CN103930555A - 水解和发酵纤维素材料的方法 - Google Patents

Abstract

本文中描述了使用连二亚硫酸盐将纤维素材料降解或转化为可发酵的糖的改善的方法。亦描述了在连二亚硫酸盐存在下改善的发酵方法。

Description

水解和发酵纤维素材料的方法

涉及序列表

本申请包含计算机可读形式的序列表。所述计算机可读形式通过提述并入本文。

发明背景

纤维素材料对于生成可替代化石燃料的能源提供了有吸引力的平台。将纤维素材料转化(例如从木素纤维素原料)为生物燃料具有下述优点：大量原料现成可用，可以理想地避免燃烧或填埋材料，以及生物燃料(如乙醇)的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物被认为是用于生物燃料生产的原料。一旦将纤维素转化成可发酵的糖例如葡萄糖，所述可发酵的糖容易地由酵母发酵成生物燃料，如乙醇。

对木素纤维素(来自细胞壁的纤维素材料，其在混合基质中含有木质素、纤维素和半纤维素)进行化学和物理预处理以破坏植物细胞壁组分，并允许纤维素酶改善的攻击(access)是增加糖化产量/产率(yield)的常见方法。然而，预处理的严酷条件亦会在木质素结构内生成官能团，其导致木质素与纤维素酶之间不合意的相互作用，使得糖化的产量/产率不理想。

Soudham等,2011,Journal of Biotechnology155:244-250涉及在预处理液体的存在下使用还原剂改善纤维素底物的酶促水解。

在本领域中，改善水解经预处理的纤维素材料的方法会是有利的。

发明内容

在本文中描述了使用连二亚硫酸盐(例如连二亚硫酸钠)将纤维素材料降解或转化为可发酵的糖的方法。亦描述了在连二亚硫酸盐存在下的发酵方法。

在一个方面，为降解经预处理的生物质材料(例如纤维素材料)的方法，其包括：

(a)用连二亚硫酸盐温育经预处理的纤维素材料；和

(b)用包含一种或多种纤维素酶的酶组合物糖化经预处理的纤维素材料。

在另一个方面，为产生发酵产物的方法，其包括：

(a)用包含一种或多种纤维素酶的酶组合物糖化生物质材料(例如纤维素材料)；

(b)用一种或多种发酵微生物在连二亚硫酸盐存在下发酵经糖化的纤维素材料；和

(c)从(b)回收发酵产物。

附图说明

图1显示连二亚硫酸盐对里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶制备物水解经预处理的玉米秸秆(PCS)的作用。

图2显示不同的GH61A浓度对在连二亚硫酸盐存在下里氏木霉纤维素酶制备物水解经预处理的玉米秸秆(PCS)的作用。

图3显示当将0-3％Na₂S₂O₄添加至使用15％TS NREL未洗涤的PCS的乙醇发酵时，使用C5酵母在50小时发酵之后的乙醇产量。

图4显示当使用15％TS NREL未洗涤的PCS添加0-3％Na₂S₂O₄时，使用C5酵母在乙醇发酵过程中的木糖消耗。

图5显示使用添加0、1、2和3％Na₂S₂O₄的15％TS NREL未洗涤PCS使用C5酵母在50小时和72小时乙醇发酵之后的乙醇产率。

定义

乙酰木聚糖酯酶：术语“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC3.1.1.72)，其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯(alpha-napthyl acetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。就本发明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用含有0.01％TWEEN^TM20(聚乙二醇山梨坦单月桂酸酯)的50mM乙酸钠pH5.0中的0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为能够在pH5,25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子(p-nitrophenolate anion)的酶量。

等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

α-L-***呋喃糖苷酶：术语“α-L-***呋喃糖苷酶”意指α-L-***呋喃糖苷***呋喃水解酶(EC3.2.1.55)，其催化对α-L-***糖苷中的末端非还原性α-L-***呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-***呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-***聚糖、***木聚糖和***半乳聚糖起作用。α-L-***呋喃糖苷酶也称为***糖苷酶、α-***糖苷酶、α-L-***糖苷酶、α-***呋喃糖苷酶、多糖α-L-***呋喃糖苷酶、α-L-***呋喃糖苷水解酶、L-***糖苷酶或α-L-***聚糖酶。就本发明而言，α-L-***呋喃糖苷酶活性是使用总体积200μl中的每ml的100mM乙酸钠pH5中5mg的中等粘度小麦***木聚糖(Megazyme International Ireland,Ltd.,Bray,Co.Wicklow,Ireland)在40℃进行30分钟，接着通过HPX-87H柱层析(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)的***糖分析来确定的。

α-葡糖醛酸糖苷酶：术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指α-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(alpha-D-glucosiduronate glucuronohydrolase)(EC3.2.1.139)，其催化α-D-葡糖醛酸糖苷水解为D-葡糖醛酸和醇。就本发明而言，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根据de Vries,1998,J.Bacteriol.180:243-249确定的。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于能够在pH5，40℃每分钟释放1微摩尔葡糖醛酸或4-O-甲基葡糖醛酸的酶量。

β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(E.C.No.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，β-葡糖苷酶活性根据Venturi等,2002,Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var.coprophilum:production,purification and some biochemical properties,J.Basic Microbiol.42:55-66描述的基本步骤确定。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃,pH4.8，在含有0.01％20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚阴离子。

β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指β-D木糖苷木糖水解酶(β-D-xylosidexylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以从非还原端去除连续的D-木糖残基。就本发明而言，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃，pH5在含有0.01％20的100mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚阴离子。

生物质材料：如本文中使用的术语“生物质材料”指任何含糖生物质(例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木材)及其任何组分，如纤维素、半纤维素或木质素。应理解的是，除非另行指明，生物质材料包括未处理的、预处理的和水解的或部分水解的形式(例如生物质降解的产物，如寡糖)。

cDNA：术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核或原核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少可存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤包括剪接进行加工，然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。

纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(1,4-beta-D-glucan cellobiohydrolase)(E.C.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维寡糖，或任何包含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖(Teeri,1997,Crystalline cellulose degradation:Newinsight into the function of cellobiohydrolases,Trends in Biotechnology15:160-167；Teeri等,1998,Trichoderma reesei cellobiohydrolases:why so efficient on crystallinecellulose？,Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。根据Lever等,1972,Anal.Biochem.47:273-279；van Tilbeurgh等,1982,FEBS Letters149:152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBS Letters187:283-288；以及Tomme等,1988,Eur.J.Biochem.170:575-581描述的方法确定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，Tomme等的方法可用于确定纤维二糖水解酶活性。

纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种(例如几种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，β-葡糖苷酶，或其组合。测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如Zhang等,Outlook for cellulase improvement:Screening and selection strategies,2006,Biotechnology Advances24:452-481所综述的。总纤维素分解活性通常是使用不溶性底物来测定的，所述底物包括Whatman1号滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经预处理的木素纤维素等。最常见的总纤维素分解活性测定法是使用Whatman1号滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定法是由International Union of Pure andApplied Chemistry(IUPAC)(Ghose,1987,Measurement of cellulase activities,Pure Appl.Chem.59:257-68)确立的。

就本发明而言，纤维素分解酶活性通过测量在下述条件下由纤维素分解酶进行的纤维素材料水解相比于未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解的增加来确定：1-50mg的纤维素分解酶蛋白/g的PCS中纤维素(或其它经预处理的纤维素材料)在合适的温度，例如50℃、55℃、60℃或65℃进行3-7日。通常条件为：1ml反应液，经洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固形物，50mM乙酸钠pH5，1mM MnSO₄，50℃、55℃、60℃或65℃，72小时，通过HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行糖分析。

纤维素材料：如用于本文中的术语“纤维素材料”指包含纤维素(一种化学上均质的寡糖或多糖，即β-(1-4)-D-葡聚糖(含β(1-4)连接的D-葡萄糖单元的聚合物))的任何生物质材料。尽管通常是多形的，但存在于植物组织中的纤维素主要是平行葡聚糖链的不溶晶体基质。纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木材。纤维素材料可以是，但不限于，草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸、以及纸浆和造纸厂残余物(参见，例如，Wiselogel等,1995,于Handbook on Bioethanol(Charles E.Wyman编),pp.105-118,Taylor&Francis,Washington D.C.；Wyman,1994,BioresourceTechnology50:3-16；Lynd,1990,Applied Biochemistry and Biotechnology24/25:695-719；Mosier等,1999,Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics,于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,T.Scheper主编,Volume65,pp.23-40,Springer-Verlag,New York)。纤维素材料包含任何形式的纤维素，如降解或水解为寡糖的多糖。在本文中应理解的是，纤维素可为木素纤维素组分的形式，木素纤维素是一种植物细胞壁材料，包含木质素、纤维素和半纤维素的混合基质。

在一个方面，纤维素材料是草本材料(包括能源作物)。在另一个方面，纤维素材料是农业残余物。在另一个方面，纤维素材料是木材(包括林业残余物)。在另一个方面，纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面，纤维素材料是废纸。在另一个方面，纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。

在另一个方面，纤维素材料是玉米秸秆。在另一个方面，纤维素材料是麦秆。在另一个方面，纤维素材料是甘蔗渣。在另一个方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面，纤维素材料是柳枝稷(switchgrass)。在另一个方面，纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面，纤维素材料是稻秆。在另一个方面，纤维素材料是芒草属(miscanthus)。在另一个方面，纤维素材料是橙皮。在另一个方面，纤维素材料是杨树。在另一个方面，纤维素材料是松树。在另一个方面，纤维素材料是柳树。在另一个方面，纤维素材料是桉树。

在另一个方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面，纤维素材料是棉线头(cotton linter)。在另一个方面，纤维素材料是无定型的经磷酸处理的纤维素。在另一个方面，纤维素材料是滤纸。

在另一个方面，纤维素材料是水生生物质。如用于本文中，“水生生物质”意指在水生环境中由光合作用过程产生的生物质。水生生物质可为藻类、沉水植物(submerged plant)、挺水植物(emergent plant)、或浮叶植物(floating-leaf plant)。

纤维素材料可以按原样(as is)使用，或进行预处理，使用本领域已知的常规方法，如本文所述。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或其它起始密码子如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的多核苷酸。

调控序列(control sequence)：术语“调控序列”意指对编码成熟多肽的多核苷酸表达而言为必需的核酸序列。各个调控序列对于编码所述多肽的多核苷酸可以是天然的(即，来自同一基因)或外来的(即，来自不同基因)，或者，各个调控序列对于彼此而言可以是天然的或外来的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以配备有接头，用于引入促进调控序列与编码多肽的多核苷酸编码区的连接的特异性限制位点。

内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1,4-β-D-glucan4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(lichenin)中的1,4-β-D-糖苷键、混合的β-1,3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素组分的其它植物材料中的β-1,4键的内切水解(endohydrolysis)。内切葡聚糖酶活性可通过测量底物粘度的减少或由还原糖测定法(Zhang等,2006,Biotechnology Advances24:452-481)确定的还原端增加来确定。就本发明而言，根据Ghose,1987,Pure and Appl.Chem.59:257-268的方法，在pH5，40℃使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来确定内切葡聚糖酶活性。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的调控序列可操作地连接。

家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”在本文中定义为根据Henrissat,1991,A classification of glycosyl hydrolases basedon amino-acid sequence similarities,Biochem.J.280:309-316,及Henrissat和Bairoch,1996,Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases,Biochem.J.316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。该家族中的酶最初是基于在一个家族成员测量到的非常弱的内切-1,4-β-D葡聚糖酶活性而被归类为糖苷水解酶家族的。这些酶的结构和作用模式必然是非经典的，且它们无法视为真正的(bona fide)糖苷酶。然而，基于它们与纤维素酶或纤维素酶的混合物一同使用时增强木素纤维素分解的能力，将它们保留在CAZy分类中。

阿魏酸酯酶：术语“阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)”意指4-羟基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶(EC3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基团从酯化的糖(其在“天然”底物中通常为***糖)的水解，以产生阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也称作阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羟基肉桂酰基酯酶、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。就本发明而言，阿魏酸酯酶活性是使用50mM乙酸钠pH5.0中的0.5mM阿魏酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的阿魏酸酯酶等于能够在pH5，25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子的酶量。

半纤维素：如用于本文中的术语“半纤维素”指除了纤维素之外的寡糖或多糖生物质材料。半纤维素在化学上是异质的，并在复杂的、异质的支化的和直链的多糖或寡糖中含有多种聚合的糖，主要是D-戊糖，如木聚糖、葡聚糖、***木聚糖和甘露聚糖，其通过氢键键合于植物细胞壁中的纤维素微纤维，且其中木糖通常含量最大。半纤维素可共价附接于木质素，且通常氢键键合于纤维素，以及其它半纤维素，这帮助稳定化细胞壁基质，形成高度复杂的结构。半纤维素材料含有任何形式的半纤维素，如降解或水解为寡糖的多糖。在本文中应理解的是，半纤维素可为木素纤维素组分的形式，木素纤维素是在混合基质中含有木质素、纤维素和半纤维素的细胞壁材料。

半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指一种或多种(几种)水解半纤维素材料的酶。参见，例如Shallom和Shoham，2003，Microbial hemicellulases.Current Opinion In Microbiology,6(3):219-228)。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键成分。半纤维素酶的实例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、***聚糖酶、***呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。这些酶的底物，半纤维素，是一种由支化和直链多糖构成的异质集团，这些多糖通过氢键键合于植物细胞壁中的纤维素微纤维，将其交联为一个鲁棒(robust)的网络。半纤维素亦共价地附接于木质素，与纤维素一同形成高度复杂的结构。半纤维素的可变的结构和组织形式需要许多酶的协同作用使其完全降解。半纤维素酶的催化模块为水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或水解乙酸或阿魏酸侧基的酯连接的糖酯酶(CE)。这些催化模块，基于其一级结构的同源性，可指派为GH和CE家族，并标以数字。一些家族，具有总体上类似的折叠，可进一步归类为以字母标记的宗族(clan)(例如，GH-A)。这些和其他糖活性酶的一种最具信息性和最新的分类可在Carbohydrate-Active Enzymes(CAZy)数据库获得。半纤维素分解酶活性可根据Ghose和Bisaria,1987,Pure&Appl.Chem.59:1739-1752进行测量。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖任何亲本细胞的后代，其由于在复制中发生的突变而不同于亲本细胞。

分离的：术语“分离的”意指以不在自然界出现的形式或环境存在的物质。分离的物质的非限定性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)任何至少部分地与一种或多种或所有与其天然伴随的天然存在的成分分开的物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)任何这样的物质：相对于在自然界存在的该物质，其经过人工修饰；或(4)任何这样的物质：该物质经过增加该物质相对于与其自然伴随的其他成分的量的修饰(例如，编码该物质的基因的多重拷贝；或与编码该物质的基因自然结合的启动子更强的启动子的使用)。分离的底物可存在于发酵液样品中。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在本领域中已知宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即具有不同的C端和/或N端氨基酸)的混合物。成熟多肽可使用SignalP程序(Nielsen等,1997,Protein Engineering10:1-6)预测。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有生物活性的成熟多肽的核苷酸序列。成熟多肽编码序列可使用SignalP程序(Nielsen等,1997,见上文)预测。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或其经修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的区段，或其为合成的，其包含一个或多个调控序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。

多肽片段：术语“片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基端缺失一个或多个(例如几个)氨基酸的多肽。在一个方面，片段含有参照的成熟多肽的至少85％的氨基酸残基，例如至少90％的氨基酸残基或至少95％的氨基酸残基。

具有纤维素分解增强活性的多肽：术语“具有纤维素分解增强的多肽”意指催化具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的增强的GH61多肽。就本发明而言，通过测量来自由纤维素分解酶在下述条件下水解纤维素材料的还原糖增加或纤维二糖与葡萄糖的总量增加来确定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白/g PCS中纤维素，其中总蛋白包含50-99.5％w/w的纤维素分解酶蛋白，及0.5-50％w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白质，在合适的温度，例如50℃、55℃或60℃历时1-7天，与用等量的总蛋白加载量而无纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中纤维素)所进行的对照水解相比。在一个优选的方面，使用在总蛋白重量的2-3％的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO02/095014在米曲霉中重组产生)或者总蛋白质量的2-3％的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO2002/095014所述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白加载量存在下的1.5L(Novozymes A/S,,Denmark)的混合物作为纤维素分解活性的来源。

具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过降低达到相同水解水平所需的纤维素分解酶的量而增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解，优选降低至少1.01倍，更优选至少1.05倍，更优选至少1.10倍，更优选至少1.25倍，更优选至少1.5倍，更优选至少2倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，更优选至少5倍，甚至更优选至少10倍，和最优选至少20倍。

预处理的玉米秸秆：术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆”意指已经经预处理(例如通过用热和稀硫酸处理)的源自玉米秸秆的纤维素材料。

序列同一性：参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite,Rice等,2000,Trends Genet.16:276-277)，优选5.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。使用的参数为缺口罚分(gap penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：

(同样的残基×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)

就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,见上文)，优选5.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的参数为缺口罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：

(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)

亚序列：术语“亚序列(subsequence)”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有生物活性的片段。

变体：术语“变体”意指在一个或多个位置包含一个或多个(例如几个)氨基酸改变，即取代、***和/或缺失的壳多糖结合蛋白。取代意指将占据某位置的氨基酸用不同的氨基酸替代；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而***意指在邻接占据某位置的氨基酸之后添加氨基酸。

木聚糖降解活性或木聚糖分解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含木聚糖材料的生物学活性。两种测定木聚糖分解活性的基础方法包括：(1)测定总木聚糖分解活性，和(2)测定单独的木聚糖分解活性(例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、***呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醛酸酯酶(α-glucuronyl esterase))。最近在木聚糖分解酶测定法的进展总结于几个公开文献中，包括Biely和Puchard,Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes,2006,Journal of theScience of Food和Agriculture86(11):1636-1647；Spanikova和Biely,2006,Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllumcommune,FEBS Letters580(19):4597-4601；Herrmann等,1997,Thebeta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xylanxylohydrolase,Biochemical Journal321:375-381。

总木聚糖降解活性可通过确定从多种类型的木聚糖形成的还原糖来测量，所述木聚糖包括例如燕麦小麦(oat spelt)、山毛榉木(beechwood)和落叶松木(larchwood)木聚糖，或者可通过光度法确定从多种共价染色的木聚糖释放出的染色的木聚糖片段来测量。最常见的总木聚糖分解活性测定法基于从多聚的4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如Bailey等,1992,Interlaboratorytesting of methods for assay of xylanase activity,Journal of Biotechnology23(3):257-270中所述。木聚糖酶活性亦可用0.2％AZCL-***木聚糖作为底物在37℃在0.01％X-100和200mM磷酸钠缓冲液pH6中来确定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH6在200mM磷酸钠pH6缓冲液中从作为底物的0.2％AZCL-***木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青精。

就本发明而言，木聚糖降解活性是通过测量由木聚糖降解酶在下述通常条件下造成的桦木木聚糖(Sigma Chemical Co.,Inc.,St.Louis,MO,USA)水解的增加来确定的：1ml反应液，5mg/ml底物(总固形物)，5mg木聚糖分解蛋白质/g底物，50mM乙酸钠，pH5，50℃，24小时，如Lever,1972,A new reactionfor colorimetric determination of carbohydrates,Anal.Biochem47:273-279所述使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定法进行糖分析。

木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(1,4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内切水解。就本发明而言，木聚糖酶活性是使用0.2％AZCL-***木聚糖作为底物，在0.01％和200mM磷酸钠缓冲液中、pH6、37℃确定的。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH6在200mM磷酸钠pH6缓冲液中从作为底物的0.2％AZCL-***木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青精。

在本文中，提及“约”某值或参数包括了涉及该值或参数本身的方面。举例而言，提及“约X”的描述包括了“X”的方面。

如用于本文中和所附权利要求中，除非上下文明确地表示相反，单数形式“一(个/种…)(a)”或“所述/该(the)”包括了对复数的提及。应理解本文中所述的发明的各方面包括了“由…组成(consisting)”和/或“基本上由…组成(consisting essentially of)”的方面。

除非另行定义或上下文明确指出，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含意。

发明详述

本发明涉及降解或转化经预处理的生物质的方法和发酵生物质的方法等。如本文中所述，用连二亚硫酸盐温育经预处理的纤维素材料显示增强的糖化产量/产率。此外，将连二亚硫酸盐添加至发酵混合物导致糖化的糖至乙醇的发酵增强。

因此，在一个方面，为降解经预处理的生物质材料的方法，其包括：

(a)用连二亚硫酸盐温育经预处理的纤维素材料；和

(b)用包含一种或多种纤维素酶的酶组合物糖化经预处理的纤维素材料。

步骤(a)和(b)可全部或部分以任何顺序和/或可同时进行。例如，温育用连二亚硫酸盐预处理的纤维素材料可发生在糖化经预处理的纤维素材料之前。在此情况下，在糖化之前可能温育已完成(例如，全部或部分去除所述连二亚硫酸盐)，或温育可在糖化过程中继续进行(例如在糖化过程中，连二亚硫酸盐留存在经预处理的纤维素混合物中)。在一个方面，温育用连二亚硫酸盐预处理的纤维素材料进行至少30分钟，例如至少1小时、2小时、4小时、8小时、12小时或24小时，然后糖化经预处理的纤维素材料。在一个方面，所述连二亚硫酸盐在糖化经预处理的纤维素材料步骤的过程中存在。在另一个方面，温育和糖化同时开始和结束(例如，包含一种或多种纤维素酶的酶组合物亦包含连二亚硫酸盐，并直接加入经预处理的纤维素材料中)。在另一个方面，在糖化经预处理的纤维素材料步骤之前从经预处理的纤维素材料去除大部分的连二亚硫酸盐。

在另一个方面，为产生发酵产物的方法，其包括：

(a)用包含一种或多种纤维素酶的酶组合物糖化纤维素材料(经预处理或未经预处理的)；

(b)用一种或多种发酵微生物在连二亚硫酸盐存在下发酵经糖化的纤维素材料；和

(c)从(b)回收发酵产物。

在产生发酵产物的一些方面，糖化纤维素材料在发酵经糖化的纤维素材料之前和/或同时(全部或部分)进行。例如，糖化纤维素材料可在发酵经糖化的纤维素材料开始之前开始和结束；或可在发酵开始之前开始，然后在发酵过程中继续进行。在一个方面，糖化经预处理的纤维素材料进行至少12小时，例如至少1日，2日，或5日，然后发酵开始。

根据上述方法使用的连二亚硫酸盐(S₂O₄ ^2-)可为任何合适形式的连二亚硫酸盐，并可为任何合适的浓度。例如，在一个方面，所述连二亚硫酸盐可为连二亚硫酸钠的形式。在温育过程中合适浓度的非限定性实例包括，例如约0.1％至约5％，如约0.5％至4％，1％至3％，或约2％(w/w)，这基于所述连二亚硫酸盐(例如Na₂S₂O₄)的重量相比于经预处理的纤维素材料的干重量。在发酵过程中合适浓度的非限定性实例包括，例如约0.1％至约3％，如约0.5％至2％，0.75％至1.5％，或约1％(w/w)。

在产生发酵产物的一些方面，所述方法进一步包括用连二亚硫酸盐温育预处理的纤维素材料在糖化纤维素材料之前和/或同时进行。在温育过程中的连二亚硫酸盐浓度可为如上所述的任何合适浓度。在一些方面，所述连二亚硫酸盐在温育中处于较高浓度(例如约2％(w/w))，然后在发酵中减少至较低浓度(例如约1％(w/w))。在这些方面的一些中，所述较高浓度降低至少10％，例如至少15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，或95％。

温育用连二亚硫酸盐预处理的纤维素材料可在任何合适温度进行，例如在约25℃至约85℃，例如35℃至80℃，45℃至75℃，50℃至70℃，55℃至65℃，或约60℃进行；且可进行任何合适量的时间，如至少30分钟，例如至少1小时，2小时，4小时，8小时，12小时，或24小时，或约30分钟至24小时，或约1小时至16小时。

预处理。经预处理的纤维素材料可例如通过化学预处理、物理预处理，或化学预处理和物理预处理进行预处理，如下所述。在一个方面，所述经预处理的纤维素材料通过化学预处理进行预处理。在另一个方面，所述经预处理的纤维素材料通过物理预处理进行预处理。在另一个方面，所述经预处理的纤维素材料通过化学预处理和物理预处理进行预处理。在一些方面，所述经预处理的纤维素材料是经预处理的玉米秸秆(PCS)。

可以使用本领域已知的任何预处理工艺破坏植物细胞壁的纤维素材料组分(Chandra等,2007,Substrate pretreatment:The key to effective enzymatic hydrolysisof lignocellulosics？Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:67-93；Galbe and Zacchi,2007,Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol production,Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:41-65；Hendriks and Zeeman,2009,Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass,BioresourceTechnol.100:10-18；Mosier等,2005,Features of promising technologies forpretreatment of lignocellulosic biomass,Bioresource Technol.96:673-686；Taherzadeh and Karimi,2008,Pretreatment of lignocellulosic wastes to improveethanol and biogas production:A review,Int.J.of Mol.Sci.9:1621-1651；Yang andWyman,2008,Pretreatment:the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol,Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr.2:26-40)。

纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行粒度减小、预浸泡、润湿、洗涤或调理(conditioning)。

常规的预处理包括但不限于，蒸汽预处理(伴随或不伴随***)、稀酸预处理、热水预处理、碱性预处理、石灰预处理、湿氧化、湿***、氨纤维***、有机溶剂预处理和生物预处理。其它预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO₂、超临界H₂O、臭氧、和γ辐射预处理。

可以在水解和/或发酵之前预处理纤维素材料。预处理优选在水解前进行。或者，预处理可以与酶水解同时进行以释放可发酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纤维二糖。在大多数情况下，预处理步骤本身使一些纤维素材料转化成可发酵糖(甚至在不存在酶的情况下)。

蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁成分，包括木质素、半纤维素和纤维素，使酶可接触纤维素和其它级分，例如，半纤维素。将纤维素材料经过或通过反应容器，其中注入蒸汽以增加温度至需要的温度和压力，并且在其中保持期望的反应时间。蒸汽预处理优选在140-230℃，例如160-200℃，或170-190℃进行，其中最优的温度范围依赖于任何化学催化剂的添加。蒸汽预处理的停留时间可为1-15分钟，例如3-12分钟，或4-10分钟，其中最优的停留时间依赖于温度范围和化学催化剂的添加。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量，使纤维素材料在预处理过程中通常仅仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的物质的***放料(explosive discharge)组合，这称为蒸汽***，即，快速闪变至大气压和物质的湍流，以通过破碎增加可接触的表面积(Duff和Murray,1996,Bioresource Technology855:1-33；Galbe和Zacchi,2002,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:618-628；美国专利申请No.2002/0164730)。在蒸汽预处理过程中，切割半纤维素乙酰基团，并且得到的酸自催化半纤维素部分水解成为半纤维素单糖和半纤维素寡糖，其变得更加可溶。去除木质素仅有限的程度。所得的液剂主要含有溶解的半纤维素材料(例如半纤维素单糖和半纤维素寡糖)，其中剩余的固形物主要由纤维素材料组成。

经常在蒸汽预处理之前加入催化剂如H₂SO₄或SO₂(通常0.3至3％w/w)，其可减少时间，降低温度，增加回收率，并改进酶水解(Ballesteros等,2006,Appl.Biochem.Biotechnol.129-132:496-508；Varga等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116:509-523；Sassner等.,2006,Enzyme Microb.Technol.39:756-762)。

化学预处理：术语“化学处理”指能促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/或释放的任何化学处理。合适的化学预处理工艺的实例包括例如稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻***(AFEX)、氨渗滤(APR)、和有机溶剂预处理。

在稀酸预处理中，将纤维素材料与稀酸(通常是H₂SO₄)和水混合以形成浆料，由蒸汽加热至期望的温度，并在一段停留时间后闪变至大气压。可以用很多反应器设计进行稀酸预处理，例如，活塞流反应器、逆流反应器或连续逆流收缩床反应器(Duff和Murray,1996,supra；Schell等,2004,Bioresource Technol.91:179-188；Lee等,1999,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93-115)。

还可以使用碱性条件下的几种预处理方法。这些碱预处理包括，但不限于，石灰预处理、湿氧化、氨渗滤(APR)和氨纤维/冷冻***(AFEX)。

用碳酸钙、氢氧化钠或氨，在85-150℃的低温进行石灰预处理，停留时间从1小时到几天(Wyman等,2005,Bioresource Technol.96:1959-1966；Mosier等,2005,Bioresource Technol.96:673-686)。WO2006/110891、WO2006/118099、WO2006/110900和WO2006/110901公开了使用氨的预处理方法。

湿法氧化是热预处理，通常在180-200℃进行5-15分钟，加入氧化剂如过氧化氢或过压氧(Schmidt和Thomsen,1998,Bioresource Technol.64:139-151；Palonen等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.117:1-17；Varga等,2004,Biotechnol.Bioeng.88:567-574；Martin等,2006,J.Chem.Technol.Biotechnol.81:1669-1677)。预处理以优选1-40％干物质，更优选2-30％干物质，和最优选5-20％干物质进行，并且由于加入碱如碳酸钠，初始pH常常会增加。

湿法氧化预处理方法的修改方法，称为湿***(湿氧化和蒸汽***的组合)，能够处理高达30％的干物质。在湿***中，在预处理过程中，在一定的停留时间后引入氧化剂。然后通过闪变至大气压而结束预处理(WO2006/032282)。

氨纤维***(AFEX)涉及在温和温度如90-100℃和高压如17-20巴，用液体或气体氨将纤维素材料处理5-10分钟，其中干物质含量可以高达60％(Gollapalli等,2002,Appl.Biochem.Biotechnol.98:23-35；Chundawat等,2007,Biotechnol.Bioeng.96:219-231；Alizadeh等,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.121:1133-1141；Teymouri等,2005,Bioresource Technol.96:2014-2018)。AFEX预处理导致纤维素的解聚和半纤维素的部分水解。木质素-糖复合物受切割。

有机溶剂预处理通过用含水乙醇(40-60％乙醇)在160-200℃提取30-60分钟而将纤维素材料去木质素化(Pan等,2005,Biotechnol.Bioeng.90:473-481；Pan等,2006,Biotechnol.Bioeng.94:851-861；Kurabi等,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.121:219-230)。经常加入硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，去除了大部分半纤维素。

合适的预处理方法的其他实例如Schell等,2003,Appl.Biochem and Biotechn.105-108:69-85,和Mosier等,2005,Bioresource Technology96:673-686,和美国公开申请2002/0164730所述。

在一个方面，化学预处理作为酸处理，如作为连续稀酸和/或弱酸处理进行。酸可为硫酸，但也可以使用其它酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢或其混合物。弱酸(mild acid)处理在优选1-5，更优选1-4，和最优选1-3的pH范围进行。在一个方面，酸浓度在优选0.01至20wt％酸，更优选0.05至10wt％酸，甚至更优选0.1至5wt％酸，和最优选0.2至2.0wt％酸的范围。将酸与生物质接触，并在优选160-220℃，且更优选165-195℃范围的温度保持数秒至数分钟，例如1秒至60分钟的时间。

在另一个方面，预处理作为氨纤维***步骤(APEX预处理步骤)进行。

在另一个方面，预处理发生在含水浆料中。在一个方面，在预处理过程中纤维素材料以优选10-80wt％，例如20-70wt％或30-60wt％，如约50wt％的量存在。预处理的纤维素材料可以不洗涤或者使用本领域任何已知的方法洗涤，例如，用水洗涤。

机械预处理或物理预处理：术语“机械预处理”或“物理预处理”指任何促进颗粒大小减少的预处理。举例而言，此种预处理可涉及各种类型的磨制(grinding)或粉碎(milling)(例如，干磨、湿磨或振动球磨)。

纤维素材料可经物理(机械)和化学预处理。机械或物理预处理可与下述偶联：汽蒸/蒸汽***、水热解(hydrothermolysis)、稀酸或弱酸处理、高温、高压处理、辐射(例如微波辐射)，或其组合。在一个方面，高压指优选约100至约400psi，更优选约150至约250psi的范围的压强。在另一个方面，高温指约100至300℃，优选约140至约200℃范围的温度。在一个优选的方面，机械或物理预处理在使用利用如上所定义的高温和高压的蒸***水解器***(例如来自Sunds Defibrator AB,Sweden的Sunds Hydrolyzer)的分批过程中进行。所述物理和化学预处理可视需要顺序进行或同时进行。

因此，在一个优选的方面，对纤维素材料进行物理(机械)或化学预处理，或者它们的任何组合，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。

生物预处理：术语“生物预处理”指可以促进纤维素、半纤维素和/或木质素从生物质材料分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以包括应用溶解木质素的微生物(参见，例如，Hsu,T.-A.,1996,Pretreatment of biomass,于Handbook on Bioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh和Singh,1993,Physicochemical andbiological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333；McMillan,J.D.,1994,Pretreating lignocellulosicbiomass:a review,于Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production,Himmel,M.E.,Baker,J.O.,和Overend,R.P.,编,ACS Symposium Series566,American Chemical Society,Washington,DC,第15章；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.,1999,Ethanol production from renewable resources,于Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology,Scheper,T.,编,Springer-Verlag BerlinHeidelberg,Germany,65:207-241；Olsson和Hahn-Hagerdal,1996,Fermentation oflignocellulosic hydrolysates for ethanol production,Enz.Microb.Tech.18:312-331；和Vallander和Eriksson,1990,Production of ethanol from lignocellulosic materials:State of the art,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。

糖化。在水解(也称作糖化)步骤中，将纤维素材料，例如经预处理的纤维素材料水解以将纤维素和半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、***糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。水解由酶组合物以酶法在壳多糖结合蛋白的存在下进行。组合物的酶还可以同时或顺序加入。在所述方法的一些方面，用于糖化的纤维素酶是非细菌、真核的纤维素酶，如下文所述。

酶水解优选在容易由本领域技术人员确定的条件下，在合适的含水环境中进行。在一个方面，水解在适于酶的活性，即对于酶最佳的条件下进行。水解可以以补料分批或连续的过程进行，其中将经预处理的纤维素材料(底物)逐渐补入，例如，含酶的水解溶液中。

糖化通常在搅拌釜反应器或发酵罐中在受控的pH、温度和混合条件下进行。合适的处理时间、温度和pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可持续长达200小时，例如约12至约96小时，约16至约72小时，或约24至约48小时。在一个方面，糖化进行至少12小时，例如至少24小时、36小时、48小时、60小时或72小时。

糖化过程中的温度可为约25℃至约75℃，例如约30℃至约70℃，约35℃至约65℃，约40℃至60℃，约45℃至约55℃，或约50℃的范围。

糖化过程中的pH可为约3.0至7.0，例如3.5至6.5，4.0至6.0，4.5至5.5，或约5.0的范围。

在一些方面，糖化过程中的干固形物含量(例如纤维素材料中的总固形物)为少于约25wt％，20wt％，15wt％，10wt％，7.5wt％，5wt％，2.5wt％，2wt％，1wt％，或0.5wt％。

在一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含一种或多种(几种)选自下组的蛋白：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。在另一个方面，所述纤维素酶为优选一种或多种(几种)选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述半纤维素酶为优选一种或多种(几种)选自下组的酶：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、***聚糖酶、***呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。

在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含一种或多种(几种)纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含一种或多种(几种)半纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含一种或多种(几种)纤维素分解酶和一种或多种(几种)半纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含一种或多种(几种)选自下组的酶：纤维素分解酶和半纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含内切葡聚糖酶。在另一个方面，所述酶组合物包含纤维二糖水解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步内切葡聚糖酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含纤维二糖水解酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含β-葡糖苷酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。

在一个优选的方面，所述酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的多肽，优选GH61多肽，其与连二亚硫酸盐在纤维素材料的降解或转化中起协同作用。

在一个实施方案中，具有纤维素分解增强活性的多肽，优选GH61多肽，构成本发明的方法中使用的酶组合物的0.1至15％，优选0.5至10％，更优选0.5至7％。

在另一个方面，所述酶组合物包含乙酰甘露聚糖酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含乙酰木聚糖酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含***聚糖酶(例如α-L-***聚糖酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含***呋喃糖苷酶(例如α-L-***呋喃糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含香豆酸酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含阿魏酸酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含半乳糖苷酶(例如α-半乳糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含葡糖醛酸糖苷酶(例如α-D-葡糖醛酸糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含葡糖醛酸酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含甘露聚糖酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含甘露糖苷酶(例如β-甘露糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含木聚糖酶。在一个方面，所述木聚糖酶是家族10木聚糖酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含木糖苷酶(例如β-木糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含棒曲霉素。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含漆酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含木质素分解酶。在一个方面，所述木质素分解酶是锰过氧化物酶。在另一个方面，所述木质素分解酶是木质素过氧化物酶。在另一个方面，所述木质素分解酶是产生H₂O₂的酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含果胶酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含过氧化物酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含蛋白酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含膨胀素。

在本发明的方法中，酶可在发酵之前或过程中，例如在糖化过程中，或在发酵微生物繁殖过程中或之后添加。

所述酶组合物的一种或多种(几种)组分可为野生型蛋白、重组蛋白或野生型蛋白和重组蛋白的组合。举例而言，一种或多种(几种)组分可为细胞的天然蛋白，其用作宿主细胞以重组表达酶组合物的一种或多种(几种)其他组分。酶组合物的一种或多种(几种)组分可作为单组分产生，然后将其组合以形成酶组合物。所述酶组合物可为多组分和单组分蛋白制备物的组合。

用于本发明方法中的酶可为任何适用于本文中所述工艺的形式，如例如去除或不去除细胞的发酵液配制物，含或不含细胞碎片的细胞裂解液，半纯化或纯化的酶制备物，或宿主细胞，作为酶的来源。所述酶组合物可为干粉或颗粒，无粉尘的颗粒，液体，稳定化液体或稳定化受保护的酶。液体酶制备物可根据确立的工艺，例如通过添加稳定剂如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有机酸来稳定化。

酶和最适量取决于几个因素，其包括但不限于，组分酶的混合物、纤维素材料的浓度、纤维素材料的预处理、温度、时间、pH和包括发酵生物体(例如，同步糖化和发酵的酵母)。

在一个方面，在发酵过程中所述一种或多种(几种)纤维素酶的有效量是约0.5至约50mg，例如约0.5至约40mg，约0.5至约25mg，约0.75至约20mg，约0.75至约15mg，约0.5至约10mg，或约2.5至约10mg每g纤维素材料。在另一个方面，在糖化过程中所述一种或多种(几种)纤维素酶的总浓度为至少约0.005mg/mL，例如至少约0.01mg/mL，0.05mg/mL，0.075mg/mL，0.1mg/mL，0.2mg/mL，0.3mg/mL，0.4mg/mL，0.5mg/mL，0.6mg/mL，0.7mg/mL，0.8mg/mL，0.9mg/mL，1.0mg/mL，1.1mg/mL，1.2mg/mL，1.3mg/mL，1.4mg/mL，1.5mg/mL，1.6mg/mL，1.7mg/mL，1.8mg/mL，1.9mg/mL，2.0mg/mL，2.5mg/mL，3.0mg/mL，或5.0mg/mL。

在另一个方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的有效量是约0.005至约1.0g，例如约0.01至约1.0g，约0.15至约0.75g，约0.15至约0.5g，约0.1至约0.5g，约0.1至约0.25g，或约0.05至约0.2g每g纤维素分解酶。

具有纤维素分解酶活性或半纤维素分解酶活性的多肽，以及其它可用于纤维素材料的降解的蛋白/多肽，例如具有纤维素分解增强活性的GH61多肽(下文中称为具有酶活性的多肽)可源自或获得自任何合适的来源，包括细菌、真菌、酵母、植物或哺乳动物来源。术语“获得”在本文中意指所述酶已从将该酶作为天然酶天然产生的生物分离。术语“获得”在本文中还意指该酶可在宿主生物中使用本文中所述的方法重组产生，其中经重组产生的酶对于宿主生物是天然的或外源的，或具有修饰的氨基酸序列，例如，具有一个或多个(几个)缺失、***和/或取代的氨基酸，即重组产生的酶，其为天然氨基酸序列的片段和/或突变体或通过本领域已知的氨基酸改组方法产生的酶。天然酶的含义中涵盖的是天然变体，而外来酶的含义中涵盖的是重组(如通过定位诱变或重排)获得的变体。

具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽可为细菌多肽。例如，所述多肽可为具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的***多肽例如具有内切葡聚糖酶活性的芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)多肽；或具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、或脲原体属(Ureaplasma)多肽。

在一个方面，所述多肽是具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。

在另一个方面，所述多肽是具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、***链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)多肽。

在另一个方面，所述多肽是具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)多肽。

具有酶活性的多肽亦可为真菌多肽，且更优选为酵母多肽如具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽；或更优选地为丝状真菌多肽如具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽。

在一个方面，所述多肽是具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。

在另一个方面，所述多肽是具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporiumzonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusariumvenenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielaviaovispora)、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。

还可以使用具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽的经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。

所述酶组合物的一种或多种(几种)组分可以是重组组分，亦即，通过克隆编码所述单独组分的DNA序列并随后用该DNA序列转化细胞并在宿主中表达(参见，例如，WO91/17243和WO91/17244)产生。所述宿主优选是异源宿主(酶对宿主是外来的)，但该宿主在一定条件下也可以是同源宿主(酶对宿主是天然的)。单组分纤维素分解蛋白还可以通过从发酵液中提纯这样的蛋白质来制备。

在一个方面，所述一种或多种(几种)纤维素分解酶包含商业性纤维素分解酶制备物。适用于本发明的商业的纤维素分解酶制备物的实例包括，例如，CELLIC^TMCTec(Novozymes A/S)、CELLIC^TMCTec2(Novozymes A/S)CELLUCLAST^TM(Novozymes A/S)、NOVOZYM^TM188(Novozymes A/S)、CELLUZYME^TM(Novozymes A/S)、CEREFLO^TM(Novozymes A/S)和ULTRAFLO^TM(Novozymes A/S)，ACCELERASE^TM(Genencor Int.)、LAMINEX^TM(Genencor Int.)、SPEZYME^TMCP(Genencor Int.)，ROHAMENT^TM7069W( )，LDI(Dyadic International,Inc.)、LBR(Dyadic International,Inc.)或150L(Dyadic International,Inc.)。所述纤维素酶以约0.001至约5.0wt％的固体，更优选约0.025至约4.0wt％的固体，和最优选约0.005至约2.0wt％的固体的有效量添加。所述纤维素酶以约0.001至约5.0wt％的固体，更优选约0.025至约4.0wt％的固体，和最优选约0.005至约2.0wt％的固体的有效量添加。

可以用于本发明的方法的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO91/05039；WO93/15186；美国专利5,275,944；WO96/02551；美国专利5,536,655，WO00/70031，WO05/093050)；Thermobifida fusca内切葡聚糖酶III(WO05/093050)；和Thermobifida fusca内切葡聚糖酶V(WO05/093050)。

可以用于本发明的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，里氏木霉内切葡聚糖酶I(Penttila等,1986,Gene45:253-263，里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I(GENBANK^TM登录号M15665；SEQ ID NO:2)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(Saloheimo等,1988,Gene63:11-22)，里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II(GENBANK^TM登录号M19373；SEQ ID NO:4)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(Okada等,1988,Appl.Environ.Microbiol.64:555-563；GENBANK^TM登录号AB003694；SEQ ID NO:6)；里氏木霉内切葡聚糖酶V(Saloheimo等,1994,Molecular Microbiology13:219-228；GENBANK^TM登录号Z33381；SEQ ID NO:8)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(Ooi等,1990,Nucleic Acids Research18:5884)；川地曲霉(Aspergillus kawachii)内切葡聚糖酶(Sakamoto等,1995,Current Genetics27:435-439)；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(Saarilahti等,1990,Gene90:9-14)；尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号L29381)；灰腐质霉thermoidea变种内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号AB003107)；Melanocarpus albomyces内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号MAL515703)；粗糙脉孢菌内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号XM_324477)；特异腐质霉内切葡聚糖酶V(SEQ ID NO:10)；嗜热毁丝霉CBS117.65内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:14)；担子菌纲(basidiomycete)CBS495.95内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:16)；土生梭孢霉NRRL8126CEL6B内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:18)；土生梭孢霉NRRL8126CEL6C内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:20)；土生梭孢霉NRRL8126CEL7C内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:22)；土生梭孢霉NRRL8126CEL7E内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:24)；土生梭孢霉NRRL8126CEL7F内切葡聚糖酶(SEQ IDNO:26)；Cladorrhinum foecundissimum ATCC62373CEL7A内切葡聚糖酶(SEQID NO:28)；以及里氏木霉菌株No.VTT-D-80133内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:30；GENBANK^TM登录号M15665)。如上所述的内切葡聚糖酶SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，和SEQ ID NO:30分别由成熟多肽编码序列SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ IDNO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，和SEQ ID NO:29编码。

可用于本发明的纤维二糖水解酶的实例包括但不仅限于，里氏木霉纤维二糖水解酶I(SEQ ID NO:32)；里氏木霉纤维二糖水解酶II(SEQ ID NO:34)；特异腐质霉纤维二糖水解酶I(SEQ ID NO:36)；嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶II(SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:40)；土生梭孢霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)(SEQ ID NO:42)；嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)纤维二糖水解酶I(SEQ ID NO:44)；和嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II(SEQ ID NO:46)，烟曲霉纤维二糖水解酶I(SEQ ID NO:48)，和烟曲霉纤维二糖水解酶II(SEQ ID NO:50)。上述的纤维二糖水解酶SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:48，和SEQ ID NO:50分别由成熟多肽编码序列SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，和SEQ ID NO:49编码。

可用于本发明的β-葡糖苷酶的实例包括但不仅限于米曲霉β-葡糖苷酶(SEQID NO:52)；烟曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO:54)；巴西青霉IBT20888β-葡糖苷酶(SEQ ID NO:56)；黑曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO:58)；和棘孢曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO:60)。上述的β-葡糖苷酶SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:54，SEQ IDNO:56，SEQ ID NO:58，和SEQ ID NO:60分别由成熟多肽编码序列SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:57，和SEQ ID NO:59编码。

其它可用于本发明的β-葡糖苷酶的实例包括SEQ ID NO:62的米曲霉β-葡糖苷酶变体融合蛋白或SEQ ID NO:64的米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白。SEQ IDNO:62和SEQ ID NO:64的β-葡糖苷酶融合蛋白分别由SEQ ID NO:61和SEQID NO:63编码。

米曲霉β-葡糖苷酶可根据WO2002/095014获得。烟曲霉β-葡糖苷酶可根据WO2005/047499获得。巴西青霉β-葡糖苷酶可根据WO2007/019442获得。黑曲霉β-葡糖苷酶可根据Dan等,2000,J.Biol.Chem.275:4973-4980获得。棘孢曲霉β-葡糖苷酶可根据Kawaguchi等,1996,Gene173:287-288获得。

所述β-葡糖苷酶可以是融合蛋白。在一个方面，所述β-葡糖苷酶是根据WO2008/057637的米曲霉β-葡糖苷酶变体BG融合蛋白或米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白。

其它可用的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶公开于使用根据Henrissat,1991,A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities,Biochem.J.280:309-316和Henrissat和Bairoch,1996,Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases,Biochem.J.316:695-696的分类的许多糖基水解酶家族中。

其它可用于本发明的纤维素分解酶描述于EP495,257，EP531,315，EP531,372，WO89/09259，WO94/07998，WO95/24471，WO96/11262，WO96/29397，WO96/034108，WO97/14804，WO98/08940，WO98/012307，WO98/13465，WO98/015619，WO98/15633，WO98/28411，WO99/06574，WO99/10481，WO99/25846，WO99/25847，WO99/31255，WO00/09707，WO02/50245，WO2002/076792，WO2002/101078，WO2003/027306，WO2003/052054，WO2003/052055，WO2003/052056，WO2003/052057，WO2003/052118，WO2004/016760，WO2004/043980，WO2004/048592，WO2005/001065，WO2005/028636，WO2005/093050，WO2005/093073，WO2006/074005，WO2006/117432，WO2007/071818，WO2007/071820，WO2008/008070，WO2008/008793，U.S.Patent No.4,435,307，美国专利号5,457,046，美国专利号5,648,263，美国专利号5,686,593，美国专利号5,691,178，美国专利号5,763,254，和美国专利号5,776,757。

在本发明的方法中，可使用任何具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。

在第一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含下述基序：

[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和[FW]-[TF]-K-[AIV]，

其中X为任意氨基酸，X(4,5)为在4或5个连续位置上的任意氨基酸，而X(4)是在4个连续位置上的任意氨基酸。

包含上述所示的基序的多肽可进一步包含：

H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]，

[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，或

H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，

其中X为任意氨基酸，X(1,2)为在1个位置或2个连续位置上的任意氨基酸，X(3)为3个连续位置上的任意氨基酸，而X(2)为2个连续位置上的任意氨基酸。在上述基序中，采用公认的IUPAC单字母氨基酸缩写。

在一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽还包含H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]。在另一个方面，具有纤维素分解增强活性的分离的多肽还包含[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在另一个优选的方面，具有纤维素分解增强活性的多肽还包含H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。

在第二个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含下述基序：

[ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ]，

其中x为任意氨基酸，x(4,5)为在4或5个连续位置上的任意氨基酸，而x(3)为3个连续位置上的任意氨基酸。在上述基序中，采用公认的IUPAC单字母氨基酸缩写。

在第三个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:70，SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:78，SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:82，SEQ ID NO:84，SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:88，SEQ ID NO:90，SEQ IDNO:92，SEQ ID NO:94，SEQ ID NO:96，SEQ ID NO:98，SEQ ID NO:100，SEQ ID NO:102，SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:106，SEQ ID NO:108，SEQ IDNO:110，SEQ ID NO:112，SEQ ID NO:114，SEQ ID NO:116，SEQ ID NO:118，SEQ ID NO:120，SEQ ID NO:122，SEQ ID NO:124，SEQ ID NO:126，或SEQID NO:128的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％或至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％的同一性。

在第四个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少非常低严格条件下，例如至少低严格条件，至少中等严格条件，至少中等-高严格条件，至少高严格条件，或至少非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:65，SEQ ID NO:67，SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:79，SEQ ID NO:81，SEQ IDNO:83，SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:87，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:91，SEQID NO:93，SEQ ID NO:95，SEQ ID NO:97，SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:101，SEQ ID NO:103，SEQ ID NO:105，SEQ ID NO:107，SEQ ID NO:109，SEQ IDNO:111，SEQ ID NO:113，SEQ ID NO:115，SEQ ID NO:117，SEQ ID NO:119，SEQ ID NO:121，SEQ ID NO:123，SEQ ID NO:125，或SEQ ID NO:127的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:75，或SEQID NO:79的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或SEQ ID NO:65，SEQ ID NO:67，SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:81，SEQ ID NO:83，SEQ IDNO:85，SEQ ID NO:87，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:93，SEQID NO:95，SEQ ID NO:97，SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:101，SEQ ID NO:103，SEQ ID NO:105，SEQ ID NO:107，SEQ ID NO:109，SEQ ID NO:111，SEQ IDNO:113，SEQ ID NO:115，SEQ ID NO:117，SEQ ID NO:119，SEQ ID NO:121，SEQ ID NO:123，SEQ ID NO:125，或SEQ ID NO:127的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，(iii)(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)，(ii)或(iii)的全长互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，见上文)。SEQ ID NO:65，SEQID NO:67，SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:79，SEQ ID NO:81，SEQ ID NO:83，SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:87，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:93，SEQ IDNO:95，SEQ ID NO:97，SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:101，SEQ ID NO:103，SEQ ID NO:105，SEQ ID NO:107，SEQ ID NO:109，SEQ ID NO:111，SEQ IDNO:113，SEQ ID NO:115，SEQ ID NO:117，SEQ ID NO:119，SEQ ID NO:121，SEQ ID NO:123，SEQ ID NO:125，或SEQ ID NO:127的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少100个连续的核苷酸，或优选至少200个连续的核苷酸。而且，所述亚序列可编码具有纤维素分解增强活性的多肽片段。

在第五个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为(consisting of)核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:65，SEQ ID NO:67，SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:73，SEQ IDNO:75，SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:79，SEQ ID NO:81，SEQ ID NO:83，SEQID NO:85，SEQ ID NO:87，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:93，SEQ ID NO:95，SEQ ID NO:97，SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:101，SEQ ID NO:103，SEQ ID NO:105，SEQ ID NO:107，SEQ ID NO:109，SEQ ID NO:111，SEQ ID NO:113，SEQ ID NO:115，SEQ ID NO:117，SEQ ID NO:119，SEQ IDNO:121，SEQ ID NO:123，SEQ ID NO:125，或SEQ ID NO:127的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％的同一性程度。

在第六个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽是人工变体，其包含SEQID NO:66，SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:70，SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:78，SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:82，SEQ ID NO:84，SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:88，SEQ ID NO:90，SEQ ID NO:92，SEQ IDNO:94，SEQ ID NO:96，SEQ ID NO:98，SEQ ID NO:100，SEQ ID NO:102，SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:106，SEQ ID NO:108，SEQ ID NO:110，SEQ IDNO:112，SEQ ID NO:114，SEQ ID NO:116，SEQ ID NO:118，SEQ ID NO:120，SEQ ID NO:122，SEQ ID NO:124，SEQ ID NO:126，或SEQ ID NO:128的成熟多肽或其同源序列的一个或多个(或几个)氨基酸的取代、缺失和/或***。

优选地，氨基酸改变为性质上较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸取代或***，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；多至约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。

保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins,Academic Press,New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

或者，氨基酸改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改善多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。

能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸扫描诱变法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且就纤维素分解增强活性测试所得突变分子以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等,1992,Science255:306-312；Smith等,1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等,1992,FEBS Lett.309:59-64。必需氨基酸的身份也可从与相关于亲本多肽的多肽的同一性分析来推断。

可使用已知的诱变、重组和/或改组方法，然后进行相关的筛选过程，如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；WO95/17413；或者WO95/22625所公开的那些，进行一个或多个氨基酸取代、缺失和/或***并加以测试。其他可使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等,1991,Biochemistry30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO92/06204)和区域定向诱变(region-directedmutagenesis)(Derbyshire等,1986,Gene46:145；等,1988,DNA7:127)。

诱变/改组方法可与高通量、自动筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的经克隆、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology17:893-896)。编码活性多肽的经诱变的DNA分子可自宿主细胞回收并使用本领域标准方法迅速测序。这些方法允许快速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:70，SEQ ID NO:72，SEQ IDNO:74，SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:78，SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:82，SEQID NO:84，SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:88，SEQ ID NO:90，SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:94，SEQ ID NO:96，SEQ ID NO:98，SEQ ID NO:100，SEQ ID NO:102，SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:106，SEQ ID NO:108，SEQ ID NO:110，SEQID NO:112，SEQ ID NO:114，SEQ ID NO:116，SEQ ID NO:118，SEQ ID NO:120，SEQ ID NO:122，SEQ ID NO:124，SEQ ID NO:126，或SEQ ID NO:128的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或***的总数不超过4，例如1、2、3或4。

在一个方面，所述一种或多种(例如几种)半纤维素分解酶包含商业性半纤维素分解酶制备物。适用于本发明的商业性半纤维素分解酶制备物的实例包括，例如SHEARZYME^TM(Novozymes A/S)、CELLIC^TMHTec(Novozymes A/S)、CELLIC^TMHTec2(Novozymes A/S)、(Novozymes A/S)、(Novozymes A/S)、HC(Novozymes A/S)、Xylanase(Genencor)、TX-200A(AB Enzymes)、HSP6000Xylanase(DSM)、DEPOL^TM333P(Biocatalysts Limit,Wales,UK)、DEPOL^TM740L(Biocatalysts Limit,Wales,UK)和DEPOL^TM762P(BiocatalystsLimit,Wales,UK)。

可用于本发明方法的木聚糖酶的实例包括但不限于棘孢曲霉木聚糖酶(GeneSeqP:AAR63790；WO94/21785，xyl3SEQ ID NO:129[DNA序列]和SEQID NO:130[推导的氨基酸序列])，和土生梭孢霉NRRL8126(WO2009/079210)木聚糖酶。

可用于本发明方法的β-木糖苷酶的实例包括但不限于里氏木霉β-木糖苷酶(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458；SEQ ID NO:131[DNA序列]和SEQ ID NO:132[推导的氨基酸序列])，埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)(SwissProt登录号Q8X212)，粗糙脉孢霉(SwissProt登录号Q7SOW4)，和烟曲霉β-木糖苷酶(Uniprot登录号Q0H905；SEQ ID NO:133[DNA序列]和SEQ ID NO:134[推导的氨基酸序列])。

可用于本发明方法的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)乙酰木聚糖酯酶(WO2005/001036)，粗糙脉孢菌乙酰木聚糖酯酶(UniProt登录号q7s259)，土生梭孢霉NRRL8126乙酰木聚糖酯酶(WO2009/042846)，球毛壳菌(Chaetomium globosum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登录号Q2GWX4)，细丽毛壳菌(Chaetomium gracile)乙酰木聚糖酯酶(GeneSeqP登录号AAB82124)，颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登录号Q0UHJ1)，和特异腐质霉DSM1800乙酰木聚糖酯酶(WO2009/073709)。

可用于本发明方法的阿魏酸酯酶的实例包括但不限于特异腐质霉DSM1800阿魏酸酯酶(WO2009/076122)，粗糙脉孢菌阿魏酸酯酶(UniProt登录号Q9HGR3)，和费希新萨托菌(Neosartorya fischer)阿魏酸酯酶(UniProt登录号A1D9T4)。

可用于本发明方法的***呋喃糖苷酶的实例包括但不限于特异腐质霉DSM1800***呋喃糖苷酶(WO2009/073383)和黑曲霉***呋喃糖苷酶(GeneSeqP登录号AAR94170)。

可用于本发明方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的实例包括但不限于棒曲霉(Aspergillus clavatus)α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登录号alcc12)、里氏木霉α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q99024)、埃默森踝节菌α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登录号Q8X211)、黑曲霉α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q96WX9)、土曲霉(Aspergillus terreus)α-葡糖醛酸糖苷酶和烟曲霉α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登录号Q4WW45)。

用于本发明方法的酶和蛋白可通过在含有合适碳源和氮源和无机盐的营养培养基上，使用本领域已知方法(参见，例如Bennett,J.W.和LaSure,L.(编),MoreGene Manipulations in Fungi,Academic Press,CA,1991)发酵上述指出的微生物菌株来产生。合适的培养基可从供应商获得，或可根据已公开组合物制备(例如美国典型培养物保藏中心的目录)。适于生长和酶产生的温度范围和其他条件在本领域是已知的(参见，例如Bailey,J.E.和Ollis,D.F.,Biochemical EngineeringFundamentals,McGraw-Hill Book Company,NY,1986)。

所述发酵可以是任何其结果为酶表达或分离的培养细胞的方法。因此，发酵可以理解为包括在合适的培养基中并在允许所述酶得以表达或分离的条件下进行的摇瓶培养，或在实验室或工业发酵罐中的小-或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)。通过上述方法产生的所得的酶可从发酵培养基回收并通过常规方法纯化。

发酵。可通过一种或多种(几种)能将糖(例如木糖)直接或间接发酵成所需发酵产物(例如乙醇)的发酵微生物发酵自经水解的纤维素材料获得的可发酵糖。“发酵”或“发酵方法”指任何发酵方法或包含发酵步骤的任何方法。发酵方法还包括用于消费品醇工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品业(例如，发酵乳产品)、皮革业和烟草业的发酵方法。发酵条件依赖于期望的发酵产物和发酵生物体，并且能由本领域的技术人员容易地确定。

在发酵步骤中，作为预处理和/或酶水解步骤的结果从纤维素材料释放的糖，通过发酵生物体(如酵母)发酵成为产物，例如，乙醇。如本文中所述，水解(糖化)和发酵可以是单独或同时的。

在实施本发明的发酵步骤中可以使用任何合适的经水解的纤维素材料。通常根据所需发酵产品(即，要从发酵获得的物质)和使用的方法来选择所述材料，如本领域中所公知的。

术语“发酵培养基”在本文中可理解为指加入发酵微生物之前的培养基，如，由糖化过程产生的培养基，以及同步的糖化和发酵方法(SSF)中使用的培养基。

“发酵微生物”指适用于理想的发酵方法产生发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌生物体。发酵生物体可以是己糖和/或戊糖发酵生物体，或它们的组合。己糖和戊糖发酵生物体均在本领域公知。合适的发酵微生物能将糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、***糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖和/或寡糖)直接或间接地发酵(即，转化)成所需的发酵产品。

可产生乙醇的细菌和真菌发酵生物体的实例如Lin等,2006,Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642所述。

能发酵C₆糖的发酵微生物的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括酵母属种，优选酿酒酵母的菌株。

能发酵C₅糖的发酵生物体的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选的C₅糖发酵酵母包括假丝酵母属，优选毕赤酵母属的菌株，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS5773的菌株；假丝酵母属的菌株，优选博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、芸薹假丝酵母(Candida brassicae)、休哈塔假丝酵母(Candida sheatae)、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、假热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)或产朊假丝酵母(Candida utilis)的菌株。

其它发酵生物包括发酵单胞菌属(Zymomonas)，如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的菌株；汉逊酵母属，如异常汉逊酵母(Hansenula anomala)的菌株；克鲁维酵母属，如马克斯克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、K.thermotolerans和脆壁克鲁维酵母的菌株；裂殖酵母属，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)的菌株；大肠杆菌，特别是经遗传修饰以改善乙醇的产量的大肠杆菌的菌株；梭菌属，如丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)和Chlostridium phytofermentans的菌株；地芽孢杆菌属菌种的菌株；热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)，如解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter saccharolyticum)的菌株；和芽孢杆菌属，如凝结芽孢杆菌的菌株；假丝酵母属，如Candida sonorensis、C.methanosorbosa、迪丹斯假丝酵母、***滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、C.naedodendra、C.blankii、C.entomophilia、芸薹假丝酵母、假热带假丝酵母、博伊丁假丝酵母、产朊假丝酵母和休哈塔假丝酵母(C.scehatae)的菌株；和克雷伯氏菌属(Klebsiella)，如产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)的菌株。

在一个方面，所述酵母是酵母属菌种。在另一个方面，酵母是酿酒酵母。在另一个方面，所述酵母是糖化酵母(Saccharomyces distaticus)。在另一个方面，所述酵母是葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。在另一个方面，所述酵母是克鲁维酵母。在另一个方面，所述酵母是马克斯克鲁维酵母。在另一个方面，所述酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个方面，所述酵母是假丝酵母属。在另一个方面，所述酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个方面，所述酵母是芸薹假丝酵母。在另一个方面，所述酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个方面，所述酵母是假热带假丝酵母。在另一个更方面，酵母是产朊假丝酵母(Candida utilis)。在另一个方面，所述酵母是棒孢酵母属(Clavispora)。在另一个方面，所述酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)。在另一个方面，所述酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)。在另一个方面，所述酵母是管囊酵母属(Pachysolen)。在另一个方面，所述酵母是嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)。在另一个方面，所述酵母是毕赤酵母。在另一个方面，所述酵母是树干毕赤酵母。在另一个方面，所述酵母是酒香酵母属(Bretannomyces)。在另一个方面，所述酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)(Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversion technology,in Handbook on Bioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E.编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。

能有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌包括，例如，运动发酵单胞菌、丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌、Clostridium phytofermentans、地芽孢杆菌属菌种、解糖热厌氧杆菌和凝结芽孢杆菌(Philippidis,1996,见上文)。

在一个方面，所述细菌是发酵单胞菌。在一个方面，所述细菌是运动发酵单胞菌。在另一个方面，所述细菌是梭菌。在另一个方面，所述细菌是丙酮丁醇梭菌。在另一个方面，所述细菌是地芽孢杆菌属菌种。在另一个方面，所述细菌是解糖热厌氧杆菌。在另一个方面，所述细菌是凝结芽孢杆菌。

适于乙醇产生的商业上可获得的酵母包括，例如ETHANOL RED^TM酵母(可得自Fermentis/Lesaffre,USA)，FALI^TM(可得自Fleischmann’s Yeast,USA)，SUPERSTART^TM和THERMOSACC^TM鲜酵母(可得自Ethanol Technology,WI,USA)，BIOFERM^TMAFT和XR(可得自NABC-North American BioproductsCorporation,GA,USA)，GERT STRAND^TM(可得自Gert Strand AB,Sweden)，和FERMIOL^TM(可得自DSM Specialties).

在一个方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，提供发酵戊糖的能力，如利用木糖、利用***糖和共同利用木糖和***糖的微生物。

通过将异源基因克隆入多种发酵微生物已经构建了能将己糖和戊糖转化成乙醇(共发酵)的生物体(Chen和Ho,1993,Cloning and improving the expression ofPichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae,Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147；Ho等,1998,Genetically engineered Saccharomycesyeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose,Appl.Environ.Microbiol.64:1852-1859；Kotter和Ciriacy,1993,Xylose fermentation bySaccharomyces cerevisiae,Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776-783；Walfridsson等,1995,Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing theTKL1and TAL1genes encoding the pentose phosphate pathway enzymestransketolase and transaldolase,Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190；Kuyper等,2004,Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficientanaerobic xylose fermentation:a proof of principle,FEMS Yeast Research4:655-664；Beall等,1991,Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugarsby recombinant Escherichia coli,Biotech.Bioeng.38:296-303；Ingram等,1998,Metabolic engineering of bacteria for ethanol production,Biotechnol.Bioeng.58:204-214；Zhang等,1995,Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway inethanologenic Zymomonas mobilis,Science267:240-243；Deanda等,1996,Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolicpathway engineering,Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470；WO2003/062430,xylose isomerase)。

在一个方面，所述经遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个方面，经过遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。在另一个方面，经过遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个方面，经过遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌。在另一个方面，所述经遗传修饰的发酵微生物是克鲁维酵母属菌种。

本领域中公知的是，上述生物体还能用于产生其它物质，如本文所述。

通常向降解的木素纤维素材料或水解物加入发酵微生物，并进行约8至约96小时，如约24至约60小时发酵。温度通常为约26℃至约60℃，特别是约32℃或50℃，和在约pH3至约pH8，如约pH4-5、6或7。

在一个方面，对降解的纤维素材料施用酵母和/或另一种微生物，并进行约12至约96小时，如通常为24-60小时发酵。在一个方面，温度为约20℃至约60℃，例如约25℃至约50℃，约32℃至约50℃，并且pH通常为约pH3至约pH7，例如约pH4至7，如约pH5。然而，一些发酵生物体例如细菌，具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物优选以约10⁵-10¹²，例如约10⁷-10¹⁰，特别是约2x10⁸活细胞计数每ml发酵液的量施用。关于使用酵母进行发酵的进一步指导可见于例如“The Alcohol Textbook”(K.Jacques,T.P.Lyons和D.R.Kelsall编,Nottingham University Press,United Kingdom1999)，其通过提述并入本文。

对于乙醇产生，在发酵之后，将发酵浆料蒸馏以提取乙醇。根据本发明的方法获得的乙醇可用作，例如燃料乙醇，饮用乙醇，即可饮用的中性含酒精的饮料，或工业乙醇。

发酵刺激剂可以与本文所述的任何方法组合使用，以进一步改进发酵工艺，而且特定地，改进发酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率。“发酵刺激剂”指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺激剂。优选的用于生长的发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸(盐)、烟酸、内消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D和E。参见，例如，Alfenore等,Improving ethanolproduction and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategyduring fed-batch process,Springer-Verlag(2002)，其通过提述并入本文。矿物质的实例包括能够提供营养物的矿物质和矿物质盐，所述营养物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。

发酵产物：发酵产物可以是源自发酵的任何物质。发酵产物可以是，不限于，醇(例如，***糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1,3-丙二醇、山梨醇和木糖醇)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；烷烃(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)；环烷烃(例如环戊烷、环己烷、环庚烷、和环辛烷)；烯烃(例如戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；和气体(例如，甲烷、氢气(H₂)、二氧化碳(CO₂)和一氧化碳(CO))。发酵产物还可以是作为高价值产品的蛋白质。

在一个方面，发酵产物是醇。可理解的是，术语“醇”包括包含一个或多个羟基基团的物质。在一个方面，所述醇是***糖醇。在另一个方面，所述醇是丁醇。在另一个方面，所述醇是乙醇。在一个方面，所述醇是甘油。在另一个方面，所述醇是甲醇。在另一个方面，所述醇是1,3-丙三醇。在另一个方面，所述醇是山梨醇。在另一个方面，所述醇是木糖醇。参见，例如，Gong等,1999,Ethanol production from renewable resources,于Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.编,Springer-Verlag Berlin Heidelberg,Germany,65:207-241；Silveira和Jonas,2002,The biotechnological production ofsorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408；Nigam和Singh,1995,Processesfor fermentative production of xylitol–a sugar substitute,Process Biochemistry30(2):117-124；Ezeji等,H.P.,2003,Production of acetone,butanol and ethanol byClostridium beijerinckii BA101and in situ recovery by gas stripping,World Journalof Microbiology and Biotechnology19(6):595-603。

在另一个方面，所述发酵产物是有机酸。在一个方面，所述有机酸是乙酸。在另一个方面，所述有机酸是醋酮酸。在另一个方面，所述有机酸是己二酸。在另一个方面，所述有机酸是抗坏血酸。在另一个方面，所述有机酸是柠檬酸。在另一个方面，所述有机酸是2,5-二酮-D-葡糖酸。在另一个方面，所述有机酸是甲酸。在另一个方面，所述有机酸是反丁烯二酸。在另一个方面，所述有机酸是葡糖二酸。在另一个方面，所述有机酸是葡糖酸。在另一个方面，所述有机酸是葡糖醛酸。在另一个方面，所述有机酸是戊二酸。在另一个优选的方面，所述有机酸是3-羟基丙酸。在另一个方面，所述有机酸是衣康酸。在另一个方面，所述有机酸是乳酸。在另一个方面，所述有机酸是苹果酸。在另一个方面，所述有机酸是丙二酸。在另一个方面，所述有机酸是草酸。在另一个方面，所述有机酸是丙酸。在另一个方面，所述有机酸是琥珀酸。在另一个方面，所述有机酸是木糖酸。参见，例如，Chen和Lee,1997,Membrane-mediated extractivefermentation for lactic acid production from cellulosic biomass,Appl.Biochem.Biotechnol.63-65:435-448。

在另一个方面，所述发酵产物是酮。应理解的是，术语“酮”涵盖了含有一个或多个酮模块的酮。在另一个更优选的方面，所述酮是丙酮。参见，例如Qureshi和Blaschek,2003,见上文。

在另一个方面，所述发酵产物是氨基酸。在一个方面，所述有机酸是天冬氨酸。在另一个方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一个方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一个方面，所述氨基酸是赖氨酸。在另一个方面，所述氨基酸是丝氨酸。在另一个方面，所述氨基酸是苏氨酸。参见，例如，Richard和Margaritis,2004,Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid)production and other microbial biopolymers,Biotechnology and Bioengineering87(4):501-515。

在另一个方面，所述发酵产物是烷烃。所述烷烃可为未支化或支化的烷烃。在一个方面，所述烷烃是戊烷。在另一个方面，所述烷烃是己烷。在另一个方面，所述烷烃是庚烷。在另一个方面，所述烷烃是辛烷。在另一个方面，所述烷烃是壬烷。在另一个方面，所述烷烃是癸烷。在另一个方面，所述烷烃是十一烷。在另一个方面，所述烷烃是十二烷。

在另一个方面，所述发酵产物是环烷烃。在一个方面，所述环烷烃是环戊烷。在另一个方面，所述环烷烃是环己烷。在另一个方面，所述环烷烃是环庚烷。在另一个方面，所述环烷烃是环辛烷。

在另一个方面，所述发酵产物是烯烃。所述烯烃可为未支化或支化的烯烃。在一个方面，所述烯烃是戊烯。在另一个方面，所述烯烃是己烯。在另一个方面，所述烯烃是庚烯。在另一个方面，所述烯烃是辛烯。

在一个方面，所述发酵产物是异戊二烯。在另一个方面，所述发酵产物是聚酮化合物。

在另一个方面，所述物质是气体。在一个方面，所述气体是甲烷。在另一个方面，所述气体是H₂。在另一个方面，所述气体是CO₂。在另一个方面，所述气体是CO。参见，例如，Kataoka等,1997,Studies on hydrogen production bycontinuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria,Water Scienceand Technology36(6-7):41-47；和Gunaseelan,1997,Anaerobic digestion of biomassfor methane production:A review，Biomass and Bioenergy,Vol.13(1-2)，83-114。

回收可以使用本领域已知的任何方法，任选地从发酵培养基回收发酵产物，所述方法包括，但不限于，层析、电泳方法、差示溶解度、蒸馏或提取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的甘蔗渣分离并纯化醇。可以获得纯度高达约96vol.％的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、饮用乙醇(即，可饮用的中性含酒精饮料)，或工业乙醇。

水解(糖化)和发酵，分别或同时，包括但不限于，分离的水解和发酵(SHF)、同步糖化和发酵(SSF)、同步糖化和共发酵(SSCF)、混合的水解和发酵(HHF)、分离的水解和共发酵(SHCF)、混合的水解和共发酵(HHCF)，和直接微生物转化(DMC)。SHF使用分离的处理步骤以首先将纤维素材料酶水解为可发酵糖，例如，葡萄糖，纤维二糖，纤维三糖，和戊糖，然后将可发酵糖发酵成为乙醇。在SSF中，纤维素材料的酶水解和糖变为乙醇的发酵在一个步骤中组合(Philippidis,G.P.,1996,Cellulose bioconversion technology,于Handbook onBioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。SSCF包括多种糖的共发酵(Sheehan和Himmel,1999,Enzymes,energy and the environment:A strategic perspective on the U.S.Department of Energy’s research and development activities for bioethanol,Biotechnol.Prog.15:817-827)。HHF在同步糖化和水解步骤之外，还涉及单独的水解步骤，所述步骤可以在同一个反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度，即，高温酶法糖化，然后在发酵菌株能够耐受的较低温度进行SSF。DMC在一个或多个(几个)步骤中组合了所有三个过程(酶产生、水解和发酵)，其中使用相同的生物体产生用于将纤维素材料转化成可发酵糖并将可发酵糖转化成终产物的酶(Lynd等,2002,Microbial cellulose utilization:Fundamentals andbiotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews66:506-577)。在本文可以理解的是，任何本领域中已知的方法，包括预处理、酶水解(糖化)、发酵，或它们的组合，可用于实施本发明的方法。

常规设备包括补料批式搅拌反应器、批式搅拌反应器、具有超滤的连续流搅拌反应器和/或连续活塞流柱式反应器(Fernanda de Castilhos Corazza等,2003,Optimal control in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis,Acta Scientiarum.Technology25:33-38；Gusakov和Sinitsyn,1985,Kinetics of the enzymatichydrolysis of cellulose:1.A mathematical model for a batch reactor process,Enz.Microb.Technol.7:346-352)、研磨反应器(Ryu,S.K.和Lee,J.M.,1983,Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor,Biotechnol.Bioeng.25:53-65)，或者具有由电磁场引起的强烈搅拌的反应器(Gusakov等,1996,Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor withintensive stirring induced by electromagnetic field,Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。其它反应器类型包括：流化床、升流层(upflow blanket)、固定化和用于水解和/或发酵的挤出机型的反应器。

核酸构建体

编码多肽，如编码具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，纤维素分解酶，半纤维素分解酶等的分离的多核苷酸，可以以多种方式操作以提供所述多肽的表达，即构建核酸构建体，其包含编码所述多肽的分离的多核苷酸，所述多核苷酸与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸***载体之前对其序列进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。

调控序列可为启动子序列，其由用于表达编码多肽的多核苷酸的宿主细胞所识别的多核苷酸。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、大肠杆菌lac操纵子、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25)。另外的启动子在"Useful proteins from recombinantbacteria"于Gilbert等,1980,Scientific American,242:74-94中；和在Sambrook等,1989,见上文中描述。

用于指导本发明中的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自在曲霉属中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由在曲霉属中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自在黑曲霉中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由在构巢曲霉或米曲霉中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从如下的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等,1992,Yeast8:423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其由宿主细胞识别以终止转录。所述终止子序列与编码所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地连接。在本发明中，可使用在所选的宿主细胞中有功能的任何终止子。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等,1992,见上文描述。

调控序列还可以是合适的前导序列，其当转录时，为对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的多核苷酸的5’-末端。可使用在所选的宿主细胞中有功能的任何前导序列。

对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与多核苷酸的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可使用在所选的宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。

对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、和黑曲霉α-葡糖苷酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.15:5983-5990描述。

调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的N端相连的信号肽，并指导所述多肽进入细胞分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码所述多肽的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，可使用指导表达的多肽进入所选的宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT,nprS,nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews57:109-137描述。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等,1992,见上文描述。

调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽N端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α因子的基因获得前肽编码序列。

当信号肽和前肽序列二者均存在于多肽N端时，将前肽序列置于紧接着(next to)多肽的N端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的N端。

同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节***的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些***。原核***中的调节***包括lac、tac和trp操纵基因***。在酵母中，可使用ADH2***或GAL1***。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核***中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。

表达载体

上述的多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点***或取代编码多肽的多核苷酸，例如编码具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，纤维素分解酶，半纤维素分解酶等的多核苷酸。或者，可以通过在适当的用于表达的载体中***包含所述序列的核酸构建体或多核苷酸来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的调控序列可操作地连接以供表达。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。

所述载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。

细菌选择性标记的实例是来自地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记为ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

所述载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。

为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，400至10,000碱基对，和800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可为任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可为非编码或编码的多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1,ARS4,ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene98:61-67；Cullen等,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO00/24883中的方法完成。

可以将多于一个拷贝的多核苷酸***宿主细胞以增加多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。

用于连接上述元件以构建重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。

宿主细胞

包含编码多肽，例如编码具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，纤维素分解酶，半纤维素分解酶等的多核苷酸的重组宿主细胞可有利地用于所述多肽的重组产生。将包含此种多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞，使所述载体如前所述作为染色体整合体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是在多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。***包括但不限于，芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、地芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属和脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、***链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。

可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如，原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)，通过使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221)，通过电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)或通过接合(参见，例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如，原生质体转化(参见，例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等,1988,Nucleic Acids Res.16:6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：例如，原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等,2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399-405)，通过接合(参见，例如，Mazodier等,1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)，或通过转导(参见，例如，Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：例如，电穿孔(参见，例如，Choi等,2006,J.Microbiol.Methods64:391-397)或通过接合(参见，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如，天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297)，通过原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207)，通过电穿孔(参见，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或通过接合(参见，例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。

宿主细胞还可为真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

宿主细胞可为真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of TheFungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如引用于Hawksworth等,1995,见上文，171页)和所有有丝***孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等,1995,见上文)。

真菌宿主细胞可为酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner F.A.,Passmore S.M.,和Davenport R.R.,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。

酵母宿主细胞可为假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖构成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可为枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可为泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470-1474以及Christensen等,1988,Bio/Technology6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.编,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods inEnzymology,Volume194,pp182-187,Academic Press,Inc.,New York；Ito等,1983,J.Bacteriol.153:163；和Hinnen等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1920。

产生方法

用于产生多肽，例如具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，纤维素分解酶，半纤维素分解酶等的方法，包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式能够产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一个方面，所述细胞是曲霉属的细胞。在另一个方面，所述细胞是烟曲霉。

或者，用于产生多肽，例如具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，纤维素分解酶，半纤维素分解酶等的方法，包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

在产生方法中，将所述细胞使用本领域公知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。

可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶测定法(enzyme assay)可用于确定多肽的活性。具有纤维素分解增强活性的多肽使用本文中所述的方法检测。

所得的培养液可照原样使用，或多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden编,VCH Publishers,New York,1989)。

在另一个方面，不回收多肽，而是使用表达多肽的宿主细胞作为所述多肽的来源。

本发明进一步通过下述实施例描述，其不应视作对本发明范围的限制。

实施例

实施例1：玉米秸秆的预处理

将玉米秸秆在U.S.Department of Energy National Renewable EnergyLaboratory(美国能源部国家可再生能源实验室)(NREL)使用1.4％(w/v)硫酸在165℃和107psi预处理8分钟。预处理的玉米秸秆中的不溶于水的固体含有57.5％纤维素，4.6％半纤维素和28.4％木质素。通过两阶段硫酸水解，接着通过使用NREL Standard Analytical Procedure#002的高效液相色谱分析糖来确定纤维素和半纤维素。木质素在用硫酸水解纤维素和半纤维素级分之后使用NRELStandard Analytical Procedure#003以重量分析法确定。

将经预处理的玉米秸秆(PCS)(干重量32.35％)在Cosmos ICMG40湿式多用途研磨机(EssEmm Corporation，Tamil Nadu，India)中磨制，然后通过以数毫升的等分试样反复添加10N NaOH来调整至pH5.0，接着在室温充分混合和温育大约1小时。在4℃过夜温育之后确认pH，并将经pH调整的玉米秸秆在大约120℃蒸汽灭菌20分钟，然后在4℃储藏以使得微生物污染风险最小化。经预处理的玉米秸秆的干重量是33％TS(总固形物)，这在每次使用之前确认。

实施例2：具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的制备

桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽根据WO2005/074656在米曲霉JaL250中重组产生。将重组产生的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽首先通过使用10kDa膜的超滤来浓缩，缓冲液交换至20mM Tris-HCl pH8.0，然后使用20mL MONO 柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)以20mM Tris-HCl pH8.0中的500ml0-600mM NaCl线性梯度来纯化。基于SDS-PAGE收集和汇集级分。将汇集的级分通过使用10kDa膜的超滤浓缩，并使用320mL 75SEC柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)以大约1.3升的150mM NaCl-20mMTris-HCl pH8.0的等度洗脱来层析。基于SDS-PAGE收集和汇集级分。将汇集的级分使用2010kDa MWCO离心浓缩滤器(GE Healthcare UKlimited,Little Chalfont,Buckinghamshire,UK)浓缩并脱盐入20mM Tris-HCl pH8.5。蛋白浓度使用Microplate BCA^TMProtein Assay Kit(Thermo Fisher ScientificInc.,Rockford,IL,USA)确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。

实施例3：连二亚硫酸盐对里氏木霉纤维素酶组合物水解PCS的作用

连二亚硫酸钠对经预处理的纤维素制备物的纤维素分解活性根据下文所述步骤进行评价。

可得自Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark的含有米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO2008/057637)和桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(WO2005/074656)的里氏木霉纤维素酶制备物在本文中在实施例中命名为“里氏木霉纤维素酶组合物”。

PCS的分批水解使用50mL Nalgene聚碳酸酯离心管(Thermo Scientific,Pittsburgh,PA)以20g的总样品重量来进行。每次水解用15％总固体加载的PCS在50mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)中进行，所述缓冲液含有4mg蛋白质每克纤维素的里氏木霉纤维素酶组合物，指定剂量的连二亚硫酸钠(0～10％，基于PCS重量)，和用以阻止微生物生长的青霉素(2.5g/L)。将连二亚硫酸钠用PCS浆料在60℃预温育12小时，然后进行酶水解，接着添加里氏木霉纤维素酶组合物，并在定规摇床温育箱(Combi-D24hybridization incubator,,Yang-Chung,Seoul,Korea)中在50℃在搅拌下进行192小时。为了监测水解的进展，在底物温育72、120和192小时之后对水解物进行了三次取样。

将每个500μL的水解物样品转移至Costar Spin-X离心过滤管(Cole-Parmer,Vernon Hills,IL)，并通过离心(14,000rpm,5min)经由0.2μm尼龙滤器过滤。将所得的上清用5μL40％硫酸酸化以将剩余的酶活性灭活，并通过HPLC分析。

HPLC***(1200Series LC System,Agilent Technologies Inc.,Palo Alto,CA)配置有Rezex ROA-Organic acid H⁺(8％)(7.8×300mm)(Phenomenex Inc.,Torrance,CA)，0.2μm在线(in line)滤器，自动取样器，梯度泵，和折射率检测器(RID)。使用的流动相是5mM硫酸，其流速为0.9mL/分钟。使用浓度为0，0.3，0.75，3.75，7.5，和15g/L的单糖作为标样。葡聚糖/木聚糖转化基于酶水解上清中的糖和原料中的生物质组成使用Zhu等,2010,Bioresource Technology102(3):2897-2930发表的方法进行计算。

连二亚硫酸钠的存在显著地增强了里氏木霉纤维素酶组合物对PCS的水解(见图1)。在这些条件下，水解的最大增强显示于2％连二亚硫酸盐存在下大约192小时的温育之后。

实施例4：不同GH61A浓度对连二亚硫酸盐存在下里氏木霉纤维素酶组合物水解PCS的作用

根据上文实施例3中所述的步骤评价了不同水平的桔橙嗜热子囊菌GH61A与连二亚硫酸钠对里氏木霉纤维素酶组合物的纤维素分解活性的作用。

如实施例3中所见，里氏木霉纤维素酶组合物对PCS水解的增强随着水解时间的增加而增加(见图2)。在这些条件下，水解的最大增强显示于5％GH61A存在下大约192小时的温育之后。

实施例5：连二亚硫酸盐对发酵的作用

连二亚硫酸钠对改善经水解、预处理的纤维素的木素纤维素发酵的作用可根据如下所述的步骤来评价。

将经预处理的玉米秸秆(见上文)在不存在连二亚硫酸盐下使用里氏木霉纤维素酶组合物在类似于上文中所述的步骤中水解，或者，在不存在连二亚硫酸盐下使用棘孢曲霉GH10木聚糖酶(WO94/021785)和可得自Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark的包含烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499)和桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(WO2005/074656)的里氏木霉纤维素酶制备物的共混物，例如在20％TS加载量在pH5.0水解5日。

在水解之后，将所得的水解物混合物通过添加NaOH进行pH调整(例如至pH5.5)，稀释至15％TS，并以50mL工作体积加载于125ml Erlenmeyer瓶。在发酵过程中添加连二亚硫酸钠(例如0-3％(w/w))和氮源(例如，1g/L的尿素)。然后将瓶用合适的经繁殖的酵母培养物(例如1g/L)接种过夜，并在气动振打器(air shaker)中以150rpm在32℃维持3日。

将以不同量的连二亚硫酸盐进行的发酵所得的乙醇效价与缺乏连二亚硫酸盐的对照进行比较以说明增加的乙醇产量/产率。亦监测了发酵过程中连二亚硫酸盐对木糖消耗的作用。所有的测试一式两次进行。

实施例6

调查了连二亚硫酸钠(Na₂S₂O₄)对改善木素纤维素发酵的作用。用于本研究的底物是NREL稀释的酸预处理的玉米秸秆(PCS)水解物。将该PCS以20％TS加载量用可得自Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark的里氏木霉纤维素酶制备物在pH5.0水解5日，所述制备物含有烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499)和桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(WO2005/074656)和棘孢曲霉木聚糖酶(WO94/21785中公开的Xyl II)。在水解之后，将pH以添加NaOH增加至5.5，并添加1g/L尿素作为氮源以供发酵。将水解物稀释至15％TS并以50ml工作体积加载入125ml Erlenmeyer瓶。将不同剂量的Na₂S₂O₄，0-3％Na₂S₂O₄/TS(w/w)添加至每个瓶。然后将瓶用2g/L的经繁殖的酿酒酵母C5酵母培养物接种过夜。发酵在32℃气动振打器以150rpm进行3日。所有测试进行一式两次。在添加1％Na₂S₂O₄下，乙醇效价在50小时发酵之后增加4.34g/L(图3)。木糖消耗率通过添加Na₂S₂O₄急剧增加(图4)。

总体而言，总乙醇产量/产率在50小时发酵之后增加10.7％(图5)。亦发现对于增强作用存在Na₂S₂O₄的最适剂量。在此情况下，1％剂量性能最佳。

本发明在下述段落中描述：

.一种降解经预处理的纤维素材料的方法，其包括：

(a)用连二亚硫酸盐温育经预处理的纤维素材料；和

(b)用包含一种或多种纤维素酶的酶组合物糖化经预处理的纤维素材料。

.段[1]的方法，其中所述经预处理的纤维素材料是经预处理的玉米秸秆(PCS)。

.段[1]或[2]的方法，其中用连二亚硫酸盐温育经预处理的纤维素材料在糖化经预处理的纤维素材料之前开始。

.段[3]的方法，其中在糖化经预处理的纤维素材料之前，用连二亚硫酸盐温育经预处理的纤维素材料进行至少30分钟，例如至少1小时，2小时，4小时，8小时，12小时，或24小时。

.段[1]-[4]任一项的方法，其中当糖化经预处理的纤维素材料时存在连二亚硫酸盐。

.段[1]-[4]任一项的方法，其中在糖化经预处理的纤维素材料之前，从经预处理的纤维素材料去除大部分连二亚硫酸盐。

.段[1]-[6]任一项的方法，其中用连二亚硫酸盐温育经预处理的纤维素材料在约25℃至约85℃，例如35℃至80℃，45℃至75℃，50℃至70℃，55℃至65℃，或约60℃的温度进行。

.段[1]-[7]任一项的方法，其中在温育步骤中，连二亚硫酸盐的浓度为约0.1％至约5％，例如0.5％至4％，1％至3％，或约2％(w/w)，基于经预处理的纤维素材料的干重量。

.段[1]-[8]任一项的方法，其中所述一种或多种纤维素酶是真核纤维素酶。

.段[1]-[9]任一项的方法，其中所述一种或多种纤维素酶包括一种或多种来自木霉属(例如里氏木霉)的纤维素酶。

.段[1]-[10]任一项的方法，其中所述一种或多种纤维素酶选自内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，和β-葡糖苷酶(例如烟曲霉或米曲霉β-葡糖苷酶)。

.段[1]-[11]任一项的方法，其中所述酶组合物进一步包含具有纤维素分解增强活性的多肽(例如桔橙嗜热子囊菌纤维素分解增强多肽)。

.段[1]-[12]任一项的方法，其中所述酶组合物包含的具有纤维素分解增强活性的多肽是GH61多肽，如来源于嗜热子囊菌属，如桔橙嗜热子囊菌的菌株的多肽，如作为SEQ ID NO:2描述于WO2005/074656的多肽；或如来源于梭孢壳属，如土生梭孢霉的菌株的多肽，如作为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8描述于WO2005/074647的多肽；或如来源于曲霉属，如烟曲霉的菌株的多肽，如作为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2描述于WO2010/138754的多肽；或如来源于青霉属，如埃默森青霉(Penicillium emersonii)的菌株的多肽，如公开于WO2011/041397的多肽。

.段[1]-[13]任一项的方法，其中所述酶组合物包含β-葡糖苷酶，如来源于曲霉属，如米曲霉的菌株的β-葡糖苷酶，如公开于WO2002/095014的β-葡糖苷酶或公开于WO2008/057637的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或烟曲霉，如公开于WO2005/047499的β-葡糖苷酶或公开于WO2012/044915的烟曲霉β-葡糖苷酶变体；或青霉属的菌株的β-葡糖苷酶，如公开于WO2007/019442的巴西青霉的菌株的β-葡糖苷酶，或木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株的β-葡糖苷酶。

.段[1]-[14]任一项的方法，其中所述酶组合物包含木聚糖酶，优选GH10木聚糖酶，如来源于曲霉属的菌株的，如来源于烟曲霉的菌株的木聚糖酶，如作为Xyl III公开在WO2006/078256中的木聚糖酶，或棘孢曲霉木聚糖酶，如作为SEQ ID NO:5公开于WO94/21785的木聚糖酶(Xyl II)。

.段[1]-[14]任一项的方法，其中所述酶组合物包含β-木糖苷酶，如来源于曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的β-木糖苷酶，如公开于共同未决的美国临时申请号61/526833中的β-木糖苷酶，或来源于木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株的β-木糖苷酶，如WO2011/057140中的SEQ ID NO:58的成熟多肽。

.段[1]-[16]任一项的方法，其中所述酶组合物包含纤维二糖水解酶I(CBH I)，如来源于曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的纤维二糖水解酶I，如公开于WO2011/057140中的SEQ ID NO:2的Cel7a CBHI，或木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株的纤维二糖水解酶I。

.段[1]-[17]任一项的方法，其中所述酶组合物包含纤维二糖水解酶II(CBH II)，如来源于曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的纤维二糖水解酶II；或木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株的纤维二糖水解酶II，或梭孢壳属的菌株，如土生梭孢霉的菌株的纤维二糖水解酶II，如来自土生梭孢霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。

.段[1]-[18]任一项的方法，其中所述酶组合物是里氏木霉纤维素酶组合物，而所述具有纤维素分解增强活性的多肽是桔橙嗜热子囊菌GH61A(WO2005/074656中的SEQ ID NO:2)。

.段[19]的方法，进一步其中存在或添加β-葡糖苷酶，如米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO2008/057637)。

.段[1]-[20]任一项的方法，其中所述酶组合物是里氏木霉纤维素酶组合物，且所述具有纤维素分解增强活性的多肽是WO2011/041397中公开的埃默森青霉GH61A多肽。

.段[21]的方法，进一步其中存在或添加β-葡糖苷酶，如烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499的SEQ ID NO:2)或其具有下述取代的变体：F100D，S283G，N456E，F512Y(WO2012/044915)。

.段[1]-[22]任一项的方法，其中所述酶组合物是里氏木霉纤维素酶组合物，且其中存在或添加一种或多种下述组分：

(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；

(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；

(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其具有一种或多种下述取代的变体：F100D，S283G，N456E，F512Y(WO2012/044915)；和

(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61多肽，或其同源物。

.段[1]-[23]任一项的方法，其中所述酶组合物是里氏木霉纤维素酶组合物，且其中存在或添加一种或多种下述组分：

(i)烟曲霉β-葡糖苷酶；和

(ii)具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61多肽；或其同源物。

.段[1]-[24]任一项的方法，其中所述酶组合物是里氏木霉纤维素酶组合物，进一步包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61多肽(WO2005/074656中的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)，米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO2008/057637)，和棘孢曲霉木聚糖酶(WO94/21785中的Xyl II)。

.段[1]-[25]任一项的方法，其中所述酶组合物是里氏木霉纤维素酶组合物，进一步包含GH61具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌多肽(WO2005/074656中的SEQ ID NO:2)，烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499的SEQID NO:2)和棘孢曲霉木聚糖酶(WO94/21785中公开的Xyl II)。

.段[1]-[26]任一项的方法，其中所述酶组合物是里氏木霉纤维素酶组合物，进一步包含具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉GH61多肽(WO2011/04139中的SEQ ID NO:2)，烟曲霉β-葡糖苷酶变体(在美国临时申请号61/388,997中公开)和烟曲霉木聚糖酶(在WO2006/078256中公开的Xyl III)和来源于烟曲霉菌株的β-木糖苷酶。

.段[1]-[27]任一项的方法，其中所述酶组合物以约0.01至约50.0mg，例如约1至约25mg，如约2-10mg，如约4至约8mg蛋白质每g/DS纤维素材料的量添加。

.段[1]-[28]任一项的方法，其中所述酶组合物进一步包含一种或多种选自下组的酶：半纤维素酶，棒曲霉素，酯酶，漆酶，木质素分解酶，果胶酶，过氧化物酶，蛋白酶，和膨胀素。

.段[29]的方法，其中所述半纤维素酶选自木聚糖酶(例如棘孢曲霉木聚糖酶)，乙酰木聚糖酯酶，阿魏酸酯酶，***呋喃糖苷酶，木糖苷酶，和葡糖醛酸糖苷酶。

.段[1]-[30]任一项的方法，进一步包括回收经降解的纤维素材料。

.段[31]的方法，其中所述经降解的纤维素材料是糖。

.段[32]的方法，其中所述糖选自葡萄糖，木糖，甘露糖，半乳糖，和***糖。

.段[1]-[33]任一项的方法，其中所述连二亚硫酸盐是连二亚硫酸钠。

.段[12]-[34]任一项的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽，如GH61多肽，构成酶组合物的0.1-15％，优选0.5-10％，更优选0.5-7％。

.一种产生发酵产物的方法，其包括：

(a)用包含一种或多种纤维素酶的酶组合物糖化纤维素材料；

(b)在连二亚硫酸盐存在下用一种或多种发酵微生物发酵糖化的纤维素材料；和

(c)从(b)回收所述发酵产物。

.段[36]的方法，其中所述纤维素材料是经预处理的纤维素材料。

.段[37]的方法，其中所述经预处理的纤维素材料是经预处理的玉米秸秆(PCS)。

.段[36]-[38]任一项的方法，其中在发酵过程中，连二亚硫酸盐的浓度为约0.1％至约3％，例如0.5％至2％，0.75％至1.5％，或约1％(w/w)，基于经预处理的纤维素材料的干重量。

.段[36]-[39]任一项的方法，其中在糖化纤维素材料之前，将连二亚硫酸盐与纤维素材料进一步温育。

.段[36]-[40]任一项的方法，其中所述一种或多种纤维素酶是真核纤维素酶。

.段[36]-[41]任一项的方法，其中所述一种或多种纤维素酶包含一种或多种来自木霉属(例如里氏木霉)的纤维素酶。

.段[36]-[42]任一项的方法，其中所述一种或多种纤维素酶选自内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，和β-葡糖苷酶(例如烟曲霉或米曲霉β-葡糖苷酶)。

.段[36]-[43]任一项的方法，其中所述酶组合物进一步包含具有纤维素分解增强活性的多肽(例如桔橙嗜热子囊菌纤维素分解增强多肽)。

.段[36]-[44]任一项的方法，其中所述酶组合物包含的具有纤维素分解增强活性的多肽是GH61多肽，如来源于嗜热子囊菌属，如桔橙嗜热子囊菌的菌株的多肽，如作为SEQ ID NO:2描述于WO2005/074656的多肽；或如来源于梭孢壳属，如土生梭孢霉的菌株的多肽，如作为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8描述于WO2005/074647的多肽；或如来源于曲霉属，如烟曲霉的菌株的多肽，如作为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2描述于WO2010/138754的多肽；或如来源于青霉属，如埃默森青霉的菌株的多肽，如WO2011/041397中公开的多肽。

.段[36]-[45]任一项的方法，其中所述酶组合物包含β-葡糖苷酶，优选来源于曲霉属，如米曲霉的菌株的β-葡糖苷酶，如公开于WO2002/095014的β-葡糖苷酶或公开于WO2008/057637的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或烟曲霉的β-葡糖苷酶，如公开于WO2005/047499的β-葡糖苷酶或公开于WO2012/044915的烟曲霉β-葡糖苷酶变体；或青霉属的菌株的β-葡糖苷酶，如公开于WO2007/019442的巴西青霉的菌株的β-葡糖苷酶，或木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株的β-葡糖苷酶。

.段[36]-[46]任一项的方法，其中所述酶组合物包含木聚糖酶，优选GH10木聚糖酶，如来源于曲霉属的菌株，如来源于烟曲霉的菌株的木聚糖酶，如作为Xyl III公开在WO2006/078256中的木聚糖酶，或棘孢曲霉的木聚糖酶，如作为SEQ ID NO:5公开于WO94/21785的木聚糖酶(Xyl II)。

.段[36]-[47]任一项的方法，其中所述酶组合物包含β-木糖苷酶，如来源于曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的β-木糖苷酶，如在共同未决的美国临时申请号61/526833中公开的β-木糖苷酶，或来源于木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株的β-木糖苷酶，如WO2011/057140中的SEQ ID NO:58的成熟多肽。

.段[36]-[48]任一项的方法，其中所述酶组合物包含纤维二糖水解酶I(CBH I)，如来源于曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的纤维二糖水解酶I，如公开于WO2011/057140中的SEQ ID NO:2的Cel7a CBHI，或木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株纤维二糖水解酶I。

.段[36]-[49]任一项的方法，其中所述酶组合物包含纤维二糖水解酶II(CBH II)，如来源于曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的纤维二糖水解酶II；或木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株的纤维二糖水解酶II，或梭孢壳属的菌株，如土生梭孢霉的菌株的纤维二糖水解酶II，如来自土生梭孢霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。

.段[36]-[50]任一项的方法，其中所述酶组合物是里氏木霉纤维素酶组合物，而所述具有纤维素分解增强活性的多肽是桔橙嗜热子囊菌GH61A(WO2005/074656中的SEQ ID NO:2)。

.段[51]的方法，进一步其中存在或添加β-葡糖苷酶，如米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO2008/057637)。

.段[36]-[52]任一项的方法，其中所述酶组合物是里氏木霉纤维素酶组合物，且所述具有纤维素分解增强活性的多肽是WO2011/041397中公开的埃默森青霉GH61A多肽。

.段[53]的方法，进一步其中存在或添加β-葡糖苷酶，如烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499的SEQ ID NO:2)或其具有下述取代的变体：F100D，S283G，N456E，F512Y(WO2012/044915)。

.段[44]-[54]的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽，如GH61多肽，构成酶组合物的0.1-15％，优选0.5-10％，更优选0.5-7％。

.段[36]-[55]任一项的方法，其中所述酶组合物是里氏木霉纤维素酶组合物，且其中存在或添加一种或多种下述组分：

(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；

(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；

(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其具有一种或多种下述取代的变体：F100D，S283G，N456E，F512Y(WO2012/044915)；和

(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种GH61多肽；或其同源物。

.段[36]-[56]任一项的方法，其中所述酶组合物是里氏木霉纤维素酶组合物，且其中存在或添加一种或多种下述组分：

(i)烟曲霉β-葡糖苷酶；和

(ii)具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61多肽；或其同源物。

.段[36]-[57]任一项的方法，其中所述酶组合物是里氏木霉纤维素酶组合物，进一步包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61多肽(WO2005/074656中的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)，米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO2008/057637)，和棘孢曲霉木聚糖酶(WO94/21785中的Xyl II)。

.段[36]-[58]任一项的方法，其中所述酶组合物是里氏木霉纤维素酶组合物，进一步包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61多肽(WO2005/074656中的SEQ ID NO:2)，烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499的SEQID NO:2)和棘孢曲霉木聚糖酶(WO94/21785中公开的Xyl II)。

.段[36]-[59]任一项的方法，其中所述酶组合物是里氏木霉纤维素酶组合物，进一步包含具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉GH61多肽(WO2011/04139中的SEQ ID NO:2)，烟曲霉β-葡糖苷酶变体(在美国临时申请号61/388,997中公开)和烟曲霉木聚糖酶(在WO2006/078256中公开的Xyl III)和来源于烟曲霉菌株的β-木糖苷酶。

.段[36]-[60]任一项的方法，其中所述酶组合物以约0.01至约50.0mg，例如约1至约25mg，如约2-10mg，如约4至约8mg蛋白质每g/DS纤维素材料的量添加。

.段[36]-[61]任一项的方法，其中所述酶组合物进一步包含一种或多种选自下组的酶：半纤维素酶，棒曲霉素，酯酶，漆酶，木质素分解酶，果胶酶，过氧化物酶，蛋白酶，和膨胀素。

.段[62]的方法，其中所述半纤维素酶选自木聚糖酶(例如棘孢曲霉木聚糖酶)，乙酰木聚糖酯酶，阿魏酸酯酶，***呋喃糖苷酶，木糖苷酶，和葡糖醛酸糖苷酶。

.段[36]-[63]任一项的方法，其中纤维素材料的糖化与糖化的材料的发酵同时进行。

.段[36]-[64]任一项的方法，其中所述发酵产物是醇，有机酸，酮，氨基酸，或气体。

.段[36]-[65]任一项的方法，其中所述连二亚硫酸盐是连二亚硫酸钠。

.段[36]-[66]任一项的方法，其中所述发酵微生物是细菌或真菌生物体。

.段[36]-[67]任一项的方法，其中所述发酵生物可为己糖和/或戊糖发酵生物体，或其组合。

.段[36]-[68]任一项的方法，其中所述发酵生物是酵母属菌种，优选酿酒酵母的菌株。

.段[36]-[69]任一项的方法，其中所述发酵生物是毕赤酵母属(Pichia)的菌株，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS5773的菌株；假丝酵母属(Candida)的菌株，优选博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、芸薹假丝酵母(C.brassicae)、休哈塔假丝酵母(C.scehatae)、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、假热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)或产朊假丝酵母(Candida utilis)的菌株。

.段[36]-[70]任一项的方法，其中所述发酵生物是发酵单胞菌属(Zymomonas)，如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的菌株；汉逊酵母属(Hansenula)，如异常汉逊酵母(Hansenula anomala)的菌株；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，如马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、K.thermotolerans和脆壁克鲁维酵母的菌株(K.fragilis)；裂殖酵母属，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)的菌株；大肠杆菌(E.coli)，梭菌属(Clostridium)，如丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、热纤维梭菌(Chlostridium thermocellum)和Clostridium phytofermentans的菌株；地芽孢杆菌属菌种(Geobacillus sp.)的菌株；热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)，如解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobactersaccharolyticum)的菌株；和芽孢杆菌属(Bacillus)，如凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)的菌株。

.段[36]-[71]任一项的方法，其中所述发酵微生物经遗传修饰提供发酵戊糖的能力，如木糖利用微生物，***糖利用微生物，和木糖和***糖共利用微生物。

.段[36]-[72]任一项的方法，其中所述发酵微生物是酵母属菌种，如酿酒酵母的菌株，其能够有效地共发酵葡萄糖和木糖。

.段[36]-[73]任一项的方法，其中所述发酵微生物表达木糖异构酶。

本文描述和要求保护的本发明并不局限于本文公开的具体方面的范围内，因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。旨在将任何等同的方面包含于本发明的范围内。实际上，从前面的说明中，除本文所显示和描述的之外，本发明的多种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修改也旨在落入所附的权利要求的范围内。在冲突的情况下，将以包括定义部分的本公开为准。

Claims (20)

1.一种降解经预处理的纤维素材料的方法，其包括：

(a)用连二亚硫酸盐温育经预处理的纤维素材料；和

(b)用包含一种或多种纤维素酶的酶组合物糖化经预处理的纤维素材料。

2.权利要求1的方法，其中用连二亚硫酸盐温育经预处理的纤维素材料在糖化经预处理的纤维素材料之前开始。

3.权利要求2的方法，其中在糖化经预处理的纤维素材料之前，用连二亚硫酸盐温育经预处理的纤维素材料进行至少30分钟，例如至少1小时，2消失，4小时，8小时，12小时，或24小时。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中当糖化经预处理的纤维素材料时存在连二亚硫酸盐。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中在糖化经预处理的纤维素材料之前，从经预处理的纤维素材料去除大部分连二亚硫酸盐。

6.权利要求1-5任一项的方法，其中用连二亚硫酸盐温育经预处理的纤维素材料在约25℃至约85℃，例如35℃至80℃，45℃至75℃，50℃至70℃，55℃至65℃，或约60℃的温度进行。

7.权利要求1-6任一项的方法，其中在温育步骤过程中，连二亚硫酸盐的浓度为约0.1％至约5％，例如0.5％至4％，1％至3％，或约2％(w/w)，基于经预处理的纤维素材料的干重量。

8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述一种或多种纤维素酶包含一种或多种来自木霉属(例如里氏木霉)的纤维素酶。

9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述酶组合物进一步包含具有纤维素分解增强活性的多肽(例如桔橙嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)纤维素分解增强多肽)。

10.权利要求1-9任一项的方法，其中所述酶组合物进一步包含一种或多种选自如下的酶：半纤维素酶，棒曲霉素，酯酶，漆酶，木质素分解酶，果胶酶，过氧化物酶，蛋白酶，和膨胀素。

11.一种产生发酵产物的方法，其包括：

(a)用包含一种或多种纤维素酶的酶组合物糖化纤维素材料；

(b)在连二亚硫酸盐存在下用一种或多种发酵微生物发酵所述糖化的纤维素材料；和

(c)从(b)回收所述发酵产物。

12.权利要求11的方法，其中所述纤维素材料是经预处理的纤维素材料。

13.权利要求11或12的方法，其中在发酵过程中，连二亚硫酸盐的浓度为约0.1％至约3％，例如0.5％至2％，0.75％至1.5％，或约1％(w/w)，基于经预处理的纤维素材料的干重量。

14.权利要求11-13任一项的方法，其中在糖化纤维素材料之前，将连二亚硫酸盐与纤维素材料进一步温育。

15.权利要求11-14任一项的方法，其中所述一种或多种纤维素酶包含一种或多种来自木霉属(例如里氏木霉)的纤维素酶。

16.权利要求11-15任一项的方法，其中所述酶组合物进一步包含具有纤维素分解增强活性的多肽(例如桔橙嗜热子囊菌纤维素分解增强多肽)。

17.权利要求11-16任一项的方法，其中所述酶组合物进一步包含一种或多种选自如下的酶：半纤维素酶，棒曲霉素，酯酶，漆酶，木质素分解酶，果胶酶，过氧化物酶，蛋白酶，和膨胀素。

18.权利要求11-17任一项的方法，其中纤维素材料的糖化与糖化的材料的发酵同时进行。

19.权利要求11-18任一项的方法，其中所述发酵产物是醇，有机酸，酮，氨基酸，或气体。

20.权利要求11-19任一项的方法，其中所述发酵生物体是己糖和/或戊糖发酵生物体，或其组合。