로, 이는 인산 알루미늄 겔(Aluminum phosphate gel)의 특유의 성질로 본 발명자들이 처음 발견하여 본 새로운 공정을 제공하게 되었다. 구체적으로, 엔도톡신이 알루미늄 부형제에 흡착이 되면 엔도톡신의 활성이 없어지거나 줄어들게 되고, 엔도톡신이 인산 알루미늄 겔에 흡착되어 인체 내에 Release 되지 않아 그 독성을 발현시키지 못하는 원리를 이용한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
수산화 알루미늄 겔(Aluminum hydroxide gel)의 경우에는 Aluminum phosphate와 다른 물리적 특성 자체로 인해 엔도톡신을 흡착시킬 수 있다. 구체적으로, 정전기적 인력 (Elctrostatic interaction)을 이용하여 사전흡착 단계 등의 별도의 공정없이도 엔도톡신을 흡착시킬 수 있다. 그러나, 최종 공정에서 엔도톡신 함량을 비교하였을 때, 본 발명의 제조방법으로 제조된 다가 혼합백신 내 엔도톡신 함량이 낮음을 알 수 있다(도 5).
본 발명의 목적상 상기 알루미늄 부형제는 기존에 일반적으로 사용하는 다가 혼합백신 제조방법에 투입되는 전체 투입량의 일부를 백일해 사백신 원액과 사전흡착시키는 단계에 투입하는 것을 특징으로 한다. 일 예로, 일반적으로 사용하는 다가 혼합백신 제조방법에 투입되는 알루미늄 부형제의 전체 투입량을 100이라고 가정할 때, 사전흡착시키는 단계에 투입되는 알루미늄 부형제의 투입량은 약 10일 수 있으며, 사전흡착 단계에 투입되는 알루미늄 부형제를 제외한 전체 알루미늄 부형제: 사전흡착 단계에 투입되는 알루미늄 부형제의 비율이 약 9:1일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 더욱 구체적으로 사전흡착시키는 단계에서 투입되는 알루미늄 부형제는 다가 혼합백신의 제조시 투입되는 전체 투입량의 약 5% 내지 약 15%, 약 6% 내지 약 13%, 약 7% 내지 약 11%, 또는 약 10%인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예로, 알루미늄 부형제를 10% 정도를 사용하는 것은 엔도톡신이 목표 수치만큼 감소하는 범위에서 전체 알루미늄량 중 최소량을 사용하여 흡착 반응에 사용하려는 것이며, 나머지 알루미늄 부형제가 다른 항원들은 흡착하는 데에 부족하지 않아야 하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "약"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "다가 혼합 백신"은 항원에 대한 면역원성을 일으킬 수 있는 백신을 2 이상을 혼합한 것으로, 동일 항원 내의 다른 부위에 대해 면역원성을 일으키는 2개 이상의 백신을 포함하거나 2 이상의 항원에 대한 백신을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 다가 혼합 백신은 디프테리아 백신(D, Diphtheria), 파상풍 백신(T, Tetanus), 전세포성 백일해 백신(wP), 불활화된 폴리오 바이러스 백신(sIPV), B형 간염 백신 (HBsAg), 및/또는 b형 헤모필루스 인플루엔자 접합백신(Hib)을 포함하는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 다가 혼합 백신은 액상형으로 사용될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 디프테리아 백신(D, Diphtheria)은 디프테리아 톡신을 포르말린으로 무독화시켜 디프테리아 톡소이드로 만들고 이를 백신으로 사용한다. 디프테리아의 증상은 특별한 원인없이 편도, 인두, 코 부위에 잘 떨어지지 않는 막이 생기면서, 목이 아프고, 미열이 있는 상기도 감염증이다. 간혹 피부, 결막, 생식기 감염을 일으키기도 한다.
본 발명에서 파상풍 백신(T, Tetanus)은 파상풍 톡신을 포르말린으로 무독화시켜 파상풍 톡소이드로 만들고 이를 백신으로 사용한다. 원인균은 포자를 만드는 혐기성 그람 양성 간균인 Clostridium tetani로 중추 신경계와 결합하는 외독소를 분비하여 심한 근육의 연축(spasm)을 일으키는 신경계 질환이다. 피부와 점막의 상처를 통해 침입하여 발생하며, 서서히 증세가 나타나고 점차 심한 근육 수축이 일어난다.
본 발명에서 전세포성 백일해 백신(wP, Whole Cell Pertussis)은 백일해 균을 열처리/포르말린 등의 처리를 통하여 무독화시킨 후에 균 자체를 백신으로 사용하는 백신이다. 백일해의 원인균인 백일해균은 Bordetella pertussis이며, 이는 배양하기가 까다로운 그람 음성 다 형태성의 간균으로, 주로 영유아에게 발명하며 급성 호흡기 질환을 야기시킬 수 있다.
본 발명에서 불활화 폴리오(소아마비) 바이러스 백신은 Sabin strain (attenuated type)의 불활화된 폴리오 바이러스 백신(sIPV)와 Salk strain (Wild type)의 불활화한 폴리오 바이러스 백신(wIPV)의 두 가지 종류가 있다. 약독화된 경구 투여 백신이 개발되었으며 Dr. Sabin이 개발한 약독화된(live attenuated) 종을 sabin 불활화 폴리오 바이러스라고 한다. 최근에는, 이것을 포르말린 처리를 통해 불활화한 폴리오 바이러스(sabin inactivated polio virus)를 주사제로 개발 또는 제품화가 시작되고 있다. sIPV 백신은 Type 1, Type 2, Type 3의 3 종의 strain을 포함하고 있다. 지금까지는 주사제인 wIPV 백신이 널리 사용되고 있으나 근래에는 WHO의 wild polio virus Eradication 정책에 의해 sIPV가 연구 및 제품화되고 있다.
본 발명에서 B형 간염 백신 (HBsAg, Hepatitis B Antigen)은 B형 간염 바이러스의 표면 항원(HBsAg)을 유전자 조작을 통하여 생산한 VLP(Virus Like Particle) 구조의 백신이다. B형 간염은 B형 간염 바이러스가 간세포를 공격하여 간기능 상실, 간경화 또는 간암으로 발전하는 질환이다.
본 발명에서 b형 헤모필루스 인플루엔자 접합백신(Hib)은 Haemophilus influenzae type b (Hib) 세균의 피막에 있는 다당인 PRP (Polyribose ribitol phosphate)에 운반 단백질(Carrier Protein)을 접합하여 만든 접합 백신이다. 인플루엔자 균 (Haemophililus influenza)에 의한 수막염과 패혈증 등 침습성 질환의 95%는 b형에 의해 발생하여 Hib는 소아에서의 세균성 수막염의 중요 원인균이다.
일 예로, 본 발명의 방법으로 상기 디프테리아(D), 파상풍(T), 전세포성 백일해(wP), B형 간염백신(HBsAg), b형 헤모필루스 인플루엔자 접합 백신(Hib) 및 불활화된 폴리오 바이러스 백신(sIPV,)을 포함하는 다가 혼합백신을 제조한 뒤, 엔도톡신의 함량을 측정한 결과, 사전흡착 공정이 없는 기존의 일반적인 방법과 비교하여 엔도톡신 함량이 현저하게 감소함을 확인하였다. 구체적으로, 상기 방법에 의해 생산된 최종 다가 혼합백신의 엔도톡신의 함량은 약 5000 EU/mL 이하인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명을 구현하는 또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 파상풍 백신(T), 디프테리아 백신(D), 및 B형 간염 백신(HBsAg)과 알루미늄 부형제를 혼합하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 혼합물에 백일해 사백신 원액을 알루미늄 부형제에 사전흡착시켜 엔도톡신의 함량을 낮춘 전세포성 백일해 백신(wP)을 넣어 혼합하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 혼합물에 b형 헤모필루스 인플루엔자 접합 백신(Hib) 및 불활화된 폴리오 바이러스 백신(sIPV)을 넣어 혼합하는 단계;를 포함하고 사전흡착 공정이 없는 방법과 비교하여 엔도톡신의 함량이 감소된, 다가 혼합백신 제조방법을 제공한다.
본 발명을 구현하는 또 다른 양태로서, 본 발명은 디프테리아(D), 파상풍(T), 전세포성 백일해(wP), B형 간염백신(HBsAg), b형 헤모필루스 인플루엔자 접합 백신(Hib) 및 불활화된 폴리오 바이러스 백신(sIPV,)을 포함하는 다가 혼합백신에 있어서, 전세포성 백일해(wP)는 알루미늄 부형제에 사전 흡착시켜 추가로 투입하는 것을 특징으로 하는, 다가 혼합백신 조성물을 제공한다.
상기 용어 "다가 혼합백신", "엔도톡신", "사전흡착" 등의 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명의 목적상 전세포성 백일해 사백신은 알루미늄 부형제에 사전흡착시켜 엔도톡신의 함량을 낮춘 뒤, 일반적으로 제조되는 다가 혼합백신의 제조방법의 순서에 투입하는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 도 2의 본 발명의 사전흡착공정 단계를 포함하는 다가 혼합백신 제조방법의 모식도에서 나타낸 순서대로 다가 혼합백신을 제조하여야 엔도톡신 함량이 함량이 가장 효과적으로 감소됨을 알 수 있다.
본 발명의 목적상 상기 방법으로 제조된 다가 혼합백신과 상기 조성물은 알루미늄 부형제와 백일해 사백신 원액을 사전에 반응시켜 백일해 균체를 알루미늄 부형제에 흡착시킴으로써 백일해 항원을 사용하는 다가 혼합백신 내 엔도톡신의 함량을 급격히 낮추는데 특징이 있는바, 상기 방법으로 제조된 최종 다가 혼합백신과 상기 조성물 내의 엔도톡신의 함량은 약 5000 EU/mL 이하인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 널리 공지된 방법 및 기법을 이용하여 쉽게 달성될 수 있으며, 다양한 방식으로, 구체적으로는 비경구로 또는 비강내로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 운반체, 부형제, 결합제, 담체, 보존제, 완충제, 등장화제, 에멀전화제 또는 습윤제를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 비경구 또는 비강내 투여에 적합한 제형에는 항산화제, 완충액, 정균제 및 문제 대상체의 체액에 대한 제형을 등장성으로 만드는 용질이 포함될 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사용액; 및 현탁화제 또는 중점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액이 포함된다. 활성 면역원성 성분은 종종 약학적으로 허용가능한 부형제, 예컨대 물, 식염수, 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올 등과 혼합된다. 또한, 면역원성 조성물은 소량의 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 에멀전화제, pH 완충제, 결합제, 담체 또는 보존제를 함유할 수 있다.
본 발명의 6가 혼합백신 조성물은 완충제를 포함할 수 있다. 본 발명의 용액 조성물에서 상기 완충용액은 pH가 급격히 변화하지 않게 용액의 pH를 유지시키는 역할을 하며, 그러한 완충용액의 일 예로는 인산 완충용액(Phosphate Buffer), 히스티딘 완충용액(Histidine Buffer), 구연산 완충용액(Citrate Buffer), 트리스 완충용액(Tris Buffer)등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물은 등장화제를 포함할 수 있다. 상기 등장화제는 아미노산, 다가알콜, 염화나트륨 등을 포함하며 백신을 액상으로 체내에 투여할때 체내에서 적절하게 삼투압을 유지하는 역할을 한다.
본 발명의 조성물에는 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있으며 부형제로서 당알콜류(Sugars and Polyols), 계면활성제(Surfactants), 고분자(Polymers)등을 포함 할 수 있다. 당알콜류는 슈크로스, 트레알로스, 락토스, 말토스, 갈락토스, 만니톨, 솔비톨, 글리세롤 등이 사용될 수 있으며, 계면활성제로는 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 80, 폴록사머등의 비이온 계면활성제가 사용 될 수 있고 고분자로는 덱스트란, 폴리에틸렌글리콜, 카르복실메틸셀룰로스, 히아루론산, 사이클로덱스트린등이 사용 될 수 있다.
상기 물질들은 단독으로 또는 두 성분 이상의 조합으로 사용될 수 있으나, 당 업자들이 용이하게 선택하여 사용할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명의 면역원성 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개인의 감염을 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 면역원성 조성물은 예를 들어 국소, 경구, 항문, 질, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 비강내 또는 피내 경로에 의한 투여를 포함하는 임의의 효과적이고 편리한 방식으로 투여될 수 있다.
본 발명에서 개체는 후생동물, 포유류, 오비드(ovid), 소과동물, 조류, 영장류 및 인간을 비제한적으로 포함하는 다세포성 진핵생물을 의미한다.
본 발명에서 상기 감염은 백일해, 폴리오 바이러스(소아마비), 디프테리아, 파상풍, B형 간염 바이러스, b형 헤모필루스 인플루엔자에 의한 감염을 의미할 수 있다.
이하 본 발명을 하기 예에 의해 보다 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범주가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 다가 혼합백신 제조방법
1-1. 일반적인 다가 혼합백신 제조방법
일반적으로 다가 (또는 6가) 혼합백신의 제조방법은 도 1과 같으며, 별도의 화학적인 반응을 요구하는 공정은 포함되지 않으며, 단순히 물리적인 방법만을 사용하여 혼합하는 공정으로 제조된다. 구체적으로 도 1의 순서대로 항원 원액 및 부형제를 투입하면서 혼합하며, 최종적으로 부형제 및 보존제까지 투입이 완료되면 2시간 이상 추가 교반함으로써 완제 조제 공정을 종료한다.
1-2. 본 발명의 다가 혼합백신 제조방법(사전흡착 공정 적용)
본 발명의 다가 (또는 6가) 혼합백신 제조방법의 전체적인 순서는 1-1과 같은 기존 공정을 따르지만, 알루미늄 부형제인 인산 알루미늄 젤(Aluminum Phosphate Gel)의 일부(전체 투입량의 10%)를 백일해 사백신 원액과 사전에 별도로 흡착반응을 시켜서 엔도톡신을 제거한 후, 6가 백신 완제 혼합 조제 시에 투입한다는 차이가 있다.
제조방법은 도 2와 같으며, 도 2의 순서대로 항원 원액 및 부형제를 투입하면서 혼합한다. 백일해 사전흡착은 알루미늄 부형제와 백일해 항원이 섞인 상태에서 pH 2.5±0.2로 산도조절 후 4시간 30분 ± 1시간 동안 반응하고, 흡착이 끝난 후, 1N NaOH를 이용하여 최종 6.6±0.2로 환원시키므로써 공정이 종료된다.
도 2의 제조방법은 구체적으로 하기와 같다. ① 각 원액 및 부형제 원료를 준비한다. ② 교반용기 또는 탱크를 확인하고, 인산알루미늄 부형제를 투입한다. 인산알루미늄 부형제는 전체 투입량의 90%만 투입한다 (기존 공정은 전체 투입량 100%를 모두 투입함). ③ 10~60분 동안 교반한다 (교반속도는 교반용기 및 탱크의 사양에 따라 달라질 수 있음). ④ 파상풍 원액을 칭량하고 교반용기 또는 탱크에 투입한 후, 10~60분 동안 교반한다. ⑤ 디프테리아 원액을 칭량하고 교반용기 또는 탱크에 투입한 후, 10~60분 동안 교반한다. ⑥ B형 간염 원액을 칭량하고 교반용기 또는 탱크에 투입한 후, 10~60분 동안 교반한다. ⑦ 사전흡착시킨 '백일해 사백신+인산알루미늄 흡착원액'을 교반용기 또는 탱크에 투입한 후, 30~60분 동안 교반한다 (기존 공정은 백일해 사백신 원액만을 투입함). ⑧ PRP-TT(polyribosyl ribitol phosphate-Tetanus Toxoid conjugated) 접합체 원액을 칭량하고 교반용기 또는 탱크에 투입한 후, 10~60분 동안 교반한다. ⑨ PBS를 제조하여 교반용기 또는 탱크에 투입한 후, 10~60분 동안 교반한다. ⑩ sIPV type3 원액을 칭량하고 교반용기 또는 탱크에 투입한다. ⑪ sIPV type2 원액을 칭량하고 교반용기 또는 탱크에 투입한다. ⑫ sIPV type1 원액을 칭량하고 교반용기 또는 탱크에 투입한다. ⑬ 10x M199를 칭량하고 교반용기 또는 탱크에 투입한다. ⑭ 주사용수를 칭량하고 교반용기 또는 탱크에 투입한 후, 10~60분 동안 교반한다. ⑮ 2-PE(2-Phenoxyethanol)를 칭량하고 교반용기 또는 탱크에 투입한 후, 120~180분 동안 교반한다.
실시예 2: 사전흡착 공정 및 최적화
2-1. 사용원료, 물질 또는 시약 (Materials and Reagents)
a) HCl (Merck, 대정화금, 4090-4400),
b) NaOH (Merck, 대정화금, 7571-4400)
c) 인산알루미늄 부형제 (Aluminum phosphate gel, CRODA DENMARK A/S)
d) 백일해 사백신 원액 (VD450)
e) 1N HCl: HCl 87.54mL에 정제수를 추가 투입하여 최종 1L가 되도록 준비
f) 1N NaOH: NaOH 40g에 정제수를 추가 투입하여 최종 1L가 되도록 준비
2-2. 기기 및 도구 (Equipment and Apparatus)
a) 교반기 (Magnetic Stirrer)
b) pH Meter
c) Magnetic bar
d) 교반용기 (비이커 등) 또는 교반탱크
2-3. 사전흡착공정방법
i) 인산알루미늄 부형제 (Aluminum Phosphate Gel)와 백일해 사백신 원액을 완제 투입량만큼 칭량하여 준비한다.
ii) pH 적정을 위해 1N HCl과 1N NaOH를 준비한다.
iii) 완제 전체 투입량의 1/10 분량의 인산알루미늄 부형제와 완제 투입량의 백일해 사백신 원액을 교반 속도 200±30RPM으로, 15±5분 동안 혼합한다. (교반용기 또는 탱크의 사양에 따라 교반속도는 달라질 수 있다.)
iv) 1N HCl을 이용하여 'pH가 2.5±0.2'가 되도록 적정한다.
v) pH가 2.5±0.2 범위가 되면 1N HCl 투입을 멈추고, '4시간 30분±1시간' 동안 흡착반응공정을 진행한다.
vi) 흡착공정이 종료되면 1N NaOH를 사용하여 'pH가 6.6±0.2'가 되도록 중화한다.
vii) 중화적정이 종료되면 30분 이상 교반한다.
viii) 사전흡착공정이 종료된 인산알루미늄-백일해 혼합원액은 2~8℃에 사용 전까지 보관하거나 혼합백신 주공정 투입 시점에 맞게 투입하도록 한다.
2-4. 백일해 사전흡착의 최적화
최종 공정 조건은 Aluminum phosphate 사용 비율 (전체 백신 부피 중)은 '10%', pH는 '2.5±0.2', 흡착공정시간 '4시간 30분 ± 1시간' 이다.
공정 조건 설정은 하기의 근거를 토대로 4가지 조건을 모두 만족하는 조건으로 설정하였다.
① wP 흡착율은 전세포성 백일해 백신의 동물역가와 영향이 있기 때문에 높은 흡착율을 요구함
② 동시에 엔도톡신도 같이 흡착하여 제거하기 때문에 흡착율은 최대한 높아야 함
③ 백일해 항원 중 Pertussis Toxin (PT)가 공정 중에 손상을 입으면 안되기 때문에 PT함량이 일정량 (50 U/mL 이상) 유지되어야 함
④ 공정시간은 다른 항원들의 흡착시간 공정 시간을 반영하여 일정 시간 이상 유지가 되는 조건으로 설정함
구체적으로, 도 7에서 노란색 영역을 조건 설정의 근거가 되는 영역으로 표시하였다.
2-5. RSM 분석을 통한 최적조건 및 예측값 도출
RSM 분석을 통해 본 발명의 백일해 사전흡착 조건의 최적화 조건을 설정하고자 하였다. 구체적으로, 최적화 조건을 설정하기 위하여, (i) wP 흡착율 최대, (ii) 엔도톡신 함량 최저, (iii) PT함량 최대로 조건을 설정하여 최적 조건을 스크리닝 하였다. 본 발명자들은, 항원성을 최대한 유지하면서도 엔도톡신은 최대한 감소하고, 항원 흡착율도 최대인 조건을 선택하였다.
실시예 3: 엔도톡신 함량 확인
3-1.
엔도톡신 함량 측정방법 및 흡착율 측정방법
가) 엔도톡신 함량 측정방법
엔도톡신함량은 QC에서 운용하고 있는 SOP 시험법에 따라 SOP-QC-260 Ver.1 기기를 이용하여 분석 시험을 진행하였다.
나) 흡착율 측정방법
< 샘플 준비 및 샘플 희석 >
6가 혼합백신 완제 (36 OU/ml) 5ml 이상을 준비하고, 흡착율을 측정하고자 하는 완제 샘플 제조에 사용된 wP 원액을 준비한다 (대조군). 300 OU/ml 의 원액을 36 OU/ml의 농도로 희석한다. 1x PBS(염화나트륨 8.5g, 인산이수소칼륨 1.09g 및 인산일수소나트륨 0.28g을 각각 칭량하여 900mL의 정제수에 충분히 균질화 되도록 용해시키고, 최종 1L가 되도록 정제수를 추가 투입하여 얻음, pH 6.1) 5.28 mL 과 원액 0.72 mL을 50 mL tube에 넣고 잘 섞어주어 최종 농도를 36 OU/ml 로 만든다.
< 샘플 침전 (Settling of Sample) >
흡착율을 측정하고자 하는 샘플(대조군 포함) 수량만큼 5mL Disposable Pipette을 준비하고, 상단의 솜을 제거하고 하단 끝을 Sealing tape로 밀봉한다. 준비된 5mL Disposable Pipette을 수직으로 세우고, 샘플들을 각각 5 mL씩 상단부로 주입한다. 상온에서 18시간 방치하여 완제 샘플을 침전시킨다.
< 상등액의 흡광도 측정(600nm) 및 흡착율 계산>
샘플 침전 후의 상등액 1mL을 Disposable Cuvette에 분주 후에 Spectrophotometer를 이용하여 600nm파장에서 흡광도를 측정한다. 측정된 샘플 및 대조군의 흡광도를 하기의 식에 대입하여 탈착율 및 흡착율을 구한다.
- 탈착율(%) = 샘플 흡광도/대조군흡광도 * 100
- 흡착율(%) = 100 - 탈착율
3-2.
일반적인 다가 혼합백신 제조방법과 비교 결과
단순히 혼합하는 공정으로 생산한 6가 혼합백신에 대한 엔도톡신 함량과 백일해 사백신 원액을 사전에 알루미늄 부형제와 흡착시켜 생산한 6가 혼합백신에 대한 엔도톡신 함량을 비교했을 때, 아래와 같은 결과를 얻었다.
구체적으로, 개선 전에 비해서 약 80% 정도의 엔도톡신이 제거된 제형을 확보할 수 있었으며, 이 결과는 경쟁사 수준 13,000-EU/mL보다도 훨씬 낮은 수준의 함량 값이다. (흡착율은 기존 30% 수준에서 70% 이상으로 향상된다.)
따라서, 사전흡착공정 (pH 2.5 환경에서 약 4시간 가량 알루미늄 부형제와 흡착혼합 공정 수행)을 사용함으로써 6가 혼합백신 내의 엔도톡신 함량 값을 4000-EU/mL 수준으로 낮출 수 있음을 확인하였다 (기존 대비 80% 제거).
현재 사용하고 있는 6가 혼합백신 제조 공정으로 생산하는 경우, 최종 완제 내 엔도톡신 함량은 약 21,000 EU/mL 수준으로 분석되었다. 타사 동일 제품의 경우는 약 13,000EU/mL수준의 엔도톡신 함량을 보인다. 더불어, 백일해 항원 흡착 정도는 기존 공정으로 생산한 6가 혼합백신은 약 20~30%, 타사 동일 제품의 경우는 60~70%, 본 발명에서 제시하는 사전흡착 공정을 적용한 완제의 경우는 70% 이상의 흡착율을 보여준다.
3-3.
Aluminum 종류에 따른 비교 결과
Aluminum 종류에 따라 엔도톡신 함량 결과가 달라지는지 확인하고자 하였다. 구체적으로, Aluminum hydroxide gel 사용시 엔도톡신 함량과 Aluminum phosphate gel 사용시 엔도톡신 함량을 비교하고자 하였다.
다만, Aluminum hydoxide와 Aluminum phosphate adjuvant는 성분과 물성이 달라 직접적인 비교는 어려우므로, 경향성만을 비교하고자, 최종 공정에 적용하여 비교한 엔도톡신 잔류량 분석 결과로 이를 대신하고자 하였다(도 5)
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, Aluminum hydoxide gel은 엔도톡신 잔류량이 6,000 EU/mL이었으나, 본 발명에서 사용한 Aluminum phosphate gel의 경우에는 대략 4,000 EU/mL 정도로, Aluminum hydoxide gel에 비하여 엔도톡신 잔류량이 효과적으로 감소하였음을 확인할 수 있었다.
3-4. 백일해 사전흡착 pH별 엔도톡신 잔류 농도의 비교
사전흡작 pH에 따라 엔도톡신 함량 결과가 달라지는지 확인하고자 하였다.
구체적으로, pH 2.0 ~ 4.0까지 범위의 사전흡착 pH를 적용하고, 각 검체에 대한 엔도톡신 함량을 확인하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, pH 3.5를 기점으로 하여 pH가 낮아짐에 따라 큰 폭으로 엔도톡신 함량이 낮아지는 것을 확인할 수 있으며, 약 pH 2.5 (pH 2.3~2.7 근처에서는 엔도톡신 제거율이 최대임을 확인할 수 있었다. 또한, pH 3.5이상인 경우에는 전세포성 백일해 백신(wP, Whole Cell Pertussis)의 흡착율이 낮아질 수 있다.
다만, pH 2.3 이하의 강산성 조건은 백일해 항원에 대하여 Degradation을 초래할 가능성이 있어 무리하게 강산에 노출시키지 않도록 해야 하는바, 사전흡착 pH는 2.5±0.2의 범위에서 수행하는 것이 바람직함을 알 수 있다.
3-5. 기존 공정과 본 발명의 공정에 따른 비교 결과
Aluminum hydroxide gel은 Aluminum phosphate gel과 다른 물질로 물리적 특성 자체로 인해 정전기적 인력 (Elctrostatic interaction)이 매우 크므로, 별도의 공정 없이 엔도톡신을 흡착시킬 수 있을 것으로 판단하여, 본 발명의 구별성과 우수성을 보이기 위해서는 경쟁사의 동일 Adjuvant 사용 백신 제품 및 자사의 공정 최적화 전 제품과 비교하고자 하였다.
그 결과, 경쟁사의 동일 Adjuvant 사용 백신 완제의 경우 엔도톡신 함량이 21,000 EU/mL이었으나, 본 발명의 방법을 적용한 결과 백신 완제에서 엔도톡신 함량이 4,223 EU/mL임을 알 수 있었다. 즉, 본 발명의 방법을 적용한 결과 기존공정에 비하여 엔토톡신의 함량이 1/5배이상 감소하였는바, 엔도톡신의 함량을 효과적으로 감소시킬 수 있는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (17)
- 알루미늄 부형제에 백일해 사백신 원액을 다가 혼합백신의 다른 항원과 혼합시키는 단계 전에 사전흡착시키는 단계를 포함하는, 다가 혼합백신 내 백일해 균 유래 엔도톡신을 제거하는 방법.
- 제1항에 있어서,상기 알루미늄 부형제는 인산 알루미늄 젤(Aluminum Phosphate Gel)인 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,상기 사전흡착은 pH 2 내지 3.5, 및 3 내지 6시간의 반응조건에서 수행하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,상기 알루미늄 부형제에 사전 흡착시킨 백일해는 pH 6 내지 7로 환원시켜 반응을 종료시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서,상기 백일해는 전세포성(wP, Whole cell pertussis suspension)인 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,상기 알루미늄 부형제는 다가 혼합백신의 제조시 투입되는 전체 투입량의 5% 내지 15 %인 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,상기 방법에 의해 생산된 최종 다가 혼합백신의 엔도톡신의 함량은 5000 EU/mL 이하인 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,상기 다가 혼합백신은 디프테리아(D, Diphtheria), 파상풍(T, Tetanus), 전세포성 백일해(wP, Whole Cell Pertussis), B형 간염백신(HBsAg, Hepatitis B Antigen), b형 헤모필루스 인플루엔자 접합 백신(Hib, Haemophilus influenzae type b) 및 불활화된 폴리오 바이러스 백신(sIPV, sabin Inactivated Polio Vaccine)을 포함하는 6가 혼합백신인 것인, 방법.
- (a) 파상풍 백신(T), 디프테리아 백신(D), 및 B형 간염 백신(HBsAg)과 알루미늄 부형제를 혼합하는 단계;(b) 상기 (a) 단계의 혼합물에 백일해 사백신 원액을 알루미늄 부형제에 사전흡착시켜 엔도톡신의 함량을 낮춘 전세포성 백일해 백신(wP)을 넣어 혼합하는 단계; 및(c) 상기 (b) 단계의 혼합물에 b형 헤모필루스 인플루엔자 접합 백신(Hib) 및 불활화된 폴리오 바이러스 백신(sIPV)을 넣어 혼합하는 단계;를 포함하고 사전흡착 공정이 없는 방법과 비교하여 엔도톡신의 함량이 감소된, 다가 혼합백신 제조방법.
- 제9항에 있어서,상기 (b) 단계의 알루미늄 부형제는 인산 알루미늄 젤(Aluminum Phosphate Gel)인 것인, 제조방법.
- 제9항에 있어서,상기 (b) 단계의 알루미늄 부형제는 다가 혼합백신의 제조시 투입되는 전체 투입량의 5 내지 15 %인 것인, 제조방법.
- 제9항에 있어서,상기 (b) 단계의 사전흡착은 pH 2 내지 3, 및 3 내지 6시간의 반응조건에서 수행하는 것인, 제조방법.
- 제9항에 있어서,상기 (b) 단계의 알루미늄 부형제에 사전 흡착시킨 전세포성 백일해(wP)는 pH 6 내지 7로 환원시켜 반응을 종료시키는 단계를 포함하는, 제조방법.
- 제9항에 있어서,상기 상기 (b) 단계의 알루미늄 부형제는 다가 혼합백신의 제조시 투입되는 전체 투입량의 5 내지 15 %인 것인, 제조방법.
- 제9항에 있어서,상기 방법에 의해 생산된 최종 다가 혼합백신의 엔도톡신의 함량은 5000 EU/mL 이하인 것인, 제조방법.
- 디프테리아(D), 파상풍(T), 전세포성 백일해(wP), B형 간염백신(HBsAg), b형 헤모필루스 인플루엔자 접합 백신(Hib) 및 불활화된 폴리오 바이러스 백신(sIPV,)을 포함하는 다가 혼합백신에 있어서, 전세포성 백일해(wP)는 알루미늄 부형제에 사전 흡착시켜 추가로 투입하는 것을 특징으로 하는, 다가 혼합백신 조성물.
- 제16항에 있어서,상기 조성물의 최종 다가 혼합백신의 엔도톡신의 함량은 5000 EU/mL 이하인 것인, 조성물.
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