CN102782126A - 得自涅斯捷连科氏菌(Nesterenkonia)的淀粉酶及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了涉及得自涅斯捷连科氏菌(Nesterenkonia)和相关属菌种的α-淀粉酶的组合物和方法。

Description

得自涅斯捷连科氏菌(Nesterenkonia)的淀粉酶及其使用方法

优先权

本专利申请要求2010年2月18日提交的美国临时申请No.61/305,674的优先权，该申请据此全文以引用方式并入本文中。

技术领域

本发明所公开的是涉及得自涅斯捷连科氏菌属(Nesterenkonia spp.)的淀粉酶的组合物和方法。

背景技术

淀粉由直链淀粉(15-30%w/w)和支链淀粉(70-85%w/w)的混合物组成。直链淀粉由α-1,4-连接的葡萄糖单元的直链组成，分子量(MW)为约60,000至约800,000。支链淀粉是每24-30个葡萄糖单元含有α-1,6分支点的支链聚合物；其MW可高达一亿。

浓缩右旋糖浆形式的得自淀粉的糖目前通过酶催化法制备，该方法涉及：(1)用α-淀粉酶将固体淀粉液化（或降低粘度）成平均聚合度为约7-10的糊精，以及(2)用淀粉葡萄糖苷酶（也称为葡萄糖淀粉酶或GA）将所得的液化淀粉（即淀粉水解物）糖化。所得的糖浆具有高葡萄糖含量。大部分商业生产的葡萄糖浆随后通过酶法异构化为称为异糖浆(isosyrup)的右旋糖/果糖混合物。

α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)通过随机裂解内部α-1,4-糖苷键而水解淀粉、糖原和相关的多糖。多年以来，α-淀粉酶已用于多种不同的目的，包括淀粉液化、纺织脱浆、造纸和纸浆行业的淀粉改性以及用于酿造。这些酶也可用于在盘碟洗涤和衣物洗涤中除去淀粉污渍。衣物和盘碟污垢在组成上有很大差异，并因此在被有效和高效除去的能力方面大不相同。

涅斯捷连科氏菌属是归类为放线菌纲放线菌目微球菌亚目微球菌科的革兰氏阳性菌。在2004年首次描述的新疆涅斯捷连科氏菌(Nesterenkoniaxinjianensis)从中国新疆省高盐土壤样品中分离得到(Wen-Jun Li et al.(2004)Int.J.Syst.Evol.Microbiol.54:837-41)（李文军等人，2004年，《国际***与进化微生物学杂志》，第54卷第837-841页）。新疆涅斯捷连科氏菌不被认为是产淀粉酶杆菌。事实上，模式菌株的菌种描述指示该生物体的淀粉水解反应呈阴性，从而表明未产生或未分泌淀粉酶。

发明内容

本发明的组合物和方法涉及得自涅斯捷连科氏菌的阿尔法(α)-淀粉酶和相关的α-淀粉酶，它们在本文中统称为AmyNEST。

在一个方面，提供了分离的AmyNEST多肽。在一些实施例中，AmyNEST多肽在异源生物体中表达。在特定的实施例中，AmyNEST多肽作为分泌的多肽在异源生物体中表达。在一些实施方案中，AmyNEST多肽与序列标识号11具有至少57%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的氨基酸序列同一性。

在一些实施例中，AmyNEST多肽与序列标识号11具有至少57%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的总体氨基酸序列同一性，同时包含碳水化合物结合模块(CBM)25(1)和/或CBM 25(2)的氨基酸序列。在一些实施例中，AmyNEST多肽与序列标识号11具有至少57%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的总体氨基酸序列同一性，同时包含与CBM 25(1)和/或CBM 25(2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%序列同一性的氨基酸序列。在特定的实施例中，AmyNEST多肽包含与CBM 25(1)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%序列同一性的氨基酸序列以及与CBM 25(2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，在AmyNEST多肽中与CBM 25(1)和CBM 25(2)相关的氨基酸序列通过连接基分隔开。

在一些实施例中，提供了包含与序列标识号11的氨基酸序列具有至少60%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的AmyNEST多肽。在特定的实施例中，该多肽与序列标识号11的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性。在特定的实施例中，该多肽与序列标识号11的氨基酸序列具有至少80%的氨基酸序列同一性。在特定的实施例中，该多肽与序列标识号11的氨基酸序列具有至少90%的氨基酸序列同一性。在特定的实施例中，该多肽与序列标识号11的氨基酸序列具有至少95%的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，该多肽包含碳水化合物结合模块(CBM)25(1)的氨基酸序列（序列标识号12）和/或CBM 25(2)的氨基酸序列（序列标识号13）。在特定的实施例中，该多肽包含CBM 25(1)的氨基酸序列和CBM 25(2)的氨基酸序列，这两者通过具有序列标识号19的氨基酸序列的连接基分隔开。在一些实施例中，该多肽具有α-淀粉酶活性，其可例如通过本文所述的检测分析法测定。

在另一方面，提供了包含AmyNEST多肽的组合物。在一些实施例中，该组合物为清洁组合物。在一些实施例中，该组合物有效除去衣物、盘碟或织物的淀粉污渍。

在另一方面，提供了一种用于从表面除去淀粉污渍的方法，所述方法包括：

在存在包含有效量的AmyNEST多肽的水性组合物的情况下温育该表面，

让多肽水解存在于淀粉污渍中的淀粉组分，以形成溶于水性组合物的较小的淀粉源分子，

从而从该表面上除去淀粉污渍。

在一些实施例中，该表面为纺织物表面。在一些实施例中，该表面在盘碟上。在一些实施例中，该表面为弄脏的硬质表面。

在另一方面，提供了具有淀粉酶活性的多肽的表达方法，包括：

构建表达载体，该表达载体包含多核苷酸，该多核苷酸编码连接到编码AmyNEST多肽的多核苷酸的信号序列；

将该表达载体引入宿主细胞，

表达该多肽；

回收表达的多肽。

在一些实施例中，将AmyNEST多肽引入异源宿主细胞。在一些实施例中，将AmyNEST多肽作为分泌多肽而表达。

在另一方面，提供了包含编码AmyNEST多肽的多核苷酸序列的载体。编码AmyNEST多肽的序列可以可操作地连接到启动子或连接到其他控制元件。在另一方面，提供了包含编码AmyNEST多肽的多核苷酸的宿主细胞或包含这种多核苷酸的载体。分离的宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。分离的宿主细胞可以为杆菌（如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽胞杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)（之前称为Bacillusstearothermophilus）、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、B.lautus、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、S.murinus或大肠埃希氏菌(Escherichia coli)）。

另一方面构思了包含AmyNEST多肽的洗涤添加剂，其中该洗涤添加剂的形式任选地为不起尘颗粒、微粒、稳定化液体、凝胶或受保护的酶。洗涤添加剂中的多肽可为上述截短的多肽。该洗涤添加剂可含有每克洗涤添加剂约0.02mg至约200mg的多肽。该洗涤添加剂还可包含选自蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、氧化酶、淀粉分解酶、纤维素酶、聚酯酶以及任何它们的组合的酶。

另一方面构思了包含任何所述洗涤添加剂的洗涤剂组合物。洗涤剂组合物可任选地包含如下的一种或多种物质：表面活性剂、漂白体系或漂白剂、洗涤剂助洗剂、聚合物、稳定剂、织物调理剂、泡沫促进剂、抑泡剂、防腐剂、染料、香料、污垢悬浮剂、晦暗抑制剂、荧光增白剂或杀菌剂。洗涤剂组合物可包含或进一步包含另外的酶，其中该酶为蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、氧化酶、淀粉分解酶、纤维素酶、聚酯酶或任何它们的组合。在其他实施例中，该组合物为洗涤添加剂。

另一方面构思了包含AmyNEST多肽的手动或自动盘碟洗涤剂组合物。

还有一方面构思了洗涤盘碟的方法，包括将本文所述的手动或自动盘碟洗涤剂施用到有需要的盘碟（一个或多个）上。洗涤盘碟的方法构思了添加盘碟洗涤剂的量使得洗涤液体包含本文所述多肽的量为约0.01ppm至约4ppm。

另一方面构思了包含本文所述的洗涤添加剂的衣物洗涤剂组合物。还有一方面构思了清洁纺织物的方法，包括在具有本文所述的洗涤剂组合物的溶液中洗涤弄脏的纺织物。该方法还构思了在溶液中含有本文所述的多肽，其在溶液中的量为约0.01至约2ppm。

通过本发明的描述和附图，所述组合物和方法的这些方面和其他方面以及实施例将显而易见。

附图说明

图1为载体pRANGER-BTB3-Cat的质粒图谱。

图2为示出AmyNEST蛋白质组织的示意图，其示出了催化结构域和两个碳水化合物结合模块(CBM)。

图3为考马斯亮蓝染色SDS-PAGE凝胶的图象，其示出60、50和27kDa处的三条主带。

图4为pHPLT的质粒图谱。

图5为pHPLT-AmyNEST的质粒图谱。

图6示出CS-28米淀粉微样本(microswatches)上的AmyNEST在pH 8（HEPES缓冲液）下的清洁性能。

图7示出CS-28米淀粉微样本上的AmyNEST在pH 10（CAPS缓冲液）下的清洁性能。

图8列出文中提到的序列。

序列的简要说明

序列标识号1为新疆涅斯捷连科氏菌B4.2S6 16S rRNA基因的部分核苷酸序列。

序列标识号2为引物pRANGER-FW的核苷酸序列。

序列标识号3为引物pRANGER-RV的核苷酸序列。

序列标识号4为引物Nest-Insert3-RV的核苷酸序列。

序列标识号5为引物Nest-Insert3-FW的核苷酸序列。

序列标识号6为引物Nest-add-Fw的核苷酸序列。

序列标识号7为新疆涅斯捷连科氏菌B4.2S6α-淀粉酶基因的核苷酸序列。

序列标识号8为编码新疆涅斯捷连科氏菌B4.2S6α-淀粉酶成熟蛋白的核苷酸序列。

序列标识号9为新疆涅斯捷连科氏菌B4.2S6α-淀粉酶前体蛋白的氨基酸序列，包括24-氨基酸信号序列。

序列标识号10为新疆涅斯捷连科氏菌B4.2S6α-淀粉酶信号肽的氨基酸序列：

序列标识号11为新疆涅斯捷连科氏菌B4.2S6α-淀粉酶成熟蛋白的氨基酸序列。

序列标识号12为碳水化合物结合模块CBM 25(1)的氨基酸序列。

序列标识号13为碳水化合物结合模块CBM 25(2)的氨基酸序列。

序列标识号14为引物pHPLT-AmyNest-Fw的核苷酸序列。

序列标识号15为引物pHPLT-AmyNest-Rv的核苷酸序列。

序列标识号16为引物pHPLT-F1的核苷酸序列。

序列标识号17为引物pHPLT-R1的核苷酸序列。

序列标识号18为芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)195α-淀粉酶未成熟形式的氨基酸序列。

序列标识号19为将CBM 25(1)与CBM 25(2)分隔开的连接基的氨基酸序列。

具体实施方式

描述了涉及从涅斯捷连科氏菌分离出来的α-淀粉酶及其变体和同源物的组合物和方法。这些多肽统称为AmyNEST多肽。

将描述涉及AmyNEST多肽或编码这些多肽的多核苷酸的各种组合物和方法。

1.定义和首字母缩略词

根据此详细描述，应用下面的缩写和定义。注意，除非上下文另有明确指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指代物。因此，例如，提及“一种酶”包括多个此种酶，而提及“该剂型”，包括提及一个或多个剂型以及本领域技术人员已知的其等同物，等等。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。为了清楚起见，定义以下缩写和/或术语：

1.1缩写/首字母缩略词

除非另外指明，否则以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：

AE        醇乙氧基化物

AEO       醇乙氧基化物

AEOS      醇乙氧基硫酸盐

AES       醇乙氧基硫酸盐

AOS       α-烯烃磺酸盐

AS        烷基硫酸盐

CBD 25    碳水化合物结合结构域蛋白质家族25

cDNA      互补DNA

CMC       羧甲基纤维素

DNA       脱氧核糖核酸

DTMPA     二亚乙基三胺五乙酸

EC        酶学委员会

EDTA      乙二胺四乙酸

EMPA

Materialprüfungs-und Forschungs Anstalt（瑞士联邦材料检测与研究实验室）

EO        环氧乙烷（聚合物片段）

F&HC      织物及家居护理

GA        葡萄糖淀粉酶

IPTG      异丙基-β-D-硫代半乳糖苷

kDa       千道尔顿

LAS       直链烷基苯磺酸盐

LAT       属于地衣芽孢杆菌淀粉酶

MW        分子量

MWU       改良的伍格母单位；1.6×10^-5mg/MWU=活性单位

NOBS      壬酰基氧基苯磺酸盐

NTA       次氨基乙酸

OxAm      Purastar HPAM 5000L（杰能科国际有限公司(GenencorInternational,Inc.)）

PEG       聚乙二醇

pI        等电点

PVA       聚(乙烯醇)

PVP       聚(乙烯吡咯烷酮)

RNA       核糖核酸

SAS       烷基磺酸盐

SDS-PAGE  十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳

sp.       物种

TAED      四乙酰基乙二胺

w/v       重量/体积

w/w       重量/重量

v/v       体积/体积

wt%       重量%

℃        摄氏度

H₂O       水

dH₂O或DI  去离子水

dIH₂O     Milli-Q过滤的去离子水

g或gm     克

μg       微克

mg        毫克

kg        千克

μL和μl  微升

mL和ml    毫升

mm        毫米

μm       微米

M         摩尔

mM        毫摩尔

μM       微摩尔

U         单位

sec和″   秒

min和′   分钟

h         小时

DO        溶解氧

Genencor  位于加利福尼亚州帕罗奥图市的美国丹尼斯克有限公司杰能科子公司(Danisco US Inc,Genencor Division,Palo Alto,CA)

Ncm       牛顿厘米

ETOH      乙醇

eq.        当量

N          当量浓度

ds或DS     干固体含量

1.2定义

术语“淀粉酶”或“淀粉分解酶”是指除别的方面以外能够催化淀粉降解的酶。淀粉酶为裂解淀粉中α-D-(1→4)O-糖苷键的水解酶。一般来讲，α-淀粉酶（EC 3.2.1.1；α-D-(1→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶）被定义为以随机方式在淀粉分子内裂解α-D-(1→4)O-糖苷键的内切酶。相反地，外切淀粉分解酶如β-淀粉酶（EC 3.2.1.2；α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶）和一些产物特异性淀粉酶如生麦芽糖α-淀粉酶(EC 3.2.1.133)从底物的非还原端裂解淀粉分子。β-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.20；α-D-葡糖苷葡萄糖水解酶）、葡萄糖淀粉酶（EC 3.2.1.3；α-D-(1→4)-葡聚糖葡萄糖水解酶）和产物特异性淀粉酶可由淀粉生成特定长度的麦芽低聚糖。

如本文所用，术语“淀粉”指由植物的复杂多糖碳水化合物构成的任何材料，由具有式(C₆H₁₀O₅)_x（其中X可以是任何数字）的直链淀粉和支链淀粉构成。该术语包括植物基材料，如谷物、草、块茎和根，并且更具体地讲是从小麦、大麦、玉米、裸麦、大米、高梁、糠、木薯、小米、马铃薯、甘薯和木薯获得的材料。

关于多肽的术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不在一个或多个氨基酸位置处包括人为制造的置换、***或缺失的天然存在的多肽。类似地，关于多核苷酸的术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不包括人为制造的核苷改变的天然存在的多核苷酸。然而，应注意，编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的多核苷酸不局限于天然存在的多核苷酸，而涵盖编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的任何多核苷酸。

关于多肽的术语“变体”是指不同于特定野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的多肽，因为它在一个或多个氨基酸位置处包括人为制造的置换、***或缺失。类似地，关于多核苷酸的术语“变体”是指核苷酸序列不同于特定野生型多核苷酸、亲本多核苷酸或参考多核苷酸的多核苷酸。野生型、亲本或参考多肽或多核苷酸的同一性从上下文来看将是显而易见的。

当结合对象细胞、核酸、蛋白质或载体使用时，术语“重组”表明对象已通过引入异源核酸或蛋白质、或者变更天然的核酸或蛋白质而得到改性，或者细胞衍生自己经过此类改性的细胞。因此，例如，重组细胞表达未在天然（非重组）形式的细胞中发现的基因，或者以不同的水平或在不同于自然界中存在的条件下表达天然基因。

术语“回收的”、“分离的”和“分开的”是指从如在自然界中发现的那样与其天然相关的至少一种其他物质或组分中移除的化合物、蛋白质（多肽）、细胞、核酸、氨基酸或其他指定的物质或组分。

如本文所用，术语“纯化的”是指处于相对纯的状态的物质（如，分离的多肽或多核苷酸），所述相对纯的状态如至少约90%纯、至少约95%纯、至少约98%纯或甚至至少约99%纯。

结合酶的术语“热稳定的”和“热稳定性”是指酶在暴露于高温后保持活性的能力。酶（例如淀粉酶）的热稳定性是由其半衰期(t_1/2)衡量的，所述半衰期以分钟、小时或天为单位给出，在此期间酶活性在限定的条件下损失一半。半衰期可通过测量暴露于（即经受）高温后残余的α-淀粉酶活性来计算。

结合酶的“pH范围”是指酶显示出催化活性的pH值范围。

如本文所用，结合酶的术语“pH稳定的”和“pH稳定性”涉及在预定的时间段（如，15分钟、30分钟、1小时）内、酶在宽泛的pH值范围内保持活性的能力。

如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”是同义词，并且可互换使用。在此类氨基酸序列表现出活性的情况下，它们可被称为“酶”。使用常规的氨基酸残基的单字母或三字母代码，其中氨基酸序列以标准的氨基端至羧基端取向（即，N→C）提供。

术语“核酸”涵盖DNA、RNA、异源双链体和能够编码多肽的合成分子。核酸可为单链或双链的，而且可为化学修饰物。术语“核酸”与“多核苷酸”可互换使用。由于遗传密码具有简并性，故可以使用不止一个密码子来编码特定氨基酸，并且本发明组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另作说明，否则核酸序列是以5'至3'取向提供。

所谓“同源物”，应当指与对象氨基酸序列和对象核苷酸序列具有某种程度的同一性的实体。同源序列被认为包括与对象序列至少57%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%相同的氨基酸序列，序列对比使用常规的序列对比工具（如，Clustal、BLAST等）进行。通常，除非另外指明，否则同源物将包括与对象氨基酸序列相同的活性位点残基。

如本文所用，“杂交”是指核酸碱基对的一条链与互补链在印迹杂交技术和PCR技术期间所发生的过程。严格的杂交条件如下所示：50℃和0.2X SSC（1X SSC=0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠，pH 7.0）。高度严格的条件如下所示：65℃和0.1X SSC（1X SSC=0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠，pH 7.0）。

如本文所用，“合成”分子通过体外化学合成或酶促合成而生成、而非由生物体生成。

如本文所用，结合细胞使用的术语“转化”、“稳定转化”和“转基因”意指包含整合到其基因组中或作为经多代保留下来的附加体而携带的非天然（如，异源）核酸序列的细胞。

在将核酸序列***细胞的情况下，术语“引入”意指本领域已知的“转染”、“转化”或“转导”。

“宿主菌株”或“宿主细胞”为在其中表达所引入的载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体，包括编码所关注的多肽（如，AmyNEST多肽）的多核苷酸的生物体。示例性的宿主菌株为细菌细胞。术语“宿主细胞”包括由细胞形成的原生质体，例如芽孢杆菌属物种的原生质体。

结合多核苷酸或蛋白质的术语“异源”是指并非天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。

结合多核苷酸或蛋白质的术语“内源”是指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。

如本文所用，术语“表达”是指基于核酸序列生成多肽的过程。该过程包括转录和翻译。

“选择性标记”或“可选标记”是指这样的基因，其能够在宿主中表达以有利于选择携带该基因的宿主细胞。可选标记的实例包括（但不限于）抗微生物剂（如潮霉素、博来霉素或氯霉素）和/或赋予宿主细胞代谢益处（如营养益处）的基因。

“载体”是指旨在将核酸引入一个或多个细胞类型中的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、表达盒等等。

“表达载体”是指包含编码所关注多肽的DNA序列的DNA构建体，所述编码序列可操作地连接到能够实现DNA在合适宿主中表达的合适控制序列。这种控制序列可包括实现转录的启动子、控制转录的任选的操纵子序列、编码合适的mRNA上核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的增强子和序列。

术语“可操作地连接”意指特定组分处于一种允许它们以预期的方式起作用的关系（包括但不限于并置）。例如，调控序列可操作地连接到编码序列，使得编码序列的表达受调控序列的控制。

“信号序列”是连接到蛋白质的N-端部分的氨基酸的序列，其促进蛋白质细胞外分泌。细胞外蛋白质的成熟形式没有信号序列，其在分泌过程期间被切除。

如本文所用，“生物活性”是指具有特定生物活性（例如酶活性）的序列。

“水硬度”是对存在于水中的矿物质（如，钙和镁）的量度。

如本文所用，“包含AmyNEST淀粉酶（或AmyNEST多肽）的培养细胞材料”或者类似的语言是指包含AmyNEST多肽作为组分的细胞裂解液或上清液。细胞材料优选地来自在出于产生AmyNEST多肽的目的的培养物中生长的异源宿主。

本文所引用的所有参考文献均据此全文以引用方式并入。

2.AmyNEST淀粉酶核酸和多肽

本发明组合物和方法的一个方面为从菌属涅斯捷连科氏菌菌种中获得的α-淀粉酶多肽，或者结构相关的多肽，其统称为AmyNEST淀粉酶或AmyNEST多肽。示例性的AmyNEST多肽从新疆涅斯捷连科氏菌菌株B4.2S6中获得，并且具有序列标识号11的氨基酸序列。菌属涅斯捷连科氏菌在如Stackebrandt,E.et al.(1995)Int.J.Syst.Bacteriol.)45:682-92（Stackebrandt,E.等人，《国际***细菌学杂志》1995年第45卷第682-692页）中有所描述。

另外的AmyNEST多肽与从新疆涅斯捷连科氏菌菌株B4.2S6获得的α-淀粉酶具有特定程度的氨基酸序列同一性。这种AmyNEST多肽包括天然存在的变体，包括人为制造的氨基酸置换、***或缺失的变体，嵌合体和同源物。在一些情况下，这些AmyNEST多肽与从新疆涅斯捷连科氏菌菌株B4.2S6（序列标识号11）获得的α-淀粉酶具有至少57%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或98%，或甚至至少99%的整体同源性/同一性。

还有另外的AmyNEST多肽与从新疆涅斯捷连科氏菌菌株B4.2S6获得的α-淀粉酶具有特定程度的总体氨基酸序列同一性，同时包含新疆涅斯捷连科氏菌菌株B4.2S6多肽的特定氨基酸序列。例如，AmyNEST多肽可与序列标识号11具有至少57%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的总体氨基酸序列同一性，同时包含碳水化合物结合模块(CBM)25(1)（即序列标识号12）和/或CBM 25(2)（即序列标识号13）的氨基酸序列。类似地，AmyNEST多肽可与序列标识号11具有至少57%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的总体氨基酸序列同一性，同时包含与CBM 25(1)和/或CBM 25(2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%序列同一性的氨基酸序列。AmyNEST多肽也可包含与CBM 25(1)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%序列同一性的氨基酸序列以及与CBM 25(2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%序列同一性的氨基酸序列。与AmyNEST多肽中的CBM 25(1)和CBM 25(2)有关的氨基酸序列可通过连接基分隔开，如，与序列标识号19具有至少57%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的氨基酸序列同一性。

AmyNEST多肽可为包含信号序列的“全长”(“fl”)、“未成熟”或者“前体”多肽、或者不含信号序列的“成熟”多肽。示例性的未成熟AmyNEST多肽具有序列标识号9的氨基酸序列，而示例性的成熟AmyNEST多肽具有序列标识号11的氨基酸序列。一般来讲，多肽的成熟形式活性最强，并且最适用于清洁和其他应用。

AmyNEST多肽可被截短，使得它们不含成熟形式的N或C-端。一个示例性的截短AmyNEST多肽不含C-端第二碳水化合物结合模块(CBM)（即CBM(2)），但保留了N-端催化结构域。另一个示例性的截短AmyNEST多肽不含C-端CBM（即CBM(1)和CBM(2)），但保留了N-端催化结构域。相关的AmyNEST多肽不含CBM(2)，但保留了CBM(1)和N-端催化结构域。

不含一个或多个CBM的AmyNEST多肽可用于需要高催化转化量的地方，理想地可用于AmyNEST多肽的浓度与要水解的底物相比足够高以致CBM的存在不会对促进酶底物相互作用起关键作用的地方。

类似地，AmyNEST多肽包含保留亲本AmyNEST多肽的α-淀粉酶活性特征的至少一部分的片段。优选的片段包含催化结构域的至少一部分。

如上所述，AmyNEST多肽包括变体多肽，例如包含人为制造的置换的那些。示例性的置换为保守性氨基酸置换，例如下表中列出的那些。

如前所述，优选的AmyNEST多肽保留α-淀粉酶活性，但可能相对于天然存在的亲本多肽更改生物化学性质。

多肽也可为包含AmyNEST多肽的至少一部分和第二多肽的至少一部分的嵌合多肽。第二多肽可为（例如）第二淀粉酶、异源信号序列、允许跟踪或纯化的表位等等。示例性异源信号序列来自枯草芽孢杆菌淀粉酶(AmyE)或AprE，以及链霉菌(Streptomyces)CelA。

本发明组合物和方法的另一个方面是编码AmyNEST多肽的核酸。核酸可编码从新疆涅斯捷连科氏菌菌株B4.2S6获得的AmyNEST多肽或者上述任意变体、截短形式、片段、嵌合体和同源物。在一些情况下，核酸编码与从新疆涅斯捷连科氏菌菌株B4.2S6获得的AmyNEST多肽具有至少57%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、或98%或甚至至少99%同源性/同一性的淀粉酶。应当理解，由于遗传密码的简并性，多个核酸可编码相同的多肽。

核酸还可与编码AmyNEST多肽的示例性多核苷酸具有特定程度的核苷酸序列同一性，所述示例性多核苷酸例如序列标识号7或序列标识号8，其编码从新疆涅斯捷连科氏菌菌株B4.2S6获得的AmyNEST多肽。在一个例子中，所述核酸与序列标识号7或序列标识号8的多核苷酸具有至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或甚至99%的同一性。又如，所述核酸在严格或非常严格的条件下与序列标识号7或序列标识号8的多核苷酸杂交。所述核酸可编码包含信号序列的“全长”(“fl”)或“未成熟”多肽、或不含信号序列的“成熟”多肽。

编码AmyNEST多肽的核酸能够可操作地连接到载体中的各种启动子和调控因子以在各种宿主细胞中表达。编码AmyNEST多肽的核酸还可连接到其他编码序列，如用于编码嵌合多肽。示例性的启动子为枯草芽孢杆菌Amy E和AprE启动子，以及链霉菌CelA启动子。

3.生产和纯化蛋白质的方法

生产和纯化从芽孢杆菌分泌到培养基中的蛋白质的方法是本领域已知的，用于生产α-淀粉酶的合适宿主细胞也是如此。用于生产α-淀粉酶的示例性方法描述如下。

3.1用于生产α-淀粉酶的材料和方法

使用通常包括编码合适的启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号和任选的阻遏基因或多个激活基因的控制序列的表达载体，以酶形式表达AmyNEST多肽。大量的载体可商购获得，以用于重组DNA方法，并且载体的选择通常将取决于它即将引入其中的宿主细胞。该载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如，质粒、噬菌体或染色体外元件、微型染色体或人工染色体。或者，载体可以是当其被引入分离的宿主细胞中时被整合进宿主细胞基因组中并与整合其的染色体一起复制的载体。通过使用由抗生素选择或其他选择压力（如必需的调节基因）驱动的或由对必需代谢途径基因剂量效应的补充而驱动的可扩增构建体，也可以扩增该整合的基因以产生染色体中该基因的多个拷贝。

在载体中，DNA序列应可操作地连接到合适的启动子序列。该启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，并且可以源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。用于引导编码AmyNEST多肽的DNA序列的转录，尤其是在细菌宿主中的转录的示例性启动子为大肠杆菌(E.coli)乳糖操纵子的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因dagA或celA启动子、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪地芽孢杆菌（之前称为Bacillusstearothermophilus）麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)xylA和xylB基因的启动子等。对于在真菌宿主中的转录，可用的启动子的例子为那些衍生自编码米曲霉(Aspergillus oryzae)高峰淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶或者构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因的启动子。当在诸如大肠杆菌之类的细菌物种中表达编码AmyNEST多肽的基因时，可以例如从噬菌体启动子（包括T7启动子和λ噬菌体启动子）选择合适的启动子。适用于在酵母物种中表达的启动子的例子包括但不限于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的Gal 1和Gal 10启动子以及巴斯德毕赤酵母(Pichia pastorisor)的AOX1或AOX2启动子。对于在里氏木霉(Trichoderma reesei)中的表达，可使用CBHII（纤维二糖水解酶II）启动子。

表达载体也可包含与编码AmyNEST多肽的DNA序列可操作地连接的合适的转录终止子以及在真核生物中的多腺苷酸化序列。终止序列和多腺苷酸化序列可适宜地源自与启动子相同的来源。

载体还可包含使得载体能在宿主细胞中复制的DNA序列。这类序列的例子是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。

载体还可包含可选标记，如其产物能补足分离的宿主细胞中的缺陷的基因，诸如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性（如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性）的基因。此外，载体可包含曲霉属(Aspergillus)选择标记，如amdS、argB、niaD和xxsC（产生潮霉素抗性的标记），或者可通过例如本领域已知的共转化实现选择。参见例如PCT国际专利申请WO 91/17243。

尽管细胞内表达或固态发酵在某些方面可能有利，如，当使用某些细菌或真菌作为宿主细胞时，一方面构思了AmyNEST多肽进入培养基的表达。通常，α-淀粉酶包含氨基末端处的信号序列，其允许分泌到培养基中。如果需要，该信号肽可被不同序列取代，这可通过编码相应信号多肽的DNA序列的置换而方便地实现。

表达载体通常包含克隆载体的组分，例如，在选择的宿主生物中允许载体自主复制的元件和用于选择目的的一个或多个表型可检测标记。表达载体通常包含例如启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号和任选的阻遏基因或一个或多个激活基因的控制核苷酸序列。另外，表达载体可包含能够将AmyNEST多肽导向到宿主细胞细胞器（例如过氧化物酶体）、或导向到特定宿主细胞区室的氨基酸序列的序列编码。这种导向序列包括但不限于序列SKL。对于在控制序列引导下的表达，AmyNEST多肽的核酸序列相对于表达以适当的方式可操作地连接到控制序列。示例性的载体在图5中示出。

用于分别连接编码AmyNEST多肽的DNA构建体、启动子、终止子和其他元件的操作，和用于将它们***含有复制必需信息的合适载体的操作是本领域技术人员众所周知的（参见例如Sambrook et al.,MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL,2^nd ed.,Cold Spring Harbor,1989,and 3^rded.,2001（Sambrook等人，《分子克隆实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，1989年，以及第3版，2001年））。

包含DNA构建体或表达载体的分离细胞有利地在重组生产AmyNEST多肽的过程中用作宿主细胞。可用编码酶的DNA构建体，方便地通过将该DNA构建体（以一个或多个拷贝）整合进宿主染色体中来转化细胞。通常认为这种整合是有利的，因为DNA序列更有可能在细胞中稳定地维持。可根据常规方法，例如通过同源或异源重组，实现DNA构建体整合进宿主染色体中。作为另外一种选择，可用与不同类型的宿主细胞有关的上述表达载体对细胞进行转化。

合适的细菌宿主生物的例子为***物种，例如芽胞杆菌(Bacillaceae)（包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽胞杆菌、短芽胞杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌（之前称为Bacillus stearothermophilus）、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽胞杆菌、灿烂芽胞杆菌(Bacilluslautus)、巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)和苏云金芽孢杆菌；链霉菌物种，例如鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)；乳酸细菌物种，包括乳球菌属(Lactococcus spp.)，例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；乳杆菌属(Lactobacillus spp.)，包括罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)；明串珠菌属(Leuconostoc spp.)；片球菌属(Pediococcus spp.)；以及链球菌属(Streptococcus spp.)。作为另外一种选择，可以选择属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)（包括大肠杆菌）或者属于假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的革兰氏阴性细菌物种的菌株作为宿主生物。

可从生物工艺学相关的酵母物种中选择合适的酵母宿主生物，所述酵母物种例如但不限于如毕赤酵母属物种(Pichia sp.)、汉森(氏)酵母属物种(Hansenula sp.)，或者克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、Yarrowinia、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种的酵母物种或酵母属(Saccharomyces)的物种（包括酿酒酵母），或属于裂殖酵母属的物种例如粟酒裂殖酵母(S.pombe)物种。甲基营养酵母物种巴斯德毕赤酵母的菌株可以用作宿主生物。或者，宿主生物可以是汉逊酵母属(Hansenula)物种。丝状真菌中合适的宿主生物包括曲霉属的物种，如黑曲霉、米曲霉、塔宾曲霉(Aspergillustubigensis)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或构巢曲霉。作为另外一种选择，镰孢菌属(Fusarium)物种的菌株，如尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，或者根毛霉属(Rhizomucor)物种的菌株，例如米赫根毛霉可用作宿主生物。其他合适的菌株包括嗜热真菌属(Thermomyces)和毛霉菌属(Mucor)物种。另外，里氏木霉可用作宿主。转化曲霉属宿主细胞的合适方法包括（例如）在EP 238023中所述的。

在又一个方面，提供生产AmyNEST多肽的方法，该方法包括在有利于酶生产的条件下培养上述宿主细胞，并从该细胞和/或培养基回收酶。

用于培养细胞的培养基可以是任何适于培养所考虑的宿主细胞和获得AmyNEST多肽表达的常规培养基。合适的培养基和培养基组分可获自商业供应商或可根据公布的配方（例如，如在美国典型培养物保藏中心的目录中所述的配方）制备。

在一个方面，从宿主细胞分泌的酶用于全发酵液制备。在本发明的方法中，使用任何本领域已知的导致α-淀粉酶表达的培养方法，可实现要消耗的重组微生物全发酵液的制备。因此，可将发酵理解为包括在合适培养基中以及在允许淀粉酶表达或分离的条件下进行的在实验室中的摇瓶培养、或在工业发酵罐中的小规模或大规模发酵（包括连续发酵、分批发酵、分批补料发酵或固态发酵）。术语“要消耗的全发酵液”在本文中被定义为发酵材料的未分级内容物，包括培养基、细胞外蛋白质（例如酶）和细胞生物质。应当理解，术语“要消耗的全发酵液”还涵盖了已使用本领域中熟知的方法使其裂解或具有渗透性的细胞生物质。

可通过公知的方法从培养基中方便地回收分泌自宿主细胞的酶，所述方法包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，以及借助于诸如硫酸铵之类的盐沉淀培养基中的蛋白质组分，随后使用诸如离子交换层析、亲和色谱等之类的色谱方法。

一个方面构思了载体中的多核苷酸可操作地连接到能够通过宿主细胞提供编码序列的表达的控制序列，即载体为表达载体。控制序列可例如通过添加其他转录调控元件进行修饰，从而使控制序列所引导的转录水平对转录调节因子的响应更灵敏。控制序列尤其可包含启动子。

可在允许AmyNEST多肽表达的合适条件下培养宿主细胞。酶的表达可以是组成型的，使得它们可以连续生产；或可以是诱导型的，从而需要刺激物来引发表达。在诱导型表达的情况下，例如，可以在需要时通过向培养基中添加诱导物质（例如***或IPTG或Sopharose）来引发蛋白质产生。也可以在体外无细胞体系（如TNT^TM(Promega)兔网织红细胞体系）中重组生产多肽。

表达AmyNEST多肽的宿主也可在适合该宿主的培养基中、在有氧条件下进行培养。可以提供振荡或者搅拌和通风的组合，在适合该宿主的温度例如约25℃至约75℃（例如30℃至45℃）下进行生产，这取决于宿主的需要以及生产所需AmyNEST多肽的需要。可以培养约12至约100小时或更长（以及其间的任何时间值，如24至72小时）。通常，培养液的pH为约5.5至约8.0，这也取决于与AmyNEST多肽的生产相关的宿主所需的培养条件。

3.2用于蛋白质纯化的材料和方法

发酵、分离和浓缩技术是本领域中熟知的，并且可使用常规方法来制备浓缩的包含AmyNEST多肽的溶液。

发酵后，获得发酵液，并通过常规分离技术除去微生物细胞和各种悬浮的固形物（包括残留的发酵原料）以获得淀粉酶溶液。通常使用过滤、离心、微滤、转鼓真空过滤、超滤、离心、随后进行的超滤、萃取或层析法等。

希望浓缩含有AmyNEST多肽的溶液以优化回收率。使用未浓缩的溶液需要增加温育时间以便收集纯化的酶沉淀。

使用常规的浓缩技术浓缩含酶溶液直到获得所需的酶含量。可使用本文所讨论或者说是本领域已知的任何技术来实现含酶溶液的浓缩。浓缩的示例性方法包括但不限于旋转式真空过滤和/或超滤。

可使用例如沉淀剂（如金属卤化物沉淀剂）进行浓缩。金属卤化物沉淀剂包括但不限于：碱金属氯化物、碱金属溴化物和这些金属卤化物中两种或更多种的共混物。示例性的金属卤化物包括氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾和这些金属卤化物中两种或更多种的共混物。金属卤化物沉淀剂氯化钠也可用作防腐剂。

金属卤化物沉淀剂以能有效沉淀AmyNEST多肽的量使用。在常规测试后选择能有效引起酶沉淀的金属卤化物的至少有效量和最适量，以及最大回收率的沉淀条件（包括温育时间、pH、温度和酶浓度），对于本领域中的普通技术人员来说将是显而易见的。

一般而言，向浓缩的酶溶液添加至少约5%w/v（重量/体积）至约25%w/v的金属卤化物，通常是至少8%w/v。一般而言，向浓缩的酶溶液添加不超过约25%w/v的金属卤化物，通常是不超过约20%w/v。金属卤化物沉淀剂的最适浓度将取决于尤其是具体AmyNEST多肽的性质以及其在浓缩的酶溶液中的浓度。

影响酶沉淀的另一个选择方案是使用有机化合物。示例性的有机化合物沉淀剂包括：4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸的碱金属盐、4-羟基苯甲酸的烷基酯以及这些有机化合物中两种或更多种的共混物。所述有机化合物沉淀剂的添加可以在添加金属卤化物沉淀剂之前、与其同时或在其后发生，并且两种沉淀剂（有机化合物和金属卤化物）的添加可相继进行或同时进行。

通常，有机沉淀剂选自4-羟基苯甲酸的碱金属盐（如钠或钾盐）和4-羟基苯甲酸的直链或支链烷基酯（其中烷基含有1至12个碳原子）以及这些有机化合物中两种或更多种的共混物。有机化合物沉淀剂可以是（例如）4-羟基苯甲酸的直链或支链烷基酯（其中烷基含有1至10个碳原子）以及这些有机化合物中两种或更多种的共混物。示例性的有机化合物为4-羟基苯甲酸的直链烷基酯（其中烷基含有1至6个碳原子）以及这些有机化合物中两种或更多种的共混物。也可以使用4-羟基苯甲酸的甲基酯、4-羟基苯甲酸的丙基酯、4-羟基苯甲酸的丁基酯、4-羟基苯甲酸的乙基酯以及这些有机化合物中两种或更多种的共混物。另外的有机化合物还包括但不限于4-羟基苯甲酸甲酯（名为对羟基苯甲酸甲酯）和4-羟基苯甲酸丙酯（名为对羟基苯甲酸丙酯），它们也都是淀粉酶防腐剂。有关进一步的描述，参见例如美国专利No.5,281,526。

就pH、温度、AmyNEST多肽浓度、沉淀剂浓度和温育时间而言，添加有机化合物沉淀剂提供了沉淀条件高度灵活性的优势。

有机化合物沉淀剂以能通过金属卤化物沉淀剂有效地改善酶沉淀的量使用。按照本公开，在常规测试后选择有机化合物沉淀剂的至少有效量和最适量，以及最大回收率的沉淀条件（包括温育时间、pH、温度和酶浓度），对于本领域中的普通技术人员来说将是显而易见的。

一般而言，向浓缩的AmyNEST相关多肽溶液添加至少约0.01%w/v的有机化合物沉淀剂，通常是至少约0.02%w/v。一般而言，向浓缩的AmyNEST多肽溶液添加不超过约0.3%w/v的有机化合物沉淀剂，通常是不超过约0.2%w/v。

可以调节含有金属卤化物沉淀剂和有机化合物沉淀剂的浓缩酶溶液的pH，该pH将必然取决于待纯化的酶。通常，将pH调节至淀粉酶等电点附近的水平。可将pH在低于等电点(pI)约2.5pH单位至高于等电点约2.5pH单位的pH范围内调节。

获得纯化的酶沉淀物所需的温育时间取决于具体酶的性质、酶浓度以及具体沉淀剂及其浓度。一般来讲，能有效沉淀酶的时间在约1至约30小时；通常不超过约25小时。在存在有机化合物沉淀剂的情况下，温育时间还可以减至低于约10小时，在大多数情况下甚至是约6小时。

一般来讲，温育期间的温度在约4℃和约50℃之间。通常在约10℃和约45℃之间（如，在约20℃和约40℃之间）的温度下进行该方法。用于诱导沉淀的最佳温度根据溶液条件和酶或所用的沉淀剂而变化。

通过搅拌包含酶、添加的金属卤化物和添加的有机化合物的溶液来改善纯化的酶沉淀物的总回收率以及该方法的实施效率。在添加金属卤化物和有机化合物期间，以及在随后的温育期期间进行搅拌步骤。合适的搅拌方法包括机械搅拌或振荡、强力通风或任何类似的技术。

在温育期后，将已纯化的酶与解离的颜料和其他杂质分离，并通过常规分离技术（诸如过滤、离心、微滤、旋转式真空过滤、超滤、压滤、跨膜微滤、错流膜微滤等）进行收集。可以通过用水洗涤沉淀物获得对纯化的酶沉淀物的进一步纯化。例如，用含有金属卤化物沉淀剂的水、或者用含有金属卤化物和有机化合物沉淀剂的水来洗涤纯化的酶沉淀物。

在发酵期间，AmyNEST多肽在培养液中积累。对于所需AmyNEST多肽的分离和纯化，对培养液进行离心或过滤以除去细胞，然后将所得的无细胞液体用于酶纯化。在一个实施例中，使用约70%饱和度的硫酸铵对无细胞的培养液进行盐析；然后将70%饱和度沉淀的级分溶解于缓冲液中，再施加到诸如Sephadex G-100柱的柱上，然后洗脱以回收酶活性级分。为了进一步的纯化，可使用诸如离子交换色谱之类的常规方法。

纯化后的酶可用于衣物洗涤和清洁应用。例如，它们可以用于衣物洗涤剂和去渍剂中。可以将它们制成液体（溶液、浆液）或固体（颗粒、粉末）形式的终产品。

纯化的更具体的实例在Sumitani,J.et al.(2000)Biochem.J.350:477-484（Sumitani,J.等人，2000年，《生物化学杂志》，第350卷，第477-484页）中有所描述并在这里进行简要概括。从4升变铅青链霉菌TK24培养上清液获得的酶采用80%饱和度的(NH₄)₂SO₄进行处理。通过在10,000×g下（20分钟和4℃）离心而回收沉淀物，然后将其重新溶解在含5mMCaCl₂的20mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.0)中。然后用相同的缓冲液对溶解的沉淀进行透析。然后将透析后的样品施加到先前已用含5mM CaCl₂的20mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.0)平衡的Sephacryl S-200柱上，然后用相同缓冲液以7cm/h的线性流速洗脱。收集来自柱的级分，然后评估其按酶活性测定和SDS-PAGE判断的活性。按如下方式进一步纯化蛋白质。ToyopearlHW55柱（宾夕法尼亚州蒙哥马利市东曹生命科学公司(Tosoh Bioscience,Montgomeryville,PA)；产品编号19812）用含5mM CaCl₂和1.5M(NH₄)₂SO₄的20mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.0)平衡。用含5mM CaCl₂的20mM Tris/HCL缓冲液(pH 7.0)中线性梯度为1.5至0M的(NH₄)₂SO₄洗脱酶。集活性级分，并且用80%饱和度的(NH₄)₂SO₄使酶沉淀。如上所述对沉淀物进行回收、重新溶解和透析。然后将透析后的样品施加到Mono QHR5/5柱（安发玛西亚生物技术公司(Amersham Pharmacia)；产品编号17-5167-01），该柱先前已用含5mM CaCl₂的20mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.0)以60mL/h的流速进行了平衡。收集活性级分，并将其添加到1.5M(NH₄)₂SO₄溶液中。使活性酶级分如前所述在Toyopearl HW55柱上重新层析，得到如通过SDS-PAGE确定的均相酶。参见J.Sumitani et al.,“Newtype of starch-binding domain:the direct repeat motif in the C-terminal region ofBacillus sp.no.195α-amylase contributes to starch binding and raw starchdegrading,”Biochem.J.350:477-484(2000)（J.Sumitani等人，“新型淀粉结合区域：芽孢杆菌属物种195号α-淀粉酶的C-端区域中的同向重复基序有助于淀粉结合和原淀粉降解”，《生物化学杂志》，第350卷，第477-484页，2000年），了解有关其方法和变化的一般讨论。

对于工厂规模的回收，可如上一般地描述通过用聚合物絮凝除去细胞而对AmyNEST多肽进行部分纯化。作为另外一种选择，可使用可用的膜和设备通过微滤、接下来通过超滤进行浓缩而对酶进行纯化。然而，对于某些应用，无需对酶进行纯化，并且无需进一步处理即可对整个肉汤培养物进行溶解和使用。然后可将酶加工成（例如）颗粒。

4.清洁组合物

本发明组合物和方法的一个方面为包含AmyNEST多肽作为组分的清洁组合物。AmyNEST多肽可用作洗涤剂组合物中的组分，所述洗涤剂组合物用于手洗、衣物洗涤、盘碟洗涤和其他硬面清洁。优选地，将AmyNEST多肽掺入到洗涤剂中，其浓度在方便洗涤剂中淀粉酶使用的浓度处或附近。例如，AmyNEST多肽可以对应于每升洗涤液/盘碟洗涤液0.00001–1mg（按纯酶蛋白质计算）α-淀粉酶的量添加。本文提供示例性制剂，如下所示出：

4.1衣物洗涤剂组合物

AmyNEST多肽通常可为洗涤剂组合物的组分，作为唯一的酶或者与其他酶（包括其他淀粉分解酶）结合使用。照此，其可以以无粉尘颗粒、稳定化液体或受保护的酶的形式包含在洗涤剂组合物中。可以例如，如美国专利No.4,106,991和No.4,661,452所公开的那样来生产无粉尘颗粒，并且可任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的例子为聚（环氧乙烷）产品（聚乙二醇，PEG），其平均摩尔量为1,000至20,000；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化的壬基酚；乙氧基化的脂肪醇，其中醇含有12至20个碳原子，并且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的单甘油酯、二甘油酯和三甘油酯。例如英国专利No.1483591给出了适于通过流化床技术施加的成膜包衣材料的实例。可例如通过加入多元醇（如丙二醇）、糖或糖醇、乳酸或硼酸，根据已确立的方法来稳定液态酶制备物。其他酶稳定剂是本领域所熟知的。可根据例如EP 238,216中公开的方法来制备受保护的酶。长期以来多元醇被公认为蛋白质的稳定剂，以及用于改善蛋白质的溶解性。参见例如Kaushik,J.K.et al.(2003)J.Biol.Chem.278:26458-65（Kaushik,J.K.等人，2003年，《生物化学杂志》，第278卷，第26458-26465页）以及其中引用的参考文献；以及Monica Conti,M.et al.(1997)J.Chromatography A 757:237-245（Monica Conti,M.等人，1997年，《色谱分析杂志》，第757卷，第237-245页）。

洗涤剂组合物可为任何可用形式，如作为粉末、颗粒剂、糊剂或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70%的水，和0%至约30%的有机溶剂。它也可为仅含约30%水的致密凝胶类型形式。

洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，其中每种都可以是阴离子型、非离子型、阳离子型或两性离子型。洗涤剂通常将含有0%至约50%的阴离子表面活性剂，例如直链烷基苯磺酸盐(LAS)；α-烯烃磺酸盐(AOS)；烷基硫酸盐（脂肪醇硫酸盐）(AS)；醇乙氧基硫酸盐（AEOS或AES）；仲烷基磺酸盐(SAS)；α-磺基脂肪酸甲酯；烷基或烯基琥珀酸；或皂。所述组合物也可含有0%至约40%的非离子表面活性剂，如醇乙氧基化物（AEO或AE）、羧化的醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺或多羟基烷基脂肪酸酰胺（如例如在WO 92/06154中所述）。

洗涤剂组合物可另外包含一种或多种其他酶，如脂肪酶、另一种淀粉分解酶、角质酶、蛋白酶、纤维素酶、过氧化物酶和/或漆酶的任何组合。

洗涤剂可含有约1%至约65%的洗涤剂助洗剂或络合剂，如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐（例如来自Hoechst的SKS-6）。洗涤剂也可以是无助洗剂的，即基本上不含洗涤剂助洗剂。可以在与酶的稳定性相容的任何组合物中使用酶。通常可以用已知的包封形式（例如通过造粒或隔离在水凝胶中）来保护酶免于遭遇有害的组分影响。酶，具体地讲α-淀粉酶，（诸如具有或不具有CBD的AmyNEST多肽）可用于包括衣物洗涤和盘碟洗涤应用、表面清洁剂的多种组合物中，以及由淀粉或生物质生成乙醇的组合物中。

洗涤剂可包含一种或多种聚合物。例子包括羧甲基纤维素(CMC)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可含有漂白***，其可包含可与形成过酸的漂白活化剂如四乙酰乙二胺(TAED)或壬酰基氧基苯磺酸盐(NOBS)联用的H₂O₂来源（如过硼酸盐或过碳酸盐）。或者，漂白***可包含过氧酸（例如酰胺、酰亚胺或砜类过氧酸）。漂白***也可为酶漂白***，例如过水解酶，如在PCT国际专利申请WO 2005/056783中所描述的。

可使用常规的稳定剂，例如多元醇（如丙二醇或甘油）、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物（例如芳香硼酸酯）稳定洗涤剂组合物的酶；并且可如例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制所述组合物。

洗涤剂也可含有其他常规洗涤剂成分，例如织物调理剂，包括粘土、增泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀细菌剂、晦暗抑制剂、荧光增白剂或香料。

pH（在使用浓度下于水溶液中测量）通常是中性或碱性，例如pH约7.0至约11.0。

包含AmyNEST相关多肽的洗涤剂组合物可以配制成具体形式，包括：

1)一种配制为堆密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，其包含约7%至约12%的直链烷基苯磺酸盐（按酸计算）；约1%至约4%的醇乙氧基硫酸盐（例如，C_12-18醇，1-2环氧乙烷(EO)）或烷基硫酸盐（例如，C_16-18）；约5%至约9%的醇乙氧基化物（例如，C_14-15醇，7EO）；约14%至约20%的碳酸钠（例如，Na₂CO₃）；约2至约6%的可溶硅酸盐（例如，Na₂O、2SiO₂）；约15%至约22%的沸石（例如，NaA1SiO₄）；0%至约6%的硫酸钠（例如，Na₂SO₄）；约0%至约15%的柠檬酸钠/柠檬酸（例如，C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇）；约11%至约18%的过硼酸钠（例如，NaBO₃H₂O）；约2%至约6%的TAED；0%至约2%的羧甲基纤维素(CMC)；0至3%的聚合物（例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG）；0.0001至0.1%蛋白质的酶（按纯酶计算）；以及0至5%的微量成分（例如，抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂）。

2)一种配制为堆密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，其包含约6%至约11%的直链烷基苯磺酸盐（按酸计算）；约1%至约3%的醇乙氧基硫酸盐（例如，C_12-18醇，1-2EO）或烷基硫酸盐（例如，C_16-18）；约5%至约9%的醇乙氧基化物（例如，C_14-15醇，7EO）；约15%至约21%的碳酸钠（例如，Na₂CO₃）；约1%至约4%的可溶硅酸盐（例如，Na₂O、2SiO₂）；约24%至约34%的沸石（例如，NaA1SiO₄）；约4%至约10%的硫酸钠（例如，Na₂SO₄）；0%至约15%的柠檬酸钠/柠檬酸（例如，C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇）；0%至约2%的羧甲基纤维素(CMC)；1至6%的聚合物（例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG）；0.0001至0.1%的酶（按纯酶蛋白质计算）；0至5%的微量成分（例如，抑泡剂、香料）。

3)一种配制为堆密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，其包含约5%至约9%的直链烷基苯磺酸盐（按酸计算）；约7%至约14%的醇乙氧基化物（例如，C_12-15醇，7EO）；约1至约3%的脂肪酸皂（例如，C_16-22脂肪酸）；约10%至约17%的碳酸钠（如Na₂CO₃）；约3%至约9%的可溶硅酸盐（例如，Na₂O、2SiO₂）；约23%至约33%的沸石（如NaA1SiO₄）；0%至约4%的硫酸钠（例如，Na₂SO₄）；约8%至约16%的过硼酸钠（例如，NaBO₃H₂O）；约2%至约8%的TAED；0%至约1%的膦酸盐（例如，EDTMPA）；0%至约2%的羧甲基纤维素(CMC)；0至3%的聚合物（例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG）；0.0001至0.1%的酶（按纯酶蛋白质计算）；0至5%的微量成分（例如，抑泡剂、香料、荧光增白剂）。

4)一种配制为堆密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，其包含约8%至约12%的直链烷基苯磺酸盐（按酸计算）；约10%至约25%的醇乙氧基化物（例如，C_12-15醇，7EO）；约14%至约22%的碳酸钠（如Na₂CO₃）；约1%至约5%的可溶硅酸盐（例如，Na₂O、2SiO₂）；约25%至约35%的沸石（例如，NaA1SiO₄）；0%至约10%的硫酸钠（例如，Na₂SO₄）；0%至约2%的羧甲基纤维素(CMC)；1至3%的聚合物（例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG）；0.0001至0.1%的酶（按纯酶蛋白质计算）；以及0至5%的微量成分（例如，抑泡剂、香料）。

5)一种含水液体洗涤剂组合物，其包含约15%至约21%的直链烷基苯磺酸盐（按酸计算）；约12%至约18%的醇乙氧基化物（例如，C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO）；约3%至约13%的脂肪酸皂（例如，油酸）；0%至约13%的烯基琥珀酸(C_12-14)；约8%至约18%的氨基乙醇；约2%至约8%的柠檬酸；0%至约3%的膦酸盐；0%至约3%的聚合物（例如，PVP、PEG）；0%至约2%的硼酸盐（例如，B₄O₇）；0%至约3%的乙醇；约8%至约14%的丙二醇；0.0001至0.1%的酶（按纯酶蛋白质计算）；以及0至5%的微量成分（例如，分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂）。

6)一种含水结构化液体洗涤剂组合物，其包含约15%至约21%的直链烷基苯磺酸盐（按酸计算）；3至9%的醇乙氧基化物（例如，C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO）；约3%至约10%的脂肪酸皂（例如，油酸）；约14%至约22%的沸石（如NaA1SiO₄）；约9%至约18%的柠檬酸钾；0%至约2%的硼酸盐（例如，B₄O₇）；0%至约2%的羧甲基纤维素(CMC)；0%至约3%的聚合物（例如，PEG、PVP）；0%至约3%的锚定聚合物，例如，甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物（摩尔比25:1，分子量3800）；0%至约5%的甘油；0.0001至0.1%的酶（按纯酶蛋白质计算）；以及0至5%的微量成分（例如，分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂）。

7)一种配制为堆密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，其包含约5%至约10%的脂肪醇硫酸盐；约3%至约9%的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0至3%的脂肪酸皂；约5%至约10%的碳酸钠（例如，Na₂CO₃）；约1%至约4%的可溶硅酸盐（例如，Na₂O、2SiO₂）；约20%至约40%的沸石（例如，NaA1SiO₄）；约2%至约8%的硫酸钠（例如，Na₂SO₄）；约12%至约18%的过硼酸钠（例如，NaBO₃H₂O）；约2%至约7%的TAED；约1%至约5%的聚合物（例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PEG）；0.0001至0.1%的酶（按纯酶蛋白质计算）；以及0至5%的微量成分（例如，荧光增白剂、抑泡剂、香料）。

8)一种配制为颗粒的洗涤剂组合物，其包含约8%至约14%的直链烷基苯磺酸盐（按酸计算）；约5%至约11%的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0%至约3%的脂肪酸皂；约4%至约10%的碳酸钠（例如，Na₂CO₃）；约1%至约4%的可溶硅酸盐（例如，Na₂O、2SiO₂）；约30%至约50%的沸石（例如，NaA1SiO₄）；约3%至约11%的硫酸钠（例如，Na₂SO₄）；约5%至约12%的柠檬酸钠（例如，C₆H₅Na₃O₇）；约1%至约5%的聚合物（例如，PVP、马来酸/丙烯酸共聚物、PEG）；0.0001至0.1%的酶（按纯酶蛋白质计算）；以及0至5%的微量成分（例如，抑泡剂、香料）。

9)一种配制为颗粒的洗涤剂组合物，其包含约6%至约12%的直链烷基苯磺酸盐（按酸计算）；约1%至约4%的非离子表面活性剂；约2%至约6%的脂肪酸皂；约14%至约22%的碳酸钠（例如，Na₂CO₃）；约18%至约32%的沸石（例如，NaA1SiO₄）；约5%至约20%的硫酸钠（例如，Na₂SO₄）；约3%至约8%的柠檬酸钠（例如，C₆H₅Na₃O₇）；约4%至约9%的过硼酸钠（例如，NaBO₃H₂O）；约1%至约5%的漂白活化剂（例如，NOBS或TAED）；0%至约2%的羧甲基纤维素(CMC)；约1%至约5%的聚合物（例如，聚羧酸酯或PEG）；0.0001至0.1%的酶（按纯酶蛋白质计算）；以及0至5%的微量成分（例如，荧光增白剂、香料）。

10)一种含水液体洗涤剂组合物，其包含约15%至约23%的直链烷基苯磺酸盐（按酸计算）；约8%至约15%的醇乙氧基硫酸盐（例如，C_12-15醇，2-3EO）；约3%至约9%的醇乙氧基化物（例如，C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO）；0%至约3%的脂肪酸皂（例如，月桂酸）；约1%至约5%的氨基乙醇；约5%至约10%的柠檬酸钠；约2%至约6%的水溶助长剂（例如，甲苯磺酸钠）；0%至约2%的硼酸盐（例如，B₄O₇）；0%至约1%的羧甲基纤维素；约1%至约3%的乙醇；约2%至约5%的丙二醇；0.0001至0.1%的酶（按纯酶蛋白质计算）；以及0至5%的微量成分（例如，聚合物、分散剂、香料、荧光增白剂）。

11)一种含水液体洗涤剂组合物，其包含约20%至约32%的直链烷基苯磺酸盐（按酸计算）；6至12%的醇乙氧基化物（例如，C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO）；约2%至约6%的氨基乙醇；约8%至约14%的柠檬酸；约1%至约3%的硼酸盐（例如，B₄O₇）；0%至约3%的聚合物（例如，马来酸/丙烯酸共聚物，锚定聚合物诸如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物）；约3%至约8%的甘油；0.0001至0.1%的酶（按纯酶蛋白质计算）；以及0至5%的微量成分（例如，水溶助长剂、分散剂、香料、荧光增白剂）。

12)一种配制为堆密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，其包含约25%至约40%的阴离子表面活性剂（直链烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、α-烯烃磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基磺酸盐、皂）；约1%至约10%的非离子表面活性剂（例如，醇乙氧基化物）；约8%至约25%的碳酸钠（例如，Na₂CO₃）；约5%至约15%的可溶硅酸盐（例如，Na₂O、2SiO₂）；0%至约5%的硫酸钠（例如，Na₂SO₄）；约15%至约28%的沸石(NaA1SiO₄)；0%至约20%的过硼酸钠（例如，NaBO₃4H₂O）；约0%至约5%的漂白活化剂（TAED或NOBS）；0.0001至0.1%的酶（按纯酶蛋白质计算）；0至3%的微量成分（例如，香料、荧光增白剂）。

13)如上述组合物1)-12)中所述的洗涤剂组合物，其中所述直链烷基苯磺酸盐中的所有或部分被(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐代替。

14)一种配制为堆密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，其包含约9%至约15%的(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐；约3%至约6%的醇乙氧基化物；约1%至约5%的多羟基烷基脂肪酸酰胺；约10%至约20%的沸石（例如，NaA1SiO₄）；约10%至约20%的层状二硅酸盐（例如，来自赫斯特(Hoechst)的SK56）；约3%至约12%的碳酸钠（例如，Na₂CO₃）；0%至约6%的可溶硅酸盐（例如，Na₂O、2SiO₂）；约4%至约8%的柠檬酸钠；约13%至约22%的过碳酸钠；约3%至约8%的TAED；0%至约5%的聚合物（例如，聚羧酸酯和PVP）；0.0001至0.1%的酶（按纯酶蛋白质计算）；以及0至5%的微量成分（例如，荧光增白剂、光漂白剂、香料、抑泡剂）。

15)一种配制为堆密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，其包含约4%至约8%的(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐；约11%至约15%的醇乙氧基化物；约1%至约4%的皂；约35%至约45%的沸石MAP或沸石A；约2%至约8%的碳酸钠（如Na₂CO₃）；0%至约4%的可溶硅酸盐（例如，Na₂O、2SiO₂）；约13%至约22%的过碳酸钠；1至8%的TAED；0%至约3%的羧甲基纤维素(CMC)；0%至约3%的聚合物（例如，聚羧酸酯和PVP）；0.0001至0.1%的酶（按纯酶蛋白质计算）；以及0至3%的微量成分（例如，荧光增白剂、膦酸盐、香料）。

16)如上面1)-15)中所述的洗涤剂制剂，其含有稳定化的或包封的过酸作为额外组分或作为已经述及的漂白***的替代物。

17)如上面1)、3)、7)、9)和12)中所述的洗涤剂组合物，其中过硼酸盐被过碳酸盐代替。

18)如上面1)、3)、7)、9)、12)、14)和15)中所述的洗涤剂组合物，还额外含有锰催化剂。所述锰催化剂为例如在Rage et al.(1994)Nature 369:637-639（Rage等人，1994年，《自然》，第369卷，第637-639页）中所描述的化合物之一。

19)配制为非水性洗涤剂液体的洗涤剂组合物，其包含液态非离子型表面活性剂，如直链烷氧基化伯醇、助洗剂体系（例如磷酸盐）、酶和碱。该洗涤剂还可包含阴离子型表面活性剂和/或漂白***。

AmyNEST多肽可以常规使用的浓度掺入到洗涤剂中。目前考虑的是，在洗涤剂组合物中，可以相当于每升洗涤液体0.00001-1.0mg（按纯酶蛋白质计算）AmyNEST多肽的量添加酶。

在另一个实施例中，其他酶（诸如2,6-β-D-果聚糖水解酶）可掺入到包含AmyNEST相关淀粉酶的洗涤剂组合物中，并且用于家居和/或工业纺织物/要洗的衣物上存在的生物膜的除去/清洁。

例如，可以将洗涤剂组合物配制成手洗（人工）或机洗（自动）的衣物洗涤剂组合物，包含适于预处理玷污的织物的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物软化剂组合物，或者可配制成用于一般的家居硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或者配制以用于人工或自动的盘碟洗涤操作。

在一个具体的方面，洗涤剂组合物可包含除了AmyNEST多肽外的2,6-β-D-果聚糖水解酶、一种或多种其他清洁酶，如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、***聚糖酶、半乳聚糖酶、另一种淀粉分解酶、木聚糖酶、氧化酶、漆酶和/或过氧化物酶，和/或它们的组合。

通常，所选酶的特性应与所选的洗涤剂相容（例如最适pH、与其他酶和非酶成分的相容性等），且所述酶应以有效量存在。

蛋白酶：合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体，以及天然制成的蛋白质。蛋白酶可为丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，诸如碱性微生物蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、或胰凝乳蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子为枯草杆菌蛋白酶，尤其是源自芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168（参见例如WO 89/06279）。胰蛋白酶样蛋白酶的例子是胰蛋白酶（例如猪或牛起源）和镰孢菌属蛋白酶（参见例如WO 89/06270和WO94/25583）。可用的蛋白酶的例子也包括但不限于WO 92/19729、WO98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中所述的变体。可商购获得的蛋白酶包括但不限于：

PRIMASE^TM、DURALASE^TM、

和KANNASE^TM（诺和诺德公司(Novo NordiskA/S)）；

MAXACAL^TM、MAXAPEM^TM、

PURAFECT OXP^TM、FN2^TM和FN3^TM（杰能科国际有限公司）。

脂肪酶：合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰、蛋白分解改性或蛋白质工程改造的突变体。可用的脂肪酶的例子包括但不限于来自腐质霉属(Humicola)（同义词为嗜热真菌属）的脂肪酶，例如来自柔毛腐质霉(H.lanuginosa)(T.lanuginosus)（参见例如EP 258068和EP305216）、来自特异腐质霉(H.insolens)（参见例如WO 96/13580）的脂肪酶；假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶（例如，来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)的脂肪酶；参见例如EP218 272），洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶（参见例如EP 331 376）、施氏假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶（参见例如GB 1,372,034）、荧光假单胞菌(P.fluorescens)脂肪酶、假单胞菌属物种菌株SD 705脂肪酶（参见例如WO95/06720和WO 96/27002）、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)脂肪酶（参见例如WO 96/12012）；芽孢杆菌属脂肪酶（例如，来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶；参见例如Dartois et al.Biochemica et Biophysica Acta,1131:253-360(1993)（Dartois等人，《生物化学与生物物理学报》，第1131卷，第253-360页，1993年））、嗜热脂肪地芽孢杆菌（之前称为Bacillusstearothermophilus）脂肪酶（参见例如JP 64/744992）、或短小芽孢杆菌(B.pumilus)脂肪酶（参见例如WO 91/16422）。构思用于剂中的其他脂肪酶变体包括例如在如下专利中所述的那些：WO 92/05249、WO 94/01541、WO95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079、WO 97/07202、EP 407225和EP 260105。一些可商购获得的脂肪酶包括和LIPOLASE ULTRA^TM（诺和诺德公司）。

聚酯酶：合适的聚酯酶可包含在组合物中，例如WO 01/34899和WO01/14629中描述的那些。

淀粉酶：组合物可与其他淀粉酶（例如非生产增强型α-淀粉酶）结合。这些酶可包括市售的淀粉酶，例如但不限于

和BAN^TM（诺和诺德公司）；

和

（得自杰能科国际公司）。

纤维素酶：可向组合物添加纤维素酶。合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢菌属、梭孢壳属(Thielavia)、枝顶孢属(Acremonium)的纤维素酶，例如美国专利No.4,435,307、5,648,263、5,691,178、5,776,757和WO 89/09259中公开的特异腐质霉(Humicola insolens)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermop制hila)和尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)产生的真菌纤维素酶。可以考虑使用的示例性纤维素酶为对于纺织物具有颜色护理益处的那些。此类纤维素酶的例子为例如EP 0495257、EP 0531372、WO 96/11262、WO 96/29397和WO98/08940中所述的纤维素酶。其他例子为纤维素酶变体，例如WO94/07998、WO 98/12307、WO 95/24471、PCT/DK98/00299、EP 531315、美国专利No.5,457,046、5,686,593和5,763,254中所述的那些。市售的纤维素酶包括

和

（诺和诺德公司）、

和PURADAX

（杰能科国际公司）和KAC-500(B)^TM（花王公司(Kao Corporation)）。

过氧化物酶/氧化酶：考虑用于组合物中的合适过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。可用的过氧化物酶的例子包括WO 93/24618、WO 95/10602和WO98/15257中描述的来自鬼伞属(Coprinus)，例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶及其变体。市售的过氧化物酶包括例如GUARDZYME^TM（诺和诺德公司）。

可通过添加含有一种或多种酶的分开的添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂而在洗涤剂组合物中包括洗涤剂酶。洗涤添加剂（即分开的添加剂或组合添加剂）可配制为例如颗粒、液体、浆液等。示例性的洗涤添加剂制剂包括（但不限于）颗粒尤其是无粉尘颗粒、液体尤其是稳定的液体或浆液。

可以例如，如美国专利No.4,106,991和No.4,661,452所公开的那样来生产无粉尘颗粒，并且可任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的例子是平均摩尔量为1,000至20,000的聚(环氧乙烷)产品（如聚乙二醇(PEG)）；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化的壬基酚；乙氧基化的脂肪醇，其中醇含有12至20个碳原子，并且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的单甘油酯、二甘油酯和三甘油酯。例如，GB 1483591给出了适于通过流化床技术施加的成膜包衣材料的实例。可例如通过加入多元醇（如丙二醇）、糖或糖醇、乳酸或硼酸，根据已确立的方法来稳定液态酶制备物。可根据EP 238,216中公开的方法来制备受保护的酶。

洗涤剂组合物可以是任何简便形式，如条棒状、小块、粉末、颗粒、糊状物或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70%的水，和0%至约30%的有机溶剂。还考虑包含约30%或更少水的紧致洗涤剂凝胶。洗涤剂组合物可任选地包含一种或多种表面活性剂，该表面活性剂可以是非离子型的，包括半极性和/或阴离子型和/或阳离子型和/或两性离子型的。表面活性剂可以很宽的范围（约0.1重量%至约60重量%）存在。

当包含在洗涤剂中时，洗涤剂通常将含有约1%至约40%的阴离子型表面活性剂，如直链烷基苯磺酸盐、α-烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐（脂肪醇硫酸盐）、醇乙氧基硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸或皂。

当包含在洗涤剂中时，洗涤剂通常将含有约0.2%至约40%的非离子型表面活性剂，如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基-N-烷基衍生物（“葡糖酰胺”）。

洗涤剂可含有0%至约65%的洗涤剂助洗剂或络合剂，如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐（例如来自赫斯特(Hoechst)的SKS-6）。

洗涤剂可包含一种或多种聚合物。示例性的聚合物包括羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚乙烯基咪唑、聚羧酸酯（如聚丙烯酸酯）、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

可使用常规的稳定剂来稳定洗涤剂组合物的酶，该稳定剂例如多元醇（如丙二醇或甘油）、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物（如硼酸芳族酯）或苯基硼酸衍生物（如4-甲酰基苯基硼酸）。可如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制所述组合物。

目前考虑在洗涤剂组合物中，AmyNEST相关多肽可以按相当于每升洗液约0.01至约100mg酶蛋白质（如每升洗液约0.05至约5.0mg酶蛋白质、或每升洗液0.1至约1.0mg酶蛋白质）的量加入。

4.2清洁组合物

在洗涤剂应用中，AmyNEST多肽通常用于包含丙二醇的液体组合物中。酶溶于例如丙二醇中，通过在含10%氯化钙的25%体积/体积丙二醇溶液中混合而使其溶解。

可以将本文论述的AmyNEST多肽配制于用于清洁盘碟的洗涤剂组合物中或其他清洁组合物中。这些组合物可以是粉末、凝胶或液体。组合物可以只包含酶，或与其他淀粉分解酶和/或与其他清洁酶或漂白剂活化酶和其他组分共同用于清洁组合物。

因此，盘碟洗涤剂组合物可包含表面活性剂。表面活性剂可以是阴离子型、非离子型、阳离子型、两性离子型或这些类型的混合物。洗涤剂可含有0重量%至约90重量%的非离子型表面活性剂，如低泡沫至不起泡的乙氧基化丙氧基化直链醇。

洗涤剂组合物可含有无机和/或有机类型的洗涤剂助洗剂盐。洗涤剂助洗剂可细分为含磷和不含磷的类型。洗涤剂组合物通常含有约1%至约90%的洗涤剂助洗剂。当存在含磷的无机碱性洗涤剂助洗剂时，其例子包括水溶性盐，尤其是碱金属焦磷酸盐、正磷酸盐和多磷酸盐。当存在含磷的有机碱性洗涤剂助洗剂时，其例子包括水溶性膦酸盐。当存在不含磷的无机助洗剂时，其例子包括水溶性碱金属碳酸盐、硼酸盐和硅酸盐以及多种类型的水不溶性晶体或无定形硅铝酸盐，其中沸石是最为公知的代表。

合适有机助洗剂的例子包括碱金属、铵和取代铵、柠檬酸盐、琥珀酸盐、丙二酸盐、脂肪酸磺酸盐、羧基甲氧基琥珀酸盐、聚乙酸铵、羧酸盐、聚羧酸盐、氨基聚羧酸盐、聚乙酰基羧酸盐和多羟基磺酸盐。

其他合适的有机助洗剂包括已知具有助洗剂性质的较高分子量的聚合物和共聚物，例如适当的聚丙烯酸、聚马来酸和聚丙烯酸/聚马来酸共聚物，以及它们的盐。

清洁组合物可含有氯/溴类型或氧类型的漂白剂。无机氯/溴类型漂白剂的例子是锂、钠或钙的次氯酸盐和次溴酸盐，以及氯化磷酸三钠。有机氯/溴类型的漂白剂的例子是杂环N-溴酰亚胺类和N-氯酰亚胺类，例如三氯异氰脲酸、三溴异氰脲酸、二溴异氰脲酸和二氯异氰脲酸，及其与水增溶性阳离子（如钾和钠）形成的盐。乙内酰脲化合物也是合适的。

清洁组合物可含有氧漂白剂，例如以无机过酸盐的形式，任选与漂白前体一起，或以过氧酸化合物的形式。合适的过氧漂白化合物的典型例子是碱金属过硼酸盐（四水合物和一水合物二者）、碱金属过碳酸盐、碱金属过硅酸盐和碱金属过磷酸盐。示例性活化剂材料为TAED和三乙酸甘油酯。酶漂白活化体系也可存在于制剂中，例如过硼酸盐或过碳酸盐、三乙酸甘油酯和过水解酶（参见例如WO 2005/056783）。

可使用酶的常规稳定剂来稳定清洁组合物，该稳定剂为例如多元醇（例如丙二醇）、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物（例如芳族硼酸酯）。

清洁组合物也可包含其他常规洗涤剂成分，例如反絮凝剂材料、填充剂材料、消泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、多价螯合剂、防污垢再沉积剂、脱水剂、染料、杀菌剂、荧光剂、增稠剂和香料。

虽然本发明的组合物和方法结合以下详情进行了描述，但应当理解可进行各种改变。

4.3评估洗涤剂组合物的方法

存在多种α-淀粉酶清洁测定法。清洁测试的示例性描述包括如下所述。

“样片”是其上施有污渍的一块材料如织物。该材料可以是例如由棉、聚酯或天然纤维与合成纤维的混合物制成的织物。该样片还可以是纸，例如滤纸或硝化纤维素，或者是一块硬质材料，如陶瓷、金属或玻璃。对于淀粉酶，污渍是基于淀粉的，但是也可以包括血液、乳、墨、草、茶、酒、菠菜、肉汁、巧克力、蛋、奶酪、粘土、颜料、油或这些化合物的混合物。

“小样片”是自样片上用单孔打孔装置切下的部分，或者用定制的96孔打孔装置（其中该多孔打孔模式与标准96孔微量滴定板匹配）切下的部分，或者是以其他方式自样片上取下的部分。样片可以是纺织物、纸、金属或其他合适的材料。小样片可以在放入24孔、48孔或96孔微量滴定板孔之前或之后具有固着的污渍。“小样片”也可以通过向小块材料施加污渍而制成。例如，小样片可以是直径为5/8英寸或0.25英寸的一块施有污渍的织物。定制的打孔器以使得其同时将96个样片递送至96孔板的所有孔中的方式设计。该装置可以通过简单地向同一96孔板多次上样，而向每孔递送不止一个样片。可以设想将多孔打孔装置用于向任何格式的板（包括但不限于24孔、48孔和96孔板）同时递送多个样片。在另一个可设想的方法中，染污的测试平台可以是由金属、塑料、玻璃、陶瓷或其他合适材料制成的、被污物载污体包覆的珠。然后将一个或多个包覆的珠置于含有合适缓冲液和酶的96孔、48孔或24孔板或更大版式的板的孔中。这种情况下，可以通过直接吸光度测量或在二级生色反应后在上清液中检测释放的污物。也可以通过质谱分析来进行对所释放的污物的分析。另外的微量筛选分析法也可以将样片（例如用靛蓝染色的斜纹粗棉布）递送并固定至多孔板的孔，然后加入颗粒（例如砂石）或较大颗粒（例如石榴石，其经筛分以包括6至8或9目的颗粒），并且通过加入的颗粒搅拌平板使得引起样片磨损。据发现，该分析法可用于对石洗应用中纤维素酶的评估。酶的效能可通过释放（如释放的靛蓝溶解于二甲基亚砜中，并且在A₆₀₀nm处测量吸光度）至反应缓冲液的颜色或通过磨损样片的反射率测量而判断。

当例如未处理的BMI（血液/乳/墨水）样片在无漂白剂的洗涤剂中洗涤时，即使没有蛋白酶的帮助大部分墨水也释放出来。加入蛋白酶导致墨水释放小幅增加，这在大背景中可能难以定量。本发明的组合物和方法提供容许人们控制污渍的固着程度的处理方案。因此，产生例如当在不存在被测试的酶的情况下进行洗涤时能释放出不等量的污渍的样片是可能的。固着的样片的使用导致在洗涤测定中信噪比显著改善。此外，通过改变固着程度，可以产生在多种清洁条件下给出最佳结果的污渍。

在各种类型材料上具有已知“强度”污渍的样片是可商购获得的（瑞士圣加仑的国家联邦材料测试与开发研究所(EMPA,St.Gallen,Switzerland)、德国克雷菲尔德的wfk--Testgewebe股份有限公司(wfk--Testgewebe GmbH,Krefeld Germany)、或荷兰符拉尔丁根的测试材料中心(Center for Test Materials,Vlaardingen,The Netherlands)）和/或可由专业人员制备（Morris and Prato,Textile Research Journal 52(4):280 286(1982)（Morris和Prato，《纺织研究杂志》，1982年，第52卷第4期第280-286页））。其他测试样片包括但不限于含棉织物上的血液/乳/墨水(BMI)污渍、含棉织物上的菠菜污渍或含棉织物上的草，以及含棉织物上的巧克力/乳/烟灰。

可以用0.0003%至0.3%的过氧化氢将BMI污渍固着在棉上。其他组合包括用0.001%至1%戊二醛固着的草或菠菜、用0.001%至1%戊二醛固着的明胶和考马斯染料，或用0.001%至1%戊二醛固着的巧克力、乳和烟灰。

也可以在用酶和/或洗涤剂制剂温育期间搅拌样片。洗涤性能数据取决于样片在孔中（尤其是在96孔板中）的取向（水平对垂直）。这将表明在温育期间混合是不充分的。尽管存在许多方式来确保温育期间充分的搅拌，但可以构造其中微量滴定板夹在两个铝板之间的板夹持器。这可以简单地例如在孔上方放置粘性板密封物，然后用任何类型的适合的、可商购获得的夹子将两个铝板与96孔板夹紧而实现。然后可以将它放到商业培养箱摇床中。将摇床设定为约400rpm可导致非常有效的混合，而板夹持器有效地阻止了泄漏或交叉污染。

可以使用三硝基苯磺酸(TNBS)来定量洗涤液体中的氨基基团的浓度。这可以用作从样片中除去的蛋白质的量的量度（参见例如Cayot andTainturier,Anal.Biochem.249:184-200(1997)（Cayot和Tainturier，《分析生物化学》，1997年，第249卷第184-200页））。然而，如果洗涤剂或酶样品导致形成异乎寻常小的肽片段（例如，因样品中存在肽酶所致），那么人们将获得较大的TNBS信号，即更多“噪音”。

测量对血液/乳/墨水或其他污渍的洗涤性能的另一种方法基于墨水的释放。样片上蛋白质的蛋白水解作用导致墨水颗粒释放，该释放可通过测量洗涤液体的吸光度而进行定量。可以在350至800nm之间的任何波长下测量吸光度。在410nm或620nm处测量吸光度。也可以检查洗涤液体以确定对于含有草、菠菜、明胶或考马斯染料的污渍的洗涤性能。用于这些污渍的示例性波长包括对于菠菜或草的670nm和对于明胶或考马斯染料的620nm。例如，移出等份试样的洗涤液体（例如，通常来自96孔微板的100-150μL）并置于比色皿或多孔微量滴定板中。然后将其置于分光光度计中并在适当的波长下读取吸光度。

该***也可用于确定用于盘碟洗涤的增强的酶和/或洗涤剂组合物，例如利用在例如布、塑料或陶瓷之类的合适载污体上的血液/乳/墨水污渍。

在一个方面，可以通过在25℃下将0.3%过氧化氢施加到BMI/棉样片上30分钟或通过在60℃下将0.03%过氧化氢施加到BMI/棉样片上30分钟，而使BMI污渍固着在棉上。从BMI/棉样片上切下大约0.25英寸的小样片并置于96孔微量滴定板的孔中。向各孔中放入洗涤剂组合物与酶的已知混合物。向微量滴定板顶部放置粘性板密封物后，将微量滴定板与铝板夹在一起，并在定轨摇床上以大约250rpm搅拌约10至60分钟。这个时间结束后，将上清液转移至新微量滴定板的孔中并测量620nm处的墨水吸光度。这可以类似地用通过在25℃下向菠菜/棉样片或草/棉样片施加0.01%戊二醛30分钟而固着在棉上的菠菜污渍或草污渍来进行测试。这也可以用巧克力、乳和/或烟灰污渍来进行。

本发明被组织成多个章节，以便于阅读；然而，读者将会知道，在一个章节中进行的陈述可以应用到其他章节。因此，本公开不同章节使用的标题不应理解为限制性的。

为了进一步说明组合物和方法以及它们的优点，给出了以下具体实例，应当理解它们是示例性的，而非限制性的。

实例

实例1：新疆涅斯捷连科氏菌菌株B4.2S6的分离

新疆涅斯捷连科氏菌菌株B4.2S6通过在30℃下于pH为7-7.5的中度嗜盐培养基(MHM)上培养而从碱性（pH 10.5，27.5℃）和含盐（电导率25.8mS·cm-1）湖泊沉积物中分离，该培养基由10%NaCl、1%酵母提取物、0.1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、和1.8%琼脂组成。生物体形成淡黄色菌落。

实例2：新疆涅斯捷连科氏菌菌株B4.2S6的鉴定

使新疆涅斯捷连科氏菌菌株B4.2S6在GAM琼脂（参见实例3）上生长，然后送至荷兰莱顿的BaseClear公司(BaseClear(Leiden,TheNetherlands))进行部分16S rRNA基因测序。测序使用由BaseClear公司提供的标准PCR引物16S-500-F1和16S-500-R1进行。440bp部分序列在序列标识号1中示出。BLAST搜索显示，440bp片段与来自新疆涅斯捷连科氏菌的模式菌株YIM 70097的类似序列100%相同（Wen-Jun Li et al.(2004)Int.J.Syst.Evol.Microbiol.54:837-41（李文军等人，2004年，《国际***与进化微生物学杂志》，第54卷第837-841页））。这些数据证明克隆的淀粉酶对应于新疆涅斯捷连科氏菌的淀粉酶。

实例3：新疆涅斯捷连科氏菌B4.2S6的培养

新疆涅斯捷连科氏菌菌株B4.2S6在35℃下、于pH为7-7.5的中度嗜盐培养基(MHM)或pH为10-10.5的碱性GAM培养基上培养，如下所述。

MHM培养基(g/L)

GAM培养基(g/L)

溶液A

溶解于500ml去离子水中，然后通过高压灭菌法进行灭菌。

溶液B

NaCl         40.0

Na₂CO₃       10.0

溶解于500ml去离子水中，然后通过高压灭菌法进行灭菌。

灭菌和冷却后，将溶液A和溶液B混合，然后分配到摇瓶中。固体培养基包含20.0g/L琼脂。培养72小时之后得到良好的生长。琼脂平板提供淡黄色菌落的纯培养物。

实例4：来自表达文库的新疆涅斯捷连科氏菌B4.2S6α-淀粉酶的鉴定

使用与Duckworth et al.(1996)FEMS Microbiology Letters 19:181-91（Duckworth等人，1996年，《欧洲微生物学会联合会微生物学通讯》，第19卷第181-191页）中描述类似的方法，将新疆涅斯捷连科氏菌B4.2S6的细胞培养在碱性培养基上。根据制造商的方案、使用MasterPure革兰氏阳性菌DNA纯化试剂盒（美国威斯康星州麦迪逊市Epicentre公司(Epicentre;Madison,WI,USA)）制备基因组DNA。

Eurofins Medigenomix股份有限公司（德国马丁雷德Fraunhoferstrasse22 D-82152）(Eurofins Medigenomix GmbH(Fraunhoferstrasse 22 D-82152Martinsried,DE))使用新疆涅斯捷连科氏菌B4.2S6的基因组DNA来构建表达文库。3-5kb的片段通过随机剪切新疆涅斯捷连科氏菌B4.2S6的基因组DNA而获得。所述片段被克隆到低拷贝数载体pRANGER-BTB3-Cat（图1，美国威斯康星州米德尔顿市Lucigen公司(Lucigen Corporation,Middleton,WI,USA)，GenBank登录号DQ058731）内。***糖启动子驱动***基因的转录（只要***物中不存在终止子，并且只沿一个方向）。翻译取决于克隆***物中存在的基因的天然RBS/起始密码子。载体首先由德国埃伯斯贝格的Medigenomix公(Medigenomix(Ebersberg,DE))进行TA克隆的修饰：在MCS中***EcoRV限制性位点、添加单个3′-胸腺嘧啶核苷悬突，并且在载体上的T/A***位点之后和终止子之前***三个终止密码子（三种读框）。

将连接混合物转化至电感受态TOP10大肠杆菌细胞（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德英杰公司(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA,USA)）中，然后平铺到RBB琼脂平板上。这些琼脂平板每升包含10g酵母提取物、16g胰蛋白胨、5g NaCl、15g琼脂、25mg氯霉素和5g用雷玛唑亮蓝R（荷兰兹韦恩德雷赫特Fluka/西格玛奥德里奇公司(Fluka/Sigma-Aldrich;Zwijndrecht,The Netherlands)）染色的淀粉。选择在RBB平板上形成清晰区域的大肠杆菌克隆（该克隆表明存在淀粉酶基因）用于进一步研究。该淀粉卤素阳性克隆***物由BaseClear公司（荷兰莱顿Einsteinweg(Einsteinweg;Leiden,The Netherlands)）使用DNA引物pRANGER-FW（序列标识号2）和pRANGER-RV（序列标识号3）进行测序，这些引物杂交至pRANGER载体。通过使用三个内部DNA引物（基于使用上述pRANGER引物恢复的DNA序列）确定整个***物的DNA序列。分析显示存在新疆涅斯捷连科氏菌B4.2S6α-淀粉酶基因（序列标识号7）。成熟α-淀粉酶蛋白质的推测氨基酸序列被示出为序列标识号9。

实例5：新疆涅斯捷连科氏菌α-淀粉酶基因和蛋白质的特性描述

新疆涅斯捷连科氏菌α-淀粉酶基因编码724个氨基酸的前体蛋白（序列标识号9）。所述前体蛋白包含24个氨基酸的信号肽（序列标识号10）和700个氨基酸的成熟蛋白(AmyNEST)（序列标识号11）。BLAST搜索显示，AmyNEST与任何已知的淀粉酶具有相当低的同一性。最近的同源物是得自芽孢杆菌属物种195的α-淀粉酶（序列标识号18），该酶与AmyNEST享有56%的同一性。

AmyNEST与得自芽孢杆菌属物种195的α-淀粉酶的比较提出，AmyNEST具有催化结构域和具有组织的两个碳水化合物结合模块，如图2中示出。两个碳水化合物结合模块(CBM)均属于CBM 25超家族，并且一前一后位于分子的C-端，且被17个氨基酸的连接基部分[即DPCEAQPAPGEDPDLTV（序列标识号19）]分隔开。这些CBM是特定的CBM 25(1)（序列标识号12）和CBM 25(2)（序列标识号13），它们享有60%的序列同一性。CBM很可能有助于淀粉结合特征和降解原淀粉的能力（参见例如Sumitani,J.et al.(2000)New type of starch-binding domain:thedirect repeat motif in the C-terminal region of Bacillus sp.no.195α-amylasecontributes to starch binding and raw starch degrading.Biochem.J.350(PT2):477-84（Sumitani,J.等人，2000年，“新型淀粉结合区域：芽孢杆菌属物种195号α-淀粉酶的C-端区域中的同向重复基序有助于淀粉结合和原淀粉降解”，《生物化学杂志》，第350卷（第2部分）第477-484页））。

实例6：新疆涅斯捷连科氏菌淀粉酶的小规模表达

将10ml种菌培养物(1∶10)接种到两个装有100ml GAM培养基的摇瓶(250ml)中，然后在振荡培养器中于35℃和220rpm下温育24小时，以用作淀粉发酵的接种物。产生淀粉酶的培养基(sGAM)由其中葡萄糖被可溶性淀粉(10g/L)取代的改良GAM培养基和1g/L的还原蛋白胨组成。将10ml接种培养物接种到装有100ml sGAM培养液的摇瓶(250ml)中，然后在振荡培养器中于35℃和220rpm下温育48小时。通过离心（10℃）：首先4700rpm（西格玛(Sigma)）、然后10,000rpm（索福(Sorval)）移除剩余的细胞来收集产生淀粉酶的培养基(2.7L)。将上清液保存在-80℃直至浓缩。为了减少被蛋白酶降解，加入三片蛋白酶抑制剂混合物片（即罗氏公司(Roche)的“Complete”）。通过使用200cm²有效膜面积(Vivaflow200)的连续再循环膜过滤（截留分子量5K）将上清液从2700ml浓缩（在冰上）至70ml。在UF处理期间，另外加入数片蛋白酶抑制剂混合物片。将浓缩物保存在-80℃。

使用英杰公司的NuPAGE Novex Bis-Tris凝胶在MES SDS电泳缓冲液中进行SDS-PAGE分析。用25μL 0.5N HCl稀释50μL样品。在冰上放置5分钟后，加入25μL样品缓冲液，然后将样品在95℃下加热5分钟。使样品在冰上短暂冷冻，然后进行离心，随后将30、40或10μL加载到凝胶槽。在100V（恒定电压）下进行电泳，并且用考马斯亮蓝（英杰公司）使蛋白带可见。可以看到60、50和27kDa的三条主要条带（图3）。

使用琼脂糖凝聚扩散分析法确定培养液浓缩物中存在淀粉酶，该方法利用可溶性淀粉作为底物。将80、40、20或10μL浓缩物的等分试样放置在琼脂糖中钻出的孔内，并在35℃下的高湿度环境中温育过夜。孔周围的淀粉酶活性通过用碘溶液(KI/I)淹没琼脂糖平板来显现。孔周围的清晰区域或光环指示新疆涅斯捷连科氏菌B4.2S6培养液浓缩物中存在淀粉酶。使用RBB淀粉作为底物得到了类似的光环。脱脂乳平板未显示出清晰区域，从而指示不存在蛋白酶。

实例7：新疆涅斯捷连科氏菌淀粉酶的大规模表达

要在枯草芽孢杆菌中表达大量的新疆涅斯捷连科氏菌α-淀粉酶，通过使用pHPLT载体制备了构建体。对于表达研究，成熟编码序列的N-端通过删除前42个DNA密码子来截短，并且在第43位用丙氨酸取代丝氨酸。新疆涅斯捷连科氏菌α-淀粉酶成熟DNA片段被克隆到pHPLT载体中（Solingen et al.(2001)Extremophiles 5:333-41（Solingen等人，2001年，《极端微生物》，第5卷第333-341页）；参见图4），该克隆使用独特的PstI和HpaI限制性位点进行。pHPLT表达载体包含地衣芽孢杆菌LAT启动子(Plat)，随后是用于克隆AmyNEST的PstI和HpaI限制性位点，以及得自pUB110的附加元件（McKenzie et al.(1986)Plasmid 15:93-103（McKenzie等人，1986年，《质粒》，第15卷第93-103页）），该元件包含复制酶基因(reppUB)、新霉素/卡那霉素抗性基因(neo)和博来霉素抗性标记(bleo)。pHPLT-AmyNEST质粒的图谱在图5中示出。

要制备得自新疆涅斯捷连科氏菌B4.2S6的基因组DNA，使用过夜生长培养物（37℃下的胰酶大豆肉汤）的1ml细胞沉淀作为遗传物质的来源。根据制造商的方案、使用得自Epicentre公司（美国威斯康星州麦迪逊市Epicentre公司）的MasterPure革兰氏阳性菌DNA纯化试剂盒制备基因组DNA。新疆涅斯捷连科氏菌B4.2S6α-淀粉酶基因使用MJ Research PTC-200热循环仪和Phusion高保真DNA聚合酶（芬兰埃斯波市的FinnzymesOY公司(Finnzymes OY,Espoo,FN)）通过PCR从基因组DNA扩增，该扩增根据制造商的说明进行，所使用的退火温度为55℃。所使用的两种引物为：pHPLT-AmyNest-Fw（序列标识号14）和pHPLT-AmyNest-Rv（序列标识号15）。

根据供应商（美国印第安纳州印第安纳波利斯市的罗氏应用科学公司(Roche Applied Science,Indianapolis,IN,USA)）的说明，将所得的PCR片段用限制性内切酶PstI和HpaI消化，并且在存在T4 DNA连接酶以及pHPLT pDNA（50ng/μL范围，用PstI和HpaI限制性内切酶消化）的情况下进行温育。将连接混合物转化至枯草芽孢杆菌菌株SC6.1（ΔaprE、ΔnprE、oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE::[xylR,pxylA-comK]）中，如美国专利公布US20020182734（国际专利公开WO 02/14490）中所描述。将转化物平铺在DIFCO^TM心脏浸出液琼脂平板上，该平板包含10mg/L新霉素和0.5%用雷玛唑亮蓝R染色的淀粉。使用菌落PCR和测序评估淀粉-卤素-阳性菌落是否在pHPLT中存在新疆涅斯捷连科氏菌α-淀粉酶基因。对于菌落PCR，将枯草芽孢杆菌转化株重悬于100μL无菌水中，其中1μL用于PCR反应，该PCR反应包含英杰公司的Platinum Taq DNA聚合酶高保真PCR体系和两种引物：pHPLT-F1引物（序列标识号16）和pHPLT-R1引物（序列标识号17）。

循环条件为：95℃2分钟，单次循环；然后是95℃30秒、55℃1分钟和68℃2分钟，总共25个循环；然后是68℃5分钟，最后一个循环。PCR产物在BaseClear公司使用引物pHPLT-F1（序列标识号16）和pHPLT-R1（序列标识号17）以及引物Nest-Insert3-RV（序列标识号4）、Nest-Insert3-FW（序列标识号5）和Nest-add-Fw（序列标识号6）进行测序。通过序列分析确定在pHPLT载体（即pHPLT-AmyNEST；参见图5）中是否存在新疆涅斯捷连科氏菌α-淀粉酶基因开放阅读框。

具有pHPLT-AmyNest载体的枯草芽孢杆菌转化株的选择性生长在装有25ml MBD培养基（基于MOPS的确定成分培养基）的摇瓶中进行，该培养基包含5mM CaCl₂和10mg/L新霉素。MBD培养基根据Neidhardt等人[(1974)J.Bacteriol.119:736-47（1974年，《细菌学杂志》，第119卷第736-747页）]的修改方法进行制备。具体地讲，从基础培养基省略掉NH₄Cl₂、FeSO₄和CaCl₂，使用3mM K₂HPO₄，并且向基础培养基补充60mM尿素、75g/L葡萄糖和1%大豆胨。将微量营养素制备为100×储备溶液，一升该储备溶液包含400mg FeSO₄·7H₂O、100mg MnSO₄·H₂O、100mgZnSO₄·7H₂O、50mg CuCl₂·2H₂O、100mg CoCl₂·6H₂O、100mg NaMoO₄·2H₂O、100mg Na₂B₄O₇·10 H₂O、10ml 1M CaCl₂和10ml 0.5M柠檬酸钠。生长产生了具有淀粉水解活性的分泌性新疆涅斯捷连科氏菌α-淀粉酶。

使用Ceralpha法（爱尔兰的美格兹密国际有限公司(MegazymeInternational,IR)）确定来自上述MBD培养基上生长的转化株的AmyNEST培养上清液的α-淀粉酶活性，该方法经修改可用于96孔微量滴定板。将25μl对硝基苯麦芽庚糖苷（即BPNPG7）底物、5.45mg/mM淀粉酶HR试剂（美格兹密国际有限公司；产品目录号R-AMHR4）加入每个孔中，并且在所需的温度（在这种情况下为25℃）下预平衡10分钟。将25μl培养上清液在50mM pH为7.15的MOPS缓冲液中稀释，该缓冲液还包含50mM NaCl和0.1mM CaCl₂，然后将稀释的培养上清液加入孔中并与底物混合。将平板置于培养箱（雷勃公司的iEMS培养箱(iEMS,Labsystems)）中，在所需的温度下以650rpm振荡温育30分钟，随后通过向每个孔中加入50μl 200mM硼酸/NaOH(pH 10.2)溶液而使反应终止。在400nm处测量的吸光度与稀释样品中的α-淀粉酶含量直接相关。

实例8：AmyNEST的清洁性能

在96孔经CS28橙色染色的大米淀粉染污的织物样片微应用清洁试验中分析在MBD培养基中生长的pHPLT-AmyNest载体转化细胞的培养上清液（实例5）的活性。使用织物穿孔法，从CS28有色大米淀粉染污的织物样片上切下1/4英寸圆盘。该淀粉包含边界指示染料以有利于跟踪（测试织物产品目录号CS-28；荷兰符拉尔丁根的测试材料中心）。将这些圆盘中的两个放置在平底96孔检测板的每个孔中。

对于α-淀粉酶清洁试验，将预先选择的缓冲液加入检测板的孔中，并且平衡至预选择的温度。对于初始测试，所用的缓冲液为25mM HEPES(pH 8.0)或25mM CAPS(pH 10.0)，其另外包含2mM CaCl₂和0.005%TWEEN 80。将190μL或180μL缓冲液加入孔中，并容许在40℃下平衡，然后将10或20μL稀释的培养上清液（淀粉酶的最终浓度为0ppm至2ppm）加入所选的孔中。将平板在1150rpm振荡下于40℃温育1小时。酶清洁性能基于释放到洗涤液体中的酶依赖性颜色的量。释放的颜色通过将100μL最终洗涤液体转移至新的微量滴定板中并在488nm处进行分光光度测定而进行定量。将数据归一化为对照反应（其中不存在淀粉酶），并借助于得自Erithicus Software公司的GRAFIT绘制曲线。采用Langmuir等温线拟合算法拟合数据点，该算法的形式与Michaelis-Menten拟合算法相同。该检测的结果表明，在40℃以及pH 8.0与pH 10.0（分别为图6和7）下，AmyNEST高效地将淀粉污渍从纺织物样片除去。

出于所有目的，本文引用的所有参考文献均全文以引用方式并入本文。

Claims (23)

1.一种分离的多肽，所述多肽包含的氨基酸序列与序列标识号11的所述氨基酸序列具有至少60%的氨基酸序列同一性。

2.根据权利要求1所述的分离的多肽，与序列标识号11的所述氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性。

3.根据权利要求2所述的分离的多肽，与序列标识号11的所述氨基酸序列具有至少80%的氨基酸序列同一性。

4.根据权利要求3所述的分离的多肽，与序列标识号11的所述氨基酸序列具有至少90%的氨基酸序列同一性。

5.根据权利要求4所述的分离的多肽，与序列标识号11的所述氨基酸序列具有至少95%的氨基酸序列同一性。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的分离的多肽，包含碳水化合物结合模块(CBM)25(1)的所述氨基酸序列（序列标识号12）和/或CBM25(2)的所述氨基酸序列（序列标识号13）。

7.根据权利要求6所述的分离的多肽，包含的CBM 25(1)的所述氨基酸序列和CBM 25(2)的所述氨基酸序列被具有序列标识号19的所述氨基酸序列的连接基分隔开。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的分离的多肽，具有α-淀粉酶活性。

9.一种包含根据权利要求1-8中任一项所述的多肽的组合物。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述组合物对于从衣物、盘碟或纺织物除去淀粉污渍是有效的。

11.根据权利要求9或10所述的组合物，还包含表面活性剂。

12.根据权利要求9-11中任一项所述的组合物，其中所述组合物为洗涤剂组合物。

13.根据权利要求9-12中任一项所述的组合物，其中所述组合物为衣物洗涤剂或衣物洗涤剂添加剂。

14.根据权利要求9-12中任一项所述的组合物，其中所述组合物是人工或自动盘碟洗涤剂。

15.一种从表面除去淀粉污渍的方法，包括：

在存在水性组合物的情况下温育所述表面，所述水性组合物包含有效量的根据权利要求1-8中任一项所述的多肽，

让所述多肽水解存在于所述淀粉污渍中的淀粉组分，以形成溶于所述水性组合物的较小的淀粉源分子，

从而从所述表面上除去所述淀粉污渍。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述水性组合物还包含表面活性剂。

17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述表面是纺织物表面。

18.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述表面在盘碟上。

19.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述表面是染污的硬质表面。

20.一种编码根据权利要求1-8中任一项所述的多肽的分离的多核苷酸。

21.根据权利要求20所述的分离的多核苷酸，与序列标识号8的所述多核苷酸具有至少90%的核苷酸序列同一性。

22.一种包含根据权利要求20或21所述的多核苷酸的表达载体。

23.一种包含根据权利要求22所述的表达载体的宿主细胞。

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