JPH05506649A - 百日咳菌外膜蛋白質の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 百日咳菌外膜蛋白質の精製方法 技術分野 本発明は、分子量が約６９，０００ダルトンであり、以前には６９ｋＤａタンパ ク、また現在ではパータフチンと呼ばれる百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐ ｅｒｔｕｓｓｉｓ）の培養ブロス及び細胞抽出液から得られる外膜蛋白質の新規 な精製方法に関するものである。本方法により得られるタンパクは、百日咳疾患 予防のための「コンポーネント」ワクチンに使用される。

背景技術 百日咳疾患は、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒ　ｔｕｓｓ　ｉｓ）の感 染によるもので、人間、特に幼児で重篤な衰弱性疾患である。過去５０年間に、 本疾患は大規模な免疫プログラムにより予防されてきた。北米で現在認可されて いるワクチンは、　「全細胞型」ワクチンで、細菌を発酵槽内で培養した後、得 られた百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の細胞をホルムアルデヒドなどの化 学薬品で処理して殺菌し、有毒なタンパクを不活化して調製する。この細胞を再 度懸濁した後、直接もしくはその他の抗原と混合して使用する。このワクチンは 効力が高いが、発熱、局所反応、号泣及び痙彎などの臨床症状を併発する。これ らの症状とワクチンの関係は立証されていないにも関わらず、このワクチンに対 する一般の許容は低下し、多数の国、例えば日本、スウェーデン、英国などでは 予防接種率が減少し、百日咳疾患の大発生を招いている。

さらに限定的なワクチンの必要性が認められており、きわめて精製度の高い少数 のタンパクから成る有効な百日咳ワクチンの開発に向け、７多くの製薬会社及び 研究者が大いに努力してきた。このワクチンは、成分ワクチンと呼ばれている。

この研究は、百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の病原性機序に関する情報不 足のため、あまり進歩していない。リンパ球増多症促進因子（ＬＰＦ）としても 知られる百日咳毒素（ＰＴ）、糸状血球凝集素（ＦＨＡ）、アデニル酸シクラー ゼ（アデニレートシクラーゼ°ａｄｅｎｙｌａｔｅ　ｃｙｃｌａｓｅ）、リポ多 糖体、凝集深及びその他の外膜タンパクなど毒性に関与する多数の因子は、コン ポーネントワクチンと比較して限定性が低い「無細胞」ワクチンに含めるべきだ とされている。最近の臨床試験の結果、ＰＴ−）キソイドのめから成るワクチン は、幼児の感染を部分的に予防するに過ぎないことが指摘されている。ＰＴ／Ｆ ＨＡ混合ワクチンは、効果がやや高いが、全細胞ワクチンと比較すると、効果が あることが知られている。

可能性の高い予防活性抗原の１つに、百日咳菌（Ｂ。

ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の全ての有毒菌株で認められる分子量が約６９，０００ダ ルトンの外膜タンパク（バータフチン）がある。このタンパクは、細菌培養中に 比較的大量に産生じ、発酵ブロスまたは細胞抽出液のいずれからも精製すること ができる。本発明は、この精製を行うための新規な方法を提供するものである。

ヒト百日咳ワクチンとしての本外膜タンパクの重要性は、ブタの気管支敗血症菌 （Ｂ、ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）に対するを予防ワクチンの創製研究の結 果から示唆された。すなわち、気管支敗血症菌（Ｂ。

ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔ　１ｃａ）の細胞表面抽出液を用いて、雌ブタの免疫を 試みたところ、分子量が６８゜０００ダルトンの細胞表面抗原に対する抗体量と 、ブタの新生仔の感染予防の間に相関が認められた。はぼ同じ分子量を有する抗 原が、百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕ　ｓ　ｓ　ｉ　ｓ、約６９，０００ダルトン） 及びバラ百日咳菌（Ｂ、ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓｌ　約７０，０００ダルト ン）で検出された。百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）がら得られたタンパク で免疫を与えたマウスは、生存菌を大瓶に接種しても発病せず、この試験で、タ ンパクに対する抗体が、マウスに受動的免疫を付与した。また、エーロゾル感染 モデルにおいてもマウスの能動的及び受動的な防御作用が報告されている。

発表されているパータフチンの精製手順では、精製度の高い非発熱原性の安定し た抗原を大量に産生することが不可能である。すでに報告されている方法（カナ ダ特許第１．２５３．０７３号）は、細胞の酸グリシン抽出、陰イオン交換クロ マトグラフィー及び分取型等電点電気泳動法に関するものである。しかし、この 方法により得られるバータフチンは、さらに小さなフラグメントに分解し、ｐＨ が低下すると分解し、またアデニル酸シクラーゼ活性を有することが報告されて いる。このため、この抽出方法はタンパクの大規模製造には望ましくないと思わ れる。また、等電点電気泳動法も、大量製造には不適当である。第２の手順は、 百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の非釆状な菌株の細胞から外膜タンパクを 抽出するものであった。このタンパクは、ＤＥＡＥ−セファ０−ス及びアフィゲ ル−ブルーによるクロマトグラフィーを併用して精製した。青色染料が精製物中 に浸出する可能性があるため、安全性に問題がある。ただし、いずれの場合にも 、発酵ブロスから直接バータフチンを精製する方法は述べられていない。

発明の概略 本発明を実施した場合、以下に記述する方法を用いて、バータフチンは、好まし い製造源である発酵ブロスから大量に、がっ精製された形で得ることができる。

このタンパクは、幼児の百日咳ワクチンとして広く用いる製剤に封入することが できる。

発酵槽内で細菌を培養し、遠心分離および濾過におよりで細胞を除去し、上溝を 濃縮減菌する。このブロスを低イオン強度に希釈し、その他の抗原を除去した後 、各種の担体を用いたクロマトグラフィーで分離し、さらには限外濾過により、 パータフチンを精製する。

また、本タンパクは、細胞から尿素で抽出し、遠心分離し、さらに前記の方法で 処理可能な溶液を調製することもできる。

ゆえに本発明は、１面では、バータフチン以外の百日咳菌抗原の含有量はかなり 低いが、夾雑物を含むバータフチン水溶液を供給し、前記の水溶液を微粒子のイ オン交換媒体及びゲル濾過媒体に順次通して接触させることにより、前記溶液中 のパータフチンを精製し、得られた精製溶液を限界濾過することからなるバータ フチンの精製方法を提供するものである。

本法により精製した場合、得られた精製物はきわめて安定であり、アデニル酸シ クラーゼ活性は検出されない。ゆえに、本発明の別の側面は、検出可能な量のア デニル酸シクラーゼ活性を有さず、生物学的に純度が高くかつ安定なパータフチ ンを提供するものである。

発明についての記述 本発明で記載する工程は、百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のみを培養し、 百日咳用コンポーネントワクチンとして用いることのできる数種のタンパク抗原 の精製を可能にするものである。

本発明では、調節条件下の発酵槽内で百日咳菌（Ｂ。

ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）を培養する。各抗原について、特異的な酵素免疫抗体法（ ＥＬＩＳＡ）により測定した、百日咳菌タンパク（ＰＴ、ＦＨＡ及びバータフチ ン）が所定の濃度に達するまで、炭素源及び増殖因子を発酵期間中に所定の間隔 で連続的、またはバッチに添加する。発酵槽内の培地を取り出し、遠心分離によ り大部分の細胞を除去し、望ましくは孔径約０．２μの既知のメンブランフィル タ−を用いて、マイクロフィルトレージョンして殺菌する。限外濾過薄膜により 、この培地を約１０倍に濃縮し、百日咳毒素及びＦＨＡの精製に用いる（ヨーロ ッパ特許出願公開第０．３３６．７３６号：米国特許第４，９９７，９１５号参 照、これらの特許の開示内容をここに引用する）。取り出した細胞は、凝集素を 精製するために使用する。バータフチンは培地または細胞のいずれからも精製す ることができる。タンパクの大部分は培地中に存在することから、望ましくは培 地を用いる。

バータフチン精製の第１段階として、培地を低イオン強度になるよう希釈し、Ｆ Ｔ及びＦＨＡ抗厘を除去するため、パーライトまたはその他の適当な微粒子状の 固体吸収剤を用いたクロマトグラフィーを行うことが必要である。これについて は、前記のヨーロッパ特許出願公開第０．３３６，７３６号、米国特許第４゜９ ９７．９１５号に詳述されている。このＰＴ及びＦＨＡ抗原は、高イオン強度の 水溶液により吸収剤から溶出し、百日咳菌コンポーネントワクチンに使用するこ とができる。

ここで「低イオン強度」という用語は、電導度が約１１　ｍ　Ｓ　／　ｃ　ｍ以 下、望ましくは４　ｍ　Ｓ　／　ｃ　ｍ以下の水溶液をさす。測定単位のｍＳ／ ａｍは、ミリシーメンス／センチメートルのことである。シーメンス（Ｓ）とは 、電導度の単位であり、抵抗（Ω）の逆数に相当し、ｍｈｏと表示されることも ある。用いた「高イオン強度」は、電導度が約１１ｍＳ／ｃｍ以上、望ましくは 少なくとも約５０ｍ５／ｃｍの水溶液をさす。

ついで、残った混合液は、メンブランフィルタ−で濾過して濃縮し、硫酸アンモ ニウムで析出し、生成したペレットをＴｒｉｓ−ＨＣＩなど低イオン強度の緩衝 液ｐＨ６，０〜８．５に溶解し、溶液の最終電導度を一般には約４ｍＳ／ｃｍ以 下、典型的には約３．４ｍ　Ｓ　／　ｃ　ｍとする。この溶液は、水酸北隣灰石 などのイオン交換媒倣　ならびにＱ−セファローズなどのゲル濾過媒体を用いて 連続的にクロマトグラフする。前記の緩衝液の電導度では、バータフチンは、両 力ラムとも吸着されず、流出画分中に溶出する。しかし水酸北隣灰石では電導度 が１．５ｍＳ／ｃｍ以下、またＱ−セファローズでは２．８ｍＳ／ｃｍ以下の場 合、バータフチンは両力ラムとも吸着され、水酸比隣灰石カラムでは電導度が１ ．５ｍＳ／ｃｍ以上、またＱ−セファローズカラムチは２．８ｍＳ／ｃｍ以上の １Ｉｉｆｒ液を用いて溶出することができる。

さらに、設定分子量限界（ＮＭＷＬ）が約１００〜３００ｋＤａの膜を用いた限 外濾過法でバータフチンを精製する。この場合、バータフチンは濾液中に集まる 。ＮＭＷＬ約３０ｋＤａまたはそれ以下の膜を用いて濃縮し、殺菌濾過して、そ の他の百日咳菌桃源と混合してワクチンに使用する。

別の方法として、硫酸アンモニウムを添加することにより、バータフチンをＦＨ Ａ及びＦＴとともに培養培地から沈澱される。沈殿を培地から分離し、再溶解し て適当な水溶液を調製し、前記の方法で処理してまずＰＴ及びＦＨＡを除去し、 次にバータフチンを精製する。

バー９　’）　ｆ　：／　ハ、百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉＳ）の細胞から も精製することが可能である。高濃度（例えば４Ｍ）の尿素を含む溶液を用い、 室温で約１゜５時間細胞を、抽出する。遠心分離により細胞の砕片を除去し、タ ンパクを含む上清をＮＭＷＬ　１００〜１０００ｋＤａの膜を用いて濾過する。

凝集素などの高分子タンパクは残るが、大部分のバータフチンは濾過される。濾 液を濃縮し、ＮＭＷＬ　３０　ｋ　Ｄ　ａまたはそれ以下の膜を用いてダイアフ ィルトレージョン（ｄｉａｆ　ｉ　１ｔｒａｔ　１ｏｎ）ｌ、た後、硫酸アンモ ニウムにより沈澱させ、遠心分離により、前記の処理に用いるベレットを得る。

バータフチンは、蛋白解裂を受けやすいことが報告されているが、本発明による 方法を用いて精製した場合にはきわめて安定である。５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分 析したところ、精製バータフチンは均質で、分子量が３０〜４０ｋＤａの分解物 が微量認められるだけで、基本的には分解は認められなかった。２〜８℃、ある いはさらに高温（２４℃、３７℃）で数か月保存した後も、分解または、免疫抗 原性の変化は認められなかった。先願の特許（カナダ特許第１，２５３，０７３ 号）と比較して、本方法により調製されたバータフチンはアデニン酸シクラーゼ 活性を含まず、安定性が増大することにより、百日咳菌（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉ Ｓ）の予防に用いるコンポーネントワクチンとして理想的である。

実施例 本発明で使用したタンパク生化学的および免疫化学的方法は、本明細書ならびに 本実施例で詳細には記載されていないが、関連する科学的文献には詳細に報告さ れており、当該技術分野の専門家には十分理解できるものである。

実施例　１ 本実施例では、培養槽中における百日咳菌（Ｂ。

ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の生育について説明する。

百日咳菌（Ｂ、　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）は、２５０Ｌのブロア、（Ｓｔａｉｎｅ ｒ−５ｃｈｏｌｔｅの改良培地）を含む培養槽に接種した。培養期間中に、抗原 の収量を増強するため、グルタミン酸−ナトリウム塩、ならびにグルタチオン、 硫酸第一鉄、塩化カルシウム、アスコルビン酸、ナイアシンおよびシスティン等 の主賓要素を培地に添加した。４８時間培養したのち、培地を遠心分離してほと んどの細胞を除去し、ＰＴ、　ＦＨＡおよび大部分のバータフチンを含む上溝を 、酢酸セルロース膜（孔径ｏ、２２μｍ）を用いた限外濾過によってさらに精製 した。殺菌した濾液をＮＭＷＬ２０　ｋＤａの膜で約倍に濃縮し、桃源特異性Ｅ Ｌ　ｒ　ＳＡｓによりタンパク濃度および抗原を検定した。

実施例　２ 本実施例では、パーライトカラムクロマトグラフィーによるＰＴおよびＦＨＡの 大規模抽出について説明する。

実施例１と同様に調製した培地濃縮液を水で希釈して、伝導度を４ｍＳ／ｃｍま たはそれ以下とし、あらかじめ水で平衡化したパーライトカラム（高さ１２ｃｍ Ｘ　直径３７　ｃｍ）を用い、タンパク対パーライト比約３ｍｇ／ｍｌ、約１０ ０　ｃｍ／時間の直線流速でクロマトグラフィーを行った。パーライトに吸着さ れたタンパクのほとんどはＦＴおよびＦＨＡであり、バータフチンは流出液中に 検出された。

実施例　３ 本実施例では、硫酸アンモニウム分画を用いたパータフチン沈澱の生成について 説明する。

実施例２から得られたカラム流出画分を、ＮＭＷＬｌｏ　ｋＤａの膜を用いた限 外濾過により約１０Ｌに濃縮した。これにより得られる溶液中のタンパク濃度は 、通常１〜２ｍｇ／ｍｌであった。室温で攪拌しながら、硫酸アンモニウム（濃 縮液１０Ｌに対して３゜５　Ｋｇまたは３５％ｗ　／　ｖ　）をゆっくりと添加 し、混合液を放置して溶解させたのち、２〜８℃の冷蔵庫に置き、さらに２時間 、望ましくは１夜攪拌した。遠心分離によって沈澱を集め、１０　ｍＭのトリス ・ＨＣｌｍｍ液、ｐＨ６，０〜８．５．２　Ｌニｍ解１．り。

この２　Ｌの溶液に硫酸アンモニウム（５００ｇ）ｅゆっくりと添加し、溶液を ２〜８℃に冷却したのち、少なくとも２時間、通常は１夜攪拌して２回目の硫酸 アンモニウム分画（２５％Ｗ　／　Ｖ　）を行った。最後に、遠心分離によって 沈澱を集め、２　Ｌのトリス・ＨＣＩ緩衝液、ｐＨ７，５、に溶解し、硫酸アン モニウム（伝導度が３．４　ｍ３７ｃｍ以下の場合）または１０ｍＭのトリス・ ＨＣｌ１ａ衝液、ｐＨ７，５（伝導度が３．４　ｍＳ７ｃｍ以上の場合）のいず れかを添加して伝導度を約３．　４　ｍ５７ｃｍに調整した。

実施例　４ 本実施例では、百日咳菌培養培地の濃縮液からのバータフチンの沈澱化について 説明する。

培養培地の濃縮液に硫酸アンモニウム（２５０ｇ／Ｌ）を添加し、混合液を２〜 ８℃に冷却したのち、２時間以上攪拌した。遠心分離により沈澱を集め、１０ｍ Ｍのトリス・ＨＣ１ｗｔ衝液、ｐＨ７，５に溶解し、伝導度が４．０　ｍ５７ｃ ｍまたはそれ以下になるまで同一緩衝液を添加した。この溶液には、ＦＴ。

ＦＨＡおよびパーチクチンが含まれていた。この溶液からＦＴおよびＦＨＡを除 くため、パーライトクロマトグラフィーを行い（実施例２と同様）、カラム流出 液について水酸化燐灰石およびＱ−セファローズクロマトグラフィー（実施例５ 参照）を行った。

実施例　５ 本実施例では、水酸化燐灰石およびＱ−セファローズによるパーチクチンのクロ マトグラフィーについて説明する。

水酸化燐灰石を適当な大きさ、望ましくは直径５ＣｍＸ　高さ１０　ｃｍのカラ ムに充填し、１５ｍＭの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのトリス・ＨＣＩ緩衝 液、ｐＨ７，５（伝導度約３．４　ｍ５７ｃｍ）で平衡化した。Ｑ−セファロー ズも同じ大きさのカラムに充填し、同一の緩衝液で平衡化した。Ｑ−セファロー ズカラムの上に、水酸化燐灰石カラムを直列に接続した。再溶解したバータフチ ン（実施例３で得られたもの）は、直列に接続したカラムでクロマトグラフィー を行った場合、吸着剤に吸着されなかったので、流出画分を集めた。ＮＭＷＬ３ ００　ｋＤａの膜で濾過し、パーチクチンを含む濾液を濃縮し、ＮＭＷＬ３０ｋ Ｄａ以下の膜を用いてダイアフィルトレージョンを行い、最後に０２２μｍの膜 を用いて殺菌濾過した。

実施例　６ 本実施例では、Ｑ−セファローズに対する吸着によるバータフチンの精製につい て説明する。

実施例２で得られたパーライトカラム流出画分を約７　Ｌに濃縮した。この濃縮 液中のタンパク濃度は、通常１５〜３．０　ｍｇ／ｍｌの範囲内にあった。

濃縮液に、硫酸アンモニウムの結晶を約３５％（Ｗ／Ｖ）の割合で添加した。こ れを２〜８℃で２時間以上攪拌した。集めた沈澱を、約５００ｍ１の１０ｍＭト リス・ＨＣＩＲ衝液、ｐＨ８，０に溶解し、ついで硫酸アンモニウム（１００ｇ ／Ｌ）で沈澱させた。２〜８℃で少なくとも２時間攪拌したのち、遠心分離によ って上溝を分取した。さらに上滑に硫酸アンモニウム（１００ｇ／Ｌ）を添加し 、パータフチンを沈澱させた。沈澱を１０ｍＭのトリス・ＨＣｌ１衝液、ｐＨ８ ，０に溶解し、さらに伝導度を約３．　４　ｍＳ／Ｃｍに調整した。実施例と同 様に、水酸化燐灰石およびＱ−セファローズカラム（それぞれ直径１１ｃｍＸ　 高さ８　ｃｍ）に通して精製し、３００　ｋＤａ膜で限外濾過し、１０〜３０　 ｋＤａの膜で濃縮した。

ついで、透析、ダイアフィルトレージョンまたは溶媒交換カラムを用いて、バー タフチンを１０ｍＭのトＩＪＸ・ＨＣＩ！衝液、ｐＨ８，０（伝導度約０．　６ ｍＳ／ｃｍ）に転溶させたのち、１０ｍＭのトリス・ＨＣ１ａ衝液、ｐＨ８，０ で平衡化したＱ−セファローズカラム（直径１１ｃｍＸ　高さ８ｃｍ）に吸着さ せた。５　ｍＭの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのトリス−ＨＣＩＭ／Ｌ衝液 、ｐＨ８，０（伝導度約１．７　ｍ３７ｃｍ）でカラムを洗浄し、１０〜１００ ｍＭ（望ましくは５０ｍＭ）の燐酸緩衝液、ｐＨ８，０でバータフチンを溶出さ せた。精製したバータフチンをＰＢＳに転溶させ、殺菌濾過した。

別の方法としては、硫酸アンモニウムによる沈澱化工程ののち、イオン強度を約 ３．４　ｍ５７ｃｍに調整したバータフチン溶液を水酸化燐灰石カラムのみに通 してもよい。カラム流出画分を濃縮し、１０ｍＭのトリス・ＨＣ１ｇ衝液、衝液 Ｈ８，０に転溶させ、直接Ｑ−セファローズカラムに吸着させる。５ｍＭの硫酸 アンモニウムを含む１０ｍＭのトリス・ＨＣｌ、＠漬液、ｐＨ８，０でカラムを 洗浄したのち、１０〜１００　ｍＭ　（望ましくは５０ｍＭ）の燐酸鑵漬液、ｐ Ｈ８、０でＱ−セファローズカラムからバータフチンを溶出させる。精製したバ ータフチンを３００　ｋＤａ膜に通して限外濾過し、濃縮し、１０〜３０　ｋＤ ａの膜でダイアフィルトレージョンし、殺菌濾過する。

実施例　７ 本実施例では、百日咳菌（Ｂ、　ｐｅｒｔｕｓｓｉＳ）の細胞からバータフチン を抽出する方法について説明する。

百日咳菌（Ｂ、　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）細胞（５％ｗ　／　ｖ　）を４　Ｍの尿 素を含む燐酸緩衝食塩水（１０ｍＭの燐酸ナトリウム、ｐＨ７，５と０．１５Ｍ の塩化ナトリウム（ＢＰＳ））に懸濁させ、１５秒〜６０分間分散させ、室温で １．　５時間攪拌した。５〜６０００　ＸＧで遠心分離を行って細胞の破片を除 去した。細胞抽出液を１００　ｋＤａまたは３００ｋＤａ膜に通して、保持され たものを２〜３倍量のＢＰＳでダイアフィルトレージョンした。膜を通った濾液 とダイアフィルトレージョンされた濾液を一緒にし、ＮＷＭＬ３０　ｋＤａ以下 の膜を用いてもとの容積の１１５に濃縮し、さらに５倍量のＰＢＳを用いてダイ アフィルトレージョンした。

実施例　８ 本実施例では、百日咳菌（Ｂ、　ｐｅｒｔｕｓｓｉＳ）細胞抽出物からのパータ フチンの調製について説明する。

実施例７で得られた膜保持物に、室温で硫酸アンモニウム（２５％Ｗ　／　Ｖ　 ）をゆっくりと添加して沈澱させ、混合物を２〜８℃でさらに２時間、望ましく は１夜攪拌した。１５ｍＭの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのトリス・ＨＣＩ 緩衝液、ｐＨ７，５と同じ伝導度（３，５ｍＳ／ｃｍ）が得られるように飽和硫 酸アンモニウムを添加した１０ｍＭのトリス・ＨＣ１緩衝液、ｐＨ７，５に溶解 した。ついで、実施例５と同様に、水酸化燐灰石／Ｑ−セファローズクロマトグ ラフィーによって純粋なバータフチンを得た。

実施例　９ 本実施例では、その他の抗原と組み合わせたバータフチンの免疫原性について説 明する。　精製バータフチンの溶液を燐酸アルミニウム（３ｍｇ　７ｍ　１　） 　ｔ’を釈して調製した各種用量（１〜２０μｇ）のバータフチンに一定用量の ＦＴトキソイド、ＦＨＡ　トキソイドおよび凝集原を添加した。試験Ｏ日目およ び２１日目にモルモット（１群１０匹、体重範囲４００〜４５０ｇ）に注射し、 試験２８日目に採血した。バータフチンは１μｇの低用量でも良好な抗体反応を 示した。

１〜１０μｇの用量では抗体反応に顕著な差は認められず、パータフチンのロッ ト間でも変動は認められなかった（下表１参照）。

実施例　１０ 本実施例では、精製したバータフチンの安定性について説明する。

バータフチンのみの場合、燐酸アルミニウムと混合した場合およびその他の百日 咳抗原と混合してワクチン製剤にした場合についてバータフチン抗原の安定性を 検査した。バータフチン（燐酸アルミニウムを添加しないもの）を−２０℃、２ 〜８℃、２４℃および３７℃で所定時間保存した。２０ツトを用い、それぞれ保 存剤（チメロサルおよびフェノキシエタノール）を添加して試験した。いずれの 保存剤を添加した場合にも、少なくとも３力月間、バータフチン特異性ＥＬＩＳ Ａ値の減少は認められなかった。保存剤としてフェノキシエタノールを使用した 場合には、６および１２力月時に特異性ＥＬＩＳＡ値の減少が認められた。結果 は下表ＩＩに示す。

燐酸アルミニウムを用いて調製したワクチン製剤は、２〜８℃、２４℃および３ ７℃で保存した。抗原の安定性は、外観、バータフチン特異性ＥＬＩＳＡ、タン パク濃度、Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ、単−特異性抗バータクチン血清を用 いたウェスタン分析およびモルモットを用いた免疫原性試験で評価した。下表Ｉ ＩＩに示したごとく、パータフチンは単独でも、いずれのアジュバントまたはそ の他の抗原と混合した場合にも、保存期間中に変化が認められなかった。実験に 使用した材料は、バータフチンのみを燐酸アルミニウムアジュバントと混合した もの、および燐酸アルミニウムを用いてワクチンに製剤したものである。

記述の要約 上記の記述を要約すると、本発明はコンポーネントワクチンの成分として配合す るのに適した形のバータフチンを、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ種の培養生産物か°ら のカラムクロマトグラフィーと限外濾過を用で回収する新規な方法を提供する。

本発明の範囲ないで種々の変法が可能である。

バータフチンの用量相関反応及び生成の一貫性抗原６９１ｄ）ａ１迷 ロット＃　μｇ　μｇ／Ｉｔ　抗６９Ｋｂ力佃１６９）ｄ）ａ　λ０９．美±０ ．８ ６９　）ｄ）ａ　２０．０　１０．８０±０．７ＣＰａ０１”　ａｏ　５．４０ 　１００±１２０ＣＰ＆　６．０　６．５７　９．０Ｏｆ０．５８ＣＰ４ｅ４Ａ ”　巳０　６．１）　１■±Ｌはａ）　＝Ｌｏ　ｇ２（ＨＪｉ力価／１００）° 群当たり動物８匹傘　＝これらの材粍よ、ワクチン製剤であった。

投与量　抗原は、１ｍＬに溶解し、動物光たり投与量は、試験０８目で０．５ｍ Ｌ、試験２１日目で０．５ｍＬであった。試験２８日目に採血した。

表ＩＩ 単独の保存安定性 試料　保存期間（試験→月目）　僅イｐシ隻α刀　タンパク（ａ）（μｖ−Ｕ　 ＥＬＩＳＡ（μＶ吐）（月） Ｇ２３６１−７７（０１４９’ｂｌ　ＮＤｌ　６　１２５１４３ Ｇ２３６１−Ｐ　Ｏ１４９（ｂ）！［）Ｇ２３６１−ＴＨ＝防腐剤として０．０ １％のチメロサールを含むバーワクチン製剤Ｇ２３６１−Ｐ　＝防腐剤として０ ．５％の２−フェノキシエタノールを含むノ（−ワクチン製剤 ａ）　＝試料中のタンパク濃度は、試料にＴＡＣを添加して沃澱七せ、ＢＣＡ検 定（Ｐｉｅｒｃｅ）によって測定した。

ｂ）　二〇時における試料中のタンパク濃度は、Ｋｊｅｌｄａｈｌによって測定 した。

表ＩＩＩ ワクチン製剤中のパータフチンの保存安定性保存期間　保存温度　Ｅ工込 ロット＃　（月）　（’Ｃ）　（μＶ吃）　抗日ｋＤａ力価＋ａ＋Ａ６９ＫＯＯ ＩＰｂ）　０　６　Ｋ）　ＮＤ３　６　５６　１０．７±１２８ ６　６　４２　９．９±０．８３ Ａ６９ＫＯＯ２ＰＣ）　０　６　９９　１１．２ｆＬ　２８６　６　ＮＤ　９． ９±１０ Ａ６９に＠３Ｐｄ）　Ｏ６５８１０，９±０．６４６　６　ＮＤ　９．５±ＬＯ σ暫聾壱）　０　６　１材　１０．１土α７４６　ｇ、６３　９．　Ｏｆｆ、　 ００ ３　２４　＆４３　９．０±０．８９ ３７　７．３５　９．２±０．＆４ ９　６　＆１９　１０．５±０．８５ ＣＰａｌｆ）　ＯＳ　５．４　９．０Ｌ２０３　５　ａ５５　１０．６±０．９ ２ ６　５　ａ６７　９．１ｔ−１１３ 注゛試料ｂＳｃ及びｄは、注射直前に試料を希釈してバータフチンの濃度を６μ ｇ／ｍＬとし、試験０８目には０．５ｍＬ、試験２８日目には０．５ｍＬを各動 物に投与した。

注゛試料ｅ及びｆについては、抗原を１ｍＬに溶解し、動物光たり投与量は、試 験Ｏ日程で０．５ｍＬ、試験２８日８で０．５ｍＬであった。

ａ）＝Ｌ□ｇ２　俄正力価／１００）：群当たり動物８匹ｂ）＝リン酸アルミニ ウムに吸着させたバータフチン溶液。５４μｇ／ｍＬのバータフチン１含む。

Ｃ）＝リン酸アルミニウムに吸着させたバータフチンａ１３４μｇ／ｍＬのバー タフチンを含む。

ｄ）＝リン酸アルミニウムに吸着させたバータフチン溶液。７７μｇ／ｍＬのバ ータクチ７針含む。

ｅ）＝１０μｇ／ｍＬのバータフチンを含むワクチン製剤ｆ）＝６μｇ／ｍＬの バータフチンを含むワクチン製剤要約書 Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの培養における培養液あるいは菌体 からアデニレートシクラーゼ活性が検出されないバータフチン（以前は６９ｋＤ ａ蛋白質とよばれていた）が生物学的に安定で純粋な形で回収された。培養液は 百日咳毒素（ＦＴ）および糸状血球凝集素（ＦＨＡ）を選択的に除去するために 処理され、バータフチンは硫酸アンモニウムにより沈澱させられ、沈澱はｐＨ６ ，０〜８５の緩衝液に溶解さＬ　得られた溶液は最終的な限外濾過の前にヒドロ キシアパタイト及びＱ−セファロースクロマトグラフカラムに通された。菌体は 尿素での抽出にかけられ、抽出液は限外濾過およびダイアフィルトレージョンに かけられた。バータフチンは該抽出液から沈澱し、沈澱物は上記と同様の処理に かけられた。変法において、培養液から硫酸アンモニウムによりバータフチン、 ＦＴおよびＦＨＡの沈澱がえられ、得られた沈澱は溶解され、溶液を上記にクロ マトグラフカラムにかける前にＦＴとＦＨＡが選択的に除去された。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成４年１０月　５日 園

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．來雑物を含み、百日咳毒素（ＰＴ）および糸状血球凝集素（ＦＨＡ）の含有 量がかなり低いパータクチン水溶液を供給し、 前記水溶液を微粒状のイオン交換媒体および微粒状のゲル濾過媒体に通すことに より、これらと接触させて前記水溶液中のパータクチンを精製し、その結果精製 去れた溶液を限外濾過することを特徴とするパータクチンの製造法。
2. ２．前記のパータクチン、ＰＴおよびＦＨＡを含む百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌ ｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）培養培地を供給し、前記の培地から前記のＰＴおよび ＦＨＡを選択的に除き、 ついで前記の培地からパータクチンを沈澱させ、前記のパータクチン沈澱を溶解 させて前記の水溶液を調製することにより、前記の來雑物を含む水溶液を調製す ることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記の溶液に硫酸アンモニウムを添加して、前記のパータクチンを沈澱させ ることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
4. ４．百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）を培養した培地か らバータクチン、ＰＴおよびＦＨＡを沈澱させ、 前記沈澱の水溶液を調製し、 得られた溶液から前記のＰＴおよびＦＨＡを選択的に除去することにより來雑物 を含む前記の溶液を調製することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
5. ５．前記の溶液に硫酸アンモニウムを添加して、前記の培養培地から前記のパー タクチン、ＰＴおよびＦＨＡを沈澱させることを特徴とする、請求項４に記載の 方法。
6. ６．百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の細胞からパータ クチンを抽出し、限外濾過により抽出物から高分子タンパクを除去し、限外濾過 した抽出物からパータクチンを沈澱させ、前記パータクチン沈澱を溶解して前記 の水溶液を調製することにより前記の來雑物を含む溶液を調製することを特徴と する、請求項１に記載の方法。
7. ７．ＮＭＷＬ１００〜１０００　ｋＤａの膜を用いて、前記の抽出物の前記限外 濾過を行うことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
8. ８．前記の沈澱の調製に先だって、ＮＭＷＬ３０　ｋＤＡまたはそれ以下の膜を 用い、前記の限外濾過した抽出物をダイアフィルトレーションすることを特徴と する、請求項６または７に記載の方法。
9. ９．前記の限外濾過した抽出物に硫酸アンモニウムを添加することにより、前記 のバータクチンを沈殿させることを特徴とする、請求項６、７または８に記載の 方法。
10. １０．前記の沈澱させたパータクチンを、ｐＨ約６．０〜約８．５の低イオン強 度の緩衝液に溶解することを特徴とする、請求項３または６に記載の方法。
11. １１．前記の緩衝液が４ｍＳ／ｃｍ以下のイオン強度を有することを特徴とする 、請求項１０に記載の方法。
12. １２．前記の微粒状のイオン交換媒体が水酸化燐灰石であることを特徴とする、 請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
13. １３．前記の微粒状のゲル濾過媒体がＱ−セファローズであることを特徴とする 、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
14. １４．１００〜３００ｋＤａの膜を用いて、前記の精製溶液の前記限外濾過を行 うことを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
15. １５．ＮＭＷＬ３０　ｋＤａまたはそれ以下の膜を用いて、前記の限外濾過精製 溶液をさらに濃縮することを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
16. １６．検出可能なアデニレートシクラーゼ（ａｄｅｎｙｌａｔｅ　ｃｙｏｌａｓ ｅ　活性）を有さない生物学的に純粋で安定なパータクチン。
17. １７．生理学的に影響のない担体を含み、予防免疫活性を有し、生物学的に純粋 で、かつ安定であり、その活性成分として検出可能なアデニレートシクラーゼ活 性を有さないパータクチンを特徴とする百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅ ｒｔｕｓｓｉｓ）の感染を予防するワクチン。
18. １８．前記ワクチン中に、パータクチン以外に少なくとも１種類の予防免疫活性 を有する百日咳菌抗原を含むことを特徴とする、請求項１７に記載のワクチン。
19. １９．前記のパータクチン以外の少なくとも１種類の予防免疫活性を有する抗原 が、ＰＴ、ＦＨＡまたは血液凝固素であることを特徴とする、請求項１８に記載 の方法。