KR100303622B1

KR100303622B1 - 셀룰라제 변이체

Info

Publication number: KR100303622B1
Application number: KR1020007003130A
Authority: KR
Inventors: 쉴라인마틴; 프레드홀름헨리크; 효르트카르스텐마일란트; 라스무센그레테; 닐센에곤; 로스홀름페테르
Original assignee: 피아 스타르; 노보자임스 에이/에스
Priority date: 1992-10-06
Filing date: 2000-03-23
Publication date: 2001-09-24
Also published as: MX9306229A; FI951629A; JPH08501692A; EP1431389A2; EP0663950A1; EP0663950B1; KR100303619B1; US5792641A; JP3681750B2; EP1431389A3; KR100303621B1; US6114296A; FI951629A0; ATE262035T1; DE69333454D1; WO1994007998A1; DE69333454T2

Abstract

셀룰로스결합 도메인(CBD), 촉매활성 도메인(CAD) 및 셀룰로스결합 도메인과 촉매활성 도메인을 연결하는 부위(연결부)로 이루어지는 모 셀룰라제, 예컨대Humicola insolens43 kD 엔도글루칸아제 같은 패밀리 45 로 분류되는 셀룰라제의 셀룰라제 변이체에서, CBD, CAD 또는 연결부의 하나 이상의 아미노산 잔기를 결실시키거나 또는 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 치환시키고 및/또는 하나 이상의 아미노산을 연결부에 첨가시키고 및/또는 촉매활성 도메인의 반대쪽 말단에 다른 CBD 를 첨가시켜서 가령 알칼리 활성, 세정제 조성물 성분과의 적합성, 입자성 얼룩 제거, 색깔정화, 보풀제거, 거칠음 감소, 및 음이온성 계면활성제와 퍼옥시다제 표백시스템에 대한 민감성에 관하여 개선된 성질을 갖게 되고, 예컨대 직물처리용 세정제 조성물, 제지용 펄프 공정, 동물사료 및 진의 스톤 세척에서 유용하게 되었다.

Description

셀룰라제 변이체{CELLULASE VARIANTS}

(발명의 분야)

본 발명은 개선된 성질을 갖는 셀룰라제 변이체에 관한 것이다.

(발명의 배경)

셀룰로스를 분해할수 있는 효소(하기에서는 '셀룰로스 분해효소' 또는 '셀룰라제' 라고 명명함)는 셀룰로스의 비-결정질 부분을 제거하여 펄프의 결정질 셀룰로스의 비율을 증가시키기 위해 제지용 펄프 가공에서 이용되고, 글루칸의 소화성을 개선하기 위해 동물 사료에서 이용될수 있다. 셀룰로스 분해효소의 추가의 중요한 용도는 직물처리, 예컨대 면직물의 거칠음의 감소(가령 GB 1,368,599 또는 US 4,435,307 참조), 직물의 얼룩제거 및 색깔정화(가령 EP 220 016 참조) 또는 색깔에 국부적인 변화를 제공하여 직물에 '스톤-와시'(stone-washed)모양의 부여(가령 EP 307 564 참조)를 위한 것이다.

셀룰로스 분해효소의 실제 이용은 여러가지의 단일 셀룰라제 성분의 복합 혼합물이고 다소 낮은 비활성을 가질수 있는 알려진 셀룰라제 제제의 성질에 의해 어느정도는 방해되었다. 복합효소계에서 단일 성분의 생성을 최적화하여 공업적 비용면에서 셀룰로스 분해효소의 효과적인 생성을 제공하는 것은 어렵고, 원하는 효과를 얻기위해서 다소 많은 양의 효소를 이용할 필요성에서 생기는 어려움에 의해 그것의 실제 사용이 방해되었다. 이전에 제안된 셀룰로스 분해효소의 결점은 높은 비활성에 대해서 선택된 단일성분 효소를 이용함으로써 치유될수 있다. 단일성분 셀룰라제는 가령 WO 91/ 17243, WO 91/17244 및 WO 91/10732에서 기술되었다.

셀룰라제의 개선된 성질은 그러한 개선된 성질을 나타내는 셀룰라제 변이체를 얻기위해서 특정 셀룰라제를 발현하는 DNA 서열에서의 하나 이상의 특정 돌연변이에 의하여 얻어질수 있다는 것을 추가 연구는 보여주고 있다.

따라서, 본발명은 셀룰로스결합 도메인(CBD), 촉매활성 도메인(CAD) 및 셀룰로스결합 도메인과 촉매활성 도메인을 연결하는 부위(연결부)로 이루어지는 모(母) 셀룰라제의 셀룰라제 변이체에 관한 것인데, 셀룰라제 변이체의 성질을 개선하기 위해서 CBD, CAD 또는 연결부의 하나 이상의 아미노산 잔기를 결실시키거나 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 치환시키고 및/또는 하나 이상의 아미노산을 연결부에 첨가시키고 및/또는 촉매활성 도메인의 반대쪽 말단에 다른 CBD를 첨가시켰다.

본발명의 셀룰라제 변이체의 개선된 성질은 본발명의 다양한 면과 구체예에 대해 하기에서 더욱 기술되는 것처럼 연결부에서 또는 CBD에서 또는 CAD에서 또는 이러한 부위와 도메인의 어떤 조합에서 모 셀룰라제를 변화시킴으로써 얻을수 있다.

본발명의 한면에서는 하나 이상의 아미노산 잔기를 연결부로부터 결실시키거나, 또는 하나 이상의 아미노산을 연결부에 첨가하거나, 또는 프로테아제에 의한 가수분해에 민감한 상기 연결부의 하나 이상의 아미노산 잔기를 프로테아제에 의한 가수분해에 내성이 있는 하나 이상의 아미노산 잔기에 의하여 치환, 결실 또는 삽입함으로써 단백질 분해효소에 의한 분해에 대한 셀룰라제 변이체의 민감성이 감소된 셀룰라제 변이체가 제공되었다.

본발명의 다른 면에서는 셀룰라제 변이체의 결합성질을 하기에 의해 변형시킨 셀룰라제 변이체가 제공되었다:

(a) 변형된 결합 친화성을 제공하도록 셀룰로스결합에 참여하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환함,

(b) CBD 의 하나 이상의 음전하를 띤 아미노산 잔기를 중성 또는 양전하를 띤 아미노산 잔기에 의해 치환, 결실 또는 삽입, 또는 하나 이상의 양전하를 띤 아미노산 잔기를 양전하를 띤 아미노산 잔기에 의해 치환, 또는 하나 이상의 양전하를 띤 아미노산 잔기를 중성 또는 음전하를 띤 아미노산 잔기에 의해 치환, 또는 하나 이상의 중성 아미노산 잔기를 음전하를 띤 아미노산 잔기에 의해 치환함으로써 CBD의 정전기적 전하를 변화시킴,

(c) 촉매활성 도메인의 반대쪽 말단에 다른 CBD를 첨가함,

(d) 하나 이상의 아미노산 잔기를 프롤린에 의해 치환함.

그러한 변형의 목적은 효소의 기질에 대한 결합 친화성을 변화시킴으로써 셀룰라제 - 처리 직물의 장력에 대한 효소성능의 바람직한 비율을 갖는 셀룰라제를 제공하는 것이다.

본발명의 또다른 면에서는 촉매 활성부를 함유하는 신장된 개구부(cleft), 셀룰라제 분자의 표면으로부터 상기 개구부까지 이끄는 적어도 하나의 채널, 활성부의 적어도 한 아미노산 잔기 주변의 양전하를 띤 표면부위 및 선택적으로 촉매 활성부에 접근하여 기질이 절단되는 터널을 형성할수 있는 가요성이 있는 표면 루프영역으로 이루어지는 촉매활성 도메인(CAD)을 포함하는 모 셀룰라제의 셀룰라제 변이체가 제공되는데, 여기서 바람직하게는 알칼리 조건하에서 셀룰라제 변이체의효소활성을 변화시키기 위해서 상기의 개구부, 채널 또는 표면부위의 하나 이상의 아미노산 잔기가 하나 이상의 다른 아미노산 잔기에 의하여 치환된다.

본발명의 또다른 면에서는 촉매 활성부를 함유하는 신장된 개구부, 셀룰라제 분자의 표면으로부터 상기 개구부까지 이끄는 적어도 하나의 채널, 활성부의 적어도 한 아미노산 잔기 주변의 양전하를 띤 표면부위로 이루어지는 촉매활성 도메인(CAD)을 포함하는 모 셀룰라제의 셀룰라제 변이체가 제공되는데, 여기서 음이온성 계면활성제(특히 선형 알킬술포네이트)에 대한 셀룰라제 변이체의 민감성을 감소시키기 위해서 CAD 표면의 하나 이상의 중성 아미노산 잔기는 하나 이상의 음전하를 띤 아미노산 잔기에 의해 치환하거나, 또는 CAD 표면의 하나 이상의 양전하를 띤 아미노산 잔기를 하나 이상의 중성 또는 음전하를 띤 아미노산 잔기에 의해 치환하거나, 또는 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기를 하나 이상의 비-소수성 아미노산 잔기에 의해 치환하거나, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기를 프롤린에 의해 치환한다.

본발명의 또 다른 면에서는 CBD, CAD 및 연결부로 이루어지는 모 셀룰라제의 셀룰라제 변이체가 제공되는데, 여기서는 산화 또는 표백제의 존재에 대한 셀룰라제 변이체의 민감성을 감소시키기 위해서 CAD, CBD 또는 연결부의 표면의 하나 이상의 아미노산 잔기가 산화 또는 퍼옥시다제 표백시스템에 덜 민감한 하나 이상의 아미노산 잔기에 의하여 치환된다.

본발명은 또한 본발명의 셀룰라제 변이체를 함유하는 세정제 조성물에도 관련된다.

도 1은 각각Humicola insolens,Fusarium oxysporum및Pseudomonas fluorescens의 세가지의 43kD 셀룰라제의 서열비교를 나타낸다.

도 2는 pCaHj 170 의 제조를 나타낸다.

도 3은 43 K 유전자의 부위 특이적 돌연변이유발을 보여준다.

도 4는 pCaHj 171의 제조를 나타낸다.

도 5는 pCaHj 201의 제조를 나타낸다.

도 6은 pCaHj 416 및 pCaHj 417의 제조를 나타낸다.

도 7은 주형으로서 pCaHj 201을 이용한 돌연변이체의 제조를 보여준다.

도 8은 다이드 아비셀 분석(Dyed Avicel Assay)에서 표준곡선 및 샘플반응을 보여준다.

도 9는 액체세정제에서 43 kD 셀룰라제 변이체(V221S+N222S+Q223T)의 보관 안정성을 보여준다.

도 10은 pH 7.5에서 LAS (선형 알킬술포네이트) 억제를 보여준다.

본 명세서 및 청구범위에서는 하기의 약호가 사용된다:

아미노산:

본 발명에 따른 셀룰라제 변이체를 기술할때에는 참조의 편의를 위해서 하기의 명명법을 사용한다:

본래의 아미노산(들): 위치(들): 치환된 아미노산(들)

이 명명법에 따르면, 예컨대 위치 221에서 발린 대신에 세린을 치환한 것은 다음과 같이 나타낸다: V221S

동일한 위치에서 발린의 결실은 다음과 같이 나타낸다: V221*

그리고 트레오닌 같은 추가의 아미노산 잔기를 삽입한 것은 다음과 같이 나타낸다: V221ST

다수의 돌연변이는 ＋ 에 의해 분리된다. 즉: V221S ＋ N222S ＋ Q223T

는 각각 위치 221, 222 및 223에서 발린, 아스파라긴 및 글루타민 대신에 세린과 트레오닌이 치환된 돌연변이를 나타낸다.

본 명세서에서 용어 '셀룰로스결합 도메인' (하기에서는 CBD로 나타냄) 은 셀룰라제 변이체와 셀룰로스 기질의 결합을 일으킬수 있는 아미노산 서열을 나타내도록 의도된다(가령, Kraulis, P., Clore, G.M., Nilges, M., Jones, T.A., Pettersson, G., Knowles, J. 및 Gronenborn, A.M.Trichoderma reesei의 셀로비오히드롤라제 I의 C터미날 도메인 3차원 구조의 결정. 핵자기 공명 및 하이브리드 디스턴스 기하학-동적 모의 어닐링을 이용한 연구. Biochemistry 28: 7241-7257, 1989에서 기술된 것과 같다).

용어 '촉매활성 도메인'(하기에서는 CAD로 나타냄)은 효소의 촉매부위를 포함하는 효소의 코어 영역을 나타내도록 의도된다. 가령,Gideon 등: Nature(1993) 365, p. 362-364참조.

용어 '연결부'는 CBD에 인접하며 그것을 효소의 CAD와 연결하는 부위를 나타낸다. 지금까지 확인된 연결부는 우세하게 친수성이고 전하를 띠지 않으며, 일부 아미노산이 풍부하여 서열에 가요성을 제공하는 짧은 반복 단위체를 형성하는 것을 특징으로 한다. 연결부의 가요성 구조는 CBD에 의해 셀룰로스 기질에 결합된 효소의 촉매활성 도메인의 작용을 촉진하는 것으로 믿어진다. 적합한 연결부의 실례는 N.R. Gilkes등,Microbiol.Rev.55, 1991, pp. 303-315 에서 보여진다.

용어 '결합성'은 CBD가 다른 조건하에서 결합하는 방식뿐만 아니라 CBD가 셀룰로스 기질에 결합하는 친화성을 나타낸다. 가령 CBD는 다른 pH 값에서는 다르게 결합할수 있다. 다른 조건하에서의 이러한 양태는 예컨대 상기에서 나타낸대로 CBD의 정전기적 전하를 변화시킴으로써 변형될 수 있다.

용어 '또 다른 CBD'는 다른 셀룰라제에서 유도된 CBD를 포함한다. 추가의 CBD는 '본래의' CBD가 C-터미날 말단에 위치할때 촉매 활성도메인의 N-터미날 말단에 위치할 수 있으며, 반대의 경우도 마찬가지이다. 특이적으로 프롤린에 의한 치환은 효소의 열안정성 및 프로테아제 안정성에 영향을 미치는 것으로 여겨진다.

모 셀룰라제는 바람직하게는 미생물의 셀룰라제이다. 셀룰라제는 세균성 셀룰라제, 가령Pseudomonas셀룰라제 또는 US 4,822,516, US 5,045,464 또는 EP 468,464 에서 기술된Bacillus균주, 또는B. lautus(WO 91/10732 참조) 같은Bacillus셀룰라제로부터 선택될수 있다. 더 바람직하게는, 모 셀룰라제가 곰팡이의 셀룰라제, 특히Humicola,Trichoderma,Irpex,Aspergillus,Penicillium,Myceliophthora또는Fusarium셀룰라제일수 있다. 적합한 모 셀룰라제의 실례는 가령 WO 91/17244에서 기술되었다. 적합한Trichoderma셀룰라제의 실례는 T.T. Teeri,Gene51, 1987, pp. 43-52에서 기술된 것이다. 바람직하게는 모 셀룰라제는 Henrissat, B.등:Biochem. J. (1993),293, p. 781-788에서 기술된대로 패밀리 45 로 분류되는 셀룰라제, 가령 효소 EG B(Pseudomonas fluorescens)및 EGV(Humicola insolens)로부터 선택된다.

특히 바람직한 셀룰라제는H. insolens엔도글루칸아제, 특히 WO 91/17243에서 기술된H. insolens43kD 엔도글루칸아제, 또는 그것의 유사체 같은Humicola insolens균주에서 추출된 것이다.

본 명세서에서 용어 '유사체'는 아미노산 서열이 43kD 엔도글루칸아제와 적어도 45% 동일한 셀룰라제, 또는H. insolens의 43kD 엔도글루칸아제와 동일한 전체 삼차 또는 3 차원(3D) 폴드를 채택하며 촉매작용에 관여하고 활성부위 개구부에 위치한 2 아미노산 잔기 및 선택적으로 촉매작용에 관여하고 활성부위 개구부에 면한 가요성 루프에 위치한 추가의 아미노산 잔기를 갖는 셀룰라제를 나타낸다.

서열비교는 Lipman 및 Pearson,Science 227, 1985, p. 1435에서 기술된 것과 같이 알려진 알고리즘을 통해 수행할수 있다.

단백질의 골격은 상동 단백질의 구조분석 및 서열 비교에 의하여 가요성 영역과 구조적으로 보존되는 영역으로 나눌수 있다. 가요성 영역(FR)은 진화하는 동안 골격형태가 변화되는 단백질폴드의 부분이다. 보존영역(SCR) 은 골격형태가 주로 변하지 않은 채로 남게되는 즉 동일한 폴드를 갖는 다른 단백질에서 보존되는 단백질 폴드의 부분이다. 게다가 SCR은 알려진 촉매작용잔기 또는 다른 중요한 잔기를 특정할 수 있다.

하기의 조건중 적어도 하나가 충족된다면 단백질 A는 단백질 B와 동일한 전체 폴드를 갖는 것으로 정의된다:

1. A 의 3D 구조는 4 Å 미만, 바람직하게는 3 Å 미만, 더 바람직하게는 2Å 미만인 루트 평균제곱편차로 B에 대해 정의된 SCR과 중복된다. 루트평균제곱은 B에 대해 정의된 SCR의 전체 잔기수에 의해 나누어진 SCR에 의해 등치 관계인 잔기사이의 유클리드 거리로서 계산된다;

2. 아미노산 서열은 B의 폴드를 정의하는 SCR에 적합하다.

적합성을 측정하기 위해서, Wodak, S.J. 등:Curr. Opin. Struc. Biol. 1993, 3, p. 247-259및 여기서 개시된 참고문헌에서 기술된 인버스 폴딩 문제에 대한 어떤 방법을 이용할 수 있다.

유사체의 실례는 상기의 H.J.Gilbert등에 의해 기술된Pseudomonas fluorescens셀룰라제, 및 WO 91/17243에서 기술된Fusarium oxysporum셀룰라제이다. 3 가지의 셀룰라제의 서열 비교를 보여주는 첨부된 도 1을 참조.

본 명세서에서 용어 '신장된 개구부'는 β-1,4-글루칸 중합체 기질의 적어도 3 글루코스 단위가 활성부에 접근하는 것을 허용하는 크기를 갖는 개구부를 나타낸다. 본 명세서에서 사용되는 용어의 더 나은 이해를 위해서, 촉매활성 도메인이 상술한 전체위상을 갖는 하나의 특이적인 모 셀룰라제, 즉 WO 91/17243에서 기술된 하기에서는 EG V(엔도글루칸아제 V)로서 나타낸 셀룰라제를 참조한다. 그러나, 본발명이 어떤식으로든 이러한 특정 셀룰라제의 변이체에 제한되는 것을 의도하지 않는다는 것이 이해되어야 한다.

X-선 결정학에 의해 EG V 에 대해서 세가지의 결정 구조가 해명되었다. 3 구조는 본래의 효소(Gideon 등:Nature(1993) 365, p. 362-364), 셀로비오스와 복합체화된 본래의 효소(Gideon 등: 상기에서 인용) 및 두 셀로트리오스 단위로 구성되는 생성물과 복합체화된 활성부 돌연변이체 D10N (Gideon 등, 개인통신)을 나타낸다.

효소의 전체 형태는 가요성 표면 루프를 제외하고는 세구조 모두 동일한데, 이 루프는 본래의 구조에서는 보이지 않고, 셀로비오스가 있는 구조에서는 열린 위치로 그리고 셀로트리오스 생성물이 있는 구조에서는 닫힌 위치로 고정되어 있다. EG V 에서 개구부는 약 30 Å의 길이, 약 9Å의 너비, 약 7Å의 깊이를 갖는다. 개구부의 크기는 β-1,4-글루칸의 7 글루코스 단위의 결합을 가능하게 하는데 충분하다. 이 위치를 A,B,C,D,E,F,G로 표시하는데, 절단은 위치 D 와 E 사이에서 일어난다. 하기의 표1 에서는 다른 위치 A-G에서 글루코스 단위와 상호 작용하는 EG V 의 원자들이 정의되어 있다. EG V의 절단 패턴의 분석은 위치 C-F와의 결합이 촉매작용에 필요하고 다른 위치와의 결합은 촉매작용을 증가시킨다는 것을 보여준다. 셀로트리오스 생성물이 있는 구조에서, 생성물중 하나는 위치 A-C에 결합하고 다른 생성물은 위치 E-G에 결합하는데 위치 G는 약한 결합위치이고 잘 정의되어 있지 않다. 단지 몇몇 입체 오버랩으로 위치 D에서 글루코스 단위로 모델링하는 것이 가능하다. 효소는 촉매작용동안 위치 D에서 글루코스 단위의 정상 형태를 찌그러뜨린다고 여겨진다.

어떤 기질도 결합되지 않았을때, 활성부위 개구부는 표면에서 열려서 그 안에서 글루칸폴리머의 도킹을 허용한다. 도킹동안 가요성 표면루프 부위, 잔기 111-119는 형태를 변화시켜서 Leu115가 용매노출된 위치에서 파묻힌 위치로 약 13 Å 움직여서, 위치D 와 E 사이의 절단점에서 글루칸 폴리머를 터널속에 둘러싼다.

활성부는 두 아스파르트산, Asp10 및 Asp121을 포함한다.

역학 연구 및 결정구조는 EG V가 Asp10이 촉매작용에서 일반 염기로서 작용하는 전화효소라는 이론을 지지한다. 게다가 Asp114 및 His119도 촉매작용에 중요하다는 것이 발견되었다. Asp114는 위치 D에서 글루코스 단위를 결합시키는데 관여하며 Ile131과 함께 글루코스 폴리머에 접근하고 개구부를 터널속으로 향하게 한다. 터널의 목적은 Asp121 주위의 환경으로부터 물을 밀어내서 Asp121의 양성자를 얻은 산소를 안정화시키는 것으로 여겨진다. His119는 Thr6을 통한 Asp121 의 다른 산소와의 수소결합 네트워크에 관여하는 것이 발견되었다. 이 수소결합 네트워크는 또한 Asp121의 양성자를 얻은 형태를 안정화시키는데 도움이 될수 있다. His119가 양전하를 띨때에는 근처의 양전하를 띤 다른 표면잔기와 함께 활성부가 음전하를 띨때 Asp121 위에 강한 정전기장을 유도할수 있다. 글루칸 폴리머결합에 대해 이 장은 분극을 일으켜서 글루코스 단위사이의 결합의 절단을 촉진할수 있다. 유사한 정전기장은 리소짐의 대응하는 활성산위에서 발견된다.

표면에서 개구부까지 이끄는 '채널'(이 특별한 경우에는 그러한 채널이 2개 있다)은 글루칸 폴리머의 가수분해를 위해 Asp10에 물을 공급하는 것으로 믿어진다. 게다가 채널은 기질 도킹동안 상기 개구부로부터 물을 밀어내는 수단으로 사용될수 있다.

표 1에서는 원자 명명의 표준 PDB 표시가 이용된다(Bernstein등 (1977):Insight II, Biosym Technologies, Inc.). 어떤 수소도 구조내에 존재하지 않는 것처럼 그것들이 결합된 중원소에 의해 수소에 대한 참조가 행해진다. 분석은 위치 A-C및 E-G에서 결합된 셀로트리오스를 갖는 구조에 기초한다. 결합에 참여하는 구조내에 존재하는 물분자가 명시적으로(HOH로서) 참조표시되었다. 거리 단위는 옹스트롬이다.

표 1의 특징에서 'PI-상호작용'은 두 방향족 고리사이의 상호작용을 나타낸다; '물 통과'는 어떤 물도 구조내에 존재하지 않지만, 기질과의 상호작용이 물분자를 지나서 일어날수 있는 경우를 나타낸다; '가능'은 다른 결합방식으로 기질과 상호작용할수 있는 원자를 나타낸다; '입체'는 그것이 아닌 다른 명백한 상호작용이 없는 것을 나타낸다; '촉매'는 촉매작용하는 잔기를 나타낸다.

본발명에 따르면, 셀룰라제 변이체는 바람직하게는 O-글리코실화 아미노산 잔기에서의 단백질 분해효소에 의한 절단이 존재하는 탄수화물기 때문에 입체적으로 방해된다고 밝혀졌기 때문에 연결부의 아미노산중 하나 이상이 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 치환되어 세포내에서의 변이체의 발현시 O-글리코실화의 위치를 제공하게 된 것이다. 특히 발린, 리신, 아스파라긴 또는 글루타민이 세린 또는 트레오닌에 의해 치환될 수 있다. 한편, 연결부의 하나 이상의 아미노산 잔기가 프로테아제에 의한 가수분해(세정제의 존재에서를 포함)에 내성이 있는 프롤린에 의해 치환될 수 있다.

이 구체예에서는 하나 이상의 아미노산 잔기가 하기와 같이 치환된다.

V221S,T,P

N222S,T,P

Q223S,T,P

V240S,T,P

Q241S,T,P

하기와 같이 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환하는 것이 유용할 수도 있다.

V221S ＋ N222S ＋ Q223T

V240S ＋ Q241T

더욱이 원하는 효과를 얻기 위해서 연결부의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실될수 있다. 특히 Val, Gln, Lys 또는 Asn, 또는 이러한 아미노산중 하나 또는 그 이상을 포함하는 서열이 결실될 수 있다.

그러한 변형의 목적은 기질에 대한 효소의 결합 친화성을 변화시킴으로써 셀룰라제-처리된 직물의 장력에 대한 효소성능의 바람직한 비율을 갖는 셀룰라제를 제공하는 것이다. 셀룰라제 변이체의 셀룰로스 기질, 가령 직물과의 감소된 결합을 얻기 위해서는 연결부의 아미노산 잔기의 절반까지를 결실시킬수 있다. 셀룰라제 변이체의 셀룰로스 기질, 가령 직물과의 증가된 결합을 얻기위해서는 연결부에 하나 이상의 아미노산 잔기를 첨가시킬수 있다. 적어도 이러한 추가의 아미노산(들)중 하나는 유용하게는 프롤린일수 있다.

본발명의 셀룰라제 변이체는 또한 연결부를 제공하는것 보다 다른 모 셀룰라제로부터 추출된 촉매활성 도메인 및/또는 셀룰로스결합도메인과 상기에서 기술한연결부를 조합함으로써 얻어질수도 있다는 것이 이해되어야 한다.

본발명에 따르면, 셀룰라제 변이체는 바람직하게는 하기에 의해 셀룰라제 변이체의 결합성질이 변화된 것이다:

(a) 변형된 결합 친화성을 제공하기 위해서 셀룰로스결합에 참여하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환함,

(b) CBD의 하나 이상의 음전하를 띤 아미노산 잔기를 중성 또는 양전하를 띤 아미노산 잔기에 의해 치환, 결실 또는 삽입, 또는 하나 이상의 양전하를 띤 아미노산 잔기를 양전하를 띤 아미노산 잔기에 의해 치환, 또는 하나 이상의 양전하를 띤 아미노산 잔기를 중성 또는 음전하를 띤 아미노산 잔기에 의해 치환, 또는 하나 이상의 중성 아미노산 잔기를 음전하를 띤 아미노산 잔기에 의해 치환함으로써 CBD의 정전기적 전하를 변화시킴,

(c) 촉매 활성도메인의 반대쪽 말단에 다른 CBD를 첨가함, 또는

(d) 하나 이상의 아미노산 잔기를 프롤린에 의해 치환함.

본발명의 바람직한 구체예에서는 CBD의 하나 이상의 아미노산 잔기를 하기와 같이 치환할수 있다:

E251S,Q,N,P

R252L,Q,H

V268E

A269E,R

T265R,E

W253Y,F

A254S,D,G

Q255E,R,K

W261R,Y,F

S262A,N,D

T274R

K275R,Q

I276D,Q,N

N277Q,D

D278P

W279Y,F

Y280W,F

H281S

Q282N,R

Y280F ＋ Q282N.

촉매활성 도메인의 반대쪽 말단에 CBD가 첨가된 셀룰라제 변이체로 이루어지는 구체예에서 추가의 CBD는 예컨대 하기의 문헌에서 기술된 셀룰라제중 하나로부터 유도될수 있다. WO 91/10732 또는 WO 91/17244 또는 Penttila, M.E., Lehtovaara, P., Nevalainen, H., Bhikha-bhai, R. 및 Knowles, J. Trichoderma reesei의 셀룰라제 유전자 사이의 상동성: 엔도글루칸아제 I 유전자의 전체 뉴클레오티드 서열..Gene45: 253-263, 1986; 또는 Saloheimo, M., Lehtovaara, P., Penttila, M.E., Teeri, T.T., Stahlberg, J., Johansson, G., Pettersson, G., Claessens, M. 및 Tomme, P. EG III, Trichoderma reesei 의 새로운 엔도글루칸아제. 유전자와 효소의 특정화..Gene63: 11-23, 1988; 또는 Teeri, T.T., Lehtovaara, P., Kauppinen, S., Salovuori, I. 및 Knowles, J. Trichoderma reesei 셀룰로스 분해효소의 상동 도메인: 셀로비오히드롤라제 II 의 유전자서열 및 발현..Gene51: 43-52, 1987; 또는 Sims, P., James, C. 및 Broda, P. Trichoderma reesei의 엑소셀로비오히드롤라제; 유전자와 강한 상동성을 보이는 Phanerochaete chrysosporium의 유전자의 동정, 분자 클로닝 및 특정화..Gene74: 411-422, 1988; 또는 De Oliviera Alzvedo, M.및 Radford, A. Humicola grisea var. thermoidea 의 CBH I의 서열..Nucleic Acid Research18: 668, 1990; 또는 Raguz, S., Yague, E., Wood, D.A. 및 Thurston, C.F. Aparicus-Bisporus의 셀룰로스- 생장- 특정 유전자의 분리 및 특정화.Gene119: 183-190, 1992; 또는 Koch, A. 및 Schulz, G. penicillium-janthinellum의 셀룰라제- 암호화 cdna(CBH1) 의 클로닝, 시퀀싱 및 이종 발현.Gene124: 57-65, 1993.

본발명에 따르면, 셀룰라제 변이체는 바람직하게는 셀룰라제 변이체의 효소활성을 변형시키기 위해서 촉매활성 부위를 함유하는 신장된 개구부, 셀룰라제 분자의 표면으로부터 상기 개구부까지 이끌고 활성부위에서 셀룰로스의 가수분해를 위해 상기 개구부에 물을 공급하는 적어도 하나의 채널, 및 활성부위의 적어도 한 아미노산 잔기 부근의 양전하를 띤 표면영역으로 이루어지는 촉매활성 도메인(CAD)의 하나 이상의 아미노산 잔기를 결실시키거나 또는 하나 이상의 다른 아미노산에 의해 치환한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서는 알칼리 조건하에서 셀룰라제 변이체의 효소활성을 개선하기 위해서 상기 개구부의 하나 이상의 양전하를 띤 아미노산 잔기를 하나 이상의 중성 또는 음전하를 띤 아미노산 잔기에 의해 치환함으로써, 또는 하나 이상의 중성 아미노산 잔기를 하나 이상의 음전하를 띤 아미노산 잔기에 의해 치환함으로써, 또는 하나 이상의 음전하를 띤 아미노산 잔기를 더 많은 음전하를 띤 아미노산 잔기(들)에 의해 치환함으로써 활성부위 부근의 정전기적 전하를 변화시킬수 있다.

또다른 바람직한 구체예에서, 셀룰라제 변이체는 촉매활성 도메인이 추가로 가요성 표면루프 영역을 구비한것 일수 있다. 알칼리 조건하에서 셀룰라제 변이체의 효소활성을 개선하기 위해서 상기 루프영역의 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 활성부위의 아미노산 잔기와의 수소결합 네트워크에 관여하는 하나 이상의 아미노산을 상기 수소결합 네트워크를 변화시키도록 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 치환한다.

알칼리 조건하에서 셀룰라제 변이체의 효소활성은 또한 루프의 가요성을 변화시키도록 가요성 루프영역의 하나 이상의 아미노산 잔기를 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 치환함으로써, 즉 활성부위의 아미노산 잔기와의 수소결합 네트워크에 관여할수 있는 루프의 능력을 보존함으로써 또한 개선될수 있다. 또한, 알칼리 조건하에서 셀룰라제 변이체의 효소활성을 개선하기 위해서, 활성부위 개구부의 표면의 하나 이상의 아미노산 잔기를 기질과 상호작용할수 있는 표면의 능력을 변화시키도록 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 치환할수 있다. 더욱이 알칼리 조건하에서 셀룰라제 변이체의 효소활성은 채널을 통한 물의 흐름을 변화시키도록 활성부위 개구부로 이끄는 채널의 표면의 하나 이상의 아미노산 잔기를 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 치환함으로써 개선될수 있다.

더 바람직한 구체예에서 셀룰라제 변이체는 알칼리 조건하에서 셀룰라제 변이체의 효소활성을 개선하기 위해서 양전하를 띤 표면영역의 하나 이상의 중성 또는 음전하를 띤 아미노산 잔기를 그 영역의 양전하를 증가시키도록 하나 이상의 양전하를 띤 아미노산 잔기에 의해 치환한 것이다.

하기에서 보여지는 영역 I-X는 43 kD 엔도글루칸아제 서열에서 하기의 위치에 해당한다:

영 역 잔 기

I 2-21

II 44-48

III 55-60

IV 65-67

V 72-75

VI 95-103

VII 109-123

VIII 128-136

IX 142-148

X 175-185

변이체H. insolens43kD 엔도글루칸아제 또는 상동 셀룰라제의 한 구체예에서, 상기의 개구부, 채널(들) 및/또는 루프의 표면형태는 상기에서 보여지는 영역 I-VII 또는 IX-X 중 하나 이상에서, 또는 위치 28,37또는 90 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환함으로써 변화될수 있다. 보다 특이적으로는 43kD 엔도글루칸아제의 위치 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 15, 18, 20, 21, 44, 45, 48, 74, 110, 114, 117, 119, 121, 128, 131, 132, 147, 176, 178 또는 179 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환함으로써 상기 개구부의 표면형태를 변화시킬수 있다. 마찬가지로 상동 셀룰라제의 대응 위치에서 아미노산 잔기가 치환될수 있을 것이다.

다른 구체예에서는 상기에서 보여지는 영역 VII에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환함으로써 표면형태 및/또는 루프영역의 수소결합 성질을 변화시킬수 있다. 보다 특이적으로는 위치 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 또는 119 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환함으로써 상기 루프영역의 표면형태를 변화시킬수 있다. 마찬가지로 상동 셀룰라제의 대응 위치에서 아미노산 잔기가 치환될수 있을 것이다.

다른 구체예에서는 영역 I, III, V 또는 VII-IX 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환함으로써 상기 채널(들)의 표면형태를 변화시킬수 있다. 보다 특이적으로는, 위치 9, 14, 28, 37, 55, 58, 59, 60, 63, 72, 78, 109, 118,123, 129, 131, 132, 133, 136, 142, 145, 146, 158, 163, 176, 179, 186 또는 196 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환함으로써 상기 채널(들)의 표면형태를 변화시킬수 있다. 유사하게 상동 셀룰라제의 대응 위치에서 아미노산 잔기가 치환될수 있을 것이다.

또 다른 구체예에서는 영역 IV, VI 또는 X중 하나 이상에서 또는 위치 2에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환함으로써 양전하를 띤 표면영역의 정전기적 양전하를 변화시킬수 있다. 보다 특이적으로는 2, 13, 20, 44, 65, 66, 67, 90, 95, 96, 97, 98, 100, 102, 103, 175, 176, 178, 179, 180, 183 또는 185중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환함으로써 정전기적 양전하를 변화시킬수 있다. 유사하게 상동 셀룰라제의 대응 위치에서 아미노산 잔기가 치환될수 있을 것이다.

또다른 구체예에서는 위치 55, 74, 90 또는 123중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환함으로써 상기 개구부의 정전기적 음전하를 변화시킬수 있다. 마찬가지로 상동 셀룰라제의 대응 위치에서 아미노산 잔기가 치환될수 있을 것이다. 보다 특이적으로는 하나 이상의 아미노산 잔기가 하기와 같이 치환될수 있다:

D2N

S5A

T6S

Y8F

W9S,G

D10E

K13R

S15N,A,D

W18H

K20R

V28T

R37N,S,A

K44R

S45N,D

E48D,Q,A

S55E,D

D58N,S,A

Q59S,A,G

N65R

D66R,N

D67R,N

A74S,D,N

Y90F

S96R

A100R

K102R

K103R

S110N,A,D

T111G,A,S

G112A

G113A

L115I,V,F,H,T,N,Q,G

G116A

S117G,A,D,E,N,Q

N118G,A,S,D,R

H119Q,K

N123D,E,Y

K175R

N179D,H,A

S185R,K

C11A ＋ C135A

C12A ＋ C47A

R37N ＋ D58A

본발명은 또한 음이온성 계면활성제에 대한 셀룰라제 변이체의 민감성을 감소시키기 위해서 CAD 표면상의 하나 이상의 중성 아미노산 잔기가 하나 이상의 음전하를 띤 아미노산 잔기에 의해 치환되거나, 또는 CAD 표면상의 하나 이상의 양전하를 띤 아미노산 잔기가 하나 이상의 중성 또는 음전하를 띤 아미노산 잔기에 의해 치환된 셀룰라제 변이체, 또는 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기가 하나 이상의 비- 소수성 아미노산 잔기에 의해 치환된것, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 프롤린에 의해 치환된 것에 관한 것인데, CAD 는 촉매 활성부를 함유하는 신장된 개구부, 셀룰라제 분자의 표면으로부터 상기 개구부까지 이끌고 활성부에서 셀룰로스의 가수분해를 위해 상기 개구부에 물을 공급하는 적어도 하나의 채널, 및 활성부의 적어도 한 아미노산 잔기 부근의 양전하를 띤 표면영역으로 이루어진다.

음이온성 계면활성제(특히 선형 알킬술포네이트)의 존재는 셀룰라제의 활성을 억제할수 있다는 것이 발견되었다. 그러한 억제는 계면활성제의 음전하를 띤 헤드가 셀룰라제 분자의 표면상의 양전하를 띤 아미노산 잔기에 결합하고 계면활성제의 소수성 테일이 셀룰라제 분자표면의 소수성 아미노산 잔기에 결합함으로써 야기된다고 현재 생각된다. 이러한 결합 패턴은 단백질의 국부적인 풀림 및 결과적으로 활성의 상실을 야기한다고 생각된다. 상기에서 언급한 것처럼 음이온성 계면활성제에 의한 셀룰라제의 억제는 단백질 표면의 중성 또는 양전하를 띤 잔기대신에 음전하를 띤 아미노산 잔기를 치환함으로써 또는 단백질 표면의 소수성 아미노산 잔기를 친수성 잔기로 치환함으로써 치유될수 있다. 그러나, 활성부의 적어도 한 아미노산 잔기 부근의 표면영역에서 양전하를 띤 아미노산 잔기를 치환하는 것은 CAD의 정전기적 전위에 나쁜 효과를 나타낼수 있어서 덜 적합하다고 현재 생각한다. 더욱이, 프롤린에 의한 치환은 골격의 강도를 증가시킴으로써 효소를 안정화시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다.

변이체H. insolens43 kD 엔도글루칸아제 또는 상동 셀룰라제의 한 구체예에서는 상기에서 보여지는 영역 VIII-X 중 하나 이상 또는 상동 셀룰라제에서 그것에 대응하는 영역에서 또는 위치 37, 62, 63, 78, 118, 158, 163, 179, 186 또는 196에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환함으로써 상기의 단백질 표면의 표면형태를 변화시킬수 있다.

이 구체예에서는 위치 37, 62, 63, 78, 118, 129, 131, 133, 136, 142, 146, 158, 163, 175, 176, 179, 186 또는 196중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환될수 있다. 보다 특이적으로는 하나 이상의 아미노산 잔기가 하기와 같이 치환될수 있다.

R37N,S,A

W62E,F

A63D,T,R

A78D

N118D

V129D,T,S

I131L,V,T,N,Q,H,G

D133Q

T136D

L142D,T,S

R146E,Q,S

R158D

L163N

N176D

N179D

N186D

R196D.

한편, 하나 이상의 아미노산이 하기와 같이 치환될수 있다.

A78P

A162P

K175G,S

본발명은 또한 산화 또는 표백제의 존재에 대한 셀룰라제 변이체의 민감성을 감소시키기 위해서 CAD, CBD 또는 연결부의 표면의 하나 이상의 아미노산 잔기가 산화 또는 퍼옥시다제 표백시스템의 존재에 덜 민감한 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 치환된 셀룰라제 변이체에 관한 것인데, CAD는 촉매 활성부를 함유하는 신장된 개구부, 셀룰라제 분자의 표면으로부터 상기 개구부까지 이끌고 활성부에서 셀룰로스의 가수분해를 위해 상기 개구부에 물을 공급하는 적어도 하나의 채널, 및 활성부의 적어도 한 아미노산 잔기부근의 양전하를 띤 표면영역으로 이루어진다.

본발명에 따르면, 어떤 아미노산, 가령 메티오닌은 가령 하이포아염소산염에의한 산화에 민감하지만, 다른것 가령 트립토판이나 티로신은 퍼옥시다제 시스템같은 표백제의 존재에 민감해서 효소의 불활성화를 야기한다는 것이 밝혀졌다. 본 명세서에서 용어 '퍼옥시다제 시스템'은 예컨대 WO 89/09813 또는 WO 91/05839에서 기술된 것처럼 퍼옥시다제, 퍼옥시다제의 기질 및 표백촉진제로 이루어지는 표백시스템을 나타낸다. 더욱이 이러한 문제점은 덜 민감한 아미노산 잔기, 가령 세린, 아스파라긴, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 글루탐산, 또는 글리신에 의한 적당한 치환에 의해 경감될수 있다는 것이 발견되었다.

변이체H. insolens43 kD 엔도글루칸아제 또는 상동 셀룰라제의 한 구체예에서는 상기에서 보여지는 영역 IX 또는 X의 하나 이상에서 또는 위치 62 또는 104의 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환함으로써 효소의 표면형태를 변화시킬수 있다.

변이체H. insolens43 kD 엔도글루칸아제의 한 구체예에서는 위치 8, 9, 18, 62, 104, 147 또는 175중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환될수 있다. 보다 특이적으로는 하나 이상의 아미노산 잔기가 하기와 같이 치환된다.

Y8F

W9F,H,S,A

W18H,F,A

W62F,E

M104S,N,Q

Y147F,H,S,Q,N,E,D.

본발명의 셀룰라제 변이체의 제조방법

유전자속에 돌연변이를 도입하는 여러 방법이 당업계에서 공지되었다. 셀룰라제-암호화 DNA서열의 클로닝에 대한 간단한 논의후, 셀룰라제-암호화 서열내의 특정위치에서 돌연변이를 생성하는 방법이 논의될 것이다.

셀룰라제를 암호화하는 DNA서열의 클로닝

모 셀룰라제를 암호화하는 DNA서열은 당업계에서 잘 공지된 다양한 방법에 의하여 문제의 셀룰라제를 생성하는 어떤 세포 또는 미생물로부터 분리할수 있다. 먼저 연구할 셀룰라제를 생성하는 생물체로부터 염색체 DNA 또는 메신저 RNA를 이용하여 게놈 DNA 및/또는 cDNA 라이브러리를 제조해야 한다. 그 다음, 셀룰라제의 아미노산 서열이 알려져 있으면 상동의 표지화된 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하여 세균의 DNA 의 게놈 라이브러리로부터 또는 곰팡이의 cDNA 라이브러리로부터 셀룰라제-암호화 클론을 식별하는데 사용할수 있다. 한편 세균 또는 곰팡이의 다른 균주의 셀룰라제와 상동인 서열을 포함하는 표지화된 올리고뉴클레오티드 프로브는 더 낮은 스트린전시(stringency)의 혼성화 및 세척조건을 이용하여 셀룰라제- 암호화 클론을 식별하기 위한 프로브로서 사용할수 있다.

셀룰라제-생성 클론을 식별하기 위한 또다른 방법은 플라스미드같은 발현 벡터속에 게놈 DNA 단편을 삽입하고, 결과적인 게놈 DNA 라이브러리로 셀룰라제-음성 세균을 형질전환시킨다음, 형질전환된 세균을 셀룰라제의 기질을 함유하는 한천위에 플레이팅하는 것을 포함한다. 셀룰라제-함유 플라스미드를 포함하는 세균은 분비된 셀룰라제에 의한 기질의 분해때문에 투명한 한천의 후광에 의해 둘러싸인 콜로니를 생성할 것이다.

한편, 이 효소를 암호화하는 DNA 서열은 확립된 표준방법, 예컨대 S.L. Beaucage및 M.H. Caruthers,Tetrahedron Letters22, 1981, pp. 1859-1869 에서 기술된 포스포아미디트 방법, 또는 Matthes 등,The EMBO J.3, 1984, pp. 801-805에서 기술된 방법에 의해 합성제조할수 있다. 포스포아미디트방법에 따라서, 가령 자동 DNA 합성기에서 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 정제하고, 어닐링시키고, 결합시키고 적당한 벡터에서 클로닝한다.

최종적으로 DNA 서열은 표준기술에 따라서 합성, 게놈 또는 cDNA 기원의 단편들을(적당히) 결합시킴으로써 제조된 게놈기원과 합성된 것이 혼합된것, 합성된 것과 cDNA 기원이 혼합된것, 게놈기원과 cDNA 기원이 혼합된 것일수 있는데, 이 단편들은 전체 DNA 서열의 다양한 부분들에 해당한다. DNA 서열은 또한 가령 US 4,683,202 또는 R.K. Saiki 등,Science 239, 1988, pp. 487-491에서 기술된 것처럼 폴리머라제 연쇄반응(PCR) 에 의해 제조할수도 있다.

셀룰라제- 암호화 서열의 부위 특이적 돌연변이 유발

셀룰라제-암호화 DNA 서열을 분리하고 바람직한 돌연변이 부위를 식별하면, 합성올리고 뉴클레오티드를 이용하여 돌연변이를 도입할수 있다. 이 올리고뉴클레오티드는 원하는 돌연변이 부위 측면부의 뉴클레오티드 서열을 포함한다; 올리고뉴클레오티드 합성동안 돌연변이 뉴클레오티드가 삽입된다. 특정방법에서 셀룰라제-암호화 서열을 연결하는 DNA의 단일가닥 틈이 셀룰라제 유전자를 운반하는 벡터에서 생성된다. 그 다음 원하는 돌연변이를 함유하는 합성뉴클레오티드가단일 가닥 DNA의 상동부분에 어닐링된다. 남아있는 틈은 DNA 폴리머라제 I(Klenow단편)으로 채워지고 이 구조체는 T4 리가제를 이용하여 결합시킨다. 이 방법의 특정실례는 Morinaga 등, (1984, Biotechnology 2: 646-639)에서 기술되었다. 1988년 8월 26일 발행된 Estell 등의 미국 특허 제4,760,025호는 카세트의 약간의 변화를 일으킴으로써 다수의 돌연변이를 암호화하는 올리고뉴클레오티드의 도입을 개시하지만, 다양한 길이의 다수의 올리고뉴클레오티드가 도입될수 있기때문에 Morinaga 방법에 의해 훨씬 더 많은 수의 돌연변이가 한번에 도입될수 있다.

셀룰라제-암호화 서열속에 돌연변이를 도입하는 다른 방법은 Nelson 및 Long,Analytical Biochemistry 180, 1989, pp. 147-151 에서 기술되었다. 그것은 PCR 반응에서 프라이머중 하나로서 화학합성된 DNA 가닥을 사용함으로써 도입된 원하는 돌연변이를 포함하는 PCR 단편의 3-단계 생성을 포함한다. PCR-생성된 단편으로부터 돌연변이를 지닌 DNA 단편은 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고 발현 플라스미드 속에 재삽입하여 분리할 수 있다.

Carezyme(H. insolens의 43 kD 셀룰라제) 의 부위 특이적 돌연변이유발을 위한 시스템의 제조

Aspergillus oryzae에서Humicola insolens∼43 kD 엔도글루칸아제( 카리오솜; karyosome)의 발현을 가능하게 하는 플라스미드(pSX 320)는 종전의 특허(PCT/DK91/00123)에서 기술되었다. 카리오솜을 암호화하는 유전자는 도 2에서 기술된대로 pSX 320으로부터 pUC 19 (C. Yanisch-Perron 등 (1985), Gene 33, 103-119)속에 서브클로닝하였다.

위치 537에서 사일런트(silent) 부위 특이적 돌연변이로서 43K 유전자에서 ClaI 제한위치를 pCaHj 170 속에 도입하였다. 부위 특이적 돌연변이 유발은 Nelson 및 Long (R.M. Nelson, G.L.Long, (1989), Anal. Biochem. 180, 147-151)의 PCR 방법을 이용하여 행해졌다. 세부사항은 도 3에서 주어진다. 플라스미드 pCaHj 171 및 pCaHj 201 은 도 4 및 도 5에서 보여진대로 pCaHj 170으로부터 제조하였다. 돌연변이체 제조를 위해 pCaHj 201을 이용할수있는 두 플라스미드 pCaHj 416 및 pCaHj 417은 Aspergillus 발현플라스미드 pHD 414로부터 만들어졌다. 이 플라스미드의 제조는 도 6에서 개략화되었다. pCaHj 201을 도 7에서 보여지는 것처럼 돌연변이체의 제조에 사용하였다.

돌연변이된 43K 유전자를 지닌 발현 플라스미드를 특허출원(PCT/DK/00123)에서 기술된 대로 pToC 90과의 공형질전환에 의한 아세트아미드에서의 선택을 이용하여Aspergillus oryzaeIFO 4177 속에 형질전환시켰다.

돌연변이체 CC234 및 CC248의 제조:

V221S, cN222S, Q223T로 구성되는 돌연변이체 CC234를 올리고뉴클레오티드 4214 를 이용하여 제조했다.

4214 5' CACCAGCTCTCCGAGCAGCACGCCTACCAGCACC 3'

도 6에서 기술된 대로 돌연변이된 Hind III-SaℓI 단편을 pCaHj 416 속에 서브클로닝하여 돌연변이를 도입하였다. A162P로 구성되는 돌연변이체 CC248은 올리고뉴클레오티드 4271을 이용하여 제조하였다.

4271 5' CGGTTCCCCGACCCCCTCAAGCC 3'.

도 6에서 기술된 대로 돌연변이된 BamHI-Hind III 단편을 pCaHj 417 속에 서브클로닝하여 돌연변이를 도입하였다.

하기에서는 첨부된 도면 도 2-도 7을 더욱 설명한다:

도 2, pCaHj 170 의 제조:

pSX 320을 AccI으로 분해시켰다. 분해를 페놀/클로로포름 추출에 의해 종결시키고, 에탄올로 침전시키고 진공에서 건조시켰다. 쑥 들어간 3' 말단을 클레노우 폴리머라제를 이용하여 채우고 상술한대로 반응을 종결시켰다. DNA를 재용해시키고 BamHI으로 분해시켰다. 아가로스겔에서 카리오솜 유전자를 포함하는 920bp 단편을 분리하였다. pUC19를 SaℓI으로 분해시키고, 쑥 들어간 3' 말단을 클레노우 폴리머라제로 채우고 상술한 것처럼 DNA를 BamHI으로 분해시켰다. 생성된 2675bp 단편을 아가로스 겔에서 분리하였다.

920bp pSX 320 단편을 2675bp pUC 19 단편에 결합시키고 종래의 방법에 의해 r-m+로 만든E. coliMC 1000균주(Casadaban및 Cohen (1980), J. Mol. Biol., 138, 179-207)인E. coliMT 172속에 형질전환시켰다. 결과적인 플라스미드를 pCaHj 170이라고 명명하였다. 도 3, 43 K 유전자의 부위특이적 돌연변이 유발: 플라스미드 pCaHj 170, pCaHj 171, 또는 pCaHj 201을 문제의 돌연변이에 좌우되는 주형으로서 이용하였다. 선택한 주형은 돌연변이 유발 프라이머(별표를 갖는 화살표로서 보여짐) 및 3' 말단(21 뉴클레오티드)에서 주형에 꼭들어 맞고 5' 말단(21 뉴클레오티드)에서 주형에 들어맞지않는 42 뉴클레오티드 프라이머인 프라이머 2834 를 이용하여 증폭시켰다:

2834: 5'

CCAATGTAGCAGTAGAGCAGCCAGCTATGACCATGATTACGC 3'

온도순환프로필은 제조자 지시사항에 따라 Perkin-Elmer Cetus의 taq 폴리머라제(amplitaq™)를 이용하여 도면에 나타낸 것과 같았다. 제1 PCR 산물을 아가로스겔에서 분리하고 상기와 동일한 주형을 이용하여 PCR 사이클러에서 신장시켰다. 온도프로필은 amplitaq™및 표준 PCR 조건을 이용하여 도면에 나타낸 것과 같았다. 신장후 신장 혼합물에 PCR 프라이머 2833 및 2832를 직접 첨가하고, 도면에 나타낸 온도순환 프로그램을 실행하고, 돌연변이를 지닌 결과적인 PCR 단편을 아가로스겔에서 분리하였다. PCR 프라이머 2833 은 2834의 5' 말단에 해당한다:

2833: 5' CCAATGTAGCAGTAGAGCAGC 3'

프라이머 2832는 주형에 해당한다:

2832: 5' GTTTTCCCAGTCACGACGTTG 3'

도 4, pCaHj 171의 제조:

주형으로서 pCaHj 170 그리고 돌연변이유발 프라이머 2831을 이용하여 43K 유전자속에 43K 유전자의 사일런트 돌연변이(Arg 코돈의 세번째 위치에서 G가 A로 됨) 를 도입하였다:

2831: 5' AGTGCGATCGATTCCCCGACG 3'.

돌연변이된 PCR 단편을 NcoI 및 XhoI으로 분해시키고 NcoI 및 XhoI으로 분해된 pCaHj 170에 결합시켰다. 결합혼합물을E. coliMT 172 속에 형질전환시켰다. 재조합체 플라스미드로부터 NcoI-XhoI 삽입체를 제조자 지시에 따라서 UnitedStates Biochemicals의 Sequenase™ 키트를 이용하여 서열결정하였다.

이 서열은 원하는 돌연변이를 제외하고는 pCaHj 170의 서열과 동일하였다. 이 플라스미드는 pCaHj 171이라고 명명했다.

도 5, pCaHj 201 의 제조:

주형으로서 pCaHj 171 그리고 돌연변이유발 프라이머 847을 이용하여 43K 유전자속에 43K 유전자의 사일런트 돌연변이(Pro 코돈의 세번째 위치에서 G가 A로 됨) 를 도입하였다:

847: 5' GCCGACAATCCAAGCTTCAGCTT 3'

돌연변이된 PCR 단편을 ClaI 및 XhoI으로 분해시키고 ClaI 및 XhoI으로 분해된 pCaHj 171에 결합시켰다. 결합혼합물을E. coliMT 172 속에 형질전환시켰다. 재조합체 플라스미드로부터 ClaI-XhoI 삽입체를 제조자 지시에 따라서 United States Biochemicals의 Sequenase™키트를 이용하여 서열결정하였다. 이 서열은 원하는 돌연변이를 제외하고는 pCaHj 171의 서열과 동일하였다. 이 플라스미드는 pCaHj 201이라고 명명했다.

도 6, pCaHj 416 및 pCaHj 417 의 제조:

pCaHj 416의 제조: pCaHj 201을 BamHI 및 Hind III로 분해시키고, 612bp 단편을 BamHI 및 Hind III로 분해된 pHD 414속에 결합시켰다.

pCaHj 417의 제조: pCaHj 201을 Hind III 및 SaℓI으로 분해시키고, 317bp 단편을 Hind III 및 XhoI으로 분해된 pHD 414 속에 결합시켰다.

도 7, 주형으로 pCaHj 201을 이용한 돌연변이체의 제조: 부위특이적 돌연변이유발을 도 2에서 기술한대로 수행하였다. 변형부분이 Hind III 위치 윗쪽에 위치할때(위치 1-612)에는, 돌연변이된 PCR 단편을 BamHI 및 Hind III로 분해시키고, 생성된 612bp 단편을 BamHI 및 Hind III로 분해된 pCaHj 417에 결합시켜서 돌연변이된 유전자의 발현 플라스미드를 생성하였다.

변형부분이 Hind III 위치 아랫쪽에 위치할때(위치 612-928)에는 돌연변이된 PCR 단편을 Hind III 및 SaℓI으로 분해시키고, 생성된 316bp 단편을 Hind II 및 XhoI으로 분해된 pCaHj 416에 결합시켜서 돌연변이된 유전자의 발현 플라스미드를 생성하였다. 플라스미드 크기 및 제한부위위치는 단지 치환에만 일치한다. 결실 또는 삽입의 경우에는 크기와 부위위치가 보여지는 도면과 다르다.

셀룰라제 변이체의 발현

본발명에 따르면 상술한 방법, 또는 당업계에서 공지된 어떤 다른 방법에 의하여 생성된 돌연변이된 셀룰라제-암호화 서열은 전형적으로는 프로모터를 암호화하는 조절서열, 오퍼레이터, 리보솜결합부위, 번역개시시그날, 및 선택적으로 리프레서 유전자 또는 각종 활성인자 유전자를 포함하는 발현 벡터를 이용하여 효소형태로 발현시킬수 있다. 발현된 단백질의 분비를 가능하게 하기 위해서 셀룰라제- 코딩 서열전에 '시그날 서열'을 암호화하는 뉴클레오티드를 삽입할수 있다. 조절서열방향하의 발현을 위해서는 본발명에 따라 처리되는 표적유전자가 적당한 리딩프레임으로 조절서열에 작동적으로 연결된다.

플라스미드 벡터속에 투입될수 있고 돌연변이체 셀룰라제 유전자의 전사를 지지할수 있는 프로모터 서열은 원핵성 β-락탐아제 프로모터(Villa-Kamaroff 등,1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.75: 3727-3731) 및 tac 프로모터(DeBoer 등, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.80: 21-25)를 포함하지만 이것들에 제한되지는 않는다. 다른 참고문헌은 또한 Scientific American, 1980,242: 74-94의 '재조합체 세균의 유용한 단백질' 에서 발견될수 있다.

한 구체예에 따르면 돌연변이된 DNA를 운반하는 발현벡터에 의해B. subtilis가 형질전환된다. 발현이B. subtilis같은 분비 미생물에서 일어나려면 시그날 서열이 번역개시 시그날 뒤에 그리고 관심있는 DNA 서열 앞에 있을 수 있다. 시그날 서열은 발현 생성물을 세포벽까지 운반하는 작용을 하는데 거기서 분비시 생성물로부터 절단된다. 상술한 용어 '조절서열' 은 존재할 때에는 시그날 서열을 포함하는 것으로 의도된다.

본발명의 셀룰라제 변이체를 생성하는 현재 바람직한 방법에서는 숙주 생물체로서 사상 곰팡이를 이용한다. 사상 곰팡이 숙주생물체는 편리하게는 재조합 단백질을 생성하기 위한 숙주로서 종전에 사용된것, 예컨대A. niger,A. nidulans또는A.oryzae같은Aspergillussp. 균주일수 있다. 재조합 단백질의 생성에서A.oryzae를 이용하는 것은 가령 EP 238 023에서 광범위하게 기술되었다.Aspergillus에서 셀룰라제 변이체의 발현을 위해서는 셀룰라제 변이체를 암호화하는 DNA 서열앞에 프로모터가 위치한다. 프로모터는Aspergillus에서 강한 전사활성을 나타내는 어떤 DNA 서열일수 있으며 아밀라제, 글루코아밀라제, 프로테아제, 리파제, 셀룰라제 또는 글루코스 분해효소 같은 세포외 또는 세포내 단백질을 암호화하는 유전자로부터 유도될수 있다.

적합한 프로모터의 실례는A.oryzaeTAKA 아밀라제,Rhizomucor miehei아스파르트 프로틴아제,A. niger중성 α-아밀라제,A. niger산 안정 α-아밀라제,A. niger글루코아밀라제,Rhizomucor miehei리파제,A.oryzae알칼리 프로테아제 또는A.oryzae트리오스 포스페이트 이소메라제를 암호화하는 유전자로부터 유도된 것들이다. 특히 숙주 생물체가A.oryzae일때 본발명의 방법에 사용하는데 바람직한 프로모터는A.oryzaeTAKA 아밀라제 프로모터인데, 그것은A.oryzae에서 강한 전사활성을 나타내기 때문이다. TAKA 아밀라제 프로모터의 서열은 EP 238 023 에서 볼 수 있다. 종결 및 폴리아데닐화 서열은 적합하게는 프로모터와 동일한 공급원에서 유도될 수 있다.

곰팡이의 숙주세포를 형질전환하는데 사용되는 기술은 적합하게는 EP 238 023에서 기술된 것과 같을수 있다.

숙주세포에서 셀룰라제 변이체의 분비를 가능하게 하기 위해서는 셀룰라제 변이체를 암호화하는 DNA서열 앞에 시그날 서열이 위치할수 있는데, 이것은 천연적으로 존재하는 시그날서열 또는 그것의 기능적인 부분 또는 세포로부터 단백질의 분비를 일으키는 합성서열일 수 있다. 특히, 시그날서열은Aspergillussp. 아밀라제 또는 글루코아밀라제를 암호화하는 유전자,Rhizomucor miehei리파제 또는 프로테아제를 암호화하는 유전자, 또는Humicola셀룰라제, 크실란아제 또는 리파제를 암호화하는 유전자로부터 유도될수 있다. 시그날 서열은 바람직하게는A.oryzaeTAKA 아밀라제,A. niger중성 α-아밀라제,A. niger산-안정 α-아밀라제 또는 A. niger 글루코아밀라제를 암호화하는 유전자로부터 유도된다.

형질전환된 숙주세포를 배양하는데 이용되는 배지는Aspergillus세포를 생장시키는데 적합한 어떤 통상적인 배지일수 있다. 형질전환체는 대개 안정하고 선택압없이 배양할수 있다. 그러나, 형질전환체가 불안정하다고 밝혀지면, 세포속에 도입된 선택마커를 선택에 이용할수 있다.

숙주세포로부터 분비된 성숙 셀룰라제 단백질은 편리하게는 원심분리 또는 여과에 의해 배지로부터 세포를 분리하고, 황산 암모늄같은 염에 의해 배지의 단백질함유 성분을 침전시키고, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등과 같은 크로마토그래피 방법을 행하는 것을 포함하는 잘 알려진 방법에 의하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다.

본발명에 따르면 셀룰라제 변이체는 전형적으로는 세정제 조성물의 한 성분으로서 첨가할수 있다. 그것은 비-살포성 과립, 액체, 특히 안정화된 액체, 또는 보호된 효소의 형태로 세정제 조성물속에 포함될수 있다. 비-살포성 과립은 가령 US 4,106,991 및 4,661,452 (둘다 Novo Industri A/S)에서 개시된 대로 제조될수 있고 선택적으로 당업계에서 공지된 방법에 의해 피복될수 있다. 액체 효소제제는 예컨대 확립된 방법에 따라서 프로필렌 글리콜 같은 폴리올, 당 또는 당 알코올, 락트산 또는 붕산을 첨가함으로써 안정화 시킬수 있다. 다른 효소 안정화제도 당업계에서 잘 공지되었다. 보호된 효소는 EP 238,216 에서 개시된 방법에 따라서 제조할수 있다. 세정제 조성물은 더욱이 통상적으로 세정제 첨가물속에 포함되는 프로테아제, 리파제, 퍼옥시다제, 옥시다제 또는 아밀라제 같은 하나 이상의 다른 효소를 포함할수 있다.

본발명의 세정제 조성물은 어떤 편리한 형태, 가령 분말, 과립 또는 액체일수 있다. 액체 세정제는 전형적으로는 90%에 달하는 물과 0-20% 유기용매를 포함하여 수성일수 있다.

세정제 조성물은 계면활성제를 함유하는데, 이것은 음이온성, 비-이온성, 양이온성, 양쪽성 또는 이 유형들의 혼합물일수 있다. 세정제는 대개 0-50% 음이온성 계면활성제로서 선형 알킬벤젠술포네이트(LAS), 알파-올레핀 술포네이트(AOS), 황산알킬(AS), 황산에톡시 알코올(AES) 또는 비누 등을 포함할 것이다. 그것은 또한 0-40% 비-이온성 계면활성제로서 노닐페놀 에톡실레이트 또는 알코올 에톡실레이트 등을 포함할수 있다. 더욱이 그것은 폴리히드록시 지방산 아미드 계면활성제( 가령, WO 92/06154 에서 기술된것)를 포함할 수 있다.

세정제 조성물은 부가적으로 하나 이상의 다른 효소로서 아밀라제, 리파제, 퍼옥시다제, 옥시다제, 에스테라제, 셀룰라제, 엔도글루칸아제 타입 II 또는 프로테아제등을 함유할 수 있다.

pH(세정제 수용액에서 측정됨)는 대개 중성 또는 알칼리, 가령 7-11 일 것이다. 세정제는 1-40%의 세정제 연마제로서 제올라이트, 포스페이트, 포스포네이트, 시트르산염, NTA, EDTA 또는 DTPA, 알케닐 숙신산 무수물, 또는 규산염등을 포함할수 있고, 또는 본질적으로 세정제 연마제가 없을 수 있다. 그것은 또한 다른 종래의 세정제성분, 예컨대 직물조절제, 거품 부스터, 표백제, 가령 과붕산염, 과탄산염, 테트라아세틸 에틸렌 디아민(TAED) 또는 노나노일옥시벤젠 술포네이트 (NOBS), 부식방지제, 얼룩-현탁제, 금속이온 봉쇄제, 얼룩 재침착 방지제, 효소의 안정화제, 거품억제제, 염료, 살균제, 광증백제 또는 향료등을 포함할 수 있다.

본발명의 범위내에서 세정제 조성물의 특별한 형태는 하기의 것들을 포함한다:

a) 포스페이트 연마제, 음이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 규산염, 사용시 원하는 pH로 조정하기 위한 알칼리, 중성 무기염을 포함하는 세정제 분말로서 제제화된 세정제 조성물.

b) 제올라이트 연마제, 음이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 아크릴 중합체 또는 등가의 중합체, 규산염, 사용시 원하는 pH로 조정하기 위한 알칼리, 중성 무기염을 포함하는 세정제 분말로서 제제화된 세정제 조성물.

c) 음이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 습윤제, 유기산, 사용시 pH 를 7과 11 사이의 값으로 조정하기 위한 가성 알칼리로 이루어지는 수성 세정액으로서 제제화된 세정제 조성물.

d) 본질적으로 선형 알콕실화 일차 알코올로 구성되는 액체 비이온성 계면활성제, 포스페이트 연마제, 사용시 pH를 약 7과 11 사이의 값으로 조정하기 위한 가성 알칼리로 이루어지는 비수성 세정액으로서 제제화된 세정제 조성물.

e) 음이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제, 낮은 또는 실질적으로 제로인 중성 무기염, 포스페이트 연마제, 규산나트륨을 포함하는, 적어도 600g/ℓ의 부피밀도를 갖는 과립형태의 세정제 분말로서 제제화된 세정제 조성물.

f) 음이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제, 낮은 또는 실질적으로 제로인 중성 무기염, 제올라이트 연마제, 규산나트륨을 포함하는, 적어도 600g/ℓ의부피밀도를 갖는 과립형태의 세정제 분말로서 제제화된 세정제 조성물.

g) 음이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 아크릴 중합체, 지방산 비누, 탄산나트륨, 황산나트륨, 점토입자, 및 규산나트륨을 포함하는 세정제 분말로서 제제화된 세정제 조성물.

h) 5-65 중량% 의 계면활성제, 0-50중량% 의 연마제, 0-30중량%의 전해질을 포함하는 액체콤팩트 세정제.

이러한 성분과는 별도로 세정제 조성물 a)- h)는 본발명의 셀룰라제 변이체 및 선택적으로 상기에서 나타낸대로 하나 이상의 다른 효소를 포함한다.

본발명의 세정제 조성물에서 셀룰라제 변이체는 세척액 리터당 0.001-100 mg효소에 해당하는 양만큼 첨가될수 있다고 현재 생각된다.

하기의 실시예는 본발명을 예시하며 본발명의 범위를 어떤식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1

잔류활성에 대한 연결부의 변이의 효과

프로테아제 효소를 포함하는 액체세정제에서 보관한후 셀룰라제 변이체의 잔류활성은 두가지의 다른 분석으로 평가하였다.

S-CEVU 분석은 카르복시메틸셀룰로스(CMC) 용액의 점도를 줄일수 있는 샘플의 능력을 측정함으로써 샘플에 존재하는 촉매활성의 양을 정량한다. 이 활성은 단지 효소 코어에만 관련되고 연결부 및 CBD 영역의 존재 또는 부재에 의해서는 영향을 받지 않는다.

S-CEVU 분석은 기질(CMC)의 점도감소에 대한 상대 효소 표준물을 이용하여 40℃, pH 7.5에서 수행된다. 이 방법은 청구시 출원인으로부터 No. AF-302/2 GB로서 얻을 수 있다.

다이드 아비셀 분석(Dyed Avicel Assay (DAA))은 불용성 셀룰로스에 부착하고 셀룰로스 분말의 표면에 결합된 염료를 방출할수 있는 셀룰라제의 양을 정량한다. 연결부 및 CBD 영역없는 셀룰라제는 이 기질에 대해 낮은 활성을 나타내고 따라서 이 분석은 본래의 셀룰라제의 효소코어로의 단백질 분해효소에 의한 분해를 모니터하는데 이용될수 있다.

연결부 및 CBD 영역없는 셀룰라제의 세척성능은 온전한 효소보다 더 낮기 때문에, DAA는 어느 정도는 프로테아제 효소(들)를 함유하는 세정제에서 보관된 셀룰라제의 세척성능과 관련된다.

본발명에 따른 하기의 셀룰라제 변이체를 잔류활성에 대해 시험하였다:

변이체 I: V221S ＋ N222S ＋ Q223T

변이체II: V240P ＋ Q241P

WO 91/17243 에서 기술된H. insolens43 kD 엔도글루칸아제를 참조(모) 셀룰라제로서 이용하였다.

다이드 아비셀 분석(DAA).

레마졸 브릴리언트 블루(Remazol Brilliant Blue)로 착색된 셀룰로스분말과 셀룰라제의 효소반응은 셀룰라제의 활성과 관련된 양의 염료를 방출한다.

반응조건:

pH 7.50

온도 40℃

기질 다이드(Dyed) 미소결정 셀룰로스

완충액 1g/ ℓ 비이온성 텐사이드(Berol 160) 가 있는 0.1 M 인산염

완충액 pH 7.5

시간 60분

샘플농도 0.5-15 S- CEVU/ mℓ

다이드 셀룰로스의 제조:

2000 mℓ유리비이커에서 500 mℓ의 탈이온수에 50g의 Sigmacell 타입 20 셀룰로스 분말을 첨가하고 자기 교반기로 교반하였다. 탈이온수 350 mℓ에 4g 의 레마졸 브릴리언트 블루 R 19 염료(C.I. 61200 Reactive Blue 19)를 녹였다. 염료용액을 Sigmacell 현탁액에 가하고 약 55 ℃로 가열했다. 100g 무수 황산나트륨을 느리게 첨가하면서 혼합물을 30 분간 교반하였다. 20g 인산３나트륨12수화물을 탈이온수 200 mℓ에 녹였다. 인산３나트륨 용액 약 150 mℓ을 첨가하여 Sigmacell/ 염료용액의 pH 를 11.5로 조정하였다.

혼합물을 55℃에서 60분간 교반하였다. 1000 mℓ Buchner 깔때기 및 Whatman No.54 여과지에 의하여 혼합물을 진공여과하였다. 여과액( 배출된 물) 의 590nm 에서의 광학농도(OD₅₉₀)가 0.03 이하일때까지 70 ℃- 80℃에서 필터케이크를 반복적으로 탈이온수로 590nm 세척하였다. 필터케이크를 100 mℓ의 50% 에탄올로 헹궈서 청색을 더욱 제거하고 그 다음엔 100 mℓ의 96% 에탄올로 헹구었다. 깔때기에서 셀룰로스를 제거하고(클린벤치에서) 건조시켰다.

분석시약

0.1M 인산염 완충액

ＮaH₂PO₄2H₂O (Merck 6345.1000) 15.6g

탈이온수 800mℓ첨가

Berol 160 (AEO) 1.0 g

NaOH, 4N pH를 7.5로 조정

탈이온수 1000 mℓ까지 채움

pH를 7.5 +/- 0.03 으로 체크함

비이온성 스톱시약

인산 3나트륨(Merck 6578) 19g

탈이온수 950mℓ첨가

Berol 160 20g

완전히 투명할때까지 교반함

탈이온수를 1000mℓ까지 채움

다이드 셀룰로스 기질

매일 새롭게 제조해야 함

건조분말을 계량하고 0.1M 인산염 완충액중의 10% (w/w)용액(기술된 대로)을 제조한다. 분석을 개시하기 전에 적어도 30 분간 교반한다.

0.1M 완충액으로 희석한 효소샘플

4, 8, 12, 16 S-CEVU/mℓ의 농도로 샘플을 0.1M 인산염 완충액으로 희석한다.

효소 표준물

적당한 효소표준물 또는 참조 비-보관 샘플을 0.1M 인산염 완충액으로 희석하여 표준곡선을 만들었다. 표준물의 농도 0, ½, 1, 2, 4, 8, 12, 16 S-CEVU/mℓ

장치

40℃의 수조

스펙트로포토미터(590 nm)

Variomag Telesystem HP 60P, 물속에 가라앉힐수 있는 자기 교반기 플레이트(60 포인트).

16mm 시험관용 Variomag 시험관랙 HP 60

시험관, 16 mm φ

자기교반막대, 3 × 8 mm.

여과지 φ 9 cm, Munktell 1F.

여과 깔때기

핀피페트 1-5 mℓ

여과액 수집용 시험관 및 랙

기질현탁용 자기교반기 플레이트 및 자석

방법

수조의 온도는 40 ℃이어야 한다. 2mℓ의 샘플 또는 표준용액이 랙에 놓인 시험관속에서 측정되었다. 모든 시험관이 준비되었을때 수조에 랙을 놓았다.

모든 시험관에 자기교반 막대를 첨가하고, 교반기 플레이트를 600rpm에서 시동시켰다. 10초 간격으로 2 mℓ의 다이드 셀룰로스기질을 피페팅하는 동안 일정하게 교반하면서 첨가했다. 60분 반응시간후 각 시험관에 2 mℓ 비이온성 스톱시약을 첨가하였다. 40℃에서 잘 혼합한 샘플을 여과 깔때기속의 여과지위에 붓고, 투명한 여과액을 수집하였다. 여과액이 투명하지 않으면 여과를 반복해야 한다. 여과액의 590 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 샘플과 다른 표준물의 흡광도로부터 효소없는 표준물, O S-CEVU/mℓ의 흡광도를 공제하였다. 590 nm에서의 결과적인 델타 흡광도를 S-CEVU/mℓ로 측정된 샘플용액에서의 효소활성에 대해서 그래프로 나타냈다. 투여량-반응곡선은 비선형이고(도 8), 표준물에 대한 샘플의 활성(또는 비- 보관 샘플에 대한 보관 샘플의 활성)을 보여지는 것처럼 계산할수 있다.

실험, 보관 안정성

고도로 정제된 셀룰라제 2475 S-CEVU를 동결건조시켰다. 1.65g 액체세정제를 첨가하고 셀룰라제가 용해될때까지 교반하였다. 0.165 KNPU (S) Savinase프로테아제를 첨가하고 철저하게 혼합하였다. 효소가 있는 100μℓ세정제를 (최대) 7 개의 1 mℓ Nunc-튜브속에 피페팅했다. 튜브중 하나는 참조를 위해 급속냉동 냉장고(-18℃) 에 즉시 놓았다. 남아있는(6) 튜브를 1,2 또는 5일간 25 ℃ 및 35 ℃에서 배양하였다. 배양후 샘플을 조작농도로 희석하고, 비-보관 참조물에 대한 보관샘플의 잔류활성을 다이드 아비셀 분석으로 결정하였다. 또한 S-CEVU/g의 활성에 관한 참조물에 대해서 샘플의 잔류활성을 결정하였다.

결과

도 9는 셀룰라제 변이체I 의 다이드 아비셀 분석의 곡선의 한 실례를 보여준다.

실시예 2

비결정 셀룰로스에 대한 셀룰라제 흡착

85% 인산에서 팽창시킴으로써 비결정화된 Avicel(Asahi Chemical Co. Ltd., Japan)을 시험흡착제로서 이용하였다. 세부내용은 하기의 실시예5 참조. 시험흡착제를 증류수에서의 현탁액으로서 보관하였는데, 건조 셀룰로스의 함량(전형적으로는 15g/ℓ)은 별도의 실험에서 분액을 건조시키고 계량함으로써 결정되었다. 밀봉할수있고 0-8 mg 범위의 셀룰로스 건조물 함량을 수용할수 있는 플라스틱 튜브속에 체적(0-0.5 mℓ)당 흡착제를 담았다. 체적은 증류수로 0.5 mℓ로 조정하였다. 상업적인 콤팩트 분말세정제인 Ariel Color를 85 ℃에서 8분간 전자오븐에서 세정제를 배양함으로써 분말세정제에 존재하는 효소를 불활성화시키기 위해 미리 처리하였다. 1M Gly-NaOH 완충액 pH10 중의 미리 처리한 Ariel Color 용액(21.67 g/ℓ) 0.3mℓ을 각 튜브에 첨가한후, 효소(5 IU/mℓ) 0.2mℓ분액을 가하여 혼합물에서의 초기 EG 활성이 약 1 IU/mℓ이 되도록 하였다. 현탁액을 20°, 1초^-1에서 Swelab Instrument 440 믹서에서 60 분동안 진동시키고, 흡착된 효소가 있는 기질을 2500g, 20°에서 5분간 원심분리하여 침강시켰다. 상징액을 Red CMC분석(Tikhomirov D.F. 등,Biotechnologia(Moscow), Plenum Press에 의해 영어로 번역, 1989, Vol. 5, No. 4, p. 518-524)같은 종래기술을 이용하여 결합되지 않은 엔도글루칸아제 활성에 대해 분석하였다.

100μℓ의 효소분액을 좁은 유리튜브의 1% Red CMC 기질(Fermentas Co., Vilnius, Lithuania), pH 7.5 (0.05 M 트리스 완충액) 1mℓ에 첨가하고, 혼합물을 40 분간 40 ℃, 물 자동온도조절기로 옮겼다. 블랭크로서 효소분액대신 완충액이 있는 하나의 튜브를 더 자동온도조절기에 첨가했다. 0.1M CaCℓ₂를 함유하는 80% 에탄올 1 mℓ을 첨가하고 격렬하게 진동시켜서 효소반응을 종결시켰다. 동일한 튜브를 10 분간 4000g에서 원심분리하여 가수분해되지 않은 기질을 분리하고 490 nm 에서 상징액 흡광도를 물에 대해서 측정하였다. 흡착의 정도를 흡착제 농도에 대한 A₀/A_super비율에 의하여 곡선으로 나타냈다. 이것은 흡착성에 따라 단일의 엔도글루칸아제 아이소폼의 경우에 동종의 직선을 나타내는 선형화 방법이다(Klyosov A.A. 등,Bioorgan. Chem. (Moscow), Plenum Press에 의해 영어로 번역, 1982,Vol. 8, No. 5, p. 643-651). 분배상수 Kd = A_bound/(A_super·[S])는 이 그래프로부터 직선의 기울기로서 결정될수 있다.

Ariel Color 에서는 하기의 Kd 값이 얻어졌다:

Carezyme 0.6/g

Y280F 2.9/g

R252F 4.3/g

Y280F ＋ R252F 3.3/g

실시예 3

세척시험

A.조건

장치 : Terg-o-tometer

액체체적: 150mℓ

교반 : 100 운동/분

세척시간: 30분

린스시간: 수도물에서 5분

세척온도: 40°

직물 : 2 견본 100% 낡은 흑색면직물 5×6 cm

건조 : 라인드라잉

반복 : 3

상업적인 세정제의 예비처리: 85℃에서 8 분동안 전자오븐에서 배양

평가 : 색깔 투명도와 보풀수준에 관하여 하나의 실험에서 표면의 상대적인 등급을 패널의 일원들에게 문의한다. 숫자가 클수록 성능이 더 좋다.

1. Carezyme 대 Y280F

세정제: 상업적인 유럽형 콤팩트 칼라 파우더

과립, 6.5g/ℓ, pH 10.2.

물 경도: 3mM Ca++

평균패널 스코어( 스코어 1-6)

효소부재 1.0

Carezyme 500 S-CEVU/ℓ 3.4

Y280F 500 S-CEVU/ℓ 4.3

이 데이타는 시험한 조건하에서 변이체가 개선된 성능을 갖는다는 것을 보여준다.

2. Carezyme 대

1) V221S-N222S-Q223T,

2) Y8F,

3) Del(S219-T235)

세정제: 상업적인 US 강력 콤팩트 파우더

과립, 1g/ℓ, pH 10.

물 경도: 1mM Ca++

평균패널 스코어( 스코어 1-11)

효소부재 1.0

Carezyme 250 S-CEVU/ℓ 4.0

Carezyme 500 S-CEVU/ℓ 6.5

Carezyme 1000 S-CEVU/ℓ 9.0

1) 500 S-CEVU/ℓ 10.0

2) 500 S-CEVU/ℓ 8.0

3) 500 S-CEVU/ℓ 11.0

이 데이타는 세가지 변이체 모두 시험한 조건에서 개선된 성능을 갖는다는 것을 보여준다.

B. 조건

장치 : Terg-o-tometer

액체체적: 800mℓ

세척시간: 12분

린스시간: 수도물에서 4분

세척온도: 35°

직물 : 2 견본 100% 낡은 흑색면직물 10×15cm

건조 : 텀블건조

반복 : 11

평가 : 결정된 스케일에 따라 육안으로 보이는 형태(색깔투명도 및 보풀)에 관하여 효소처리표면 대 효소부재를 등급을 매기도록 패널의 일원들에게 문의한다.

등급: 0 = 이점이 없음

1 = 이점을 인식할수 있음

2 = 이점을 용이하게 인식할수 있음

3 = 이점이 큼

4 = 이점이 매우 큼

5 = 새로운 직물

1. Carezyme 대 A162P

세정제: 상업적인 US 콤팩트 칼라 파우더

과립, 1g/ℓ, pH 8.1.

물 경도: 1mM Ca++ 및 0.35 mM Mg

평균패널 스코어

효소부재 0

Carezyme 15 S-CEVU/ℓ 1.5

Carezyme 30 S-CEVU/ℓ 2.0

A162P 15 S-CEVU/ℓ 1.8

A162P 30 S-CEVU/ℓ 2.7

C.조건

장치 : Terg-o-tometer

액체체적: 800mℓ

교반 : 100 운동/분

세척시간: 30분

린스시간: 수도물에서 10분

세척온도: 40°

직물 : 2 견본 100% 낡은 흑색면직물 10×15cm

건조 : 텀블건조

반복 : 4

평가 : 결정된 스케일에 따라 육안으로 보이는 형태( 색깔투명도 및 보풀) 에 관하여 효소처리표면 대 효소부재를 등급을 매기도록 패널의 일원들에게 문의한다.

등급: 0 = 이점이 없음

1 = 이점을 인식할수 있음

2 = 이점을 용이하게 인식할수 있음

3 = 이점이 큼

4 = 이점이 매우 큼

5 = 새로운 직물

1. Carezyme 대 W62E

세정제: 상업적인 유럽형 콤팩트 파우더

과립, 6.5g/ℓ, pH 10.2.

물 경도: 3mM Ca++

평균패널 스코어

효소부재 0

Carezyme 50 S-CEVU/ℓ 1.0

Carezyme 80 S-CEVU/ℓ 1.3

Carezyme 120 S-CEVU/ℓ 1.8

Carezyme 150 S-CEVU/ℓ 2.0

W62E 100 S-CEVU/ℓ 1.9

실시예 4

퍼옥시다제 안정화된 43 kD 셀룰라제 변이체

Coprinus cinereus 퍼옥시다제(유럽특허출원 179,486에 따라 얻어진 CiP), 과산화수소, 및 퍼옥시다제 강화제로서 p-히드록시 벤젠술포네이트(pHBS)로 이루어지는 염료 전달억제(DTI)에 사용되는 퍼옥시다제 시스템(POD시스템)을 Britton-Robinson 완충액, pH 8.5에서 시뮬레이션하였다: [pHBS]: 50 μM, [H₂Ｏ₂]: 200μM, [CiP]: 2 PODU/mℓ, [-셀룰라제]: 1.4 ECU/ mℓ, 10mM Britton-Robinson 완충액, pH 8.5.

43 kD 셀룰라제와 셀룰라제 변이체 Y147S를 35 ℃에서 10 분간 POD 시스템과 배양하였다. 샘플을 꺼내서 얼음 냉각된 0.1M 인산나트륨, pH 7.0으로 5번 희석하였다. 셀룰라제의 잔류활성은 페리시안화물 검출원리를 이용한 CMCU 방법에 의해 측정하였다. 결과를 하기의 표에서 나타냈는데, 이것은 치환 Y147S가 POD 시스템에 대해 안정한 셀룰라제 변이체를 이끈다는 것을 보여준다.

셀룰라제	POD 처리후 잔류활성(%)
43 kD 셀룰라제	10
변이체 Y147S	85

실시예 5

비결정 셀룰로스에 대한 알칼리 셀룰라제 활성의 결정

방법:

기질제조: 20g 산-팽창된 AVICEL스톡용액(1개월간 보관할수 있는 제제에 대해서는 하기 참조)을 5000 rpm 에서 20 분간 원심분리하고, 상징액을 버리고, 침전물을 30mℓ완충액에 재현탁시켰다. 그 다음 5000 rpm 에서 20 분간 원심분리하고, 상징액을 버리고, 침전물을 전체 30g의 완충액에 재현탁시켰다. 이것은 10g AVICEL/리터의 기질농도에 해당한다.

완충액:

0.1M 바르비탈 pH 8.5 또는 0.1M 글리신 pH 10.0

효소용액:

효소를 pH 8.5 에서 0.5 S-CEVU/mℓ또는 pH 10.0에서 0.75 S-CEVU/mℓ의 활성으로 희석하였다.

시약:

2% NaOH, PHBAH- 시약: 1.5g의 p-히드록시벤조산 히드라지드 및 5.0g 타르타르산 나트륨을 2% NaOH 100mℓ에 녹였다.

기질, 완충액 및 효소용액을 하기와 같이 혼합하였다:

기질/완충액 용액을 40 ℃에서 5분간 예비가열했다. 그 다음 효소용액을 첨가하고 용액을 5초동안 혼합한후 40 ℃에서 20 분간 배양하였다.

500 μℓ2% NaOH용액을 첨가함으로써 반응을 종결시킨 다음 5초동안 혼합하였다. 샘플을 5000rpm에서 20 분간 원심분리하였다. 1000μℓ의 상징액을 시험관에서 새로운 시험관으로 옮기고, 500 μℓPHBAH-시약을 첨가하고, 10분간 끓였다. 시험관을 얼음물에서 냉각시켰다. 410 nm에서 분광광도계상에서 샘플의 흡광도를 측정하였다.

표준 글루코스 곡선:

300mg/ℓ을 포함하는 스톡용액을 5, 10, 15및 25mg/ℓ로 희석하였다. 희석한 표준물 1000 μℓ를 500μℓ의 PHBAH-시약과 혼합하고, 다른 샘플처럼 처리하였다. 상기 참조.

활성의 결정:

환원 글루코스당량의 방출은 표준곡선을 이용하여 계산하였다. 효소농도는 43 kD 엔도글루칸아제에 대한 몰 흡광도 61300 (ε)을 이용하여 계산하였다. K_m, V_max및 K_cat는 다른 기질농도를 이용하여 Lineweaver-Burk 그래프로부터 계산하였다. 치환된 티로신 및 트립토판을 갖는 셀룰라제 변이체의 몰 흡광도는 트립토판의 흡광도값 5690(ε) 및 티로신의 흡광도값 1280(ε) 그리고 시스테인의 흡광도값 120(ε)을 이용하여 조정하였다.

흡광도 계수 (ε)는 Gill, S.C. 및 Hippel, P.H. : 아미노산 서열 데이타의 단백질 흡광도 계수의계산: Analytical Biochemistry Vol 182, (319-326), (1989)에서 개시되었다. 시험한 셀룰라제 변이체 각각을 높은 균질도로 정제하였고 이것은 SDS-PAGE 분석에서 단일 밴드를 나타냈다(A₂₈₀/A₂₆₀비율은 1.5 이상인 것으로 확인되었다).

산 팽창된 셀룰로스의 제조:

재료:

5g AVICEL(Art. 2331 Merck)

150mℓ 85% 오르토- 인산(Art. 573 Merck)

400mℓ아세톤(Art. 14 Merck)

1.3 ℓ 탈이온수(Milli Q)

1 ℓ 유리비이커

1 ℓ 유리 여과깔때기

2 ℓ 흡입플라스크

Ultra Turrax 호모게나이저

방법:

아세톤과 인산을 얼음에서 냉각시켰다. 5g AVICEL을 물로 젖게하고, 150mℓ의 얼음냉각한 85% 오르토-인산을 첨가하고, 혼합물을 1시간동안 약하게 교반하면서 얼음수조에 놓았다. 교반하면서 얼음냉각한 아세톤 100 mℓ을 첨가하고, 혼합물을 유리여과깔때기로 옮긴다음, 3 ×100 mℓ얼음냉각 아세톤으로 세척하고 각 세척후 건조 흡입시켰다. 필터 케이크를 2 × 500 mℓ물로 세척하고 각 세척후 가능한한 건조상태로 흡입시켰다.

필터케이크를 전체 체적 300 mℓ에 재현탁시키고 균질상태까지 혼합하였다( Ultra Turrax 호모게나이저를 사용함).

결과적인 생성물을 냉장고에 보관하였다.

하기의 결과는 각각 43kD 셀룰라제 및 변이체 A162P와 W62E으로 얻어졌다.

pH 8.5에서 초당 Kcat pH 10 에서 초당 Kcat

43 kD 57 25

A162P 64 36

W62E 41 31

표로부터 알수있듯이 두 치환은 알칼리조건(pH 10.0)에서 기질 비결정 Avicel에 대한 촉매활성을 증가시켰다.

실시예 6

셀룰라제의 LAS 억제

셀룰라제를 다른 농도의 LAS(선형 알킬벤젠술포네이트; Nansa 1169/P)와 40 ℃ 에서 10분간 배양하였다.

하기에서 기술되는 CMCU 방법을 이용하여 잔류활성을 결정하였다.

LAS를 0.1M 인산염완충액 pH 7.5으로 희석하였다. 하기의 농도를 사용하였다: 500 ppm, 250 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm, 및 10 ppm, LAS부재. 셀룰라제를 전체체적 10mℓ중의 0, 2 S-CEVU/mℓ최종농도로 다른 LAS 완충액으로 희석하고, 온도조절되는 수조에서 10 분간 배양하였다.

그 다음엔 잔류활성을 CMCU 기질을 사용하고 환원당을 측정하여 이중으로 결정하였다. 0, 5 mℓ용액의 두 샘플을 동일한 인산염 완충액으로 제조한 1, 5 mℓ 1% CMC 용액(Hercules 7 L)과 혼합하고, 40℃에서 20 분간 배양한 다음 2% NaOH 중의 타르타르산나트륨, PHBAH 로 종결시켰다.

종결 시약의 첨가후, 0, 5 mℓ의 유사한 블랭크 샘플을 CMC 용액에 첨가하였다.

샘플을 10 분간 끓이고 410 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 활성은 블랭크의 공제후 측정하였다. LAS 부재의 활성은 100% 였다.

도 10에서는 각각 43 kD 셀룰라제 그리고 셀룰라제 변이체 A162P 및 R158E의 잔류활성이 보여진다. 43 kD 셀룰라제는 'Wild'로 표시하고, A162P 변이체는 '248'로 표시하고, R158E 변이체는 '280' 으로 표시한다. 도면으로부터 알수 있듯이, A162P 또는 R158E의 치환은 LAS( 음이온성 계면활성제) 에 대한 셀룰라제의 안정성을 증가시킨다.

본발명의 셀룰라제 변이체는 분말조성물, 액체조성물 및 강력액체조성물과 같은 세정제 조성물에 대개 존재하는 다른 성분과의 증가된 융화성, 증가된 알칼리 활성을 나타낸다. 더욱이 본발명의 셀룰라제 변이체는 세정제 조성물에서 사용될때 입자성 얼룩제거, 색깔정화, 보풀제거, 솜털제거 및 거칠음 감소에 대해서 개선된 성질을 가지며, 그것은 음이온성 계면활성제에 대한 감소된 민감성과 산화 또는 퍼옥시다제 표백시스템의 존재에 대한 감소된 민감성을 나타낸다.

본발명의 셀룰라제 변이체의 개선된 성질은 예컨대 제지용 펄프 가공, 동물사료, 직물처리 및 데님같은 직물, 특히 진(jeans) 의 '스톤- 와시' 모양의 부여에서 사용될때 공지된 셀룰라제보다 셀룰라제 변이체를 휠씬 더 유용하게 만든다.

Claims

패밀리 45로 분류되는, 촉매활성 도메인을 갖는 미생물성 모(母) 셀룰라제의 셀룰라제 변이체로, 상기 변이체는 셀룰로스결합 도메인(CBD), 촉매활성 도메인(CAD) 및 셀룰로스결합 도메인과 촉매활성 도메인을 연결하는 부위(연결부)를 포함하고, SEQ ID NO:10에 대응하는 위치로 W9F,H,S,A, W18H,F,A 및 M104S,N,Q로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것에 의하여 산화 또는 표백제의 존재에 대해 감소된 민감성을 나타내는 것을 특징으로 하는 셀룰라제 변이체.
제 1 항에 있어서, 모 셀룰라제는 진균성 셀룰라제인 것을 특징으로 하는 셀룰라제 변이체.
제 5 항에 있어서, 모 셀룰라제는Humicola,Trichoderma,Myceliophthora,Penicillium,Irpex,Aspergillus또는Fusarium의 균주로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 셀룰라제 변이체.
제 1 항의 셀룰라제 변이체를 포함하는 세정제 조성물.
제 7 항에 있어서, 프로테아제, 리파제, 퍼옥시다제, 에스테라제, 셀룰라제, 엔도글루칸아제 타입 II, 옥시다제 및 아밀라제로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 세정제 조성물.
제 7 항에 있어서, 세정제 조성물은 분말 또는 액체 조성물인 것을 특징으로하는 세정제 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 분말 조성물은 콤팩트 강력 분말 조성물이고 그리고 상기 액체 조성물은 강력 액체 조성물 또는 콤팩트 강력 액체 조성물인 것을 특징으로 하는 세정제 조성물.